BR112015018508B1 - Composto de fórmula estrutural ii, seu uso e composição farmacêutica - Google Patents

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James Edmund Audia
Andrew S. Cook
Les A. Dakin
Martin Duplessis
Victor S. Gehling
Jean-Christophe Harmange
Christopher G. Nasveschuk
Rischi G. Vaswani
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Abstract

moduladores de enzimas modificadoras de metila, suas composições e uso. são aqui fornecidos agentes tendo a fórmula (ii) estrutural, abaixo definida, para a modulação das enzimas de modificação de histona metila, suas composições e uso, por exemplo, como agentes anticâncer.

Description

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS
[0001] Este pedido reivindica a prioridade do Pedido InternacionalNo. PCT/US2013/025639, depositado em 11 de fevereiro de 2013. O Pedido Internacional PCT/US2013/025639 reivindica a prioridade dos Pedidos Provisórios dos Estados Unidos Nos. de Série 61/597.695, depositado em 10 de fevereiro de 2012 e 61/667.821, depositado em 03 de Julho de 2012. Os conteúdos inteiros dos pedidos anteriormente mencionados são aqui incorporados por referência.
FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO
[0002] A cromatina eucariótica é composta de complexosmacromoleculares chamados nucleossomas. Uma nucleossoma possui 147 pares de base de DNA envolvidos em torno de uma octâmero de proteína tendo duas subunidades de cada uma das proteínas histonas H2A, H2B, H3 e H4. As proteínas histonas estão sujeitas às modificações pós-translacionais que por sua vez afetam a estrutura de cromatina e a expressão do gene. Um tipo de modificação pós- translacional encontrado nas histonas é a metilação de resíduos de lisina e arginina. A metilação de histona desempenha um papel crítico na regulação da expressão do gene em eucariotas. A metilação afeta a estrutura de cromatina e tem sido associada tanto na ativação quanto na repressão de transcrição (Zhang and Reinberg, Genes Dev. 15:23432360, 2001). As enzimas que catalisam a fixação e a remoção de grupos de metila a partir de histonas são implicadas no silenciamento do gene, no desenvolvimento embrionário, na proliferação celular, e em outros processos.SUMÁRIO DA INVENÇÃO
[0003] A presente divulgação abrange o reconhecimento de que as enzimas de modificação de metila são um alvo atraente para a modulação, dado o seu papel na regulação de diversos processos biológicos. Foi agora descoberto que os compostos desta invenção, e as suas composições farmaceuticamente aceitáveis, são eficazes como agentes que estimulam a atividade das enzimas de modificação de histona metila, incluindo as histonas metilases e as metilases desmetilases. Tais compostos possuem a fórmula geral II:
Figure img0001
[0004] ou um sal farmaceuticamente aceitável destes, em que cadavariável é como aqui definida.
[001] Os compostos da presente invenção, e as suas composiçõesfarmaceuticamente aceitáveis, são úteis para o tratamento de uma variedade de doenças, distúrbios ou condições, associadas com uma enzima de modificação de metila. Tais doenças, distúrbios ou condições incluem aqueles aqui descritos.
[002] Os compostos fornecidos por esta invenção também sãoúteis para o estudo de enzimas de modificação de metila nos fenômenos biológicos e patológicos; o estudo das vias intracelulares de transdução de sinal mediadas pelas enzimas de modificação de metila e a avaliação comparativa de novos moduladores de enzima de modificação de metila.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
[003] Figura 1. Compostos exemplares de Fórmula II.
DESCRIÇÃO DETALHADA DE CERTAS MODALIDADES 1. Descrição Geral dos Compostos da Invenção
[004] Em certas modalidades, a presente invenção fornece um composto de Fórmula II:
Figure img0002
[0005] ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, em que:
[0006] A é CH ou N;
[0007] R1a é selecionado de alquila C1-C2 e -O-(alquila C1-C2), emque R1a é opcionalmente substituído com um ou mais flúor;
[0008] R4a é selecionado de -(alquileno C1-C4)-O-(alquila C1-C3), 1-substituída-pipieridin-4-ila, cicloalquila C3-C6 opcionalmente substituída com um ou mais flúor, e tetra-hidropiranila; e
[0009] R13 é selecionado de hidrogênio, halo, fenila, piridinila e -O-(alquila C1-C4).2. Compostos e Definições
[005] As definições de grupos funcionais específicos e termosquímicos são descritos com mais detalhes abaixo. Para os propósitos desta invenção, os elementos químicos são identificados de acordo com a Periodic Table of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 75th Ed., contracapa, e os grupos funcionais específicos são geralmente definidos como aqui descritos. Adicionalmente, os princípios gerais de química orgânica, assim como os componentes funcionais específicos e a reatividade, são descritos em Organic Chemistry, Thomas Sorrell, University Science Books, Sausalito, 1999; Smith and March March’s Advanced Organic Chemistry, 5th Edition, John Wiley & Sons, Inc., New York, 2001; Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, Inc., New York, 1989; Carruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis, 3rd Edition, Cambridge University Press, Cambridge, 1987; cujos conteúdos inteiros de cada um são aqui incorporados por referência.
[006] A não ser que de outra maneira mencionada, as estruturasaqui representadas também pretendem incluir todas as formas isoméricas (por exemplo, enantioméricas, diastereoméricas e geométricas (ou conformacionais)) da estrutura; por exemplo, as configurações R e S para cada centro assimétrico, os isômeros de ligação dupla Z e E, e os isômeros conformacionais Z e E. Portanto, os isômeros estereoquímicos individuais assim como as misturas enantioméricas, diastereoméricas e geométrica (ou conformacionais) dos presentes compostos estão dentro do escopo da invenção. A não ser que de outra maneira mencionada, todas as formas tautoméricas dos compostos da invenção estão dentro do escopo da invenção. Adicionalmente, a não ser que de outra maneira, as estruturas aqui representadas também pretendem incluir os compostos que diferem apenas na presença de um ou mais átomos isotopicamente enriquecidos. Por exemplo, compostos tendo as presentes estruturas incluindo a substituição de hidrogênio por deutério ou trítio, ou a substituição de um carbono por um carbono enriquecido com 13C ou 14C, estão dentro do escopo da presente invenção. Tais compostos são úteis, por exemplo, como ferramentas analíticas, como sondas em ensaios biológicos, ou como agentes terapêuticos de acordo com a presente invenção.
[007] Onde um enantiômero particular é preferível, pode, emalgumas modalidades, ser fornecido substancialmente livre do enantiômero correspondente, e também pode ser referido como "oticamente enriquecido". "Opticamente enriquecido", como aqui utilizado, significa que o composto é preparado de uma proporção significativamente maior de um enantiômero. Em certas modalidades, o composto é composto de pelo menos cerca de 90 % em peso de um enantiômero preferido. Em outras modalidades, o composto é composto de pelo menos cerca de 95 %, 98 % ou 99 % em peso de um enantiômero preferido. Os enantiômeros preferidos podem ser isolados a partir de misturas racêmicas por qualquer método conhecido daqueles versados na técnica, incluindo a cromatografia líquida de alta pressão quiral (HPLC) e a formação e cristalização de sais quirais ou preparados pelas sínteses assimétricas. Ver, por exemplo, Jacques et al., Enantiomers, Racemates and Resolutions (Wiley Interscience, New York, 1981); Wilen, et al., Tetrahedron 33:2725 (1977); Eliel, E.L. Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill, NY, 1962); Wilen, S.H. Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions p. 268 (E.L. Eliel, Ed., Univ. of Notre Dame Press, Notre Dame, IN 1972).
[008] Uma ligação ondulada (—) em um centro quiral com umaestrutura química é utilizada para indicar os compostos da invenção que são oticamente puros, mas cuja rotação ótica não foi determinada. Uma ligação reta em um centro quiral indica uma mistura racêmica embora, como mencionado acima, a invenção também inclua todas as possíveis formas isoméricas do racemato.
[009] Os termos "halo" e "halogênio" como aqui utilizados referem-se a um átomo selecionado de flúor (fluoro, -F), cloro (cloro, -Cl), bromo (bromo, -Br) e iodo (iodo, -I).
[0010] O termo "alquileno" refere-se a um grupo de alquila bivalente.Uma "cadeia de alquileno" é um grupo de polimetileno, isto é, (CH2)n, em que n é um número inteiro positivo, de preferência de 1 a 6, de 1 a 4, de 1 a 3, de 1 a 2 ou de 2 a 3. Uma cadeia de alquileno substituído é um grupo de polimetileno em que um ou mais átomos de metileno hidrogênio são substituídos com um substituinte. Os substituintes adequados incluem aqueles descritos abaixo com relação a um grupo alifático substituído.
[0011] O termo "alquila", como aqui utilizado, refere-se a um radical de hidrocarboneto monovalente saturado de cadeia reta ou ramificada derivado de um componente alifático contendo entre um e seis átomos de carbono mediante a remoção de um único átomo de hidrogênio. Em algumas modalidades, alquila contém de 1 a 5 átomos de carbono. Em outra modalidade, alquila contém de 1 a 4 átomos de carbono. Em mais outras modalidades, alquila contém de 1 a 3 átomos de carbono. Em ainda outra modalidade, alquila contém de 1 a 2 átomos de carbono. Exemplos de radicais de alquila incluem, mas não são limitados a estes, metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, iso-butila, sec-butila, sec-pentila, iso-pentila, terc-butila, n-pentila, neopentila, n-hexila, sec-hexila, e outros mais.
[0012] Como aqui descrito, os compostos da invenção podemconter componentes "opcionalmente substituídos". Em geral, o termo "substituído", se precedido pelo termo "opcionalmente" ou não, significa que um ou mais hidrogênios do componente designado são substituídos com um substituinte adequado. A não ser que de outra maneira indicada, um grupo "opcionalmente substituído" pode ter um substituinte adequado em cada posição substituível do grupo, e quando mais do que uma posição em uma dada estrutura pode ser substituída com mais do que um substituinte selecionado de um grupo especificado, o substituinte pode ser o mesmo ou diferente em cada posição. As combinações de substituintes previstos sob esta invenção são preferivelmente aquelas que resultam na formação de compostos estáveis ou quimicamente viáveis. O termo "estável", como aqui utilizado, refere-se aos compostos que não são substancialmente alterados quando sujeitos às condições que levam em conta a sua produção, detecção, e, em certas modalidades, a sua recuperação, purificação e uso para um ou mais dos propósitos aqui divulgados.
[0013] Os substituintes monovalentes adequados em um átomo decarbono substituível de um grupo "opcionalmente substituído" são, independentemente, halogênio; -(CH2)o-4R°; -(CH2)o—4OR°; -O-(CH2)o- 4C(O)OR°; -(CH2)O-4CH(OR°)2; -(CH2)O-4SR°; -(CH2)o-4Ph, que pode ser substituído com R°; -(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph que pode ser substituído com R°; -CH=CHPh, que pode ser substituído com R°; -NO2; -CN; -N3; -(CH2)0-4N(R°)2; -(CH2)0-4N(R°)C(O)R°; -N(R°)C(S)R°; -(CH2)0-4N(R° )C(O)NR°2; -N(R°)C(S)NR°2; -(CH2)0-4N(R°)C(O)OR°; -N(R°)N(R°)C(O) R°; -N(R°)N(R°)C(O)NR°2; -N(R°)N(R°)C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)R°; -C(S )R°; -(CH2)0-4C(O)OR°; -(CH2)0-4C(O)SR°; -(CH2)0-4C(O)OSiR°3; -(CH2)0 -4OC(O)R°; -OC(O)(CH2)0-4SR-; -SC(S)SR°; -(CH2)0-4SC(O)R°; -(CH2)0-4C(O)NR°2; -C(S)NR°2; -C(S)S R°; -SC(S)SR°; -(CH2)0-4OC(O)NR°2; -C(O)N(OR°)R°; -C(O)C(O)R°; -C (O)CH2C(O)R°; -C(NOR°)R°; -(CH2)0-4SSR°; -(CH2)0-4S(O)2R°; -(CH2)0-4 S(O)2OR°; -(CH2)0-4OS(O)2R°; -S(O)2NR°2; -(CH2)0-4S(O)R°; -N(R°)S(O )2NR°2; -N(R°)S(O)2R°; -N(OR°)R°; -C(NH)NR°2; -P(O)2R°; -P(O)R°2; - OP(O)R°2; -OP(O)(OR°)2; -SiR°3; -(alquileno C1-4 reto ouramificado)O-N(R°)2; ou -(aqluileno C1-4 reto ouramificado)C(O)O-N(R°)2, em que cada R° pode ser substituído como definido abaixo e é independentemente hidrogênio, C1-6 alifático, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, ou um anel de arila saturado ou parcialmente saturado de 5 a 6 membros tendo de 0 a 4 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, ou, apesar da definição acima, duas ocorrências independentes de Ro, tomadas juntamente com os seus átomos de intervenção, formam um anel mono- ou bicíclico de arila saturado ou parcialmente insaturado de 3 a 12 membros tendo de 0 a 4 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, que podem ser substituídos como definido abaixo.
[0014] Os substituintes adequados em um nitrogênio substituível deum grupo "opcionalmente substituído" incluem -Ri, -NR^, -C(O)Rt, -C(O)ORt -C(O)C(O)Rt, -C(O)CH2C(O)R t, -S(O)2Rt, -S(O)2NRi2, -C(S)NRi2, -C(NH)NRi2, ou -N(Ri)S(O)2Ri; em que cada Ri é independentemente hidrogênio, C1-6 alifático que pode ser substituído como definido abaixo, OPh não substituído, ou um anel de arila saturado ou parcialmente insaturado de 5 a 6 membros não substituído tendo de 0 a 4 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre, ou, apesar da definição acima, duas ocorrências independentes de Ri, tomados em conjunto com o seu átomo de intervenção formam um anel mono- ou bicíclico de arila saturado ou parcialmente insaturado de 3 a 12 membros não substituído independentemente selecionado de nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
[0015] Os substituintes adequados no grupo alifático de Ri sãoindependentementehalogênio, -R*, -(haloR*), -OH, -OR*, -O(haloR*), -CN, -C(O)OH, -C(O) OR*, -NH2, -NHR*, -NR*2, ou -NO2, em que cada R* é não substituído ou onde precedido por "halo" é substituído apenas com um ou mais halogênios, e é independentemente C1-4 alifático, -CH2Ph, -O(CH2)0-1Ph, ou um anel de arila saturado ou parcialmente saturado de 5 a 6 membros tendo de 0 a 4 heteroátomos independentemente selecionados de nitrogênio, oxigênio ou enxofre.
[0016] Como aqui utilizado, o termo "inibidor" é definido como umcomposto que se liga e/ou inibe um alvo S-adenosilmetionina (SAM) utilizando a enzima com afinidade mensurável. Em certas modalidades, um inibidor possui uma IC50 e/ou uma constante de ligação de menos de cerca de 50 μM, menos do que cerca de 1 μM, menos do que cerca de 500 nM, menos do que cerca de 100 nM, ou menos do que cerca de 10 nM.
[0017] Os termos "afinidade mensurável" e "inibir de formamensurável", como aqui utilizados, significam uma alteração mensurável na atividade de pelo menos uma SAM que utiliza a enzima entre uma amostra compreendendo um composto fornecido, ou sua composição, e pelo menos uma enzima dependente de SAM, e uma amostra equivalente compreendendo pelo menos uma enzima dependente de SAM, na ausência de dito composto, ou sua composição.3. Descrição dos Compostos Exemplares
[0018] Em algumas modalidades da Fórmula II, R1a é selecionadode -OCH3, -CH3, -OCHF2 e -CH2CH3.
