PT2197486E - Redução de infecções concomitantes em porcos através da utilização de antigénio de pcv2 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "REDUÇÃO DE INFECÇÕES CONCOMITANTES EM PORCOS ATRAVÉS DA UTILIZAÇÃO DE ANTIGÉNIO DE PCV2"

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

Este pedido contém uma listagem de sequências em formato de papel e em formato informático. A listagem de sequências das sequências é idêntica à incorporada no documento W006/072065.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Campo da Invenção: A presente invenção refere-se ao campo da medicina veterinária, em particular a doenças infecciosas. Além disso, a presente invenção refere-se a um método para a redução de infecções concomitantes em porcos, causadas por patogénios diferentes de PCV-2.

Antecedentes

Em 1996, uma nova doença emergente, designada "Sindrome de Deperdição Multissistémica Pós-desmame" (PMWS), foi descrita em referência a casos observados cinco anos antes no Canadá (Clark T. Patologia da Sindrome de Deperdição Multissistémica Pós-desmame de Porcos. 1996 p. 22-5) . 0 circovirus porcino de 1 tipo 2 (PCV2) foi identificado como um agente causativo essencial desta sindrome de doença. Entretanto, a PMWS foi observada em virtualmente todas as regiões do mundo gue produzem porcos (Brunborg IM, Moldai T, Jonassen CM. J Virol Methods, 15 de Dezembro de 2004; 122(2):171-8). Os porcos de 5 a 15 semanas de idade são, geralmente, mais afectados (Allan G, McNeilly F. PMWS/PCVD: Diagnóstico, Doença e Controlo: Que Sabemos? 16 de Julho de 2006-19 de Julho de 2006; 2006; Allan GM, et al., Vet Microbiol, 4 de Fevereiro de 2004; 98 (2):165-8; Chae C. Vet J, Julho de 2004; 168(1):41-9). Os sinais clínicos incluem um marcado aumento na taxa de mortalidade, deperdição, hipertrofia generalizada de nódulos linfáticos, sinais respiratórios e, ocasionalmente, palidez, icterícia e diarreia (Chae C. Vet J, Maio de 2005; 16 9 (3) : 326-36; Segales J. et al.

Vet Microbiol, 4 de Fevereiro de 2004; 98(2):151-8). Estes sinais clínicos não se verificam todos ao mesmo tempo numa única vara de porcos afectada por PMWS, mas parece que a expressão de sinais clínicos está indirectamente ligada a co-patogénios específicos de herdade, que têm como alvo, de um modo preferido, diferentes sistemas de órgãos (Krakowka S. et al., Vet Pathol, Janeiro de 2001; 38(1):31-42). As investigações epidemiológicas mostraram que o vírus da sindrome reprodutiva e respiratória porcina (PRRSV), vírus da influenza suína (SIV), parvovírus porcino (PPV), Haemophilus parasuis, Actinobacillus pleuropneumoniae (APP), Streptococcus suis e Mycoplasma hyopneumoniae (Chae C. Vet J, Julho de 2004; 168(1):41-9) se verificam, mais geralmente, em combinação com a sindrome de doença.

Para a produção de PMWS, a activação do sistema imunitário foi postulada como sendo o evento central (Krakowka S. et al., Vet Pathol, Janeiro de 2001; 38(1):31-42). Embora a inoculação 2 experimental com PCV2 isoladamente apenas tenha produzido infecções clinicamente assintomáticas e uma evidência histológica muito modesta de inflamação, a infecção dual com PCV2 e PPV ou PRRSV resultou em sinais clínicos mais graves, lesões grosseiras e histológicas, uma carga virai de PCV2 mais alargada e mais elevada dentro de tecidos afectados. Estas verificações parecem ser predominantemente causadas por PCV2, visto que a infecção com PRRSV ou PPV isoladamente não resultou em sinais ou lesões clínicas comparáveis (Allan et al., J Comp Pathol, Julho de 1999; 121(1) :1-11; Allan GM, et al., Arch Virol, 2000; 145(11):2421-9; Harms PA, et al., Vet Pathol, Setembro de 2001; 38 (5) :52 8-3 9; Krakowka S, et al., Vet Pathol,

Maio de 2000; 3 7 (3):254-63,- Ostanello F, et ai., Vet Microbiol, 1 de Julho de 2005; 108 (3-4) :179-86,- Rovira A, et ai., J Virol, Abril de 2002; 76 (7) :3232-9) . Além disso, um aumento semelhante na gravidade da doença também podia ser alcançado na ausência de outros agentes co-infectantes, se os porcos fossem imunoestimulados com hemocianina de lapa californiana em adjuvante incompleto de Freund (KLH/ICFA) (Krakowka S. et ai., Vet Pathol, Janeiro de 2001; 38(1):31-42).

Os efeitos de PCV2 no sistema imunitário do porco não são totalmente conhecidos. Foi referido que as principais células alvo para a replicação de PCV2 são a linhagem de monócitos/macrófagos, assim como outras células de apresentação de antigénios, tal como células dendríticas foliculares (Darwich L, et al., Arch Virol, Maio de 2004; 1.49(5):857-74). Vários

estudos sugeriram que o PCV2 infecta células em divisão, macrófagos e linfócitos B, induzindo a apoptose das células B, que conduz à lesão de tecidos linfóides, resultando em extensa depleção de linfócitos (Darwich L, et al. , Arch Virol, Maio de 2004; 149(5):857-74). Particularmente, porcos afectados com PMWS 3 mostraram infiltração histiocítica e depleção de linfócitos de centros foliculares e zonas parafoliculares, sintomas associados à presença de PCV2 (Segales J. et al. Vet Microbiol, 4 de Fevereiro de 2004; 98(2):151-8; Darwich L, et al. Arch Virol,

Maio de 2004; 149(5):857-74). Estes factos levaram a que alguns sugerissem que a infecção por PCV2 poderia causar imunossupressão (Darwich L, et al., Arch Virol, Maio de 2004; 149 (5) : 857-74; Krakowka S, et al. Virai Immunol, 2002; 15(4):567-82).

As abordagens para tratar infecções por PCV2, em particular, PMWS, baseadas numa vacina de ADN são descritas na Patente U.S. N° 6703023. No documento WO 03/049703 é descrita a produção de uma vacina quimérica viva, compreendendo uma estrutura de PCV1, na qual um gene imunogénico de uma estirpe de PCV2 patogénica substitui um gene da estrutura de PCV1. O documento W099/18214 proporcionou várias estirpes de PCV2 e processos para a preparação de uma vacina de PCV2 morta. Uma vacina de subunidade baseada em ORF-2 eficaz foi referida no documento W006/072065. Quaisquer dessas vacinas destinam-se a ser utilizadas para a vacinação/tratamento de suinos contra PMWS. O documento WO 2006/113372 A2 divulga a utilização médica de uma vacina de combinação compreendendo, pelo menos, um antigénio de Helicobacter e, pelo menos, um antigénio de circovirus porcino e um veiculo ou excipiente veterinariamente aceitável para a dedução de uma resposta imunológica contra uma espécie de Helicobacter e circovirus porcino. Não existe referência acerca do potencial impacto de infecções por PCV2 na incidência de infecções concomitantes, 4 suínos relevantes. causadas por diversos patogénios Particularmente, nada é referido acerca do potencial impacto de PCV2 em patogénios específicos, tais como Actlnobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Mycoplasma hyorhinis, Pasteurella multocida, PRRSV, Salmonella spp., SIV ou Streptococcus suis. Além disso, mesmo que, durante um curto tempo, sejam conhecidas diferentes vacinas de PCV2, ainda não se conhece o seu impacto em infecções concomitantes diferentes de PCV2 em suínos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Perfil de viremia de PCV2. As amostras sanguíneas de animais pré-seleccionados tratados com placebo (Figura IA; n=110) e animais vacinados (Figura 1B; n=110) foram recolhidas nos intervalos de tempo indicados. Com base nos resultados de PCR quantitativo, os animais foram agrupados em classes de animais com cargas virais subclínicas (104 - 106 gE/mL) e cargas virais relevantes clínicas (> 106 gE/mL). As barras a branco representam a proporção de animais com cargas virais subclínicas e as barras a negro ilustram a proporção de animais com cargas virais relevantes clínicas por dia de amostragem.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se na verificação, surpreendente, de que a vacina de PCV2 consegue, não apenas reduzir a percentagem de infecções por PCV2 em porcos, ou uma vara de porcos, mas também a percentagem de infecções 5 concomitantes causadas por patogénios diferentes de circovírus, em particular, diferentes de PCV2.

Por conseguinte, de acordo com um aspecto, a presente divulgação refere-se a um método para a redução da percentagem de infecções concomitantes em porcos ou uma vara de porcos, causadas por patogénios diferentes de PCV2, compreendendo a etapa de administrar ao(s) referido(s) porco(s) uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2. 0 termo "infecções concomitantes", como aqui utilizado, deverá significar, mas não está limitado a qualquer infecção de suíno causada por patogénios virais, bacterianos ou fúngicos diferentes de circovírus, em particular, diferentes de PCV2. 0 termo "patogénio concomitante", como aqui utilizado, significa mas não está limitado a um patogénio de suíno diferente de circovírus, em particular, diferente de PCV2. Deste modo, de acordo com outro aspecto, a presente divulgação proporciona um método para a redução da percentagem de infecções concomitantes em porcos ou uma vara de porcos, causadas por um ou mais patogénios virais, bacterianos ou fúngicos diferentes de circovírus, em particular, diferentes de PCV2, compreendendo a etapa de administrar ao (s) referido (s) porco (s) uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2. De um modo preferido, as infecções concomitantes são causadas por um ou mais patogénios bacterianos, virais ou fúngicos, ou suas combinações. De um modo mais preferido, as infecções concomitantes são causadas por um ou mais patogénios bacterianos ou virais, ou uma sua combinação. 6

De acordo com outro aspecto da presente invenção, o termo "infecções concomitantes" também significa que o porco infectado com um ou mais patogénios concomitantes diferentes de circovirus, em particular, diferentes de PCV2, é co-infectado com PCV2. Deste modo, de acordo com outro aspecto, a presente divulgação proporciona um método para a redução da percentagem de infecções concomitantes em porcos ou uma vara de porcos, co-infectados com PCV2, em que as infecções concomitantes são causadas por um ou mais patogénios diferentes de circovirus, em particular, diferentes de PCV2, compreendendo a etapa de administrar ao(s) referido(s) porco (s) uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2. De um modo preferido, as infecções concomitantes são causadas por um ou mais patogénios virais, bacterianos ou fúngicos diferentes de circovirus, em particular, diferentes de PCV2. 0 termo "co-infectado com PCV2", como aqui utilizado, significa, mas não está limitado a qualquer forma de co-infecção com PCR2, o que significa que a infecção por PCV2 ocorre antes, simultaneamente ou após a infecção com os patogénios que são diferentes de circovirus, em particular, diferentes de PCV2. Também inclui cursos subclinicos, clínicos aparentes, fulminantes e crónicos de infecções por PCV2. Neste contexto, os cursos aparentes não estão limitados a PMWS, mas também incluem quaisquer outras manifestações clinicas de infecções por PCV2, tais como complexo de doença respiratória porcina (PRDC), dermatopatia porcina e síndrome de nefropatia (PDNS), insuficiência reprodutiva, enterite granulomatosa, potencialmente, tremores congénitos (CT-AII) e miocardite perinatal (Chae, Veterinary J., 2005; 169: 326-336). 7

Contudo, o termo "infecção concomitante" não significa, necessariamente, que o porco ou vara de porcos, esteja co-infectado com PCV2. 0 termo "infecção concomitante" também se refere, mas não está limitado a casos onde os porcos ou uma vara de porcos, está/estão exposto (s) a PCV2 ou onde existe um risco de ficar (ficarem) infectado(s) com PCV2. Deste modo, de acordo com outro aspecto, a presente divulgação proporciona um método para a redução da percentagem de infecções concomitantes em porcos ou uma vara de porcos, expostos a PCV2 ou em perigo ou susceptiveis de ficarem infectados com PCV2, em que as infecções concomitantes são causadas por um ou mais patogénios diferentes de circovirus, em particular, diferentes de PCV2, compreendendo a etapa de administrar ao(s) referido(s) porco(s) uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2. De um modo preferido, as infecções concomitantes são causadas por um ou mais patogénios virais, bacterianos ou fúngicos diferentes de circovirus, em particular, diferentes de PCV2. 0 termo "a percentagem de infecções concomitantes é reduzida" deverá significar que o número de porcos infectados com um patogénio diferente de circovirus, para o referido patogénio, é reduzido para mais de 10%, de um modo preferido para mais de 20%, de um modo mais preferido, para mais de 30%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 40%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 50%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 60%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 80%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 100%, em comparação com um grupo de controlo não vacinado. Neste contexto, o termo "grupo de controlo não vacinado" deverá significar um grupo de porcos a que não é administrada uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2. Deste modo, de acordo com outro aspecto, a presente divulgação também proporciona um método para a redução da percentagem de infecções concomitantes em porcos ou uma vara de porcos, causadas por um patogénio diferente de PCV2, compreendendo a etapa de administrar ao(s) referido(s) porco(s) uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2, em que o número de porcos infectados com o referido patogénio diferente de circovirus, para o referido patogénio, é reduzido para mais de 10%, de um modo preferido para mais de 20%, de um modo mais preferido, para mais de 30%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 40%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 50%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 60%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 80%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 100%, em comparação com um grupo de controlo não vacinado. De um modo preferido, a infecção concomitante é causada por um patogénio virai, bacteriano ou fúngico diferente de circovirus, em particular, diferente de PCV2. De um modo mais preferido, os referidos porcos, ou vara de porcos, são co-infectados com PCV2, como definido acima, expostos a PCV2 ou em perigo ou susceptiveis de ficarem infectados com PCV2.

