PT2053063E

PT2053063E - Moléculas de reconhecimento para o tratamento e detecção de tumores

Info

Publication number: PT2053063E
Application number: PT81719239T
Authority: PT
Inventors: Steffen Goletz; Uwe Karsten; Renate Stahn; Antje Danielczyk
Original assignee: Glycotope Gmbh
Priority date: 2003-01-23
Filing date: 2004-01-23
Publication date: 2013-09-24
Also published as: EP1585770A2; DE502004008910D1; CY1114409T1; EP2053063A1; SI2053063T1; PT1585770E; EP1585770B1; US8779102B2; DK1585770T3; CY1108965T1; US20150005474A1; ES2321298T3; US20060292643A1; EP2053063B1; US9845361B2; WO2004065423A3; ATE421537T1; SI1585770T1; DE10303664A1; DK2053063T3

Description

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Descrição "Moléculas de reconhecimento para o tratamento e detecção de tumores" A invenção diz respeito a moléculas de reconhecimento direcionadas para tumores, a composições farmacêuticas que compreendem as moléculas de reconhecimento, processos para o fabrico das moléculas de reconhecimento, e a utilização das moléculas de reconhecimento para o fabrico de uma composição farmacêutica para o diagnóstico e terapia de doenças tumorais.

As doenças tumorais pertencem às doenças mais frequentes dos organismos, especialmente de mamíferos tais como os seres humanos. Em particular, um tratamento bem-sucedido de uma doença tumoral depende do estado do desenvolvimento tumoral em que a terapia foi iniciada. É vantajoso quando a terapia pode ser iniciada numa altura, em que o tumor tem uma expansão e difusão mínima dentro do corpo, com a expansão a ser entendida como sendo o tamanho individual do tecido tumoral, e a difusão sendo entendida como sendo a metastasização ou infiltração possíveis em órgãos circundantes. Um organismo que sofre de uma doença tumoral secrega, determinadas substâncias mais complexas ou moléculas mais simples que podem ser utilizadas no diagnóstico de tumores em fase precoce da doença, isto é, de tumores pequenos. Destas estruturas as mais conhecidas são os marcadores tumorais. Em geral, os marcadores tumorais são substancias químicas que são mais ou menos específicas para um determinado tipo de tumor ou que surgem em maior quantidade, em associação com um tumor. Os marcadores tumorais podem ser de natureza celular, tais como por exemplo oncogenes, determinados receptores hormonais ou antigénios de membrana, tais 2 como por ex. o CA 2, CA 3, CA 19-19 e outros. No entanto, os marcadores tumorais também podem ser marcadores humorais sendo produzidos por um tumor ou induzidos por um tumor. Mais especificamente ao grupo de marcadores tumorais produzidos por tumores pertencem antigénios, hormonas, enzimas e outros compostos associados a tumores. Por exemplo, os marcadores tumorais humorais induzidos por tumores são enzimas, tal como a fosfatase alcalina ou por exemplo, a proteína de fase aguda (por exemplo, a ferritina). Na estado da técnica, os marcadores tumorais são detectados preferencialmente utilizando métodos imunológicos, razão pela qual o sinónimo "antigénio tumoral" é frequentemente utilizado para designar os marcadores tumorais. Antigénios tumorais conhecidos são antigénios oncofetais, antigénios associados ao tipo de sangue, antigénios específicos de órgãos e outros antigénios, tal como o CA 15-3, por exemplo.

Os diagnósticos de cancro utilizando marcadores tumorais com moléculas de reconhecimento apresentam várias desvantagens. Assim, alguns marcadores tumorais podem também estar presentes em doenças não-cancerígenas, pelo que as moléculas de reconhecimento empregues indicam uma reacção positiva; além disso, uma não interacção com as moléculas de reconhecimento não significa a ausência de uma doença tumoral. Uma outra desvantagem é que as moléculas de reconhecimento conhecidas são normalmente inespecíficas. Ou seja, a detecção positiva raramente indica um tipo específico de doença tumoral. Além disso, uma outra desvantagem crucial de moléculas de reconhecimento conhecidas é que só podem ser utilizadas de forma limitada na monitorização do desenvolvimento de tumores, por exemplo após uma cirurgia. Assim, os marcadores tumorais bem conhecidos não podem em regra ser utilizados no reconhecimento 3 precoce ou na reabilitação, especialmente não podem ser utilizados na profilaxia.

Para além destas desvantagens gerais, surgem algumas desvantagens especificas nas moléculas de reconhecimento orientadas para antigénios tumorais que diferem apenas na sua glicosilação de um antigénio correspondente no tecido normal. Os anticorpos são requeridos para serem dependentes da glicosilação e devem reflectir a alteração no estado de glicosilação do antigénio num tumor. Assim, por exemplo, a glicosilação de MUC1 nas células tumorais da mama é alterada. Verifica-se uma redução massiva no comprimento da cadeia de O-glicanos e uma redução da O-acetilação do ácido siálico.

Uma outra desvantagem das moléculas de reconhecimento dos marcadores tumorais conhecidos é que só tornam o tumor reconhecível, quando este já atingiu uma dimensão crítica. Isto é, as fases iniciais de crescimento tumoral não podem ser determinadas com as moléculas de reconhecimento dirigidas para os marcadores tumorais conhecidos. A mucina MUC1 epitelial polimórfica, na forma da molécula global, é um marcador tumoral reconhecido. Von Price M. et al., Tumor Biology 1989, 19 (1) : 1-20, descrevem a análise de um grande número de anticorpos monoclonais contra a mucina MUC1. Como consequência da complexidade da molécula, que é muito grande, altamente glicosilada, extracelular, consistindo essencialmente num grande número de repetições paralelas polimórficas de resíduos de 20 aminoácidos, e tem glicosilação heterogénea no que diz respeito às repetições paralelas, o MUC1 possui uma variedade de epitopos. Uma desvantagem existente é o facto de que não se sabe qual o epítopo no MUC1 é que tem uma adequabilidade óptima como uma estrutura alvo 4 para a terapia e o diagnóstico tumoral. Uma outra desvantagem é que os anticorpos específicos de MUC1 convencional (que disponibilizam um reconhecimento relativamente bom de MUC1 em determinados tumores) também dão elevados níveis de reconhecimento de tal MUC1 libertado no soro por células tumorais (Shedding-contágio). Obviamente, tais níveis elevados de ligação ao MUC1 presente no soro em doentes com tumores é desvantajoso na terapia de doenças tumorais utilizando tais anticorpos específicos de MUC1. Um outro inconveniente é que a maioria dos anticorpos específicos de MUC1 apresenta também, ligação a vários tecidos normais. 0 objectivo da invenção é, portanto, o de fornecer moléculas de reconhecimento com as quais tumores possam ser detectados de uma forma fácil, fiável e eficaz, e, além disso, possam ser usadas na profilaxia, terapia e/ou reabilitação de tumores e metásteses e que não apresentem, ou apresentem um nível baixo de ligação ao MUC1 libertado no soro e não apresentem ou apresentem um nível baixo de ligação ao tecido normal. A invenção resolve este problema técnico disponibilizando moléculas de reconhecimento, caracterizadas por compreenderem as seguintes sequências de aminoácidos: (i) uma sequência de aminoácidos possuindo uma homologia de pelo menos 60%, preferencialmente de 70%, preferencialmente 80%, muito especialmente preferida de 90% em relação à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ou 2 e ou 4, e (ii) uma sequência de aminoácidos possuindo uma homologia de pelo menos 60%, preferencialmente de 70%, preferencialmente 80%, muito especialmente preferida de 90% em relação à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 5 (iii) sequência de aminoácidos possuindo uma homologia de pelo menos 60%, preferencialmente 70%, preferencialmente 80%, muito especialmente preferida de 90% em relação à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5 ou 6; e que se liga especificamente ao epitopo tumoral MUC1 glicosilado de tal forma que a força da ligação é aumentada pelo menos por um factor de 20 em comparação com a ligação ao péptido não glicosilado com o mesmo comprimento e sequência péptidica.