[0019] Em algumas modalidades da Fórmula II, R4a é selecionadode -CH2OCH3, -CH(CH3)OCH3, 4,4-difluorocicloexila, ciclopropila, tetra- hidropiran-4-ila, 1-(t-butoxicarbonil)-piperidin-4-ila, 1-(isobutoxicarbonil)-piperidin-4-ila, 1-(isopropoxicarbonil)-piperidin-4-ila, 1-(2-fluoroetil)-piperidin-4-ila, 1-(2,2-difluoroetil)-piperidin-4-ila, 1-(2,2,2- trifluoroetil)-piperidin-4-ila, 1-(2-hidroxiisobutil)-piperidin-4-ila, 1-(hidroxiisopropilcarbonil)-piperidin-4-ila, 1-(etoxicarbonilmetil)-piperidin- 4-ila, 1-(isopropilcarbonil)-piperidin-4-ila, 1-metilpiperidin-4-ila, 1- (metilsulfonil)-piperidin-4-ila, 1-(etilsulfonil)-piperidin-4-ila, 1-(isopropilsulfonil)-piperidin-4-ila, 1-(fenil)-piperidin-4-ila, 1-(oxetan-3- il)piperidin-4-ila, 1-(piridin-2-il)-piperidin-4-ila e 1-(pirimidin-2-il)- piperidin-4-ila.
[0020] Em algumas modalidades da Fórmula II, R13 é selecionadode hidrogênio, cloro, flúor, OCH(CH3)2, fenila e piridin-2-ila.
[0021] Os compostos exemplares de Fórmula II são apresentadosna Figura 1. Em alguns casos, dois (ou mais) dos compostos na Figura 1 tendo uma ou mais ligações onduladas terão a estrutura exata. Visto que a ligação ondulada representa um centro quiral de rotação ótica indeterminada, tais compostos serão compreendidos de serem isômeros óticos separados e distintos entre si. A Figura 1 é anotada de indicar os conjuntos de dois ou mais compostos que possuem a mesma estrutura representada, mas são de estereoquímica diferente.4. Uso, Formulação e AdministraçãoComposições farmaceuticamente aceitáveis
[0022] De acordo com outra modalidade, a invenção fornece umacomposição compreendendo um composto desta invenção ou um derivado farmaceuticamente aceitável deste e um portador, adjuvante ou veículo farmaceuticamente aceitável. A quantidade de composto nas composições desta invenção é tal que é eficaz para modular de forma mensurável uma enzima de modificação de histona metila, ou um mutante desta, em uma amostra biológica ou em um paciente. Em certas modalidades, a quantidade de composto nas composições desta invenção é tal que é eficaz para modular de modo mensurável uma enzima de modificação de histona metila, ou um mutante desta, em uma amostra biológica ou em um paciente.
[0023] Em certas modalidades, uma composição desta invenção éformulada para administração a um paciente que necessite de tal composição. Em algumas modalidades, uma composição desta invenção é formulada para administração oral a um paciente.
[0024] O termo "paciente", como aqui utilizado, significa um animal,preferivelmente um mamífero, e mais preferivelmente um ser humano.
[0025] O termo "portador, adjuvante ou veículo farmaceuticamenteaceitável" refere-se a um portador, adjuvante ou veículo não tóxico que não destrói a atividade farmacológica do composto com o qual ele é formulado. Portadores, adjuvantes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis que podem ser utilizados nas composições desta invenção incluem, mas não são limitados a estes, trocadores iônicos, alumina, estearato de alumínio, lecitina, proteínas séricas, tais como albumina do soro humano, substâncias tamponantes tais como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potássio, misturas de glicerídeo parciais de ácidos graxos vegetais saturados, água, sais ou eletrólitos, tais como sulfato de protamina, fosfato de hidrogênio dissódico, fosfato de hidrogênio potássico, cloreto de sódio, sais de zinco, sílica coloidal, trissilicato de magnésio, polivinil pirrolidona, substâncias à base de celulose, polietileno glicol, carboximetilcelulose de sódio, poliacrilatos, ceras, polímeros de bloco de polietileno-polioxipropileno, polietileno glicol e lanolina.
[0026] Um "derivado farmaceuticamente aceitável" significaqualquer sal, éster, sal de um éster ou outro derivado não tóxico de um composto desta invenção que, após administração a um receptor, é capaz de fornecer, direta ou indiretamente, um composto desta invenção ou um metabólito inibidoramente ativo ou seu resíduo.
[0027] As composições da presente invenção podem seradministradas por via oral, parenteral, por pulverização de inalação, por via tópica, retal, nasal, bucal, vaginal ou através de um reservatório implantado. O termo "parenteral" como aqui utilizado inclui injeção subcutânea, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intrassinovial, intraesternal, intratecal, intra-hepática, intralesional e intracraniana ou técnicas de infusão. De preferência, as composições são administradas por via oralmente, intraperitoneal ou intravenosa. As formas injetáveis estéreis das composições desta invenção podem ser uma suspensão aquosa ou oleaginosa. Estas suspensões podem ser formuladas de acordo com as técnicas conhecidas na especialidade utilizando agentes dispersantes ou umectantes adequados e agentes de suspensão. A preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente não tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3- butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão a água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Além disso, os óleos estéreis fixos sãoconvencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão.
[0028] Para este propósito, qualquer óleo fixo suave pode serempregado incluindo mono- ou di-glicerídeos sintéticos. Os ácidos graxos, tais como ácido oleico e os seus derivados de glicerídeo, são úteis na preparação de injetáveis, como são os óleos naturais farmaceuticamente aceitáveis, tais como azeite de oliva ou óleo de rícino, especialmente nas suas versões polioxietiladas. Estas soluções ou suspensões de óleo também podem conter um diluente ou dispersante de álcool de cadeia longa, tal como carboximetil celulose ou agentes dispersantes similares que são comumente utilizados na formulação de formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis incluindo emulsões e suspensões. Outros tensoativos comumente utilizados, tais como Tweens, Spans e outros agentes emulsificantes ou intensificadores da biodisponibilidade que são comumente utilizados na fabricação de formas de dosagem sólidas, líquidas ou outras farmaceuticamente aceitáveis, também podem ser utilizados para os propósitos de formulação.
[0029] As composições farmaceuticamente aceitáveis destainvenção podem ser administradas por via oral em qualquer forma de dosagem oralmente aceitável incluindo, mas não limitado a estes, cápsulas, comprimidos, suspensões ou soluções aquosas. No caso de comprimidos para uso oral, os portadores comumente utilizados incluem lactose e amido de milho. Os agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, também são tipicamente adicionados. Para a administração oral em uma forma de cápsula, diluentes úteis incluem lactose e amido de milho seco. Quando a suspensões aquosas são requeridas para uso oral, o ingrediente ativo é combinado com agentes emulsificantes e de suspensão. Se desejável, certos agentes edulcorantes, flavorizantes ou corantes também podem ser adicionados.
[0030] Alternativamente, as composições farmaceuticamenteaceitáveis desta invenção podem ser administradas na forma de supositórios para a administração retal. Estes podem ser preparados mediante a mistura do agente com um excipiente não irritativo adequado que é sólido na temperatura ambiente, mas líquido na temperatura retal e, portanto, irá derreter no reto para liberar o medicamento. Tais materiais incluem manteiga de cacau, cera de abelha e polietileno glicóis.
[0031] As composições farmaceuticamente aceitáveis destainvenção também podem ser administradas topicamente, especialmente quando o alvo de tratamento inclui áreas ou órgãos facilmente acessíveis pela aplicação tópica, incluindo doenças dos olhos, da pele ou do trato intestinal inferior. As formulações tópicas adequadas são facilmente preparadas para cada uma destas áreas ou órgãos.
[0032] A aplicação tópica para o trato intestinal inferior pode serefetuada em uma formulação de supositório retal (ver acima) ou em uma formulação de enema adequada. Os emplastros topicamente transdérmicos também podem ser utilizados.
[0033] Para aplicações tópicas, as composições fornecidasfarmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas em uma pomada adequada contendo o componente ativo em suspensão ou dissolvido em um ou mais portadores. Os portadores para a administração tópica dos compostos desta invenção incluem, mas não são limitados a estes, óleo mineral, petrolato líquido, petrolato branco, propileno glicol, polioxietileno, composto de polioxipropileno, cera emulsificante e água. Alternativamente, as composições fornecidas farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas em uma loção ou creme adequado contendo os componentes ativos em suspensão ou dissolvidos em um ou mais portadores farmaceuticamente aceitáveis. Os portadores adequados incluem, mas não são limitados a estes, óleo mineral, monoestearato de sorbitano, polissorbato 60, cera de éster cetílico, álcool cetearílico, 2-octildodecanol, álcool benzílico e água.
[0034] Para uso oftálmico, as composições fornecidasfarmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas como suspensões micronizadas isotônicas, solução salina estéril com pH ajustado ou, de preferência, como soluções em salina estéril com pH ajustado isotônica, com ou sem um conservante tal como cloreto de benzilalcônio. Alternativamente, para uso oftálmico, as composições farmaceuticamente aceitáveis podem ser formuladas em uma pomada tal como petrolato.
[0035] As composições farmaceuticamente aceitáveis da presenteinvenção também podem ser administradas por aerossol ou inalação nasal. Tais composições são preparadas de acordo com as técnicas bem conhecidas na especialidade de formulação farmacêutica e podem ser preparadas como soluções em salina, empregando álcool benzílico ou outros conservantes adequados, promotores de absorção para melhorar a biodisponibilidade, fluorocarbonetos e/ou outros agentes de solubilização ou dispersão convencionais.
[0036] Mais preferivelmente, as composições farmaceuticamenteaceitáveis desta invenção são formuladas para administração oral. Tais formulações podem ser administradas com ou sem alimentos. Em algumas modalidades, as composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção são administradas sem alimentos. Em outras modalidades, as composições farmaceuticamente aceitáveis desta invenção são administradas com alimentos.
[0037] A quantidade de compostos da presente invenção que podeser combinada com os materiais portadores para produzir uma composição em uma única forma de dosagem irá variar dependendo do hospedeiro tratado e do modo particular de administração. De preferência, as composições fornecidas devem ser formuladas de modo que uma dosagem entre 0,01 a 100 mg/kg de peso corporal/dia do inibidor possa ser administrada a um paciente que recebe estas composições.
[0038] Também deve ficar entendido que um regime de dosagem etratamento específico para qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico empregado, a idade, peso corporal, saúde geral, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de medicamentos, e a avaliação do médico assistente e a gravidade da doença particular sendo tratada. A quantidade de um composto da presente invenção na composição dependerá também do composto particular na composição. Uso de Compostos e Composições Farmaceuticamente Aceitáveis
[0039] Os compostos e as composições aqui descritas sãogeralmente úteis para a modulação da atividade de uma ou mais enzimas envolvidas na regulação epigenética.
[0040] A epigenética é o estudo das mudanças hereditárias naexpressão do gene provocadas por mecanismos diferentes que alteram a sequência de DNA subjacente. Os mecanismos moleculares que desempenham um papel na regulação epigenética incluem metilação do DNA e modificações da cromatina/histona. A metilação de histona, em particular, é fundamental em muitos fenômenos epigenéticos.
[0041] Cromatina, o conjunto organizado de DNA nuclear eproteínas histona, é a base para uma multiplicidade de processos nucleares vitais incluindo a regulação da transcrição, replicação, reparação do dano de DNA e a progressão através do ciclo celular. Vários fatores, tais como as enzimas de modificação da cromatina, foram identificados os quais desempenham um papel importante na manutenção do equilíbrio dinâmico da cromatina (Margueron, et al. (2005) Curr. Opin. Genet. Dev. 15:163-176).
[0042] As histonas são os componentes principais da proteína decromatina. Elas atuam como bobinas em torno das quais o DNA gira, e elas desempenham um papel na regulação do gene. Há um total de seis classes de histonas (H1, H2A, H2B, H3, H4 e H5) organizadas em duas superclasses: histonas do núcleo (H2A, H2B, H3 e H4) e histonas ligantes (H1 e H5). A unidade básica da cromatina é a nucleossoma, que consiste em cerca de 147 pares de base de DNA em volta do octâmero de histona, que consiste em duas cópias de cada uma das histonas do núcleo H2A, H2B, H3 e H4 (Luger, et al. (1997) Nature 389:251-260).
[0043] As histonas, em particular os resíduos dos terminais deamino das histonas H3 e H4 e dos terminais amino e carboxila das histonas H2A, H2B e H1, são suscetíveis a uma variedade de modificações pós-translacionais incluindo acetilação, metilação, fosforilação, ribosilação, sumoilação , ubiquitinação, citrulinação, deiminação e biotinilação. O núcleo das histonas H2A e H3 também pode ser modificado. As modificações de histona são parte integrante de diversos processos biológicos tais como a regulação do gene, reparo de DNA e condensação de cromossoma.
[0044] A presente divulgação fornece compostos e composiçõespara a atividade modulação da enzima de modificação de histona metila. As enzimas de modificação de histona metila são reguladores fundamentais dos processos celulares e de desenvolvimento. As enzimas de modificação de histona metila podem ser caracterizadas como histona metil transferases ou histona desmetilases. As enzimas histona desmetilase possuem módulos que mediam a ligação aos resíduos metilados. Por exemplo, múltiplas desmetilases contêm um domínio de Tudor (por exemplo, JMJD2C/GASC1) ou um domínio de PHD (por exemplo, JARID1C/SMCX, PHF8).
[0045] As especificidades de lisina de muitas histonas metiltransferases foram caracterizadas. Por exemplo, SET7/9, SMYD3, e MLL1-5 são específicos para H3K4. SUV39H1, DIM-5, e G9a são específicos para H3K9. SET8 é específico para H4K20.
[0046] DOT1 é um exemplo de um domínio não SET contendohistona metilase. Metilatos de DOT1 H3 em lisina 79.
[0047] Igualmente as histonas metilases foram mostradas deregular a atividade transcricional, a estrutura de cromatina, e o silenciamento do gene, as desmetilases também foram descobertas as quais atingem a expressão do gene. A LSD1 foi a primeira histona lisina desmetilase a ser caracterizada. Esta enzima apresenta homologia às amina oxidases dependente de FAD e atua como um correpressor da transcrição de genes neuronais (Shi et al., Cell 119:941-953, 2004). As desmetilases adicionais que definem as famílias de desmetilase separadas foram descobertas, incluindo as famílias JHDM1 (ou KDM2), JHDM2 (ou KDM3), JMJD2 (ou KDM4), JARID (ou KDM5), JMJD3 (ou KDM6), e JMJD6 (Lan et al., Curr. Opin. Cell Biol. 20(3):316-325, 2008).
[0048] As desmetilases atuam sobre os resíduos de lisinaespecíficos dentro de sequências de substrato e discriminam entre o grau de metilação presente em um determinado resíduo. Por exemplo, a LSD1 remove os grupos de mono ou dimetila de H3K4. Os membros da família JARID1A-D removem os grupos de trimetila de H3K4. UTX e JMJD3 desmetilam a H3K27, efeitos de neutralização da atividade de metilase EZH2. As especificidades de substrato de outras desmetilases foram caracterizadas (ver Shi, Nat. Rev. 8:829-833, 2007).
[0049] Uma classe de histona metilases é caracterizada pelapresença de um domínio SET, designado após as proteínas que partilham o domínio, Su(var)3-9, o intensificador de zeste [E(Z)] e trithorax. Um domínio SET inclui cerca de 130 aminoácidos. As famílias de metilase contendo o domínio SET incluem as famílias SUV39H1, SET1, SET2, EZH2, RIZ1, SMYD3, SUV4-20H1, SET7/9 e PR- SET7/SET8 (revisto em Dillon et al., Genome Biol. 6:227, 2005). Os membros de uma família tipicamente incluem motivos de sequência semelhantes na proximidade e dentro do domínio SET. O genoma humano codifica mais 50 histona proteína metilases contendo o domínio SET, qualquer uma das quais pode ser utilizada em um ensaio aqui descrito.
