PT2953941T - Moduladores de enzimas modificadoras de metilo, composições e as suas utilizações - Google Patents

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Description

DESCRIÇÃO
"MODULADORES DE ENZIMAS MODIFICADORAS DE METILO, COMPOSIÇÕES E AS SUAS UTILIZAÇÕES"
Este pedido reivindica prioridade para o Pedido Internacional N° PCT/US2013/025639, apresentado em 11 de fevereiro de 2013. O Pedido Internacional N° PCT/US2013/025639 reivindica prioridade para o pedido provisório dos Estados Unidos com os N° de série 61/597695, apresentado em 10 de fevereiro de 2012 e 61/667821, apresentado em 03 de julho de 2012.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A cromatina eucariótica é composta por complexos macromoleculares denominados nucleossomas. Um nucleossoma possui 147 pares de bases de ADN envolvidos em torno de um octâmetro de proteína possuindo duas subunidades de cada das proteínas histonas H2A, H2B, H3 e H4. As proteínas histonas estão sujeitas a modificações pós-tradução que, por sua vez, afetam a estrutura da cromatina e a expressão génica. Um tipo de modificação pós-tradução encontrada nas histonas é a metilação de resíduos de lisina e arginina. A metilação de histonas desempenha um papel crítico na regulação da expressão génica em eucariotas. A metilação afeta a estrutura da cromatina e tem sido associada à ativação e à repressão da transcrição (Zhang e Reinberg, Genes Dev. 15: 2343-2360, 2001). Enzimas que catalisam a ligação e a remoção de grupos metilo das histonas estão implicadas no silenciamento génico, desenvolvimento embrionário, proliferação celular e outros processos. 0 documento WO 2011/140324 Al divulga indoles que são úteis para o tratamento do cancro. O documento WO 2012/118812 A2 refere-se a compostos de heteroarilo biciclicos 6,5-fundidos substituídos, bem como a composições farmacêuticas contendo estes compostos e métodos de tratamento do cancro através da administração destes compostos e composições farmacêuticas a indivíduos que dele necessitem. O documento US 2012/264734 Al refere-se a compostos de benzeno substituídos com arilo ou heteroarilo, bem como a composições farmacêuticas contendo estes compostos e métodos de tratamento de cancro através da administração destes compostos e composições farmacêuticas a indivíduos que dele necessitem.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente divulgação abrange o reconhecimento de que as enzimas modificadoras de metilo são um alvo atraente para a modulação, dado seu papel na regulação de diversos processos biológicos. Verificou-se agora que os compostos desta invenção e as suas composições farmaceuticamente aceitáveis são eficazes como agentes que estimulam a atividade de enzimas modificadoras de metilo de histonas, incluindo histona metilases e histona desmetilases. Tais compostos têm a fórmula geral II:
ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que cada variável é como aqui definida.
Os compostos da presente invenção, e as suas composições farmaceuticamente aceitáveis, são úteis para tratar uma variedade de doenças, distúrbios ou estados, associados a uma enzima modificadora de metilo. Tais doenças, distúrbios ou estados incluem as aqui descritas.
Os compostos proporcionados por esta invenção também são úteis para o estudo de enzimas modificadoras de metilo em fenómenos biológicos e patológicos; o estudo das vias de transdução de sinal intracelular mediadas por enzimas modificadoras de metilo e a avaliação comparativa de novos moduladores de enzimas modificadoras de metilo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
Figura 1. Compostos exemplificativos de Fórmula II.
DESCRIÇÃO DETALHADA DE DETERMINADAS FORMAS DE REALIZAÇÃO I. Descrição Geral dos Compostos da Invenção
Em determinadas formas de realização, a presente invenção proporciona um composto de Fórmula II:
ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que: A é CH ou N;
Rla é selecionado de alquilo -C1-C2 e -0-(alquilo C1-C2) , em que Rla é opcionalmente substituído com um ou mais flúor; R4a é selecionado de 1-halo-alquil(C1-C3)-piperidin-4-ilo, cicloalquilo C3-C6 , opcionalmente substituído com um ou mais flúor, e tetra-hidropiranilo; e R13 é selecionado de hidrogénio, halo, fenilo, piridinilo, e -0- (alquilo C1-C4) . 2. Compostos e Definições
As definições de grupos funcionais específicos e termos químicos são descritos em mais detalhes abaixo. Para os propósitos desta invenção, os elementos químicos são identificados de acordo com a Tabela Periódica dos Elementos, versão CAS, Handbook of Chemistry and Physics, 75a Ed., capa interior e os grupos funcionais específicos são geralmente definidos como aí descrito. Além disso, os princípios gerais de química orgânica, bem como as unidades funcionais específicas e reatividade, são descritos em Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March March's Advanced Organic Chemistry, 5a edição, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., Nova Iorque, 1989; Carruthers, Some Modern Methods of Organic Chemistry, 3a edição, Cambridge University Press, Cambridge, 1987; os conteúdos totais de cada dos quais são aqui incorporados por referência.
Salvo indicação em contrário, as estruturas aqui representadas pretendem também incluir todas as formas isoméricas (e. g., enantioméricas, diastereoméricas e geométricas (ou conformacionais) da estrutura; por exemplo, as configurações R e S para cada centro assimétrico, isómeros de ligação dupla Z e E e isómeros conformacionais Z e E. Assim, os isómeros estereoquímicos únicos, bem como misturas enantioméricas, diastereoméricas e geométricas (ou conformacionais) dos presentes compostos estão dentro do âmbito da invenção. Salvo indicação em contrário, todas as formas tautoméricas dos compostos da invenção estão dentro do âmbito da invenção. Além disso, a menos que seja indicado o contrário, as estruturas aqui descritas também pretendem incluir compostos que diferem apenas na presença de um ou mais átomos isotopicamente enriquecidos. Por exemplo, compostos possuindo as presentes estruturas, incluindo a substituição de hidrogénio por deutério ou tritio, ou a substituição de um carbono por um carbono enriquecido com 13C ou 14C estão dentro do âmbito desta invenção. Tais compostos são úteis, por exemplo, como ferramentas analíticas, como sondas em ensaios biológicos, ou como agentes terapêuticos de acordo com a presente invenção.
Quando um enantiómero particular é preferido, este pode, em algumas formas de realização ser proporcionado substancialmente livre do enantiómero correspondente, e também pode ser referido como "enriquecido oticamente". "Enriquecido oticamente", como aqui utilizado, significa que o composto é constituído por uma proporção significativamente maior de um enantiómero. Em determinadas formas de realização, o composto é constituído por, pelo menos, cerca de 90% em peso de um enantiómero preferido. Noutras formas de realização, o composto é constituído por, pelo menos, cerca de 95%, 98% ou 99% em peso de um enantiómero preferido. Os enantiómeros preferidos podem ser isolados a partir de misturas racémicas por qualquer método conhecido pelos especialistas na técnica, incluindo cromatografia líquida de alta pressão quiral (HPLC) e a formação e cristalização de sais quirais ou preparados por sínteses assimétricas. Ver, por exemplo, Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, Nova Iorque, 1981); Wilen, et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E.L. Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NI, 1962); Wilen, S.H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972) .
Uma ligação ondulada (**») num centro quiral numa estrutura química é utilizada para denotar compostos da invenção que são oticamente puros, mas cuja rotação ótica não foi determinada. Uma ligação linear num centro quiral indica uma mistura racémica apesar de, como indicado acima, a invenção também incluir todas as formas isoméricas possíveis do racemato.
Os termos "halo" e "halogéneo", como aqui utilizados, referem-se a um átomo selecionado de flúor (fluoro, -F) , cloro (cloro, -Cl), bromo (bromo, -Br) e iodo (iodo, -I). 0 termo "alquileno" refere-se a um grupo alquilo bivalente. Uma "cadeia alquileno" é um grupo polimetileno, í. e., — (CH2) n-, em que n é um número inteiro positivo, de um modo preferido, desde 1 a 6, desde 1 a 4, desde 1 a 3, desde 1 a 2, ou desde 2 a 3. Uma cadeia alquileno substituída é um grupo polimetileno no qual um ou mais átomos de hidrogénio de metileno são substituídos com um substituinte. Os substituintes adequados incluem os descritos abaixo para um grupo alifático substituído. 0 termo "alquilo", como aqui utilizado, refere-se a um radical hidrocarboneto monovalente saturado, de cadeia linear ou ramificada derivado de uma unidade alifática contendo entre um e seis átomos de carbono por remoção de um único átomo de hidrogénio. Em algumas formas de realização, o alquilo contém 1-5 átomos de carbono. Noutra forma de realização, o alquilo contém 1-4 átomos de carbono. Ainda noutras formas de realização, o alquilo contém 1-3 átomos de carbono. Ainda noutra forma de realização, o alquilo contém 1-2 carbonos. Os exemplos de radicais alquilo incluem, mas não estão limitados a metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo, sec-pentilo, iso-pentilo, terc-butilo, n-pentilo, neopentilo, n-hexilo, sec-hexilo e semelhantes.
Como aqui descrito, os compostos da invenção podem conter unidades "opcionalmente substituídas". Em geral, o termo "substituído", precedido pelo termo "opcionalmente" ou não, significa que um ou mais hidrogénios da unidade designada são substituídos com um substituinte adequado. Salvo indicação em contrário, um grupo "opcionalmente substituído" pode ter um substituinte adequado em cada posição substituível do grupo e quando mais de uma posição em qualquer estrutura dada pode ser substituída com mais de um substituinte selecionado de um grupo especificado, o substituinte pode ser o mesmo ou diferente em cada posição. As combinações dos substituintes previstas nesta invenção são, de um modo preferido, aquelas que resultam na formação de compostos estáveis ou quimicamente viáveis. 0 termo "estável", como aqui utilizado, refere-se a compostos que não são substancialmente alterados quando sujeitos a condições que permitem a sua produção, deteção e, em determinadas formas de realização, a sua recuperação, purificação e utilização para um ou mais dos propósitos aqui descritos.
Os substituintes monovalentes adequados num átomo de carbono substituível de um grupo "opcionalmente substituído" são independentemente halogéneo; -(CH2)o-4R°; - (CH2) 0-4OR0; --(CH2)o-4C(0)OR°; - (CH2)o-4CH(OR°)2; - (CH2) 0-4SR0; -(CH2)o-4Ph, o qual pode estar substituído com R°; - (CH2) 0-4O (CH2) o-iPh, o qual pode estar substituído com R°; -CH=CHPh, o qual pode estar substituído com R°; -N02; -CN;-N3; - (CH2) 0-4N (R°) 2; - (CH2) o-4N (R° ) C (0) R' ; -N(R°)C(S)R°; -(CH2)0-4N(Ro)C(0)NR°2; -N(R°)C(S)NR°2; - (CH2)o-4N(R°)C(0)OR°; -N(R°)N(R°)C(0)R°; -N (R°)N (R°) C (0)NR°2; -N (R° ) N (R° ) C (0) 0R° ; - (CH2) 0-4C (0) R° ; -C (S) R° ; - (CH2)o-4C(0)OR°; - (CH2) o-4C (0) SR° ; - (CH2) 0-4C (0) 0SiR°3; - (CH2) 0-4OC (0)R°; -0C(0) (CH2)o-4SR-; -SC(S)SR°; - (CH2) 0-4SC (0) R° ; - (CH2) 0-4C (0)NRo2; -C (S) NR°2; -C(S)SR°; -SC (S) SR° ; - (CH2) 0-4OC (0)NR°2; -C(0)N(0R°) R°; -C(0)C(0)R°; -C(0)CH2C(0)R°; -C(N0R°)R°; - (CH2) 0-4SSR0; - (CH2) 0-4S (0) 2R° ; - (CH2 ) 0-4S (0) 20R° ; - (CH2)o-4OS (0)2R°; -S (0) 2NR°2; - (CH2) 0-4S (0) R° ; -N (R° ) S (0) 2NR°2; -N(R°)S (0) 2R°; -N(0R°)R°; -C(NH)NR°2; -P(0)2R°; -P(0)R°2; -OP (0) R°2; -0P(0) (0R°)2; -SíR°3; -(alquileno C1-4 linear ou ramificado) 0-N (R° ) 2; ou -(alquileno C1-4 linear ou ramificado)C(0)0-N(R°)2, em que cada R° pode ser substituído como definido abaixo e é, independentemente, hidrogénio, C1-6 alifático, -CH2Ph, -0 (CH2) o-iPh, ou um anel de 5-6 membros saturado, parcialmente insaturado ou arilo possuindo 0-4 heteroátomos independentemente selecionados de azoto, oxigénio ou enxofre ou, apesar da definição acima, duas ocorrências independentes de R°, tomadas em conjunto com o(s) seu (s) átomo(s) interveniente(s) , formam um anel de 3-12 membros saturado, parcialmente saturado ou arilo mono ou bíclico possuindo 0-4 heteroátomos selecionados independentemente de azoto, oxigénio ou enxofre, os quais podem ser substituídos como definido abaixo.
Os substituintes adequados num azoto substituível de um grupo "opcionalmente substituído" incluem -R+, -NR+2, -C(0)R+, -C(0)0Rt, -C(0)C(0)Rt, -C(0)CH2C(0)R+, -S(0)2Rt, -S(0)2N Rt2, -C(S)NRt2, -C(NH)NRt2, ou -N (R+) S (0) 2R+; em que cada R* é independentemente hidrogénio, C1-6 alifático, o qual pode ser substituído tal como definido abaixo, -OPh não substituído, ou um anel de 5-6 membros saturado, parcialmente insaturado ou arilo possuindo 0-4 heteroátomos independentemente selecionados de azoto, oxigénio ou enxofre ou, apesar da definição acima, duas ocorrências independentes de R+, tomadas em conjunto com o(s) seu(s) átomo(s) interveniente(s) , formam um anel de 3-12 membros saturado, parcialmente saturado ou arilo mono ou biclico possuindo 0-4 heteroátomos selecionados independentemente de azoto, oxigénio ou enxofre, os quais podem ser substituídos como definido abaixo.
Os substituintes adequados no grupo alifático de R+ são independentemente halogéneo, -R’, -(haloR* ), -OH, -OR’, -O(haloR’), -CN, -C (O) OH, -C(0)0R\ -NH2, -NHR’, -NR’2 ou -NO2, em que cada R’ é não substituído ou onde precedido por "halo" é substituído apenas com um ou mais halogéneos, e é, independentemente, alifático C1-4 , -CH2Ph, -O (CH2) o-iPh, ou um anel com 5-6 membros saturado, parcialmente insaturado, ou arilo possuindo 0-4 heteroátomos selecionados independentemente a partir de azoto, oxigénio ou enxofre.
Tal como aqui utilizado, o termo "inibidor" é definido como um composto que se liga e/ou inibe uma S-adenosilmetionina (SAM) alvo utilizando enzima com afinidade mensurável. Em determinadas formas de realização, um inibidor tem uma IC50 e/ou constante de ligação de menos do que cerca de 50 μΜ, menos do que cerca de 1 μΜ, menos do que cerca de 500 nM, menos do que cerca de 100 nM, ou menos do que cerca de 10 nM.
As expressões "afinidade mensurável" e "inibição mensurável", como aqui utilizadas, significam uma alteração mensurável na atividade de, pelo menos, uma SAM que utiliza enzima entre uma amostra compreendendo um composto proporcionado ou sua composição e, pelo menos, uma enzima dependente de SAM, e uma amostra equivalente compreendendo, pelo menos, uma enzima dependente de SAM, na ausência do referido composto ou sua composição. 3. Descrição de Compostos Exemplificativos
Em algumas formas de realização de Fórmula II, Rla é selecionado de entre -OCH3, -CH3, -OCHF2 e -CH2CH3.
