TWI629273B - 甲基修飾酵素之調節劑、其組成物及用途 - Google Patents

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Abstract

本文提供用於調節甲基修飾酵素之藥劑、其組成物及用途。

Description

甲基修飾酵素之調節劑、其組成物及用途 【相關申請案之交叉參考】
本申請案主張2013年2月11日申請之國際申請案第PCT/US2013/025639號的優先權。國際申請案第PCT/US2013/025639號主張2012年2月10日申請之美國臨時申請案第61/597,695號及2012年7月03日申請之美國臨時申請案第61/667,821號的優先權。前述申請案之全部內容均以引用之方式併入本文中。
本發明係關於調節甲基修飾酵素之藥劑、其組成物及用途。
真核染色質由稱為核小體之巨分子複合體構成。核小體具有圍繞一個蛋白質八聚體纏繞的147個DNA鹼基對，該蛋白質八聚體具有組蛋白H2A、H2B、H3及H4中之每一者的兩個次單元。組蛋白經受轉譯後修飾，該等修飾隨後影響染色質結構及基因表現。在組蛋白上發現的一類轉譯後修飾為離胺酸及精胺酸殘基之甲基化。組蛋白甲基化在調控真核生物中之基因表現中起關鍵作用。甲基化影響染色質結構且已與轉錄之活化及抑制兩者相關聯(Zhang及Reinberg,Genes Dev.15：2343-2360,2001)。催化甲基與組蛋白之附接及移除的酵素牽涉在基因沉默、胚胎發育、細胞增殖及其他過程中。
本發明涵蓋以下認知：甲基修飾酵素鑒於其在調控不同生物過程中之作用而成為具有吸引力的用於調節之目標。目前已發現本發明之化合物及其醫藥學上可接受之組成物有效用作刺激組蛋白甲基修飾酵素(包括組蛋白甲基化酶及組蛋白去甲基酶)之活性的藥劑。該等化合物具有通式Ⅱ： 或其醫藥學上可接受之鹽，其中各變數如本文所定義。
本發明之化合物及其醫藥學上可接受之組成物適用於治療與甲基修飾酵素相關之多種疾病、病症或病狀。該等疾病、病症或病狀包括本文所描述之彼等疾病、病症或病狀。
本發明所提供之化合物亦適用於生物及病理性現象中甲基修飾酵素的研究；由甲基修飾酵素介導之細胞內信號轉導路徑的研究及新甲基修飾酵素調節劑的比較評估。
圖1。例示性式Ⅱ化合物。
1.本發明之化合物的一般描述
在某些具體實例中，本發明提供一種式Ⅱ化合物， 或其醫藥學上可接受之鹽，其中：A為CH或N；R1a係選自-C1-C2烷基及-O-(C1-C2烷基)，其中R1a視情況經一或多個氟取代；R4a係選自-(C1-C4伸烷基)-O-(C1-C3烷基)、1-取代-哌啶-4-基、視情況經一或多個氟取代之C3-C6環烷基、及四氫哌喃基；且R13係選自氫、鹵基、苯基、吡啶基及-O-(C1-C4烷基)。
2.化合物及定義
下文更詳細地描述特定官能基及化學術語之定義。出於本發明之目的，根據化學及物理學手冊(Handbook of Chemistry and Physics),第75版裏封，元素週期表(CAS版本)來鑑別化學元素，且特定官能基一般如其中所描述來定義。另外，有機化學之一般原理以及特定官能性部分及反應性描述於Organic Chemistry,Thomas Sorrell,University Science Books出版社,Sausalito,1999；Smith及March March's Advanced Organic Chemistry,第5版,John Wiley & Sons公司,New York,2001；Larock,Comprehensive Organic Transformations,VCH Publishers公司,New York,1989；Carruthers,Some Modern Methods of Organic Synthesis,第3版,Cambridge University Press出版社, Cambridge,1987中；其中之每一者的全部內容均以引用之方式併入本文中。
除非另外陳述，否則本文所描繪之結構亦意欲包括該結構之所有異構(例如對映異構、非對映異構及幾何異構(或構形異構))形式；舉例而言，對各不對稱中心之R及S組態、Z及E雙鍵異構體、及Z及E構形異構體。因此，本發明化合物之單一立體化學異構體以及對映異構、非對映異構及幾何異構(或構形異構)混合物處於本發明之範疇內。除非另外陳述，否則本發明之化合物的所有互變異構形式均處於本發明之範疇內。另外，除非另外陳述，否則本文所描繪之結構亦意欲包括僅在存在一或多個經同位素增濃之原子的方面不同之化合物。舉例而言，包括氫由氘或氚替換或碳由13C或14C增濃之碳替換的具有本發明之結構的化合物處於本發明之範疇內。該等化合物適用作例如分析工具，用作生物分析中之探針，或用作本發明之治療劑。
在其中特定對映異構體較佳的情況下，在一些具體實例中，可提供實質上不含相應對映異構體之特定對映異構體，且亦可稱為「光學增濃」。如本文所用之「光學增濃」意謂化合物由比例明顯更大之一個對映異構體製成。在某些具體實例中，化合物由至少約90重量%之較佳對映異構體製成。在其他具體實例中，化合物由至少約95重量%、98重量%或99重量%之較佳對映異構體製成。較佳對映異構體可藉由熟習此項技術者已知之任何方法(包括手性高壓液相層析(HPLC)及手性鹽之形成及結晶)而自外消旋混合物分離，或藉由不對稱合成來製備。參見例如Jacques等人,Enantiomers,Racemates and Resolutions(Wiley Interscience,New York,1981)；Wilen等人,Tetrahedron 33：2725(1977)；Eliel,E.L.Stereochemistry of Carbon Compounds (McGraw-Hill,NY,1962)；Wilen,S.H.Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions第268頁(E.L.Eliel編,Univ.of Notre Dame Press出版社,Notre Dame,IN 1972)。
化學結構中手性中心處之波浪鍵()用於表示本發明之化合物為光學純的，但其旋光度未經測定。手性中心處之直線鍵指示外消旋混合物，儘管如以上所陳述，本發明亦包括該外消旋體之所有可能異構形式。
如本文所用之術語「鹵基」及「鹵素」係指選自氟(fluorine/fluoro/-F)、氯(chlorine/chloro/-Cl)、溴(bromine/bromo/-Br)及碘(iodine/iodo/-I)之原子。
術語「伸烷基」係指二價烷基。「伸烷基鏈」為聚亞甲基，亦即-(CH2)n-，其中n為正整數，較佳1至6、1至4、1至3、1至2、或2至3。經取代之伸烷基鏈為其中一或多個亞甲基氫原子由取代基替換之聚亞甲基。適合之取代基包括下文為經取代之脂族基團所描述之彼等取代基。
如本文所用之術語「烷基」係指藉由移除單個氫原子而衍生自含有一與六個之間碳原子之脂族部分的單價飽和直鏈或分支鏈烴基。在一些具體實例中，烷基含有1-5個碳原子。在另一個具體實例中，烷基含有1-4個碳原子。在其他具體實例中，烷基含有1-3個碳原子。在又另一個具體實例中，烷基含有1-2個碳。烷基之實例包括(但不限於)甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、第二丁基、第二戊基、異戊基、第三丁基、正戊基、新戊基、正己基、第二己基及其類似物。
如本文所描述，本發明之化合物可含有「視情況經取代之」部分。一般而言，術語「經取代之」不論是否在術語「視情況」之後均意謂指定部 分之一或多個氫由適合之取代基替換。除非另外指示，否則「視情況經取代之」基團在該基團之各可取代位置處均可能具有適合之取代基，且當任何既定結構中一個以上位置可經一個以上選自指定基團之取代基取代時，該取代基在各位置處可為相同或不同的。根據本發明所預想之取代基的組合較佳為促使形成穩定或化學可行之化合物的彼等組合。如本文所用之術語「穩定」係指化合物在經受允許其生產、偵測及(在某些具體實例中)其回收、純化及用於本文所揭示之一或多種目的的條件時不發生實質上改變。
在「視情況經取代之」基團的可取代之碳原子上的適合之單價取代基獨立地為鹵素；-(CH2)0-4Ro；-(CH2)0-4ORo；-O-(CH2)0-4C(O)ORo；-(CH2)0-4CH(ORo)2；-(CH2)0-4SRo；可經Ro取代之-(CH2)0-4Ph；可經Ro取代之-(CH2)0-4O(CH2)0-1Ph；可經Ro取代之-CH=CHPh；-NO2；-CN；-N3；-(CH2)0-4N(Ro)2；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)Ro；-N(Ro)C(S)Ro；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)NRo 2；-N(Ro)C(S)NRo 2；-(CH2)0-4N(Ro)C(O)ORo；-N(Ro)N(Ro)C(O)Ro；-N(Ro)N(Ro)C(O)NRo 2；-N(Ro)N(Ro)C(O)ORo；-(CH2)0-4C(O)Ro；-C(S)Ro；-(CH2)0-4C(O)ORo；-(CH2)0-4C(O)SRo；-(CH2)0-4C(O)OSiRo 3；-(CH2)0-4OC(O)Ro；-OC(O)(CH2)0-4SR-；-SC(S)SRo；-(CH2)0-4SC(O)Ro；-(CH2)0-4C(O)NRo 2；-C(S)NRo 2；-C(S)SRo；-SC(S)SRo；-(CH2)0-4OC(O)NRo 2；-C(O)N(ORo)Ro；-C(O)C(O)Ro；-C(O)CH2C(O)Ro；-C(NORo)Ro；-(CH2)0-4SSRo；-(CH2)0-4S(O)2Ro；-(CH2)0-4S(O)2ORo；-(CH2)0-4OS(O)2Ro；-S(O)2NRo 2；-(CH2)0-4S(O)Ro；-N(Ro)S(O)2NRo 2；-N(Ro)S(O)2Ro；-N(ORo)Ro；-C(NH)NRo 2；-P(O)2Ro；-P(O)Ro 2；-OP(O)Ro 2；-OP(O)(ORo)2；-SiRo 3；-(C1-4直鏈或分支鏈伸烷基)O-N(Ro)2；或-(C1-4直鏈或分支鏈伸烷基)C(O)O-N(Ro)2，其中各Ro可如下文所定義經取代且獨立地為氫、C1-6 脂族基團、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或具有0-4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子的5員-6員飽和環、部分不飽和環或芳基環；或不管以上定義，兩個獨立出現之Ro與其中間原子結合在一起形成可如下文所定義經取代的具有0-4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子的3員-12員飽和環、部分不飽和環或芳基單環或雙環。
在「視情況經取代之」基團之可取代氮上的適合之取代基包括-R†、-NR† 2、-C(O)R†、-C(O)OR†、-C(O)0(O)R†、-C(O)CH2C(O)R†、-S(O)2R†、-S(O)2NR† 2、-C(S)NR† 2、-C(NH)NR† 2或-N(R†)S(O)2R†；其中各R†獨立地為氫、可如下文所定義經取代之C1-6脂族基團、未經取代之-OPh、或未經取代的具有0-4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子的5員-6員飽和環、部分不飽和環或芳基環；或不管以上定義，兩個獨立出現的R†與其中間原子結合在一起形成未經取代的具有0-4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子的3員-12員飽和環、部分不飽和環或芳基單環或雙環。
脂族基團R†上的適合之取代基獨立地為鹵素、-R˙、-(鹵基R˙)、-OH、-OR˙、-O(鹵基R˙)、-CN、-C(O)OH、-C(O)OR˙、-NH2、-NHR˙、-NR˙ 2或-NO2，其中各R˙為未經取代的或在「鹵基」之後的情況下僅經一或多個鹵素取代，且獨立地為C1-4脂族、-CH2Ph、-O(CH2)0-1Ph或具有0-4個獨立地選自氮、氧或硫之雜原子的5員-6員飽和環、部分不飽和環或芳基環。
如本文所用，術語「抑制劑」定義為利用酵素以可量測之親和性與目標S-腺苷甲硫胺酸(SAM)結合及/或對其加以抑制的化合物。在某些具體實例中，抑制劑之IC50及/或結合常數小於約50μM，小於約1μM，小於約500nM，小於約100nM或小於約10nM。
如本文所用術語「可量測之親和性」及「可量測地抑制」意謂在包含所提供之化合物或其組成物及至少一種SAM依賴性酵素的樣品與在不存在該化合物或其組成物的情況下下包含至少一種SAM依賴性酵素的等效樣品之間，至少一種SAM利用酵素之活性中可量測的變化。
3.例示性化合物之描述
在式II之一些具體實例中，R1a係選自-OCH3、-CH3、-OCHF2及-CH2CH3。