[0050] A EZH2 é um exemplo de uma metilase contendo o domínioSET humano. A EZH2 se associa com EED (Desenvolvimento Ectodérmico Embrionário) e SUZ12 (supressor de homólogo zeste 12) para formar um complexo conhecido como PRC2 (Complexo Repressivo do Grupo de Polycomb 2) tendo a capacidade de tri-metilar a histona H3 na lisina 27 (Cao and Zhang, Mol. Cell 15:57-67, 2004). Os complexos de PRC2 também podem incluir as subunidades RBAP46 e RBAP48.
[0051] As atividades oncogênicas de EZH2 foram demonstradaspor vários estudos. Nas experiências de linhagem celular, a superexpressão de EZH2 induz a invasão de células, o crescimento em ágar macio, e a motilidade embora inesperada de EZH2 inibe a proliferação celular e a invasão de células (Kleer et al., 2003, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 100:11606-11611; Varambally et al., (2002), “The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer,” Nature 419, 624-629). Tem sido demonstrado que a EZH2 reprime a expressão de vários supressores tumorais, incluindo E- caderina, DAB2IP e RUNX3 entre outros. Em modelos de xenoenxerto, a EZH2 inesparada inibe o crescimento de tumores e metástases. Recentemente, foi demonstrado que a modulação negativa de EZH2 em modelos murinos bloqueia a metástase do câncer da próstata (Min et al., “An oncogene-tumor suppressor cascade drives metastatic prostate cancer by coordinately activating Ras and nuclear factor- kappaB,” Nat Med. 2010 Mar; 16(3):286-94). A superexpressão de EZH2 está associada com a agressividade de certos tipos de câncer tais como o câncer de mama (Kleer et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 100:11606-11611, 2003). Estudos recentes também sugerem que o gene de fusão oncogênico específico do câncer de próstata TMPRSS2-ERG induz programas epigenéticos repressivos por meio da ativação direta de EZH2 (Yu et al., “An Integrated Network of Androgen Receptor, Polycomb, and TMPRSS2-ERG Gene Fusions in Prostate Cancer Progression,” Cancer Cell. 2010 May 18;17(5):443-454).
[0052] Em algumas modalidades, os compostos da presenteinvenção modulam a atividade de uma ou mais enzimas envolvidas na regulação epigenética. Em algumas modalidades, os compostos da presente invenção modulam a atividade de uma enzima de modificação de histona metila, ou um mutante desta. Em algumas modalidades, os compostos da presente invenção modulam a atividade de EZH2. Em certas modalidades, os compostos da presente invenção regulam negativamente ou suprimem a atividade de EZH2. Em algumas modalidades, os compostos da presente invenção são antagonistas da atividade de EZH2.
[0053] Em algumas modalidades, os compostos e composições dapresente invenção são úteis no tratamento de doenças e/ou distúrbios associados com uma enzima de modificação de histona metila. Consequentemente, em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de modulação de uma doença e/ou distúrbio associado com uma enzima de modificação de histona metila. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença e/ou distúrbio associado com uma enzima de modificação de histona metila que compreende a etapa de administração de um composto ou composição de Fórmula II.
[0054] Em algumas modalidades, os compostos e composições da presente invenção são úteis no tratamento de doenças e/ou distúrbios associados com a superexpressão de EZH2. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença e/ou distúrbio associado com a superexpressão de EZH2 compreendendo a etapa de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em algumas modalidades, o método acima adicionalmente compreende a etapa preliminar de determinar se o indivíduo superexpressa EZH2.
[0055] Em algumas modalidades, os compostos e composições dapresente invenção são úteis no tratamento de doenças e/ou distúrbios associados com a proliferação celular. Em algumas modalidades, os compostos e composições da presente invenção são úteis no tratamento de doenças e/ou distúrbios associados com a desregulação do ciclo celular ou reparo do DNA. Em algumas modalidades, os compostos e composições da presente invenção são úteis no tratamento de câncer. Os tipos exemplares de câncer incluem o câncer de mama, câncer de próstata, câncer de cólon, carcinoma de células renais, câncer de glioblastoma multiforme, câncer de bexiga, melanoma, câncer de brônquios, linfoma e câncer de fígado.
[0056] O estudo de anulações de EZH2, as mutações de sentidoerrado e por deslocamento do quadro de leitura sugerem que a EZH2 funcione como um supressor tumoral nos distúrbios do sangue tais como as síndromes mielodisplásicas (MDS) e neoplasias mielóides (Ernst et al., Nat Genet. 2010 Aug; 42(8):722-6; Nikoloski et al., Nat Genet. 2010 Aug; 42(8):665-7). Consequentemente, em algumas modalidades, os compostos e composições da presente invenção são úteis no tratamento de doenças e/ou distúrbios associados com a presença de uma forma mutante de EZH2. Em algumas modalidades, os compostos e composições da presente invenção são úteis no tratamento de doenças e/ou distúrbios associados com a presença de Y641N EZH2. Em certas modalidades, a doença ou distúrbio associado com a presença de uma forma mutante de EZH2 é um linfoma de células B humanas. Em certas modalidades, a doença e/ou distúrbio associado com a presença de Y641N EZH2 é o linfoma folicular ou linfoma de células B grandes difusas. Em algumas modalidades, os compostos ou composições da presente invenção são úteis no tratamento de distúrbios do sangue, tais como as síndromes mielodisplásicas, leucemia, anemia e citopenia. Sneeringer et al., “Coordinated activities of wild-type plus mutant EZH2 drive tumor-associated hypertrimethylation of lysine 27 on histone H3 (H3K27) in human B-cell lymphomas,” Proceedings of the National Academy of Sciences, PNAS Early Edition published ahead of print on November 15, 2010.
[0057] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece ummétodo de redução da atividade de EZH2 em um indivíduo que compreende a etapa de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de redução da atividade de EZH2 do tipo grande em um indivíduo que compreende a etapa de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de redução da atividade de uma forma mutante de EZH2 em um indivíduo que compreende a etapa de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método de redução da atividade de uma forma mutante de EZH2 em um indivíduo que compreende a etapa de administração de um composto ou composição de Fórmula II, em que a forma mutante de EZH2 é Y641N EZH2. Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença e/ou distúrbio associado com a EZH2 que compreende a etapa de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de um sujeito que sofre de uma doença e/ou distúrbio associado com a EZH2 do tipo grande que compreende a etapa de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença e/ou distúrbio associado com uma forma mutante de EZH2 que compreende a etapa de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença e/ou distúrbio associado com uma forma mutante de EZH2 que compreende a etapa de administração de um composto ou composição de Fórmula II, em que a forma mutante de EZH2 é Y641N EZH2. Em certas modalidades, o método acima adicionalmente compreende a etapa preliminar de determinar se o indivíduo expressa uma forma mutante de EZH2, tal como Y641N EZH2. Em certas modalidades, a presente invenção fornece um método de redução da atividade de uma forma mutante de EZH2, tal como EZH2 Y641N, em um indivíduo com sua necessidade, compreendendo a etapa de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratamento de um indivíduo que sofre de uma doença e/ou distúrbio associado com uma forma mutante de EZH2 que compreende a etapa de administração de um composto ou composição de Fórmula II. Em certas modalidades, o método acima adicionalmente compreende a etapa preliminar de determinar se o indivíduo expressa uma forma mutante de EZH2, tal como Y641N EZH2. Em algumas modalidades, essa determinação é feita por meio da determinação se o indivíduo possui níveis aumentados de trimetilação específica de histona H3 Lys-27 (H3K27me3), em comparação com um indivíduo conhecido de não expressar uma forma mutante de EZH2.
EQUIVALENTES
[0058] Os exemplos representativos que se seguem são destinadosa ajudar a ilustrar a invenção, e não se destinam, nem devem ser interpretados, a limitar o escopo da invenção. De fato, várias modificações da invenção e muitas outras modalidades desta, além daquelas aqui apresentadas e descritas, se tornarão evidentes para aqueles versados na técnica a partir dos conteúdos completos deste documento, incluindo os exemplos que se seguem e as referências à literatura científica e de patente aqui citada. Deve ainda ser observado que os conteúdos dessas referências citadas são aqui incorporados por referência para ajudar a ilustrar o estado da técnica.
[0059] Será observado que para as preparações de composto aquidescritas, quando a HPLC de fase reversa for utilizada para purificar um composto, um composto pode existir como um sal de adição de ácido. Em algumas modalidades, um composto pode existir como um sal de ácido fórmico ou ácido mono-, di- ou tri- trifluoroacético.
[0060] Ainda será observado que a presente invenção contempla oscompostos individuais aqui descritos. Quando os compostos individuais exemplificados são isolados e/ou caracterizados como um sal, por exemplo, como um sal de ácido trifluoroacético, a presente invenção contempla uma base livre do sal, assim como outros sais farmaceuticamente aceitáveis da base livre.
[0061] Os seguintes exemplos contêm informação, exemplificaçãoe orientação adicionais importantes que podem ser adaptadas à prática desta invenção nas suas várias modalidades e nos seus equivalentes.
[0062] Os procedimentos para a preparação dos compostosexemplificados abaixo, assim como os compostos/intermediários adicionais nos esquemas de síntese, podem ser observados no Pedido Internacional No. PCT/US2013/025639, cujos conteúdos são aqui incorporados por referência. EXEMPLOS
[0063] Como descritos nos Exemplos abaixo, em certasmodalidades exemplares, os compostos são preparados de acordo com os seguintes procedimentos gerais. Será observado que, embora os métodos e esquemas sintéticos representem a síntese de certos compostos da presente invenção, os seguintes métodos e outros métodos conhecidos de uma pessoa de habilidade prática na técnica podem ser aplicados a todos os compostos e subclasses e espécies de cada um destes compostos, como aqui descrito.
[0064] A não ser que de outra maneira mencionada, todos ossolventes, produtos químicos e reagentes foram obtidos comercialmente e utilizados sem purificação. Os espectros 1H RMN foram obtidos em CDCl3, d6-DMSO, CD3OD, ou d6-acetona a 25 oC em 300 MHz sobre um OXFORD (Varian) com desvio químico (δ, ppm) registrado em relação a TMS como um padrão interno. Os cromatogramas HPLC-MS e espectros foram obtidos com o sistema Shimadzu LC-MS-2020. A análise quiral e purificação foram obtidas com Yilite P270.Exemplo 1. Síntese de Compostos 327 e 346 e Compostos Relacionados e Intermediários. Os compostos do título deste e outros Compostos Relacionados foram preparados de acordo com o seguinte esquema geral. Além disso, onde indicado, as modificações deste esquema são divulgadas para a síntese de mais Compostos Relacionados adicionais da invenção e seus intermediários.(S)-2-metilpropano-2-sulfonamida 0 >]' S'NH2 Ti(OEt)4 60-90% Etapa 1
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Etapa 1: 4-(((terc-butilsulfinil)imino)metil)piperidina-1-carboxilatode (S,E)-terc-butila:(S)-2-metilpropano-2-sulfinamida
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[0065] A um frasco de fundo redondo carregado com uma barra deagitação magnética foram adicionados (S)-2-metilpropano-2- sulfinamida (20,46 g, 169 mmol), 4-formilpiperidina-1-carboxilato de terc-butila (30 g, 141 mmol), DCM (300 ml), e Ti(OEt)4 (59,0 ml, 281 mmol). A solução foi agitada na temperatura ambiente durante 3 h antes que ela fosse esfriada rapidamente com salmoura (80 ml). A solução foi agitada durante 30 minutes antes da filtragem. A torta de filtro foi lavada com DCM e o filtrado foi colocado em um funil de separação e lavado com água. A camada orgânica foi secada por Na2SO4, filtrada, e concentrada in vacuo. O resíduo bruto solidificou com o composto do título (29 g, 92 mmol, 65,1 % de rendimento) m/z 217.
[0066] O intermediário mostrado na seguinte tabela foi preparadode acordo com o procedimento geral delineado na Etapa 1 utilizando os materiais de partida apropriados e modificações.Nome Estrutura m/z(S,E)-2-metil-N-((tetra-hidro-2H-piran-4- il)metileno)propano-2-sulfinamida ,2
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Etapa 2: 4-((S)-1-((R ou S)-1,1-dimetiletilsulfinamido)etil) piperidina- 1-carboxilato de terc-butila:
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[0067] A um frasco de fundo redondo carregado com uma barra deagitação magnética foram adicionados 4-((terc-butilsulfinilimino)metil)piperidina-1-carboxilato de (S,E)-terc-butila (36,4 g, 115 mmol), DCM (400 ml), e a solução foi esfriada para 0 °C em um banho de gelo com agitação. A esta solução foi adicionado MeMgBr (77 ml, 230 mmol) (3M em éter dietílico) e a reação agitada durante 4 h enquanto se aquece para a temperatura ambiente. A reação foi cuidadosamente extinta por meio da adição de NH4Cl aquoso saturado. O sólido foi fragmentado pela adição de 1N HCl. As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída com DCM. A fase orgânica combinada foi secada por Na2SO4, filtrada, e concentrada in vacuo para proporcionar o composto do título (29 g, >9:1 dr) o qual é utilizado sem mais purificação na próxima etapa.
[0068] O intermediário mostrado na seguinte tabela foi preparadode acordo com o procedimento geral delineado na Etapa 2 utilizando os materiais de partida apropriados e modificações.Nome Estrutura m/z(S)-2-metil-N-((R ou S)-1-(tetra-hidro-2H-piran-4- il)etil)propano-2-sulfinamida ° y / \/ HN-S* 'b 234
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Etapa 3: 4-(1-aminoetil)piperidina-1-carboxilato de (R ou S)- terc- butila:
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[0069] A um frasco de fundo redondo de 1 L carregado com umabarra de agitação magnética foi adicionado 4-((S)-1-((S)-1,1- dimetiletilsulfinamido)etil)piperidina-1-carboxilato de terc-butila bruto (29 g) foi absorvido em MeOH (200 ml) antes da adição de um 4 N solução de HCl em 1,4-dioxano (24,06 ml, 96 mmol). A solução resultante foi depois agitada na temperatura ambiente durante 1 h na rt. O metanol foi depois removido in vacuo para proporcionar óleo viscoso que foi tratado com NaHCO3 aquoso saturado (~ 500 ml) e extraído com acetato de etila (2 x 500 ml). Esta fase orgânica foi combinada, secada com MgSO4, filtrada, e o solvente foi depois removido in vacuo proporcionando o composto do título (22 g) que foi utilizado sem mais purificação.
[0070] O intermediário mostrado na seguinte tabela foi preparadode acordo com o procedimento geral delineado na Etapa 3 utilizando os materiais de partida apropriados.Nome Estrutura m/z(R ou S)-1-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)etanamina ° y z NH2 130
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Etapa 4: 2-(2-bromofenil)-3-oxobutanoato de metila:
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[0071] Um frasco de fundo redondo foi carregado com uma barra deagitação magnética e 2-(2-bromofenil)acetato de metila (25 g, 109 mmol) e THF (50 ml). Esta solução foi esfriada para -78 °C antes da adição por gotejamento de uma 1 M solução de LiHMDS em THF (218 ml, 218 mmol). A reação foi agitada durante 30 min a -78 °C antes da adição de 1-(1H-imidazol-1-il)etanona (14,42 g, 131 mmol), dissolvida em uma mistura de THF:DMF (112 ml de THF, 24 ml de DMF). A solução foi agitada durante 1 h antes da extinção com NH4Cl aquoso saturado (~250 ml) e diluição com EtOAc. As camadas foram separadas e a fase aquosa foi extraída com EtOAc (~2 x 250 ml). O extrato orgânico combinado foi lavado com salmoura, secado por Na2SO4, filtrado e concentrado in vacuo. O resíduo bruto foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel utilizando um eluente de acetato de etila/hexanos (10:1) para proporcionar 2-(2-bromofenil)-3-oxobutanoato de metila (32,5 g, 102 mmol, 93 % de rendimento).
