PT2140882E

PT2140882E - Agente para tratamento de doença pulmonar

Info

Publication number: PT2140882E
Application number: PT87516068T
Authority: PT
Inventors: Kensuke Egashira; Junji Kojima; Megumi Sakamoto
Original assignee: Univ Kyushu Nat Univ Corp; Kowa Co
Priority date: 2007-04-27
Filing date: 2008-04-25
Publication date: 2013-09-30
Also published as: EP2140882A1; EP2140882B1; CA2685054A1; CN101668542A; EP2140882A4; HK1141708A1; KR101530393B1; ES2425969T3; US20100086615A1; CA2685054C; CN101668542B; JPWO2008139703A1; KR20100015758A; JP4896220B2; WO2008139703A1

Description

ΕΡ 2 140 882/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Agente para tratamento de doença pulmonar"

Campo Técnico 0 presente invento refere-se ao fármaco pitavastatina para utilização no tratamento de doenças pulmonares (daqui em diante referido como um "um fármaco terapêutico para doença pulmonar"), fármaco que exibe excelentes efeitos de melhoramento de doenças pulmonares.

Antecedentes da Técnica

As doenças pulmonares intratáveis (p. ex., doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), fibrose pulmonar, sindroma da dificuldade respiratória aguda (SDRA) e hipertensão pulmonar) causam comprometimento da qualidade de vida e têm muito mau prognóstico. Tal doença pulmonar intratável (p. ex., hipertensão pulmonar) tem uma taxa de sobrevivência de cinco anos de 50% ou menos. Recentemente, novos medicamentos (p. ex., sildenafil, bosentan e infusão intravenosa continua de prostaciclina) têm sido utilizados para o tratamento de hipertensão pulmonar grave, mas estes medicamentos exibem efeitos insatisfatórios. Além disso, os medicamentos não podem completar a cura, por exemplo, da doença pulmonar obstrutiva crónica ou da fibrose pulmonar. Portanto, surgiu a necessidade de investigação e desenvolvimento de um método terapêutico fundamental e pouco invasivo para doenças pulmonares graves.

Muitas doenças respiratórias agudas ou crónicas (p. ex., asma brônquica, DPOC e fibrose pulmonar (pneumonia intersticial)) envolvem condições patológicas associadas a inflamação das vias aéreas. Tal como se sabe, no curso geral do desenvolvimento de condições inflamatórias, primeiramente, moléculas de sinalização (designadas "factor quimiotáctico") libertadas numa fase inicial promovem a migração de células inflamatórias (p. ex., neutrófilos, basófilos, eosinófilos e macrófagos) para regiões locais, e as células inflamatórias migratórias provocam a libertação de enzimas ou radicais que causam danos nos tecidos, bem como libertam citocinas ou 2 ΕΡ 2 140 882/ΡΤ factores semelhantes, para desse modo causarem ainda mais migração e activação de células inflamatórias. Quando tal inflamação é desenvolvida na vias respiratórias, as células inflamatórias infiltradas causam danos nos tecidos dos brônquios ou do pulmão, que eventualmente resultam em disfunções respiratórias caracteristicas das doenças acima mencionadas, tais como redução na taxa de fluxo respiratório ou capacidade de troca de oxigénio.

Com base em tais descobertas, fármacos exibindo efeito anti-inflamatório têm sido aplicados ao tratamento de doenças respiratórias inflamatórias. Como já se sabe, o esteróide do córtex supra-renal é notavelmente eficaz para asma brônquica suave a moderada (Documento Sem Ser de Patente 1) . Além disso, foi relatado que o esteróide do córtex supra-renal previne a exacerbação da DPOC. No entanto, o esteróide do córtex supra-renal apresenta um efeito limitado na DPOC (Documento Sem Ser de Patente 2) . Até ao momento, não foram ainda obtidos dados que suportem positivamente a eficácia do esteróide do córtex supra-renal em fibrose pulmonar (Documento Sem Ser de Patente 3). Entretanto, o esteróide do córtex supra-renal tem sido conhecido não só por inibir não especificamente a função imunitária, como também por causar possivelmente vários efeitos secundários, tais como anormalidade dos electrólitos, úlcera péptica, miopatia, anormalidade comportamental, cataratas, osteoporose, osteonecrose, e inibição do crescimento (Documento Sem Ser de Patente 4).