As infecções concomitantes causadas por um patogénio virai, bacteriano ou fúngico diferente de circovirus, em particular, diferente de PCV2, podem causar sintomas entéricos, respiratórios, reprodutivos, do sistema nervoso central ou locomotores nos animais infectados. A incidência de quaisquer daqueles sintomas clínicos, causados pelos respectivos patogénios, pode ser reduzida. Deste modo, de acordo com outro aspecto, a presente divulgação refere-se a um método para a redução da percentagem de infecções concomitantes em porcos, ou 9 uma vara de porcos, causadas por um ou mais patogénios entéricos, respiratórios, reprodutivos, do sistema nervoso central ou locomotores diferentes de PCV2, compreendendo a etapa de administrar ao (s) referido(s) porco (s) uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2. De um modo preferido, os referidos porcos são co-infectados com PCV2, como definido acima, expostos a PCV2 ou em perigo ou susceptíveis de ficarem infectados com PCV2. De um modo mais preferido, o número de porcos infectados com um patogénio entérico, respiratório, reprodutivo, do sistema nervoso central ou locomotor diferente de circovirus, para o referido patogénio entérico, respiratório, reprodutivo, do sistema nervoso central ou locomotor, é reduzido para mais de 10%, de um modo preferido, para mais de 20%, de um modo mais preferido, para mais de 30%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 40%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 50%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 60%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 80%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 100%, em comparação com um grupo de controlo não vacinado.

Os patogénios entéricos são, por exemplo, Lawsonia intracellularis, E. coli, Streptococcus suis, Clostridium spp., Salmonella spp., Brachyspira spp., rotavirus ou coronavirus. Os patogénios respiratórios são, por exemplo, PRRSV, Mycoplasma hyopneumoniae, M. hyorhinis. Os patogénios reprodutivos são, por exemplo, Leptospira spp., PRRSV, Chlamydia spp. Os patogénios locomotores são, por exemplo, S. suis, M. hyorhinis, Erysipelotrix rusiopathiae. Os patogénios do sistema nervoso central são, por exemplo, vírus da Pseudo-raiva, S. suis., Haemophilus sp. 10

Em geral, o termo "patogénio diferente de PCV2", significa, mas não está limitado a um ou mais dos patogénios seleccionados do grupo consistindo em: Actinobacillus suis; Arcanobacterium pyogenes; Actinobacillus pleuropneumonia (APP); Vírus da febre suína Africana; Aspergillus spp.; Astrovírus; Ascaris suum; Blastocystis spp.; Bordetella bronchlseptlca; Brachysplra spp., B. hyodysenteriae, B. pilosicoli; Brucella suis, Biovares 1, 2 e 3 de Brucella suis; Candida spp.; Vírus da febre suína clássica; Clostridium spp., em particular C. difficile, tipos A, B e C de C. perfringens, C. novyi, C. septicum, C. difficile, C. tetani; Chlamydia spp., Cryptosporldlum spp.; Vírus da encefalomiocardite; Eperythrozoonosis suis; Erysipelothrix ruhsiopathiae; Escherichia coli; Fusarium spp.; Haemophilus parasuis; Vírus da encefalomielite de hemoglutinação; Vírus da hepatite E; Vírus da encefalite Japonesa; Hyostrongylus rubidus;

Lawsonia intracellularis; Leptospira spp., L. australis L. canicola, L. grippotyphosa, L. pomona L. icterohaemorrhagicae, L. interrogans, L. tarassovi L. hardjo, L. sejroe, L. bratislava; Mannheimia haemolytica Vírus de Menangle; Mycobacterium spp. r M. avium M. intracellulare, M. tuberculosis; Mycoplasma spp., M. hyopneumoniae, M. hyorhinis; vírus Nipah; Oesophagostum spp., Oesophagostum dentatum, Oesophagostum quadrospinulatum; Pasteurella spp., P. multocida; Penicillium spp.; Adenovírus porcino; Citomegalovírus porcino; Calicivírus entéricos porcinos; Picornavírus entéricos porcinos; Parvovírus porcino; Coronavírus respiratório porcino; Vírus da PRRS; Vírus da pseudo-raiva; Reovírus; Rotavírus; Rubulavírus; Salmonella spp., S. typhimurium, S. choleraesuis, S. dublin; Sarcoptes spp.; Staphylococcus hyicus; Streptococcus spp., S. suis, S. porcinus, S. dysgalactiae, Subespécie equisimilis de S. dysgalactiae; Strongyloides ransomi; Herpesvírus suíno; Vírus influenza suíno; 11 Vírus da varíola suína; Vírus da gastroenterite transmissível; Trichuris spp.r Taenia spp., Trichinella spiralis; Vírus da estomatite vesicular; Vírus do exantema vesicular do suíno; Vírus do Nilo Ocidental; ou Yersina spp., Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica.

Deste modo, de acordo com outro aspecto, a presente divulgação refere-se a um método para a redução da percentagem de infecções concomitantes em porcos ou uma vara de porcos, causadas por um ou mais patogénios diferentes de PCV2, compreendendo a etapa de administrar ao(s) referido(s) porco (s) uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2, em que os patogénios que causam as infecções concomitantes são seleccionados do grupo consistindo em: Actinobacillus suis; Arcanobacterium pyogenes; Actinobacillus pleuropneumonia (APP); Virus da febre suína Africana; Aspergillus spp.; Astrovírus; Ascaris suum; Blastocystis spp.; Bordetella bronchiseptica; Brachyspira spp., B. hyodysenteriae, B. pilosicoli; Brucella suis, Biovares 1, 2 e 3 de Brucella suis; Candida spp.; Vírus da febre suína clássica; Clostridium spp., em particular, C. difficile, tipos A, B e C de C. perfringens, C. novyi, C. septicum, C. difficile, C. tetani; Chlamydia spp., Cryptosporidium spp.; Vírus da encefalomiocardite; Eperythrozoonosis suis; Erysipelothrix ruhsiopathiae; Escherichia coli; Fusarium spp.; Haemophilus parasuis; Vírus da encefalomielite de hemoglutinação; Virus da hepatite E; Vírus da encefalite Japonesa; Hyostrongylus rubidus; Lawsonia intracellularis; Leptospira spp., L. australis, L. canicola, L. grippotyphosa, L. pomona, L. icterohaemorrhagicae, L. interrogans, L. tarassovi, L. hardjo, L. sejroe, L. bratislava; Mannheimia haemolytica; Vírus de Menangle; 12

Mycobacterium spp., M. avium, M. intracellulare, M. tuberculosis; Mycoplasma spp., M. hyopneumoniae, M. hyorhinis; Vírus Nipah; Oesophagostum spp., Oesophagostum dentatum, Oesophagostum quadrospinulatum; Pasteurella spp., P. multocida; Penicillium spp.} Adenovírus porcino; Citomegalovírus porcino; Calicivírus entéricos porcinos; Picomavírus entéricos porcinos; Parvovírus porcino; Coronavírus respiratório porcino; Vírus da PRRS; Vírus da pseudo-raiva; Reovírus; Rotavírus; Rubulavírus; Salmonella spp., S. typhimurium, S. choleraesuis, S. dublin; Sarcoptes spp.} Staphylococcus hyicus; Streptococcus spp., S. suis, S. porcinus, S. dysgalactiae, Subespécie equisimilis de S. dysgalactiae; Strongyloides ransomi; Herpesvírus suíno; Vírus influenza suíno; Vírus da varíola suína; Vírus da gastroenterite transmissível; Trichuris spp., Taenia spp., Trichinella spiralis; Vírus da estomatite vesicular; Vírus do exantema vesicular do suíno; Vírus do Nilo Ocidental; ou Yersina spp., Y. pseudotuberculosis, Y. enterocolitica.

De um modo preferido, as referidas infecções concomitantes são causadas por um ou mais dos patogénios seleccionados do grupo consistindo em: Actinobacillus pleuropneumoniae·, Haemophilus parasuis; Mycoplasma hyrhinis; Pasteurella multocida} PRRS; Salmonella spp. e Streptococcus suis. De um modo muito preferido, as referidas infecções concomitantes são causadas por um ou mais dos patogénios seleccionados do grupo consistindo em: Actinobacillus pleuropneumoniae} Haemophilus parasuis} Mycoplasma hyrhinis·, Pasteurella multocida} PRRS; Salmonella spp. e Streptococcus suis. De um modo mais preferido, as referidas infecções concomitantes são causadas por um ou mais dos patogénios seleccionados do grupo consistindo em: 13

Actinobacillus pleuropneumoniae; Mycoplasma hyrhinis e PRRS. De um modo muito preferido, por Mycoplasma hyrhinis e/ou PRRS.

De um modo preferido, os referidos porcos são co-infectados com PCV2, como definido acima, expostos a PCV2, em perigo ou susceptiveis de ficarem infectados com PCV2. De um modo mais preferido, o número de porcos infectados com um ou mais dos referidos patogénios acima diferentes de circovírus, para os referidos patogénios, é reduzido para mais de 10%, de um modo preferido, para mais de 20%, de um modo mais preferido, para mais de 30%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 40%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 50%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 60%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 80%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 100%, em comparação com um grupo de controlo não vacinado. No caso de infecções múltiplas, as taxas de redução, como descrito acima, referem-se a cada patogénio especifico. Por exemplo, a redução de mais de 10% de infecções concomitantes num porco multiplamente infectado, significa que a taxa de infecção, com respeito a um patogénio especifico, é reduzida para mais de 10%. Não significa, necessariamente, que a taxa de infecção, com respeito a todos os patogénicos, seja reduzida para mais de 10%, em comparação com um grupo de controlo não vacinado ou com respeito a uma vara de porcos que menos de 10% dos porcos da referida vara estejam infectados pela totalidade dos referidos patogénios.

Os termos "antigénio de PCV2", como aqui utilizados, referem-se a uma sequência de aminoácidos que deduz uma resposta imunitária contra PCV2 num hospedeiro. Um antigénio, como aqui utilizado, inclui a sequência de comprimento completo de 14 quaisquer proteínas de PCV2, seus análogos ou seus fragmentos imunogénicos. 0 termo "fragmento imunogénico" refere-se a um fragmento de uma proteína que inclui um ou mais epitopos e, deste modo, deduz a resposta imunitária num hospedeiro. Esses fragmentos podem ser identificados utilizando qualquer número de técnicas de mapeamento epitópico, bem conhecidas na técnica. Ver, e. g., Protocolos de Mapeamento Epitópico em Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed. , 1996) Humana Press,

Totowa, Nova Jérsia. Por exemplo, os epitopos lineares podem ser determinados através, e. g., da síntese concorrente de um grande número de péptidos em suportes sólidos, os péptidos correspondendo a porções da molécula proteica e da reacção dos péptidos com anticorpos, enquanto os péptidos estão ainda ligados aos suportes. Essas técnicas são conhecidas na técnica e descritas em, e. g., Patente U.S. N° 4708871; Geysen et ai. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715. De modo semelhante, os epitopos conformacionais são facilmente identificados através da determinação da conformação espacial de aminoácidos, tais como por, e. g., cristalografia de raios X e ressonância magnética nuclear bidimensional. Ver, e. g., Protocolos de Mapeamento Epitópico, supra.