[0072] Os intermediários mostrados na seguinte tabela forampreparados de acordo com o procedimento geral delineado na Etapa 4 utilizando os materiais de partida apropriados.Nome Estrutura m/z2-(2-bromo-4-clorofenil)-3-oxobutanoato de metila O o— 3042-(2-bromo-4-metoxifenil)-3-oxobutanoato de metila oZ CHO o— 3022-(2-bromo-4-fluorofenil)-3-oxobutanoato de metila ?r°Y 1 289
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Etapa 5: 4-(1-(3-(2-bromofenil)-4-metóxi-4-oxobut-2-en-2-ilamino)etil)piperidina-1-carboxilato de (R ou S, E e Z)-terc-butila:
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[0073] A um frasco de fundo redondo foram adicionados 4-(1-aminoetil)piperidina-1-carboxilato de (R ou S)-terc-butila (9,35 g, 40,9 mmol), EtOH (75 ml), e 2-(2-bromofenil)-3-oxobutanoato de metila (7,40 g, 27,3 mmol) (da Etapa 4). A esta solução foi adicionado AcOH (1,563 ml, 27,3 mmol) e a reação foi aquecida durante a noite a 85 °C antes do esfriamento para a temperatura ambiente e concentração. O resíduo bruto foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel (330 g, 100 % hexanos a 25 % EA em hexanos) para proporcionar o composto do título (6,45 g, 13,40 mmol, 49,1 % de rendimento).
[0074] Os intermediários mostrados na seguinte tabela forampreparados de acordo com o procedimento geral delineado na Etapa 5 utilizando os materiais de partida apropriados.
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Etapa 6: 1-(1-(1-(terc-butoxicarbonil)piperidin-4-il)etil)-2-metil-1H-
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indol-3-carboxilato de (R ou S)-metila:
[0075] Um frasco de fundo redondo de 250 ml foi carregado comuma barra de agitação magnética, 4-(1-(3-(2-bromofenil)-4-metóxi-4- oxobut-2-en-2-ilamino)etil)piperidina-1-carboxilato de (R ou S,Z)-terc- butila (3,33 g, 6,92 mmol), RuPhos Pre-catalyst II (Metanossulfonato(2- dicicloexilfosfino-2',6'-di-i-propóxi-1,1'-bifenil)(2-amino-1,1'-bifenil-2-il) paládio(II)) (0,463 g, 0,553 mmol), dicicloexil(2’,6’-diisopropoxibifenil-2- il)fosfina (0,387 g, 0,830 mmol), 1,4-dioxano anidro (27,7 ml, 6,92 mmol), e metóxido de sódio (0,561 g, 10,38 mmol). A mistura de reação foi expurgada e suprida outra vez com nitrogênio e aquecida para 100 °C com agitação durante a noite antes de ser deixada esfriar para a rt. A reação foi diluída com acetato de etila (~ 100 ml) e a mistura foi filtrada através de um leito de terra diatomácea. O filtrado foi pré-absorvido em sílica-gel (~30 g) e purificado por meio de cromatografia em sílica-gel (120 g) utilizando acetato de etila/hexanos (1:1) como eluente para proporcionar o composto do título (2,01 g, 4,77 mmol, 68,9 % de rendimento).
[0076] Os intermediários mostrados na seguinte tabela forampreparados de acordo com o procedimento geral delineado na Etapa 6 utilizando os materiais de partida apropriados.
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Etapa 7: ácido (R ou S)-2-metil-1-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-i )etil)-1H-indol-3-carboxílico:
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[0077] Um frasco de fundo redondo de 1 L foi carregado com umabarra de agitação magnética, 2-metil-1-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)etil)- 1H-indol-3-carboxilato de (R ou S)-metila (11,60 g, 38,5 mmol), etanol (96 ml, 38,5 mmol), e 6 N NaOH aquoso (64,1 ml, 385 mmol). O frasco foi ajustado com um condensador de refluxo e aquecido em refluxo durante 6 h antes de ser deixado esfriar para a rt. Os voláteis foram removidos in vacuo e a mistura resultante foi despejada em 10 % HCl (~300 ml). Um precipitado se formou o qual foi coletado por meio de filtração a vácuo utilizando um funil Buchner. A torta de filtro foi enxaguada com uma porção adicional de água (~200 ml), coletada, e secada sob vácuo para proporcionar o composto do título (10,87 g, 35,9 mmol, 93 % de rendimento) como um sólido esbranquiçado.
[0078] Os intermediários mostrados na seguinte tabela forampreparados de acordo com o procedimento geral delineado na Etapa 7 utilizando os materiais de partida apropriados.
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Etapa 8: 4-(1-(3-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metilcarbamoil)-2-metil-1H-indol-1-il)etil)piperidina-1-carboxilato de (R ou S)-terc-butila (Composto 327).
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[0079] Um frasco de fundo redondo de 250 ml foi carregado comuma barra de agitação magnética, ácido (R ou S)-1-(1-(1-(terc- butoxicarbonil)piperidin-4-il)etil)-2-metil-1H-indol-3-carboxílico (1,950 g, 5,05 mmol), cloridrato de 3-(aminometil)-4-metóxi-6-metilpiridin-2(1H)- ona (2,065 g, 10,09 mmol), DMF (25,2 ml, 5,05 mmol), base de Hunig (3,52 ml, 20,18 mmol). A mistura de reação foi esfriada para 0 °C e COMU (2,16 g, 5,05 mmol) foi adicionado. A reação foi deixada agitar durante a noite para a temperatura ambiente. A mistura de reação foi diluída com água e extraída com EtOAc. O extrato orgânico combinado foi lavado com salmoura, secado com MgSO4, filtrado e conc. in vacuo para proporcionar o material bruto que foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel (120 g) utilizando MeOH/acetato de etila (1:5) como eluente para proporcionar o composto do título (1,86 g, 3,29 mmol, 65,3 % de rendimento). LCMS 537 (M + 1)+ 1H RMN (400 MHz ,DMSO-d6) δ = 11,83 - 11,71 (m, 1 H), 7,80 (br. s., 1 H), 7,73 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 7,62 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,06 (td, J = 7,1, 14,4 Hz, 2 H), 6,21 (s, 1 H), 4,32 (br. s., 2 H), 4,16 (br. s., 1 H), 4,02 (br. s., 1 H), 3,85 (s, 3 H), 3,75 (br. s., 1 H), 2,70 (br. s., 1 H), 2,58 (s, 3 H), 2,37 (br. s., 1 H), 2,21 (s, 3 H), 1,90 (d, J = 12,9 Hz, 1 H), 1,53 (d, J = 6,9 Hz, 3 H), 1,35 (s, 10 H), 1,21 (br. s., 1 H), 0,89 (d, J = 8,7 Hz, 1 H), 0,67 (d, J = 11,8 Hz, 1 H).
[0080] Os compostos mostrados na seguinte tabela forampreparados de acordo com o procedimento geral delineado na Etapa 8 utilizando os materiais de partida apropriados. As estruturas dos compostos são mostradas na Figura 1.
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Etapa 9: Cloridrato de (R ou S)-N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di- hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1-(1-(piperidin-4-il)etil)-1H-indol-3- carboxamida (Composto 326).
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[0081] Um frasco de fundo redondo de 250 ml foi carregado com uma barra de agitação magnética, 4-(1-(3-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2- di-hidropiridin-3-il)metilcarbamoil)-2-metil-1H-indol-1-il)etil)piperidina-1- carboxilato de (R ou S)-terc-butila (Composto 327) (1,850 g, 3,45 mmol), MeOH (13,79 ml, 3,45 mmol), e HCl (2,59 ml, 10,34 mmol) (4 N em dioxano). A reação foi deixada agitar na rt durante 6 h antes de ser conc. in vacuo para proporcionar o composto do título (1,65 g, 3,14 mmol, 91 % de rendimento). LCMS 437 (M + 1)+.
[0082] O composto mostrado na seguinte tabela foi preparado deacordo com o procedimento geral delineado na Etapa 9 utilizando os materiais de partida apropriados. A estrutura deste composto é mostrada na Figura 1.Número do Composto Nome 1H RMN m/z376 Cloridrato de (R ou S)-1-(1-(1- (azetidin-3- il)piperidin-4-il)etil)- N-((4,6-dimetil-2- oxo-1,2-di- hidropiridin-3- il)metil)-2-metil-1H- indol-3- carboxamida (400 MHz, DMSO-d6) δ 12,27 -12,10 (m, 1 H), 11,96 - 11,72 (m, 1 H), 9,80 (br. s., 1 H), 9,19 (br. s., 2 H), 7,89 - 7,67 (m, 2 H), 7,62 (d, J = 7,6 Hz, 1 H), 7,09 (quin, J = 6,6 Hz, 2 H), 5,99 (s, 1 H), 4,59 - 4,36 (m, 3 H), 4,24 - 3,95 (m, 2 H), 3,48 (d, J = 13,2 Hz, 1 H), 3,17 (d, J = 12,0 Hz, 1 H), 2,87 (br. s., 1 H),2,70 (br. s., 2 H), 2,58 (s, 3 H), 2,34 - 2,25 (m, 3 H), 2,19 - 2,10 (m, 3 H), 1,75 (d, J = 12,3 Hz, 1 H), 1,57 (d, J = 6,7 Hz, 3 H), 1,47 (d, J = 12,7 Hz, 2 H), 1,33 - 1,21 (m, 2 H), 0,85 (d, J = 13,6 Hz, 1 H) 476
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Etapa 10: 4-(1-(3-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metilcarbamoil)-2-metil-1H-indol-1-il)etil)piperidina-1-carboxilato de (R ou S)-isopropila (Composto 346).
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[0083] Um frasco de fundo redondo de 250 ml foi carregado comuma barra de agitação magnética, cloridrato de (R ou S)-N-((4-metóxi- 6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1-(1-(piperidin-4- il)etil)-1H-indol-3-carboxamida (0,467 g, 0,987 mmol), DMF (2,468 ml, 0,987 mmol), THF (2,468 ml, 0,987 mmol), e N-etil-N-isopropilpropan-2- amina (0,638 g, 4,94 mmol). A reação foi esfriada para 0 °C e carbonocloridato de isopropila (0,160 ml, 1,086 mmol) foi adicionado por gotejamento por meio de siringa. A reação foi deixada agitar durante 2 h na rt e foi depois tratada com 5 N LiOH durante 1 h para remover qualquer piridona acilada. Este material foi extraído com acetato de etila, lavado com salmoura, secado com MgSO4 e filtrado e conc. in vacuo. O material resultante foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel (50 g) utilizando acetato de etila/MeOH (5:1) como eluente para proporcionar composto do título puro como um sólido amarelo claro (0,300 g, 0,545 mmol, 55,2 % de rendimento). LCMS 523 (M + 1)+; 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) δ 11,59 (br. s., 1 H), 7,74 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,69 (t, J = 4,9 Hz, 1 H), 7,62 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,13 - 7,01 (m, 2 H), 6,15 (s, 1 H), 4,78 - 4,67 (m, 1 H), 4,32 (d, J = 4,9 Hz, 2 H), 4,23 - 4,12 (m, 1 H), 4,12 - 4,02 (m, 1 H), 3,84 (s, 3 H), 3,82 - 3,74 (m, 1 H), 2,79 - 2,66 (m, 1 H), 2,58 (s, 3 H), 2,46 - 2,34 (m, 2 H), 2,20 (s, 3 H), 1,96 - 1,88 (m, 1 H), 1,58 - 1,46 (m, 4 H), 1,15 (d, J = 6,0 Hz, 6 H), 0,95 - 0,89 (m, 1 H), 0,74 - 0,65 (m, 1 H).
[0084] Os compostos mostrados na seguinte tabela forampreparados de acordo com o procedimento geral delineado na Etapa 10 utilizando os materiais de partida apropriados. As estruturas dos compostos são mostradas na Figura 1.
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Exemplo 2. Síntese de (R ou S)-1-(1-(1-isopropilpiperidin-4-il)etil)- N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1H- indol-3-carboxamida (Composto 358)
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[0085] Um frasco de 25 ml foi carregado com uma barra de agitaçãomagnética, cloridrato de (R ou S)-N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di- hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1-(1-(piperidin-4-il)etil)-1H-indol-3- carboxamida, THF (2,114 ml, 0,211 mmol), propan-2-ona (0,061 g, 1,057 mmol), e triacetoxiboroidreto de sódio (0,224 g, 1,057 mmol). A reação foi deixada agitar na rt durante 12 h. A reação foi extinta de modo inverso em NaHCO3 aquoso saturado, extraída com acetato de etila e conc. in vacuo. O material resultante foi tratado com 10 ml de 7 N amônia em MeOH e foi conc in vacuo para produzir material que foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel (10g) utilizando DCM/MeOH/NH4OH (90:1:0,1) como eluente para proporcionar 33 mg (0,065 mmol, 31,0 % de rendimento) do composto do título como um sólido branco. LCMS 479 (M + 1)+; 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz)
[0086] δ 11,59 (s, 1H), 7,64 - 7,82 (m, 2H), 7,59 (d, 1H), 6,95 - 7,17(m, 2H), 6,15 (s, 1H), 4,32 (d, 2H), 4,04 - 4,24 (m, 1H), 3,84 □, 3H),2,77 - 2,93 (□, 2H), 2,68 (□, 1H), 2,60 (□, 3H), 2,20 (□, 2H), 0,91 (□, 6H), 0,71 - 0,67 (□, 2H).
[0087] Os compostos mostrados na seguinte tabela forampreparados de acordo com o procedimento geral delineado neste Exemplo utilizando os materiais de partida apropriados. As estruturas dos compostos são mostradas na Figura 1.
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Exemplo 3. Síntese de (R ou S)-1-(1-(1-(2-fluoroetil)piperidin-4-il)etil)-N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2- metil-1H-indol-3-carboxamida (Composto 356):
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[0088] Um frasco de 25 ml foi carregado com uma barra de agitaçãomagnética, cloridrato de (R ou S)-N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di- hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1-(1-(piperidin-4-il)etil)-1H-indol-3- carboxamida (0,062 g, 0,131 mmol), K2CO3 (0,072 g, 0,524 mmol), MeCN (0,655 ml, 0,131 mmol), DMF (0,262 ml, 0,131 mmol) e 1-bromo- 2-fluoroetano (0,020 ml, 0,262 mmol). A reação foi tampada e aquecida para 82 °C com agitação durante 4 h. A reação foi deixada esfriar para a rt, filtrada, e o filtrado foi pré-absorvido em sílica-gel (12 g). O material foi purificado por meio de cromatografia em SiO2 (25 g) utilizando DCM/MeOH/Et3N (85:15:0,5) como eluente para proporcionar o composto do título como um sólido esbranquiçado (30 mg, 0,059 mmol, 45,1 % de rendimento). LCMS 483 (M + 1)+ ; 1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) δ 11,59 (s, 1H), 7,75 - 7,68 (m, 2H), 7,60 (d, 1 H) 7,09 - 7,03 (m, 2H), 6,15 (s, 1H) 4,53 - 4,51 (m, 1H), 4,42 - 4,39 (m, 1H), 4,32 (d, 2H), 4,24 - 4,2 (m, 1H), 3,84 (s, 3H), 2,98 (br. d., 1H), 2,70 - 2,49 (m, 4H), 2,60 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,01 (dt, 1H), 1,92 - 1,90 (m, 1H), 1,75 - 1,71 (m, 1H), 1,54 (d, 3H), 1,38 - 1,36 (m, 1H), 1,02 - 0,98 (m, 1H), 0,7 - 0,66 (br. d., 1H).