在式II之一些具體實例中，R4a係選自-CH2OCH3、-CH(CH3)OCH3、4,4-二氟環己基、環丙基、四氫哌喃-4-基、1-(第三丁氧羰基)-哌啶-4-基、1-(異丁氧羰基)-哌啶-4-基、1-(異丙氧羰基)-哌啶-4-基、1-(2-氟乙基)-哌啶-4-基、1-(2,2-二氟乙基)-哌啶-4-基、1-(2,2,2-三氟乙基)-哌啶-4-基、1-(2-羥基異丁基)-哌啶-4-基、1-(羥基異丙基羰基)-哌啶-4-基、1-(乙氧基羰基甲基)哌啶-4-基、1-(異丙基羰基)-哌啶-4-基、1-甲基哌啶-4-基、1-(甲基磺醯基)-哌啶-4-基、1-(乙基磺醯基)-哌啶-4-基、1-(異丙基磺醯基)-哌啶-4-基、1-(苯基)-哌啶-4-基、1-(氧呾-3-基)哌啶-4-基、1-(吡啶-2-基)-哌啶-4-基及1-(嘧啶-2-基)-哌啶-4-基。
在式II之一些具體實例中，R13係選自氫、氯、氟、-OCH(CH3)2、苯基及吡啶-2-基。
例示性式II化合物闡述於圖1中。在一些情況下，圖1中具有一個(或多個)波浪鍵之化合物中的兩種(或超過兩種)將具有精確相同結構。因為波浪鍵表示未測定旋光度之手性中心，該等化合物應理解為彼此分離且截然不同之光學異構體。註釋圖1以指示所描繪之結構相同但立體化學不同的兩種或超過兩種化合物的彼等集合。
4.使用、調配及投藥
醫藥學上可接受之組成物
根據另一個具體實例，本發明提供一種組成物，其包含本發明之化合物或其醫藥學上可接受衍生物、及醫藥學上可接受之載劑、佐劑或媒劑。本發明之組成物中的化合物之量使得可以有效地在生物樣品中或在患者中可量測地調節組蛋白甲基修飾酵素或其突變體。在某些具體實例中，本發明之組成物中的化合物之量使得可以有效地在生物樣品中或在患者中可量測地調節組蛋白甲基修飾酵素或其突變體。
在某些具體實例中，調配本發明之組成物以用於向需要該組成物之患者投予。在一些具體實例中，調配本發明之組成物以用於向患者經口投予。
如本文所用之術語「患者」意謂動物，較佳為哺乳動物，且最佳為人類。
術語「醫藥學上可接受之載劑、佐劑或媒劑」係指不破壞與其一起調配之化合物的藥理學活性的無毒載劑、佐劑或媒劑。可在本發明之組成物中使用的醫藥學上可接受之載劑、佐劑或媒劑包括(但不限於)離子交換劑、氧化鋁、硬脂酸鋁、卵磷脂、血清蛋白(諸如人類血清白蛋白)、緩衝物質(諸如磷酸鹽)、甘胺酸、山梨酸、山梨酸鉀、飽和蔬菜脂肪酸之部分甘油酯混合物、水、鹽或電解質(諸如魚精蛋白硫酸鹽、磷酸氫二鈉、磷酸氫鉀、氯化鈉、鋅鹽)、膠態二氧化矽、三矽酸鎂、聚乙烯基吡咯啶酮、基於纖維素之物質、聚乙二醇、羧甲基纖維素鈉、聚丙烯酸酯、蠟、聚乙烯-聚氧丙烯-嵌段聚合物、聚乙二醇及羊毛脂。
「醫藥學上可接受之衍生物」意謂在向接受者投予時能夠直接或間接提供本發明之化合物或其抑制活性之代謝物或殘餘物的本發明化合物之任何 無毒鹽、酯、酯之鹽或其他衍生物。
本發明之組成物可經口、非經腸、藉由吸入噴霧、局部、經直腸、經鼻、經頰、經陰道或藉助於植入式貯器而投予。如本文所用之術語「非經腸」包括皮下、靜脈內、肌肉內、關節內、滑液內、胸骨內、鞘內、肝內、病灶內及顱內注射或輸注技術。較佳地。組成物經口、腹膜內或靜脈內投予。本發明之組成物的無菌可注射形式可為水性或油性懸浮液。此等懸浮液可根據此項技術中已知之技術使用適合之分散劑或濕潤劑及懸浮劑來調配。無菌可注射製劑亦可為無毒非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中的無菌可注射溶液或懸浮液，例如呈1,3-丁二醇中之溶液的形式。在可接受之媒劑及溶劑中，可採用的為水、林格氏溶液(Ringer's solution)及等張氯化鈉溶液。另外，無菌不揮發性油習知地用作溶劑或懸浮介質。
出於此目的，可採用任何溫和不揮發性油，包括合成單甘油酯或二甘油酯。脂肪酸(諸如油酸及其甘油酯衍生物)適用於製備可注射劑，天然的醫藥學上可接受之油(諸如橄欖油或蓖麻油，尤其其聚氧乙烯化形式)亦然。此等油溶液或懸浮液亦可含有長鏈醇稀釋劑或分散劑，諸如羧甲基纖維素或常用於調配醫藥學上可接受之劑型(包括乳液及懸浮液)的類似分散劑。其他常用界面活性劑(諸如Tween、Span及其他乳化劑)或常用於製造醫藥學上可接受之固體、液體或其他劑型中的生物可用性增進劑亦可用於調配之目的。
本發明的醫藥學上可接受之組成物可以任何經口可接受之劑型經口投予，包括(但不限於)膠囊、片劑、水性懸浮液或溶液。在用於經口使用之片劑的的情況下，常用載劑包括乳糖及玉米澱粉。通常亦添加潤滑劑， 諸如硬脂酸鎂。對以膠囊形式經口投予而言，適用之稀釋劑包括乳糖及乾燥玉米澱粉。當需要水性用於經口使用時，活性成分與乳化劑及懸浮劑組合。若需要，亦可添加某些甜味劑、調味劑或著色劑。
或者，本發明的醫藥學上可接受之組成物可為以用於經直腸投予之栓劑形式投予。可藉由將藥劑與適合之非刺激性賦形劑混合來製備此等栓劑，該賦形劑在室溫下為固體但在直腸溫度下為液體且因此將在直腸中熔融以釋放藥物。該等材料包括可可脂、蜂蠟及聚乙二醇。
本發明的醫藥學上可接受之組成物亦可局部投予，尤其當治療目標包括藉由局部施用容易進入之區域或器官(包括眼睛、皮膚或低位腸道之疾病)時容易製備適合用於此等區域或器官中之每一者的局部調配物。
用於低位腸道之局部施用可以經直腸栓劑調配物(參見上文)形式或以適合之灌腸調配物形式實現。亦可使用局部經皮貼片。
對局部施用而言，所提供的醫藥學上可接受之組成物可以含有懸浮或溶解於一或多種載劑中之活性組分的適合之軟膏形式調配。用於本發明化合物之局部投予的載劑包括(但不限於)礦物油、液體石蠟脂、白石蠟脂、丙二醇、聚氧乙烯、聚氧丙烯化合物、乳化蠟及水。或者，所提供的醫藥學上可接受之組成物可以含有懸浮或溶解於一或多種醫藥學上可接受之載劑中的活性組分的適合之洗劑或乳膏形式調配。適合之載劑包括(但不限於)礦物油、脫水山梨糖醇單硬脂酸酯、聚山梨醇酯60、鯨蠟酯蠟、鯨蠟硬脂醇、2-辛基十二醇、苯甲醇及水。
對眼用使用而言，所提供的醫藥學上可接受之組成物可調配為具有或不具有防腐劑(諸如氯苄烷銨)的於等張之pH值經調整之無菌生理食鹽水 中的微米尺寸化懸浮液，或較佳為於等張pH值經調整之無菌生理食鹽水中的溶液。或者，對眼部使用而言，醫藥學上可接受之組成物可在軟膏(諸如石蠟脂)中調配。
本發明的醫藥學上可接受之組成物亦可藉由經鼻氣霧劑或吸入來投予。該等組成物根據醫藥調配技術中熟知之技術來製備，且可採用苯甲醇或其他適合之防腐劑、增強生物可用性之吸收促進劑、碳氟化合物及/或其他習知增溶劑或分散劑來製備為於生理食鹽水中之溶液。
最佳地，調配本發明的醫藥學上可接受之組成物以用於經口投予。該等調配物可在存在或不存在食物的情況下投予。在一些具體實例中，本發明的醫藥學上可接受之組成物在不存在食物的情況下投予。在其他具體實例中，本發明的醫藥學上可接受之組成物在食物存在的情況下投予。
可與載劑材料組合以產生呈單一劑型之組成物的本發明之化合物量將視所治療之宿主及特定投藥模式而變化。較佳地，應調配所提供之組成物以使得可向接受此等組成物之患者投予每日每公斤體重0.01-100mg之間劑量的抑制劑。
亦應理解，用於任何特定患者之特定劑量及治療方案將視多種因素而定，該等因素包括所採用之特定化合物的活性、年齡、體重、一般健康狀況、性別、膳食、投藥時間、排泄率、藥物組合及治療醫師之判斷及所治療之特定疾病的嚴重強度。本發明之化合物在組成物中之量亦視組成物中之特定化合物而定。
化合物及醫藥學上可接受組成物的用途
本文所描述之化合物及組成物一般適用於調節一或多種涉及後生調控 之酵素的活性。
後生學為對由除基礎DNA序列改變之外的機制所造成之基因表現可遺傳性改變的研究。在後生調控中起一定作用之分子機制包括DNA甲基化及染色質/組蛋白修飾。組蛋白甲基化在許多後生現象中尤其為關鍵的。
染色質為核DNA及組蛋白之組織集合，其為多種至關重要核過程之基礎，該等核過程包括轉錄之調控、複寫、DNA損壞修復及經由細胞循環之進程。已鑑別出多種在維持染色質之動力學平衡中起重要作用的因素(諸如染色質修飾酵素)(Margueron等人(2005)Curr.Opin.Genet.Dev.15：163-176)。
組蛋白為染色質之首要蛋白質組分。其充當DNA圍繞其捲繞之線軸，且其在基因調控中起一定作用。存在總共六個類別之組蛋白(H1、H2A、H2B、H3、H4及H5)，其可分組為兩個超類別：核心組蛋白(H2A、H2B、H3及H4)及鍵聯組蛋白(H1及H5)。染色質之基本單元為核小體，其由圍繞組蛋白八聚體纏繞之約147個DNA鹼基對組成，該組蛋白八聚體由核心組蛋白H2A、H2B、H3及H4中之每一者的兩個複本組成(Luger等人(1997)Nature 389：251-260)。
組蛋白，尤其組蛋白H3及H4之胺基末端的殘基及組蛋白H2A、H2B及H1之胺基及羧基末端，易受多種轉譯後修飾，包括乙醯化、甲基化、磷酸化、核糖基化、類泛素化、泛素化、瓜胺酸化、去氨基化及生物素化。組蛋白H2A及H3之核心亦可經修飾。組蛋白修飾對不同生物過程為整合的，該等生物過程諸如基因調控、DNA及染色體縮合。
本發明提供用於調節組蛋白甲基修飾酵素之活性的化合物及組成物。 組蛋白甲基修飾酵素為細胞及發育過程之關鍵調節劑。組蛋白甲基修飾酵素可表徵為組蛋白甲基轉移酶或組蛋白去甲基酶。組蛋白去甲基酶酵素具有介導與甲基化殘基之結合的模組。舉例而言，多個去甲基酶含有都鐸結構域(Tudor domain)(例如JMJD2C/GASC1)或PHD結構域(例如JARID1C/SMCX、PHF8)。
已表徵許多組蛋白甲基轉移酶之離胺酸特異性。舉例而言，SET7/9、SMYD3及MLL1-5對H3K4具有特異性。SUV39H1、DIM-5及G9a對H3K9具有特異性。SET8對H4K20具有特異性。
DOT1為含有組蛋白甲基化酶之非SET結構域的一個實例。DOT1使離胺酸79上之H3甲基化。
在已顯示組蛋白甲基化酶調控轉錄活性、染色質結構及基因沉默的同時，亦發現去甲基酶影響基因表現。LSD1為第一個得到表徵之組蛋白離胺酸去甲基酶。此酵素顯示與FAD依賴性胺氧化酶之同源性，且充當神經元基因之轉錄共抑制物(Shi等人,Cell 119：941-953,2004)。已發現限定單獨去甲基酶家族的另外之去甲基酶，包括JHDM1(或KDM2)、JHDM2(或KDM3)、JMJD2(或KDM4)、JARID(或KDM5)、JMJD3(或KDM6)及JMJD6家族(Lan等人,Curr.Opin.Cell Biol.20(3)：316-325,2008)。
去甲基酶對受質序列內特定離胺酸殘基起作用，且辨別存在於所給定殘餘物上的甲基化程度之間的差別。舉例而言，LSD1移除來自H3K4之單甲基或二甲基。JARID1A-D家族之成員自H3K4移除三甲基。UTX及JMJD3使H3K27去甲基，抵消EZH2甲基化酶活性之效果。已表徵其他去甲基酶之受質特異性(參見Shi,Nat.Rev.8：829-833,2007)。
一個類別之組蛋白甲基化酶的特徵在於存在SET結構域，其以共用該結構域之蛋白質(Su(var)3-9、zeste強化子(enhancer of zeste)[E(Z)]及三胸基因(trithorax))命名。設定結構域包括約130個胺基酸。含SET結構域之甲基化酶家族包括SUV39H1、SET1、SET2、EZH2、RIZ1、SMYD3、SUV4-20H1、SET7/9及PR-SET7/SET8家族(綜述於Dillon等人Genome Biol.6：227,2005中)。家族成員通常在SET結構域附近及在SET結構域內包括類似序列基元。人類基因組編碼超過50個含SET結構域之組蛋白甲基化酶，其中的任一者可用於本文所描述之分析。
EZH2為含SET結構域之人類甲基化酶的一個實例。EZH2與EED(胚胎外胚層發育；Embryonic Ectoderm Development)及SUZ12(zeste 12同源物之抑制因子)相關聯以形成具有在離胺酸27處使組蛋白H3三甲基化之能力的複合體(稱為多梳家族抑制複合體2(Polycomb Group Repressive Complex 2；PRC2))(Cao及Zhang,Mol.Cell 15：57-67,2004)。PRC2複合體亦可包括RBAP46及RBAP48次單元。
多個研究已顯示EZH2之致癌活性。在細胞系實驗中，EZH2之過度表現誘導細胞侵襲、軟瓊脂中之生長及活動性，而EZH2之阻斷基因表現抑制細胞增殖及細胞侵襲(Kleer等人,2003,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100：11606-11611；Varambally等人,(2002),「The polycomb group protein EZH2 is involved in progression of prostate cancer」,Nature 419,624-629)。已顯示EZH2抑制若干腫瘤抑制因子之表現，其中尤其包括E-鈣黏素、DAB2IP及RUNX3。在異種移植物模型中，EZH2阻斷基因表現抑制腫瘤生長及癌轉移。最近，已顯示在鼠類模型中向下調節EZH2阻斷前列腺癌症癌轉移(Min 等人,「An oncogene-tumor suppressor cascade drives metastatic prostate cancer by coordinately activating Ras and nuclear factor-kappaB」,Nat Med.2010年3月；16(3)：286-94)。EZH2過度表現與某些癌症(諸如乳癌)之侵襲性相關(Kleer等人,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 100：11606-11611,2003)。近期研究亦表明，前列腺癌症特異性致癌融合基因TMPRSS2-ERG藉助於直接活化EZH2來誘導抑制性後生程序(Yu等人,「An Integrated Network of Androgen Receptor,Polycomb,and TMPRSS2-ERG Gene Fusions in Prostate Cancer Progression」,Cancer Cell.2010年5月18日；17(5)：443-454)。