Os antigénios sintéticos também estão incluídos na definição, por exemplo, poliepitopos, epitopos flanqueantes e outros antigénios recombinantes ou sinteticamente derivados. Ver, e. g., Bergmann et al., (1993) Eur. J. Immunol. 23:2.777-2781; Bergmann et al., (1996), J. Immunol. 157:3242-3249; Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 15 75:402-408; Gardner et al., (1998) 12a Conferência Mundial de SIDA, Genebra, Suíça, 28 de Junho - 3 de Julho, 1998.

Uma "resposta imunitária" significa, mas não está limitada ao desenvolvimento, num hospedeiro, de uma resposta imunitária celular e/ou de anticorpo a um antigénio, uma composição imunogénica ou vacina de interesse. Habitualmente, uma "resposta imunitária" inclui, mas não está limitada a, um ou mais dos seguintes efeitos: produção ou activação de anticorpos, células B, células T auxiliares, células T supressoras e/ou células T citotóxicas, dirigidos especificamente a um antigénio ou antigénios incluídos na composição ou vacina de interesse. De um modo preferido, o hospedeiro exibirá uma resposta imunológica terapêutica ou protectora (memória), de modo a que a resistência a nova infecção seja melhorada e/ou a gravidade clínica da doença reduzida. Essa protecção será demonstrada por uma redução no número ou gravidade ou ausência de um ou mais dos sintomas associados a infecções por PCV2, no atraso do começo da viremia, numa persistência virai reduzida, numa redução da carga virai global e/ou uma redução da excreção virai.

Os termos "composição imunogénica" ou "vacina" (ambos os termos são utilizados sinonimamente), como aqui utilizados, referem-se a qualquer composição farmacêutica contendo um antigénio de PCV2, cuja composição pode ser utilizada para prevenir ou tratar uma doença ou estado associado a infecção por PCV2 num indivíduo. Uma composição imunogénica preferida pode induzir, estimular ou melhorar a resposta imunitária contra PCV2. Deste modo, o termo abrange composições imunogénicas subunitárias, como descrito abaixo, assim como composições contendo PCV2 intacto morto ou atenuado e/ou inactivado. 16

Deste modo, de acordo com um aspecto, a presente divulgação refere-se a um método para a redução da percentagem de infecções concomitantes em porcos ou uma vara de porcos, causadas por um ou mais patogénios diferentes de PCV2, compreendendo a etapa de administrar ao(s) referido(s) porco(s) uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2, em que a composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2 é uma composição imunogénica subunitária, uma composição contendo PCV2 intacto morto ou atenuado e/ou inactivado. De um modo preferido, os referidos porcos são co-infectados com PCV2, como definido acima, expostos a PCV2 ou em perigo ou susceptíveis de ficarem infectados com PCV2. De um modo mais preferido, o número de porcos infectados com os referidos patogénios diferentes de circovírus, com respeito a um ou mais dos referidos patogénios, é reduzido para mais de 10%, de um modo preferido, para mais de 20%, de um modo mais preferido, para mais de 30%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 40%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 50%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 60%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 80%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 100%, em comparação com um grupo de controlo não vacinado. O termo "composição imunogénica subunitária", como aqui utilizado, refere-se a uma composição contendo, pelo menos, um polipéptido ou antigénio imunogénico, mas não todos os antigénios, derivados ou homólogos a um antigénio de PCV2. Essa composição é substancialmente isenta de PCV2 intacto. Deste modo, uma "composição imunogénica subunitária" é preparada a partir de, pelo menos, polipéptidos imunogénicos parcialmente purificados ou fraccionados (de um modo preferido, substancialmente purificados) de PCV2 ou seus análogos 17 recombinantes. Uma composição imunogénica subunitária pode compreender o antigénio ou antigénios subunitários de interesse substancialmente isentos de outros antigénios ou polipéptidos de PCV2 ou na forma fraccionada. Uma composição imunogénica subunitária preferida compreende a proteína ORF-2 de PCV2, como descrito abaixo. São muito preferidas as composições imunogénicas subunitárias que compreendem qualquer dos antigénios de PCV2 proporcionados no documento WO06/072065, que são todos aqui incorporados por referência na sua totalidade.

De acordo com mais um aspecto, a composição imunogénica, como aqui utilizada, compreende, de um modo muito preferido, o polipéptido, ou um seu fragmento, expresso por ORF-2 de PCV2. ADN e proteína ORF-2 de PCV2, aqui utilizados para a preparação das composições e dentro dos processos aqui proporcionados, é um domínio altamente conservado dentro de isolados de PCV2 e, desse modo, qualquer ORF-2 de PCV2 seria eficaz como fonte do ADN e/ou polipéptido ORF-2 de PCV2 como aqui utilizado. Uma proteína ORF-2 de PCV2 preferida é a da SEQ ID N° 11 do documento W006/072065. Um polipéptido ORF-2 de PCV adicional preferido é proporcionado como SEQ ID N° 5 do documento W006/072065. Contudo, é compreendido pelos especialistas na técnica que esta sequência poderá variar tanto quanto 6-10% em homologia de sequência e ainda reter as características antigénicas que a tornam útil em composições imunogénicas. As características antigénicas de uma composição imunológica podem ser, por exemplo, estimadas pela experiência de provocação, como proporcionada pelo Exemplo 4 do documento W006/072065. Além disso, a característica antigénica de um antigénio modificado é ainda retida, quando o antigénio modificado confere, pelo menos, 70%, de um modo preferido, 80%, de um modo mais preferido, 90% da imunidade protectora, em comparação com a proteína ORF-2 de 18 PCV2, codificada pela sequência polinucleotídica de SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4, como proporcionada no documento W006/072065.

Deste modo, de acordo com um aspecto, a presente divulgação refere-se a um método para a redução da percentagem de infecções concomitantes em porcos ou uma vara de porcos, causadas por patogénios diferentes de PCV2, compreendendo a etapa de administrar ao(s) referido(s) porco (s) uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2, em que o antigénio de PCV2 é um antigénio da proteína ORF-2 de PCV2 que tem, pelo menos, 70%, de um modo preferido, 80%, de um modo ainda mais preferido, 90% da imunidade protectora, em comparação com a proteína ORF-2 de PCV2, codificada pela sequência polinucleotídica de SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4, como proporcionada no documento W006/072065. De um modo preferido, a referida ORF-2 de PCV2 tem a sequência de SEQ ID N° 11 ou SEQ ID N° 5 do documento W006/072065. De um modo preferido, os referidos porcos são co-infectados com PCV2, como definido acima, expostos a PCV2 ou em perigo ou susceptíveis de ficarem infectados com PCV2. De um modo mais preferido, o número de porcos infectados com os referidos patogénios diferentes de circovírus, é reduzido para mais de 40%, de um modo preferido, para mais de 50%, de um modo mais preferido, para mais de 60%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 80%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 100%, em comparação com um grupo de controlo não vacinado.

Em algumas formas, as porções imunogénicas da proteína ORF-2 de PCV2 são utilizadas como o componente antigénico na composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2. O termo "porção imunogénica", como aqui utilizado, refere-se a formas truncadas e/ou substituídas, ou fragmentos da proteína e/ou 19 polinucleótido ORF-2 de PCV2, respectivamente. De um modo preferido, essas formas truncadas e/ou substituídas, ou fragmentos, compreenderão, pelo menos, 6 aminoácidos contíguos do polipéptido ORF-2 de comprimento completo. De um modo mais preferido, as formas truncadas ou substituídas ou fragmentos, terão, pelo menos, 10, de um modo mais preferido, pelo menos, 15 e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 19 aminoácidos contíguos do polipéptido ORF-2 de PCV de comprimento completo. A esse respeito, duas sequências preferidas são proporcionadas como SEQ ID N° 9 e SEQ ID N° 10 do documento W006/072065. É ainda compreendido que essas sequências podem ser uma parte de fragmentos maiores ou formas truncadas.

Como mencionado acima, um polipéptido ORF-2 de PCV2 preferido adicional é qualquer um codificado pelas sequências nucleotídicas de SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4. Contudo, é compreendido pelos especialistas na técnica que esta sequência poderá variar tanto quanto 6-20% em homologia de sequência e ainda reter as características antigénicas que a tornam útil em composições imunogénicas. Em algumas formas, uma forma truncada ou substituída, ou fragmento, deste polipéptido ORF-2 de PVC2, é utilizada como o componente antigénico na composição. De um modo preferido, essas formas truncadas ou substituídas, ou fragmentos, compreenderão, pelo menos, 18 nucleótidos contíguos da sequência nucleotídica ORF-2 de PCV2 de comprimento completo, e. g., da SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4. De um modo mais preferido, as formas truncadas ou substituídas, ou fragmentos, terão, pelo menos, 30, de um modo mais preferido, pelo menos, 45 e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 57 nucleótidos contíguos da sequência nucleotídica ORF-2 de PCV2 de comprimento completo, e. g.r SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4. 20 "Identidade de sequência", como é conhecido na técnica, refere-se a uma relação entre duas ou mais sequências polipeptidicas ou duas ou mais sequências polinucleotídicas, nomeadamente, uma sequência de referência e uma sequência dada a ser comparada com a sequência de referência. A identidade de sequência é determinada através da comparação da sequência dada à sequência de referência, após as sequências terem sido alinhadas de um modo óptimo, para produzir o qrau mais elevado de semelhança de sequência, como determinado pela correspondência entre segmentos dessas sequências. Após esse alinhamento, a identidade de sequência é averiguada posição-a-posição, e. g. , as sequências são "idênticas" numa particular posição se, nessa posição, os nucleótidos ou residuos de aminoácidos forem idênticos. 0 número total dessas identidades de posição é, depois, dividido pelo número total de nucleótidos ou residuos na sequência de referência, para dar a % de identidade de sequência. A identidade de sequência pode ser facilmente calculada por métodos conhecidos, incluindo, mas não limitados, aos descritos em Biologia Molecular Computacional, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, Nova Iorque (1988), Biocomputação: Informática e Projectos do Genoma, Smith, D.W. ed., Academic Press, Nova Iorque (1993); Análise Informática de Dados de Sequência, Parte I, Griffin, A.M. e Griffin, H. G., ed., Humana Press, Nova Jérsia (1994); Análise de Sequência em Biologia Molecular, von Heinge, G., Academic Press (1987); Iniciador de Análise de Sequência, Gribskov, M. e Devereux, J., ed., M. Stockton Press, Nova Iorque (1991); e Carillo, H. e Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988), cujos ensinamentos são aqui incorporados por referência. Os métodos preferidos para determinar a identidade de sequência são concebidos para proporcionarem a maior correspondência entre as sequências testadas. Os métodos para determinar a identidade de 21 sequência são codificados em programas de computador publicamente disponíveis, que determinam a identidade de sequência entre sequências dadas. Exemplos desses programas incluem, mas não estão limitados, ao pacote do programa GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN e FASTA (Altschul, S. F. et ai., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). O programa BLASTX está publicamente disponível da NCBI e outras fontes (BLAST Manual, Altschul, S. et ai., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990), cujos ensinamentos são aqui incorporados por referência). Estes programas alinham sequências de um modo óptimo, utilizando as ponderações de lacuna predefinidas, de modo a produzir o nível de identidade de sequência mais elevado entre as sequências dada e de referência. Como ilustração, por polinucleótido tendo uma sequência nucleotídica tendo, pelo menos, por exemplo, 85%, de um modo preferido, 90%, de um modo ainda mais preferido, 95%, de "identidade de sequência" com uma sequência nucleotídica de referência, significa-se que a sequência nucleotídica do dado polinucleótido é idêntica com a sequência de referência, excepto que a sequência polinucleotídica pode incluir até 15, de um modo preferido, até 10, de um modo ainda mais preferido, até 5 mutações pontuais por cada 100 nucleótidos da sequência nucleotídica de referência. Por outras palavras, num polinucleótido tendo uma sequência nucleotídica tendo, pelo menos, 85%, de um modo preferido, 90%, de um modo ainda mais preferido, 95% de identidade em relação à sequência nucleotídica de referência, até 15%, de um modo preferido, 10%, de um modo ainda mais preferido, 5% dos nucleótidos na sequência de referência podem ser delecionados ou substituídos com outro nucleótido ou um número de nucleótidos até 15%, de um modo preferido, 10%, de um modo ainda mais preferido, 5% dos 22 nucleótidos totais na sequência de referência podem ser inseridos dentro da sequência de referência. Estas mutações da sequência de referência podem ocorrer nas posições 5' ou 3' terminais da sequência nucleotidica de referência ou em qualquer parte entre essas posições terminais, interdispersas individualmente entre nucleótidos na sequência de referência ou num ou mais grupos contíguos dentro da sequência de referência. De modo análogo, por polipéptido tendo uma dada sequência de aminoácidos tendo, pelo menos, por exemplo, 85%, de um modo preferido, 90%, de um modo ainda mais preferido, 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de referência, significa-se que a dada sequência de aminoácidos do polipéptido é idêntica à sequência de referência, excepto que a dada sequência polipeptídica pode incluir até 15, de um modo preferido, até 10, de um modo ainda mais preferido, até 5 alterações de aminoácidos por cada 100 aminoácidos da sequência de aminoácidos de referência. Por outras palavras, para se obter uma dada sequência polipeptídica tendo, pelo menos, 85%, de um modo preferido, 90%, de um modo ainda mais preferido, 95% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de referência, até 15%, de um modo preferido, até 10%, de um modo ainda mais preferido, até 5% dos resíduos de aminoácidos na sequência de referência podem ser delecionados ou substituídos com outro aminoácido ou um número de aminoácidos até 15%, de um modo preferido, até 10%, de um modo ainda mais preferido, até 5% do número total de resíduos de aminoácidos na sequência de referência pode ser inserido dentro da sequência de referência. Estas alterações da sequência de referência podem ocorrer nas posições amino ou carboxilo terminais da sequência de aminoácidos de referência ou em qualquer parte entre essas posições terminais, interdispersas individualmente entre resíduos na sequência de referência ou num ou mais grupos 23 contíguos dentro da sequência de referência. De um modo preferido, as posições de resíduos que não são idênticas diferem por substituições conservativas de aminoácidos. Contudo, quando se determina a identidade de sequência, as substituições conservativas não estão incluídas como uma correspondência. "Homologia de sequência", como aqui utilizado, refere-se a um método de determinar o parentesco de duas sequências. Para determinar a homologia de sequência, duas ou mais sequências são alinhadas de um modo óptimo e, se necessário, são introduzidas lacunas. Contudo, em contraste com "identidade de sequência", quando se determina a homologia de sequência, as substituições conservativas de aminoácidos são contadas como uma correspondência. Por outras palavras, para se obter um polipéptido ou polinucleótido tendo 95% de homologia de sequência com uma sequência de referência, 85%, de um modo preferido, 90%, de um modo ainda mais preferido, 95% dos resíduos de aminoácidos ou nucleótidos na sequência de referência devem corresponder ou compreender uma substituição conservativa com outro aminoácido ou nucleótido, ou um número de aminoácidos ou nucleótidos até 15%, de um modo preferido, até 10%, de um modo ainda mais preferido, até 5% dos resíduos totais de aminoácidos ou nucleótidos, não incluindo substituições conservativas, na sequência de referência podem ser inseridos dentro da sequência de referência. De um modo preferido, a sequência homóloga compreende, pelo menos, um segmento de 50, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 100, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 250 e, de um modo ainda mais preferido, pelo menos, 500 nucleótidos.