[0089] Os compostos mostrados na seguinte tabela forampreparados de acordo com o procedimento geral delineado neste Exemplo utilizando os materiais de partida apropriados. As estruturasdos compostos são mostradas na Figura 1.
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Exemplo 4. Síntese de (R ou S)-N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1-(1-(1-(pirimidin-2-il)piperidin-4-il)etil)-1H-indol-3-carboxamida (Composto 361).
Figure img0044
[0010] A um frasco reutilizável foram adicionados 2-cloropirimidina(185 mg, 1,611 mmol), cloridrato de (R ou S)-N-((4-metóxi-6-metil-2- oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1-(1-(piperidin-4-il)etil)-1H- indol-3-carboxamida (508 mg, 1,074 mmol), e EtOH (8 ml). A esta solução foi adicionado Et3N (449 μl, 3,22 mmol). O frasco foi lacrado e aquecido para 100 °C durante a noite. A solução foi deixada esfriar para a temperatura ambiente e concentrada in vacuo. O resíduo bruto foi
[0011] purificado por meio de cromatografia em sílica-gel (10g)utilizando DCM/MeOH/NH4OH (90:1:0,1) como eluente paraproporcionar 33 mg (0,065 mmol, 31,0 % de rendimento) do composto do título como um sólido branco. LCMS 479 (M + 1)+; 1H RMN (DMSO- d6, 400 MHz)
[0090] d 11,59 (s., 1H), 7,64 - 7,82 (m, 2H), 7,59 (d, 1H), 6,95 - 7,17(m, 2H), 6,15 (s, 1H), 4,32 (d, 2H), 4,04 - 4,24 (m, 1H), 3,84 (s, 3H), 2,77 - 2,93 (m, 2H), 2,68 (d, 1H), 2,60 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 2,08 - 2,15 (m, 1H), 1,92 (d, 1H), 1,83 (br. s., 1H), 1,54 (d, 3H), 1,27 - 1,43 (m, 2H), 0,91 (t, 6H), 0,71-0,67 (m, 2H).
[0091] Os compostos mostrados na seguinte tabela forampreparados de acordo com o procedimento geral delineado nesteExemplo utilizando os materiais de partida apropriados. As estruturasdos compostos são mostradas na Figura 1.
Figure img0045
Exemplo 5. Síntese de (R ou S)-1-(1-(1-(2-hidroxietil)piperidin-4- il)etil)-N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2- metil-1H-indol-3-carboxamida (Composto 347).
Figure img0046
[0092] Em um tubo lacrado carregado com uma barra de agitaçãomagnética foi adicionado (R ou S)-N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di- hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1-(1-(piperidin-4-il)etil)-1H-indol-3- carboxamida (0,1 g, 0,229 mmol), foi adicionado DCM (3 ml) e a reação esfriada para 0 °C. À mistura de reação esfriada foi adicionado oxirano que foi condensado no frasco de reação (~1 ml). A reação foi deixada agitar na rt durante 4 h e foi depois conc. in vacuo para proporcionar o material bruto que foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel (12 g) utilizando acetato de etila/MeOH (4:1) como eluente para proporcionar o composto do título como um sólido branco (50 mg). LCMS 481 (M + 1)+ ;1H RMN (DMSO-d6, 400 MHz) δ 11,58 (s, 1 H), 7,77 - 7,65 (m, 2 H), 7,59 (d, J = 7,8 Hz, 1 H), 7,11 - 6,99 (m, 2 H), 6,14 (s, 1H), 4,54 - 4,44 (m, 1 H), 4,31 (d, J = 5,1 Hz, 3 H), 4,13 (dd, J = 7,1, 10,3Hz, 1 H), 3,83 (s, 3 H), 3,42 (q, J = 6,0 Hz, 2 H), 2,93 (br. s., 1 H), 2,71 - 2,56 (m, 4 H), 2,31 (br. s., 2 H), 2,19 (s, 3 H), 2,03 - 1,83 (m, 2 H), 1,64(br. s., 1 H), 1,53 (d, J = 6,9 Hz, 3 H), 1,32 (d, J = 11,1 Hz, 1 H), 1,02 (d,J = 10,3 Hz, 1 H), 0,65 (d, J = 11,8 Hz, 1 H).
[0093] Os compostos mostrados na seguinte tabela forampreparados de acordo com o procedimento geral delineado neste Exemplo utilizando os materiais de partida apropriados. As estruturas dos compostos são mostradas na Figura 1.
Figure img0047
Figure img0048
Exemplo 6. Síntese de (R ou S)-N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-6-fenil-1-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)etil)-1H-indol-3-carboxamida (Composto 374).
Figure img0049.
[0094] Um tubo de reação de 25 ml foi carregado com uma barra deagitação magnética, ácido fenil borônico (72,6 mg, 0,596 mmol), K3PO4 (103 mg, 0,447 mmol), X-Phos pre-catalyst (Cloro(2-dicicloexilfosfino- 2‘,4‘,6‘-triisopropil-1,1‘-bifenil)[2-(2-aminoetil)fenil)]paládio(II)) (4,92 mg, 5,96 μmol), e o frasco foi lacrado. O frasco foi evacuado/suprido outra vez com nitrogênio (3x) antes da adição de 6-cloro-2-metil-1-(1-(tetra- hidro-2H-piran-4-il)etil)-1H-indol-3-carboxilato de metila (Composto 314) (100 mg, 0,298 mmol) como um solução em 1,4-dioxano (1 ml). O frasco foi depois aquecido para 100 °C durante a noite com agitação. O frasco foi depois deixado esfriar para a temperatura ambiente e a reação concentrada in vacuo. O resíduo bruto foi purificado por meio de cromatografia em SiO2 (10g) utilizando um eluente de acetato de etila/hexanos (4:1) para fornecer o composto do título como um sólido branco (106 mg, 0,281 mmol, 94 % de rendimento). ). LCMS 514 (M + 1)+ ; 1H RMN 1H RMN (400 MHz, DMSO-d6) δ = 11,59 (s, 1 H), 7,98 - 7,84 (m, 2 H), 7,75 - 7,67 (m, 3 H), 7,47 (t, J = 7,8 Hz, 2 H), 7,39 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 7,35 - 7,27 (m, 1 H), 6,15 (s, 1 H), 4,35 (d, J = 4,9 Hz, 2 H), 4,25 - 4,12 (m, 1 H), 3,93 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 3,86 - 3,77 (m, 3 H), 3,67 (d, J = 8,5 Hz, 1 H), 3,39 - 3,32 (m, 1 H), 3,10 - 3,00 (m, 1 H), 2,62 (s, 3 H), 2,21 (s, 3 H), 1,85 (d, J = 10,0 Hz, 1 H), 1,63 - 1,49 (m, 4 H), 1,45 - 1,33 (m, 1 H), 1,20 - 0,99 (m, 1 H), 0,66 (d, J = 12,0 Hz, 1 H).Exemplo 7. Síntese de ácido (R ou S)-2-(4-(1-(3-((4-metóxi-6-metil- 2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metilcarbamoil)-2-metil-1H-indol-1 -il)etil)piperidin-1-il) acético (Composto 364).
Figure img0050
A um frasco de fundo redondo foi carregado com uma barra de agitação magnética foi adicionado (R ou S)-etil-2-(4-(1-(3-((4-metóxi-6-metil-2- oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metilcarbamoil)-2-metil-1H-indol-1- il)etil)piperidin-1-il)acetato (Composto 363) (69 mg, 0,132 mmol), THF (1,5 ml), MeOH (1,5 ml), e água ( 0,75 ml). A esta solução foi adicionado monoidrato de hidróxido de lítio (5,54 mg, 0,132 mmol) e a reação agitada na temperatura ambiente durante 1 h. Os orgânicos foram removidos sob pressão reduzida e a solução aquosa resultante purificada por meio de HPLC de fase reversa (água/MeCN) 0^95 % para proporcionar o composto do título (66 mg, 0,108 mmol, 82 % derendimento). LCMS 514 (M + 1)+ 1H RMN (400 MHz ,DMSO-d6) δ =11,67 (s, 1 H), 9,65 (s, 1 H), 7,84 - 7,68 (m, 2 H), 7,63 (d, J = 7,4 Hz, 1H), 7,14 - 7,03 (m, 2 H), 6,18 (s, 1 H), 4,33 (d, J = 3,6 Hz, 2 H), 4,27 -4,15 (m, 1 H), 4,04 (br. s., 2 H), 3,85 (s, 3 H), 3,57 (s, 1 H), 3,35 - 3,23 (m, 1 H), 3,14 - 2,99 (m, 1 H), 2,86 - 2,74 (m, 1 H), 2,62 (s, 3 H), 2,21 (s, 3 H), 2,18 - 2,08 (m, 1 H), 1,75 (s, 1 H), 1,60 - 1,49 (m, 4 H), 1,46 - 1,33 (m, 1 H), 0,92 - 0,81 (m, 1 H).Exemplo 8. Síntese de 2-metil-6-(piridin-3-il)-1-(1-(tetra-hidro-2H- piran-4-il)etil)-1H-indol-3-carboxilato de (R ou S)-metila. Este intermediário foi utilizado como um material de partida alternativo na Etapa 7 apresentada no Exemplo 1 para a síntese de outros compostos da invenção.2-metil-1-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)etil)-6-(4,4,5,5-tetrametil-1,3,2- dioxaborolan-2-il)-1H-indol-3-carboxilato de (R ou S)-metila
Figure img0051
[0095] A um frasco de fundo redondo foram adicionados Pd(OAc)2(10,03 mg, 0,045 mmol), acetato de potássio (219 mg, 2,233 mmol), 4,4,4',4',5,5,5',5'-octametil-2,2'-bi(1,3,2-dioxaborolano) (567 mg, 2,233 mmol), e 2-dicicloexilfosfino-2‘,4‘,6‘-triisopropilbifenila (XPhos) (85 mg, 0,179 mmol), e o frasco foi lacrado. A este recipiente foi adicionado 6- cloro-2-metil-1-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)etil)-1H-indol-3-carboxilato de (R ou S)-metila (Etapa 6) (500 mg, 1,489 mmol) dissolvido em dioxano (3,4 ml) e a reação evacuada/suprida outra vez com N2 (3*) antes do aquecimento para 100 °C durante a noite. A reação foi depois deixada esfriar para a rt e foi diluída com EtOAc. A reação foi filtrada através de terra diatomácea e o filtrado concentrado para proporcionar o composto do título que foi utilizado nas reações subsequentes sem mais purificação. LCMS 428 (M + 1)+.2-metil-6-(piridin-3-il)-1-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)etil)-1H-indol-3- carboxilato de (R ou S)-metila:
Figure img0052
[0096] A um frasco reutilizável foram adicionados K2CO3 (206 mg,1,488 mmol), aduto de PdCl2(dppf)-CH2Cl2 (60,8 mg, 0,074 mmol), e o frasco foi lacrado. Este frasco foi evacuado/suprido outra vez com N2 (3X) antes da adição de 2-metil-1-(1-(tetra-hidro-2H-piran-4-il)etil)-6- (4,4,5,5-tetrametil-1,3,2-dioxaborolan-2-il)-1H-indol-3-carboxilato (R ou S)-metila (318 mg, 0,744 mmol) dissolvido em 1,4-dioxano (4 ml), 3- bromopiridina (71,7 μl, 0,744 mmol), e água (400 μL). A reação foi evacuada/suprida outra vez com N2 (3X) antes do aquecimento para 100 °C. A solução foi esfriada para a temperatura ambiente e diluída com EtOAc. A solução foi filtrada e concentrada in vacuo. O resíduo bruto foi purificado por meio de cromatografia em sílica-gel (10 g, EtOAc/hex (1:1)) para proporcionar o composto do título (101 mg, 0,267 mmol, 35,9 % de rendimento). LCMS 379 (M + 1)+.Exemplo 9. Outros Intermediários de Alquil Carboxilato. Os seguintes intermediários de alquil carboxilato foram sintetizados de uma maneira análoga àquela apresentada na Etapa 2 do Exemplo 1, utilizando um material de partida apropriado e reagente.
Figure img0053
Figure img0054
Exemplo 10. Outros Compostos da Invenção Produzidos de Intermediários de Ácido Carboxílico. Os seguintes compostos foram sintetizados de uma maneira análoga àquela apresentada na Etapa 4 de Exemplo 1, utilizando um material de partida apropriado. As estruturas destes compostos são apresentadas na Figura 1.
Figure img0055
Figure img0056
Figure img0057
Figure img0058
Figure img0059
Figure img0060
Figure img0061
Exemplo 11. Síntese de 1 -(1-(1,4-dioxan-2-il)etil)-2-metil-1H-indol-3- carboxilato de metila. O composto do título foi utilizado como um material de partida de alquil carboxilato alternativo na Etapa 3 do Exemplo 1.Etapa 1: 1-(1,4-dioxan-2-il)etanona:
Figure img0062
[0097] A uma solução de peróxido benzóico (20 g, 141 mmol) em200 ml de 1,4-dioxano na temperatura ambiente sob atmosfera de nitrogêniofoi adicionado biacetila (24,3 g, 282 mmol). Após a adição, a mistura foi aquecida em refluxo e agitada durante 24 horas. A mistura de reação foi esfriada para 0 °C. O pH foi ajustado para ao redor de 9 através da adição progressiva hidróxido de sódio 2 N abaixo de 0 °C, extraído com 2-metóxi-2-metilpropano (10 ml x 3), e concentrado para fornecer 1-(1,4-dioxan-2-il)etanona (13 g, 36 %) como um óleo amarelo que foi utilizado diretamente na próxima etapa sem purificação.Etapa 2: 1-(1,4-dioxan-2-il)etanamina:
Figure img0063
[0098] A uma solução de 1-(1,4-dioxan-2-il)etanona (12 g, 92,2mmol) em 1,2-dicloroetano (100 ml) foi adicionado (4-metoxifenil)metanamina (25 g, 184,4 mmol) na temperatura ambiente. A mistura foi deixada agitar durante 3 horas, e depois triacetoxiboroidreto de sódio (39 g, 184,4 mmol) foi adicionado. A mistura resultante foi deixada agitar durante 48 horas na temperatura ambiente. A mistura de reação foi extinta através da adição de água, extraída com diclorometano (100 ml x 3). A fase orgânica combinada foi secada por sulfato de sódio anidro, e depois filtrada. O filtrado foi concentrado e purificado através da cromatografia de coluna em sílica-gel (eluato: diclorometano/metanol 100:1 ^50:1 ^20:1) para fornecer 1 -(1,4-dioxan- 2-il)-N-(4-metoxibenzil) etanamina (16,4 g, 71%) como um sólido amarelo. LCMS (M + H+) m/z: calc. 251,15, observado 251,9. À uma solução de 1-(1,4-dioxan-2-il)-N-(4-metoxibenzil)etanamina (5 g, 19,9 mmol) em metanol anidro (100 ml) foi adicionado paládio 10 % em carbono (240 mg, 2 mmol), depois expurgada com hidrogênio (30 psi), a mistura foi deixada agitar durante a noite na temperatura ambiente. A mistura de reação foi filtrada, e o filtrado foi concentrado para proporcionar o composto do título (2,5 g, 96 %) como um sólido marrom.