Com a penetração de terapias utilizando principalmente um esteróide inalado para o tratamento da asma brônquica, o número de pacientes externos de emergência ou pacientes internos com ataque asmático diminuiu, e o número de pacientes externos controláveis aumentou. Mesmo sob tais condições, o número de pacientes com asma não é reduzido, e as mortes de asmáticos por ataque fatal ainda ocorrem. Isto é, as terapias de combinação antiasmáticas actualmente disponíveis utilizando principalmente um esteróide inalado não exibem efeitos terapêuticos satisfatórios. Portanto, surgiu a necessidade do desenvolvimento de um novo agente terapêutico com elevada eficácia e efeitos secundários reduzidos. 3 ΕΡ 2 140 882/ΡΤ

Em anos recentes, estudos clínicos retrospectivos (estudos epidemiológicos) sobre inibidores da HMG-CoA-redutase, que exibem um potente efeito de redução do LDL-colesterol e são utilizados como fármacos de primeira escolha para o tratamento de hiperlipidemia, relataram que a utilização de inibidores de HMG-CoA-redutase contribui para a taxa de sobrevivência de pacientes de DPOC (Documentos Sem Ser de Patente 5 e 6). Outros estudos relataram anteriormente que os inibidores da HMG-CoA-redutase exibem um efeito anti-inflamatório, que é um dos efeitos pleiotrópicos, independente do efeito destes de abaixamento do LDL-colesterol, e sugeriram a possibilidade de aplicação de inibidores da HMG-CoA-redutase às doenças pulmonares inflamatórias acima mencionados (Documento Sem Ser de Patente 7) .

No entanto, quando um inibidor da HMG-CoA-redutase é administrado oralmente, o inibidor da HMG-CoA-redutase acumula-se especificamente no fígado através do envolvimento de um transportador de fármacos. Por conseguinte, é necessária a administração de altas doses de um inibidor da HMG-CoA-redutase para a acumulação do inibidor no pulmão para que o inibidor exiba efeitos numa doença pulmonar. No entanto, particularmente, a administração de altas doses de um inibidor da HMG-CoA-redutase pode suscitar preocupações acerca de efeitos secundários graves, tais como rabdomiólise. WO-A-OO/48626 divulga formulações farmacêuticas de aerossol compreendendo um inibidor da HMG-CoA-redutase, em particular estatinas, para utilização no tratamento de asma e hipertensão pulmonar. Difere do objecto do presente pedido na medida em que não divulga a utilização de nanopartículas de polímeros biocompatíveis que contenham o agente activo, nem o inibidor específico da HMG-CoA-redutase, pitavastatina.

Documento Sem Ser de Patente 1: GINA Guideline, 2006 Documento Sem Ser de Patente 2: GOLD Guideline, 2006 Documento Sem Ser de Patente 3: Walter N., et al., Proc. Am. Thorac. Soc., Vol. 3, 330-338, 2006 4 ΕΡ 2 140 882/ΡΤ

Documento Sem Ser de Patente 4: Goodman & Gilman,

Pharmacological Basis of Therapeutics, 10a ed., McGraw hill, 2001

Documento Sem Ser de Patente 5: Soyseth V., et al., Eur. Respir. J., 29: 279-283, 2007

Documento Sem Ser de Patente 6: Mancini GBJ, et al., J. Am. Coll. Cardlol., 47: 2554-2560, 2006

Documento Sem Ser de Patente 7: Hothersall E., et al., Thorax 61: 729-734, 2006

Divulgação da Invenção

Problemas a Resolver pelo Invento

Um objecto do presente invento consiste em proporcionar um excelente fármaco terapêutico para doença pulmonar apresentando uma alta eficácia e efeitos secundários reduzidos.

Meios para Resolver os Problemas

Os presentes inventores realizaram estudos extensivos para aplicação de um inibidor da HMG-CoA-redutase a um fármaco terapêutico de doença pulmonar, e como resultado, verificaram que quando um inibidor da HMG-CoA-redutase é incorporado em nanoparticulas de polímeros biocompatíveis, e as nanoparticulas são administradas directamente num local principal de lesão da doença pulmonar (i.e., dos bronquíolos aos alvéolos) , as nanoparticulas exibem um excelente efeito terapêutico da doença pulmonar a uma dose baixa. O presente invento foi realizado com base nesta descoberta.