在一些具體實例中，本發明之化合物調節一或多種涉及後生調控之酵素的活性。在一些具體實例中，本發明之化合物調節組蛋白甲基修飾酵素或其突變體之活性。在一些具體實例中，本發明之化合物調節EZH2活性。在一些具體實例中，本發明之化合物下調或抑制EZH2之活性。在一些具體實例中，本發明之化合物為EZH2活性之拮抗劑。
在一些具體實例中，本發明之化合物及組成物適用於治療與組蛋白甲基修飾酵素相關之疾病及/或病症。相應地，在一些具體實例中，本發明提供一種調節與組蛋白甲基修飾酵素相關之疾病及/或病症的方法。在一些具體實例中，本發明提供一種治療罹患與組蛋白甲基修飾酵素相關之疾病及/或病症的個體的方法，其包含投予式II之化合物或組成物的步驟。
在一些具體實例中，本發明之化合物及組成物適用於治療與EZH2之過度表現相關的疾病及/或病症。在一些具體實例中，本發明提供一種治療罹患與EZH2之過度表現相關之疾病及/或病症的個體的方法，其包含投予式II之化合物或組成物的步驟。在一些具體實例中，以上方法另外包含測定個 體是否過度表現EZH2之預先步驟。
在一些具體實例中，本發明之化合物及組成物適用於治療與細胞增殖相關之疾病及/或病症。在一些具體實例中，本發明之化合物及組成物適用於治療與細胞循環或DNA修復之誤調控相關的疾病及/或病症。在一些具體實例中，本發明之化合物及組成物適用於治療癌症。例示性癌症類型包括乳癌、前列腺癌、結腸癌、腎細胞癌、多形性神經膠質母細胞瘤癌、膀胱癌、黑色素瘤、支氣管癌、淋巴瘤及肝癌。
EZH2缺失、誤義及移碼突變之研究表明EZH2在血液病(骨髓發育不良症候群(MDS)及骨髓惡性病)中充當腫瘤抑制因子(Ernst等人,Nat Genet.2010年8月；42(8)：722-6；Nikoloski等人,Nat Genet.2010年8月；42(8)：665-7)。相應地，在一些具體實例中，本發明之化合物及組成物適用於治療與突變體形式EZH2之存在相關的疾病及/或病症。在一些具體實例中，本發明之化合物及組成物適用於治療與Y641N EZH2之存在相關的疾病及/或病症。在一些具體實例中，與突變體形式EZH2之存在相關的疾病或病症為人類B細胞淋巴瘤。在一些具體實例中，與Y641N EZH2之存在相關的疾病及/或病症為濾泡性淋巴瘤或彌漫性大B細胞性淋巴瘤。在一些具體實例中，本發明之化合物或組成物適用於治療血液病，諸如骨髓發育不良症候群、白血病、貧血及細胞減少症。Sneeringer等人,「Coordinated activities of wild-type plus mutant EZH2 drive tumor-associated hypertrimethylation of lysine 27 on histone H3(H3K27)in human B-cell lymphomas」,Proceedings of the National Academy of Sciences,PNAS 2010年11月15日在印刷前出版之早期版本。
在一些具體實例中，本發明提供一種減少個體中EZH2之活性的方法， 其包含投予式II之化合物或組成物的步驟。在一些具體實例中，本發明提供一種減少個體中寬型EZH2之活性的方法，其包含投予式II之化合物或組成物的步驟。在一些具體實例中，本發明提供一種減少個體中突變體形式EZH2之活性的方法，其包含投予式II之化合物或組成物的步驟。在一些具體實例中，本發明提供一種減少個體中突變體形式EZH2之活性的方法，其包含投予式II之化合物或組成物的步驟，其中該突變體形式EZH2為Y641N EZH2。在一些具體實例中，本發明提供一種治療罹患與EZH2相關之疾病及/或病症的個體的方法，其包含投予式II之化合物或組成物的步驟。在一些具體實例中，本發明提供一種治療罹患與寬型EZH2相關之疾病及/或病症的個體的方法，其包含投予式II之化合物或組成物的步驟。在一些具體實例中，本發明提供一種治療罹患與突變體形式EZH2相關之疾病及/或病症的個體的方法，其包含投予式II之化合物或組成物的步驟。在一些具體實例中，本發明提供一種治療罹患與突變體形式EZH2相關之疾病及/或病症的個體的方法，其包含投予式II之化合物或組成物的步驟，其中該突變體形式EZH2為Y641N EZH2。在一些具體實例中，以上方法另外包含測定個體是否表現突變體形式EZH2(諸如Y641N EZH2)之預先步驟。在一些具體實例中，本發明提供一種減少有需要之個體中突變體形式EZH2(Y641N EZH2)之活性的方法，其包含投予式II之化合物或組成物的步驟。在一些具體實例中，本發明提供一種治療罹患與突變體形式EZH2相關之疾病及/或病症的個體的方法，其包含投予式II之化合物或組成物的步驟。在一些具體實例中，以上方法另外包含測定個體是否表現突變體形式EZH2(諸如Y641N EZH2)之預先步驟。在一些具體實例中，該測定藉由測定與 已知不表現突變體形式EZH2之個體相比，個體之組蛋白H3 Lys-27特異性三甲基化(H3K27me3)的量是否增加來進行。
等效物
以下代表性實施例意欲幫助說明本發明，而並不意欲亦不應解釋為限制本發明之範疇。實際上，除本文所顯示與描述之彼等修改及具體實例之外，來自此文件之全部內容(包括以下實施例及對本文所引用之科學及專利文獻的參考)的本發明之各種修改及其許多其他具體實例對熟習此項技術者而言將變得顯而易見。進一步應瞭解彼等所引用之參考的內容以引用之方式併入本文中以幫助說明目前先進技術。
應瞭解對本文所描述之化合物製備而言，當使用逆相HPLC來純化化合物時，化合物可以酸加成鹽形式存在。在一些具體實例中，化合物可以甲酸鹽或單-、二-、或三-三氟乙酸鹽形式存在。
進一步應瞭解本發明涵蓋本文所描述之個別化合物。在其中所例示之個別化合物以鹽形式(例如以三氟乙酸鹽形式)經分離及/或表徵的情況下，本發明涵蓋該鹽之游離鹼，以及該游離鹼的其他醫藥學上可接受之鹽。
以下實施例含有重要之其他資訊、範例及指導，該等資訊、範例及指導可適於本發明之實踐的各種具體實例及其等效物。
用於製備以下所例示之化合物的程序以及合成流程中之其他化合物/中間物可見於國際申請案第PCT/US2013/025639號，其內容以引用之方式併入本文中。
實施例
如在以下實施例中所描繪，在某些例示性具體實例中，根據以下通用 程序來製備化合物。應瞭解，儘管合成方法及流程描繪本發明之某些化合物的合成，但以下方法及一般熟習此項技術者已知之其他方法可應用於如本文所描述之所有化合物及此等化合物中之每一者的子類及種類。
除非另外說明，否則所有溶劑、化學品及試劑均為商購所得且不經純化即使用。在CDCl3、d 6 -DMSO、CD3OD或d 6 -丙酮中於25℃下在OXFORD(Varian)上300MHz處以相對於作為內標之TMS而報告的化學位移(δ,ppm)獲得1H NMR光譜。用島津(Shimadzu)LC-MS-2020系統獲得HPLC-MS層析圖及譜。用Yilite P270獲得手性分析及純化。
實例1. 化合物327與346及相關化合物與中間物之合成。
根據以下通用流程來製備此實施例之標題化合物及其他相關化合物。另外，在所指示之情況下，針對本發明之其他相關化合物及其中間物之合成揭示此流程之修改。
步驟1：(S,E)-4-(((第三丁基亞磺醯基)亞胺基)甲基)哌啶-1-甲酸第三丁酯：
(S)-2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺
向裝有磁性攪拌棒之圓底燒瓶中添加(S)-2-甲基丙烷-2-亞磺醯胺(20.46 g，169mmol)、4-甲醯基哌啶-1-甲酸第三丁酯(30g，141mmol)、DCM(300mL)及Ti(OEt)4(59.0ml，281mmol)。在室溫下攪拌溶液3小時，隨後用鹽水(80mL)淬滅。攪拌溶液30分鐘，隨後過濾。用DCM洗滌濾餅，且將濾液置放在分液漏斗中且用水洗滌。經Na2SO4乾燥有機物層，過濾，且在真空中濃縮。粗殘餘物固化為標題化合物(29g，92mmol，產率65.1%)m/z 217。
根據概述於步驟1中之通用程序使用適當起始物質及修改來製備顯示在下表中之中間物。
步驟2：4-((S)-1-((R或S)-1,1-二甲基乙基亞磺醯胺基)乙基)哌啶-1-甲酸第三丁酯：
向裝有磁性攪拌棒之圓底燒瓶中添加(S,E)-4-((第三丁基亞磺醯基亞胺基)甲基)哌啶-1-甲酸第三丁酯(36.4g，115mmol)、DCM(400mL)，且在攪拌下在冰浴中將溶液冷卻至0℃。向此溶液中添加MeMgBr(77ml，230mmol)(乙醚中3M)，且在升溫至室溫之同時攪拌反應4小時。藉助於添加飽和NH4Cl水溶液來謹慎地淬滅反應。藉由添加1N HCl來打碎固體。分離各層且用DCM萃取水相。經Na2SO4乾燥經合併之有機物相，過濾，且在真空中濃縮，得到標題化合物(29g，>9：1 dr)，該標題化合物在下一步驟中不經進一步純化即使用。
根據概述於步驟2中之通用程序使用適當起始物質及修改來製備顯示在下表中之中間物。
步驟3：(R或S)-4-(1-胺基乙基)哌啶-1-甲酸第三丁酯：
向裝有磁性攪拌棒之1L圓底燒瓶中添加溶解於MeOH(200mL)中之粗物質4-((S)-1-((S)-1,1-二甲基乙基亞磺醯胺基)乙基)哌啶-1-甲酸第三丁酯(29g)，隨後添加HCl於1,4-二烷中之4N溶液(24.06ml，96mmol)。隨後在室溫下攪拌所得溶液1小時。隨後在真空中移除甲醇，得到黏稠油狀物，用飽和NaHCO3水溶液(約500mL)處理該油狀物且用乙酸乙酯(2×500mL)萃取。合併此有機相，經MgSO4乾燥，過濾，且隨後在真空中移除溶劑，得到標題化合物(22g)，該化合物不經進一步純化即使用。
根據概述於步驟3中之通用程序使用適當起始物質來製備顯示在下表中之中間物。
步驟4：2-(2-溴苯基)-3-側氧基丁酸甲酯：
在圓底燒瓶中裝入磁性攪拌棒及2-(2-溴苯基)乙酸甲酯(25g，109mmol)與THF(50mL)。將此溶液冷卻至-78℃，隨後逐滴添加LiHMDS於THF中之1M溶液(218ml，218mmol)。在-78℃下攪拌反應30分鐘，隨後添加溶解於THF：DMF混合物(112mL THF，24mL DMF)中之1-(1H-咪唑-1-基)乙酮(14.42g，131mmol)。攪拌溶液1小時，隨後用飽和NH4Cl水溶液(約250mL)淬滅且用EtOAc稀釋。分離各層，且用EtOAc(約2×250mL)萃取水相。用鹽水洗滌經合併之有機萃取物，經Na2SO4乾燥，過濾，且在真空中濃縮。藉助於矽膠層析使用乙酸乙酯/己烷(10：1)洗提劑來純化粗殘餘物，得到2-(2-溴苯基)-3-側氧基丁酸甲酯(32.5g，102mmol，產率93%)。
根據概述於步驟4中之通用程序使用適當起始物質來製備顯示在下表中之中間物。
步驟5：(R或S,E及Z)-4-(1-(3-(2-溴苯基)-4-甲氧基-4-側氧基丁-2-烯-2-基胺基)乙基)哌啶-1-甲酸第三丁酯：
向圓底燒瓶中添加(R或S)-4-(1-胺基乙基)哌啶-1-甲酸第三丁酯(9.35g，40.9mmol)、EtOH(75mL)及2-(2-溴苯基)-3-側氧基丁酸甲酯(7.40g，27.3mmol)(來自步驟4)。向此溶液中添加AcOH(1.563ml，27.3mmol)，且在85℃下加熱反應隔夜，隨後冷卻至室溫且濃縮。藉助於矽膠層析(330g，100%己烷：己烷中之25% EA)來純化粗殘餘物，得到標題化合物(6.45g，13.40mmol，產率49.1%)。
根據概述於步驟5中之通用程序使用適當起始物質來製備顯示在下表中之中間物。
步驟6：(R或S)-1-(1-(1-(第三丁氧羰基)哌啶-4-基)乙基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲酸甲酯：
在250mL圓底燒瓶中裝入磁性攪拌棒、(R或S,Z)-4-(1-(3-(2-溴苯基)-4-甲氧基-4-側氧基丁-2-烯-2-基胺基)乙基)哌啶-1-甲酸第三丁酯(3.33g，6.92mmol)、RuPhos預催化劑II(甲磺酸根基(2-二環己基膦基-2',6'-二異丙氧基-1,1'-聯苯)(2-胺基-1,1'-聯苯-2-基)鈀(II))(0.463g，0.553mmol)、二環己基(2',6'-二異丙氧基聯苯-2-基)膦(0.387g，0.830mmol)、無水1,4-二烷(27.7ml，6.92mmol)及甲醇鈉(0.561g，10.38mmol)。用氮氣吹掃及回填反應混合物，且在攪拌下加熱至100℃持續隔夜，隨後使之冷卻至室溫。用乙酸乙酯(約100ml)稀釋反應，且經由矽藻土床過濾混合物。將濾液預吸附至矽膠(約30g)上，且藉助於矽膠層析(120g)使用乙酸乙酯/己烷(1：1)作為洗提劑來純化，得到標題化合物(2.01g，4.77mmol，產率68.9%)。