[0099] Os intermediários de amina mostrados na seguinte tabelaforam preparados de acordo com o procedimento geral delineado acima utilizando os materiais de partida apropriados e modificações.
Figure img0064
Figure img0065
Etapa 3: 3-((1-(1,4-dioxan-2-il)etil)imino)-2-(2-bromofenil)butanoato de (E)-metila:
Figure img0066
[00100] A uma solução de 1-(1,4-dioxan-2-il)etanamina (2,5 g, 19 mmol) em metanol (100 ml) foram adicionados 2-(2-bromofenil)-3- oxobutanoato de metila (5,4 g, 20 mmol) e ácido acético (1,8 g, 30 mmol). O sistema de reação resultante foi aquecido em refluxo e deixado agitar durante a noite. A mistura de reação foi concentrada e purificada por cromatografia de coluna em sílica-gel (eluída: diclorometano/metanol 50:1^20:1^5:1) para fornecer o composto do título (1 g, 14 %) como um sólido marrom. LCMS (M + H+) m/z: calc. 383,07, observado 384,9.
[00101] Os intermediários de imino-bromo mostrados na seguinte tabela foram preparados de acordo com o procedimento geral delineado acima utilizando os materiais de partida apropriados (por exemplo, uma das aminas apresentadas na tabela na Etapa 2 deste exemplo) e modificações.
Figure img0067
Figure img0068
Etapa 4: 1-(1-(1,4-dioxan-2-il)etil)-2-metil-1H-indol-3-carboxilato demetila:
Figure img0069
[00102] A uma solução de 3-((1-(1,4-dioxan-2-il)etil)imino)-2-(2- bromofenil)butanoato de (E)-metila (400 mg, 1,1 mmol) em dioxano (3 ml) foram adicionados Cloro[2-(dicicloexilfosfino)-3,6-dimetóxi-2’,4’,6’- triisopropilbifenil][2-(2-aminoetil)fenil]Pd( π) (160 mg, 0,2 mmol), 2-Dicicloexifosfino-2’,6’-diisopropoxibifenila (93 mg, 0,2 mmol) e terc- butóxido de sódio (192 mg, 2 mmol). A mistura resultante de reação foi aquecida para 120 °C com agitação durante 30 min em um forno de microondas. A mistura de reação foi extinta através da adição de água e foi extraída com acetato de etila (25 ml x 3). A fase orgânica combinada foi secada por sulfato de sódio anidro, e depois filtrada. O filtrado foi concentrado e purificado por cromatografia de coluna em sílica-gel (eluída: éter de petróleo / éster acético 10:1^5:1^2:1) para proporcionar o composto do título (282 mg, 89 %) como sólido amarelo. LCMS (M + H+) m/z: calc. 303,15, observado 303,9.
[00103] O composto mostrado na seguinte tabela foi preparado de acordo com o procedimento geral delineado acima utilizando os materiais de partida apropriados (por exemplo, um dos intermediários de imino-bromo mostrados na tabela na Etapa 3 deste exemplo) e modificações.
Figure img0070
[00104] Estes carboxilatos de alquila também foram utilizados como material de partida na Etapa 3 do Exemplo 1 na síntese de certos compostos da invenção.Exemplo 12. Separação Quiral do Composto 219 para proporcionar os Compostos 223 e 224. N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-1-(1-metoxipropan-2-il)-2-metil-1H-indol-3- carboxamida (200 mg) (Composto 219) foi submetido à cromatografia quiral por meio da cromatografia de fluido supercrítico (SFC) (A:C2HÕOH,B:NHS^H2O. A:B = 55:45 coluna AD) para proporcionar os enantiômeros separados 223 (pico 1) e 224 (Pico 2) (60 mg cada um) LCMS 398 (M + 1)+ 1H RMN (400 MHz, CD3OD) δ 7,69 (d, J=7,2 Hz,1H), 7,53 (d, J = 7,6 Hz,1H), 7,12 (m, 2H), 6,26 (s,1H), 4,80 (m,1H), 4,52 (s,2H), 3,99 (m, 4H), 3,75 (m, 1H),3,20 (s, 3H), 2,62 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 1,59 (d, J = 7,2 Hz, 3H). A rotação ótica de cada enantiômero não foi determinada.
[00105] Os compostos mostrados na seguinte tabela foram preparados de acordo com o procedimento geral de cromatografia quiral delineado acima. A rotação ótica dos enantiômeros separados não foi determinada, mas o pico de eluição (“Pico 1” ou “Pico 2”) é indicado. As estruturas de cada composto são mostradas na Figura 1.
Figure img0071
Figure img0072
Figure img0073
Exemplo 1. Síntese de 1-(2,3-di-hidro-1H-inden-1-il)-2-metil-1H- pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butila. O composto do título como material de partida na Etapa 3 do Exemplo 36 na síntese de certos compostos da invenção.2-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butila:
Figure img0074
[00106] A um frasco de fundo redondo de 500 ml que contém N- acetil-N-(3-bromopiridin-2-il)acetamida (14’815 g’ 57’6 mmol) foram adicionados iodeto de cobre(I) (1’098 g’ 5’76 mmol)’ L-prolina (1’327 g’ 11’53 mmol)’ carbonato de césio (28’2 g’ 86 mmol)’ depois acetoacetato de t-butila (11’47 ml’ 69’2 mmol) e dioxano (100 ml). A reação foi vac/expurgada com N2 3X depois ajustada com um septo e uma entrada de N2 e aquecida durante a noite a 70 °C. Os sólidos inorgânicos foram removidos por filtração com celita e a torta foi lavada com 100 ml de EtOAc. Esta solução foi concentrada e o resíduo foi dividido entre 250 ml de salmoura e 250 ml de EtOAc. A camada aq. foi ainda extraída com EtOAc (2 x 250 ml) e a camada orgânica combinada foi secada por Na2SO4’ filtrada’ concentrada e purificada porbi CC utilizando 1:1 EtOAc:Hex como eluente para fornecer (2’7 g’ 20’2 %) de 2-metil-1H- pirrolo[2’3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butila. LRMS (M + H+) m/z: calc. 233’28; observado 233’1.1-(2,3-di-hidro-1H-inden-1-il)-2-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3- carboxilato de terc-butila:
Figure img0075
[00107] Uma solução de 2-metil-1H-pirrolo[2’3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butil etila (100 mg’ 0’74 mmol)’ 2’3-di-hidro-1H- inden-1-ol (176 mg, 0,74 mmol), PPh3 (195 mg, 1,49 mmol) foi agitada em THF seco (10 ml) a 0 °C sob uma atmosfera de nitrogênio. À esta mistura foi adicionado DIAD por gotejamento (150 mg , 1,48 mmol) durante um período de 5 min, e a reação foi agitada na temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura foi lavada com salmoura, secada e concentrada para proporcionar o produto bruto. O produto bruto foi purificado por cromatografia em sílica-gel (éter de petróleo/acetato de etila = 5:1) para proporcionar o terc-butil-1-(2,3-di-hidro-1H-inden-1-il)- 2-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato (150 mg, 60 %).
[00108] O composto mostrado na seguinte tabela foi preparado de acordo com o procedimento geral delineado acima utilizando os materiais de partida apropriados e modificações.
Figure img0076
[00109] Cada um dos carboxilatos de alquila acima foi utilizado como material de partida na Etapa 3 do Exemplo 1 na síntese de certos compostos da invenção.Exemplo 13. Síntese de diastereômeros isolados de N-((4-metóxi- 6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-1-((2R ou 2S, 3R ou 3S)- 3-metoxibutan-2-il)-2-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxamida (Compostos 261, 266, 267 e 302).Etapa 1: 2-metil-1-(3-oxobutan-2-il)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butila:
Figure img0077
[00110] A uma solução de 2-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3- carboxilato de terc-butila (5,0 g, 21,53 mmol) em CH3CN (50 ml) foram adicionados Cs2CO3 (21,0 g, 64,58mmol), iodeto de potássio (3,57 g, 21,53 mmol). A mistura foi agitada a 27 oC durante 30 minutos. Depois 3-clorobutan-2-ona (2,75 g, 25,83 mmol) foi adicionada e a mistura foi agitada a 70 oC durante 12 horas. A mistura foi filtrada e o filtrado foi concentrado. O resíduo foi purificado através de coluna (Eluato: Éter de petróleo: Acetato de etila = 50:1) para fornecer 2-metil-1-(3-oxobutan-2- il)-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butila como um óleo amarelo esverdeado. (3,23 g, rendimento de 50 %) LCMS (M + H+) m/z: calc 303,37; observado 302,9. 1H RMN (400 MHz, CDCh): a 8,32 - 8,30 (m, 1H), 8,25 - 8,23 (m, 1H), 7,17 - 7,14 (m, 1H), 5,50 - 5,44 (m, 1H), 2,71 (s, 3H), 1,96 (s, 3H), 1,65 - 1,67 (d,3H), 1,64 (s, 9H).Etapa 2: 1-(3-hidroxibutan-2-il)-2-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3- carboxilato de terc-butila:
Figure img0078
[00111] À solução de 2-metil-1-(3-oxobutan-2-il)-1H-pirrolo[2,3- b]piridina-3-carboxilato de terc-butila (3,1 g, 10,25 mmol) em metanol (30 ml) foi adicionado boroidreto de sódio (0,30 g, 8,2 mmol) a 0 oC. Após 30 minutes, outra batelada de boroidreto de sódio (0,30 g, 8,2 mmol) foi adicionada a 0 oC. Após a reação estar concluída ao redor de 2 h mais tarde, água (30 ml) foi adicionada por gotejamento muito cuidadosamente para extinguir a reação. A mistura foi extraída com CH2Cl2. A extração foi secada por Na2SO4, filtrada e concentrada sob vácuo para fornecer 1-(3-hidroxibutan-2-il)-2-metil-1H-pirrolo[2,3- b]piridina-3-carboxilato de terc-butila como um sólido amarelo. (3,0 g, iield 96 %) LCMS (M + H+) m/z: calc 305,38; observado 304,9. 1H RMN (400 MHz, CDCl3): a 8,31 - 8,29 (m, 1H), 8,13 - 8,12 (m, 1H), 7,11 - 7,07 (m, 1H), 4,46 - 4,43 (m, 1H), 4,12 (m, 1H), 2,73 (s, 3H), 1,58 (s, 9H), 1,51 - 1,49 (d, 3H), 0,92 - 0,91 (d, 3H).Etapa 3: Terc-butil-1-(3-metoxibutan-2-il)-2-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato:
Figure img0079
[00112] Ao THF seco (20 ml) foi adicionado NaH (60 % em óleo mineral, 2,37 g, 59,14 mmol). Depois a mistura foi agitada a 27 oC durante 20 minutos, depois 1-(3-hidroxibutan-2-il)-2-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butila (3,0 g, 9,86 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada a 27 oC durante 1 hora, depois adicionada em CH3I (13,99 g, 98,6 mmol). A mistura foi agitada durante 12 horas a 27 oC e depois esfriada para 0 oC. NH4CI sat. foi adicionado e extraído com CH2Cl2. A extração foi secada por sulfato de sódio, filtrada e concentrada para fornecer terc-butil-1-(3-metoxibutan-2-il)-2- metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato como um óleo amarelo. (3,2 g, rendimento de 100 %) LCMS (M + H+) m/z: calc. 319,41; observado 318,9.Etapa 4: ácido 1-(3-metoxibutan-2-il)-2-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxílico:
Figure img0080
[00113] À solução pré-esfriada de 1-(3-metoxibutan-2-il)-2-metil-1H- pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxilato de terc-butila (3,0 g, 9,42 mmol) em CH2Cl2 (20 ml) foi adicionado ácido trifluoroacético (20 ml) por gotejamento. A solução foi agitada a 27 oC durante 1,5 hora. O solvente foi removido sob vácuo a 27 oC. O resíduo foi utilizado para a próxima etapa sem purificado. LCMS (M + H+) m/z: calc 263,30; observado 262,9.Etapa 5: N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-1- (3-metoxibutan-2-il)-2-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3- carboxamida:
Figure img0081
[00114] A uma solução de ácido 1-(3-metoxibutan-2-il)-2-metil-1H- pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxílico (2,4 g, 9,15 mmol) em DMF (30 ml) foi adicionado TEA (4,2 g, 41,50 mmol), cloridrato de 3-(aminometil)-4- metóxi-6-metilpiridin-2(1H)-ona (2,1 g, 12,81 mmol). Após agitação durante 10 minutos a 27 oC, a mistura foi esfriada e HATU adicionado (5,56 g, 14,64 mmol). A mistura foi agitada a 27 oC durante 72 horas e 30 % de S.M. permaneceu. Depois a mistura foi aquecida a 80 oC durante 5 horas. A solução foi diluída com salmoura (100 ml) e extraída com CH2Cl2 (100 ml*3). As extrações foram combinadas e secadas por Na2SO4. O solvente foi evaporado sob vácuo e o resíduo foi purificado por coluna cintilante (Eluente: diclorometano: metanol = 95:5) para fornecer N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-1-(3- metoxibutan-2-il)-2-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxamida. (3,6g, rendimento de 95 %).Etapa 6: Separação de N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-1-(3-metoxibutan-2-il)-2-metil-1H-pirrolo[2,3- b]piridina-3-carboxamida: Isômeros (Compostos 261, 266, 267, e 302):
Figure img0082
[00115] mistura de isômeros da Etapa 5, N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo- 1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-1-(3-metoxibutan-2-il)-2-metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxamida, foi purificada por prep-HPLC (Condição: Coluna: SHIMADZU LC-8A, 250*50mm *10um; Fase móvel A: água com 0,2 % ácido fórmico; Fase móvel B: MeCN; temperatura da coluna: 30 oC; Gradiente: B em A 10~50 %) para fornecer um par de isômero principal (Composto 261 e Composto 266 combinados) (1,0 g, pureza 98,8 %) e um par de isômero secundário (Composto 267 e Composto 302 combinados) (180 mg, pureza 63 %). Os pares de isômero resultantes foram individualmente separados por SFC (Condição: Coluna: Chiralpak AD 250*30 mm *5 um; Fase móvel A: CO2 Supercrítico; Fase móvel B: IPA+NHa^O; Gradiente: B/A: 75:25) para fornecer os seguintes compostos isolados individuais:
[00116] Composto 261, N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-1-((2R ou 2S, 3R ou 3S)-3-metoxibutan-2-il)-2- metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxamida (Par de Isômeros Principal; Pico 1): 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,173 - 8,157 (m, 1H), 8,140 - 8,116 (m, 1H), 7,582 - 7,555 (m, 1H), 6,968 - 6,936 (m, 1H), 5,927 (s, 1H), 4,707 - 4,609 (m, 2H), 4,348 (s, 1H), 3,892 (s, 3H), 2,869 (s, 3H), 2,788 (s, 3H), 2,173 (s, 3H), 1,644 - 1,627 (d, 3H), 1,263 - 1,249 (d, 3H).
[00117] Composto 266, N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-1-((2R ou 2S, 3R ou 3S)-3-metoxibutan-2-il)-2- metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxamida (Par de Isômeros Principal; Pico 2): 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,179 - 8,163 (m, 1H), 8,143 - 8,120 (m, 1H), 7,558 - 7,531 (m, 1H), 6,986 - 6,954 (m, 1H), 5,931 (s, 1H), 4,702 - 4,605 (m, 2H), 3,897 (s, 3H), 2,892 (s, 3H), 2,789 (s, 3H), 2,189 (s, 3H), 1,647 - 1,629 (d, 3H), 1,267 - 1,252 (d, 3H).