Por conseguinte, o presente invento proporciona um fármaco terapêutico de doença pulmonar concebido para administração intratraqueal, compreendendo nanoparticulas de polímero biocompatível contendo um inibidor da HMG-CoA-redutase. O presente invento proporciona também a utilização de nanoparticulas de polímero biocompatível contendo um inibidor da HMG-CoA-redutase para a produção de um fármaco terapêutico para doença pulmonar concebido para administração intratraqueal. O presente invento proporciona também nanoparticulas de polímero biocompatível, contendo um 5 ΕΡ 2 140 882/ΡΤ inibidor da HMG-CoA-redutase, para utilização no tratamento de uma doença pulmonar através de administração intratraqueal. O presente invento proporciona também um método para o tratamento de uma doença pulmonar, compreendendo a administração por via intratraqueal de uma quantidade eficaz de nanopartículas de polímero biocompatível contendo um inibidor da HMG-CoA-redutase.

Efeitos da Invenção

De acordo com o presente invento, uma vez que nanopartículas de polímero biocompatível contendo um inibidor da HMG-CoA-redutase podem ser administradas directamente no pulmão através de um procedimento simples (p. ex., inalação), as nanopartículas são transferidas eficazmente para um local de lesão de doença pulmonar e são acumuladas em grandes quantidades no local da lesão. Assim, o presente invento proporciona um fármaco terapêutico de doença pulmonar que exibe maior eficácia a doses baixas e causa menos efeitos secundários, em comparação com o caso em que o inibidor da HMG-CoA-redutase é administrado oralmente com o propósito do tratamento de hiperlipidemia.

Breve Descrição dos Desenhos A FIG. 1 mostra o efeito da administração intratraqueal de nanopartículas de PLGA com pitavastatina de cálcio incorporada no número de células contidas no fluido de lavagem bronco-alveolar recuperado a partir de ratinhos com lesão pulmonar aguda induzida por LPS. A FIG. 2 mostra a taxa de sobrevivência de ratos com hipertensão pulmonar grave induzida por monocrotalina após administração intratraqueal de nanopartículas de PLGA com pitavastatina de cálcio incorporada.

Melhores Modos de Realização do invento 0 fármaco terapêutico de doença pulmonar concebido para administração intratraqueal do presente invento compreende nanopartículas de polímero biocompatível contendo o inibidor da HMG-CoA-redutase, pitavastatina. O ingrediente activo do 6 ΕΡ 2 140 882/ΡΤ fármaco é um inibidor da HMG-CoA-redutase. O inibidor da HMG-CoA-redutase utilizado no presente invento engloba o chamado composto de estatina, pitavastatina, que exibe actividade inibidora da sintese do colesterol e é conhecido como um agente terapêutico para hiperlipidemia. O inibidor da HMG-CoA-redutase preferido é a pitavastatina (Pedido de Patente Japonesa No. 2569746, Patentes U.S Nos. 5102888 e 5856336, Patente Europeia No. 304063), e sais destes. Exemplos de sais do inibidor da HMG-CoA-redutase incluem sais de metais alcalinos, sais de metais de terra alcalina, sais de amónio, e sais de alquilamónio. O sal do inibidor da HMG-CoA-redutase particularmente preferido é um sal de cálcio ou um sal de sódio.

No fármaco terapêutico de doença pulmonar do presente invento, o teor de inibidor da HMG-CoA-redutase das nanoparticulas é de preferência de 0,001 a 20% em peso, de maior preferência de 0,005 a 20% em peso, muito mais preferido de 0,01 a 20% em peso, particularmente de preferência de 0,05 a 15% em peso, do ponto de vista da distribuição eficaz do fármaco a um local de lesão do pulmão. Tal como aqui utilizado, a expressão "nanopartículas contendo um inibidor da HMG-CoA-redutase" engloba tanto o caso em que o inibidor da HMG-CoA-redutase está contido nas nanopartículas, como o caso em que o inibidor da HMG-CoA-redutase está adsorvido nas superfícies das nanopartículas.