Com as mudanças necessárias, as definições dos termos dados a seguir também se aplicam às declarações feitas acima, àquelas feitas aqui e a seguir.

De acordo com a invenção, o termo molécula de reconhecimento é entendido como referindo-se a uma molécula a qual, especialmente sob condições estritas, especificamente liga o epitopo do tumor de MUC1 glicosilado. Por exemplo, condições estritas são concentrações elevadas de sal e lavagem excessiva usando detergentes suaves, tais como o NP-40 ou o Tween.

De acordo com a invenção, "epitopo tumoral MUC1 glicosilado" é entendido como sendo um epitopo o qual compreende pelo menos uma sequência de PDTRP de repetição paralela de MUC1 e é glicosilado com GalNAc ou Gal-GalNAc na treonina de PDTRP.

De acordo com a invenção, ligação especifica do epitopo do tumor de MUC1 glicosilado é entendida como sendo a ligação das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção, que compreende uma combinação das seguintes propriedades de ligação: 6 a) A ligação nos métodos de ensaio, conforme descrito no Exemplo 5 à região de PDTRP glicosilada dentro de uma sequência de repetição paralela de MUC1 que consiste em 1 a 1,5 repetições paralelas (molécula composta por 30 aminoácidos, ver o exemplo 5) e à treonina glicosilada com GalNAcalphal-O-Thr (a seguir referida como GalNAc) ou com Galbetal-3GalNAcalfal-0-Thr (designado a seguir por Gal-GalNAc) na treonina, em que a força de ligação é multiplicada várias vezes, quando comparada com o péptido não-glicosilado do mesmo comprimento e com a mesma sequência péptidica. Conforme definido aqui, "multiplicado várias vezes" significa que a proporção da ligação do glicopéptido MUC1 glicosilado em PDTRP e o péptido não-glicosilado atinge um factor de > 4,5 num ensaio, conforme descrito no Exemplo 5.1 (utilizando o glicopéptido ou o péptido de MUCl nele descrito com um comprimento de 30 aminoácidos, o qual corresponde a 1,5 repetições paralelas). b) A ligação em métodos de ensaio, como descrito no exemplo 5.2 em múltiplas repetições paralelas de MUCl não glicosiladas que consistem de pelo menos 3 repetições paralelas, preferivelmente 5 repetições paralelas. c) Uma ligação estatisticamente claramente reduzida ao MUCl que ocorre no soro de doentes com carcinoma do cólon que é libertado pelas células tumorais, em comparação com os anticorpos do teste CA15-3 (Exemplo 11) e de HMFG-1 (ver também o Exemplo 11). O método de teste utilizado para este efeito é ilustrado com mais pormenor no Exemplo 11. d) Conforme descrito no Exemplo 6, a interacção entre o antigénio e a molécula de reconhecimento é aumentada ou não é influenciada pelo tratamento com neuraminidase. 7 e) Não há nenhuma ligação ou quase nenhuma ligação detectável ao tecido normal do cólon e ligação forte específica ao tecido tumoral do cólon (ver o Exemplo 6).

As moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção possuem uma estrutura que provoca a interacção específica das moléculas de reconhecimento com o MUC1 na forma de uma ligação específica ao epítopo tumoral de MUC1 glicosilado com as propriedades de ligação descritas, devido às sequências de aminoácidos incluídas definidas de acordo com a invenção que são apresentadas acima e a seguir.

Numa outra concretização preferida da invenção a molécula de reconhecimento compreende uma sequência de aminoácidos que contém a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 1, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 3, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 5, em que a referida molécula de reconhecimento se liga especificamente ao epítopo tumoral de MUC1 glicosilado.

Numa outra forma de concretização preferida da invenção a molécula de reconhecimento compreende uma sequência de aminoácidos que contém a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 2 e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 6, em que a referida molécula de reconhecimento se liga especificamente ao epítopo tumoral de MUCl glicosilado. Estas moléculas de reconhecimento apresentam um aumento na ligação de um factor > 20 de acordo com a) . Vantajosamente, estas moléculas de reconhecimento apresentam além disso, pelo menos uma das seguintes propriedades: 8 f) uma ligação a múltiplas repetições paralelas não-glicosiladas como em b) com um factor da proporção de ligação a uma repetição paralela de MUC1 não-glicosilado com 5 repetições paralelas a um péptido de MUC1 não-glicosilado com uma repetição paralela de > 8 (ver sequência de péptidos e o método de ensaio no Exemplo 5) . 0 método de ensaio para a determinação do referido factor é ilustrado em maior detalhe no Exemplo 5.2. g) um aumento da força de ligação, por se aumentar o número de repetições paralelas glicosiladas (região PDTR de glicosilação múltipla) (ver o Exemplo 5.3).

Vantajosamente, outras moléculas de reconhecimento preferidas possuem todas as propriedades de ligação de a) até g).

As moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção combinam as propriedades acima descritas, sendo assim vantajosas no diagnóstico e na terapia de tumores. Elas diferem de anticorpos bem conhecidos não só como um resultado das suas novas sequências, mas também como um resultado da sua excelente especificidade para o MUC1, uma vez que se ligam especificamente ao epitopo tumoral de MUC1 glicosilado, apresentando apenas uma ligação mínima ao MUC1 do soro de doentes com carcinoma do cólon, praticamente nenhuma ligação ao tecido normal do cólon e forte ligação ao tecido do tumor do cólon. Além disso, as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção reconhecem os tumores do cólon já como carcinomas in situ, mas não conseguem reconhecer displasias ligeiras, distinguindo assim, entre tumores perigosos e doenças benignas. Dadas essas propriedades e a sua elevada afinidade, elas são particularmente adequadas para a utilização na terapêutica, bem como no diagnóstico, oferecendo assim vantagens em relação aos anticorpos de MUC1 conhecidos. 9 A combinação das propriedades das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção é surpreendente, uma vez que entre a grande variedade de anticorpos de MUC1 conhecidos, não existe até agora nenhum anticorpo que tenha propriedades correspondentes.

Isto mostra a superioridade das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção em relação aos anticorpos de MUCl convencionais.

Consequentemente, os anticorpos convencionais apresentam claras desvantagens em comparação com as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção, tal como irá ser brevemente exemplificado a seguir.