Em algumas formas de realização da Fórmula II, R4a é selecionado de 4,4-difluorociclo-hexilo, ciclopropilo, tetra-hidropirano-4-ilo, 1-(2 — fluoroetil)-piperidin-4-ilo, 1-(2,2-difluoroetil)piperidin-4-ilo, 1-(2,2,2-trifluoroetil)-piperidin- 4-ilo.
Em algumas formas de realização de Fórmula II, R13 é selecionado de hidrogénio, cloro, flúor, -0CH(CH3)2, fenilo, e piridin-2-ilo.
Os compostos exemplificativos de Fórmula II são apresentados na Figura 1. Em alguns casos, dois (ou mais) dos compostos na Figura 1 possuindo uma (ou mais) ligações onduladas terão a mesma estrutura exata. Uma vez que a ligação ondulada representa um centro quiral de rotação ótica indeterminada, tais compostos serão entendidos como isómeros óticos separados e distintos uns dos outros. A Figura 1 é anotada para indicar os conjuntos de dois ou mais compostos que possuem a mesma estrutura representada, mas são de estereoquimica diferente. 4. Utilizações, Formulação e Administração
Composições farmaceuticamente aceitáveis
De acordo com outra forma de realização, a invenção proporciona uma composição compreendendo um composto desta invenção ou um seu derivado farmaceuticamente aceitável e um transportador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável. A quantidade de composto nas composições desta invenção é tal que é eficaz para modular de modo mensurável uma enzima modificadora de metilo de histonas, ou um seu mutante, numa amostra biológica ou num doente. Em determinadas formas de realização, a quantidade de composto nas composições desta invenção é tal que é eficaz para modular de modo mensurável uma enzima modificadora de metilo de histonas, ou um seu mutante, numa amostra biológica ou num doente.
Em determinadas formas de realização, uma composição desta invenção é formulada para administração a um paciente que necessite de tal composição. Em algumas formas de realização, uma composição desta invenção é formulada para administração oral a um paciente. 0 termo "paciente", como aqui utilizado, significa um animal, de um modo preferido, um mamífero e, de um modo mais preferido, um humano. A expressão "transportador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um transportador, adjuvante ou veículo não tóxico que não destrói a atividade farmacológica do composto com o qual está formulado. Os transportadores, adjuvantes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser utilizados nas composições desta invenção incluem, mas não estão limitados a permutadores de iões, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tal como albumina sérica humana, substâncias tampão, tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicéridos parciais de ácidos gordos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, hidrogenofosfato dissódico, hidrogenofosfato de potássio, cloreto de sódio, sais de zinco, silica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinilpirrolidona, substâncias à base de celulose, polietilenoglicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloco de polietileno-polioxipropileno, polietilenoglicol e gordura de lã.
Um "derivado farmaceuticamente aceitável" significa qualquer sal, éster, sal de um éster ou outro derivado não tóxico de um composto desta invenção que, após administração a um recetor, é capaz de proporcionar, direta ou indiretamente, um composto desta invenção ou um metabolito inibitório ativo ou seu resíduo.
As composições da presente invenção podem ser administradas oralmente, parentericamente, por pulverização por inalação, por via tópica, retal, nasal, bucal, vaginal ou através de um reservatório implantado. 0 termo "parentérico", como aqui utilizado, inclui técnicas de injeção ou infusão subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrassinovial, intraesternal, intratecal, intra-hepática, intralesional e intracraniana. De um modo preferido, as composições são administradas por via oral, intraperitoneal ou intravenosa. As formas injetáveis estéreis das composições desta invenção podem ser suspensão aquosa ou oleaginosa. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com técnicas conhecidas na técnica utilizando agentes dispersantes ou molhantes adequados e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril num diluente ou solvente não tóxico parentericamente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser utilizados estão água, solução de
Ringer e solução isotónica de cloreto de sódio. Além disso, os óleos fixos estéreis são convencionalmente empregues como um solvente ou meio de suspensão.
Para este fim, qualquer óleo fixo brando pode ser empregue, incluindo mono ou diglicéridos sintéticos. Os ácidos gordos, tais como ácido oleico e os seus derivados de glicéridos, são úteis na preparação de injetáveis, assim como os óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, tais como azeite ou óleo de rícino, especialmente nas suas versões polioxietiladas. Estas soluções ou suspensões de óleo também podem conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, tal como carboximetilcelulose ou agentes dispersantes semelhantes que são comummente utilizados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis, incluindo emulsões e suspensões. Outros tensioativos vulgarmente utilizados, tais como Tweens, spans e outros agentes emulsionantes ou potenciadores da biodisponibilidade que são comummente utilizados no fabrico de formas de dosagem sólidas, líquidas ou outras podem também ser utilizadas para os fins de formulação.
As composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção podem ser administradas oralmente em qualquer forma de dosagem aceitável oralmente incluindo, mas não limitada a cápsulas, comprimidos, suspensões aquosas ou soluções. No caso de comprimidos para utilização oral, os transportadores comummente utilizados incluem lactose e amido de milho. Agentes de lubrificação, tais como estearato de magnésio, também são tipicamente adicionados. Para administração oral numa forma de cápsula, os diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando são necessárias suspensões aquosas para utilização oral, o ingrediente ativo é combinado com agentes emulsionantes e de suspensão. Se desejado, determinados agentes edulcorantes, aromatizantes ou corantes também podem ser adicionados.
Em alternativa, as composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção podem ser administradas na forma de supositórios para administração retal. Estes podem ser preparados misturando o agente com um excipiente não irritante adequado que é sólido à temperatura ambiente, mas liquido à temperatura retal e, assim, irá fundir-se no reto para libertar o fármaco. Tais materiais incluem manteiga de cacau, cera de abelha e polietilenoglicóis.
As composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção também podem ser administradas topicamente, especialmente quando o alvo do tratamento inclui áreas ou órgãos facilmente acessíveis por aplicação tópica, incluindo doenças do olho, a pele ou o trato intestinal inferior. As formulações tópicas adequadas são facilmente preparadas para cada dessas áreas ou órgãos. A aplicação tópica para o trato intestinal inferior pode ser efetuada numa formulação de supositório retal (ver acima) ou numa formulação de enema adequada. Os adesivos topicamente transdérmicos também podem ser utilizados.
Para aplicações tópicas, as composições farmaceuticamente aceitáveis proporcionadas podem ser formuladas numa pomada adequada contendo o componente ativo suspenso ou dissolvido num ou mais veículos. Os transportadores para administração tópica de compostos desta invenção incluem, mas não estão limitados a óleo mineral, petrolato líquida, petrolato branca, propilenoglicol, polioxietileno, composto de polioxipropileno, cera emulsionante e água. Em alternativa, as composições farmaceuticamente aceitáveis proporcionadas podem ser formuladas numa loção ou creme adequados contendo os componentes ativos suspensos ou dissolvidos num ou mais transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Os transportadores adequados incluem, mas não estão limitados a óleo mineral, monoestearato de sorbitano, polissorbato 60, cera de ésteres cetilicos, álcool cetearilico, 2-octildodecanol, álcool benzilico e água.
Para utilização oftálmica, as composições farmaceuticamente aceitáveis proporcionadas podem ser formuladas como suspensões micronizadas em solução salina estéril isotónica, ajustada ao pH ou, de um modo preferido, como soluções em solução salina estéril isotónica, ajustada ao pH, com ou sem um conservante, tal como cloreto de benzilalcónio. Em alternativa, para utilizações oftálmicas, as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas numa pomada, tal como petrolato.
As composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção também podem ser administradas por aerossol nasal ou por inalação. Tais composições são preparadas de acordo com técnicas bem conhecidas na técnica de formulação farmacêutica e podem ser preparadas como soluções em solução salina, empregando álcool benzilico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para aumentar a biodisponibilidade, fluorocarbonetos e/ou outros agentes convencionais de solubilização ou dispersão.
De um modo mais preferido, as composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção são formuladas para administração oral. Tais formulações podem ser administradas com ou sem alimentos. Em algumas formas de realização, as composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção são administradas sem alimentos. Noutras formas de realização, as composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção são administradas com alimentos. A quantidade de compostos da presente invenção que pode ser combinada com os materiais transportadores para produzir uma composição numa forma de dosagem única variará dependendo do hospedeiro tratado e do modo particular de administração. De um modo preferido, as composições proporcionadas devem ser formuladas de modo que uma dosagem entre 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal/dia do inibidor possa ser administrada a um doente que recebe estas composições.
Também deve ser entendido que uma dosagem especifica e regime de tratamento para qualquer doente particular dependerão de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto especifico empregue, idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de fármacos e o julgamento do médico assistente e a gravidade da doença particular a ser tratada. A quantidade de um composto da presente invenção na composição também dependerá do composto particular na composição.
Utilizações de Compostos e Composições Farmaceuticamente Aceitáveis
Os compostos e as composições aqui descritos são geralmente úteis para a modulação da atividade de uma ou mais enzimas envolvidas na regulação epigenética. A epigenética é o estudo de mudanças hereditárias na expressão génica provocadas por mecanismos diferentes das mudanças na sequência de ADN subjacente. Mecanismos moleculares que desempenham um papel na regulação epigenética incluem metilação de ADN e modificações de cromatina/histona. A metilação da histona, em particular, é critica em muitos fenómenos epigenéticos. A cromatina, a montagem organizada de ADN nuclear e proteínas histonas, é a base para uma grande quantidade de processos nucleares vitais, incluindo regulação da transcrição, replicação, reparação de dano de ADN e progressão através do ciclo celular. Foram identificados vários fatores, tais como enzimas modificadoras de cromatina, que desempenham um papel importante na manutenção do equilíbrio dinâmico da cromatina (Margueron, et al. (2005) Curr. Opin. Genet. Dev. 15: 163-176).
As histonas são os principais componentes proteicos da cromatina. Atuam como carretéis em torno dos quais o ADN se enrola e desempenham um papel na regulação de genes. Existe um total de seis classes de histonas (Hl, H2A, H2B, H3, H4 e H5) organizadas em duas superclasses: histonas nucleares (H2A, H2B, H3 e H4) e histonas de ligação (Hl e H5) . A unidade básica de cromatina é o nucleossoma, que consiste em cerca de 147 pares de bases de ADN enrolados em torno do octâmetro de histona, consistindo em duas cópias de cada das histonas nucleares H2A, H2B, H3 e H4 (Luger, et al. (1997) Nature 389: 251-260).
As histonas, particularmente os resíduos do terminal amino das histonas H3 e H4 e os terminais amino e carboxilo das histonas H2A, H2B e Hl, são suscetíveis a uma variedade de modificações pós-tradução incluindo acetilação, metilação, fosforilação, ribosilação, sumoilação, ubiquitinação, citrulinação, desaminação e biotinilação. O núcleo das histonas H2A e H3 também pode ser modificado. As modificações da histona são parte integrante de diversos processos biológicos, tais como regulação de genes, reparação de ADN e condensação cromossómica. A presente divulgação proporciona compostos e composições para a atividade de modulação de enzimas modificadoras de metilo de histonas. As enzimas modificadoras de metilo de histonas são reguladores fundamentais dos processos celulares e de desenvolvimento. As enzimas modificadoras de metilo de histonas podem ser caracterizadas como histona metil transferases ou histone desmetilases. As enzimas histona desmetilase possuem módulos que medeiam a ligação a resíduos metilados. Por exemplo, as desmetilases múltiplas contêm um domínio Tudor (e. g., JMJD2C/GASC1) ou um domínio PHD (e. g. , JARID1C/SMCX, PHF8).
As especificidades de lisina de muitas histonas metiltransferases foram caracterizadas. Por exemplo SET7/9, SMYD3 e MLLl-5 são específicos para H3K4. SUV39H1, DIM-5 e G9a são específicos para H3K9. SET8 é específico para ο H4K20. DOTl é um exemplo de um domínio não SET contendo histona metilase. DOTl metila H3 na lisina 79.
Assim como demonstraram que as histonas metilases regulam a atividade transcricional, a estrutura da cromatina e o silenciamento génico, foram também verificadas desmetilases que impactam a expressão génica. LSDl foi a primeira histona lisina desmetilase a ser caracterizada. Esta enzima exibe homologia com as oxidases de amina dependentes de FAD e atua como um co-repressor transcricional de genes neuronais (Shi et ai., Cell 119: 941-953, 2004). Foram verificadas demetilases adicionais que definem famílias de desmetilase separadas, incluindo famílias JHDMl (ou KDM2), JHDM2 (ou KDM3), JMJD2 (ou KDM4), JARID (ou KDM5) , JMJD3 (ou KDM6) e JMJD6 (Lan et al., Curr. Opin. Cell Biol. 20 (3): 316-325, 2008).
As desmetilases atuam sobre resíduos de lisina específicos dentro das sequências do substrato e discriminam entre o grau de metilação presente num dado resíduo. Por exemplo, o LSDl remove grupos mono- ou dimetilo de H3K4. Os membros da família JARID1A-D removem grupos trimetilo de H3K4. UTX e JMJD3 desmetilam H3K27, neutralizando os efeitos da atividade da metilase EZH2. As especificidades do substrato de outras desmetilases foram caracterizadas (ver, Shi, Nat. Rev. 8: 829-833, 2007).
Uma classe de histona metilases é caracterizada pela presença de um domínio SET, nomeado após proteínas que compartilham o domínio, Su(var)3-9, potenciador de zeste[E(Z)] e tritorax. Um domínio SET inclui cerca de 130 aminoácidos. As famílias de metilase contendo o domínio SET incluem as famílias SUV39H1, SETl, SET2, EZH2, RIZl, SMYD3, SUV4-20H1, SET7/9 e PR-SET7/SET8 (revistas em Dillon et al., Genome Biol. 6: 227, 2005) . Os membros de uma família incluem tipicamente motivos de sequência semelhantes na proximidade e dentro do domínio SET. O genoma humano codifica mais de 50 metilases da proteína histona contendo o domínio SET, qualquer das quais pode ser utilizada num ensaio aqui descrito. EZH2 é um exemplo de uma metilase contendo um domínio SET humano. EZH2 associa-se com EED (Desenvolvimento de Ectoderme Embrionário) e SUZ12 (supressor do homólogo zeste 12) para formar um complexo conhecido como PRC2 (Complexo Repressivo do Grupo Polycomb 2) possuindo a capacidade de tri-metilato histona H3 na lisina 27 (Cao e Zhang, Mol. Cell 15: 57-67, 2004). Os complexos PRC2 também podem incluir subunidades RBAP46 e RBAP48.