Exemplos do polímero biocompatível que forma as nanopartículas incluem ácido poliláctico, ácido poliglicólico, ácido poliaspártico, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico, copolímeros de ácido aspártico-ácido láctico-ácido glicólico, poliamida, policarbonato, polialquileno (p. ex., polietileno), polipropileno, polietilenoglicol, óxido de polietileno, tereftalato de polietileno, compostos de polivinilo (p. ex., álcool polivinílico, éter polivinílico, e éster de polivinilo), polímeros de ácido acrílico-ácido metacrílico, celulose e outros polissacáridos, péptidos, proteínas, e copolímeros ou misturas destes. Destes, o ácido poliláctico, o ácido poliglicólico, um copolímero de ácido láctico-ácido glicólico 7 ΕΡ 2 140 882/ΡΤ (PLGA) e um copolímero de blocos de qualquer um destes polímeros e polietilenoqlicol (PEG) são os preferidos, sendo particularmente preferido um copolímero de blocos de um copolímero de ácido láctico-ácido qlicólico (PLGA) e polietilenoqlicol (PEG) (PLGA modificado com PEG, peg-PLGA). Qualquer um dos polímeros biocompativeis anteriormente mencionados pode conter nele um inibidor da HMG-CoA-redutase, e o polímero com fármaco contido pode ser armazenado durante um longo período de tempo, enquanto a eficácia do fármaco é mantida. É concebível que, em virtude da degradação do polímero biocompatível através de uma enzima in vivo, libertação sustida do inibidor da HMG-CoA-redutase possa ser alcançada no pulmão durante várias horas a várias dezenas de horas. 0 polímero biocompatível tem de preferência um peso molecular de 5000 a 200000, de preferência de 15000 a 25000. Quando o polímero biocompatível é um copolímero de ácido láctico-ácido glicólico (PLGA) , a razão em moles de ácido láctico para ácido glicólico pode ser de 1:99 a 99:1, mas é de preferência de 1:0,333. Um PLGA possuindo um teor de ácido láctico ou ácido glicólico de 25% em peso a 65% em peso é de preferência empregue, uma vez que um tal PLGA é amorfo e pode ser dissolvido num solvente orgânico tal como acetona.

As nanopartículas empregues no presente invento têm de preferência um tamanho de partícula de 30 nm a 10 pm, de maior preferência de 100 nm a 5 pm, do ponto de vista da libertação eficaz do fármaco num local da lesão do pulmão e incorporação eficaz de um inibidor da HMG-CoA-redutase. O tamanho de partícula das nanopartículas pode ser medido por meio de Coulter Counter N4 PLUS (produto de Beckman Coulter Inc.).

As nanopartículas empregues no presente invento podem ser produzidas através de um método descrito em, por exemplo, Journal of the Society of Powder Technology 42 (11) : 765-772 (2005), JP-A-2 0 03-2 752 81, JP-A-2004-262810, ou JP-A-2006-321763. 8 ΕΡ 2 140 882/ΡΤ

Em seguida, será descrito um exemplo de produção das nanoparticulas do presente invento através do método baseado na difusão de solvente de emulsão em água purificada.

Um PLGA é dissolvido num solvente orgânico tal como acetona, para preparar deste modo uma solução de polimero. A solução de polimero é misturada com um inibidor da HMG-CoA-redutase ou uma solução aquosa deste. A mistura resultante é adicionada gota a gota a uma solução aquosa de álcool polivinilico (PVA), água purificada, etc., sob agitação, para preparar desse modo uma emulsão. O solvente orgânico (p. ex., acetona) é removido por evaporação, para formar assim uma suspensão de nanoparticulas de PLGA e a suspensão é centrifugada. As nanoparticulas de PLGA assim precipitadas são recuperadas e ressuspensas em água purificada, e lavadas para que o excesso de PVA que não foi adsorvido na superfície das nanoparticulas de PLGA seja removido, seguido de liofilização, para formar assim um pó. Alternativamente, a suspensão de nanoparticulas de PLGA pode ser liofilizada sem ressuspensão, para formar assim pó.

As nanoparticulas do presente invento podem formar um composto com estrutura de ordem mais elevada, e englobar o composto de nanoparticulas assim formado. Tal composto de nanoparticulas pode ser produzido misturando uniformemente um álcool de açúcar com um líquido contendo nanoparticulas produzidas, por exemplo, através de qualquer um dos métodos acima mencionados, e liofilização da mistura resultante. Exemplos do álcool de açúcar incluem manitol, trealose, sorbitol, eritritol, maltitol e xilitol. A quantidade de álcool de açúcar é de preferência de 0,001 a 1% em peso, de maior preferência de 0,01 a 0,1% em peso, com base na totalidade do líquido contendo nanoparticulas.