Exemplos de diferenças na especificidade: nas investigações indicadas no Exemplo 5.1, o HMFG-1 (patentes norte-americanas de invenção No. 5804187, 6315997) e o C595 (patente WO 02/44217) ligam-se aos péptidos de MUCl independentemente da glicosilação e, portanto, não se ligam ao epitopo tumoral de MUCl glicosilado. Por exemplo, o HMFG-1 também se liga ao tecido normal do cólon. Como pode ser verificado, não apresentam a ligação vantajosa das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção. De acordo com o teste no Exemplo 5.1, o SM3 (patente norte-americana de invenção No. 5683674) obtido pela imunização com MUCl derivado de material não tumoral humano (goticulas de gordura do leite) liga-se os péptidos derivados de MUCl glicosilados e não glicosilados praticamente na mesma medida, com um ligeiro aumento de um factor de cerca de 1,5, não apresentando a ligação vantajosa ao epitopo tumoral. Além disso, o SM3 não demonstra qualquer dependência acentuada em relação ao número de repetições paralelas de MUCl 10 glicosiladas nem não glicosiladas (Exemplos 5.2 e 5.3) . O DF3 tem sido descrito como um anticorpo especifico de MUC1 que se liga preferencialmente aos péptidos derivados de MUC1 independentemente da glicosilação (patente WO 93/20841, patente norte-americana de invenção No. 5506343) . Além disso, a ligação do DF3 a MUC1 ou a células tumorais que transportam o MUC1 é drasticamente reduzida ou completamente inibida, através do tratamento com a neuraminidase (Dai J. et al. , 1998; Hinoda et al.r 1992). Além disso, o HMFG-1 e o DF3 ligam-se fortemente ao MUC1 tumoral no soro, especialmente em doentes com carcinoma mamário, mas também em doentes com carcinoma do cólon (ver o Exemplo 11) . Assim, eles não apresentam as propriedades de ligação vantajosas das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção.

As moléculas de reconhecimento são caracterizadas de acordo com a definição acima, essencialmente, através das suas propriedades de ligação no que diz respeito aos tecidos do cólon normal e tumorais. Isto mostra que, as referidas moléculas de reconhecimento são vantajosas na terapia e diagnóstico de tumores do cólon e das suas metástases, quando comparadas com anticorpos anti-MUCl convencionais. No entanto, as referidas moléculas de reconhecimento são vantajosas não somente para o tratamento e para o diagnóstico de carcinomas do cólon e outros tumores gastrointestinais, mas também para outras doenças tumorais e metástases, preferencialmente doenças tumorais positivas para MUC1 e metástases, por exemplo, carcinomas mamários, tumores gastrointestinais, incluindo carcinomas do cólon, carcinomas do estômago, cancro do intestino grosso e cancro do intestino delgado, carcinomas do pâncreas, carcinomas dos ovários, cancro do pulmão, carcinomas de células renais, mielomas múltiplos e/ou as suas metástases. Isto é comprovado pelos dados do Exemplo 6, demonstrando a ligação 11 específica das moléculas de reconhecimento às células tumorais de várias doenças tumorais. A descrição detalhada das propriedades de ligação em relação aos carcinomas do cólon serve para tornar claras as vantagens e estabelecer os parâmetros adequados para a caracterização da ligação das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção.

Numa concretização preferida uma molécula de reconhecimento de acordo com a invenção que se liga especificamente ao epítopo tumoral de MUC1 glicosilado, inclui: a) uma primeira sequência de aminoácidos que contém a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 1 ou 2 e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 3 ou 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 5 ou 6; e b) uma segunda sequência de aminoácidos a que contém a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 7 ou 8 e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 9 ou 10 e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 11 ou 12. A primeira e a segunda sequência de aminoácidos podem ocorrer num ou mais e preferivelmente em dois polipéptidos.

Seguidamente por razões de simplicidade, as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção que se ligam especificamente ao epítopo tumoral de MUC1 glicosilado no sentido da invenção, serão também referidas como moléculas de reconhecimento específicas ou de ligação a MUC1.

As moléculas de reconhecimento de ligação ao MUC1 preferidas são caracterizadas pelo facto de conterem um conjunto definido de sequências individuais de aminoácidos. A combinação das sequências de aminoácidos resulta numa estrutura das referidas moléculas de 12 reconhecimento, que como propriedade, apresentam a combinação acima descrita das propriedades de ligação no que diz respeito ao epitopo tumoral de MUC1 glicosilado. A sequência de aminoácidos destas moléculas de reconhecimento inclui um ou dois tripletos de sequências definidas. Estas sequências representam os dominios de ligação e definem a especificidade das moléculas de reconhecimento. A molécula de reconhecimento do tripleto 1 compreende a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ou 2, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ou 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 5 ou 6. As moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 definidas por dois tripletos compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ou 2, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ou 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 5 ou 6 para o primeiro tripleto, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 7 ou 8, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 9 ou 10 e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 11, ou 12 para o segundo tripleto. O primeiro e o segundo tripleto podem estar presentes tanto numa ou em várias cadeias de polipéptidos, que, no último caso, em conjunto formam a molécula de reconhecimento de ligação. Seguidamente, no âmbito da invenção, estes tripletos são designados como sequência tripleto 1 para a primeira sequência de aminoácidos a ser incluída e como sequência tripleto 2 para a segunda sequência de aminoácidos a ser incluída, ver a definição a) e b) da descrição acima. De acordo com a invenção, a molécula de reconhecimento pode ser um anticorpo, em particular um IgG ou IgM de murino, quimérico ou humano, uma estrutura de scFv ou um outro fragmento derivado de anticorpo, tal como por exemplo fragmentos de Fab, F(ab)2/· Fv ou F(v)2-

Numa forma de concretização preferida as moléculas de reconhecimento de ligação a MUC1 de acordo com a invenção compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 1, a sequência de 13 aminoácidos SEQ ID NO. 3, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 5 como sequência tripleto 1.

Numa outra conctretização preferida as moléculas de reconhecimento de liqação a MUC1 de acordo com a invenção compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 2, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 6 como sequência tripleto 1.

Numa forma de concretização preferida as moléculas de reconhecimento de ligação a MUC1 de acordo com a invenção compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 1, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 3, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 5 como sequência tripleto 1, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 7, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 9 e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 11 como sequência tripleto 2.

Numa outra concretização preferida as moléculas de reconhecimento de ligação a MUC1 de acordo com a invenção compreendem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 2, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 6 como sequência tripleto 1, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 8, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 10 e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 12 como sequência tripleto 2.

Numa outra concretização uma molécula de reconhecimento pode-se encontrar modificada por uma ou várias mutações numa ou mais sequências de aminoácidos seleccionadas a partir da SEQ ID NO. la 12, em que os aminoácidos individuais são substituídos por aminoácidos que têm propriedades físico-químicas semelhantes os quais vantajosamente não modificam fundamentalmente a estrutura 14 tri-dimensional do domínio de ligação nas moléculas de reconhecimento, para que a especificidade de MUC1 das moléculas de reconhecimento seja mantida. Os aminoácidos que têm propriedades físico-químicas semelhantes no âmbito da invenção podem ser reunidas em 6 grupos diferentes, e são ilustrados na Tabela 1.