As atividades oncogénicas da EZH2 foram demonstradas por vários estudos. Em experiências de linha celular, a sobre-expressão de EZH2 induz invasão celular, crescimento em ágar macio e motilidade, enquanto a eliminação de EZH2 inibe a proliferação celular e a invasão celular (Kleer et al., 2003,
Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 100: 11606-11611; Varambally et al., (2002), "The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer" Nature 419, 624-629) . Demonstrou-se que EZH2 reprime a expressão de vários supressores de tumores, incluindo E-caderina, DAB2IP e RUNX3 entre outros. Nos modelos de xenoenxerto, a desativação de EZH2 inibe o crescimento do tumor e metástase. Recentemente, demonstrou-se que a modulação negativa de EZH2 em modelos murinos bloqueia a metástase do cancro da próstata (Min et al., "An oncogene-tumor suppressor cascade drives metastatic prostate cancer by coordinately activating Ras and nuclear factor- kappaB", Nat Med. mar de 2010; 16(3):286-94). A sobre-expressão de EZH2 está associada à agressividade de determinados tipos de cancro, como o cancro da mama (Kleer et al., Proc. Nat. Acad. Sei. EUA 100: 11606-11611, 2003). Estudos recentes também sugerem que o gene de fusão oncogénica especifica TMPRSS2-ERG do cancro da próstata induz programas epigenéticos repressivos por meio de ativação direta de EZH2 (Yu et al., "An Integrated Network of Androgen Receptor, Polycomb, and TMPRSS2-ERG Gene Fusions in Prostate Cancer Progression", Cancer Cell. 18 de maio de 2010; 17(5):443-454) .
Em algumas formas de realização, os compostos da presente invenção modulam a atividade de uma ou mais enzimas envolvidas na regulação epigenética. Em algumas formas de realização, os compostos da presente invenção modulam a atividade de uma enzima modificadora de metilo de histonas, ou um seu mutante. Em algumas formas de realização, os compostos da presente invenção modulam a atividade de EZH2. Em algumas formas de realização, os compostos da presente invenção regulam ou suprimem a atividade de EZH2. Em algumas formas de realização, os compostos da presente invenção são antagonistas da atividade de EZH2.
Em algumas formas de realização, os compostos e composições da presente invenção são úteis no tratamento de doenças e/ou distúrbios associados a uma enzima modificadora de metilo de histonas. Consequentemente, em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método de modulação de uma doença e/ou distúrbio associado a uma enzima modificadora de metilo de histonas. Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método de tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença e/ou distúrbio associado com uma enzima modificadora de metilo de histonas compreendendo o passo de administração de um composto ou composição de Fórmula II.
Em algumas formas de realização, os compostos e as composições da presente invenção são úteis no tratamento de doenças e/ou distúrbios associados à sobre-expressão de EZH2. Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método de tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença e/ou distúrbio associado com a sobre-expressão de EZH2 compreendendo o passo de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em algumas formas de realização, o método acima compreende adicionalmente o passo preliminar de determinar se o indivíduo está a sobre-expressar EZH2.
Em algumas formas de realização, os compostos e composições da presente invenção são úteis no tratamento de doenças e/ou distúrbios associados à proliferação celular. Em algumas formas de realização, os compostos e composições da presente invenção são úteis no tratamento de doenças e/ou distúrbios associados à desregulação do ciclo celular ou reparação do ADN. Em algumas formas de realização, os compostos e as composições da presente invenção são úteis no tratamento do cancro. Tipos exemplificativos de cancro incluem cancro da mama, cancro da próstata, cancro do cólon, carcinoma de células renais, cancro de glioblastoma multiforme, cancro da bexiga, melanoma, cancro de brônquios, linfoma e cancro do fígado. 0 estudo de deleções de EZH2, mutações de troca de sentido e de alteração da grelha de leitura sugere que EZH2 funciona como um supressor de tumores em distúrbios sanguíneos, tais como síndromes mielodisplásicas (MDS) e malignidades mieloides (Ernst et ai., Nat Genet. 2010 Ago; 42 (8): 722-6; Nikoloski et ai., Nat Genet, ago de 2010; 42 (8):665-7). Consequentemente, em algumas formas de realização, os compostos e composições da presente invenção são úteis no tratamento de doenças e/ou distúrbios associados com a presença de uma forma mutante de EZH2. Em algumas formas de realização, os compostos e composições da presente invenção são úteis no tratamento de doenças e/ou distúrbios associados com a presença de Y641N EZH2. Em alguma forma de realização, a doença ou distúrbio associado com a presença de uma forma mutante de EZH2 é um linfoma de células B humano. Em algumas formas de realização, a doença e/ou distúrbio associado à presença de Y641N EZH2 é linfoma folicular ou linfoma de células B grandes difusas. Em algumas formas de realização, os compostos ou composições da presente invenção são úteis no tratamento de distúrbios sanguíneos, tais como síndromes mielodisplásicas, leucemia, anemia e citopenia. Sneeringer et al., "Coordinated activities of wild-type plus mutant EZH2 drive tumor-associated hypertrimethylation of lysine 27 on histone H3 (H3K27) in human B-cell lymphomas", Proceedings of the National Academy of Sciences, PNAS Edição Prévia publicada antes da impressão em 15 de novembro de 2010.
Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método para reduzir a atividade de EZH2 num indivíduo compreendendo o passo de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método para reduzir a atividade de EZH2 do tipo selvagem num indivíduo compreendendo o passo de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método de redução da atividade de uma forma mutante de EZH2 num indivíduo compreendendo o passo de administração de um composto ou composição de Fórmula II, em que a forma mutante de EZH2 é Y641N EZH2. Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método de tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença e/ou distúrbio associado com EZH2 compreendendo o passo de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método de tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença e/ou distúrbio associado com EZH2 de tipo largo compreendendo o passo de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método de tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença e/ou distúrbio associado com uma forma mutante de EZH2 compreendendo o passo de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método de tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença e/ou distúrbio associado com uma forma mutante de EZH2 compreendendo o passo de administração de um composto ou composição de Fórmula II, em que a forma mutante de EZH2 é Y641N EZH2. Em algumas formas de realização, o método acima compreende adicionalmente o passo preliminar de determinar se o sujeito está a expressar uma forma mutante de EZH2, tal como Y641N EZH2. Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método para reduzir a atividade de uma forma mutante de EZH2, tal como Y641N EZH2, num indivíduo que dele necessite, compreendendo o passo de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em algumas formas de realização, a presente invenção proporciona um método de tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença e/ou distúrbio associado a uma forma mutante de EZH2 compreendendo o passo de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em algumas formas de realização, essa determinação é feita determinando se o indivíduo aumentou os níveis de trimetilação específica de histona H3 Lys-27 (H3K27me3), em comparação com um indivíduo conhecido por não expressar uma forma mutante de EZH2.
EQUIVALENTES
Os exemplos representativos que se seguem pretendem ajudar a ilustrar a invenção, e não se destinam a, nem devem ser interpretados como, limitando o âmbito da invenção. De facto, várias modificações da invenção e muitas outras suas formas de realização, além das aqui mostradas e descritas, tornar-se-ão evidentes para os especialistas na matéria a partir do conteúdo completo deste documento, incluindo os exemplos que se seguem e as referências à literatura científica e de patentes aqui citada.
Será entendido que, para as preparações de compostos aqui descritas, quando a HPLC de fase inversa é utilizada para purificar um composto, pode existir um composto como um sal de adição de ácido. Em algumas formas de realização, um composto pode existir como um ácido fórmico ou sal de ácido mono-, di- ou tri-trifluoroacético.
Será ainda entendido que a presente invenção contempla compostos individuais aqui descritos. Quando os compostos individuais exemplificados são isolados e/ou caracterizados como um sal, por exemplo, como um sal de ácido trif luoroacético, a presente invenção contempla uma base livre do sal, bem como outros sais farmaceuticamente aceitáveis da base livre.
Os exemplos seguintes contêm importantes informações adicionais, exemplificação e orientação que podem ser adaptadas à prática desta invenção em suas várias formas de realização e nos seus equivalentes.
Os procedimentos para a preparação dos compostos exemplificados abaixo, bem como compostos adicionais/ intermediários nos esquemas sintéticos podem ser encontrados no Pedido Internacional N° PCT/US2013/025639, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência.
EXEMPLOS
Conforme ilustrado nos Exemplos abaixo, em determinadas formas de realização exemplificativas, os compostos são preparados de acordo com os seguintes procedimentos gerais. Será entendido que, embora os métodos sintéticos e os Esquemas representem a síntese de determinados compostos da presente invenção, os seguintes métodos e outros métodos conhecidos de um especialista na matéria podem ser aplicados a todos os compostos e subclasses e espécies de cada destes compostos, como aqui descrito.
Salvo indicação em contrário, todos os solventes, produtos quimicos e reagentes foram obtidos comercialmente e utilizados sem purificação. Os espetros de RMN de ΧΗ foram obtidos em CDCI3, dg-DMSO, CD3OD ou dg-acetona, a 25 °C em 300 MHz numa OXFORD (Varian) com desvio químico (δ, ppm) referido relativo a TMS como um padrão interno. Os cromatogramas e espetros de HPLC-MS foram obtidos com o sistema Shimadzu LC-MS-2020. A análise quiral e a purificação foram obtidas com Yilite P270.
Exemplo 1. Síntese dos Compostos 327 e 346 e Compostos e Intermediários Relacionados. Os compostos do título deste Exemplo e outros compostos relacionados foram preparados de acordo com o seguinte esquema geral. Além disso, quando indicado, as modificações deste esquema são divulgadas para a síntese de compostos ainda adicionais relacionados da invenção e seus intermediários.
Passo 1: 4-(((terc-butilsulfinil)imino)metil)piperidina-l-carboxilato de (S,E)-terc-butilo:
A um balão de fundo redondo carregado com uma barra de agitação magnética foi adicionada (S)-2-metilpropano-2-sulfinamida (20,46 g, 169 mmol), 4-formilpiperidina-l-carboxilato de terc-butilo (30 g, 141 mmol), DCM (300 mL) e Ti(OEt)4 (59,0 mL, 281 mmol). A solução foi agitada à temperatura ambiente durante 3 h antes de se extinguir com solução salina (80 mL) . A solução foi agitada durante 30 minutos antes da filtração. O bolo de filtração foi lavado com DCM e o filtrado foi colocado num funil de separação e lavado com água. As camadas orgânicas foram secas sobre Na2S04, filtradas e concentradas in vácuo. O resíduo em bruto solidificado para o composto do título (29 g, 92 mmol, 65,1% de rendimento) m/z 217. O intermediário mostrado na tabela seguinte foi preparado de acordo com o procedimento geral descrito no Passo 1 usando os materiais de partida e modificações apropriados.
Passo 2: 4-((S)-1-((R ou S)-1,1-dimetiletilsulfinamido) etil)piperidina-l-carboxilato de terc-butilo:
A um balão de fundo redondo carregado com uma barra de agitação magnética foi adicionado 4-((terc -butilsulfinilimino) metil)piperidina-l-carboxilato de (S,E)-terc-butilo (36,4 g, 115 mmol), DCM (400 mL) e a solução foi arrefecida para 0 °C num banho de gelo com agitação. A esta solução foi adicionado MeMgBr (77 ml, 230 mmol) (3 M em éter dietilico) e a reação foi agitada durante 4 h enquanto se aqueceu até à temperatura ambiente. A reação foi cuidadosamente extinta através da adição de solução aquosa saturada de NH4CI. O sólido foi decomposto pela adição de HC1 1 N. As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída com DCM. As fases orgânicas combinadas foram secas sobre Na2SC>4, filtradas, concentradas in vácuo para dar o composto do título (29 g, >9:1 dr) , o qual foi utilizado no passo seguinte sem purificação adicional. O intermediário mostrado na tabela seguinte foi preparado de acordo com o procedimento geral descrito no Passo 2 utilizando os materiais de partida e modificações apropriados.
Passo 3: 4-(l-aminoetil)piperidina-l-carboxilato de (R ou S)-terc-butilo:
A um balão de 1 L de fundo redondo carregado com uma barra de agitação magnética foi adicionado 4-((S)-1-((S)-1,1-dimetiletilsulfinamido)etil)piperidina-l-carboxilato de terc-butilo em bruto (29 g), foi recuperado em MeOH (200 mL) antes da adição de uma solução de HC1 4 N em 1,4-dioxano (24,06 mL, 96 mmol) . A solução resultante foi então agitada à temperatura ambiente durante 1 h. 0 metanol foi então removido in vácuo para se obter um óleo viscoso que foi tratado com uma solução saturada aquosa de NaHCCh (~ 500 mL) e extraída com acetato de etilo (2 χ 500 ml). Esta fase orgânica foi combinada, seca com MgS04, filtrada e o solvente foi removido in vácuo para dar o composto do título (27 g) , o qual foi utilizado sem purificação adicional. O intermediário mostrado na tabela seguinte foi preparado de acordo com o procedimento geral descrito no Passo 3 usando os materiais de partida apropriados.
Passo 4: 2-(2-bromofenil)-3-oxobutanoato de metilo:
Um balão de fundo redondo foi carregado com uma barra de agitação magnética e 2-(2-bromofenil) acetato de metilo (25 g, 109 mmol) e THF (50 mL). Esta solução foi arrefecida para -78 °C antes da adição, gota a gota, de uma solução 1 M de LiHMDS em THF (218 mL, 218 mmol) . A reação foi agitada durante 30 minutos a -78 °C antes da adição de 1-(lH-imidazol-l-il)etanona (14,42 g, 131 mmol) dissolvida numa mistura de THF:DMF (112 mL de THF, 24 mL de DMF) . A solução foi agitada durante 1 h antes de se extinguir com uma solução saturada aquosa de NH4CI (~250 mL) e diluir com EtOAc. As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (~ 2 x 250 mL) . O extrato orgânico combinado foi lavado com solução salina, seca sobre Na2S04, filtrada, e concentrada in vácuo. O resíduo em bruto foi purificado por cromatografia em silica gel utilizando um eluente de acetato de etilo/hexanos (10:1) para dar 2-(2-bromofenil)-3-oxobutanoato de metilo (32,5 g, 102 mmol, 93% de rendimento).
Os intermediários mostrados na tabela seguinte foram preparados de acordo com o procedimento geral descrito no Passo 4 utilizando os materiais de partida apropriados.
Passo 5: 4-(1-(3-(2-bromofenil)-4-metoxi-4-oxobut-2-en-2- ilamino)etil)piperidina-l-carboxilato de (R ou S, E e Z)-terc-butilo:
A um balão de fundo redondo foi adicionado 4-(1-aminoetil)piperidina-l-carboxilato de (R ou S)-terc-butilo (9,35 g, 40,9 mmol), EtOH (75 mL), e 2-(2-bromofenil)-3-oxobutanoato de metilo (7,40 g, 27,3 mmol) (do Passo 4). A esta solução foi adicionado AcOH (1,563 ml, 27,3 mmol) e a reação foi aquecida de um dia para o outro a 85 °C antes de ser arrefecida até à temperatura ambiente e concentrada. O resíduo em bruto foi purificado através de cromatografia em sílica gel (330 g, 100% de hexanos a 25% de EA em hexanos) para proporcionar o composto do título (6,45 g, 13,40 mmol, 49,1% de rendimento).
Os intermediários mostrados na tabela seguinte foram preparados de acordo com o procedimento geral descrito no Passo 5 utilizando os materiais de partida apropriados.