Uma "substituição conservativa" refere-se à substituição de um resíduo de aminoácido ou nucleótido com outro resíduo de aminoácido ou nucleótido tendo características semelhantes ou apropriadas, incluindo tamanho, hidrofobicidade, etc., de modo a que a funcionalidade global não se altere significativamente. "Isolado" significa alterado "pela mão do homem" desde o seu estado natural, i. e., se ocorrer na natureza, foi alterado ou removido do seu ambiente natural, ou ambos. Por exemplo, um polinucleótido ou polipéptido naturalmente presente num organismo vivo não está "isolado", mas o mesmo polinucleótido ou polipéptido separado dos materiais coexistentes do seu estado natural está "isolado", como o termo é aqui empregue.

Deste modo, de acordo com um aspecto, a presente divulgação refere-se a um método para a redução da percentagem de infecções concomitantes em porcos ou uma vara de porcos, causadas por um ou mais patogénios diferentes de PCV2, compreendendo a etapa de administrar ao(s) referido(s) porco(s) uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2, em que a referida proteína ORF-2 de PCV2 é qualquer uma dessas acima descritas: De um modo preferido, a referida proteína ORF-2 de PCV2 é

i) um polipéptido compreendendo a sequência de SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10 OU SEQ ID N° 11 do documento W006/07065; ii) qualquer polipéptido que seja, pelo menos, 80% homólogo ao polipéptido de i) , iii) qualquer porção imunogénica dos polipéptidos de i) e/ou ii) iv) a porção imunogénica de iii), compreendendo, pelo menos, 10 aminoácidos contíguos incluídos nas sequências de SEQ ID N° 5, SEQ ID N° 6, SEQ ID N° 9, SEQ ID N° 10 OU SEQ ID N° 11 do documento W006/072065, 25 v) um polipéptido que é codificado por um ADN compreendendo a sequência de SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4 do documento W006/072065. vi) qualquer polipéptido que é codificado por um polinucleótido que é, pelo menos, 80% homólogo ao polinucleótido de v), vii) qualquer porção imunogénica dos polipéptidos codificados pelos polinucleótidos de v) e/ou vi) viii) a porção imunogénica de vii), em que o polinucleótido codificando para a referida porção imunogénica compreende, pelo menos, 30 nucleótidos contíguos incluídos na sequência de SEQ ID N° 3, ou SEQ ID N° 4 do documento W006/072065.

De um modo preferido, qualquer das porções imunogénicas tem as caracteristicas imunogénicas da proteína ORF-2 de PCV2, que é codificada pela sequência de SEQ ID N° 3 ou SEQ ID N° 4 do documento W006/07065.

De um modo preferido, os referidos porcos infectados são co-infectados com PCV2, como definido acima, expostos a PCV2 ou em perigo ou susceptíveis de ficarem infectados com PCV2. De um modo mais preferido, o número de porcos infectados com os referidos patogénios diferentes de circovírus, com respeito a um ou mais do referido patogénio, é reduzido para mais de 10%, de um modo preferido, para mais de 20%, de um modo mais preferido, para mais de 30%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 40%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 50%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 60%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 80%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 100%, em comparação com um grupo de controlo nao vacinado. 26

De acordo com um aspecto adicional, a proteína ORF-2 de PCV2 é proporcionada na composição imunogénica a um nível de inclusão de antigénio eficaz para o tratamento de animais subclinicamente injectados com PCV2. De um modo preferido, o nível de inclusão de proteína ORF-2 de PCV2 é, pelo menos, 0,2 pg de antigénio/mL da composição imunogénica final (pg/mL), de um modo mais preferido, desde cerca de 0,2 a cerca de 400 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,3 a cerca de 200 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,35 a cerca de 100 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,4 a cerca de 50 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,45 a cerca de 30 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,6 a cerca de 15 pg /mL, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0, 75 a cerca de 8 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 1,0 a cerca de 6 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 1,3 a cerca de 3,0 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 1,4 a cerca de 2,5 pg/mL, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 1,5 a cerca de 2,0 pg/mL e, de um modo muito preferido, cerca de 1,6 pg/mL.

De acordo com um aspecto adicional, o nível de inclusão de antigénio ORF-2 de PCV2 é, pelo menos, 0,2 pg/proteína ORF-2 de PCV2, como descrito acima, por dose da composição antigénica final (pg/dose ), de um modo mais preferido, desde cerca de 0,2 a cerca de 400 pg/dose, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,3 a cerca de 200 pg/dose, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,35 a cerca de 100 pg/dose, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,4 a cerca de 50 pg/dose, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,45 a cerca de 30 pg/dose, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 0,6 a cerca de 15 pg/dose, de um modo ainda mais 27 preferido, desde cerca de 0,75 a cerca de 8 yg/dose, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 1,0 a cerca de 6 yg/dose, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 1,3 a cerca de 3,0 yg/dose, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 1,4 a cerca de 2,5 yg/dose, de um modo ainda mais preferido, desde cerca de 1,5 a cerca de 2,0 yg/dose e, de um modo muito preferido, cerca de 1,6 yg/dose. O polipéptido ORF-2 de PCV2 utilizado na composição imunogénica, de acordo com a presente invenção, pode ser derivado de qualquer modo, incluindo isolamento e purificação de ORF2 de PCV2, síntese proteica corrente e metodologia recombinante. Os métodos preferidos para a obtenção de polipéptido ORF-2 de PCV2 são proporcionados no documento W006/072065, cujos ensinamentos e conteúdo são por este meio incorporados por referência na sua totalidade. Resumidamente, as células susceptíveis são infectadas com um vector virai recombinante contendo sequências codificantes de ADN de ORF-2 de PCV2, o polipéptido ORF-2 de PCV2 é expresso pelo vírus recombinante e o polipéptido ORF-2 de PCV2 expresso é recuperado do sobrenadante por filtração e inactivado por qualquer método convencional, de um modo preferido, utilizando etilenimina que é, depois, neutralizada para parar o processo de inactivação. A composição imunogénica, como aqui utilizada, também se refere a uma composição que compreende i), qualquer da proteína ORF-2 de PCV2 descrita acima, de um modo preferido, em concentrações descritas acima e ii), pelo menos, uma porção do vector virai expressando a referida proteína ORF-2 de PCV2, de um modo preferido, de um baculovírus recombinante. Além disso, a composição imunogénica pode compreender i) qualquer das proteínas ORF-2 de PCV2 descritas acima, de um modo preferido, 28 em concentrações descritas acima, ii), pelo menos, uma porção do vector virai expressando a referida proteína ORF-2 de PCV2, de um modo preferido, de um baculovírus recombinante e iii) uma porção do sobrenadante de cultura celular.

Deste modo, de acordo com um aspecto, a presente divulgação refere-se a um método para a redução da percentagem de infecções concomitantes em porcos ou uma vara de porcos, causadas por um ou mais patogénios diferentes de PCV2, compreendendo a etapa de administrar ao(s) referido(s) porco(s) uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2, em que o antigénio de PCV2 é ORF-2 de PCV2 recombinante, de um modo preferido um ORF-2 de PCV2 expresso em baculovírus. De um modo preferido, os ORF-2 de PCV2 recombinantes ou expressos em baculovírus tendo a sequência como descrita acima. A composição imunogénica, como aqui utilizada, também se refere a uma composição que compreende i) qualquer das proteínas ORF-2 de PCV2 descritas acima, de um modo preferido, em concentrações descritas acima, ii) , pelo menos, uma porção do vector virai expressando a referida proteína ORF-2 de PCV2, de um modo preferido, de um baculovírus recombinante e iii), uma porção da cultura celular; em que cerca de 90% dos componentes têm um tamanho inferior a 1 pm. A composição imunogénica, como aqui utilizada, também se refere a uma composição que compreende i), qualquer das proteínas ORF-2 de PCV2 descritas acima, de um modo preferido, em concentrações descritas acima, ii), pelo menos, uma porção do vector virai expressando a referida proteína ORF-2 de PCV2, iii) uma porção da cultura celular, iv) e agente de inactivação para 29 inactivar o vector virai recombinante, de um modo preferido BEI, em que cerca de 90% dos componentes i) até iii) têm um tamanho inferior a 1 pm. De um modo preferido, o BEI está presente em concentrações eficazes para inactivar o baculovirus, de um modo preferido, numa quantidade de 2 a cerca de 8 mM de BEI, de um modo preferido, de cerca de 5 mM de BEI. A composição imunogénica, como aqui utilizada, também se refere a uma composição que compreende i), qualquer das proteínas ORF-2 de PCV2 descritas acima, de um modo preferido, em concentrações descritas acima, ii), pelo menos, uma porção do vector virai expressando a referida proteína ORF-2 de PCV2, iii) uma porção da cultura celular, iv) um agente de inactivação para inactivar o vector virai recombinante, de um modo preferido, BEI e v) , um agente de neutralização para parar a inactivação mediada pelo agente de inactivação, em que cerca de 90% dos componentes i) até iii) têm um tamanho inferior a 1 pm. De um modo preferido, se o agente de inactivação for BEI, a referida composição compreende tiossulfato de sódio em quantidades equivalentes a BEI. 0 polipéptido está incorporado numa composição que pode ser administrada a um animal susceptível a infecção por PCV2. Em formas preferidas, a composição também pode incluir componentes adicionais conhecidos dos especialistas na técnica (ver, também, Remington's Pharmaceutical Sciences. (1990). 18a ed. Mack Publ., Easton). Além disso, a composição pode incluir um ou mais veículos veterinariamente aceitáveis. Como aqui utilizado, "um veículo veterinariamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos, agentes 30 retardantes da adsorção e semelhantes. Numa forma de realização preferida, a composição imunogénica compreende a proteína ORF-2 de PCV2, como aqui proporcionada, de um modo preferido, em concentrações descritas acima, que é misturada com um adjuvante, de um modo preferido, Carbopol e solução salina fisiológica.