根據概述於步驟6中之通用程序使用適當起始物質來製備顯示在下表中之中間物。
步驟7：(R或S)-2-甲基-1-(1-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酸：
在1L圓底燒瓶中裝入磁性攪拌棒、(R或S)-2-甲基-1-(1-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酸甲酯(11.60g，38.5mmol)、乙醇(96ml，38.5mmol)及6N NaOH水溶液(64.1ml，385mmol)。在燒瓶上安裝回流冷凝器，且加熱至回流持續6小時，隨後使之冷卻至室溫。在真空中移除揮發物，且將所得混合物倒入10% HCl(約300mL)中。形成沈澱，藉助於真空過濾使用布赫納漏斗收集該沈澱。用額外部分之水(約200mL)沖洗濾餅，收集，且在真空下乾燥，得到呈灰白色固體狀之標題化合物(10.87g，35.9mmol，產率93%)。
根據概述於步驟7中之通用程序使用適當起始物質來製備顯示在下表中之中間物。
步驟8：(R或S)-4-(1-(3-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基胺甲醯基)-2-甲基-1H-吲哚-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸第三丁酯(化合物327)
在250mL圓底燒瓶中裝入磁性攪拌棒、(R或S)-1-(1-(1-(第三丁氧羰基)哌啶-4-基)乙基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲酸(1.950g，5.05mmol)、3-(胺甲基)-4-甲氧基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮鹽酸鹽(2.065g，10.09mmol)、DMF(25.2ml，5.05mmol)、許尼希鹼(Hunig's base)(3.52ml，20.18mmol)。將反應混合物冷卻至0℃，且添加COMU(2.16g，5.05mmol)。使反應攪拌隔夜至室溫。 用水稀釋反應混合物且用EtOAc萃取。用鹽水洗滌經合併之有機萃取物，經MgSO4乾燥，過濾且在真空中濃縮，得到粗物質，藉助於矽膠層析(120g)使用MeOH/乙酸乙酯(1：5)作為洗提劑來純化該粗物質，得到標題化合物(1.86g，3.29mmol，產率65.3%)。LCMS 537(M+1)+ 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=11.83-11.71(m,1 H),7.80(br.s.,1 H),7.73(d,J=7.6Hz,1 H),7.62(d,J=7.8Hz,1 H),7.06(td,J=7.1,14.4Hz,2 H),6.21(s,1 H),4.32(br.s.,2 H),4.16(br.s.,1 H),4.02(br.s.,1 H),3.85(s,3 H),3.75(br.s.,1 H),2.70(br.s.,1 H),2.58(s,3 H),2.37(br.s.,1 H),2.21(s,3H),1.90(d,J=12.9Hz,1 H),1.53(d,J=6.9Hz,3 H),1.35(s,10 H),1.21(br.s.,1 H),0.89(d,J=8.7Hz,1 H),0.67(d,J=11.8Hz,1 H)。
根據概述於步驟8中之通用程序使用適當起始物質來製備顯示在下表中之化合物。化合物之結構顯示在圖1中。
步驟9：(R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲醯胺鹽酸鹽(化合物326)
在250mL圓底燒瓶中裝入磁性攪拌棒、(R或S)-4-(1-(3-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基胺甲醯基)-2-甲基-1H-吲哚-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸第三丁酯(化合物327)(1.850g，3.45mmol)、MeOH(13.79ml，3.45mmol)及HCl(2.59ml，10.34mmol)(二烷中4N)。使反應在室溫下攪拌6小時，隨後在真空中濃縮，得到標題化合物(1.65g，3.14mmol，產率91%)。LCMS 437(M+1)+。
根據概述於步驟9中之通用程序使用適當起始物質來製備顯示在下表中之化合物。此化合物之結構顯示在圖1中。
步驟10：(R或S)-4-(1-(3-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基胺甲醯基)-2-甲基-1H-吲哚-1-基)乙基)哌啶-1-甲酸異丙酯(化合物346)
在250mL圓底燒瓶中裝入磁性攪拌棒、(R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲醯胺鹽酸鹽(0.467g，0.987mmol)、DMF(2.468ml，0.987mmol)、THF(2.468ml，0.987mmol)及N-乙基-N-異丙基丙-2-胺(0.638g，4.94mmol)。將反應冷卻至0℃，且藉助於注射器逐滴添加氯甲酸異丙酯(0.160ml，1.086mmol)。將反應攪拌2小時至室溫，且隨後用5N LiOH處理1小時以移除任何醯基化吡啶酮。用乙酸乙酯萃取此物質，用鹽水洗滌，經MgSO4乾燥，且過濾且在真空中濃縮。藉助於矽膠層析(50g)使用乙酸乙酯/MeOH(5：1)作為洗提劑來純化所得物質，得到呈淺黃色固體狀之純標題化合物(0.300g，0.545mmol，產率55.2%)。LCMS 523(M+1)+；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ 11.59(br.s.,1 H),7.74(d,J=7.8Hz,1 H),7.69(t,J=4.9Hz,1 H),7.62(d,J=7.8Hz,1 H),7.13-7.01(m,2 H),6.15(s,1 H),4.78-4.67(m,1 H),4.32(d,J=4.9Hz,2 H),4.23-4.12(m,1 H),4.12-4.02(m,1 H),3.84(s,3 H),3.82-3.74(m,1 H),2.79-2.66(m,1 H),2.58(s,3 H),2.46-2.34(m,2 H),2.20(s,3 H),1.96-1.88(m,1 H),1.58-1.46(m,4 H),1.15(d,J=6.0Hz,6 H),0.95-0.89(m,1 H),0.74-0.65(m,1 H)。
根據概述於步驟10中之通用程序使用適當起始物質來製備顯示在下表中之化合物。化合物之結構顯示在圖1中。
實施例2. (R或S)-1-(1-(1-異丙基哌啶-4-基)乙基)-N-(4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醯胺(化合物358)之合成
在25mL小瓶中裝入磁性攪拌棒、(R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲醯胺鹽酸鹽、THF(2.114ml，0.211mmol)、丙-2-酮(0.061g，1.057mmol)及三乙醯氧基硼氫化鈉(0.224g，1.057mmol)。使反應在室溫下攪拌12小時。將反應在飽和NaHCO3水溶液上反相淬滅，用乙酸乙酯萃取，且在真空中濃縮。用10mL MeOH中之7N氨處理所得物質，且在真空中濃縮以得到物質，藉助於矽膠層析(10g)使用DCM/MeOH/NH4OH(90：1：0.1)作為洗提劑來純化該物質，得到33mg(0.065mmol，產率31.0%)呈白色固體狀之標題化合物。LCMS 479(M+1)+；1H NMR(DMSO-d 6 ,400MHz) δ 11.59(s.,1 H),7.64-7.82(m,2 H),7.59(d,1 H),6.95-7.17(m,2 H),6,15(s,1 H),4.32(d,2 H),4.04-4.24(m,1 H),3.84(σ,3 H),2.77-2.93(μ,2 H),2.68(δ,1 H),2.60(σ,3 H),2.20(σ,3 H),2.08-2.15(μ,1 H),1.92(δ,1 H),1.83(βp,σ.,1 H),1.54(σ,3 H),1.27-1.43(μ,2 H),0.91(τ,6 H),0.71-0.67(μ,2 H)。
根據概述於此實施例中之通用程序使用適當起始物質來製備顯示在下表中之化合物。化合物之結構顯示在圖1中。
實施例3. (R或S)-1-(1-(1-(2-氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醯胺(化合物356)之合成：
在25mL小瓶中裝入磁性攪拌棒、(R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲醯胺鹽酸鹽(0.062g，0.131mmol)、K2CO3(0.072g，0.524mmol)、MeCN(0.655ml，0.131mmol)、DMF(0.262ml，0.131mmol)及1-溴-2-氟乙烷(0.020ml，0.262mmol)。加蓋反應且在攪拌下加熱至82℃持續4小時。使反應冷卻至室溫，過濾，且將濾液預吸附至矽膠上(12g)。藉助於SiO2層析(25g)使用DCM/MeOH/Et3N(85：15：0.5)作為洗提劑來純化物質，得到呈灰白色固體狀之標題化合物(30mg，0.059mmol，產率45.1%)。LCMS 483(M+1)+；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ 11.59(s,1H),7.75-7.68(m,2H),7.60(d,1 H) 7.09-7.03(m,2H),6.15(s,1H)4.53-4.51(m,1H),4.42-4.39(m,1H),4.32(d,2H),4.24-4.2(m,1H),3.84(s,3H),2.98(br.d.,1H),2.70-2.49(m,4H),2.60(s,3H),2.20(s,3H),2.01(dt,1H),1.92-1.90(m,1H),1.75-1.71(m,1H),1.54(d,3H),1.38-1.36(m,1H),1.02-0.98(m,1H),0.7-0.66(br.d.,1H)。
根據概述於此實施例中之通用程序使用適當起始物質來製備顯示在下表中之化合物。化合物之結構顯示在圖1中。
實施例4. (R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(1-嘧啶-2-基)哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲醯胺(化合物361)之合成
向可再密封小瓶中添加2-氯嘧啶(185mg，1.611mmol)、(R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲醯胺鹽酸鹽(508mg，1.074mmol)及EtOH(8mL)。向此溶液中添加Et3N(449μl，3.22mmol)。密封小瓶，且加熱至100℃持續隔夜。使溶液冷卻至室溫，且在真空中濃縮。藉助於矽膠層析(己烷：(3：2 DCM：IPA))來純化粗殘餘物，得到呈固體狀之標題化合物(357mg，0.694mmol，產率64.6%)。LCMS 515(M+1)+；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ 11.60(s,1 H),8.30(d,J=4.7Hz,2 H),7.76(d,J=7.6Hz,1 H),7.73-7.64(m,2 H),7.14-7.01(m,2 H),6.55(t,J=4.7Hz,1 H),6.15(s,1 H),4.84-4.75(m,1 H),4.57-4.47(m,1 H),4.33(d,J=4.2Hz,2 H),4.22-4.11(m,1 H),3.84(s,3 H),2.92-2.81(m,1 H),2.63-2.52(m,4 H),2.20(s,3 H),2.05-1.94(m,1 H),1.61-1.49(m,4 H),1.34-1.21(m,1 H),1.04-0.91(m,1 H),0.83-0.75(m,1H)。
根據概述於此實施例中之通用程序使用適當起始物質來製備顯示在下表中之化合物。化合物之結構顯示在圖1中。
實施例5. (R或S)-1-(1-(1-(2-羥基乙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醯胺(化合物347)之合成