Tabela 1 Aminoácidos com propriedades físico-químicas análogas, independentemente do tamanho da molécula.

Propriedade ou

Grupo funcional Aminoácidos Alifático Glicina Alanina Valina Leucina Isoleucina Grupo hidróxilo Serina Tréonina Grupo carboxilo Ácido aspártico Ácido glutâmico Grupo amida Asparagina Glutamina Grupo amino Lisina Arginina aromático Fenilalanina Tirosina Triptofano

Numa outra concretização preferida das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção que se ligam a MUC1 especificamente, pelo menos uma sequência de aminoácidos das sequências de aminoácidos da 15 SEQ ID N° 1,2,3,4,7,8,11 e/ou 12 encontra-se substituída com variantes de estruturas canónicas ou estruturas equivalentes com as sequências de aminoácidos da SEQ ID N° 13 a 31, em que a SEQ ID N° 1 ou 2 encontra-se substituída com uma sequência das sequências SEQ ID N° 13 a 20 (CDRH1) , a SEQ ID N° 3 ou 4 encontra-se substituída com uma sequência das sequências SEQ ID N° 21 a 23 (CDRH2), a SEQ ID N° 7 ou 8 encontra-se substituída com uma sequência das sequências SEQ ID N° 24 a 29 (CDRL1) e a SEQ ID N° 11 ou 12 encontra-se substituída com uma sequência das sequências SEQ ID N° 30 a 31 (CDRL3). A relação geral entre uma sequência de aminoácidos e a estrutura terciária do loop formado por estas sequências é conhecida do perito no estado da técnica e foi investigada em detalhe [Rooman et al., 1989; Martin, Thornton, 1996]. As imunoglobulinas representam um exemplo especial. Através da análise das conformações do loop das regiões hipervariáveis (complementary determining regions, CDRs) da cadeia leve e da cadeia pesada de moléculas de anticorpos foram definidas as chamadas classes canónicas [Chothia, Lesk, 1987; Chothia et al. 1986, 1989, 1992; Wu, Cygler, 1993]. Nesta base foram derivadas as variantes estruturais canónicas SEQ ID N° 13 a 31 da SEQ ID N° 1,2,3,4,7,8,11 e 12. Por uma variante estrutural canónica equivalente entende-se sequências de aminoácidos de acordo com a invenção que se distinguem das sequências de partida na medida em que em determinadas posições pelo menos um aminoácido se encontre substituído sem que ocorra uma alteração da classe canónica.

As sequências de aminoácidos SEQ ID N.os 1 a 12 ou as suas modificações em uma molécula de reconhecimento específica de MUC1, no âmbito da invenção formam estruturas espaciais, por exemplo, os 16 chamados ansas que se caracterizam por possuírem uma estrutura terciária possível de definir e /ou uma estrutura quaternária. A região de ligação de uma molécula de reconhecimento com o antigénio de MUC1 é formada por resíduos de aminoácidos, os quais são fornecidos com uma até seis ansas variáveis na superfície da molécula e, interagem especificamente com o MUC1.

Numa outra concretização da invenção, são fornecidas moléculas de reconhecimento que se ligam especificamente ao MUC1, em que pelo menos uma sequência das sequências do tripleto não envolvida directamente na interacção com o antigénio de MUC1 é omitida.

Numa outra concretização, as moléculas de reconhecimento compreendem pelo menos uma das sequências de aminoácidos SEQ ID Nos 1 a 12 ou as suas variantes acima descritas, em duplicado ou de forma múltipla, e tais duplicados também podem estar presentes na forma de variantes da mesma sequência de aminoácido. Todas as moléculas de reconhecimento descritas nesta secção reconhecem vantajosamente o antigénio de MUC1 de uma maneira específica. Para facilitar a compreensão, também as moléculas de reconhecimento, estritamente falando, que não têm quaisquer sequências tripleto como um resultado das sequências de multiplicação ou de omissão, serão, no entanto, referidas a seguir como sequência tripleto 1, ou sequência tripleto 2. em

Noutra concretização, as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção que ligam especificamente o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado compreendem as sequências de aminoácidos que apresentam uma homologia de pelo menos 60%, preferencialmente de 70%, mais preferencialmente de 80%, muito especialmente preferida de 90%, respeito às sequências SEQ ID Nos 1 a 12. 17

Além disso, as moléculas de reconhecimento, no âmbito da invenção, podem compreender sequências de estrutura que separam as sequências de aminoácidos compreendidas, ou seja, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ou 2 e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ou 4 e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 5 ou 6, ou as suas variantes acima descritas, e sequências de estrutura que separam a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 7 ou 8 e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 9 ou 10 e a sequência de aminoácidos SEQ ID No. 11 ou 12, ou as suas variantes, acima descritas. A primeira e a segunda sequência de aminoácidos podem estar presentes em um ou mais e, preferivelmente, duas cadeias de polipéptidos. No âmbito da invenção, tais sequências de estrutura também são referidas como separadores e podem possuir diferentes comprimentos e sequências. Isto inclui igualmente expressamente aquelas moléculas de reconhecimento em que nem todas as sequências de aminoácidos SEQ ID Nos 1 a 12 ou as suas variantes acima descritas, são separadas por espaçadores. Além disso, as moléculas de reconhecimento possuem preferencialmente sequências de aminoácidos de flanqueamento adicionais que no âmbito da invenção são também designadas como sequências de estrutura.

As sequências de estrutura possuem em particular a função de fazer com que as sequências de aminoácidos acima descritas responsáveis por, ou envolvidas na ligação especifica das moléculas de reconhecimento a MUC1 tomem uma configuração adequada e estrutura espacial para que uma ligação a MUC1 de possa dar. Pode ser previsto que as sequências de aminoácidos SEQ ID NO. 1 a NO. 12 sem pelo menos uma sequência de aminoácidos adicional como sequência de estrutura não se possam ligar ao antigénio de MUC1 de uma maneira especifica, no âmbito da invenção. Além disso, as sequências de 18 estrutura podem fornecer às moléculas de reconhecimento, por exemplo, a estabilidade química e biológica necessárias, de modo a que a estrutura espacial possa ser construída de forma eficaz e mantida para funcionar e ser aplicada numa forma funcional adequada que inclui a ligação a MUC1.

Numa concretização preferida as sequências tripleto são introduzidas em proteínas existentes, através da substituição das sequências de aminoácidos e/ou inserção, em que as sequências proteicas existentes servem como sequências de estrutura no âmbito da invenção, ou sequências de estrutura retiradas de proteínas adequadas. Por exemplo, essas sequências de estrutura podem ser modificadas por meio de mutações, supressões ou inserções. Neste caso utilizam-se os métodos de biologia molecular, bioquímica e engenharia de proteína conhecidos dos peritos no estado da técnica. As proteínas preferidas para esse efeito são as proteínas da superfamília das imunoglobulinas, os inibidores da protease, as lecitinas, proteínas de feixes de hélices e lipocalinas, tais como por ex. as divulgadas em: Nygren e Uhlen, 1997; Nuttall SD et al., 1999; e Skerra, 2000.