De preferência, quando em utilização, as nanoparticulas do presente invento estão contidas numa solução aquosa, tal como solução salina (Farmacopeia Japonesa) (pH = 6,0) ou água purificada (pH = 6,8). O líquido contendo nanoparticulas contém de preferência um dispersante tal como o álcool polivinilico ou polietilenoglicol. A concentração de nanoparticulas do líquido contendo nanoparticulas é de preferência de 0,1 a 20% em peso, de maior preferência de 1 a 9 ΕΡ 2 140 882/ΡΤ 10% em peso, do ponto de vista da prevenção da agregação de partículas. A concentração de dispersante do líquido contendo nanopartículas é de preferência de 0,1 a 20% em peso, de maior preferência de 1 a 10% em peso, do ponto de vista da dispersão eficaz das nanopartículas. A dose diária das nanopartículas do presente invento (reduzida ao inibidor da HMG-CoA-redutase), que é apropriadamente determinada tendo em consideração o tipo de doença e sintomas, é de 0,001 a 100 mg, de preferência de 0,01 a 50 mg, de maior preferência de 0,01 a 30 mg, ainda de preferência de 0,1 a 10 mg. Particularmente, quando o inibidor da HMG-CoA-redutase é pitavastatina ou um sal desta, a dose diária deste é de preferência de 0,001 a 50 mg, de maior preferência de 0,01 a 30 mg. A administração do fármaco do presente invento ao pulmão é de preferência realizada por meio de, por exemplo, um inalador ou um nebulizador. A frequência de administração pode ser de uma vez a três vezes por dia, no caso de dose de alta frequência, ou pode ser de uma vez a cada dois ou três dias ou uma vez por semana, no caso de dose de baixa frequência.

Quando o fármaco do presente invento é administrado directamente ao pulmão (p. ex., dos bronquíolos aos alvéolos), o fármaco é distribuído a um local de lesão do pulmão, e o inibidor da HMG-CoA-redutase é libertado durante um longo período de tempo. Portanto, uma dose baixa do fármaco efectua um tratamento seguro de uma doença pulmonar. Exemplos da doença pulmonar a tratar pelo fármaco incluem hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crónica, fibrose pulmonar, síndroma da dificuldade respiratória, asma brônquica, doença pulmonar inflamatória, pneumonia e bronquite. O fármaco é particularmente útil para o tratamento de hipertensão pulmonar. Quando é empregue esteróide do córtex supra-renal para o tratamento de doença pulmonar, em combinação com o fármaco terapêutico do presente invento, a dose do esteróide do córtex supra-renal pode ser reduzida, o que conduz à redução dos efeitos secundários do esteróide. 10 ΕΡ 2 140 882/ΡΤ

Exemplos Ο presente invento será em seguida descrito em mais detalhe por meio de exemplos, que não devem ser entendidos como limitando o invento a estes.

Exemplo 1 Método para a preparação de nanoparticulas de PLGA com sal de cálcio de pitavastatina incorporado A incorporação de um sal de cálcio de pitavastatina (pitavastatina de cálcio) (Patente Japonesa No. 2569746, Patentes US Nos. 5102888 e 5856336, Patente Europeia No. 304063) em nanoparticulas de PLGA foi realizada de acordo com um método previamente relatado baseado em difusão de solvente de emulsão em água purificada (Journal of the Society of Powder Technology 42: 765-772 (2005)).

Um copolimero de ácido láctico-ácido glicólico (PLGA, peso molecular: 20000, razão de ácido láctico/ácido glicólico: 75/25) (1 g) e pitavastatina de cálcio (0,025 g) foi dissolvido em acetona (40 ml) e foi adicionado etanol (20 ml) à solução, para deste modo preparar uma solução de polimero. A solução de polímero foi adicionada gota a gota a uma solução aquosa de PVA (uma solução aquosa (100 ml) contendo PVA (0,5 g) ) agitada a 400 rpm por meio de um agitador, para deste modo formar uma emulsão. O solvente orgânico foi removido a partir da emulsão através de evaporação com agitação sob pressão reduzida a 40°C durante uma hora, seguido de filtração com um filtro de membrana. Posteriormente, o filtrado foi liofilizado, para assim produzir as nanoparticulas de PLGA de interesse na forma de pó. Verificou-se que as nanoparticulas de PLGA têm um teor de pitavastatina de cálcio de 1,3% em peso. Como controlo, nanoparticulas de PLGA não contendo pitavastatina de cálcio foram preparadas do mesmo modo descrito acima, excepto que não foi adicionada pitavastatina de cálcio. 11 ΕΡ 2 140 882/ΡΤ