Os especialistas na técnica compreenderão que a composição aqui utilizada pode incorporar soluções estéreis conhecidas injectáveis, fisiologicamente aceitáveis. Para a preparação de uma solução pronta-a-utilizar para injecção parentérica ou infusão, estão facilmente disponíveis soluções aquosas isotónicas, tais como, e. g., solução salina ou soluções proteicas plasmáticas correspondentes. Além disso, as composições imunogénicas e vacinais da presente invenção podem incluir diluentes, agentes isotónicos, estabilizantes ou adjuvantes. Os diluentes podem incluir água, solução salina, dextrose, etanol, glicerol e semelhantes. Os agentes isotónicos podem incluir cloreto de sódio, dextrose, manitol, sorbitol e lactose, entre outros. Os estabilizantes incluem albumina e sais alcalinos de ácido etilenodiaminotetracético, entre outros. "Adjuvantes", como aqui utilizado, pode incluir hidróxido de alumínio e fosfato de alumínio, saponinas, e. g., Quil A, QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge MA), GPI-0100 (Galenica Pharmaceuticals, Inc., Birmingham, AL), emulsão de água-em-óleo, emulsão de óleo-em-água, emulsão de água-em-óleo-em-água. A emulsão pode ser baseada, em particular, em óleo de parafina líquida leve (tipo Farmacopeia Europeia); óleo isoprenóide, tal como óleo de esqualano ou esqualeno resultante da oligomerização de alcenos, em particular, de isobuteno ou deceno; ésteres de ácidos ou de álcoois contendo um grupo alquilo linear, de um modo mais particular, óleos vegetais, 31 oleato de etilo, di-(caprilato/caprato) de propilenoglicol, gliceril-tri-(caprilato/caprato) ou dioleato de propilenoglicol; ésteres de ácidos gordos ramificados ou álcoois, em particular, ésteres de ácido isoesteárico. 0 óleo é utilizado em combinação com emulsionantes para formar a emulsão. Os emulsionantes são, de um modo preferido, surfactantes não iónicos, em particular, ésteres de sorbitano, de manida (e. g., oleato de anidromanitol), de glicol, de poliglicerol, de propilenoglicol e de ácido oleico, isoesteárico, ricinoleico ou hidroxiesteárico que são, opcionalmente, etoxilados e copolímeros em bloco de polioxipropileno-polioxietileno, em particular os produtos Pluronic, especialmente L121. Ver Hunter et al. , The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed. Stewart-Tull, D. E. S.). John Wiley and Sons, NY, p. 51-94 (1995) e Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997) .

Por exemplo, é possível utilizar a emulsão SPT, descrita na página 147 de "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach", editado por M. Powell e M. Newman, Plenum Press, 1995 e a emulsão MF59 descrita na página 183 deste mesmo livro. É um exemplo adicional de um adjuvante, um composto escolhido dos polímeros de ácido acrílico ou metacrílico e dos copolímeros de anidrido maleico e derivado alquenilo. São compostos adjuvantes vantajosos, os polímeros de ácido acrílico ou metacrílico que são reticulados, especialmente com éteres de polialquenilo de açúcares ou poliálcoois. Estes compostos são conhecidos pelo termo carbómero (Phameuropa Vol. 8, N° 2, Junho de 1996). Os especialistas na técnica também podem reportar-se à Patente U. S. N° 2909462, que descreve esses polímeros acrílicos reticulados com um composto poli-hidroxilado tendo, pelo menos, 3 grupos hidroxilo, de um modo preferido, não 32 mais de 8, os átomos de hidrogénio de, pelo menos, três hidroxilos sendo substituídos por radicais alifáticos insaturados tendo, pelo menos, 2 átomos de carbono. Os radicais preferidos são os que contêm desde 2 a 4 átomos de carbono, e. g., vinilos, alilos e outros grupos etilenicamente insaturados. Os radicais insaturados podem conter, eles mesmos, outros substituintes, tal como metilo. Os produtos comercializados com o nome Carbopol; (BF Goodrich, Ohio, EUA) são particularmente apropriados. São reticulados com uma sacarose alílica ou com pentaeritritol alílico. De entre eles, pode mencionar-se o Carbopol 974P, 934P e 971P. É muito preferida a utilização de Carbopol, em particular, a utilização de Carbopol 971P, de um modo preferido, em quantidades de cerca de 500 pg a cerca de 5 mg por dose, de um modo ainda mais preferido, numa quantidade de cerca de 750 pg a cerca de 2,5 mg por dose e, de um modo muito preferido, numa quantidade de cerca de 1 mg por dose.

Adjuvantes adequados adicionais incluem, mas não estão limitados, ao sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc.), copolímero em bloco (CyRx, Atlanta GA) , SAF-M (Chiron, Emeryville CA) , monofosforil-lípido A, adjuvante de lípido-amina Avridine, enterotoxina termoinstável de E. coli (recombinante ou outra), toxina da cólera, IMS 1314 ou dipéptido muramilo, entre muitos outros.

De um modo preferido, quantidade de cerca de 100 pg modo ainda mais preferido, quantidade de cerca de 100 pg modo ainda mais preferido, quantidade de cerca de 500 pg modo ainda mais preferido, 0 adjuvante é adicionado numa a cerca de 10 mg por dose. De um o adjuvante é adicionado numa a cerca de 10 mg por dose. De um o adjuvante é adicionado numa a cerca de 5 mg por dose. De um o adjuvante é adicionado numa 33 quantidade de cerca de 750 yg a cerca de 2,5 mg por dose. De um modo muito preferido, o adjuvante é adicionado numa quantidade de cerca de 1 mg por dose.

Além disso, a composição pode incluir um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis. Como aqui utilizado, "um veículo farmaceuticamente aceitável" inclui todos e quaisquer solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos, agentes retardantes da adsorção e semelhantes. De um modo muito preferido, a composição aqui proporcionada, contém proteína ORF-2 de PCV2 recuperada do sobrenadante de células cultivadas in vitro, em que as referidas células foram infectadas com um vector virai recombinante contendo ADN de ORF-2 de PCV2 e expressando proteína ORF-2 de PCV2 e em que a referida cultura celular foi tratada com cerca de 2 a cerca de 8 mM de BEI, de um modo preferido, com cerca de 5 mM de BEI, para inactivar o vector virai e uma concentração equivalente de um agente de neutralização, de um modo preferido, solução de tiossulfato de sódio para uma concentração final de cerca de 2 a cerca de 8 mM, de um modo preferido, de cerca de 5 mM.

De acordo com uma forma de realização adicional, a presente divulgação também se refere à utilização do antigénio de PCV2 para a preparação de uma composição imunogénica para a redução de infecções concomitantes causadas por um ou mais patogénios diferentes de PCV-2 em porcos ou uma vara de porcos, em que a referida composição imunogénica compreende i), qualquer das proteínas ORF-2 de PCV2 descritas acima, de um modo preferido, em concentrações descritas acima, ii), pelo menos, uma porção do vector virai expressando a referida proteína ORF-2 de PCV2, 34 iii) uma porção da cultura celular, iv) um agente de inactivação para inactivar o vector virai recombinante, de um modo preferido, BEI e v) , um agente de neutralização para parar a inactivação mediada pelo agente de inactivação, de um modo preferido, tiossulfato de sódio, em quantidades equivalentes a BEI; e vi) um adjuvante adequado, de um modo preferido, Carbopol 971, em quantidades descritas acima; em que cerca de 90% dos componentes i) até iii) têm um tamanho inferior a 1 ym. De um modo preferido, os referidos porcos são co-infectados com PCV2, como definido acima, expostos a PCV2 ou em perigo ou susceptiveis de ficarem infectados com PCV2. De um modo mais preferido, o número de porcos infectados com os referidos patogénios diferentes de circovirus, com respeito a um ou mais do referido patogénio, é reduzido para mais de 10%, de um modo preferido, para mais de 20%, de um modo mais preferido, para mais de 30%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 40%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 50%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 60%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 80%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 100%, em comparação com um grupo de controlo não vacinado.

De acordo com um aspecto adicional, esta composição imunogénica compreende, ainda, um sal farmacêutico aceitável, de um modo preferido, um sal de fosfato, em concentrações fisiologicamente aceitáveis. De um modo preferido, o pH da referida composição imunogénica é ajustado para um pH fisiológico, que significa entre cerca de 6,5 e 7,5. A composição imunogénica, como aqui utilizada, também se refere a uma composição que compreende, por um mL, i), pelo menos, 1,6 yg de proteína ORF-2 de PCV2 descrita acima, 35 ii), pelo menos, uma porção de baculovírus expressando a referida proteína ORF-2 de PCV2, iii) uma porção da cultura celular, iv) cerca de 2 a 8 mM de BEI, v) tiossulfato de sódio em quantidades equivalentes a BEI; e vi) cerca de 1 mg de Carbopol 971 e vii) sal de fosfatos numa concentração fisiologicamente aceitável; em que cerca de 90% dos componentes i) até iii) têm um tamanho inferior a 1 pm e o pH da referida composição imunogénica é ajustado para cerca de 6,5 a 7,5.

As composições imunogénicas podem incluir, ainda, um ou mais outros agentes imunomodulatórios, tais como, e. g., interleucinas, interferões ou outras citocinas. As composições imunogénicas também podem incluir Gentamicina e Mertiolato. Embora as quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção possam ser facilmente determinadas pelo especialista na técnica, a presente divulgação contempla composições compreendendo desde cerca de 50 pg a cerca de 2000 pg de adjuvante e, de um modo preferido, cerca de 250 pg/mL de dose da composição vacinai. Deste modo, a composição imunogénica, como aqui utilizada, também se refere a uma composição que compreende desde cerca de 1 pg/mL a cerca de 60 pg/mL de antibióticos e, de um modo mais preferido, inferior a cerca de 30 pg/mL de antibióticos. A composição imunogénica, como aqui utilizada, também se refere a uma composição que compreende i), qualquer das proteínas ORF-2 de PCV2 descritas acima, de um modo preferido, em concentrações descritas acima, ii), pelo menos, uma porção do vector virai expressando a referida proteína ORF-2 de PCV2, iii) uma porção da cultura celular, iv) um agente de inactivação para inactivar o vector virai recombinante, de um modo preferido, BEI e v), um agente de neutralização para parar a inactivação 36 mediada pelo agente de inactivação, de um modo preferido tiossulfato de sódio, em quantidades equivalentes a BEI; vi) um adjuvante adequado, de um modo preferido, Carbopol 971, em quantidades descritas acima; vii) uma concentração farmacêutica aceitável de um tampão salino, de um modo preferido de um sal de fosfatos e viii) um agente activo antimicrobiológico; em que cerca de 90% dos componentes i) até iii) têm um tamanho inferior a 1 ym. A composição imunogénica, como aqui utilizada, também se refere a Ingelvac® CircoFLEX™, (Boehringer Ingelheim Vetmedica Inc, St Joseph, MO, EUA), CircoVac® (Merial SAS, Lyon, França), CircoVent (Intervet Inc., Millsboro, DE, EUA) ou Suvaxyn PCV-2 One Dose® (Fort Dodge Animal Health, Kansas City, KA, EUA). Deste modo, de acordo com outro aspecto, a presente divulgação refere-se a um método para a redução da percentagem de infecções concomitantes em porcos ou uma vara de porcos, causadas por um ou mais patogénios diferentes de PCV2, compreendendo a etapa de administrar ao(s) referido(s) porco(s) uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio PCV2, em que a referida composição imunogénica compreendendo um antigénio de PCV2 é Ingelvac® CircoFLEX™, CircoVac® CircoVent e/ou Suvaxyn PCV-2 One Dose®, de um modo preferido é Ingelvac® CircoFLEX™. De um modo preferido, os referidos porcos infectados são co-infectados com PCV2, como definido acima, expostos a PCV2 ou em perigo ou susceptíveis de ficarem infectados com PCV2. De um modo mais preferido, o número de porcos infectados com os referidos patogénios diferentes de circovirus, com respeito a um ou mais do referido patogénio, é reduzido para mais de 10%, de um modo preferido, para mais de 20%, de um modo mais preferido, para mais de 30%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 40%, de um modo ainda mais 37 preferido, para mais de 50%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 60%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 80%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 100%, em comparação com um grupo de controlo não vacinado. O termo "uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2", como aqui utilizado, significa mas não está limitado a uma quantidade de antigénio de PCV2 que deduz ou é capaz de deduzir uma resposta imunitária num animal, ao qual é administrada a referida quantidade eficaz de antigénio de PCV2. A quantidade que é eficaz depende dos ingredientes da vacina e do programa de administração. Tipicamente, quando um vírus inactivado ou uma preparação de vírus vivo modificado é utilizada na vacina de combinação, uma quantidade da vacina contendo cerca de IO2,0 a cerca de 109'° TCID50 por dose, de um modo preferido, cerca de 103'° a cerca de 108'° TCID50 por dose, de um modo mais preferido, cerca de IO4,0 a cerca de 108'° TCID50 por dose. Em particular, quando é utilizado PCV2 vivo modificado nas vacinas, a dose recomendada para administrar ao animal susceptível é, de um modo preferido, cerca de 103'° TCID50 (50% do ponto final da dose infecciosa de cultura de tecidos)/dose a cerca de 106'° TCID50/dose e, de um modo mais preferido, cerca de 104'° TCID50/dose a cerca de 105,° TCID50/dose. Em geral, quando é utilizado antigénio purificado, a quantidade de antigénio será entre 0,2 e 5000 microgramas e entre 102'° e 109' 0 TCID50, de um modo preferido, entre 103'° e 106'° TCID50, de um modo mais preferido, entre 104'° e 105'° TCID50.