Numa outra concretização as sequências de estrutura de anticorpo de uma ou de diferentes espécies ou sequências de aminoácidos, que imitam a sequência de consenso das sequências de estrutura de anticorpos de murino, anticorpos humanos e/ou anticorpos de outros mamíferos. Uma sequência de consenso é uma sequência idealizada em que o aminoácido que mais frequentemente ocorre é representativo em cada posição quando um grande número de sequências existentes, por exemplo, em bases de dados de anticorpos são comparadas umas com as outras. As moléculas de reconhecimento preferidas aqui, são caracterizados pelo facto das sequências de estrutura para a 19 primeira sequência tripleto 1 compreenderem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ou 2, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ou 4, e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 5 ou 6, ou as variantes acima descritas, serem sequências de estrutura de anticorpo da cadeia pesada variável, VH, na literatura também designada s como sequências de estrutura, e as sequências de estrutura para a sequência tripleto 2 compreenderem a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 7 ou 8, a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 9 ou 10 e a sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 11 ou 12, ou as suas variantes acima descritas, serem sequências de estrutura de anticorpo da cadeia leve variável, VL. São também preferidas as sequências de estrutura de anticorpos de anticorpos de mamíferos, sendo especialmente preferidas as sequências de estrutura de anticorpos de origem humana e/ou de murino. As sequências de estrutura podem ser combinadas a partir de sequências de estrutura de anticorpos de várias espécies. Essas sequências de estrutura de anticorpos são conhecidas dos peritos no estado da técnica e podem ser obtidas a partir de várias bases de dados tais como a base de dados Kabat (immuno.bme.nwu.edu) ou a base de dados do National Center for Biotechnology Information (www.ncbi.nlm.nih.gov). Estas estruturas de esqueleto de anticorpos podem igualmente ser prolongadas com aminoácidos adicionais e/ou modificadas com uma ou mais mutações, por exemplo, supressões e/ou inserções, em que a ligação específica ao epítopo tumoral de MUC1 glicosilado é mantida.

Quando se combinam as sequências tripleto com sequências de estrutura de anticorpo numa variante preferida da invenção, a molécula de reconhecimento representa uma cadeia variável de um anticorpo de uma estrutura daí derivada. 20

As sequências de estrutura de anticorpo particularmente preferidas como sequências de esqueleto, no âmbito da invenção, são as sequências de aminoácidos que correspondem ao FRH1, FRH2, FRH3 e FHR4 na Tabela 2 para a cadeia pesada variável e a sequência de aminoácidos correspondente ao FRL1, FRL2, FRL3 e FRL4 na Tabela 2 para a cadeia leve variável, correspondendo as sequências de aminoácidos das sequências 1 e 2 tripleto, com as SEQ ID Nos 1 a 12 correspondem às regiões de CDR correspondentes dos anticorpos. As cadeias de anticorpos pesadas variáveis (VH) e leves (VL) , respectivamente, são compostas como se segue: VH: FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4, e VL: FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4. A Tabela 2 ilustra as posições em detalhe. As posições dos aminoácidos individuais ou das sequências de aminoácidos correspondem à numeração dos aminoácidos em moléculas de anticorpos de acordo com Kabat.

Tabela 2:

Nome Intervalo de posição Posição Aminoácidos ou sequência de aminoácidos FRH1 1 a 30 1 E 2 V 3 K 4 L 5 V 6 E 7 S 8 G 9 G 10 G 11 L 12 V 13 Q 14 P 21

15 G 16 G 17 S 18 M 19 K 20 L 21 S 22 C 23 A ou V 24 A, V, S ou T 25 S 26 G 27 Y, F, S ou D 28 T 29 F, L ou I 30 S C DRH1 31 a 35 5EQ ID NO. 1 ou 2 e Variantes FRH2 36 a 49 36 w 37 V 38 R 39 Q 40 s 41 P 42 E 43 K 44 G 45 L 46 E 47 W 48 V 49 A CDRH2 50 a 65, caso em que a posição 52a, 52b e 52c são introduzidas adicionalmente 5EQ ID NO. 3 ou 4 e Variantes FRH3 66 a 94 66 R 67 F 22

68 T 69 1 70 S 71 R 72 D 73 D ou V 74 S 75 K 76 S 77 S 78 V 79 Y ou S 80 L 81 Q 82 M 82a N 82b N 82c L 83 R 84 A ou V 85 E 86 D 87 T 88 G 89 I 90 Y 91 Y 92 C 93 T 94 R, G, N ou S CDRH3 95 a 102, em que a posição 100 e a posição 99 não existem >EQ ID NO. 5 ou 6 e variantes FRH4 103 a 113 103 W 104 G 105 Q 106 G 23

107 T 108 T 109 L 110 T 111 V 112 S 113 S ou A FRL1 1 a 23 1 D 2 I, V ou L 3 V 4 M ou L 5 T 6 Q 7 T ou A 8 P OU A 9 L ou F 10 S 11 L ou N 12 P 13 V 14 S ou T 15 L 16 G 17 D ou T 18 Q ou S 19 A 20 S 21 I 22 s 23 c CDRL1 24 a 34, caso em que as posições 27a, 27b, 27c, 27d e 27e são introduzidas adicionalmente >EQ ID NO. 7 ou 8 e variantes FRL2 35 a 49 35 W 36 Y 37 L 38 Q

39 K 40 P 41 G 42 Q ou L 43 S 44 P 45 K ou Q 46 L 47 L 48 I ou V 49 Y CDRL2 50 a 56 5EQ ID NO. 9 ou 10 e variantes FRL3 57 a 88 57 G 58 V 59 P 60 D 61 R 62 F 63 S 64 G ou S 65 S 66 G 67 S 68 G 69 T 70 D 71 F 72 T 73 L 74 K ou R 75 I 76 S 77 R 78 V 79 E 80 A 25

81 E 82 D 83 L ou V 84 G 85 V 86 Y 87 Y 88 c CDRL3 89 a 97 >EQ id NO.11 ou 12 e variantes FRL4 98 a 108 98 F 99 G 100 G ou D 101 G 102 T 103 K 104 L 105 E 106 I ou L 106a K 107 R 108 A

As sequências de aminoácidos SEQ ID Nos. 32 e 33 correspondem a sequências de aminoácidos com sequências de estrutura preferidas para a cadeia pesada variável. As sequências de aminoácidos SEQ ID Nos. 34 e 35 correspondem às sequências de aminoácidos com sequências de estrutura preferidas para a cadeia leve variável. Preferido é a combinação da SEQ ID NO. 32 e 34. Também preferida é a combinação SEQ ID NO. 33 e 35.

As técnicas e os métodos a utilizar na produção dessas sequências são conhecidos dos peritos no estado da técnica, e um perito na 26 técnica será igualmente capaz de seleccionar sequências e/ou mutações adequadas.