Exemplo 2 Método para a preparação de nanopartículas de PLGA modificado com PEG com pitavastatina de sal de cálcio incorporada PLGA modificado com PEG (PEG-PLGA) (2 g) e pitavastatina de cálcio (0,1 g) foram dissolvidos em acetona (20 ml) e foi adicionado etanol (10 ml) à solução, para deste modo preparar uma solução de polímero. A solução de polímero foi adicionada gota a gota a água purificada (50 ml) agitada a 400 rpm e a 40°C. O solvente orgânico foi removido da emulsão através de evaporação sob pressão reduzida a 40°C durante duas horas, e, em seguida, a suspensão foi filtrada com um filtro de membrana possuindo um tamanho de poro de 32 pm, de modo a remover agregados de nanopartículas. O filtrado foi empregue tal como está no Exemplo de Teste 2. Verificou-se que o líquido contendo nanopartículas tem um teor de pitavastatina de cálcio de 0,0998% em peso.

Exemplo de Teste 1

Efeito da administração intratraqueal de nanopartículas de PLGA com pitavastatina de cálcio incorporada em células inflamatórias no modelo de lesão pulmonar aguda induzida por LPS Método de teste:

Ratinhos BALB/c machos adquiridos em Charles River Laboratories Japan Inc. (oito semanas de idade no teste) foram preliminarmente aclimatizados numa câmara de criação (temperatura: 21 ± 2°C, humidade: 50 ± 20%, período de luz: das 7:00 às 19:00), sob condições onde a alimentação e a água foram fornecidas ad libitum. Os ratinhos assim criados foram empregues para o teste. Para o teste, os ratinhos foram divididos nos seguintes três grupos: um grupo de ratinhos sem exposição por inalação a LPS (lipopolissacárido) (grupo de Controlo (-) , n = 7), um grupo de ratinhos com administração de nanopartículas de PLGA sem pitavastatina de cálcio incorporada e depois exposição por inalação a LPS (grupo de Controlo ( + ) , n = 14); e um grupo de ratinhos com administração de nanopartículas de PLGA com pitavastatina de 12 ΕΡ 2 140 882/ΡΤ cálcio incorporada e depois exposição por inalação a LPS (grupo de Pitava, n = 13).

Cada um dos ratinhos do grupo de Controlo (+) e do grupo de Pitava foi anestesiado através de injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (50 mg/10 ml/kg) e a cervical do ratinho foi incisada e a via aérea deste foi exposta. Nanoparticulas de PLGA sem pitavastatina de cálcio incorporada (para os ratinhos do grupo de Controlo ( + ) ) ou nanoparticulas de PLGA com pitavastatina de cálcio incorporada (para os ratinhos do grupo de Pitava) foram suspensas em solução salina sob observação visual, e a suspensão resultante (50 μΐ) foi administrada intratraquealmente juntamente com ar (200 μΐ) através de uma agulha de injecção 27G. Após administração intratraqueal, a cervical foi suturada, e os ratinhos despertos da anestesia regressaram sequencialmente à gaiola de criação. A dose (em peso) de administração de cada tipo de nanoparticulas de PLGA foi de 15 pg/corpo (teor de pitavastatina de cálcio: 0,2 pg/corpo por o grupo de Pitava). O liquido de nanoparticulas a administrar foi reconstituído na utilização através de suspensão das nanoparticulas em solução salina, seguida de sujeição a ultra-sons durante 30 segundos por meio de um homogeneizador de ultra-sons.