向裝有磁性攪拌棒之密封管中添加(R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲醯胺(0.1g，0.229mmol)，添加DCM(3mL)，且將反應冷卻至0℃。向經冷卻之反應混合物中添加在反應小瓶中冷凝之環氧乙烷(約1mL)。使反應經4小時攪拌至室溫，隨後在真空中濃縮，得到粗物質，藉助於矽膠層析(12g)使用乙酸乙酯/MeOH(4：1)作為洗提劑來純化該粗物質，得到呈白色固體狀之標題化合物(50mg)。LCMS 481(M+1)+；1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δ)δ 11.58(s,1 H),7.77-7.65(m,2 H),7.59(d,J=7.8Hz,1 H),7.11-6.99(m,2 H),6.14(s,1 H),4.54-4.44(m,1 H),4.31(d,J=5.1Hz,3 H),4.13(dd,J=7.1,10.3Hz,1 H),3.83(s,3 H),3.42(q,J=6.0Hz,2 H),2.93(br.s.,1 H),2.71- 2.56(m,4 H),2.31(br.s.,2 H),2,19(s,3 H),2.03-1.83(m,2 H),1.64(br.s.,1 H),1.53(d,J=6.9Hz,3 H),1.32(d,J=11.1Hz,1 H),1.02(d,J=10.3Hz,1 H),0.65(d,J=11.8Hz,1 H)。
根據概述於此實施例中之通用程序使用適當起始物質來製備顯示在下表中之化合物。化合物之結構顯示在圖1中。
實施例6. (R或S)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-6-苯基-1-(1-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙基-1H-吲哚-3-甲醯胺(化合物374)之合成
在25mL反應管中裝入磁性攪拌棒、苯基硼酸(72.6mg，0.596mmol)、K3PO4(103mg，0.447mmol)、X-Phos預催化劑(氯(2-二環己基膦基-2',4',6'-三異丙基-1,1'-聯苯)[2-(2-胺基乙基)苯基)]鈀(II))(4.92mg，5.96μmol)，且 密封小瓶。抽空/用氮氣回填小瓶(3×)，隨後添加6-氯-2-甲基-1-(1-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酸甲酯(化合物314)(100mg，0.298mmol)於1,4-二烷(1mL)中之溶液。隨後在攪拌下將小瓶加熱至100℃持續隔夜。隨後使小瓶冷卻至室溫，且在真空中濃縮反應。藉助於SiO2層析(10g)使用乙酸乙酯/己烷(4：1)洗提劑來純化粗殘餘物，呈白色固體狀之標題化合物(106mg，0.281mmol，產率94%)。)。LCMS 514(M+1)+；1H NMR 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=11.59(s,1 H),7.98-7.84(m,2 H),7.75-7.67(m,3 H),7.47(t,J=7.8Hz,2 H),7.39(d,J=8.5Hz,1 H),7.35-7.27(m,1 H),6.15(s,1 H),4.35(d,J=4.9Hz,2 H),4.25-4.12(m,1 H),3.93(d,J=8.5Hz,1 H),3.86-3.77(m,3 H),3.67(d,J=8.5Hz,1 H),3.39-3.32(m,1 H),3.10-3.00(m,1 H),2.62(s,3 H),2.21(s,3 H),1.85(d,J=10.0Hz,1 H),1.63-1.49(m,4 H),1.45-1.33(m,1 H),1.20-0.99(m,1 H),0.66(d,J=12.0Hz,1 H)。
實施例7. (R或S)-2-(4-(1-(3-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基胺甲醯基)-2-甲基-1H-吲哚-1-基)乙基)哌啶-1-基)乙酸(化合物364)之合成
向圓底燒瓶中裝入磁性攪拌棒，添加(R或S)-2-(4-(1-(3-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基胺甲醯基)-2-甲基-1H-吲哚-1-基)乙基)哌啶-1-基)乙酸乙酯(化合物363)(69mg，0.132mmol)、THF(1.5mL)、MeOH(1.5mL)及水(0.75mL)。向此溶液中添加單水合氫氧化鋰(5.54mg，0.132 mmol)，且在室溫下攪拌反應1小時。在減壓下移除有機物，且藉助於逆相HPLC(水/MeCN)0→95%來純化所得水溶液，得到標題化合物(66mg，0.108mmol，產率82%)。LCMS 514(M+1)+ 1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ=11.67(s,1 H),9.65(s,1 H),7.84-7.68(m,2 H),7.63(d,J=7.4Hz,1 H),7.14-7.03(m,2 H),6.18(s,1 H),4.33(d,J=3.6Hz,2 H),4.27-4.15(m,1 H),4.04(br.s.,2 H),3.85(s,3 H),3.57(s,1 H),3.35-3.23(m,1 H),3.14-2.99(m,1 H),2.86-2.74(m,1 H),2.62(s,3 H),2.21(s,3 H),2.18-2.08(m,1 H),1.75(s,1 H),1.60-1.49(m,4 H),1.46-1.33(m,1 H),0.92-0.81(m,1H)。
實施例8. (R或S)-2-甲基-6-(吡啶-3-基)-1-(1-(四氫-2H-哌喃-4-基)-乙基)-1H-吲哚-3-甲酸甲酯之合成。
此中間物作為實施例1中所闡述之步驟7中的替代性起始物質用於合成本發明之其他化合物。
(R或S)-2-甲基-1-(1-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙基)-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-1H-吲哚-3-甲酸甲酯
向圓底燒瓶中添加Pd(OAc)2(10.03mg，0.045mmol)、乙酸鉀(219mg，2.233mmol)、4,4,4',4',5,5,5',5'-八甲基-2,2'-雙(1,3,2-二氧雜硼戊烷)(567mg，2.233mmol)及2-二環己基膦基-2',4',6'-三異丙基聯苯(XPhos)(85mg，0.179mmol)，且密封小瓶。向此容器中添加溶解於二烷(3.4mL)中之(R或 S)-6-氯-2-甲基-1-(1-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酸甲酯(步驟6)(500mg，1.489mmol)，且抽空/用N2回填反應(3×)，隨後加熱至100℃持續隔夜。隨後使反應冷卻至室溫，且用EtOAc稀釋。經由矽藻土過濾反應，且濃縮濾液，得到標題化合物，該標題化合物不經進一步純化即用於後續反應中。LCMS 428(M+1)+。
(R或S)-2-甲基-6-(吡啶-3-基)-1-(1-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲酸甲酯：
向可再密封小瓶中添加K2CO3(206mg，1.488mmol)、PdCl2(dppf)-CH2Cl2加合物(60.8mg，0.074mmol)，且密封小瓶。抽空/用N2回填此小瓶(3×)，隨後添加溶解於1,4-二烷(4mL)中之(R或S)-2-甲基-1-(1-(四氫-2H-哌喃-4-基)乙基)-6-(4,4,5,5-四甲基-1,3,2-二氧雜硼戊環-2-基)-1H-吲哚-3-甲酸甲酯(318mg，0.744mmol)、3-溴吡啶(71.7μl，0.744mmol)及水(400μL)。抽空/用N2回填反應(3×)，隨後加熱至100℃。將溶液冷卻至室溫，且用EtOAc稀釋。過濾溶液，且在真空中濃縮。藉助於矽膠層析(10g，EtOAc/己烷(1：1))來純化粗殘餘物，得到標題化合物(101mg，0.267mmol，產率35.9%)。LCMS 379(M+1)+。
實施例9. 其他羧酸烷基酯中間物。
以與在實施例1之步驟2中所闡述方法類似的方式使用適當起始物質及反應物來合成以下羧酸烷基酯中間物。
實施例10. 自羧酸中間物產生的本發明之其他化合物。
以與實施例1之步驟4中所闡述方法類似的方式使用適當起始物質來合成以下化合物。此等化合物之結構闡述於圖1中。
實施例11. 1-(1-(1,4-二 烷-2-基)乙基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲酸甲酯之合成。
標題化合物用作實施例1之步驟3中的替代性甲酸烷基酯起始物質。
步驟1：1-(1,4-二 烷-2-基)乙酮：
於室溫下在氮氣氛圍下向過氧化苯甲醯(20g，141mmol)於200mL 1,4-二烷中之溶液中添加雙乙醯(24.3g，282mmol)。在添加之後，將混合物 加熱至回流且攪拌24小時。將反應混合物冷卻至0℃。藉由在0℃以下逐漸添加2N氫氧化鈉來將pH值調整至約9，用2-甲氧基-2-甲基丙烷(10mL×3)萃取，且濃縮，得到呈黃色油狀之1-(1,4-二烷-2-基)乙酮(13g，36%)，該產物不經純化即直接用於下一步驟中。
步驟2：1-(1,4-二 烷-2-基)乙胺：
在室溫下向1-(1,4-二烷-2-基)乙酮(12g，92.2mmol)於1,2-二氯乙烷(100mL)中之溶液中添加(4-甲氧基苯基)甲胺(25g，184.4mmol)。使混合物攪拌3小時，且隨後添加三乙醯氧基硼氫化鈉(39g，184.4mmol)。在室溫下使所得混合物攪拌48小時。藉由添加水來淬滅反應混合物，用二氯甲烷(100mL×3)萃取。藉由無水硫酸鈉來乾燥經合併之有機相，且隨後過濾。濃縮濾液，且藉由矽膠上之管柱層析(洗提：二氯甲烷/甲醇100：1→50：1→0：1)來純化，得到呈黃色固體狀之1-(1,4-二烷-2-基)-N-(4-甲氧基苯甲基)乙胺(16.4g，71%)。LCMS(M+H+)m/z：計算值251.15,實驗值251.9。向1-(1,4-二烷-2-基)-N-(4-甲氧基苯甲基)乙胺(5g，19.9mmol)於無水甲醇(100mL)中之溶液中添加10%鈀/碳(240mg，2mmol)，隨後用氫氣(30psi)吹掃，在室溫下使混合物攪拌隔夜。過濾反應混合物，且濃縮濾液，得到呈棕色固體狀之標題化合物(2.5g，96%)。
根據以上概述之通用程序使用適當起始物質及修改來製備顯示在下表中之胺中間物。
步驟3：(E)-3-((1-(1,4-二 烷-2-基)乙基)亞胺基)-2-(2-溴苯基)丁酸甲酯：
向1-(1,4-二烷-2-基)乙胺(2.5g，19mmol)於甲醇(100mL)中之溶液中添加2-(2-溴苯基)-3-側氧基丁酸甲酯(5.4g，20mmol)及乙酸(1.8g，30mmol)。將所得反應物系統升溫至回流，且使之攪拌隔夜。濃縮反應混合物，且藉由矽膠上之管柱層析來純化(洗脫：二氯甲烷/甲醇50：1→20：1→5：1)，呈棕色固體狀之標題化合物(1g，14%)。LCMS(M+H+)m/z：計算值383.07,實驗值384.9。
根據以上概述之通用程序使用適當起始物質(例如在此實施例之步驟2中之表中所闡述的胺之一)及修改來製備顯示在下表中之亞胺基溴中間物。
步驟4：1-(1-(1,4-二 烷-2-基)乙基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲酸甲酯
向(E)-3-((1-(1,4-二烷-2-基)乙基)亞胺基)-2-(2-溴苯基)丁酸甲酯(400mg，1.1mmol)於二烷(3mL)中之溶液中添加氯[2-(二環己基膦基)-3,6-二甲氧基-2',4',6'-三異丙基聯苯][2-(2-胺基乙基)苯基]鈀(II)(160mg，0.2mmol)、2-二環己基膦基-2',6'-二異丙氧基聯苯(93mg，0.2mmol)及第三丁醇鈉(192mg，2mmol)。在攪拌下於微波中將所得反應混合物加熱至120℃持續30分鐘。藉由添加水來淬滅反應混合物，且用乙酸乙酯(25mL×3)萃取。藉由無水硫酸鈉來乾燥經合併之有機相，且隨後過濾。濃縮濾液，且藉由矽膠上之管柱層析(洗脫：石油醚/乙酸酯10：1→5：1→2：1)來純化，得到呈黃色固體狀之標題化合物(282mg，89%)。LCMS(M+H+)m/z：計算值303.15,實驗值303.9。
根據以上概述之通用程序使用適當起始物質(例如顯示在此實施例之步驟3中之表中的亞胺基溴中間物之一)及修改來製備顯示在下表中之化合物。
在本發明之某些化合物的合成中，亦使用此等羧酸烷基酯作為實施例1之步驟3中的起始物質。
實施例12. 手性分離化合物219以得到化合物223及224。