No âmbito da invenção, as moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 podem estar presentes em diferentes formatos. A estrutura básica da molécula de reconhecimento é uma ou mais cadeias de polipéptidos, que compreendem a sequência tripleto 1, ou as sequências tripleto 1 e 2 de acordo com a invenção acima descritas e as sequências de estrutura. Por exemplo, as sequências de aminoácidos da cadeia pesada variável estão acopladas com as sequências de estrutura e as sequências tripleto 1, e as sequências de aminoácidos de cadeia leve variável estão acopladas com as sequências de estrutura e as sequências tripleto 2, de uma maneira covalente ou não-covalente e podem estar situadas numa ou mais cadeias de polipéptidos. Várias cadeias de polipéptidos podem estar ligadas de uma forma covalente, por exemplo através de pontes de dissulfureto, ou estarem ligadas de forma não covalente como molécula de reconhecimento.

Os diversos formatos de acordo com a invenção de moléculas de reconhecimento incluem em particular os acoplamentos das sequências tripleto com sequências de aminoácidos para além das sequências de estrutura acima descritas. Numa variante preferida, as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção compreendem sequências adicionais para além das sequências tripleto e das sequências de estrutura. As sequências adicionais são em particular sequências que não servem primariamente para a configuração espacial das sequências tripleto, tal como na forma de sequências de estrutura, mas podem ter ai uma influência favorável como um resultado de interacções secundárias ou terciárias. Por exemplo, as sequências adicionais na forma de domínios constantes de um anticorpo irão 27 estabilizar o anticorpo, causando a dimerização, efectuando por isso uma ligação melhorada do anticorpo, ou, por exemplo, a fusão de uma scFv com um domínio de uma proteína de revestimento bacteriófaga provoca um aumento de actividade da ligação de scFv como divulgado, por exemplo, em Jensen KB et al. 2002.

Numa concretização, as moléculas de reconhecimento compreendem sequências de aminoácidos com sequências de estrutura à base de anticorpos e para além das sequências tripleto outras sequências adicionais. Em particular, as sequências adicionais assumem pelo menos uma das seguintes funções: a) a ligação de uma sequência tripleto com as suas sequências de estrutura correspondentes adequadas com pelo menos uma outra sequência tripleto com as suas sequências de estrutura correspondes adequadas, com por exemplo a finalidade de criar ou melhorar a capacidade de ligação; b) estabilização dos domínios, por exemplo por meio de um ligante entre dois domínios de proteínas ou sequências de aminoácidos as que interagem com outras iguais ou com uma segunda cadeia; c) funções efectoras para finalidades imunológicas, por exemplo através de fusão com a porção Fc de anticorpos, quimocinas, citocinas, factores de crescimento ou as suas partes, ou anticorpos que têm uma especificidade diferente, ou os seus fragmentos, para o recrutamento de células do sistema imunológico, por exemplo, macrófagos ou partes do sistema complementar; d) a fusão com marcadores, por exemplo, sequências de multimerização, por exemplo, a sequência de retaguarda μ de IgM ou 28 o domínio de associação de p53 ou MBL para multimerização das porções de ligação de MUC1 para uma ligação multivalente ou para a purificação de moléculas de reconhecimento, por exemplo o marcador His, ou para a detecção, por exemplo o marcador myc, ou para a marcação ou quelação de moléculas de reconhecimento, por exemplo através de sequências ricas em lisina.

As estruturas adequadas são conhecidas dos peritos no estado da técnica ou podem ser derivadas por dedução lógica, ou por experiências de rotina do estado da técnica.

Outras concretizações preferidas são moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção que compreendem os seguintes formatos: fragmento de anticorpo de cadeia simples (scFv), fragmento de Fv, fragmento de (Fv)2, fragmento de Fab, fragmento de F(ab)2, multi-corpo (di, tri, tetracorpo), imunoglobulina dos isotipos IgG, IgM, IgA, IgE, IgD ou as suas sub-classes, por exemplo IgGl, ou as moléculas de reconhecimento derivadas da imunoglobulina que compreendem pelo menos um domínio constante.

De acordo com a invenção, "multicorpo" é entendido como sendo um fragmento de anticorpo de cadeia simples, em que a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável que estão ligadas uma à outra directamente ou através de um lingante de uma tal forma que a associação de VH e VL tem lugar somente de uma maneira intermolecular, em vez de intramolecular, formando assim di, tri e/ou tetracorpos.

De acordo com a invenção, um "ligante" é entendido como sendo um aminoácido ou uma sequência de aminoácidos com até 20 aminoácidos 29 que liga a cadeia pesada variável e a cadeia leve variável num fragmento de anticorpo de cadeia simples.

Numa concretização preferida as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção são compostas de uma cadeia de polipéptido pesada e de uma leve, em que as sequências de aminoácidos das cadeias leves e pesadas compreendem respectivamente uma das estruturas tripleto acima descritas que representam as regiões de CDR do anticorpo, as sequências de estrutura do anticorpo correspondentes que representam as sequências de estrutura do anticorpo, e as sequências adicionais compreendendo pelo menos um dos domínios constantes do isotipo do anticorpo. As duas cadeias podem formar ligações covalentes uma com a outra. As regiões constantes e as regiões variáveis podem incluir sequências de anticorpos a partir de uma ou mais espécies. As porções de domínios constantes ou domínios constantes completos podem ser suprimidas ou modificadas, a fim de, por exemplo se modificar a função efectora das sequências adicionais, por exemplo, para prevenir ou melhorar a ligação aos receptores de Fc. Numa concretização preferida a molécula de reconhecimento é um anticorpo ou fragmento de anticorpo de murino, quimerizado, humanizado parcialmente, ou humano. Por exemplo, a quimerização é efectuada através da ligação dos domínios de anticorpo variáveis com os domínios de anticorpo constante ou fragmentos de domínios constantes anticorpos de diferentes espécies. São as sequências de domínios constantes de anticorpos humanos. Os exemplos de anticorpos de murinos são mlgG-Pankol que consistem nas sequências SEQ ID NO. 60 e 62, e mIgG-Panko2 que consistem das sequências SEQ ID NO. 61 e 63. Os exemplos de anticorpos quiméricos são as moléculas de reconhecimento clgG-Pankol que consistem nas sequências SEQ ID NO. 64 e 68, e clgG-Panko2 que consistem das sequências SEQ ID NO. 65 e 69. 30

As sequências de estrutura de anticorpo podem ser seleccionadas de tal forma que as sequências são largamente homólogas das sequências de anticorpos humanos. A selecção quanto à origem das espécies das sequências de estrutura também irá depender da utilização. Assim, para utilização terapêutica em determinados campos são preferidas as fracções maiores possíveis das sequências de estrutura humanas, particularmente naqueles casos em que a resposta ao anticorpo de antar-to humano (HAMA), deve ser evitada. Noutros campos terapêuticos, um xeno-componente é vantajoso porque efectua estimulação adicional do sistema imunitário. Uma combinação dos dois é particularmente adequada em alguns casos, especialmente naqueles casos em que um xeno-componente é vantajoso na imunização inicial e uma espécie-compatível, isto é, um componente humano, é vantajoso em utilizações posteriores. A homologia com as sequências de consenso humanas é preferida, com o HuHIII a ser preferido para a cadeia pesada variável, e o HUKII a ser preferido para a cadeia leve variável. Particularmente preferida é a homologia com as sequências de linhas germinais humanas as quais são conhecidas dos peritos no estado da técnica e podem ser acedidas a partir da base de dados V BASE (www.mrc-cpe.cam.ac.uk) ou a partir da base de dados do Centro Nacional de Informação de Biotecnologia (www.ncbi.nlm.nih.gov).