Passo 6: 1-(1-(1-(terc-butoxicarbonil)piperidin-4-il)etil)- 2-metil-lH-indole-3-carboxilato de (R ou S)-metilo:
Um balão de fundo redondo de 250 mL foi carregado com uma barra de agitação magnética, 4-(1-3- (2-bromofenil)-4-metoxi-4-oxobut-2-en-2-ilamino)etil)piperidina-l-carboxilato de (R ou S, Z)-terc-butilo (3,33 g, 6,92 mmol), pré-catalisador II RuPhos (Metanossulfonato (2-diciclo-hexilfosfino-2',6'-di-i-propoxi-1,1'-bifenilo)(2-amino-l,1'-bifenil-2-il)paládio (II)) (0,463 g, 0,553 mmol), diciclo-hexil(2',6'-diisopropoxibifenil-2-il)fosfina (0,387 g, 0,830 Mmol), 1,4-dioxano anidro (27,7 mL, 6,92 mmol) e metóxido de sódio (0,561 g, 10,38 mmol). A mistura reacional foi purgada e cheia de novo com azoto e aquecida para 100 °C com agitação de um dia para o outro antes de ser deixada arrefecer até à temperatura ambiente. A reação foi diluída com acetato de etilo (~ 100 ml) e a mistura foi filtrada através de um leito de terra de diatomáceas. O filtrado foi pré-absorvido em sílica gel (~ 30 g) e purificado por cromatografia em sílica gel (120 g) utilizando acetato de etilo/hexanos (1:1) como eluente para dar o composto do título (2,01 g, 4,77 mmol, 68,9% de rendimento)
Os intermediários mostrados na tabela seguinte foram preparados de acordo com o procedimento geral descrito no Passo 6 utilizando os materiais de partida apropriados.
Passo 7: Ácido (R ou S)-2-metil-l-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)etil)-lH-indole-3-carboxílico:
Um balão de fundo redondo de 1 L foi carregado com uma barra de agitação magnética, 2-metil-l-(1-(tetra-hidro-2H-piran- 4-il) etil)-lH-indole-3-carboxilato de (R ou S)-metilo (11,60 g, 38,5 mmol), etanol (96 ml, 38,5 mmol) e NaOH aquoso 6 N (64,1 mL, 385 mmol). O balão foi equipado com um condensador de refluxo e aquecido a refluxo durante 6 h antes de ser deixado arrefecer até à temperatura ambiente. Os voláteis foram removidos in vácuo e a mistura resultante foi vertida em HC1 a 10% (-300 mL). Formou-se um precipitado que foi recolhido por filtração sob vácuo utilizando um funil de Buchner. 0 bolo de filtração foi enxaguado com uma porção adicional de água (-200 mL) , recolhido e seco sob vácuo para proporcionar o composto do título (10,87 g, 35,9 mmol, 93% de rendimento) como um sólido esbranquiçado.
Os intermediários mostrados na tabela seguinte foram preparados de acordo com o procedimento geral descrito no Passo 7 utilizando os materiais de partida apropriados.
Passo 8: 4-(1-(3-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metilcarbamoil)-2-metil-lH-indol-l-il)etil)piperidina-l-carboxilato de (R ou S)-terc-butilo (Composto 327).
Um balão de fundo redondo de 250 mL foi carregado com uma barra de agitação magnética, ácido (R ou S)-1-(1-(1-(terc-butoxicarbonil)piperidin-4-il)etil)-2-metil-lH-indole-3-
carboxílico (1,950 g, 5,05 mmol), cloridrato de 3-(aminometil)-4-metoxi-6-metilpiridin-2(1H)-ona (2,065 g, 10,09 mmol), DMF (25,2 ml, 5,05 mmol) , Base de Hunig (3,52 mL, 20,18 mmol) . A mistura reacional foi arrefecida para 0 °C e adicionou-se COMU (2,16 g, 5,05 mmol) . A reação foi deixada a agitar de um dia para o outro à temperatura ambiente. A mistura reacional foi diluída com água e extraída com EtOAc. O extrato orgânico combinado foi lavado com solução salina, seco com MgSCU, filtrado e concentrado in vácuo para dar o material em bruto que foi purificado através de cromatografia em sílica gel (120 g) utilizando MeOH/acetato de etilo (1:5) como eluente para dar o composto do título (1,86 g, 3,29 mmol, rendimento de 65,3%). LCMS 537 (M+l)+ RMN de XH (400 MHz, DMSO-de) 5=11,83-11,71 (m, 1 H) , 7,80 (br. s., 1 H) , 7,73 (d, J=7,6 Hz , 1 H) , 7,62 (d, J=7, 8 Hz, 1H) , 7,06 (td, J=7,l, 14,4 Hz, 2 H), 6,21 (s, 1H) , 4,32 (br. s., 2H ), 4,16 (br. s., 1H) , 4,02 (br. s., 1H) , 3,85 (s, 3H) , 3,75 (br. s., 1H) , 2,70 (br. s., 1 H) , 2,58 (s, 3H) , 2,37 (br. s., 1H) , 2,21 (s, 3H) , 1,90 (d, J=12, 9 Hz, 1H) , 1,53 (d, J= 6,9 Hz, 3H) , 1,35 (s, 10H) , 1,21 (br. s., 1H) , 0,89 (d, J=8,7 Hz, 1 H), 0,67 (d, J=ll,8 Hz, 1H) .
Os compostos mostrados na tabela seguinte foram preparados de acordo com o procedimento geral descrito no Passo 8 utilizando os materiais de partida apropriados. As estruturas dos compostos são mostradas na Figura 1.
Passo 9: Cloridrato de (2? ou S)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo- 1.2- di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-l-(1-(piperidin-4-il)etil)-lH-indole-3-carboxamida (Composto 326).
Um balão de 250 mL de fundo redondo foi carregado com uma barra magnética de agitação, 4-(1-(3 -((4-metoxi-6-metil-2-oxo- 1.2- di-hidropiridin-3-il)metilcarbamoil)-2-metil-lH-indol-l- il)etil)piperidina-l-carboxilato de (R ou S)-terc-butilo (Composto 327) (1,850 g, 3,45 mmol) , MeOH (13,79 mL, 3,45 mmol) e HC1 (2,59 mL, 10,34 mmol) (4 N em dioxano) . A reação foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 6 h antes de ser concentrada in vacuo para dar o composto do titulo (1,65 g, 3,14 mmol, 91% de rendimento). LCMS 437 (M+l)+. 0 composto mostrado na tabela seguinte foi preparado de acordo com o procedimento geral descrito no Passo 9 utilizando os materiais de partida apropriados. A estrutura deste composto é mostrada na Figura 1.
Passo 10: 4-(1-(3-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metilcarbamoil)-2-metil-lH-indol-l-il)etil) piperidina-l-carboxilato de (R ou S)-isopropilo (Composto 346).
Um balão de fundo redondo de 250 mL foi carregado com uma barra de agitação magnética, (R ou S)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-l-(1-(piperidin-4- il)etil)-lH-indole-3-carboxamida (0,467 g, 0,987 mmol), DMF (2,468 mL, 0,987 mmol), THF (2,468 mL, 0,987 mmol) e N-etil-N-isopropilpropan-2-amina (0,638 g, 4,94 mmol). A reação foi arrefecida até 0 °C e adicionado, gota a gota, carbonocloridrato de isopropilo (0,160 mL, 1,086 mmol) através de uma seringa. A reação foi deixada a agitar durante 2 h à temperatura ambiente e depois foi tratada com LiOH 5 N durante 1 h para remover
qualquer piridona acilada. Este material foi extraído com acetato de etilo, lavado com solução salina, seco com MgSCb e filtrado e concentrado in vacuo. O material resultante foi purificado através de cromatografia em sílica gel (50 g) utilizando acetato de etilo/MeOH (5:1) como eluente para dar o composto do título puro sob a forma de um sólido amarelo pálido (0,300 g, 0,545 mmol, rendimento de 55,2%) . LCMS 523 (M+l)+ ; RMN de 1H (DMS0-d6, 400 MHz) δ 11,59 (br. S., 1 H) , 7,74 (d, J=7,8 Hz, 1 H), 7,69 (t, J=4, 9 Hz, 1 H) , 7,62 (D, J=7,8 Hz, 1H) , 7,13-7,01 (m, 2 H) , 6,15 (s, 1H), 4,78-4, 67 (m, 1 H) , 4,32 (d, J=4, 9 Hz, 2 H), 4,23-4,12 (m, 1H) , 4,12-4,02 (m, 1H), 3,84 (s, 3H) , 3,82- 3,74 (m, 1H) , 2, 79-2, 66 (m, 1 H) , 2,58 (s, 3H) , 2,46-2,34 (m, 2 H) , 2,20 (s, 3H), 1,96-1,88 (m, 1H), 1,58-1,46 (m, 4 H), 1,15 (d, J=6, 0 Hz,
Os compostos mostrados na tabela seguinte foram preparados de acordo com o procedimento geral descrito no Passo 10 utilizando os materiais de partida apropriados. As estruturas dos compostos são mostradas na Figura 1.
Exemplo de Referência 2. Síntese de (R ou S)-1-(1-(1-isopropilpiperidin-4-il) etil)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-ilo)metil)-2-metil-lH-indole-3-carboxamida (Composto 358)
Um frasquinho de 25 mL foi carregado com uma barra de agitação magnética, (R ou S)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-l-(1-(piperidin-4-il)etil)-1H-indol-3-carboxamida, THF (2,1414 mL, 0,211 mmol), propan-2-ona (0,061 g, 1,057 mmol) e triacetoxiboro-hidreto de sódio (0,224 g, 1,057 mmol). A reação foi deixada a agitar à temperatura ambiente durante 12 h. A reação foi extinta inversa sobre uma solução saturada aquosa de NaHCCb, axtraida com acetato de etilo e ácido clorídrico concentrado in vacuo. O material resultante foi tratado com 10 mL de amónia 7 N em MeOH e foi concentrado in vacuo para produzir material que foi purificado por meio de cromatografia de sílica gel (10 g utilizando DCM/MeOH/NfUOH (90:1:0,1) como eluente para se obter 33 Mg, (0,065 mmol, 31,0% de rendimento) do composto do título como um sólido branco). LCMS 479 (M+l)+; RMN de ΧΗ (DMSO-dá, 400 MHz) δ 11,59, (s., 1H) 7, 64-7,82 (m, 2H) , 7,59 (d, 1H) , 6,95-7,17 (m, 2H) , 6,15 (s, 1H) , 4,32 (d, 2H) , 4,04-4,24 (m, 1H) , 3,84 (□, 3H) , 2,77-2,93 (□, 2H) , 2,68 (□, 1H) , 2,60 (□, 3H) , 2,20 (□, 3H) , 2,08-2,15 (□, 1H) , 1,92 (□, 1H) , 1,83 (□ p., 1H) , 1,54 (□, 3H) , 1,27 - 1,43 (□, 2H) 0,91 (□, 6H), 0,71-0,67 (□, 2H).
Os compostos apresentados na tabela seguinte foram preparados de acordo com o procedimento geral descrito neste Exemplo utilizando os materiais de partida apropriados. As estruturas dos compostos são mostradas na Figura 1.
Exemplo 3. Sintese de (R ou S)-1-(1-(1-(2-fluoroetil)piperidina-4-il)etil)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-dihidropiridina-3-il)metil)-2-metil-lH-indole-3-carboxamida (Composto 356):
Um frasquinho de 25 mL foi carregado com uma barra de agitação magnética, cloridrato de (R ou S)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-l-(1- (piperidin-4-il)etil)-lH-indol-3-carboxamida (0,062 g, 0,131 mmol), K2CO3
(0,072 g, 0,524 mmol), MeCN (0,655 mL, 0,131 Mmol), DMF (0,262 mL, 0,131 mmol) e l-bromo-2-fluoroetano (0,020 mL, 0,262 mmol). A reação foi tapada e aquecida para 82 °C com agitação durante 4 h. A reação foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente, filtrada e o filtrado foi pré-absorvido sobre sílica gel (12 g) . O material foi purificado através de cromatografia de SÍO2 (25 g) utilizando DCM/MeOH/Et3N (85:15:0,5) como eluente para proporcionar o composto do título como um sólido esbranquiçado (30 mg, 0, 059 mmol, 45,1% de rendimento) . LCMS 483 (M+l)+; RMN de XH (DMSO-CÍ6, 400 MHz) δ 11,59 (s, 1H) , 7,75-7, 68 (m, 2H) , 7,60 (d, 1 H) 7, 09-7,03 (m, 2H) , 6,15 (s, 1H) 4,53-4,51 (m, 1H), 4,42-4,39 (m, 1H), 4,32 (d, 2H), 4,24-4,2 (m, 1H) , 3,84 (s, 3H) , 2,98 (br. d., 1H) , 2,70-2,49 (m, 4H) , 2,60 (s, 3H) , 2,20 (s, 3H) , 2,01 (dt, 1H) , 1, 92-1, 90 (m, 1H) , 1,75- 1,71 (m, 1H) 1,54 (d, 3H) , 1,38-1,36 (m, 1H) , 1, 02-0, 98 (m, 1H) , 0,7-0,66 (br. d., 1H) .
Os compostos apresentados na tabela seguinte foram preparados de acordo com o procedimento geral descrito neste
Exemplo utilizando os materiais de partida apropriados. As estruturas dos compostos são mostradas na Figura 1.
Exemplo de Referência 4. Síntese de (R ou S)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-l-(1-(1-(pirimidin-2-il)piperidin-4-il)etil)-lH-indol-3-carboxamida (Composto 361).
A um frasquinho re-vedável foi adicionado 2-cloropirimidina (185 mg, 1,611 mmol), (R ou S)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-ilo)metil)-2-metil-l-(1-(piperidin-4-il)etil)-lH-indol-3-carboxamida (508 mg, 1, 074 mmol) e EtOH (8 mL) . A esta solução adicionou-se Et3N (449 yL, 3,22 mmol). O frasquinho foi vedado e aquecido para 100 °C de um dia para o outro. A solução foi deixada arrefecer até à temperatura ambiente e concentrada in vacuo. O resíduo em bruto foi purificado através de cromatografia de sílica gel (hexanos: (3:2 DCM:IPA)) para proporcionar o composto do título como um sólido (357 mg, 0,694 mmol, rendimento de 64,6%). LCMS 515 (M+l)+; RMN de 1H (DMSO-d6, 400 MHz) δ 11,60 (s, 1 H) , 8,30 (d, J=4,7 Hz, 2 H) , 7,76 (d, J=1,6 Hz, O composto mostrado na tabela seguinte foi preparado de acordo com o procedimento geral descrito neste Exemplo utilizando os materiais de partida apropriados. A estrutura do composto é mostrada na Figura 1.
Exemplo de Referência 5. Sintese de (R ou S)-1-(1-(1-(2-hidroxietil)piperidin-4-il)etil)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-lH-indole-3-carboxamida (Composto 347).
A um tubo vedado carregado com uma barra de agitação magnética foi adicionada (R ou S)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo- 1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metilo-l-(1-(piperidin-4-il)etil)-lH-indole-3-carboxamida (0,1 g, 0,229 mmol), foi adicionado DCM (3 mL) e a reação foi arrefecida para 0 °C. À mistura reacional arrefecida adicionou-se oxirano, que foi condensado no frasquinho de reação (~1 mL). A reação foi deixada em agitação até à temperatura ambiente durante 4 h e foi então concentrada in vacuo para dar o material em bruto que foi purificado através de cromatografia de silica gel (12 g) utilizando acetato de etilo/MeOH (4:1) como eluente para proporcionar o composto do titulo como um sólido branco (50 mg). LCMS 481 (M+l)+; RMN de XH (DMSO-d6, 400 MHz) δ) δ 11,58 (s, 1 H) , 7,77-7, 65 (m, 2 H) , 7,59 (d, J=1,8 Hz, 1 H) , 7,11-6,99 (m, 2 H) , 6,14 (s, 1 H) , 4,54-4,44 (m, 1 H) , 4,31 (d, J=5,l Hz, 3 H) , 4,13 (dd, J= 7, 1, 10,3 Hz, 1 H) , 3,83 (s, 3 H) , 3,42 (q, J=6,0 Hz, 2 H), 2,93 (br. s., 1 H), 2,71-2,56 (m, 4 H), 2,31 (br. s., 2 H) , 2,19 (s, 3 H) , 2,03-1,83 (m, 2 H) , 1,64 (br. s., 1 H) , 1,53 (d, J=6.9 Hz, 3 H) , 1,32 (d, J=ll,l Hz, 1 H) , 1,02 (d, J=10,3 Hz, 1 H), 0,65 (d, J=ll,8 Hz, 1 H) .