Vinte e quatro horas após a administração intratraqueal, cada um dos ratinhos aos quais foram administradas nanoparticulas de PLGA foi transferido para uma gaiola feita de material acrílico e possuindo as dimensões internas de 26 cm (L) x 26 cm (C) χ 10 cm (A) e LPS (Sigma) (30 pg/ml) nebulizado por meio de um nebulizador ultra-sónico (Omron Corporation) foi alimentado à gaiola para exposição por inalação do ratinho a LPS. A exposição por inalação foi continuada durante 30 minutos, e o ratinho assim exposto regressou à gaiola de criação. Quatro horas após o início da exposição por inalação ao LPS, cada um dos ratinhos de teste foi anestesiado através de injecção intraperitoneal de pentobarbital de sódio (50 mg/10 ml/kg). A aorta abdominal do ratinho foi dissecada para sangrar até à morte. Posteriormente, a cervical posterior do ratinho foi incisada, e um tubo de polietileno com um diâmetro externo de 1,2 mm (SP55, produto de Natsume Seisakusho Co., Ltd.) foi fixado no 13 ΕΡ 2 140 882/ΡΤ brônquio. Lavagem broncoalveolar foi realizada repetindo três vezes um processo incluindo a injecção e recuperação de solução salina tamponada com fosfato (PBS) (1 ml). O fluido de lavagem broncoalveolar assim recuperado (FLBA), foi submetido a centrifugação a 1000 rpm e 4°C durante 10 minutos, e as células migradoras colhidas foram ressuspensas em PBS (200 μΐ) . O número total de células e o número de neutrófilos foram contados por meio de um analisador de hematologia automático (XT-2000Í, Sysmex).

Resultados do teste: A Tabela 1 e a Fig. 1 mostram os resultados (valor médio (representado pela percentagem em relação à média (tomada como 100) dos dados do grupo de Controlo (+)), e erro padrão) .

Tabela 1

n Valor médio Erro padrão Número total de células grupo de Controlo (-) 7 14, 6 3,6 grupo de Controlo (+) 14 100 CO CO grupo de Pitava 13 74, 0 5,4 Número de neutrófilos grupo de Controlo (-) 7 4, 7 3,1 grupo de Controlo (+) 14 100 OO grupo de Pitava 13 72,6 OO LO A administração intratraqueal de nanoparticulas de PLGA com pitavastatina de cálcio incorporada inibiu significativamente a migração de células inflamatórias (p < 0,05). Os dados indicaram que a migração de células inflamatórias é inibida não pelas próprias nanopartículas de PLGA, mas pelas nanopartículas de PLGA com pitavastatina de cálcio incorporada. De um modo semelhante ao descrito acima, foi realizado outro teste através da utilização de uma solução preparada através da dissolução de pitavastatina de cálcio (isto é, forma não incorporada no polímero) (0,2 pg/corpo, 2 pg/corpo ou 20 pg/corpo) em solução salina (50 pl) . No entanto, a administração intratraqueal de qualquer uma das três doses de pitavastatina de cálcio acima mencionadas não exibiu o efeito de inibição da migração de células inflamatórias (um grupo de não administração de 14 ΕΡ 2 140 882/ΡΤ pitavastatina de cálcio: n = 8, e um grupo de administração de pitavastatina de cálcio (qualquer uma das doses acima mencionadas): n = 8). Nos testes acima mencionados, a administração local de nanoparticulas de PLGA com pitavastatina de cálcio incorporada no pulmão inibiu a resposta inflamatória induzida por LPS. Neste caso, a dose de pitavastatina de cálcio necessária para inibição da resposta inflamatória foi consideravelmente reduzida, em comparação com o caso em que a pitavastatina de cálcio foi administrada sem ser incorporada em nanoparticulas de PLGA. Isto indica que as nanopart!cuias de PLGA com pitavastatina de cálcio incorporada são úteis para o tratamento de uma doença pulmonar associada a inflamação.