As técnicas e os métodos a serem utilizados na produção dessas sequências são conhecidas dos peritos no estado da técnica, e um perito no estado da técnica também será capaz de seleccionar sequências humanas adequadas e/ou realizar eventualmente mutações necessárias das sequências. 31

Noutra concretização as sequências tripleto que geralmente correspondem às ansas de ligação (regiões de CDR) e preferivelmente que possuem elevadas homologias com as regiões de sequências correspondentes na sequência de linha germinal humana são adicionalmente a elas aproximadas passo a passo, utilizando mutações simples, sem prejudicarem a ligação especifica ao epitopo tumoral de MUC1 glicosilado. As moléculas de reconhecimento que têm estas sequências serão referidas aqui como anticorpos parcialmente humanos ou fragmentos de anticorpo.

Numa outra concretização preferida, os aminoácidos específicos de sequências de estrutura de anticorpos de uma espécie são substituídos por outros, a fim de gerarem normalmente menos regiões imunogénicas. Isto implica, tecnologias por si só conhecidas dos peritos no estado da técnica, por exemplo, tecnologias de humanização, por exemplo, enxertia de CDR, renovação, mistura da cadeia com mutações e desimunização por mutação ou supressão de epitopos de MHC humanos.

Numa concretização preferida, isto envolve uma molécula de reconhecimento derivada de IgM que tem os domínios constantes correspondentes de um IgM, preferencialmente das sequências humanas. No âmbito da invenção, as imunoglobulinas são compostas de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve de um anticorpo, em que preferencialmente 2 cadeias leves e 2 cadeias pesadas representam uma unidade. As imunoglobulinas do tipo IgM consistem na maior parte das vezes em 5 de tais unidades, que para além das pontes de dissulfureto se encontram ligadas umas às outras através da cadeia J. 32

Numa concretização particularmente preferida a cadeia J está ausente, ocorrendo a multimerização das subunidades, em que neste caso podem encontrar-se presentes estruturas hexaméricas e pentaméricas. Exemplos de anticorpos de IgM quiméricos são as moléculas de reconhecimento clgM-Pankol que consistem nas sequências SEQ ID NO. 66 e 68, e cIgM-Panko2 que consistem nas sequências SEQ ID NO. 67 e 69.

Numa concretização preferida das moléculas de reconhecimento estão envolvidos fragmentos de anticorpos de cadeia simples, compreendendo uma estrutura 1 tripleto com as sequências de estrutura de anticorpo correspondentes acima descritas, que representam as regiões de CDR do anticorpo e as sequências de estrutura do domínio variável da cadeia pesada de anticorpos, e uma estrutura 2 tripleto com as sequências de estrutura de anticorpo correspondentes descritas acima, que representam as regiões de CDR do anticorpo e as sequências de estrutura do domínio variável da cadeia leve de anticorpos, que estão covalentemente ligadas, sob a forma de uma proteína de fusão. Neste caso as sequências estão ligadas directamente ou através de um ligante.

Neste caso são preferidos os formatos scFv, sem ligante ou com um ligante de 1 a 9 aminoácidos de comprimento. Os anticorpos scFv formam estruturas multiméricas (por exemplo, di, tri, tetracorpos) que, no âmbito da invenção, também são referidos como multicorpos e apresentam maior avidez pelo epítopo tumoral de MUC1 glicosilado como um resultado da multivalência. Conforme apresentado no Exemplo 8, o multicorpo que tem a sequência SEQ ID NO. 45 liga-se muitas vezes melhor à linha de células T47D do tumor mamário num teste de ligação de célula radioactivo do que o anticorpo scFv com a sequência SEQ ID NO. 36. Estes fragmentos multivalentes num formato 33 de di/tricorpo são concretizações particularmente preferidas da invenção, sendo vantajosos na terapia de tumores como um resultado de propriedades farmacocinéticas melhoradas. As sequências preferidas são as sequências SEQ ID NO. 36 a 47. Particularmente preferidas são as sequências SEQ ID NO. 48 a 59.

Concretizações particularmente preferidas das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção são as moléculas de reconhecimento que compreendem as sequências SEQ ID NO. 48 a 59, SEQ ID NO. 61, 63, 65 ou 69, porque elas apresentam uma combinação de todas as propriedades de ligação a) ah), como será descrito em maior pormenor nos exemplos.

Numa outra concretização preferida as moléculas de reconhecimento são fundidas, acopladas quimicamente, associadas covalentemente ou não covalentemente com (i) domínios de imunoglobulina de diferentes espécies, (ii) moléculas de enzima, (iii) domínios de interacção, (iv) sequências de sinal, (v) corantes fluorescentes, (vi) toxinas, (vii) anticorpos catalíticos, (viii) um ou mais anticorpos ou fragmentos de anticorpos com diferentes especificidades, (ix) componentes citolíticos, (x) imunomoduladores, (xi) imunoefectores, (xii) antigénios de MHC de classe I ou de classe II, (xiii) agentes de quelação para marcadores radioactivos, (xiv) radioisótopos, (xv) lipossomas, (xvi) domínios transmembranares, (xvii) vírus e/ou células. As células podem ser células de bactérias, de leveduras, de plantas, de insectos e/ou de mamíferos. As células de mamíferos são preferidas, como por exemplo, células de murinos, humanas ou de hamsteres. As células efectoras são particularmente preferidas. "Células efectoras", no âmbito da invenção são células, preferencialmente as células humanas, que medeiam as reacções imunitárias, tais como por exemplo macrófagos, células dendríticas, 34 linfócitos e células NK. Além disso, as moléculas de reconhecimento podem ser fundidas em particular com um marcador permitindo a detecção da molécula de reconhecimento e sua purificação, tal como por ex. o marcador Myc ou o marcador His. No âmbito da invenção, estas moléculas combinadas são referidas como "construções". As tecnologias para a produção destas construções são conhecidas dos peritos no estado da técnica, igualmente um especialista na técnica será capaz de seleccionar as sequências e os componentes adequados e ligá-los com as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção de uma maneira adequada.

Noutra concretização preferida as moléculas de reconhecimento descritas baseadas em anticorpos ou em fragmentos de anticorpos são fundidas com péptidos ou proteínas não são derivadas das imunoglobulinas. Por exemplo, o domínio de multimerização de uma molécula de não imunoglobulina é fundido com um scFv, especialmente a extremidade de terminal C da cadeia alfa de uma proteína de ligação C4, conforme descrito em Tonye Libyh M. et al., 1997, construindo assim uma molécula de reconhecimento multivalente.

Noutra concretização, um scFv é fundido com um domínio transmembranar de uma molécula de não imunoglobulina, por exemplo, com o domínio transmembranar de c-erb B2, h-PDGFR, do receptor de transferrina humano, ou do receptor de asialoglicoproteína humano (Liao et al.r 2000), permitindo assim a expressão de moléculas de ligação sobre a superfície das células.