[00118] Composto 267, N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-1-((2R ou 2S, 3R ou 3S)-3-metoxibutan-2-il)-2- metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxamida (Par de Isômeros Secundário; Pico 1): 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,174 - 8,162 (d, 1H), 8,111 - 8,094 (d, 1H), 7,551 - 7,526 (m, 1H), 6,993 - 6,961 (m, 1H), 5,935 (s, 1H), 4,683 - 4,579 (m, 2H), 3,887 (s, 3H), 3,442 (s, 3H), 2,753 (s, 3H), 2,194 (s, 3H), 1,695 - 1,678 (d, 3H), 0,781 - 0,768 (d, 3H).
[00119] Composto 302, N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-1-((2R ou 2S, 3R ou 3S)-3-metoxibutan-2-il)-2- metil-1H-pirrolo[2,3-b]piridina-3-carboxamida (Par de Isômeros Secundário; Pico 2): 1H RMN (400 MHz, CDCl3): δ 8,177 - 8,166 (d, 1H), 8,122 - 8,104 (d, 1H), 7,587 - 7,562 (m, 1H), 6,984 - 6,952 (m, 1H), 5,933 (s, 1H), 4,698 - 4,591 (m, 2H), 4,426 (s, 2H), 3,983 (s, 3H), 3,448 (s, 3H), 2,764 (s, 3H), 2,180 (s, 3H), 1,701 - 1,684 (d, 3H), 0,786 - 0,772 (d, 3H). Exemplo 14. Síntese de (±)-N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin- 3-il)metil)-2-metil-1 -(1-feniletil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-3- carboxamidaEtapa 1: 1-(3-metoxifenil)etanol:
Figure img0083
[00120] A uma solução agitada de 3-Amino-4-picolina (7 g, 64,8 mmol) em THF anidro (200 ml), sec-BuLi (150 ml, 1,3M em cicloexano, 194 mmol) foi adicionado por gotejamento durante 20 minutos a -78 C. A solução foi aquecida para a temperatura ambiente e agitada em 3 horas. Acetato de etila (2,3 g, 25,9 mmol) foi adicionado por gotejamento na reação a -78 C e a mistura foi agitada na mesma temperatura durante 2 horas. Metanol (50 ml) foi adicionado por gotejamento na reação durante 10 minutos. A mistura foi aquecida para a temperatura ambiente e agitada durante 1 hora. Um NH4Cl meio saturado (250 ml) foi adicionado. A mistura foi extraída com EA. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas e concentradas para proporcionar o produto bruto. O produto bruto foi purificado bi cromatografia em sílica-gel (éter de petróleo / acetato de etila = 10:1) para proporcionar 2-metil-1H-pirrolo[2,3-c]piridina (2,5 g, 73,5 %).Etapa 2: 2,2,2-tricloro-1-(2-metil-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-3-il)etanona:
Figure img0084
[00121] A uma solução agitada de 2-metil-1H-pirrolo[2,3-c]piridina (2,5 g, 18,9 mmol) e cloreto de alumínio (5 g, 37,8 mmol) em DCM (100 ml), cloreto de tricloroacetila (4,1 g, 22,7 mmol) foi adicionado por gotejamento em uma reação durante 0,5 hora na temperatura ambiente. Após agitação de 2 horas, a reação foi esfriada para 0 C e foi extinta com água (100 ml). O precipitado resultante foi isolado por filtração para proporcionar 2,2,2-tricloro-1-(2-metil-1H-pirrolo[2,3-c]piridin-3-il)etanona que foi utilizada para a próxima etapa sem mais purificação. Assume-se 100 % de rendimento. (5,24 g).Etapa 3: 2-metil-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-3-carboxilato de metila:
Figure img0085
[00122] Uma mistura de 2,2,2-tricloro-1-(2-metil-1H-pirrolo[2,3- c]piridin-3-il)etanona (5,24 g, 18,9 mmol) e KOH (1,2 g, 20,9 mmol) em MeOH (100 ml) foi agitada na temperatura ambiente durante 16 horas. A mistura de reação foi concentrada para remover MeOH, o resíduo foi dividido entre EA e Água. A camada orgânica foi lavada com salmoura, secada e concentrada para proporcionar 2-metil-1H-pirrolo[2,3- c]piridina-3-carboxilato de metila (3 g, 83 %).Etapa 4: 2-metil-1-(1-feniletil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-3-carboxilato de metila:
Figure img0086
[00123]carboxilato de metila (550 mg, 2,89 mmol) e hidreto de sódio (200 mg, 4,34 mmol) em N,N-dimetilformamida (3,0 ml) foi agitada na temperatura ambiente durante 0,5 hora, e depois (1-bromoetil)benzeno (589 mg, 3,18 mmol) foi adicionado. A mistura foi agitada na temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura de reação foi despejada em NH4Cl saturado e extraída com acetato de etila. As camadas orgânicas foram combinadas e concentradas para fornecer um resíduo. O resíduo foi purificado por cromatografia (éter de petróleo / acetato de etila = 5:1) para fornecer 2-metil-1-(1-feniletil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-3-carboxilato de metila (800 mg, 94 %).Etapa 5: ácido 2-metil-1-(1-feniletil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-3-carboxílico:
Figure img0087
[00124] A uma mistura de 2-metil-1-(1-feniletil)-1H-pirrolo[2,3- c]piridina-3-carboxilato de metila (800 mg, 2,72 mmol) e KOH (1,5 g, 27,2 mmol) em (15 ml) e água (5 ml) foi submetida a refluxo durante 2 horas. A mistura foi ajustada para pH 2 através de HCl a 10 % e extraída com EA. As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas e concentradas para proporcionar o produto bruto. O produto bruto foi utilizado na próxima etapa sem mais purificação. 100 % de rendimento. (760 mg).Etapa 6: (±)-N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1-(1-feniletil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-3-carboxamida (Composto 203):
Figure img0088
[00125] Uma mistura de ácido 2-metil-1-(1-feniletil)-1H-pirrolo[2,3- c]piridina-3-carboxílico (280 mg, 1,0 mmol) foram adicionados HATU (456 mg, 1,2 mmol), TEA (1 g, 10 mmol) e 3-(aminometil)-4,6- dimetilpiridin-2(1H)-ona (182 mg, 1,2 mmol) em diclorometano anidro (30 ml), foi agitada na temperatura ambiente durante 16 horas. À mistura de reação foi adicionada água (10 ml), extraída com diclorometano (30 ml x 2). As camadas orgânicas foram combinadas e concentradas para fornecer um resíduo. O resíduo foi recristalizado a partir de MeCN para proporcionar o composto N-((4,6-dimetil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1-(1-feniletil)-1H-pirrolo[2,3-c]piridina-3-carboxamida como um sólido esbranquiçado (80 mg, 21,6%). LRMS (M + H+) m/z: calc 414,21; observado 414. 1H RMN (400 MHz, Metanol-d4) δ: 8,84 (s, 1H), 8,16 (d, J = 7,6 Hz, 1H), 8,03 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 7,44-7,37 (m, 5H), 6,09 (s, 1H), 6,01-5,99 (m, 1H), 4,49 (s, 2H), 2,73 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), 2,06 (d, J = 7,2 Hz, 3H).
[00126] Os compostos mostrados na seguinte tabela foram preparados de acordo com o procedimento geral delineado neste exemplo utilizando os materiais de partida apropriados e modificações. As estruturas são mostradas na Figura 1.
Figure img0089
Exemplo 15. Procedimentos Gerais para a Sintetizzação de OutrosCompostos da InvençãoProcedimento Geral A: Alquilação de Indol
Figure img0090
[00127] A uma solução esfriada (0 oC) de éster de NH indol (1 equivalente) em N,N-dimetilformamida (volume para constituir a concentração de 0,4M) foi adicionado hidreto de sódio (60 % p/p, 1,1 equivalente em relação ao indol). A mistura resultante foi agitada durante 15 minutos. Depois RX (2 equivalentes) foi adicionado e a reação foi deixada aquecer para a temperatura ambiente. A reação foi mantida em temperatura ambiente durante 12 horas. A mistura de reação foi despejada em solução de cloreto de amônio saturada (100 ml) com agitação. A mistura foi extraída com acetato de etila (200 ml x 2) e a fase orgânica combinada foi lavada com salmoura, secada por sulfato de magnésio, filtrada e concentrada para fornecer o produto bruto que foi purificado por cromatografia de coluna (sílica gel, éter de petróleo/acetato de etila = 20:1) para proporcionar o produto de éster de indol alquilado desejado.Procedimento Geral B: Saponificação de éster de indol alquilado
Figure img0091
[00128] A uma solução de éster de indol alquilado (1 equivalente) em tetra-hidrofurano:metanol:água (2,5:5:1, volume para constituir a concentração de 0,05 M) foi adicionado hidróxido de lítio (4 equivalentes). A mistura de reação resultante foi agitada a 60 oC durante 48 horas. A mistura foi concentrada in vacuo. Depois o resíduo foi diluído com água (40 ml) e lentamente acidificado com cloreto de hidrogênio 1 N para pH = 4 a 5. A mistura foi extraída com acetato de etila (100 ml x 3). As camadas orgânicas combinadas foram lavadas com salmoura, secadas por sulfato de magnésio, filtradas e concentradas para fornecer o ácido de indol bruto, que foi utilizado na etapa subsequente sem purificação adicional.Procedimento Geral C: Formação de ligação de amida
Figure img0092
[00129] A uma solução de ácido de indol (1 equivalente) em diclorometano (volume para constituir a concentração de 0,05 M) foram adicionados 1-hidroxibenzotriazol (1,5 equivalente), cloridrato de 1-(3- dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida (1,5 equiv.) e trietilamina (3 equiv.). A mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente durante 30 minutos. Depois piridona amina (1,2 equiv.) foi adicionada e a mistura resultante foi agitada na temperatura ambiente durante 16 horas. Água (50 ml) foi adicionada à mistura. A mistura foi extraída com diclorometano (100 ml x 2). A camada orgânica foi concentrada in vacuo para fornecer o produto bruto que foi purificado por cromatografia de coluna (sílica gel, diclorometano / metanol = 20:1) para proporcionar o composto alvo.Procedimento Geral D: Cromatografia quiral
[00130] A separação dos compostos de quiral foi executada por meio de HPLC ou SFC de fase normal (cromatografia de fluido de dióxido de carbono supercrítica). Os compostos separados foram tipicamente > 95 % ee. A configuração absoluta dos centros quirais não foi determinada. Procedimento Geral L: Sulfonilação
Figure img0093
[00131] A uma solução de amina quiral (1 equiv.) em diclorometano (volume para constituir a concentração de 0,1 M) foi adicionada trietilamina (4 equiv.) a 18 oC sob N2. A reação foi esfriada para 0 oC e cloreto de metanossulfonila (1,5 equiv.) foi adicionado. A reação foi agitada a 0 oC durante 1 h. Depois a mistura foi concentrada in vacuo e metanol e carbonato de potássio foram adicionados e a reação foi agitada durante mais 1 h. A mistura foi filtrada e o produto bruto foi purificado por HPLC preparativa.
[00132] A tabela abaixo lista os compostos da invenção e os métodos gerais acima que foram utilizados na sua síntese. As estruturas destes compostos são apresentadas na Figura 1.
Figure img0094
Exemplo 16. Medições de IC50 para os Inibidores utilizando EZH2.
[00133] Ensaio de EZH2: Os ensaios foram realizados através da mistura de rPRC2 juntamente com os substratos de oligonucleossoma biotinilados na presença do cofator de enzima radiomarcada, S- adenosil-L-metionina (3H SAM) (Perkin Elmer) e o monitoramento da transferência enzimaticamente mediada de grupos metila triciada de 3H SAM para os resíduos de histona lisina. A quantidade de produto de metila histona triciada resultante foi medida pela primeira captura dos oligonucleossomas biotinilados em estreptavidina (SAV) revestida FlashPlates (Perkin Elmer), seguido por uma etapa de lavagem para remover a 3H SAM não reagida, e depois a contagem em um contador de cintilação de placa de 384 reservatórios TopCount NXT (Perkin Elmer). As condições de ensaio finais para a EZH2 foram como se segue: Tampão 50 mM Tris pH 8,5, 1 mM DTT, detergente 69 μM Brij- 35, 5,0 mM MgCl2, 0,1 mg/mL BSA, 0,2 μM 3H SAM, 0,2 μMoligonucleossomas biotiniladas, peptídeo 3,6 μM H3K27me3 e 2 nM EZH2.
[00134] As medições de IC50 do composto foram obtidas como se segue: Os compostos foram em primeiro lugar dissolvidos em 100 % DMSO como soluções de estoque 10 mM. As curvas de resposta de dose de dez pontos foram geradas mediante a distribuição de quantidades variáveis da solução de composto a 10 mM em 10 reservatórios da placa de 384 reservatórios (Echo; Labcyte), DMSO puro foi então utilizado para aterrar os reservatórios para garantir que todos os reservatórios tiveram a mesma quantidade de DMSO. Um volume de 12,5 μl da enzima HMT, peptídeo H3K27me3 e substrato de oligonucleossoma em tampão de ensaio foi adicionado a cada reservatório da placa de ensaio utilizando uma Multidrop Combi (ThermoFisher). Os compostos foram pré-incubados com a enzima durante 20 min, seguidos pelo início da reação de metiltransferase através da adição de 12,5 μl de 3H SAM em tampão de ensaio (volume final = 25 μl). As concentrações finais dos compostos variaram de uma concentração padrão superior 80 μM até 0,16 μM em dez etapas de diluição de 2 vezes. As reações foram realizadas durante 60 minutos e extintas com 20 μl por reservatório de SAH 1,96 mM, Tris 50 mM pH 8,5, EDTA 200 mM. As reações interrompidas foram transferidas para Flashplates revestidas com SAV (Perkin Elmer), incubadas durante 120 minutos, lavadas com uma lavadora de placas, e depois lidas no TopCount NXT (1,0 min/reservatório) para medir a quantidade de produto de metila histona formada durante a reação. A quantidade de produto de metila histona foi comparada com a quantidade de produto formada nos reservatórios de controle de inibição de 0 % e 100 % que permitem o cálculo da inibição % na presença dos compostos individuais em várias concentrações. As IC50 foram calculadas utilizando um pacote de software de ajuste de curva não linear adaptado de 4 parâmetros (XLFIT, parte do pacote de banco de dados, ActivityBase (IDBS)), onde os quatro parâmetros foram IC50. A inclinação de subida, a linha de base de pré-transição (0 % INH), e valor de referência de pós- transição (100 % INH); com os dois últimos parâmetros sendo fixados em zero e 100 %, respectivamente, por padrão.
[00135] O Ensaio para Y641N EZH2 foi executado como acima utilizando oligonucleossomas H3K27Me2 reconstituídos como substrato.
[00136] A Tabela 2 mostra a atividade de compostos selecionados da presente invenção no ensaio de inibição da atividade de EZH2 e Y641N EZH2. Os valores de IC50 são relatados como se segue: "A" indica um valor de IC50 de menos do que 100 nM; "B" indica um valor de IC50 de 100 nM a 1 μM; "C" indica um valor de IC50 maior do que 1 μM e menor do que 10 μM para cada enzima; "D" indica um valor de IC50 de mais do que 10 μM para cada enzima; e “*(X μM)” indica que nenhuma inibição foi observada na concentração mais elevada (isto é, X pM) de composto testado.Tabela 2. Valores de IC50 para os compostos de Fórmula I contra as enzimas mutantes EZH2 e Y641N EZH2.
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Exemplo 17. Medições de EC50 para os inibidores nos ensaios de células HeLa.