Os compostos apresentados na tabela seguinte foram preparados de acordo com o procedimento geral descrito neste
Exemplo utilizando os materiais de partida apropriados. As estruturas dos compostos são mostradas na Figura 1.
Exemplo 6. Sintese de (R ou S)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo- 1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-6-fenil-l-(1-(tetrahidro-2H-piran-4-il)etil)-lH-indole-3-carboxamida (Composto 374) .
Um tubo de reação de 25 mL foi carregado com uma barra magnética de agitação, ácido fenilborónico (72,6 mg, 0,596 mmol), K3PO4 (103 mg, 0,447 mmol), pré-catalisador X-Phos (cloro (2-diciclo-hexilfosfino-2',4',6'-triisopropil-l,1'-bifenil) [2 - (2-aminoetil)fenil)]paládio (II)) (4,92 mg, 5,96 ymol) e o frasquinho foi vedado. O frasquinho foi evacuado/cheio de novo com azoto (3x) antes da adição de 6-cloro-2-metil-l-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)etil)-lH-indole-3-carboxilato de emtilo (Composto 314) (100 mg, 0,298 mmol) como uma solução em I, 4-dioxano (1 mL). O frasquinho para injetáveis foi então aquecido para 100 °C de um dia para o outro com agitação. O frasquinho foi então deixado arrefecer até à temperatura ambiente e a reação foi concentrada in vacuo. O resíduo em bruto foi purificado através de cromatografia em SÍO2 (10 g) utilizando um eluente de acetato de etilo/hexanos (4:1), o composto do título como um sólido branco (106 mg, 0,281 mmol, rendimento de 94%)). LCMS 514 (M+l)+; RMN de ΧΗ RMN de ΧΗ (400 MHz, DMSO-de) δ = II, 59 (s, 1 Η), 7,98-7,84 (m, 2 Η), 7,75-7,67 (m, 3 Η), 7,47 (t, J=1, 8 Hz, 2 H) , 7,39 (d, J=8,5 Hz, 1H) , 7,35-7,27 (m, 1H) , 6,15 (s, 1H) , 4,35 (d, J=4,9 Hz, 2 H) , 4,25-4,12 (m, 1H) , 3,93 (d, J=8,5 Hz, 1H) , 3, 86-3,77 (m, 3H) , 3,67 (d, J=8,5 Hz, 1H) , 3,39-3,32 (Μ, 1 H) , 3,10-3,00 (m, 1H) , 2,62 (s, 3H) , 2,21 (s, 3H) , 1,85 (d, J=10,0 Hz, 1 H) , 1,63-1,49 (m, 4 H) , 1,45-1,33 (m, 1 H), 1,20-0, 99 (m, 1 H), 0,66 (d, J=12,0 Hz, 1 H) .
Exemplo de Referência 7. Síntese de ácido (R ou S)-2-(4-(1-(3-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il) metilcarbamoil)2-metil-lH-indol-l-il)etil)piperidin-l-il) acético (Composto 364).
Um balão de fundo redondo que foi carregado com uma barra de agitação magnética foi adicionado 2-(4-(1-(3-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l, 2-di-hidropiridin-3-ilmetilcarbamoil)-2-metil-lH- indol-l-il)etil)piperidin-l-il)acetato de (R ou S)-etilo (Composto 363) (69 mg, 0,132 mmol), THF (1,5 mL) (1,5 mL) e água (0,75 mL). A esta solução foi adicionada hidróxido de litio mono-hidratado (5,54 mg, 0,132 mmol) e a reação foi agitada à temperatura ambiente durante 1 h. Os orgânicos foram removidos sob pressão reduzida e a solução aquosa resultante foi purificada através de HPLC de fase inversa (água/MeCN) 0 95% para dar o composto do titulo (66 mg, 0,108 mmol, rendimento de 82%) . LCMS 514 (M+l)+ RMN de XH (400 MHz, DMSO-de) δ = 11,67 (s, 1 H) , 9,65 (s, 1 H) , 7, 84-7, 68 (m, 2 H) , 7,63 (d, J=7,4 Hz, 1 H) , 7,14-7,03 (m, 2 H) , 6,18 (s, 1 H) , 4,33 (d, J=3, 6 Hz, 2 H) , 4,27-4,15 (m, 1 H) , 4,04 (br. s., 2 H) , 3,85 (s, 3 H) , 3,57 (s, 1 H) , 3,35- 3,23 (m, 1 H) , 3,14-2,99 (m, 1 H) , 2,86-2,74 (m, 1 H) , 2,62 (s, 3 H) , 2,21 (s, 3 H) , 2,18-2,08 (m, 1 H) , 1,75 (s, 1 H) , 1,60- 1,49 (m, 4 H) , 1,46-1,33 (m, 1 H) , 0,92-0,81 (m, 1 H) .
Exemplo 8. Síntese de (2-metil-6-(piridin-3-il)-1-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)etil)-lH-indole-3-carboxilato de R ou S)-metilo. Este intermediário foi utilizado como um material de partida alternativo no Passo 7 estabelecido no Exemplo 1 para a síntese de outros compostos da invenção. 2-metil-1-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)etil) -6-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolano-2-il)-lH-indole-3-carboxilato de (R ou S)-metilo
A um balão de fundo redondo adicionou-se Pd(0Ac)2 (10,03 mg, 0,045 mmol), acetato de potássio (219 mg, 2,233 mmol), 4,4,4',4',5,5,5',5'-octametilo-2,2'-bi(1,3,2-dioxaborolano) (567 mg, 2,233 mmol) e 2-diciclo-hexilfosfino-2',4',6'- triisopropilbifenilo (XPhos) (85 mg, 0,179 mmol) e o frasquinho foi vedado. A este recipinete foi adicionado 6-cloro-2-metil-l-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)etil)-lH-indole-3-carboxilato de (R ou S)-metilo (Passo 6) (500 mg, 1,489 mmol) dissolvido em dioxano (3,4 mL) e a reação foi evacuada/cheia de novo com N2 (3x), antes do aquecimento para 100 °C de um dia para o outro. A reação foi então deixada arrefecer até à temperatura ambiente e foi diluída com EtOAc. A reação foi filtrada através de terra de diatomáceas e o filtrado foi concentrado para proporcionar o composto do título que foi utilizado nas reações subsequentes sem purificação adicional. LCMS 428 (M+l)+. 2-metil-6-(piridin-3-il)-1-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-il) etil)-lH-indole-3-carboxilato de (R ou S)-metilo
A um frasquinho re-vedável foi adicionado K2CO3 (206 mg, 1,488 mmol), PdCÍ2(dppf)-CH2CI2 aducto (60,8 mg, 0,074 mmol) e 0 frasquinho foi vedado. Este frasquinho foi evacuado/cheia de novo com N2 (3x), antes da adição de 2-metil-l-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)etil)-6-(4,4,5,5-tetrametil-l,3,2-dioxaborolan-2-il)-lH-indole-3-carboxilato de (R ou S)-metilo (318 mg, 0,744 mmol) dissolvido em 1,4-dioxano (4 mL) , 3-bromopiridina (71,7 μΐ, 0,744 mmol) e água (400 yL) . A reação foi evacuada/ cheia de novo com N2 (3x) , antes do aquecimento para 100 °C. A solução foi arrefecida até à temperatura ambiente e diluída com EtOAc. A solução foi filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo em bruto foi purificado através de cromatografia de sílica gel (10 g, EtOAc/hex (1:1)) para se obter o composto do título (101 mg, 0,267 mmol, 35,9% de rendimento). LCMS 379 (M+l)+.
Exemplo 9. Outros Intermediários de Carboxilato de Alquilo. Os intermediários de carboxilato de alquilo seguintes foram sintetizados de um modo análogo ao descrito no Passo 2 do Exemplo 1, utilizando um material de partida e reagente apropriados.
Exemplo 10. Outros Compostos da Invenção Produzidos a partir de Intermediários de Ácido Carboxilico. Os compostos seguintes foram sintetizados de um modo análogo ao descrito no Passo 4 do Exemplo 1, utilizando um material de partida apropriado. As estruturas destes compostos são apresentadas na Figura 1.
Exemplo de Referência 11. Síntese de 1-(1-(1,4-dioxan-2-il) etil)-2-metil-lH-indole-3-carboxilato de metilo. 0 composto do título foi utilizado como um material de partida de carboxilato de alquilo alternativo no Passo 3 do Exemplo 1.
Passo 1: 1-(1,4-dioxan-2-il)etanona:
A uma solução de peróxido benzoico (20 g, 141 mmol) em 200 mL de 1,4-dioxano à temperatura ambiente sob atmosfera de azoto adicionou-se biacetilo (24,3 g, 282 mmol). Após a adição, a mistura foi aquecida a refluxo e agitada durante 24 horas. A mistura reacional foi arrefecida para 0 °C. O pH foi ajustado para cerca de 9, adicionando progressivamente hidróxido de sódio 2 N abaixo de 0 °C, extraído com 2-metoxi-2-metilpropano (10 mL x 3) e concentrado para dar 1-(1,4-dioxan-2-ilo etanona (13 g, 36%) como um óleo amarelo que foi utilizado diretamente no passo seguinte sem purificação.
Passo 2: 1-(1,4-dioxan-2-il)etanamina:
A uma solução de 1-(1,4-dioxan-2-il)etanona (12 g, 92,2 mmol) em 1,2-dicloroetano (100 mL) foi adicionada (4-metoxifenil)metanamina (25 g, 184,4 mmol) à temperatura ambiente. A mistura foi deixada a agitar durante 3 horas e, depois, adicionou-se triacetoxiboro-hidreto de sódio (39 g, 184,4 mmol). A mistura resultante foi deixada a agitar durante 48 horas à temperatura ambiente. A mistura reacional foi extinta por adição de água, extraída com diclorometano (100 mL x 3) . A fase orgânica combinada foi seca por sulfato de sódio anidro e depois filtrada. O filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia em coluna em sílica gel (eluído: diclorometano/ metanol 100:1 -► 50:1 -► 20:1) para dar 1-(1,4-dioxan-2-il)-N-(4-metoxibenzil)etanamina (16,4 g, 71%) como um sólido amarelo. LCMS (M+H+) m/z: calcd. 251,15, encontrado 251,9. A uma solução de 1-(1,4-dioxan-2-il)-N-(4-metoxibenzil)etanamina (5 g, 19,9 mmol) em metanol anidro (100 mL) foi adicionado paládio em carbono a 10% (240 mg, 2 mmol), depois purgou-se com hidrogénio (30 psi) , a mistura foi deixada a agitar de um dia para o outro à temperatura ambiente. A mistura reacional foi filtrada e o filtrado foi concentrado para proporcionar o composto do título (2,5 g, 96%) como um sólido castanho.
Os intermediários de amina mostrados na tabela seguinte foram preparados de acordo com o procedimento geral descrito acima utilizando os materiais de partida e modificações apropriados.
Passo 3: 3-((1-(1,4-dioxan-2-il)etil)imino)-2-(2-bromofenil) butanoato de (E)-metilo
A uma solução de 1-(1,4-dioxan-2-il)etanamina (2,5 g, 19 mmol) em metanol (100 mL) adicionou-se 2-(2-bromofenil)-3-oxobutanoato de metilo (5,4 g, 20 mmol) e ácido acético (1,8 g, 30 mmol) . O sistema reacional resultante foi aquecido a refluxo e deixou-se agitar de um dia para o outro. A mistura reacional foi concentrada e purificada por cromatografia de coluna em silica gel (eluido: diclorometano/metanol 50:1 -► 20:1 -► 5:1) o composto do titulo (1 g, 14%) como um sólido castanho. LCMS (M+H+) m/z: calcd. 383, 07, encontrado 384,9.
Os intermediários imino-bromo mostrados na tabela seguinte foram preparados de acordo com o procedimento geral descrito acima utilizando os materiais de partida (por exemplo, uma das aminas apresentadas na tabela no Passo 2 deste exemplo) e modificações apropriados.
Passo 4: 1-(1-(1,4-dioxan-2-il)etil)-2-metil-lH-indole-3- carboxilato de metilo
A uma solução de 3-((1- (1,4-dioxan-2-il)etil)imino)-2-(2- bromofenil)butanoato de (E)-metilo (400 mg, 1,1 mmol) em dioxano (3 ML) adicionou-se cloro [2-(diciclo-hexilfosfino)-3,6-dimetoxi-2 ' ,4',6'-triisopropilbifenil] [2-(2-aminoetil)fenil]Pd(II) (160 mg, 0,2 mmol), 2-diciclo-hexifosfino-2',6'- diisopropoxibifenilo (93 mg, 0,2 mmol) e terc-butóxido de sódio (192 mg, 2 mmol). A mistura reacional resultante foi aquecida para 120 °C com agitação durante 30 minutos num micro-ondas. A mistura reacional foi extinta por adição de água e extraiu-se com acetato de etilo (25 mL x 3) . A fase orgânica combinada foi seca por sulfato de sódio anidro e depois filtrada. O filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia de coluna em silica gel (eluido: éter de petróleo/éster acético 10:1 -► 5:1 -► 2:1) para dar o composto do titulo (282 mg, 89%) como um sólido amarelo. LCMS (M+H+) m/z: calcd. 303,15, encontrado 303,9. O composto mostrado na tabela seguinte foi preparado de acordo com o procedimento geral descrito acima utilizando os materiais de partida (por exemplo, um dos intermediários imino-bromo mostrados na tabela no Passo 3 deste exemplo) e modificações apropriados.
Estes carboxilatos de alquilo também foram utilizados como material de partida no Passo 3 do Exemplo 1 na síntese de determinados compostos da invenção.
Exemplo 12. Separação Quiral do Composto 219 para dar os Compostos 223 e 224. N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di- hidropiridin-3-il)metil)-1-(l-metoxipropan-2-il)-2-metil-lH-indole-3-carboxamida (200 mg) (Composto 219) foi submetida a cromatografia quiral através de cromatografia de fluido supercrítico (SFC) (A: C2H5OH, B: ΝΗ3Ή2Ο. A:B = 55:45 coluna AD) para proporcionar os enantiómeros separados 223 (pico 1) e 224 (pico 2) (60 mg cada) LCMS 398 (M+1)+RMN de ΧΗ (400 MHz, CD3OD) δ 7,69 (d, J=7,2 Hz, 1H) , 7,53 (d, J=7,6 Hz, 1H) , 7,12 (m, 2H) , 6,26 (s, 1H) , 4,80 (m, 1H) , 4,52 (s, 2H) , 3,99 (m, 4H) 3,75 (m, 1H) , 3,20 (s, 3H), 2,62 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 1,59 (d, J=7,2 Hz, 3H). A rotação ótica de cada enantiómero não foi determinada.
Os compostos mostrados na tabela seguinte foram preparados de acordo com o procedimento de cromatografia quiral geral descrito acima. A rotação ótica dos enantiómeros separados não foi determinada, mas o pico de eluição ("Pico 1" ou "Pico 2") é indicado. Estruturas de cada composto são mostradas na Figura 1.