As vacinas subunitárias são, normalmente, administradas com um nível de inclusão de antigénio de, pelo menos, 0,2 pg de antigénio por dose, de um modo preferido, com cerca de 0,2 a 38 cerca de 400 pg/dose, de um modo ainda mais preferido, com cerca de 0,3 a cerca de 200 pg/dose, de um modo ainda mais preferido, com cerca de 0,35 a cerca de 100 pg/dose, de um modo ainda mais preferido, com cerca de 0,4 a cerca de 50 pg/dose, de um modo ainda mais preferido, com cerca de 0,45 a cerca de 30 pg/dose, de um modo ainda mais preferido, com cerca de 0,6 a cerca de 16 pg/dose, de um modo ainda mais preferido, com cerca de 0,75 a cerca de 8 pg/dose, de um modo ainda mais preferido, com cerca de 1,0 a cerca de 6 pg/dose, de um modo ainda mais preferido, com cerca de 1,3 a cerca de 3,0 pg/dose. A administração de antigénio de PCV2 a porcos resulta, não apenas na redução da percentagem de infecções concomitantes causadas por patogénios diferentes de circovirus, em particular, diferentes de PCV2, mas também num melhoramento geral da saúde, particularmente na resistência contra essas infecções concomitantes. Deste modo, de acordo com outro aspecto, a presente divulgação também se refere a um método para o melhoramento da resistência de porcos contra uma ou mais infecções concomitantes com patogénios diferentes de PCV2, compreendendo a etapa de administrar ao(s) referido(s) porco(s) uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2. De um modo preferido, os referidos porcos são co-infectados com PCV2, como definido acima, expostos a PCV2 ou em perigo ou susceptiveis de ficarem infectados com PCV2. O termo "melhoramento da resistência de porcos contra infecções concomitantes", como aqui utilizado, refere-se mas não está limitado a um processo em que o número de porcos infectados com um patogénio diferente de circovirus, com respeito ao referido patogénio, é reduzido para mais de 10%, de um modo 39 preferido, para mais de 20%, de um modo mais preferido, para mais de 30%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 40%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 50%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 60%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 80%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 100%, em comparação com um grupo de controlo não vacinado. Deste modo, de acordo com outro aspecto, a presente divulgação também se refere a um método para o melhoramento da resistência de porcos contra infecções concomitantes com um ou mais patogénios diferentes de PCV2, compreendendo a etapa de administrar ao(s) referido(s) porco(s) uma quantidade eficaz de antigénio de PCV2 ou uma composição imunogénica compreendendo antigénio de PCV2, em que o número de porcos infectados com um ou mais dos referidos patogénios diferentes de circovirus, com respeito a um ou mais dos referidos patogénicos, é reduzido para mais de 10%, de um modo preferido, para mais de 20%, de um modo mais preferido, para mais de 30%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 40%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 50%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 60%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 80%, de um modo ainda mais preferido, para mais de 100%, em comparação com um grupo de controlo não vacinado. De um modo preferido, os referidos porcos são co-infectados com PCV2, como definido acima, expostos a PCV2 ou em perigo ou susceptíveis de ficarem infectados com PCV2.

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇAO PREFERIDAS

Os seguintes exemplos expõem materiais e processos preferidos de acordo com a presente invenção. Contudo, deve ser compreendido que estes exemplos são proporcionados apenas a 40 título de ilustração e nada nestes deve ser considerado como uma limitação do âmbito global da invenção. EXEMPLO 1

Detecção de infecções concomitantes em animais infectados por PCV-2

População de estudo 0 estudo foi conduzido na parte do Sul da Alemanha. Os porcos híbridos de cruzamentos comerciais (Landrace ou Edelschwein (f) x Pietrain (m) ) foram obtidos de 15 diferentes explorações de reprodução, sendo parte de uma "comunidade produtora de porcos". As explorações de reprodução diferiam em tamanho (50 a 300 porcas), gestão e estatuto sanitário. As medidas preventivas de rotina dos porquinhos em todas as explorações de reprodução incluíram injecção de ferro, dentes e corte de cauda e castração. Após desmame na idade de, aproximadamente, 4 semanas, os porquinhos das diferentes explorações de reprodução foram transferidos para uma exploração de criação com um sistema de produção tudo dentro tudo fora. Foram alojados misturados em três currais com pocilgas concebidas para conterem 60 a 120 porcos por pocilga. As medidas preventivas de rotina no local de criação incluíram tratamento profiláctico com cloridrato de tetraciclina, durante os primeiros dez dias após chegada. Durante a criação, foram realizadas quatro alterações da composição alimentar. A alimentação proporcionada aos animais foi autopreparada à base de cevada e minerais. Na idade de, aproximadamente, 12 semanas, os porcos foram transferidos para uma exploração de engorda com 41 um sistema de produção tudo dentro tudo fora. Foram novamente misturados e alojados em dois estábulos com pocilgas, concebidas para conterem 10 a 30 porcos por pocilga. Durante a engorda, foram realizadas três alterações da composição alimentar. A alimentação proporcionada foi autopreparada à base de cevada, trigo, milho e concentrado de soro lácteo. Os porcos permaneceram na exploração de engorda durante 13 a 18 semanas.

Historial da doença O padrão de doença da PMWS tinha ficado clinicamente evidente, aproximadamente, três anos antes do inicio do estudo, em Novembro de 2002 e foi serologicamente confirmado em Dezembro de 2002. No fim da criação/inicio da engorda, os animais começaram a mostrar sinais típicos de PMWS, tais como deperdição, sinais respiratórios e um marcado aumento na taxa de mortalidade. A doença foi complicada por co-infecções com PRRSV. A taxa de mortalidade durante a criação (4-12 semanas de idade) variava, habitualmente, entre 3,5 e 4,8%, mas também foram ocasionalmente referidos níveis de pico de até 10% de mortalidade. Durante a fase média a tardia da engorda, os sinais respiratórios e retardamento de crescimento foram predominantes em animais infectados por PCV2. A taxa de mortalidade durante a engorda (porcos de 12-26 semanas de idade) foi, aproximadamente, 1,7-2,4% e o número de reformas foi 1%. O ganho de peso médio diário foi apenas moderado (719-731 g/dia). Três meses antes do início do estudo, o diagnóstico de PMWS foi verificado com base em sinais clínicos e viremia de PCV2, que ocorreram ambos quando os animais tinham, aproximadamente, 9 a 13 semanas de idade. PRRSV e Mycoplasma hyorhinis foram identificados em amostras de 42 lavagem de pulmões de animais infectados por PCV2 como patogénios co-infectantes.

Artigos de teste

Para vacinação activa contra PCV2, foi administrada uma vacina subunitária inactivada (Ingelvac® CircoFLEX™, Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH). A vacina continha a proteina da cápside de 0RF2 de PCV2 como componente activo e carbómero como adjuvante. A sequência da 0RF2 foi derivada de um isolado de PCV2 da América do Norte que foi isolado de amostras de amígdala e fígado de dois porcos com sinais de PMWS. A sequência da 0RF2 foi subsequentemente inserida dentro de um sistema de expressão de baculovírus utilizando uma linha celular de insecto derivada de ovários da lagarta-do-milho Sodoptera frugiperda (células SF+) como hospedeiro. Um placebo contendo sobrenadante de cultura celular isenta de proteína da cápside de PCV2 e carbómero como adjuvante serviu como artigo de controlo.

Concepção experimental 0 ensaio de campo foi realizado de acordo com os princípios de "Boas Práticas Clínicas" (GCP) e seguiu uma concepção de estudo paralelo aleatorizado, controlado negativamente, duplamente cego. Um total de 1519 porquinhos saudáveis foi igualmente distribuído entre dois grupos de tratamento, com respeito a atribuição de peso corporal inicial e ninhada. Uma semana antes do desmame, um grupo de porquinhos (n=754) foi vacinado com Ingelvac® CircoFLEX™ e o outro grupo (n=765) recebeu um placebo. Os artigos de teste foram administrados como uma 43 única dose de 1 mL intramuscularmente na região direita do pescoço, quando os porquinhos tinham 25,4 ± 3,18 dias (média ± D.P.) de idade. Após desmame, os porcos de ambos os grupos de tratamento foram mantidos em grupos mistos até ao termo da conclusão, de modo a maximizar a exposição uniforme a patogénios.

Reacções de polimerização em cadeia

Os ensaios de reacção de polimerização em cadeia foram utilizados como descrito, de modo a detectar ácidos nucleicos específicos para PRRSV (Mardassi H, et al., J Clin Microbiol 1994; 32 (9):2197-203), Mycoplasma hyorhinis (Caron J., et al. , J Clin Microbiol 2000; 38(4):1390-6), Mycoplasma hyopneumoniae (Calsamiglia M, et al. , J Vet Diagn Invest, Maio de 1999; 11 (3):246-51), Streptococcus suis (Wisselink HJ, et al. , J Clin Microbiol, Agosto de 2002; 40 (8):2922-9), Pasteurella multocida (Townsend KM, et al., J Clin Microbiol, Abril de 1998; 36(4):1096-100), Actinobacillus pleuropneumoniae (Schaller A, et al., Toxinas Apx em espécies Pasteurellaceae de animais. Vet Microbiol, 12 de Junho de 2000; 74(4):365-76), Bordetella bronchispectica (Hozbor D, et al., Res Microbiol, Junho de 1999; 150(5):333-41) e Haemophilus parasuis (Calsamiglia M, et al., J Vet Diagn Invest, Março de 1999; 11(2):140-5) em amostras de tecido de pulmão.

Para quantificação da carga virai de PCV2 no soro, equivalente(s) de genoma de PCV2 foi/foram quantificado(s) de acordo com o método descrito em Brunborg et al., 2004; J. Virol Methods 122: 171-178. Para amplificação de PCV2, foram/são utilizados os iniciadores PCV2-84-1265U21 e PCV2-84-1319L21. 44 0 nível de exclusão para uma amostra positiva foi fixado como 104 cópias de molde por mL de soro, com base em experiências de validação. Todos os ensaios de quantificação de ADN de PCV2 foram realizados por bioScreen GmbH, Munster, Alemanha.

Resultados

Viremia de PCV2

Foi investigado se o começo e gravidade dos sinais e lesões clínicos característicos de PMWS observados estavam relacionados com o começo da viremia de PCV2 no sangue de "animais de amostra" pré-seleccionados. Como ilustrado na Figura 1, o começo da viremia de PCV2 iniciou-se no grupo tratado com placebo quando os animais tinham, aproximadamente, 9-10 semanas de idade. Os níveis de pico com até 85% de animais positivos para PCV2 foram alcançados quando os animais tinham, aproximadamente, 11 a 14 semanas de idade. Desde as 14 semanas de idade até ao termo da engorda, a proporção de animais virémicos para PCV2 estava a diminuir sem, contudo, alcançar novamente os níveis de linha de base. Na média, a duração individual da viremia durou 56 dias (dados não mostrados).