藉助於超臨界流體層析(SFC)(A：C2H5OH，B：NH3‧H2O。A：B=55：45 AD管柱)使N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-1-(1-甲氧基丙-2-基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醯胺(200mg)(化合物219)經受手性層析，得到單獨對映異構體223(峰1)及224(峰2)(各60mg)LCMS 398(M+1)+ 1H NMR(400MHz,CD3OD)δ 7.69(d,J=7.2Hz,1H),7.53(d,J=7.6Hz,1H),7.12(m,2H),6.26(s,1H),4.80(m,1H),4.52(s,2H),3.99(m,4H),3.75(m,1H),3.20(s,3H),2.62(s,3H),2.31(s,3H),1.59(d,J=7.2Hz,3H)。未測定各對映異構體之旋光度。
根據以上概述之通用手性層析程序來製備顯示在下表中之化合物。未測定所分離對映異構體之旋光度，但指示洗脫峰(「峰1」或「峰2」)。各化合物之結構顯示在圖1中。
實施例1. 1-(2,3-二氫-1H-茚-1-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯之合成。
在本發明之某些化合物的合成中，標題化合物作為實施例36之步驟3中的起始物質。
2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯
向含有N-乙醯基-N-(3-溴吡啶-2-基)乙醯胺(14.815g，57.6mmol)之500mL圓底燒瓶中添加碘化銅(I)(1.098g，5.76mmol)、L-脯胺酸(1.327g，11.53mmol)、碳酸銫(28.2g，86mmol)，隨後添加乙醯乙酸第三丁酯(11.47ml，69.2mmol)及二烷(100mL)。抽真空/用N2吹掃反應3×，隨後安裝隔膜及N2入口，且在70℃下加熱隔夜。藉由經矽藻土過濾來移除無機固體，且用100mL EtOAc洗滌濾餅。濃縮此溶液，且將殘餘物分配於250mL鹽水與250mL EtOAc之間。進一步用EtOAc萃取水層(2×250mL)，且經Na2SO4乾燥經合併之有機層，過濾，濃縮，且藉由來CC使用1：1 EtOAc：己烷作為洗提劑來純化，得到(2.7g，20.2%)2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯。LRMS(M+H+)m/z：計算值233.28；實驗值233.1。
1-(2,3-二氫-1H-茚-1-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯
在0℃下於氮氣氛圍下在無水THF(10mL)中攪拌2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸乙基第三丁酯(100mg，0.74mmol)、2,3-二氫-1H-茚-1-醇(176mg，0.74mmol)、PPh3(195mg，1.49mmol)之溶液。將5分鐘之時間段向此混合物中逐滴添加DIAD(150mg，1.48mmol)，且在室溫下攪拌反應16小時。用鹽水洗滌混合物，乾燥且濃縮，得到粗產物。藉由矽膠層析 (石油醚/乙酸乙酯=5：1)來純化粗產物，得到1-(2,3-二氫-1H-茚-1-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯(150mg，60%)。
根據以上概述之通用程序使用適當起始物質及修改來製備顯示在下表中之化合物。
在本發明之某些化合物的合成中，使用以上羧酸烷基酯中之每一者作為實施例1之步驟3中的起始物質。
實施例13. 經分離之N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-12-二氫吡啶-3-基)甲基)-1-((2R或2S,3R或3S)-3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲醯胺非對映異構體的合成(化合物261、266、267及302)
步驟1：2-甲基-1-(3-側氧基丁-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯
向2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯(5.0g，21.53mmol)於CH3CN(50mL)中之溶液中添加Cs2CO3(21.0g，64.58mmol)、碘化鉀(3.57g，21.53mmol)。在27℃下攪拌混合物30分鐘。隨後添加3-氯丁-2-酮(2.75g，25.83mmol)，且在70℃下攪拌混合物12小時。過濾混合物，且濃縮濾液。藉由管柱(洗提：石油醚：乙酸乙酯=50：1)來純化殘餘物，得 到呈黃綠色油狀之2-甲基-1-(3-側氧基丁-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯(3.23g，產率50%)。LCMS(M+H+)m/z：計算值303.37；實驗值302.9。1H NMR(400MHz,CDCl3)：ä 8.32-8.30(m,1H),8.25-8.23(m,1H),7.17-7.14(m,1H),5.50-5.44(m,1H),2.71(s,3H),1.96(s,3H),1.65-1.67(d,3H),1.64(s,9H)。
步驟2：1-(3-羥基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯
在0℃下向2-甲基-1-(3-側氧基丁-2-基)-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯(3.1g，10.25mmol)於甲醇(30mL)中之溶液中添加硼氫化鈉(0.30g，8.2mmol)。在30分鐘之後，在0℃下添加另一批次之硼氫化鈉(0.30g，8.2mmol)。在約2小時後反應完成之後，極謹慎地逐滴添加水(30mL)以淬滅反應。用CH2Cl2萃取混合物。經Na2SO4乾燥萃取物，過濾，且在真空下濃縮，得到呈黃色固體狀之1-(3-羥基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯(3.0g，產率96%)。LCMS(M+H+)m/z：計算值305.38；實驗值304.9。1H NMR(400MHz,CDCl3)：ä 8.31-8.29(m,1H),8.13-8.12(m,1H),7.11-7.07(m,1H),4.46-4.43(m,1H),4.12(m,1H),2.73(s,3H),1.58(s,9H),1.51-1.49(d,3H),0.92-0.91(d,3H)。
步驟3：1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯
向無水THF(20mL)中添加NaH(礦物油中60%，2.37g，59.14mmol)。隨後在27℃下攪拌混合物20分鐘，隨後添加1-(3-羥基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯(3.0g，9.86mmol)。在27℃下攪拌混合物1小時，隨後添加CH3I(13.99g，98.6mmol)。在27℃下攪拌混合物12小時，且隨後冷卻至0℃。添加飽和NH4Cl，且用CH2Cl2萃取。經硫酸鈉乾燥萃取物，過濾且濃縮，得到呈黃色油狀之1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯(3.2g，產率100%)。LCMS(M+H+)m/z：計算值319.41；實驗值318.9。
步驟4：1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸
向經預冷卻的1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸第三丁酯(3.0g，9.42mmol)於CH2Cl2(20mL)中之溶液中逐滴添加三氟乙酸(20mL)。在27℃下攪拌溶液1.5小時。在27℃下於真空下移除溶劑。殘餘物不經純化即用於下一步驟。LCMS(M+H+)m/z：計算值263.30；實驗值262.9。
步驟5：N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-1-(3-甲 氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲醯胺
向1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲酸(2.4g，9.15mmol)於DMF(30mL)中之溶液中添加TEA(4.2g，41.50mmol)、3-(胺甲基)-4-甲氧基-6-甲基吡啶-2(1H)-酮鹽酸鹽(2.1g，12.81mmol)。在27℃下攪拌10分鐘之後，冷卻混合物，且添加HATU(5.56g，14.64mmol)。在27℃下攪拌混合物72小時，且仍存在30%起始物質。隨後在80℃下加熱混合物5小時。用鹽水(100mL)稀釋溶液，且用CH2Cl2(100mL×3)萃取。合併萃取物且經Na2SO4乾燥。在真空下蒸發溶劑，且藉由急驟管柱(洗提劑：二氯甲烷：甲醇=95：5)來純化殘餘物，得到N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲醯胺(3.6g，產率95%)。
步驟6：N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲醯胺之分離：異構體(化合物261、266、267及302)：
藉由製備型HPLC(條件：管柱：SHIMADZU LC-8A，250×50mm×10μm；移動相A：含0.2%甲酸之水；移動相B：MeCN；管柱溫度：30℃；梯度：B：A 10%-50%)來純化來自步驟5之異構體混合物N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-1-(3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲醯胺，得到主要異構體對(化合物261與化合物266組合)(1.0g，純度98.8%)及次要異構體對(化合物267與化合物302組合)(180mg，純度63%)。藉由SFC(條件：管柱：Chiralpak AD 250×30mm×5μm；移動相A：超臨界CO2；移動相B：IPA+NH3‧H2O；梯度：B/A：75：25)來個別地分離所得異構體對，得到以下個別單一化合物： 化合物261，N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-1-((2R或2S,3R或3S)-3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲醯胺(主要異構體對；峰1)：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 8.173-8.157(m,1H),8.140-8.116(m,1H),7.582-7.555(m,1H),6.968-6.936(m,1H),5.927(s,1H),4.707-4.609(m,2H),4.348(s,1H),3.892(s,3H),2.869(s,3H),2.788(s,3H),2.173 (s,3H),1.644-1.627(d,3H),1.263-1.249(d,3H)。
化合物266，N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-1-((2R或2S,3R或3S)-3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲醯胺(主要異構體對；峰2)：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 8.179-8.163(m,1H),8.143-8.120(m,1H),7.558-7.531(m,1H),6.986-6.954(m,1H),5.931(s,1H),4.702-4.605(m,2H),3.897(s,3H),2.892(s,3H),2.789(s,3H),2.189(s,3H),1.647-1.629(d,3H),1.267-1.252(d,3H)。
化合物267，N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-1-((2R或2S,3R或3S)-3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲醯胺(次要異構體對；峰1)：1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ 8.174-8.162(d,1H),8.111-8.094(d,1H),7.551-7.526(m,1H),6.993-6.961(m,1H),5.935(s,1H),4.683-4.579(m,2H),3.887(s,3H),3.442(s,3H),2.753(s,3H),2.194(s,3H),1.695-1.678(d,3H),0.781-0.768(d,3H)。