[00137] Ensaio de H3K27me3 MSD Hela. As células HeLa tratadas com tripsina foram contadas e diluídas em DMEM a 10 % (Life Technologies, Cat. # 10569) para 5000 células/75 μl. Setenta e cinco μl de células foram colocadas em cada reservatório de uma placa de fundo plano de 96 reservatórios e incubadas a 37 °C durante 4 horas. Vinte e cinco μl de composto de teste (em várias concentrações) foram adicionados às células e a incubação continuou a 37 °C durante 96 horas. O meio foi então removido e as células enxaguadas uma vez com PBS gelado. Quarenta μl de tampão MSD gelado AT (HEPES 10 mM, pH 7,9, MgCl2 5 mM, sacarose 0,25 M, Benzonase (1:10000), Triton X100 1 % suplementado com coquetel novo de inibidor da protease 1x e 1 mM de cloridrato fluoreto de 4-(2-aminoetil)benzenossulfonila (AEBSF)) foram adicionados a cada reservatório e as placas colocadas em gelo durante 30 minutos. Dez μl de NaCl 5 M foram então adicionados a cada reservatório e a incubação em gelo continuou durante mais 15 minutos. O material em cada reservatórios foi colocado em suspensão com pipeta para cima e para baixo e depois transferido para uma nova placa de 96 reservatórios. Os reservatórios vazios foram enxaguados com 150 μl de Tris 20 mM gelado, pH 7,5, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM, suplementado com coquetel fresco de inibidor da protease 1x e AEBSF 1 mM ("NO sal NO tampão detergente) e transferidos para os respectivos reservatórios na nova placa. Trezentos μl de tampão NO sal NO detergente foram então adicionados a cada reservatório de lisados e as placas congeladas a -80 °C.
[00138] No mesmo dia, um número apropriado de placas de 96 reservatórios de ligação padrão a MSD foi revestido com 30 μl/ reservatório de anticorpo de captura H3 total (Millipore, Cat # MAB3422) na concentração de 1 μg/ml em PBS. A solução de anticorpo foi distribuída uniformemente em primeiro lugar batendo suavemente nos lados das placas e depois através de agitação das placas durante alguns minutos a 1000 rpm. As placas revestidas com anticorpo foram armazenadas a 4 °C durante a noite.
[00139] No dia seguinte os lisados são descongelados na temperatura ambiente. As placas de MSD revestidas com anticorpos são lavadas 3X com TBS-T (solução salina tamponada com Tris (Fisher Scientific, Cat # BP2471-1) + Tween-20 0,2 %). Cento e cinquenta μl de Blocker A 5 % em TBS-T são adicionados a cada reservatório. Os reservatórios são cobertos e agitados em um agitador na RT durante uma hora. A etapa de Blocker A é repetida uma segunda vez. Após a remoção dos bloqueadores, 25 μl de lisado de células são transferidos para dentro de cada reservatório revestido com anticorpo. As placas são agitadas durante 2 horas na RT, o lisado removido e as placas novamente lavadas com Blocker A em TBS-T. Vinte e cinco μl de mistura de anticorpo recentemente preparada apropriada (incluindo anticorpos tanto primários quanto secundários) são adicionados a cada reservatório e as placas agitadas durante uma hora na RT. A mistura de anticorpos utilizada foi uma (ou ambas) daquelas indicadas na tabela abaixo:
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[00140] Ambos os anticorpos H3 foram obtidos a partir da Sinalização Celular (Cat #s 4499 e 9733). O anticorpo anticoelho de cabra foi obtido da Meso-Scale Discovery (Cat #R32AB-1).
[00141] A mistura de anticorpo foi então removida e os reservatórios lavados com Blocker A. Cento e cinquenta μl de Tampão de Leitura MSD 1X recentemente preparado (Meso-Scale Discovery; Cat # R927C-2) foram então adicionados a cada reservatório e as placas lidas em uma leitora de placas em uma MSD Sector 2400 Plate Reader.
[00142] Os dados foram analisados utilizando o modelo Assay Assistant (Constellation Pharmaceuticals In-house product) e Activity Base (IDBS Ltd, Surrey, UK). Os arquivos de dados foram importados da Assay Assistant e as condições de ensaio foram especificadas. Uma única ID de Análise foi criada e os arquivos de dados exportados para Activity Base. Um modelo de análise foi criado em Activity Base para medir a inibição dependente da dose da marca H3K27me3 e viabilidade celular, respectivamente. A leitura dos reservatórios de DMSO foi utilizada para normalizar os dados. As curvas resultantes foram adaptadas utilizando o software Activity Base Model 205 (IDBS Ltd, Surrey, UK). Os dados foram verificados quanto a qualidade, validados e integrados em formato excel utilizando SARview (IDBS Ltd, Surrey, UK).
[00143] Ensaio H3K27me3 Alpha Hela (AlphaLISA). Dez diferentes doses de cada composto de teste (em uma série de diluições de 3 vezes) foram laminadas em placas tratadas de cultura de tecido de 384 reservatórios duplicadas (Catalog # 781080; Greiner Bio One; Monroe, North Carolina). As células HeLa cultivadas na cultura foram tratadas com tripsina e contadas utilizando um contador de células Countess® (Catalog # C10281; Life Technologies, Grand Island, NY). As células foram diluídas em 67.000 células por ml em DMEM a 10 % (Catalog # 10569-010 Life Technologies, Grand Island, NY) e 15 μl (1000 células) foram laminadas em cada reservatório utilizando o Biotek MicroFloTM Select Dispenser (BioTek Instruments, Inc. Vermont, USA), da placa de 384 reservatórios. As placas foram incubadas a 37 0C/5 % de CO2 durante 72 horas. Uma das placas duplicadas foi processada pelo ensaio de HeLa e a outra com relação à viabilidade.
[00144] À placa processada por AlphaLISA foram adicionados 5 μl por reservatório de tampão Cell-Histone Lysis (1X) (Catalog # AL009F1 Perkin Elmer; Waltham, MA) e a placa foi incubada na RT durante 30 minutos em um agitador de placa com velocidade baixa (Model# 4625- Q Thermo Scientific; Waltham, MA). Depois, 10 μl por reservatório de tampão Histone Extraction (catalog # AL009F2; Perkin Elmer; Waltham, MA) foram adicionados e a placa ainda incubada na RT durante 20 min em um agitador de placas com baixa velocidade. A cada reservatório foram então adicionados 10 μl por reservatório de uma mistura 5X de glóbulos aceitantes anti-K27me3 acrescidos de anticorpo anti-Histona tratado com Biotina H3 (C-ter) (diluído em 3 nM final) (Catalog #AL118 Perkin Elmer; Waltham, MA). A diluição dos glóbulos aceitantes e depois anti-Histona H3 foi com tampão 1X Histone Detection (Catalog # AL009F3 Perkin Elmer; Waltham, MA) que foi produzido diluído a partir do estoque em 10X fornecido. A placa foi lacrada com um lacre selador de placa de alumínio e incubada a 23 0C durante 60 min. Em seguida foram adicionados 10 μl de solução 5X de glóbulos Streptavidin Donor (Catalog #6760002 Perkin Elmer; Waltham, MA) (20 μg/mL final com 1X Histone Detection Buffer), a placa lacrada com selador de placas de alumínio e incubada a 23 0C durante 30 min. As placas foram então lidas utilizando uma EnVision- Alpha Reader (model # 2104 Perkin Elmer; Waltham, MA).
[00145] A viabilidade celular foi experimentada através da adição de 15 μl de Cell Titer Glo ((Catalog #G7571 Promega Madison, WI) a cada reservatório com células com meios. As placas foram incubadas na RT durante 15 a 20 minutos em um agitador de placas em baixa velocidade. As placas foram então lidas utilizando uma EnVision- Alpha Reader (model # 2104 Perkin Elmer; Waltham, MA).
[00146] Os dados de ambos os ensaios foram analisados utilizando o padrão do Assay Assistant (Constellation Pharmaceuticals In-house product) and Activity Base (IDBS Ltd, Surrey, UK). Os arquivos de dados foram importados do Assay Assistant e as condições de ensaio foram especificadas. A Analysis ID exclusiva foi criada e os arquivos de dados exportados da Activity Base. Um modelo de análise foi criado em Activity Base para medir a inibição dependente da dose da marca H3K27me3 e a viabilidade celular, respectivamente. A leitura completa dos reservatórios de DMSO foi utilizada para normalizar os dados. As curvas resultantes foram adaptadas utilizando o software Activity Base Model 205 (IDBS Ltd, Surrey, UK). Os dados foram verificados quanto à qualidade, validados e integrados no formato excel utilizando SARview (IDBS Ltd, Surrey, UK).
[00147] A Tabela 3 mostra a atividade dos compostos selecionados desta invenção nos dois ensaios de células HeLa diferentes descritos acima. Os valores de EC50 são relatados como se segue: "A" indica um valor de EC50 de menos do que 400 nM; "B" indica um valor de EC50 de 400 nM a 2 μM; "C" indica um valor de EC50 maior do que 2 μM e menos do que 10 μM para cada enzima; "D" indica um valor de EC50 maior do que 10 μM para cada enzima; e “*(X μM)” indica que nenhuma inibição foi observada na concentração mais elevada (isto é, X μM) do composto testado.Tabela 3. Valores de EC50 para os Compostos Selecionados da Invenção nas Células HeLa que expressam o mutante H3k27 EZH2.
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Exemplo 18. Análise de Inibição do Crescimento Tumoral
[00148] A eficácia antitumoral do Composto 362 e 365 no modelo de xenoenxerto de linfoma humano Karpas422 subcutânea em camundongos CB-17 SCID fêmeas foi como se segue.AnimaisEspécie: Mus musculusCepa: CB-17 SCIDIdade: 6 a 8 semanasSexo: femininoPeso corporal: 18 a 22 gNúmero de animais: 50 camundongos mais reservasFornecedor de animais: Shanghai SLAC Laboratory Animal Co., LTD.Cultura de Células
[00149] As células tumorais Karpas422 foram mantidas in vitro como cultura em suspensão em meio RPMI1640 suplementado com soro de bezerro fetal inativo pelo calor a 37 °C em uma atmosfera de 5 % de CO2 com ar. As células tumorais foram rotineiramente subcultivadas duas vezes por semana. As células que se desenvolvem em uma fase de crescimento exponencial foram colhidas e contadas para inoculação do tumor.
Inoculação do tumor
[00150] Cada camundongo foi inoculado por via subcutânea no flanco direito com as células tumorais Karpas422 (5 x 106) em 0,2 ml de PBS com Matrigel (1:1) para o desenvolvimento do tumor. 23 dias após a inoculação do tumor foi como o dia 0 após o início do tratamento, quando o tamanho médio do tumor atingiu aproximadamente 300 mm3. Cada grupo consistia de 10 camundongos portadores de tumor.
Medições Tumorais
[00151] O tamanho do tumor foi medido três vezes por semana em duas dimensões utilizando um compasso de calibre, e o volume foi expresso em mm3 utilizando a fórmula: V = 0,536 a x b2, onde a e b são os diâmetros longos e curtos do tumor, respectivamente. O tamanho do tumor foi então utilizado para os cálculos de valores T/C. O valor T/C (em porcentagem) é uma indicação da eficácia antitumoral; T e C são os volumes médios dos grupos tratados e de controle, respectivamente, em um determinado dia.
[00152] O TGI foi calculado para cada grupo utilizando a fórmula: TGI (%) = [1-(Ti-T0)/ (Vi-V0)] x100; Ti é o volume médio do tumor de um grupo de tratamento em um determinado dia, T0 é o volume médio do tumor do grupo de tratamento no dia do início do tratamento, Vi é o volume médio do tumor do grupo de controle de veículo no mesmo dia com Ti, e V0 é o volume médio do tumor do grupo de veículo no dia do início do tratamento.Estágio Final Experimental e Coleta de Amostras1) Plasma, tumor e muscular no grupo ZPE-6438 foram coletados no dia 16 após o início do tratamento em 6 h após a dosagem. Plasma, tumor e músculo no veículo, os grupos CPI-524369, CPI- 524416 e CPI591780 foram coletados no dia 25 após o início do tratamento em 1 h após a dosagem. 2) Todo o sangue foi tirado de cada animal com EDTA-K2 como anticoagulante. O plasma foi dividido em duas partes. A primeira parte foi para a análise PK; a segunda parte foi congelada para cópia de segurança. 3) O tumor foi dividido em três partes. A primeira parte foi congelada instantaneamente para PK; a segunda parte foi congelada instantaneamente para análise PD; a terceira parte foi congelada para cópia de segurança. 4) O músculo foi dividido em duas partes. A primeira parte foi congelada instantaneamente para PK; a segunda parte foi congelada para cópia de segurança.Análise Inibição do Crescimento do TumorTabela 4. Cálculo de inibição do crescimento do tumor para os Compostos 362 e 365 no modelo de xenoenxerto Karpass422 calculado com base nas medições do volume de tumor no dia 25 ou no dia 16 após o início do tratamento
Figure img0103
Nota: a. Média ± SEM. b. Inibição do Crescimento de Tumor é calculada pela divisão do volume médio de tumor do grupo com relação ao grupo tratado pelo volume médio de tumor do grupo com relação ao grupo de controle (T/C). Para um artigo de teste a ser considerado de ter atividade antitumoral, o T/C deve ser de 0,5 ou menos. d. Diferença estatisticamente significativa (ANOVA unidirecional), vs veículo: ***p < 0,001.

Claims (12)

1. Composto tendo a Fórmula (II) estrutural:
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ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, caracterizadopelo fato de que:A é CH ou N;R1a é selecionado de alquila C1-C2 e -O-(alquila C1-C2), em que R1aé opcionalmente substituído com um ou mais de flúor;R4a é selecionado de1-halo (C1-C3) alquil-piperidin-4-ila, cicloalquila C3-C6 opcionalmente substituída com um ou mais de flúor, e tetra-hidropiranila; eR13 é selecionado de hidrogênio, halo, fenila, piridinila e -O- (alquila C1-C4).
2. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que R1a é selecionado de -OCH3, -CH3, -OCHF2 e -CH2CH3.
3. Composto, de acordo com a reivindicação 1ou 2, caracterizado pelo fato de que R4a é selecionado de 4,4- difluorocicloexila, ciclopropila, tetra-hidropiran-4-ila, 1-(2-fluoroetil)- piperidin-4-ila, 1-(2,2-difluoroetil)-piperidin-4-ila e 1-(2,2,2-trifluoroetil)- piperidin-4-ila.
4. Composto, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que R13 é selecionado de hidrogênio, cloro, flúor, -OCH(CH3)2, fenila e piridin-2-ila.
5. Composto, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di- hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1-(1-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4- il)etil)-1H-indol-3-carboxamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
6. Composto, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o composto é R-N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di- hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1-(1-(1-(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4- il)etil)-1H-indol-3-carboxamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
7. Composto de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto é 1-(1-(1-(2,2-difluoroetil)piperidin-4-il)etil)- N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil-1H- indol-3-carboxamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
8. Composto, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o composto é R-1-(1-(1-(2,2-difluoroetil)piperidin-4- il)etil)-N-((4-metóxi-6-metil-2-oxo-1,2-di-hidropiridin-3-il)metil)-2-metil- 1H-indol-3-carboxamida, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste.
9. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste; e um veículo farmaceuticamente aceitável.
10. Uso de um composto, como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, ou um sal farmaceuticamente aceitável deste, caracterizado pelo fato de ser para a preparação de um medicamento para o tratamento de uma doença ou distúrbio associado com a proliferação celular.
11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a doença é câncer.
12. Uso, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o câncer é selecionado de câncer de mama, câncer de próstata, câncer de cólon, carcinoma de células renais, glioblastoma multiforme, câncer de bexiga, melanoma, câncer de brônquios, linfoma e câncer de fígado.
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