Comparativamente com o grupo tratado com placebo, a proporção de animais positivos para PCV2 no grupo vacinado foi significativamente reduzida (p<0, 0001), com não mais de 35% de animais positivos no pico da viremia (Figura 1B) . A duração média da viremia em animais vacinados foi reduzida em 31 dias (p<0,0001; dados não mostrados). 45

Outro foco foi colocado na examinação da carga virai nos animais. Neste estudo, as cargas virais de relevância clínica (>106 gE/mL de soro) foram, principalmente, observadas em animais tratados com placebo na fase precoce da viremia, quando os animais tinham, aproximadamente, 10-15 semanas de idade (Figura IA) . Na idade de 11 semanas, a proporção de animais com cargas virais clínicas relevantes (40%) foi superior à proporção de animais com cargas virais subclinicas relevantes (37%). Esta razão foi-se drasticamente alterando na fase tardia da viremia (17-25 semanas de idade), devido a uma redução significativa de infecções com relevância clínica. Em animais vacinados que eram positivos para PCV2, as infecções subclinicas eram predominantes em todos os intervalos de tempo analisados (Figura 1B).

Em suma, o perfil de PCV2 nos locais de estudo seleccionados durante o tempo do estudo foi caracterizado como se segue: a) um começo da viremia de PCV2 na semana de estudo 9-10 que coincidiu com o começo de sinais e lesões clínicos de PMWS, b) uma elevada carga virai em animais tratados com placebo na fase precoce da viremia de PCV2, c) uma redução significativa na duração da viremia e na percentagem de animais com cargas virais clínicas e subclinicas relevantes em animais vacinados, em comparação com animais tratados com placebo.

Presença de infecções concomitantes em animais tratados com placebo

Os resultados obtidos até agora, confirmam o diagnóstico de PMWS dentro da população de estudo analisada e indicam que a vacinação contra PCV2 pode proteger consideravelmente os animais da PMWS. Esta experiência de imunização controlada por placebo 46 permitiu, por conseguinte, a testagem da hipótese de que a PMWS causa uma imunossupressão subjacente nos animais. Foi especulado que, no caso de uma imunodeficiência associada a PCV2, a frequência de co-infecções após o começo da viremia de PCV2 seria mais elevada em animais tratados com placebo do que nos animais vacinados. Numa primeira etapa, a exposição dos animais de estudo a organismos oportunistas foi, por conseguinte, analisada em maior detalhe. Visto que a monitorização de sinais clínicos tinha mostrado que os animais eram predominantemente afectados por sinais respiratórios, decidiu-se seleccionar amostras de pulmão de animais mortos para um respectivo ensaio de patogénio por PCR. Na Tabela 3, os resultados são apresentados apenas para animais tratados com placebo, visto que são considerados como reflectindo mais de perto as condições de campo naturais.

Antes do começo da viremia de PCV2 (3-8 semanas de idade), 0 único patogénio que foi detectado em 2 de 5 amostras de pulmão de animais tratados com placebo foi o Streptococcus suis. No começo da viremia de PCV2 (9-10 semanas de idade), 1 em 8 amostras de pulmão de animais tratados com placebo verificou-se positiva para PCV2, enquanto 4 em 8 das amostras de pulmão analisadas testaram positivo para PRRSV. Outros patogénios detectados em baixo número, isoladamente ou em combinação com estes dois patogénios, foram Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyopneumoniae e Streptococcus suis. A quantidade mais elevada de patogénios co-infectantes foi detectada em amostras de pulmão de animais tratados com placebo durante a fase aguda da viremia de PCV2 (11-16 semanas de idade). Entre as 17 amostras de pulmão testadas positivo para PCV2, 12 também se verificaram positivas para PRRSV e 13 para Mycoplasma hyorhinis. Além disso, foram esporadicamente 47 detectadas co-infecções com Streptococcus suis ou Pasteurella multocida. Finalmente, na fase tardia da viremia (17-26 semanas de idade), as co-infecções com Mycoplasma hyopneumoniae eram predominantes (6 em 7 amostras de pulmão positivas para PCV2) mas também se verificaram co-infecções com Mycoplasma hyorhinis, Actinobacillus pleuropneumoniae e Streptococcus suis. Durante todo o período de tempo após o começo da viremia (9-26 semanas de vida) , apenas 2 em 22 das amostras de pulmão de animais tratados com placebo testaram positivo apenas para PCV2. Na maior parte das amostras de pulmão analisadas, positivas para PCV2, foram detectadas combinações de dois ou três organismos oportunistas. Durante a duração do estudo, a infecção por PCV2 foi, deste modo, verificada em associação com várias infecções respiratórias concomitantes. 0 começo e pico da viremia de PCV2 coincidiram com os começos e picos de co-infecções por PRRSV e Mycoplasma hyorhinis, ao passo que a fase tardia da viremia de PCV2 foi acompanhada pelo começo de uma infecção por Mycoplasma hyopneumoniae.

Redução de co-infecções por vacinação contra PCV2 A comparação da frequência de patogénios respiratórios detectados em amostras de pulmão não revelou diferenças importantes entre ambos os grupos de tratamento quanto ao tempo antes do começo da viremia de PCV2 (dados não mostrados). Após o começo da viremia de PCV2 (10-26 semanas de idade), a proporção de amostras de pulmão de animais vacinados que testaram positivo para Mycoplasma hyorhinis e PRRS V foi reduzida em 71% (p=0,0293) e 46% (p=0,2847), respectivamente (Tabela 1). 48

Tabela l: Resultados do estudo de B05 BIVI 030

Placebo Vacina Redução o, "0 (N) o, o (N) o, "0 PCV2 92 (24/26) 55 (6/11) 40 PRRSV 50 (13/26) 27 (3/11) 46 M. hyorhinis 62 (16/26) 18 (2/11) 71 M. hyopneumoniae 23 (6/26) 45 (5/11) - S. suis 12 (3/26) 27 (3/11) - P. multocida 4 (1/26) 9 (1/11) - APP 8 (2/26) 0 (0/11) 100 B. bronchiseptica 0 (0/26) 0 (0/11) 0 H. parasuis 0 (0/26) 0 (0/11) 0

Além disso, as amostras de pulmão de animais tratados com placebo verificaram ser esporadicamente positivas para Actinobacillus pleuropneumoniae. Diferenças ligeiras no número de amostras de pulmão positivas para Mycoplasma hyopneumoniae, Streptococcus suis ou Pasteurella multocida foram observadas num segundo estudo entre ambos os grupos de tratamento. Como indicado na Tabela 2, estes patogénios estavam presentes apenas a baixas frequências (Streptococcus suis, Pasteurella multocida) ou surgiram na fase mais tardia da infecção por PCV2 (Mycoplasma hyopneumoniae) .

Noutro estudo (estudo B05 BIVI 013), uma resistência semelhante a patogénios concomitantes foi observada em animais vacinados, como apresentado na Tabela 2. 49

Tabela 2: Resultados do estudo de B05 BIVI 013

Placebo Vacina Redução o o (N) o, o (N) o, o P. multocida 14 15/109 0 0/32 100 H. parasuis 3 3/109 0 0/32 100 Salmonella spp. 5 5/109 0 0/32 100 APP 4 4/109 0 0/32 100 S. suis 50 15/30 n. d n. d. n. d. Sob a influência de vacinação contra PCV-2, a frequência das infecções por PCV2, assim como a frequência das co-infecções por Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Mycoplasma hyrhinis, Pasteurella multocida, PRRSV, Salmonella spp., Streptococcus suis foi, deste modo, reduzida de um modo notável.

Noutro estudo, hyopneumoniae também uma resistência semelhante a Mycoplasma foi observada em animais vacinados.

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Haemophilus. 54

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS

<110> BOEHRINGER INGELHEIM VETMEDICA INC <120> REDUÇÃO DE INFECÇÕES CONCOMITANTES EM PORCOS ATRAVÉS DA UTILIZAÇÃO DE ANTIGÉNIO DE PCV2 <130> P10-0100 <16 0> 11 <170> Patentln versão 3.3 <210> 1 <211> 8 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Esta é uma sequência de Kozak modificada. <40 0> 1 ccgccatg 8 <210> 2 <211> 6 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Esta é uma sequência de Eco RI recombinante. 55 6 <400> 2 gaattc

<210> 3 <211> 713 <212> ADN <213> Circovírus porcino <400> 3 cagctatgac gtatccaagg ttggccagat cctccgccgc gaaggaaaaa tggcatcttc aggaaaaatg gcatcttcaa ttgttccccc gggagggggg gaaaggttaa ggttgaattc gctccactgc tgttattcta acccatatgt aaactactcc gttacttcac acccaaacct aaaggaatca gctttggctg gcactgcgtt cgaaaacagt tacaattcag agaatttaat aggcgttacc gcagaagaag cgcccctggc tcgtccaccc aacacccgcc tctcccgcac cacccgcctc tcccgcacct accaacaaaa tctctatacc tggccctgct cccccatcac gatgataact ttgtaacaaa tcccgccata caatccccca gttcttgact ccactattga aggctacaaa cctctagaaa aaatacgacc aggactacaa cttaaagacc ccccacttaa acaccgcccc cgcagccatc ccgccaccgc taccgttgga cttcggatat actgtggaga tcggatatac tgtgacgact ctttgaatac tacagaataa ccagggtgat aggggagtgg ggccacagcc ctaacctatg acccttctcc taccactccc ttacttccaa ccaaataaca tgtggaccac gtaggcctcg tatccgtgta accatgtatg accctaaatg aat 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 713 <210> 4 <211> 713 <212> ADN <213> Circovírus porcino <400> 4 ccgccatgac gtatccaagg aggcgttacc gcagaagaag acaccgcccc cgcagccatc 60 ttggccagat cctccgccgc cgcccctggc tcgtccaccc ccgccaccgc taccgttgga 120 gaaggaaaaa tggcatcttc aacacccgcc tctcccgcac cttcggatat actgtcaagg 180 ctaccacagt cacaacgccc tcctgggcgg tggacatgat gagatttaat attgacgact 240 ttgttccccc gggagggggg accaacaaaa tctctatacc ctttgaatac tacagaataa 300 gaaaggttaa ggttgaattc tggccctgct cccccatcac ccagggtgat aggggagtgg 360 gctccactgc tgttattcta gatgataact ttgtaacaaa ggccacagcc ctaacctatg 420 acccatatgt aaactactcc tcccgccata caatccccca acccttctcc taccactccc 480 gttacttcac acccaaacct gttcttgact ccactattga ttacttccaa ccaaataaca 540 aaaggaatca gctttggctg aggctacaaa cctctagaaa tgtggaccac gtaggcctcg 600 gcactgcgtt cgaaaacagt aaatacgacc aggactacaa tatccgtgta accatgtatg 660 tacaattcag agaatttaat cttaaagacc ccccacttga accctaagaa ttc 713 <210> 5 <211> 233 56

<212> PRT <213> Circovírus porcino <400> 5

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 15 10 15 ser His Leu Gly Gin Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu vai His Pro 20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45

Leu Ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr Vai Lys Ala Thr Thr Vai Thr Thr 50 55 60

Pro Ser Tro Ala vai Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asp Asp Phe vai 65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys ile Ser Ile Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95

Ara Ile Ara Lys vai Lys vai Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110

Gin Gly Asp Arg Gly Vai Gly Ser Thr Ala vai ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125

Phe vai Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Vai Asn Tyr 130 135 140

Ser ser Arq His Thr ile Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro vai Leu Asp Ser Thr ile Asp Tyr Phe Gin Pro 165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr ser Arg Asn 180 185 190

Vai Asp His Vai Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn ser Lys Tyr Asp 195 200 205

Gin Asp Tyr Asn ile Arg vai Thr Met Tyr Vai Gin Phe Arg Glu Phe 210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 230

<210> 6 <211> 233 <212> PRT <213> Circovírus porcino 57 <400> 6

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 5 10 15 ser His Leu Gly Gin lie Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu vai His Pro 20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly lie Phe Asn Thr Arg 35 40 45

Leu ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr vai Lys Ala Thr Thr Vai Thr Thr 50 55 60

Pro Ser Trp Ala Vai Asp Met Met Arg Phe Asn ile Asp Asp Phe Vai 65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Thr Asn Lys Ile Ser ile Pro Phe Glu Tyr Tyr 85 90 95

Arg Ile Arg Lys vai Lys vai Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro lie Thr 100 105 HO

Gin Gly Asp Arg Gly Vai Gly Ser Thr Ala Vai Ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125

Phe Vai Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Vai Asn Tyr 130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Vai Leu Asp Ser Thr Ile Asp Tyr Phe Gin Pro 165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr ser Arg Asn 180 185 190 vai Asp His vai Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Lys Tyr Asp 195 200 205