Exemplo 1. Sintese de 1-(2,3-di-hidro-lH-inden-l-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butilo. 0 composto do título como material de partida no Passo 3 do Exemplo 36 na síntese de determinados compostos da invenção. 2-Metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butilo:
A um balão de fundo redondo de 500 mL que contém N-acetil-N-(3-bromopiridin-2-il)acetamida (14,815 g, 57,6 mmol), adicionou-se iodeto de cobre(I) (1, 098 g, 5,76 mmol) , L-prolina (1,327 g, 11,53 mmol), carbonato de césio (28,2 g, 86 mmol), depois acetato de t-butilo (11,47 mL, 69,2 mmol) e dioxano (100 mL) . A reação foi submetida a vácuo/purgada com N2 3x, em seguida, equipada com um septo e uma entrada de N2 e aquecida de um dia para o outro a 70 °C. Os sólidos inorgânicos foram removidos por filtração sobre celite e o bolo foi lavado com 100 mL de EtOAc. Esta solução foi concentrada e o residuo foi partilhado entre 250 mL de solução salina e 250 mL de EtOAc. A camada aquosa foi ainda extraída com EtOAc (2x250 mL) e a camada orgânica combinada foi seca sobre Na2S04, filtrada, concentrada e purificada por CC utilizando 1:1 de EtOAc: Hex como eluente para proporcionar (2,7 g, 20,2%) de 2-metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina- 3-carboxilato de terc-butilo. LRMS (M+H+) m/z: calculado 233,28; encontrado 233,1. 1-(2,3-Di-hidro-lH-inden-l-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3- b]piridina-3-carboxilato de terc-butilo:
Uma solução de 2-metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato de etil-terc-butilo (100 mg, 0,74 mmol), 2,3-di-hidro-lH-inden-l-ol (176 mg, 0,74 mmol), PPh3 (195 mg, 1,49 mmol) foi agitada em THF seco (10 mL) a 0 °C sob uma atmosfera de azoto. A esta mistura adicionou-se, gota a gota, DIAD (150 mg, 1,48 mmol) durante um período de 5 min, e a reação foi diluída à temperatura ambiente durante 16 horas. Lavou-se a mistura com solução salina, secou-se e concentrou-se para se obter o produto em bruto. 0 produto em bruto foi purificado por cromatografia em sílica gel (éter de petróleo/acetato de etilo = 5:1) para proporcionar o 1-(2,3-di-hidro-lH-inden-l-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butilo (150 mg, 60%) . O composto mostrado na tabela seguinte foi preparado de acordo com o procedimento geral descrito acima utilizando os materiais de partida e modificações apropriados.
Cada dos carboxilatos de alquilo acima foi utilizado como material de partida no Passo 3 do Exemplo 1 na síntese de determinados compostos da invenção.
Exemplo 13. Síntese de N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-1-((2R ou 2S, 3R ou 3S)-3- metoxibutan- 2-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxamida (Compostos 261, 266, 267 e 302).
Passo 1: 2-metil-l-(3-oxobutan-2-il)-lH-pirrolo[2,3- b]piridina-3-carboxilato de terc-butilo:
A uma solução de 2-metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3- carboxilato de terc-butilo (5,0 g, 21,53 mmol) em CH3CN (50 mL) foi adicionado CS2CO3 (21,0 g, 64,58 mmol), iodeto de potássio (3,57 g, 21,53 mmol) . A mistura foi agitada a 27 °C durante 30 minutos. Em seguida adicionou-se 3-clorobutan-2-ona (2,75 g, 25, 83 mmol) e a mistura foi agitada a 70 °C durante 12 horas. A mistura foi filtrada e o filtrado foi concentrado. O resíduo foi purificado por coluna (Eluente: éter de petróleo:acetato de etilo = 50:1) para dar 2-metil-l-(3-oxobutan-2-il)-lH-pirrolo [2,3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butilo como um óleo amarelo esverdeado (3,23 g, rendimento 50%) LCMS (M+H+) m/z: calcd 303,37; Encontrado 302,9. RMN de XH (400 MHz, CDCI3) : ã 8,32-8,30 (m, 1H), 8,25-8,23 (m, 1H), 7,17-7,14 (m, 1H) , 5, 50-5,44 (m, 1H), 2,71 (s, 3H) , 1,96 (s, 3H) , 1, 65-1, 67 (d, 3H) , 1,64 (s, 9H) .
Passo 2: 1-(3-Hidroxibutan-2-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3- b]piridina-3-carboxilato de terc-butilo
À solução de 2-metil-l-(3-oxobutan-2-il)-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butilo (3,1 g, 10,25 mmol) em metanol (30 mL) foi adicionado boro-hidreto de sódio (0,30 g, 8,2 mmol) a 0 °C. Após 30 minutos, adicionou-se outro lote de boro-hidreto de sódio (0,30 g, 8,2 mmol) a 0 °C. Após a reação ter sido completada cerca de 2 h depois, adicionou-se, gota a gota, água (30 mL) com muita atenção para extinguir a reação. A mistura foi extraída com CH2CI2. A extração foi seca sobre Na2S04, filtrou-se e concentrou-se sob vácuo para se obter 1- (3-hidroxibutan-2-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butilo como um sólido amarelo. (3,0 g, rendimento 96%) LCMS (M+H+) m/z: calcd 305,38; Encontrado 304,9. RMN de ΧΗ (400 MHz, CDCI3) : á 8,31-8,29 (m, 1H) , 8,13-8,12 (m, 1H) , 7,11-7,07 (m, 1H) , 4,46-4,43 (m, 1H) , 4,12 (m, 1H) , 2,73 (s, 3H), 1,58 (s, 9H), 1,51-1,49 (d, 3H), 0,92-0,91 (d, 3H) .
Passo 3: 1-(3-Metoxibutan-2-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3- b]piridina-3-carboxilato de terc-butilo
A THF seco (20 mL) adicionou-se NaH (60% em óleo mineral, 2,37 g, 59,14 mmol) . Em seguida, a mistura foi agitada a 27 °C durante 20 minutos, depois adicionou-se 1--(3-hidroxibutan-2-il) -2-metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butilo (3,0 G, 9,86 mmol) . A mistura foi agitada a 27 °C durante 1 hora, em seguida, adicionando CH3I (13,99 g, 98,6 mmol) . A mistura foi agitada durante 12 horas a 27 °C e depois arrefecida para 0 °C. NH4CI saturado foi adicionado e extraído com CH2CI2. A extração foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada para dar 1-(3-metoxibutan-2-il)-2-metil-lH-pirrolo [2,3-b] piridina-3-carboxilato de terc-butilo como um Óleo amarelo. (3,2 g, rendimento 100%) LCMS (M+H+) m/z: calcd. 319,41; Encontrado 318,9.
Passo 4: ácido 1-(3-metoxibutan-2-il)-2-metil-lH-pirrolo [2,3-b]piridina-3-carboxílico:
À solução pré-arrefecida de 1-(3-metoxibutan-2-il)-2-metil-lH-pirrolo [2,3 —b] piridina-3-carboxilato de terc-butilo (3,0 g, 9,42 mmol) em CH2CI2 (20 mL) adicionou-se, gota a gota, ácido trifluoroacético (20 mL) . A solução foi agitada a 27 °C durante 1,5 horas. O solvente foi removido sob vácuo a 27 °C. O resíduo foi utilizado para o passo seguinte sem purificação. LCMS (M+H+) m/z: calculado 263,30; Encontrado 262, 9.
Passo 5: N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-1-(3-metoxibutan-2-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3-b] piridina-3-carboxamida:
A uma solução de ácido 1-(3-metoxibutan-2-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxílico (2,4 g, 9,15 mmol) em DMF (30 mL) adicionou-se TEA (4,2 g, 41,50 mmol), cloridrato de 3-(aminometil)-4-metoxi-6-metilpiridin-2 (1H)-ona (2,1 g,
12,81 mmol). Após agitação durante 10 minutos a 27 °C, a mistura foi arrefecida e adicionou-se HATU (5,56 g, 14,64 mmol). A mistura foi agitada a 27 °C durante 72 horas e permaneceu 30% de SM. Em seguida, a mistura foi aquecida para 80 °C durante 5 horas. A solução foi diluída com solução salina (100 mL) e extraiu-se com CH2CI2 (100 mL x 3) . As extrações foram combinadas e secas sobre Na2S04. O solvente foi evaporado sob vácuo e o resíduo foi purificado por coluna flash (Eluente: diclorometano:metanol = 95:5) para dar N-((4-metoxi-6-metil-2- oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-l-(3-metoxibutan-2-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxamida. (3,6 g, rendimento de 95%)
Passo 6: Separação de N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-1-(3-metoxibutan-2-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxamida: Isómeros (Compostos 261, 266, 267 e 302):
A mistura de isómeros do Passo 5, N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-1-(3-metoxibutan-2-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxamida foi purificada por HPLC preparativa (Condição: Coluna: SHIMADZU LC-8A, 250 * 50 mm * 10 um; fase móvel A: água com ácido fórmico a 0,2% Fase móvel B: MeCN: temperatura da coluna: 30 °C; gradiente: B em A 10-50%) para dar um par de isómeros principais (Composto 261 e Composto 266 combinados) (1,0 g, pureza 98,8%) e um par de isómeros secundários (Composto 267 e Composto 302 combinados) (180 mg, pureza 63%). Os pares de isómeros resultantes foram individualmente separados por SFC (Condição: Coluna: Chiralpak AD 250 * 30 mm * 5 um; fase móvel A: CO2 supercritico; fase móvel B: IPA + NH3*H20; gradiente: B/A: 75:25) para dar os compostos individuais seguintes:
Composto 261, N-( (4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di- hidropiridin-3-il) metil)-1-((2R ou 2S, 3R ou 3S)-3-metoxibutan-2 -il)-2-metil-lH-pirrolo [2,3 —b] piridina-3-carboxamida (Par de Isómeros Principais; Pico 1) : RMN de 1H (400 MHz, CDCI3) : δ 8,173-8,157 (m, 1H), 8,148-8,116 (m, 1H), 7,582-7,555 (m, 1H), 6, 968-6, 936 (m, 1H) , 5, 927 (s, 1H) , 4,707-4, 609 (m, 2H) , 4,334 (s, 1H) , 3, 889 (s, 3H) , 2,869 (s, 3H) , 2,788 (s, 3H) , 2,173 (s, 3H) , 1, 644-1, 627 (d, 3H) , 1,263-1,249 (d, 3H) .
Composto 266, N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di- hidropiridin-3-il) metil)-1-((2R ou 2S, 3R ou 3S)-3-metoxibutan-2-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxamida (Par de Isómeros Principais; Pico 2) : RMN de 1H (400 MHz, CDCI3) : δ 8,179-8,163 (m, 1H), 8,148-8,120 (m, 1H), 7,558-7,531 (m, 1H), 6, 966-6, 954 (m, 1H) , 5,931 (s, 1H) , 4,702-4, 60 (m, 2H) , 3,889 (s, 3H) , 2,892 (s, 3H) , 2,789 (s, 3H) , 2,189 (s, 3H) , 1, 647- 1,629 (d, 3H), 1,267-1,252 (d, 3H).
Composto 267, N-( (4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di- hidropiridin-3-il)metil)-1-((2R ou 2S, 3R ou 3S)-3-metoxibutano- 2-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3 —b]piridina-3-carboxamida (Par de isómeros secundários; Pico 1) : RMN de 1H (400 MHz, CDCI3) : δ 8, 174-8,162 (d, 1H) , 8, 111-8, 094 (d, 1H) , 7,551-7,526 (m, 1H) , 6, 993-6, 961 (m, 1H) , 5, 935 (s, 1H) , 4, 683-4,579 (m, 2H) , 3,887 (s, 3H) , 3,444 (s, 3H) , 2,753 (s, 3H) , 2,194 (s, 3H) , 1, 695-1,678 (d, 3H), 0,781-0,768 (d, 3H).
Composto 302, N-( (4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di- hidropiridin-3-il)metil)-1-((2R ou 2S, 3R ou 3S)-3-metoxibutan-2-il)-2-metil-lH-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxamida (Par de isómeros secundários; Pico 2) : RMN de 1H (400 MHz, CDCI3) : δ 8, 177-8, 166 (d, 1H) , 8,22-8, 104 (d, 1H) , 7,587-7,562 (m, 1H) , 6, 98-4-6, 952 (m, 1H) , 5, 933 (s, 1H) , 4, 698-4,591 (m, 2H) , 4,426 (s, 2H) , 3, 983 (s, 3H) , 3,448 (s, 3H) , 2,764 (s, 3H) , 2,180 (s, 3H) , 1,701-1, 684 (d, 3H) , 0,786-0,772 (d, 3H) .
Exemplo 14. Síntese de (+)-N-((4,6-dimetil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1-(1-feniletil)-lH-Pirrolo[2,3- c]piridina-3-carboxamida
Passo 1: 1-(3-metoxifenil)etanol:
A uma solução agitada de 3-amino-4-picolina (7 g, 64,8 mmol) em THF anidro (200 mL) , foi adicionado, gota a gota, sec-BuLi (150 mL, 1,3 M em ciclo-hexano, 194 mmol) ao longo de 20 minutos a -78 °C. A solução foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada 3 horas. Foi adicionado, gota a gota, acetato de etilo (2,3 g, 25,9 mmol) à reação a -78 °C e a mistura foi agitada à mesma temperatura durante 2 horas. Adicionou-se, gota a gota, metanol (50 mL) à reação ao longo de 10 minutos. A mistura foi aquecida até à temperatura ambiente e agitada durante 1 hora. Foi adicionado NH4C1 semi-saturado (250 mL) . A mistura foi extraída com EA. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução salina, secas e concentradas para dar o produto em bruto. O produto em bruto foi purificado por cromatografia em sílica gel (éter de petróleo/acetato de etilo = 10:1) para dar 2- metil-lH-pirrolo[2,3-c]piridina (2,5 g, 73,5%).
Passo 2: 2,2,2-tricloro-l-(2-metil-lH-pirrolo[2,3-c]piridin- 3- il)etanona:
A uma solução agitada de 2-metil-lH-pirrolo[2,3-c]piridina (2,5 g, 18,9 mmol) e cloreto de alumínio (5 g, 37,8 mmol) em DCM (100 mL), foi adicionado, gota a gota, cloreto de tricloroacetilo (4,1 g, 22,7 mmol) à reação ao longo de 0,5 horas à temperatura ambiente. Após 2 horas de agitação, a reação foi arrefecida para 0 °C e foi temperada com água (100 mL). O precipitado resultante foi isolado por filtração para proporcionar 2,2,2-tricloro-l-(2-metil-lH-pirrolo[2,3-c]piridin-3-il) etanona que foi utilizada para o passo seguinte sem purificação adicional. Assumido 100% de rendimento. (5,24 g).
Passo 3: 2-Metil-lH-pirrolo[2,3-c]piridina-3-carboxilato de metilo:
Uma mistura de 2,2,2-tricloro-l-(2-metil-lH-pirrolo [2,3-c] piridin-3-il)etanona (5,24 g, 18,9 mmol) e KOH (1,2 g, 20,9 mmol) em MeOH (100 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura reacional foi concentrada para remover MeOH, o resíduo foi dividido entre EA e água. A camada orgânica foi lavada com solução salina, seca e concentrada para dar 2-metil-lH-pirrolo[2,3-c]piridina-3-carboxilato de metilo (3 g, 83%).