化合物302，N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-1-((2R或2S,3R或3S)-3-甲氧基丁-2-基)-2-甲基-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-甲醯胺(次要異構體對；峰2)：1HNMR(400MHz,CDCl3)：δ 8.177-8.166(d,1H),8.122-8.104(d,1H),7.587-7.562(m,1H),6.984-6.952(m,1H),5.933(s,1H),4.698-4.591(m,2H),4.426(s,2H),3.983(s,3H),3.448(s,3H),2.764(s,3H),2.180(s,3H),1.701-1.684(d,3H),0.786-0.772(d,3H)。
實施例14. (±)-N-((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-苯基乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-甲醯胺之合成
步驟1：1-(3-甲氧基苯基)乙醇
在-78℃下向3-胺基-4-甲基吡啶(7g，64.8mmol)於無水THF(200mL)中之攪拌溶液中經20分鐘逐滴添加第二丁基鋰(150mL，環己烷中之1.3M，194mmol)。將溶液升溫至室溫且攪拌3小時。在-78℃下向反應中逐滴添加乙酸乙酯(2.3g，25.9mmol)，且在相同溫度下攪拌混合物2小時。向反應中經10分鐘逐滴添加甲醇(50mL)。將混合物升溫至室溫且攪拌1小時。添加半飽和NH4Cl(250mL)。用EA萃取混合物。用鹽水洗滌經合併之有機層，乾燥且濃縮，得到粗產物。藉由矽膠層析(石油醚/乙酸乙酯=10：1)來純化粗產物，得到2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(2.5g，73.5%)。
步驟2：2,2,2-三氯-1-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-基)乙酮：
在室溫下向2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶(2.5g，18.9mmol)及氯化鋁(5g，37.8mmol)於DCM(100mL)中之攪拌溶液中經0.5小時逐滴添加三氯乙醯氯(4.1g，22.7mmol)至反應中。在攪拌2小時之後，將反應冷卻至0℃，且用水(100mL)淬滅。藉由過濾來分離所得沈澱，得到2,2,2-三氯-1-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-基)乙酮，其不經進一步純化即用於下一步驟。假定產率100%。(5.24g)。
步驟3：2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-甲酸甲酯：
在室溫下攪拌2,2,2-三氯-1-(2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-基)乙酮(5.24g，18.9mmol)及KOH(1.2g，20.9mmol)於MeOH(100mL)中之混合物16小時。濃縮反應混合物以移除MeOH，將殘餘物分配於EA與水之間。用鹽水洗滌有機層，乾燥且濃縮，得到2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-甲酸甲酯(3g，83%)。
步驟4：2-甲基-1-(1-苯乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-甲酸甲酯：
在室溫下攪拌2-甲基-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-甲酸甲酯(550mg，2.89mmol)及氫化鈉(200mg，4.34mmol)於N,N-二甲基甲醯胺(3.0mL)中之混合物0.5小時，且隨後添加(1-溴乙基)苯(589mg，3.18mmol)。在室溫下攪拌混合物3小時。將反應混合物傾入飽和NH4Cl中，且用乙酸乙酯萃取。合併有機層且濃縮，得到殘餘物。藉由層析(石油醚/乙酸乙酯=5：1)來純化殘餘物，得到2-甲基-1-(1-苯乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-甲酸甲酯(800mg，94%)。
步驟5：2-甲基-1-(1-苯乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-甲酸：
2-甲基-1-(1-苯乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-甲酸甲酯(800mg，2.72mmol)及KOH(1.5g，27.2mmol)於(15mL)及水(5mL)中之混合物回流2小時。藉由10% HCl將混合物pH值調節至2，且用EA萃取。用鹽 水洗滌經合併之有機層，乾燥且濃縮，得到粗產物。粗產物不經進一步純化即用於下一步驟中。產率100%。(760mg)。
步驟6：(±)-N-((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-苯乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-甲醯胺(化合物203)：
在室溫下攪拌2-甲基-1-(1-苯乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-甲酸(280mg，1.0mmol)添加HATU(456mg，1.2mmol)、TEA(1g，10mmol)及3-(胺甲基)-4,6-二甲基吡啶-2(1H)-酮(182mg，1.2mmol)於無水二氯甲烷(30mL)中之混合物16小時。向反應混合物添加水(10mL)，用二氯甲烷(30mL×2)萃取。合併有機層且濃縮，得到殘餘物。殘餘物自MeCN再結晶，得到呈灰白色固體狀之化合物N-((4,6-二甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-苯乙基)-1H-吡咯并[2,3-c]吡啶-3-甲醯胺(80mg，21.6%)。LRMS(M+H)m/z：計算值414.21；實驗值414。1H NMR(400MHz,甲醇-d4)δ：8.84(s,1H),8.16(d,J=7.6Hz,1H),8.03(d,J=6.8Hz,1H),7.44-7.37(m,5H),6.09(s,1H),6.01-5.99(m,1H),4.49(s,2H),2.73(s,3H),2.38(s,3H),2.22(s,3H),2.06(d,J=7.2Hz,3H)。
根據概述於此實施例中之通用程序使用適當起始物質及修改來製備顯示在下表中之化合物。結構顯示在圖1中。
實施例15. 用於合成本發明之其他化合物的通用程序
通用程序A：吲哚烷基化
向經冷卻(0℃)的NH吲哚酯(1當量)於N,N-二甲基甲醯胺(製得0.4M濃度之體積)中之溶液中添加氫化鈉(60% w/w，相對於吲哚1.1當量)。攪拌所得混合物15分鐘。隨後添加RX(2當量)，且使反應升溫至室溫。將反應維持在環境溫度下12小時。在攪拌下將反應混合物傾入飽和氯化銨溶液(100mL)中。用乙酸乙酯(200mL×2)萃取混合物，且用鹽水洗滌經合併之有機相，經硫酸鎂乾燥，過濾且濃縮，得到粗產物，藉由管柱層析(矽膠，石油醚/乙酸乙酯=20：1)來純化該粗產物，得到所需之烷基化吲哚酯產物。
通用程序B：烷基化吲哚酯的皂化
向烷基化吲哚酯(1當量)於四氫呋喃：甲醇：水(2.5：5：1，製得0.05M濃度之體積)中之溶液中添加氫氧化鋰(4當量)。在60℃下攪拌所得反應混合物48小時。在真空中濃縮混合物。隨後用水(40mL)稀釋殘餘物，且用1N氯化氫緩慢酸化至pH值=4-5。用乙酸乙酯(100mL×3)萃取混合物。用鹽水洗滌經合併之有機層，經硫酸鎂乾燥，過濾且濃縮，得到粗物質吲哚酸，該粗物質不經額外純化即用於後續步驟中。
通用程序C：醯胺鍵形成
向吲哚酸(1當量)於二氯甲烷(製得0.05M濃度之體積)中之溶液中添加1-羥基苯并三唑(1.5當量)、1-(3-二甲胺基丙基)-3-乙基碳化二亞胺鹽酸鹽(1.5當量)及三乙胺(3當量)。在室溫下攪拌所得混合物30分鐘。隨後添加吡啶酮胺(1.2當量)，且在室溫下攪拌所得混合物16小時。向混合物中添加水(50mL)。用二氯甲烷(100mL×2)萃取混合物。在真空中濃縮有機層，得到粗產物，藉由管柱層析(矽膠，二氯甲烷/甲醇=20：1)來純化該粗產物，得到目標化合物。
通用程序D：手性層析
藉助於正相HPLC或SFC(超臨界二氧化碳流體層析)來實現手性化合物之分離。所分離之化合物典型地>95% ee。未測定手性中心之絕對組態。
通用程序L：磺醯化
在18℃下於N2下向手性胺(1當量)於二氯甲烷(製得0.1M濃度之體積)中之溶液中添加三乙胺(4當量)。將反應冷卻至0℃，且添加甲磺醯氯(1.5當量)。在0℃下攪拌反應1小時。隨後在真空中濃縮混合物，且添加甲醇及碳酸鉀，且再攪拌反應1小時。過濾混合物，且藉由製備型HPLC來純化粗產物。
下表列舉本發明之化合物及以上通用方法中之哪一個用於其合成。此等化合物之結構闡述於圖1中。
實施例16. 使用EZH2對抑制劑之IC 50 量測
EZH2分析：藉由在放射性標記之酵素輔因子S-腺苷-L-甲硫胺酸(3H SAM)(Perkin Elmer)存在下將rPRC2與生物素標記之寡核小體受質混合在一起且監測氚化甲基自3H SAM至組蛋白離胺酸殘基之酶促介導轉移來進行分析。藉由首先在經抗生蛋白鏈菌素(SAV)塗佈之閃爍板(FlashPlates)(Perkin Elmer)中捕獲生物素標記之寡核小體，繼而進行洗滌步驟以移除未 反應之3H SAM，且隨後在TopCount NXT 384孔板閃爍計數器(Perkin Elmer)上計數來量測所得氚化甲基組蛋白產物之量。EZH2之最終分析條件如下：50mM Tris緩衝液(pH值8.5)、1mM DTT、69μM Brij-35洗滌劑、5.0mM MgCl2、0.1mg/mL BSA、0.2μM 3H SAM、0.2μM生物素標記之寡核小體、3.6μM H3K27me3肽及2nM EZH2。
如下獲得化合物IC50量測值：首先在100% DMSO中將化合物溶解為10mM儲備溶液。藉由在384孔板(Echo；Labcyte)之10個孔中分配變化量之10mM化合物溶液，隨後使用純DMSO回填該等孔以保證所有孔均具有相同量之DMSO來產生十點劑量反應曲線。使用Multidrop Combi(ThermoFisher)來向分析板之各孔中添加12.5μL體積的分析緩衝液中之HMT酵素、H3K27me3肽及寡核小體受質。化合物與酵素一起預培育20分鐘，繼而藉由添加12.5μL的分析緩衝液中之3H SAM(最終體積=25μL)來引發甲基轉移酶反應。化合物之最終濃度介於最高預設濃度80μM至十個2倍稀釋步驟中的0.16μM之範圍內。反應進行60分鐘，且用每孔20μL 1.96mM SAH、50mM Tris(pH 8.5)、200mM EDTA淬滅。將停止之反應轉移至經SAV塗佈之閃爍板(Perkin Elmer)上，培育120分鐘，用洗板機洗滌，且隨後在TopCount NXT(1.0分鐘/孔)上讀取以量測在反應期間形成之甲基組蛋白產物的量。將甲基組蛋白產物之量與在0%及100%抑制對照孔中形成之產物量相比，計算得到在各種濃度之個別化合物存在下的%抑制。使用4參數擬合非線性曲線擬合套裝軟體(XLFIT，部分資料庫套裝，ActivityBase(IDBS))來計算IC50，其中四個參數為IC50、希爾斜率(Hill slope)、預過渡基線(0% INH)及後過渡基線(100% INH)；其中預設後兩個參數分 別固定為零及100%。
如上所述使用復水H3K27Me2寡核小體作為受質對Y641N EZH2進行分析。
表2顯示所選本發明化合物在EZH2及Y641N EZH2活性抑制分析中的活性。IC50值報告如下：「A」指示IC50值小於100nM；「B」指示IC50值為100nM至1μM；「C」指示IC50值對各酵素大於1μM且小於10μM；「D」指示IC50值對各酵素大於10μM；及「*(X μM)」指示在所測試化合物之最高濃度(亦即X μM)下未觀測到抑制。
實施例17. 抑制劑在海拉細胞分析(HeLa Cell Assays)中之EC50量測
H3K27me3 MSD海拉分析。計數胰蛋白酶化海拉細胞且在10% DMEM(Life Technologies，目錄#10569)中稀釋至5000個細胞/75微升。將75μL細胞置放在96孔平底板之各孔中且在37℃下培育4小時。向細胞中添加25μL測試化合物(在各種濃度下)，且在37℃下繼續培育96小時。隨後移除培養基，且用冰冷PBS沖洗細胞一次。向各孔中添加40μL冰冷MSD緩衝液AT(10mM HEPES(pH 7.9)、5mM MgCl2、0.25M蔗糖、Benzonase(1：10000)、1% Triton X-100，補充有新鮮1×蛋白酶抑制劑混合液及1mM 4-(2-胺基乙基)苯磺醯氟鹽酸鹽(AEBSF))，且將板置放於冰上30分鐘。隨後向各孔中添加10μL 5M NaCl，且在冰上繼續再培育15分鐘。上下吸液以使各孔中之材料懸浮，且隨後轉移至新的96孔板上。用補充有新鮮1×蛋白酶抑制劑混合液及1mM AEBSF(「無鹽無洗滌劑緩衝液」)的150μL冰冷20mM Tris(pH 7.5)、1mM EDTA、1mM EGTA沖洗空的孔，且轉移至新板中之各別孔中。隨後向溶胞物之各孔中添加300μL無鹽無洗滌劑緩衝液，且將板在-80℃下冷凍。