Gin Asp Tyr Asn Ile Arg Vai Thr Met Tyr Vai Gin Phe Arg Glu Phe 210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Glu Pro 225 230 <210> 7 <211> 756 <212> ADN <213> Artificial 58 <220> <223> Esta sequência é do circovírus porcino de tipo 2, fase de leitura aberta 2, juntamente com uma porção do vector pGEM T-easy. <400> 7 gcggccgcgg gaattcgatc caccgccccc gcagccatct cgccaccgct accgttggag ttcggatata ctgtcaaggc agatttaata ttgacgactt tttgaatact acagaataag cagggtgata ggggagtggg gccacagccc taacctatga cccttctcct accactcccg tacttccaac caaataacaa gtggaccacg taggcctcgg atccgtgtaa ccatgtatgt ccctaagaat tctatcacta cgccatgacg tatccaagga tggccagatc ctccgccgcc aaggaaaaat ggcatcttca taccacagtc acaacgccct tgttcccccg ggagggggga aaaggttaag gttgaattct ctccactgct gttattctag cccatatgta aactactcct ttacttcaca cccaaacctg aaggaatcag ctttggctga cactgcgttc gaaaacagta acaattcaga gaatttaatc gtgaattcgc ggccgc ggcgttaccg cagaagaaga gcccctggct cgtccacccc acacccgcct ctcccgcacc cctgggcggt ggacatgatg ccaacaaaat ctctataccc ggccctgctc ccccatcacc atgataactt tgtaacaaag cccgccatac aatcccccaa ttcttgactc cactattgat ggctacaaac ctctagaaat aatacgacca ggactacaat ttaaagaccc cccacttgaa 756 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 <210> 8 <211> 10387 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Esta é a construção de ORF-2 do circovirus porcino de tipo 2, que inclui as sequências codificantes de baculovirus e pGEM T-easy. <400> 8 aagctttact cgtaaagcga gaaagcacgt gtaaaatgtt ataaaagatt ctaatctgat gtgactagcg aagaagatgt ggagcaataa tcgatttaac gcgggcctgt tatacaaaaa gttcaagaat ttattgacac ggcgtgcact gcacacacgg cacaccctgg gtattgcgcc aaaattgaaa gacaaaatta tttaacaaat actttatcct tgcttcgctt gctccgttta gattaggccg gatattctcc ggttttccac gtacgtcttt cgcacaacac cggatgtttg gttgaaggat catatttagt tcccgcgcgt tggcacaact atgttttaaa acacctttgc gtggaccgca gaacagatag caacacgtct aaatattatg aattcaagta cctggccaga ggtaaaagaa tttacagaaa tattaatcgc accggttaca gcaggaagcc atagatagat cgttcaagat ttattaattt attttcaaat tgttgcgctt gcttgtagcc gatcagtggc accacaatgt tggcaacgtt tggccggtaa tagccgtaaa cgcttgtccg cggggtattg tgcgtttatg agataagatt atttacaatg cggccaagtt ggcccgagtt gtttgcgtac taaaacaaaa ccctagtatt atggtgtgca ttttttgcgg ctttgccgcc tgaaagcata agtgtcccgg catgttggtg tggtgtgcag atatttaatg tcgaaaaagc cagaggtcac aattaatatt atttgcattc cttccagcga accaaaacta gttgttccaa tcgacggtag gatgttacgt ttatgctttt cgtagtgccg tcgcgcgtca aaccgcgcga tccgacaaat 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 59 ccaccacttt ggcaactaaa tcggtgacct tcttttgcat ggtttcctgg aagccggtgt tgacctgcaa atctttggcc tcgatctgct actcttgttt tttaacaagt tcctcggttt tgtgctcggt gaatgtcgca atcagcttag gtttgatcgc gggatcgtac ttgccggtgc gccattcttg taattctatg gcgtaaggca cggatttagt aatgagcact gtatgcggct cgctgttaga ggtagggccc ccattttgga tgtctacatg aacacgtata gctttatcac ccttggccac gaaccggacc tgttggtcgc cttctccaaa tttaaattct ccaattttaa tttgcaacaa ctattgtttt ttaacgcaaa tatgggggaa catgcgccgc tacaacactc ggcgcaagcg gctaaaacgt gttgcgcgtt tacagttttg atttgcatat taacggcgat atgacgccta caactccccg cccgcgttga cttcctccgt gtggccgaac acgtcgagcg cgacgcacaa gtatctgtac 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3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 4920 60 ggtacccggg atcctttcct atccgtaatg ttaaacccga tacagggaaa cttggacccg gtgatggatg ttttccttgt ttcctggccc aacacgctct atcgtcgagc cttcatgggt ggcggcggct gcccaataat atcgatcgtg tcatctggga gctgaagagg aggaaattct ccagacgcac ctctgttcac atttattaag cgctagattc aataattcat taaatttata tcagcgtctt tatatctgaa cgattagttt caaacaaggg tcgctcaacg ccacaaaact gtttgtgttt tgttttgtaa tttctttcat cactgtcgtt tggacatatt taacatcggg ccctcgtcgt tagaagttgc attgtgtcgg ctaacacgtc gattgcgggc gtttttgggc acgttagaaa gcgatggtgc ggcggtggtg gagctgatga ggaggcggag gcggaggtgg ttaggcaaca cagtcggcac accggtctga gacgagtgcg tcgtctaaag gtgcagcggg gacatcgatg gtggtggtgg ggcggcggtg ccgccggtat accggcgcag gcgccgctgg ggtggtggca attcaatatt gtaatttcgc tatcgtttac ttgtaaagag attgtctcaa cagcattgta gtggcgagac aaacgtcgtt ggcaagcttt tgtcgtaaat gttgtttttg gatgcgcatc aattttgttg tacgattcgt catggccacc actgcaaaaa cgtcaaaact 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tcaaagtaaa ggagtttgca cgatacattg ttattagtac acaattgttg tacgtatttt gagcgaaaat caaatgattt tagatttgta aaataggttt ctggactatc taatggattt atctagcttt gtcgatattc aaatattatg cgcttttgta taaacacgtt aaataaagct gattatcgtc gtcgtcccaa tagccacacg acgcctatta agctttttgg aattatttct ccgattttaa ttcagacaac acggcaaatc tactaatggc gcgcaggcgg ggctggcggc gtttaggctc aaatgtctct cgggcgccgt ttttggtttg cttccaacaa ttgttgtctg gtggagcggg cggcaattca taggcacggg agaaggtggt gttcgcgcac gattgtgggc tgcttcgagg cagcgcttgg aaaaatctgc tataagcatt gctcaatgta agcaattgta aagccttttc atttttacta catgtatgct ttgttgtcaa tctgttcagc accactgtgt atcgacacgt tcaaaaaatt agattgtaca gattcatatc gctggtacaa ttttacgaaa gcgctttggc aaaatatcta aacaatttcg gcgcacaatt ccacccaaat tttataaaaa gatggactac attgactgtc gtaccaactt gttagcaata gcacaatttc atacacaacg tcgcgtgtat gtttgcgatt cggcacgttg gagtatttta tgactggtac gcggcgtgtt cctgtgtgaa attgttatcc tgtaaagcct ggggtgccta cccgctttcc agtcgggaaa gggagaggcg gtttgcgtat tcggtcgttc ggctgcggcg acagaatcag gggataacgc aaccgtaaaa 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tccatccagt ctattaattg ttgcgcaacg ttgttgccat gcttcattca gctccggttc aaaaaagcgg ttagctcctt ttatcactca tggttatggc tgcttttctg tgactggtga ccgagttgct cttgcccggc aaagtgctca tcattggaaa ttgagatcca gttcgatgta ttcaccagcg tttctgggtg agggcgacac ggaaatgttg tatcagggtt attgtctcat ataggggttc cgcgcacatt atcatgacat taacctataa ggtgatgacg gtgaaaacct taagcggatg ccgggagcag cggggctggc ttaactatgc tgtgaaatac cgcacagatg aggctgcgca actgttggga gcgaaagggg gatgtgctgc cgacgttgta aaacgacggc 10387 8640 8700 8760 8820 8880 8940 9000 9060 9120 9180 9240 9300 9360 9420 9480 9540 9600 9660 9720 9780 9840 9900 9960 10020 10080 10140 10200 10260 10320 10380

<210> 9 <211> 20 <212> PRT <213> Circovírus porcino <400> 9 ser Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His His pro Pro ser 15 10 15

His Leu Gly Gin 20 <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Circovírus porcino 62 <40 0> 10 pro Arg His His Tyr Arg pro Arg Arg Lys Asn Gly ile Phe Asn Thr 15 10 15

Thr Leu Ser <210> 11 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Esta é uma sequência de aminoácidos para o circovirus porcino de tipo 2, fase de leitura aberta 2. <40 0> 11

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg 1 1 5 10 15 ser Hi s Leu Gly Gl n lie Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu val His Pro 20 25 30 Arg Hi s Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly ile Phe Asn Thr Arg 35 40 45 Leu ser Arg Thr Phe Gly Tyr Thr val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr 50 55 60 pro ser Trp Ala val Asp Met Met Arg Phe Asn ile Asp Asp Phe Val 65 70 75 80 Pro Pro Gly Gly 85 Gly Thr Asn 90 Lys lie ser i Ile 35 Pro Phe Glu Tyr Tyr Arg ile Lys Lys val Lys Val GlU Phe Trp Pro cys Ser Pro Ile Thr 100 105 110 Gin Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val ile Leu Asp Asp Asn 115 120 125 Phe Vai Thr Lys Ala Thr Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr 130 135 140

Ser Ser Arg His Thr He Pro Gin Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr 145 150 155 160 63

Phe Thr Pro Lys Pro vai Leu Asp ser Thr ile Asp Tyr Phe Gin Pro 165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gin Leu Trp Leu Arg Leu Gin Thr Ser Arg Asn 180 185 190

Vai Asp His Vai Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp 195 200 205

Gin Asp Tyr Asn Ile Arg vai Thr Met Tyr vai Gin Phe Arg Glu Phe 210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Lys Pro 225 250

Lisboa, 6 de Agosto de 2012 64

Claims (11)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composição imunogénica consistindo na proteína ORF-2 do Circovírus Porcino de Tipo 2 (PCV-2) e um ou mais veículos veterinariamente aceitáveis, para utilização na redução da infecção concomitante causada por PCV-2 e um ou mais patogénios virais, bacterianos e/ou fúngicos diferentes de PCV-2 em porcos.
2. 2. Composição imunogénica para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que os um ou mais veículos veterinariamente aceitáveis são seleccionados do grupo consistindo em solventes, meios de dispersão, revestimentos, adjuvantes, agentes estabilizantes, diluentes, conservantes, antibacterianos e agentes antifúngicos, agentes isotónicos e agentes de retardamento da adsorção.
3. 3. Composição imunogénica para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por a infecção concomitante ser causada por um patogénio virai.
4. 4. Composição imunogénica para utilização de acordo com a reivindicação 3, caracterizada por a infecção concomitante ser causada pelo vírus da Síndrome Reprodutiva e Respiratória Porcina (PRRS).
5. 5. Composição imunogénica para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por a infecção concomitante ser causada por um patogénio bacteriano. 1
6. 6. Composição imunogénica para utilização de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por a infecção concomitante ser causada por Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyopneumoniae, Pasteurella multocida, Salmonella spp., Streptococcus suis.
7. 7. Proteína ORF-2 de PCV-2 como antigénio para a redução da infecção concomitante causada por PCV2 e um ou mais patogénios virais, bacterianos e/ou fúngicos diferentes de PCV-2 em porcos.
8. 8. Proteína ORF-2 de PCV-2 como antigénio para a utilização de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a infecção concomitante ser causada por um patogénio virai.
9. 9. Proteína ORF-2 de PCV-2 como antigénio para a utilização de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por a infecção concomitante ser causada pelo vírus da PRRS.
10. 10. Proteína ORF-2 de PCV-2 como antigénio para a utilização de acordo com a reivindicação 7, caracterizada por a infecção concomitante ser causada por um patogénio bacteriano.
11. 11. Proteína ORF-2 de PCV-2 como antigénio para a utilização de acordo com a reivindicação 10, caracterizada por a infecção concomitante ser causada por Actinobacillus pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis, Mycoplasma hyorhinis, Mycoplasma hyopneumoniae, Pasteurella multocida, Salmonella spp., Streptococcus suis. Lisboa, 6 de Agosto de 2012 2