Passo 4: 2-Metil-l-(1-feniletil)-lH-pirrolo[2,3-c]piridina-3-carboxilato de metilo
Uma mistura de 2-metil-lH-pirrolo[2,3-c]piridina-3-carboxilato de metilo (550 mg, 2,89 mmol) e hidreto de sódio (200 mg, 4,34 mmol) em N, N-dimetilformamida (3,0 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 0,5 hora, e depois adicionou-se (1-bromoetil)benzeno (589 mg, 3,18 mmol). A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura de reação foi vertida em NH4CI saturado e extraiu-se com acetato de etilo. As camadas orgânicas foram combinadas e concentradas para dar um resíduo. O resíduo foi purificado por cromatografia (éter de petróleo/acetato de etilo = 5:1) para dar 2-metil-l-(1-feniletil)-lH-pirrolo[2,3-c]piridina-3-carboxilato (800 mg, 94%).
Passo 5: ácido 2-metil-l-(1-feniletil)-lH-pirrolo[2,3- c]piridina-3-carboxilico:
Uma mistura de 2-metil-l- (1-feniletil)-lH-pirrolo[2,3- c] piridina-3-carboxilato (800 mg, 2,72 mmol) e KOH (1,5 g, 27,2 mmol) em (15 mL) e água (5 mL) foi submetida a refluxo durante 2 horas. A mistura foi ajustada para pH 2 por HC1 a 10% e extraída com EA. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução salina, secas e concentradas para dar o produto em bruto. O produto bruto foi utilizado no próximo passo sem mais purificação. 100% de rendimento. (760 mg).
Passo 6: (±)-N-((4,6-dimetil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3- il)metil)-2-metil-l-(1-feniletil)-lH-pirrolo[2,3-c]piridina-3-carboxamida (Composto 203):
Uma mistura de ácido 2-metil-l-(1-feniletil)-lH-pirrolo[2,3-
c]piridina-3-carboxílico (280 mg, 1,0 mmol) adicionando-se HATU (456 mg, 1,2 mmol), TEA (1 g, 10 mmol) e 3- (aminomet il)-4, 6-dimetilpiridin-2 (1H) -ona (182 mg, 1,2 mmol) em diclorometano anidro (30 mL) foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. À mistura reacional adicionou-se água (10 mL) , extraiu-se com diclorometano (30 mL x 2) . As camadas orgânicas foram combinadas e concentradas para dar um resíduo. O resíduo foi recristalizado a partir de MeCN para dar o composto N-((4,6-dimeti1-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-l-(1-feniletil)-lH-pirrolo[2,3-c]piridina-3-carboxamida como um sólido esbranquiçado (80 mg, 21,6%). LRMS (M+H+) m/z: calcd 414,21; encontrado 414. RMN de 1H (400 MHz, metanol-d4) δ: 8,84 (s, 1H) , 8,16 (d, J=7, 6 Hz, 1H) , 8,03 (d, J= 6,8 Hz, 1H) , 7,44-7,37 (m, 5H) , 6,09 (s, 1H) , 6,01-5,99 (m, 1H) , 4,49 (s, 2H) , 2,73 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), 2,06 (d, J=7,2 Hz, 3H).
Os compostos mostrados na tabela seguinte foram preparados de acordo com o procedimento geral descrito neste exemplo utilizando os materiais de partida e modificações apropriados. As estruturas são mostradas na Figura 1.
Exemplo 15. Procedimentos Gerais para Sintetizar Outros Compostos da Invenção
Procedimento Geral A: Alquilação de indole
A uma solução arrefecida (0 °C) de éster de índole NH (1 equivalente) em N,N-dimetilformamida (volume para tornar a a concentração 0,4 M) foi adicionado hidreto de sódio (60% p/p, 1,1 equivalentes em relação ao indole). A mistura resultante foi agitada durante 15 minutos. Em seguida, adicionou-se RX (2 equivalentes) e a reação foi deixada aquecer até à temperatura ambiente. A reação foi mantida à temperatura ambiente durante 12 horas. A mistura reacional foi vertida em solução saturada de cloreto de amónio (100 mL) com agitação. A mistura foi extraída com acetato de etilo (200 mL x 2) e a fase orgânica combinada foi lavada com solução salina, seca sobre sulfato de magnésio, filtrada e concentrada para dar o produto em bruto que foi purificado por cromatografia em coluna (silica gel, éter de petróleo/acetato etilo = 20:1) para dar o produto desejado de éster de indole alquilado.
Procedimento Geral B: Saponificação de éster de índole Alquilado
A uma solução de éster de indole alquilado (1 equivalente) em tetra-hidrofurano:metanol:água (2,5:5:1, volume para tornar a concentração 0,05 M) foi adicionado hidróxido de litio (4 equivalentes). A mistura reacional resultante foi agitada a 60 °C durante 48 horas. A mistura foi concentrada in vacuo, em seguida, o resíduo foi diluído com água (40 mL) e acidificou-se lentamente com cloreto de hidrogénio 1 N até pH = 4-5. A mistura foi extraída com acetato de etilo (100 mL x 3) . As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com solução salina, secas sobre sulfato de magnésio, filtradas e concentradas para dar índole ácido em bruto, que foi utilizado no passo subsequente sem purificação adicional.
Procedimento Geral C: Formação de ligação amida
A uma solução de índole ácido (1 equivalente) em diclorometano (volume para tornar a concentração 0,05 M) foram adicionados 1-hidroxibenzotriazole (1,5 equivalentes), cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (1,5 equiv.) e trietilamina (3 equiv.)· A mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 30 minutos. Em seguida adicionou-se piridona amina (1,2 equiv.) e a mistura resultante foi agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. Adicionou-se água (50 mL) à mistura. A mistura foi extraída com diclorometano (100 mL x 2) . A camada orgânica foi concentrada in vacuo para proporcionar o produto em bruto que foi purificado por cromatografia de coluna (sílica gel, diclorometano/metanol = 20:1) para dar o composto alvo.
Procedimento geral D: Cromatografia quiral A separação dos compostos quirais foi realizada através de HPLC de fase normal ou SFC (cromatografia de fluido de dióxido de carbono supercrítico). Os compostos separados tinham tipicamente >95%ee. A configuração absoluta dos centros quirais não foi determinada.
Procedimento geral L: Sulfonilação
A uma solução da amina quiral (1 equiv.) em diclorometano (volume para tornar a concentração 0,1 M) foi adicionada trietilamina (4 equiv.) a 18 °C sob atmosfera de N2. A reação foi arrefecida para 0 °C e foi adicionado cloreto de metanossulfonilo (1,5 equiv.). A reação foi agitada a 0 °C durante 1 h. Em seguida, a mistura foi concentrada in vacuo e foram adicionados metanol e carbonato de potássio e a reação foi agitada durante mais 1 h. A mistura foi filtrada e o produto em bruto foi purificado por HPLC preparativa. A tabela abaixo lista os compostos da invenção e qual dos métodos gerais acima mencionados foi utilizado na sua síntese. As estruturas destes compostos são apresentadas na Figura 1.
Exemplo 16. Medições de IC50 para Inibidores utilizando EZH2.
Ensaio de EZH2: Os ensaios foram realizados através da mistura de rPRC2 em conjunto com substratos de oligonucleossoma biotinilados na presença do cofator enzimático marcado com rádio, S-adenosil-L-metionina (3H SAM) (Perkin Elmer) e monitorizando a transferência mediada enzimaticamente de grupos metilo tritiados de 3H SAM para resíduos de histona lisina. A quantidade de produto de metil-histona tritiada resultante foi medida, primeiro capturando os oligonucleossomas biotinilados em FlashPlates revestidas com estreptavidina (SAV) (Perkin Elmer), seguido de um passo de lavagem para remover a SAM 3H não reagida e, em seguida, contando com um contador de cintilação em placa com poços TopCount NXT 384 (Perkin Elmer). As condições de ensaio finais para EZH2 foram as seguintes: tampão Tris 50 mM pH 8,5, DTT 1 mM, detergente Brij-35 69 μΜ, MgCÍ2 5,0 mM, 0,1 mg/mL de BSA, 3H SAM 0,2 μΜ, oligonucleossomas biotinilados 0,2 μΜ, péptido H3K27me3 3,6 μΜ e EZH2 2 nM.
As medições de IC50 do composto foram obtidas como se segue: Os compostos foram primeiro dissolvidos em DMSO a 100% como soluções stock 10 mM. As curvas de dose-resposta de dez pontos foram geradas distribuindo quantidades variáveis da solução de composto 10 mM em 10 poços da placa de 384 poços (Echo; Labcyte), em seguinda o DMSO puro foi utilizado para preencher os poços para assegurar que todos os poços tinham a mesma quantidade de DMSO. Um volume de 12,5 pL da enzima HMT, péptido H3K27me3 e substrato de oligonucleossoma em tampão de ensaio foi adicionado a cada poço da placa de ensaio utilizando um Multidrop Combi (ThermoFisher). Os compostos foram pré-incubados com a enzima durante 20 minutos, seguido do inicio da reação de metiltransferase por adição de 12,5 pL de 3H SAM em tampão de ensaio (volume final = 25 pL). As concentrações finais dos compostos variaram de uma concentração padrão superior de 80 pM até 0,16 pM em dez passos de diluição de 2 vezes. Realizaram-se as reações durante 60 minutos e extinguiram-se com 20 pL por poço de SAH 1,96 mM, Tris 50 mM pH 8,5, EDTA 200 mM. As reações interrompidas foram transferidas para placas Flashplate revestidas com SAV (Perkin Elmer) , incubadas durante 120 minutos, lavadas com uma lavadora de placas e depois lidas no TopCount NXT (1,0 min/poço) para medir a quantidade de produto de metil-histona formada durante a reação. A quantidade de produto de metil-histona foi comparada com a quantidade de produto formado nos poços de controlo de inibição de 0% e 100%, permitindo o cálculo da % de inibição na presença dos compostos individuais em várias concentrações. As IC50 foram calculadas utilizando um pacote de software de ajuste de curva não linear de 4 parâmetros (XLFIT, parte do pacote de banco de dados, ActivityBase (IDBS)), onde os quatro parâmetros foram IC50, inclinação Hill, linha de base pré-transição (0% de INH) e linha de base pós-transição (100% de INH); sendo os dois últimos parâmetros fixados em zero e 100%, respetivamente, por defeito. O ensaio para Y641N EZH2 foi realizado como acima utilizando oligonucleossomas H3K27Me2 reconstituídos como substrato. A Tabela 2 mostra a atividade dos compostos selecionados desta invenção no ensaio de inibição da atividade de EZH2 e Y641N EZH2. Os valores de IC50 são indicados como se segue: "A" indica um valor IC50 inferior a 100 nM; "B" indica um valor de IC50 de 100 nM a 1 uM; "C" indica um valor de IC50 superior a 1 μΜ e inferior a 10 para cada enzima; "D" indica um valor de IC50 superior a 10 μΜ para cada enzima; e "* (X μΜ) " indica que não foi observada inibição na maior concentração (i. e., X μΜ) do composto testado.
Tabela 2. Valores de IC50 para Compostos de Fórmula I contra as Enzimas Mutantes EZH2 e Y641N EZH2.
Exemplo 17. Medições de EC50 para Inibidores em Ensaios de Células HeLa.
Ensaio de H3K27me3 MSD Hela. Células HeLa tripsinizadas foram contadas e diluídas em DMEM 10% (Life Technologies, Cat. N° 10569) para 5000 células/75 pL. Setenta e cinco pL de células foram colocadas em cada poço de uma placa de 96 poços de fundo plano e incubadas a 37 °C durante 4 horas. Vinte e cinco pL de composto de teste (a várias concentrações) foram adicionados às células e a incubação continuou a 37 °C durante 96 horas. 0 meio foi então removido e as células foram enxaguadas uma vez com PBS gelado. Quarenta pL de MSD Tampão EM gelado (HEPES 10 mM, pH 7,9, MgCÍ2 5 mM, sacarose 0,25 M, Benzonase (1:10000), Triton X-100 a 1% suplementado com cocktail de Inibidor de Protease fresco lx e 4-(2-aminoetil)benzenossulfonilo (AEBSF)) 1 mM foram
adicionados a cada poço e as placas colocadas em gelo durante 30 minutos. Adicionaram-se então 10 pL de NaCl 5 M a cada poço e a incubação em gelo continuou durante mais 15 minutos. O material em cada poço foi suspenso através de pipetagem para cima e para baixo e depois transferido para uma nova placa de 96 poços. Os poços esvaziados foram enxaguados com 150 pL de
Tris 20 mM gelado, pH 7,5, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, suplementados com cocktail de Inibidor de Protease fresco lx e AEBSF 1 mM ("SEM sal SEM tampão de detergente) e transferidos para os respetivos poços na nova placa. Adicionou-se então, a cada poço de lisados, trezentos pL de tampão SEM sal SEM tampão de detergente e as placas congeladas a -80°C.
No mesmo dia, um número apropriado de placas de 96 poços de ligação padrão MSD foram revestidos com 30 pL/poço de anticorpo de captura H3 total (Millipore, Cat N° MAB3422) a 1 pg/mL de concentração em PBS. A solução de anticorpo foi distribuída uniformemente primeiro, tocando suavemente nos lados das placas e depois agitando as placas durante alguns minutos a 1000 rpm. As placas revestidas de anticorpo foram armazenadas a 4 °C de um dia para o outro.
No dia seguinte os lisados são descongelados para a TA. As placas MSD revestidas com anticorpo são lavadas 3X com TBS-T (solução salina tamponada com Tris (Fisher Scientific, Cat N° BP2471-1) + Tween-20 a 0,2%). Cento e cinquenta pL de
Bloqueador A a 5% em TBS-T são adicionados a cada poço. Os poços são cobertos e agitados num agitador à TA durante uma hora. O passo de Bloqueador A é repetido uma segunda vez. Após a remoção do bloqueador, 25 pL de lisado celular são transferidos para cada poço revestido com anticorpo. As placas são agitadas durante 2 horas à TA, o lisado removido e as placas novamente lavadas com o Bloqueador A em TBS-T. São adicionados vinte e cinco pL de mistura de anticorpo preparada de fresco (incluindo anticorpos primários e secundários) a cada poço e as placas agitadas durante 1 hora à TA. A mistura de anticorpos utilizada foi uma (ou ambas) daquelas indicadas na tabela abaixo:
Ambos os anticorpos H3 foram obtidos de Cell Signaling (Cat N° 4499 e 9733). O anticorpo anti-coelho de cabra foi obtido da Meso-Scale Discovery (Cat N° R32AB-1). A mistura de anticorpos foi então removida e os poços foram lavados com o Bloqueador A. Foram então adicionados cento e cinquenta pL de Tampão de Leitura MSD IX preparado de fresco (Meso-Scale Discovery, Cat N° R927C-2) a cada poço e as placas foram lidas num Leitor de Placas MSD Sector 2400.
Os dados foram analisados utilizando o molde Assistente de Ensaio (Constellation Pharmaceuticals In-house product) e Base de Atividade (IDBS Ltd, Surrey, RU). Os arquivos de dados foram importados para o Assistente de Ensaio e as condições de ensaio foram especificadas. Foi criada uma ID de Análise única e os arquivos de dados exportados para a Base de Atividade. Um molde de análise foi criado na Base de Atividade para medir a inibição dependente da dose da marca H3K27me3 e viabilidade celular, respetivamente. A leitura dos poços de DMSO foi utilizada para normalizar os dados. As curvas resultantes foram ajustadas utilizando o software da Base de Atividade Modelo 205 (IDBS Ltd, Surrey, RU). Os dados foram verificados quanto à qualidade, validados e integrados no formato excel utilizando SARview (IDBS Ltd, Surrey, RU).