Exemplo de Teste 2

Teste no tratamento de hipertensão pulmonar através de administração intratraqueal de nanopartículas de PLGA com pitavastatina de cálcio incorporada Método de teste:

Monocrotalina (MCT) foi injectada subcutaneamente (60 mg/kg de peso corporal) em ratos SD machos (sete semanas de idade, 250 a 300 g) , para deste modo preparar ratos com hipertensão pulmonar induzida por MCT (a hipertensão pulmonar grave é estabelecida três semanas após a administração de MCT). Os ratos foram divididos nos seguintes dois grupos: (1) um primeiro grupo (i.e., um grupo de ratos com administração de nanopartículas de PLGA modificado com PEG com pitavastatina de cálcio incorporada (grupo de administração de nanopartículas, n = 26)); e (2) um segundo grupo (i.e., um grupo de ratos com administração de PBS (controlo) (grupo de controlo, n = 41)). No dia 21 após a administração de MCT, a cervical anterior de cada rato foi incisada. Um líquido contendo nanopartículas de PLGA modificado com PEG contendo pitavastatina de cálcio incorporada (produzido no Exemplo 2 acima) (100 μΐ) e ar (100 μΐ) foram administrados

intratraquealmente a cada um dos ratos do primeiro grupo, e PBS (100 μΐ) e ar (100 μΐ) foram administrados intratraquealmente a cada um dos ratos do segundo grupo. Verificou-se que as nanopartículas de PLGA modificado com PEG 15 ΕΡ 2 140 882/ΡΤ com pitavastatina de cálcio incorporada contêm pitavastatina de cálcio numa quantidade de 100 pg/corpo. A sobrevivência dos ratos foi observada durante um período de 14 dias após a administração das nanopartícuias.

Resultados do teste:

Tal como mostrado na Tabela 2 e na Fig. 2, no grupo de controlo a taxa de sobrevivência dos ratos (14 dias após a administração) foi reduzida para 37%, enquanto que no grupo de administração de nanopartícuias a taxa de sobrevivência (14 dias após a administração) dos ratos foi de 69%, o que foi significativamente melhor em relação à do grupo de controlo (p < 0,01) .

Tabela 2 Número de ratos empregues Número de ratos que sobreviveram 14 dias após a administração Taxa de sobrevivência Grupo de controlo 41 15 37% Grupo de administração de nanopartículas 26 18 69%

Os resultados do teste correspondem ao caso em que uma dose muito baixa de pitavastatina de cálcio (ou seja, 100 pg) é administrada uma vez para o tratamento de hipertensão pulmonar. Os dados acima indicam que a administração intratraqueal de nanopartículas de PLGA de pitavastatina de cálcio incorporada é muito eficaz. No caso em que um inibidor de HMG-CoA-redutase é administrado por via oral para o tratamento da hiperlipidemia, sal de cálcio de atorvastatina requer uma dose elevada (10 a 80 mg/dia) , sal de cálcio de pitavastatina requer uma dose baixa (1 a 4 mg/dia). Os dados obtidos nos Exemplos de Teste 1 e 2 indicam que a administração intratraqueal de nanopartículas de polimero biocompatível com inibidor de HMG-CoA-redutase incorporado exibe o efeito de supressão de uma doença pulmonar, mesmo quando a dose do inibidor da HMG-CoA-redutase é inferior à deste no caso em que o inibidor é utilizado para o tratamento de hiperlipidemia.

Lisboa, 2013-09-23

Claims

ΕΡ 2 140 882/ΡΤ 1/1 REIVINDICAÇÕES 1. Fármaco concebido para administração intratraqueal para utilização em terapia de doença pulmonar, o referido fármaco compreendendo nanopartícuias de polímero biocompatível contendo pitavastatina ou um sal desta como inibidor da HMG-CoA-redutase, em que o referido polímero biocompatível é um copolímero de ácido láctico-ácido glicólico, ou um copolímero de blocos de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e polietilenoglicol.
2. Fármaco de acordo com a reivindicação, em que a doença pulmonar é hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crónica, fibrose pulmonar, síndroma da dificuldade respiratória aguda, asma brônquica, doença pulmonar inflamatória, pneumonia, ou bronquite.
3. Nanoparticulas de polímero biocompatível contendo pitavastatina ou um sal desta como um inibidor da HMG-CoA-redutase, para utilização no tratamento de uma doença pulmonar através de administração intratraqueal; em que o referido polímero biocompatível é um copolímero de ácido láctico-ácido glicólico, ou um copolímero de blocos de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico e polietilenoglicol.
4. Nanoparticulas de polímero biocompatível de acordo com a reivindicação 3, em que a doença pulmonar é hipertensão pulmonar, doença pulmonar obstrutiva crónica, fibrose pulmonar, síndroma da dificuldade respiratória aguda, asma brônquica, doença pulmonar inflamatória, pneumonia, ou bronquite. Lisboa, 2013-09-23