在同一天，用30微升/孔之總H3捕捉抗體(Millipore，目錄#MAB3422) 以PBS中1μg/mL濃度塗佈適當數量之MSD標準結合96孔板。首先藉由在板側面溫和輕拍，且隨後藉由在1000rpm下震盪板數分鐘來使抗體溶液均勻分佈。經抗體塗佈之板在4℃下儲存隔夜。
次日，將溶胞物解凍至室溫。用TBS-T(Tris緩衝生理食鹽水(Fisher Scientific，目錄#BP2471-1)+0.2% Tween-20)洗滌經抗體塗佈之MSD板3次。向各孔中添加150μL TBS-T中之5%阻斷劑A。覆蓋孔，且在震盪器上於室溫下震盪一小時。重複阻斷劑A步驟第二次。在移除阻斷劑之後，將25μL細胞溶胞物轉移至經各抗體塗佈之孔中。在室溫下震盪板2小時，移除溶胞物且再次用TBS-T中之阻斷劑A洗滌板。向各孔中添加25μL適當新鮮製備之抗體混合物(包括一級及二級抗體兩者)，且在室溫下震盪板1小時。所用抗體混合物為在下表中指示之彼等混合物的一者(或兩者)：
兩種H3抗體均自Cell Signalling(目錄#4499及9733)獲得。山羊抗兔抗體自Meso-Scale Discovery(目錄#R32AB-1)獲得。
隨後移除抗體混合物，且用阻斷劑A洗滌孔。隨後向各孔中添加150μL新鮮製備之1× MSD讀取緩衝液(Meso-Scale Discovery；目錄#R927C-2)，且在MSD Sector 2400讀板儀上讀取板。
使用分析輔助(Assay Assistant)(Constellation Pharmaceuticals公司內部產品)及Activity Base(IDBS有限公司,Surrey,UK)模板來分析資料。將資料檔案導入分析輔助，且指定分析條件。產生獨特分析ID，且將資料檔案輸出至Activity Base。在Activity Base上產生分析模板以分別量測H3K27me3 標記之劑量依賴性抑制及細胞活力。DMSO孔之讀數用於校正資料。使用Activity base軟體模型205(IDBS有限公司,Surrey,UK)來擬合所得曲線。使用SARview(IDBS有限公司,Surrey,UK)來檢查資料品質，驗證且整合為excel格式。
H3K27me3 Alpha海拉分析(AlphaLISA)。在雙重複384孔經組織培養物處理之板(目錄#781080；Greiner Bio One；Monroe,North Carolina)中接種十個不同劑量之各測試化合物(以3倍稀釋系列)。在培養物中生長之海拉細胞經胰蛋白酶化且使用Countess®細胞計數器(目錄#C10281；Life Technologies,Grand Island,NY)計數。在10% DMEM(目錄#10569-010 Life Technologies,Grand Island,NY)中將細胞稀釋至每毫升67,000個細胞，且使用Biotek MicroFloTM選擇分配器(BioTek Instruments公司Vermont,USA)將15μL(1,000個細胞)接種至384孔板之各孔中。在37℃/5% CO2下培育板72小時。雙重複板之一針對海拉分析經處理，另一者針對活力。
向針對AlphaLISA經處理之板中添加每孔5μL細胞-組蛋白溶解緩衝液(1×)(目錄#AL009F1 Perkin Elmer；Waltham,MA)，且於室溫下在板震盪器(型號#4625-Q Thermo Scientific；Waltham,MA)上低速培育板30分鐘。隨後，每孔添加10μL組蛋白萃取緩衝液(目錄#AL009F2；Perkin Elmer；Waltham,MA)，且於室溫下在板震盪器上低速進一步培育板20分鐘。隨後向各孔中添加每孔10μL的抗K27me3受體珠加生物素標記之抗組蛋白H3(C封端)抗體(最終稀釋至3nM)之5×混合物(目錄#AL118 Perkin Elmer；Waltham,MA)。用自所提供10×儲備液稀釋而產生之1×組蛋白偵測緩衝液(目錄#AL009F3 Perkin；Waltham,MA)稀釋受體珠，隨後稀釋抗組蛋白H3。 用鋁板密封物密封板，且在23℃下培育60分鐘。隨後添加10μL抗生蛋白鏈菌素供體珠(目錄#6760002 Perkin Elmer；Waltham,MA)之5×溶液(在1×組蛋白偵測緩衝液中最終為20μg/mL)，用鋁板密封物密封板，且在23℃下培育30分鐘。隨後使用EnVision-α讀取器(型號#2104 Perkin Elmer；Waltham,MA)來讀取板。
藉由向具有細胞及培養基之各孔中添加15μL Cell Titer Glo((目錄#G7571 Promega Madison,WI)來分析細胞活力。於室溫下在板震盪器上低速培育板15-20分鐘。隨後使用EnVision-Alpha讀取器(型號# 2104 Perkin Elmer；Waltham,MA)來讀取板。
使用分析輔助(Constellation Pharmaceuticals公司內部產品)及Activity Base(IDBS有限公司,Surrey,UK)模板來分析來自兩個分析之資料。將資料檔案導入分析輔助，且指定分析條件。產生獨特分析ID，且將資料檔案輸出至Activity Base。在Activity Base上產生分析模板以分別量測H3K27me3標記之劑量依賴性抑制及細胞活力。DMSO孔之讀數用於校正資料。使用Activity base軟體模型205(IDBS有限公司,Surrey,UK)來擬合所得曲線。使用SARview(IDBS有限公司,Surrey,UK)來檢查資料品質，驗證且整合為excel格式。
表3顯示所選本發明化合物在上述兩個不同海拉細胞分析中的活性。EC50值報告如下：「A」指示EC50值小於400nM；「B」指示EC50值為400nM至2μM；「C」指示EC50值對各酵素大於2μM且小於10μM；「D」指示EC50值對各酵素大於10μM；且「*(X μM)」指示在所測試化合物之最高濃度(亦即X μM)下未觀測到抑制。
實施例18. 腫瘤生長抑制分析
化合物362及365在雌性CB-17 SCID小鼠中之皮下Karpas422人類淋巴瘤異種移植物模型中的抗腫瘤功效如下。
動物
種類：小家鼠(Mus Musculus)
品系：CB-17 SCID小鼠
年齡：6-8週
性別：雌性
體重：18-22g
動物數量：50隻小鼠加備用
動物供應商：Shanghai SLAC Laboratory Animal有限公司
細胞培養
在37℃下於空氣中5% CO2之氛圍中維持試管內Karpas422腫瘤細胞為補充有10%熱不活化胎牛血清之RPMI1640培養基中的懸浮培養物。例行每週兩次繼代培養腫瘤細胞。收集在指數生長期中生長之細胞且計數以用於腫瘤接種。
腫瘤接種
在各小鼠右腰處皮下接種0.2ml PBS與基質膠(1：1)中之Karpas422腫瘤細胞(5×106)以用於腫瘤發展。腫瘤接種之後第23日為治療開始之後第0日，此時平均腫瘤尺寸達到約300mm。各組由10隻攜有腫瘤之小鼠組成。
腫瘤量測
使用測徑規在二維中每週三次量測腫瘤尺寸，且以mm3為單位使用公式：V=0.536 a×b 2 表示體積，其中a及b分別為腫瘤之長直徑及短直徑。隨後使用腫瘤尺寸來計算T/C值。T/C值(以百分比為單位)為抗腫瘤有效性之指示；T及C分別為在既定日的經治療組及對照組之平均體積。對各組使用公式：TGI(%)=[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)×100來計算TGI；Ti為在既定日的治療組之平均腫瘤體積；T0為在治療開始之日的治療組之平均腫瘤體 積；Vi為在與Ti同一日的媒劑對照組之平均腫瘤體積，且V0為在治療開始之日的媒劑組之平均腫瘤體積。
實驗終點及樣品收集
1).在治療開始之後第16日給藥6小時後在EPZ-6438組中收集血漿、腫瘤及肌肉。在治療開始之後第25日給藥1小時後在媒劑、CPI-524369、CPI-524416及CPI-591780組中收集血漿、腫瘤及肌肉。2).全部血液均在使用EDTA-K2作為抗凝劑之情況下自各動物獲得。將血漿分為兩個部分。第一部分用於PK分析；第二部分冷凍備用。3).腫瘤分為三個部分。第一部分快速冷凍用於PK；第二部分快速冷凍用於PD分析；第三部分冷凍備用。4).肌肉分為兩個部分。第一部分快速冷凍用於PK；第二部分冷凍備用。
腫瘤生長抑制分析

Claims (16)

  1. 一種具有結構式(Ⅱ)之化合物，
    Figure TWI629273B_C0001
    或其醫藥學上可接受之鹽，其中：A為CH或N；R1a係選自-C1-C2烷基及-O-(C1-C2烷基)，其中R1a視情況經一或多個氟取代；R4a是1-取代-哌啶-4-基；且R13係選自氫、鹵基、苯基、吡啶基及-O-(C1-C4烷基)。
  2. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中R1a係選自-OCH3、-CH3、-OCHF2及-CH2CH3。
  3. 如申請專利範圍第2項之化合物，其中該1-取代-哌啶-4-基為1-鹵基(C1-C3)烷基-哌啶-4-基。
  4. 如申請專利範圍第3項之化合物，其中R4a係選自1-(第三丁氧羰基)-哌啶-4-基、1-(異丁氧羰基)-哌啶-4-基、1-(異丙氧羰基)-哌啶-4-基、1-(2-氟乙基)-哌啶-4-基、1-(2,2-二氟乙基)-哌啶-4-基、1-(2,2,2-三氟乙基)-哌啶-4-基、1-(2-羥基異丁基)-哌啶-4-基、1-(羥基異丙基羰基)-哌啶-4-基、1-(乙氧基羰基甲基)-哌啶-4-基、1-(異丙基羰基)-哌啶-4-基、1-甲基哌啶-4-基、1-(甲基磺醯基)-哌啶-4-基、1-(乙基磺醯基)-哌啶-4-基、1-(異丙基磺醯基)-哌啶-4-基、1-(苯基)-哌啶-4-基、1-(氧呾-3-基)哌啶-4-基、1-(吡啶-2-基)-哌啶-4-基及1-(嘧啶-2-基)-哌啶-4-基。
  5. 如申請專利範圍第3項之化合物，其中R13係選自氫、氯、氟、-OCH(CH3)2、苯基及吡啶-2-基。
  6. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該化合物為N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲醯胺或其醫藥學上可接受之鹽。
  7. 如申請專利範圍第6項之化合物，其中該化合物為R-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1-(1-(1-(2,2,2-三氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-1H-吲哚-3-甲醯胺或其醫藥學上可接受之鹽。
  8. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該化合物為1-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醯胺或其醫藥學上可接受之鹽。
  9. 如申請專利範圍第8項之化合物，其中該化合物為R-1-(1-(1-(2,2-二氟乙基)哌啶-4-基)乙基)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醯胺或其醫藥學上可接受之鹽。
  10. 如申請專利範圍第1項之化合物，其中該化合物為1-(1-(1-乙基哌啶-4-基)乙基)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醯胺或其醫藥學上可接受之鹽。
  11. 如申請專利範圍第10項之化合物，其中該化合物為R-1-(1-(1-乙基哌啶-4-基)乙基)-N-((4-甲氧基-6-甲基-2-側氧基-1,2-二氫吡啶-3-基)甲基)-2-甲基-1H-吲哚-3-甲醯胺或其醫藥學上可接受之鹽。
  12. 一種醫藥組成物，其包含如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽；及醫藥學上可接受之載劑。
  13. 一種如申請專利範圍第1項至第11項中任一項之化合物或其醫藥學上可接受之鹽的用途，其用於製備用於治療與細胞增殖相關之疾病或病症的醫藥品。
  14. 如申請專利範圍第13項之用途，其中該疾病為癌症。
  15. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該癌症係選自乳癌、結腸癌、腎細胞癌、多形性神經膠質母細胞瘤癌、膀胱癌、黑色素瘤、支氣管癌、淋巴瘤及肝癌。
  16. 如申請專利範圍第14項之用途，其中該癌症是前列腺癌。
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