Ensaio de H3K27me3 Alfa Hela (AlphaLISA) . Dez doses diferentes de cada composto de teste (numa série de diluições de 3 vezes) foram plaqueadas em placas tratadas com cultura de tecidos de 384 poços em duplicado (Catálogo N° 781080; Greiner Bio One, Monroe, Carolina do Norte). As células Hela cultivadas em cultura foram tripsinizadas e contadas utilizando um contador de células Countess® (Catálogo N° C10281; Life Technologies, Grand Island, NI) . As células foram diluídas para 67000 células por mL em DMEM a 10% (Catálogo N° 10569-010 Life Technologies, Grand Island, NI) e 15 yL (1000 células) foram plaqueadas em cada poço utilizando o dispensador Biotek MicroFlo™ Select (BioTek Instruments, Inc. Vermont, EUA),) da placa de 384 poços. As placas foram incubadas a 37°C/C02 a 5% durante 72 horas. Uma das placas em duplicado foi processada para ensaio de HeLa e a outra para viabilidade. À placa processada para AlphaLISA, adicionaram-se 5 pL por poço de tampão de Lise de Célula-Histona (IX) (Catálogo N° AL009F1 Perkin Elmer, Waltham, MA) e a placa foi incubada à TA durante 30 minutos num agitador de placas com baixa velocidade (Modelo N° 4625-Q Thermo Scientific, Waltham, MA). Em seguida, adicionaram-se 10 pL por poço de tampão de Extração de Histona (catálogo N° AL009F2; Perkin Elmer; Waltham, MA) e a placa foi ainda incubada à TA durante 20 minutos no agitador de placas com baixa velocidade. A cada poço foram então adicionados 10 pL por poço de uma mistura 5X de esferas aceitadoras anti-K27me3 mais Anticorpo Biotinilado Anti-Histona H3 (C-ter) (diluído para 3 nM final) (Catálogo N° AL118 Perkin Elmer, Waltham, MA) . Diluição das esferas aceitadoras e, em seguida, a anti-Histone H3 foi com o tampão de Deteção de Histona IX (Catálogo N° AL009F3 Perkin Elmer; Waltham, MA) que foi produzido diluído a partir do stock de 10X proporcionado. A placa foi vedada com um vedante de placa de alumínio e incubada a 23 °C durante 60 min. Em seguida, a requerente adicionou 10 pL de solução de esferas Dadoras de Estreptavidina 5X (Catálogo N° 6760002 Perkin Elmer, Waltham, MA) (20 pg/ mL final em IX de tampão de Deteção de Histona), vedou-se a placa com vedante de alumínio e incubou-se a 23°C durante 30 min. As placas foram então lidas utilizando um Leitor EnVision-Alpha (modelo N° 2104 Perkin Elmer; Waltham, MA). A viabilidade celular foi ensaiada pela adição de 15 pL de Cell Titer Glo ((Catálogo N° G7571 Promega Madison, WI) a cada poço com células com meio. As placas foram incubadas à TA durante 15 a 20 minutos num agitador de placas a baixa velocidade. As placas foram então lidas utilizando um Leitor
EnVision-Alpha (modelo N° 2104 Perkin Elmer, Waltham, MA).
Os dados de ambos os ensaios foram analisados utilizando o molde Assistente de Ensaio (Constellation Pharmaceuticals In-house product) e Base de Atividade (IDBS Ltd, Surrey, RU). Os arquivos de dados foram importados para o Assistente de Ensaio e as condições de ensaio foram especificadas. Foi criada uma ID de análise única e os arquivos de dados exportados para a Base de Atividade. Um molde de análise foi criado na Base de Atividade para medir a inibição dependente de dose da marca H3K27me3 e viabilidade celular, respetivamente. A leitura dos poços de DMSO foi utilizada para normalizar os dados. As curvas resultantes foram ajustadas utilizando o software de Base de Atividade modelo 205 (IDBS Ltd, Surrey, RU) . Os dados foram verificados quanto à qualidade, validados e integrados no formato excel utilizando SARview (IDBS Ltd, Surrey, RU). A Tabela 3 mostra a atividade de compostos selecionados desta invenção nos dois diferentes ensaios de células HeLa descritos acima. Os valores de CE50 são referidos como se segue: "A" indica um valor de EC50 inferior a 400 nM; "B" indica um valor de EC50 de 400 nM a 2 μΜ; "C" indica um valor de EC50 superior a 2 μΜ e inferior a 10 μΜ para cada enzima; "D" indica um valor de EC50 superior a 10 μΜ para cada enzima; E"* (X μΜ) " indica que não foi observada inibição na maior concentração (i. e., X μΜ) do composto testado.
Tabela 3. Valores de EC50 para Compostos Selecionados da Invenção Em Células Hela que Expressam o Mutante de H3k27 EZH2.
Exemplo 18. Análise da Inibição do Crescimento Tumoral A eficácia anti-tumoral dos Compostos 362 e 365 no modelo de xenoenxerto de linfoma humano Karpas422 subcutâneo em murganhos SCID CB-17 fêmeas foi como se segue.
Animais
Espécie: Mus Musculus Estirpe: murganhos CB-17 SCID Idade: 6-8 semanas
Sexo: feminino
Peso corporal: 18-22 g Número de animais: 50 murganhos mais suplentes
Fornecedor de animais: Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., LTD.
Cultura de células
As células tumorais Karpas422 foram mantidas in vitro como cultura em suspensão em meio RPMI1640 suplementado com soro fetal de vitelo inativado a 10% pelo calor a 37 °C numa atmosfera de CO2 a 5% ao ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que crescem numa fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação de tumores.
Inoculação de tumores
Cada murganho foi inoculado subcutaneamente no flanco direito com as células tumorais Karpas422 (5 x 106) em 0,2 mL de PBS com Matrigel (1:1) para desenvolvimento de tumor. O dia 23 após a inoculação do tumor foi como o dia 0 após o inicio do tratamento, quando o tamanho médio do tumor atingiu 300 mm3. Cada grupo consistiu em 10 mruganhos portadores de tumores.
Medidas do Tumor 0 tamanho do tumor foi medido três vezes por semana em duas dimensões, utilizando um paquímetro, e o volume foi expresso em mm3 utilizando a fórmula: V = 0,536 a x b2, onde a e b são os diâmetros longos e curtos do tumor, respetivamente. O tamanho do tumor foi então utilizado para cálculos de valores T/C. O valor T/C (em percentagem) é uma indicação de eficácia anti-tumoral; T e C são os volumes médios dos grupos tratados e de controlo, respetivamente, num dado dia. O TGI foi calculado para cada grupo utilizando a fórmula: TGI (%)=[1-(Ti-TO)/(Vi-VO)]χ100; Ti é o volume médio de tumor de um grupo de tratamento num dado dia, TO é o volume médio de tumor do grupo de tratamento no dia do início do tratamento, Vi é o volume médio de tumor do grupo de controlo de veículo o mesmo dia com Ti, e V0 é o volume médio de tumor do grupo de veículo no dia do início do tratamento.
Ponto final Experimental e Recolha de Amostras 1). Plasma, tumor e músculo no grupo EPZ-6438 foram recolhidos no dia 16 após o início do tratamento 6 h após a administração. Os grupos de plasma, tumor e músculo no veículo, CPI-524369, CPI-524416 e CPI-591780 foram recolhidos no dia 25 após o início do tratamento 1 h após a administração. 2). Todo o sangue foi retirado de cada animal com EDTA-K2 como anticoagulante. O plasma foi dividido em duas partes. A primeira parte foi para análise PK; a segunda parte foi congelada para salvaguarda. 3) . O tumor foi dividido em três partes. A primeira parte foi congelada para PK; a segunda parte foi congelada para análise PD; a terceira parte foi congelada para salvaguarda. 4) . O músculo foi dividido em duas partes. A primeira parte foi congelada para PK; a segunda parte foi congelada para salvaguarda.
Análise da Inibição do Crescimento Tumoral
Tabela 4. Cálculo de inibição do crescimento tumoral para os Compostos 362 e 365 no modelo de xenoenxerto karpass422 calculado com base nas medições do volume tumoral no dia 25 ou no dia 16 após o inicio do tratamento
Nota: a. Média ± SEM. b. A Inibição do Crescimento Tumoral é calculada dividindo o volume tumoral médio para o grupo tratado pelo volume tumoral médio para o grupo de controlo (T/C). Para que um artigo de teste seja considerado como tendo atividade anti-tumoral, T/C deve ser 0,5 ou inferior, d. Diferença estatisticamente significatica (ANOVA unidirecional), vs veículo: *** p <0,001.
Outras formas de realização preferidas da invenção são descritas aqui a seguir: 1. Um composto possuindo a Fórmula estrutural (II):
ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que: A é CH ou N;
Rla é selecionado de alquilo -C1-C2 e -0- (alquilo C1-C2 ) , em que Rla é opcionalmente substituído com um ou mais flúor; R4a é selecionado de 1-halo-alquil(C1-C3)-piperidin-4-ilo, cicloalquilo C3-C6, opcionalmente substituído com um ou mais flúor, e tetra-hidropiranilo; e R13 é selecionado de hidrogénio, halo, fenilo, piridinilo, e -0-(alquilo C1-C4 ) · 2. 0 composto da forma de realização 1, em que Rla é selecionado de -OCH3, -CH3, -OCHF2 e -CH2CH3. 3. 0 composto de qualquer uma das formas de realização 1 ou 2, em que R4a é selecionado de 4,4-difluorociclo-hexilo, ciclopropilo, tetra-hidropirano-4-ilo, 1-(t-butoxicarbonil)-piperidin-4-ilo, 1-isobutoxicarbonil)-piperidin-4-ilo, 1- (isopropoxicarbonil)-piperidin-4-ilo, 1-(2 — fluoroetil)- piperidin-4-ilo, 1-(2,2-difluoroetil)-piperidin-4-ilo, 1- (2,2,2-trifluoroetil)-piperidin-4-ilo, 1-(2-hidroxiisobutil)-piperidin-4-ilo, 1-(hidroxiisopropilcarbonil)-piperidin-4-ilo, 1- (etoxicarbonilmetil)-piperidin-4-ilo, 1- (isopropilcarbonil)-piperidin-4-ilo, l-metilpiperidin-4-ilo, 1-(metilsulfonil) -piperidin-4-ilo, 1-(etilsulfonil)-piperidin-4-ilo, 1-(isopropilsulfonil)-piperidin-4-ilo, 1-(fenil)-piperidin-4- ilo, 1-(oxetan-3-il)piperidin-4-ilo, 1-(piridin-2-il)piperidin- 4-ilo e 1-(pirimidin-2-il)-piperidin-4-ilo. 4. 0 composto de qualquer uma das formas de realização 1 a 3, em que R13 é selecionado de hidrogénio, cloro, flúor, -OCH(CH3)2, fenilo e piridin-2-ilo. 5. 0 composto da forma de realização 1, em que o composto é N- ( (4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1-(1-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)etil)-1H-indole-3-carboxamida, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 6. 0 composto da forma de realização 5, em que o composto é R-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1-(1-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il) etil) -1H-indole-3-carboxamida, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 7. 0 composto da forma de realização 1, em que o composto é 1-(1-(1-(2,2-difluoroetil piperidin-4-il)etil)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l, 2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-lH-indole-3-carboxamida, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 8. 0 composto da forma de realização 7, em que o composto é R-l-(1-(1-(2,2-difluoroetil)piperidin-4-il etil)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-lH-indole-3-carboxamida ou um seu sal farmaceuticamente aceitável. 9. 0 composto da forma de realização 1, em que o composto é 1-(1-(l-etilpiperidin-4-il)etil)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l, 2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-lH-indole-3-carboxamida, ou urn seu sal farmaceuticamente aceitável. 10. O composto da forma de realização 9, em que o composto é R-l-(1-(l-etilpiperidin-4-il)etil)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo- 1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-lH-indole-3-carboxamida, ou urn seu sal farmaceuticamente aceitável. 11. Uma composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer uma das formas de realização 1 a 10, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; e um transportador farmaceuticamente aceitável. 12. Um composto de qualquer uma das formas de realização 1 a 10, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento de uma doença ou distúrbio associado à proliferação celular. 13. O composto para utilização da forma de realização 12, em que a doença é cancro. 14. O composto para utilização da forma de realização 13, em que o cancro é selecionado de cancro da mama, cancro da próstata, cancro do cólon, carcinoma de células renais, cancro do glioblastoma multiforme, cancro da bexiga, melanoma, cancro dos brônquios, linfoma e cancro do fígado.

Claims (12)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Composto possuindo a Fórmula estrutural (II):
    ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, em que: A é CH ou N; Rla é selecionado de alquilo -C1-C2 e -0- (alquilo C1-C2) , em que Rla é opcionalmente substituído com um ou mais flúor; R4a é selecionado de 1-halo-alquil(C1-C3)-piperidin-4-ilo, cicloalquilo C3-C6, opcionalmente substituído com um ou mais flúor, e tetra-hidropiranilo; e R13 é selecionado de hidrogénio, halo, fenilo, piridinilo, e -0- (alquilo C1-C4) ·
  2. 2. Composto da Reivindicação 1, em que Rla é selecionado de -OCH3, -CH3, -OCHF2 e -CH2CH3.
  3. 3. Composto da Reivindicação 1 ou 2, em que R4a é selecionado de 4,4-difluorociclo-hexilo, ciclopropilo, tetra-hidropiran-4-ilo, 1-(2 — fluoroetil)-piperidin-4-ilo, 1-(2,2-difluoroetil)-piperidin-4-ilo, 1- (2,2,2- trifluoroetil)-piperidin-4-ilo.
  4. 4. Composto de qualquer uma das Reivindicações 1 a 3, em que R13 é selecionado de hidrogénio, cloro, flúor, -OCH(CH3)2, fenilo, e piridin-2-ilo.
  5. 5. Composto da Reivindicação 1, em que o composto é N-( (4-metoxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1- (1- (1- (2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)etil)-1H-indole-3-carboxamida, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
  6. 6. Composto da Reivindicação 5, em que o composto é R-N-((4- metoxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1- (1- (1- (2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il)etil)-1H-indole-3-carboxamida, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
  7. 7. Composto da Reivindicação 1, em que o composto é 1-(1-(1- (2,2-difluoroetil)piperidin-4-il)etil)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-lH-indole-3-carboxamida, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
  8. 8. Composto da Reivindicação 7, em que o composto é R-l-(l-(l- (2,2-difluoroetil)piperidin-4-il)etil)-N-((4-metoxi-6-metil-2-oxo-l,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-lH-indole-3-carboxamida, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável.
  9. 9. Composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer uma das Reivindicações 1 a 8, ou um seu sal farmaceuticamente aceitável; e um transportador farmaceuticamente aceitável.
  10. 10. Composto de qualquer uma das reivindicações 1 a 8 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para utilização no tratamento de uma doença ou distúrbio associado à proliferação celular.
  11. 11. Composto para utilização da Reivindicação 10, em que a doença é cancro.
  12. 12. Composto para utilização de acordo com a Reivindicação 11, em que o cancro é selecionado de cancro da mama, cancro da próstata, cancro do cólon, carcinoma de células renais, cancro do glioblastoma multiforme, cancro da bexiga, melanoma, cancro dos brônquios, linfoma e cancro do figado.
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