Uma outra concretização preferida da invenção compreende as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção, compreendendo adicionalmente sequências de aminoácidos que se ligam especificamente a macrófagos ou a outras células imunoefectoras. 35

Por exemplo, as moléculas de reconhecimento da invenção compreendem ainda um local de ligação do anticorpo contra CD64, e, sob a forma de um anticorpo biespecifico ou de um fragmento de anticorpo (dicorpos), tem lugar a ligação de macrófagos a células tumorais positivas de MUC1, resultando no combate e/ou na destruição deste.

Uma concretização preferida da invenção diz respeito a moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 com marcação radioactiva. Uma forma preferida envolve as moléculas de reconhecimento baseadas em anticorpos ou em fragmentos de anticorpos. Uma outra concretização preferida envolve as moléculas de reconhecimento com marcação radioactiva da invenção em formato de cadeia simples (inclusivé na forma de di, tri, tetracorpos) . Outras formas preferidas são os fragmentos de anticorpos de cadeia simples marcados com radioactividade e as imunoglobulinas completas, por exemplo, os anticorpos de murinos, quiméricos ou humanizados de IgG ou de IgM ou os fragmentos de anticorpos de murino ou humanizados de acordo com a invenção. Escusado será dizer que a invenção não se limita a estes anticorpos, aos referidos marcadores radioactivos e aos referidos formatos de anticorpos.

Numa concretização preferida estão envolvidas moléculas de reconhecimento marcadas com radioactividade, ou marcadas com toxinas, que possuem fracções xenogénicas, por exemplo, fracções de murino, na porção Fc dos anticorpos, para que os anticorpos radioactivos tenham um menor período de permanência no sangue de um ser humano, sendo eliminados mais rapidamente. Exemplos de tais moléculas de reconhecimento são mlgG-Pankol constituídas pelas sequências SEQ id NO. 60 e 62, e mIgG-Panko2 que consistem das sequências SEQ ID NO. 61 e 63. Uma outra variante preferida são as moléculas de reconhecimento baseadas em anticorpos, em que as 36 fracções de murino são minimizadas, mas que contêm aqueles fragmentos de murinos que são responsáveis pela sua remoção do sangue (depuração) . Formas de determinar os componentes apropriados são bem conhecidas dos peritos no estado da técnica.

Os fragmentos de anticorpos, tais como os fragmentos de scfv multivalentes preferidos, especialmente com nenhum ou um ligante muito curto, oferecem uma vantagem na localização de tumores sólidos, em comparação com os anticorpos monoclonais intactos. Nos anticorpos intactos que apresentam em estudos de biodistribuição uma acumulação especifica dentro da área do tumor, é notada uma distribuição de anticorpo não homogénea com acumulação primária nas regiões periféricas, quando se investiga o tumor mais em detalhe. Partes centrais do tumor não são atingidas com estas construções de anticorpos devido a necroses do tumor, a distribuição de antigénios não homogénea e a pressão de tecido intersticial aumentada. Em contraste, os fragmentos de anticorpos mais pequenos mostram uma marcação rápida do tumor, penetram mais profundamente dentro do tumor, e também, são removidos com relativa rapidez a partir da circulação sanguínea. No entanto, a constante dissociação de fragmentos de anticorpos monovalentes, tais como Fabs ou scFv é frequentemente excessivamente baixa, resultando num curto período de permanência nas células tumorais. Por esta razão, fragmentos de anticorpos multivalentes, as construções de anticorpos multivalentes tais como por exemplo multicorpos (dicorpos, tricorpos/tetracorpos), F(ab')2 e outros minicorpos (construções de anticorpos multivalentes constituídos pelo domínio de ligação e uma sequência de multimerização, por exemplo, o domínio scfv e CH3 de um IgG) oferecem muitas vantagens na terapia do tumor. Fragmentos de anticorpos multivalentes num formato di/tricorpo (multicorpos) são concretizações preferidas da invenção e são vantajosos na terapia do tumor como resultado de melhores propriedades 37 farmacocinéticas e têm sido desenvolvidos para utilização na terapia do tumor. Podem ser utilizados como veículos para acumulação específica, por exemplo, de substâncias citotóxicas, tais como os agentes quimioterapeuticos ou radionuclídeos num tumor. Através de uma selecção adequada dos radionuclídeos, é possível destruir as células tumorais através de uma distância de vários diâmetros de células. Mesmo as células tumorais negativas para os antigénios são abrangidas numa área do tumor e a má penetração de anticorpos nos tumores sólidos pode ser pelo menos parcialmente compensada.

Uma concretização particularmente preferida da invenção envolve multicorpos com marcação radioactiva que reúnem propriedades farmacocinéticas particularmente vantajosas e, em combinação, têm uma melhorada retenção no tumor, penetração no tumor, semi-vida no soro e proporção da distribuição no soro e no tumor, quando se compara com as imunoglobulinas completas e scFv. Outras vantagens são a elevada avidez e a expressão em bactérias, permitindo uma produção de baixo custo de tais moléculas de reconhecimento. Vantajosamente, este formato específico de moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção é, portanto, adequado para ser utilizado preferencialmente no tratamento de tumores primários pequenos, metástases e doenças residuais mínimas.

Uma concretização preferida da invenção envolve moléculas de reconhecimento sem marcação radioactiva. Uma forma preferida envolve as moléculas de reconhecimento baseadas em anticorpos ou em fragmentos de anticorpos.

Outras concretizações preferidas são as moléculas de reconhecimento baseadas em IgG e IgM humanizadas ou quimerizadas acopladas à 38 toxina ou ao agente de citostático de acordo com a invenção e, em particular, multicorpos (di, tri, tetracorpos), com propriedades farmacocinéticas particularmente vantajosas, tal como apresentado acima.

Uma outra concretização preferida envolve lipossomas, os quais estão carregados com, por exemplo toxinas ou agentes citostáticos e que transportam à sua superfície moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção.

Um perito no estado da técnica encontra-se na posição de seleccionar radioisótopos, toxinas e agentes citostáticos adequados. Técnicas, métodos, dosagens e formulações adequadas são conhecidos dos peritos no estado da técnica.

Uma outra concretização preferida da invenção envolve células efectoras do sistema imunológico que têm moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção ligadas à sua superfície, que dirigem/direccionam as células efectoras para as células tumorais que transportam o MUC1, mediando assim o combate contra elas e/ou a sua destruição. As células efectoras preferidas são macrófagos, células dendríticas e células NK extraídas do doente e que são acopladas ex vivo com as moléculas de reconhecimento. Também preferidas são as linhas celulares desses tipos de células. A ligação é efectuada por exemplo, por meio de moléculas de reconhecimento biespecíficas que para além dos componentes específicos de MUC1, compreendem aminoácidos os quais medeiam a ligação das células efectoras. Por exemplo, estas são anticorpos biespecíficos, componentes complementares ou domínios constantes de anticorpos. 39

Uma outra concretização preferida envolve macrófagos de um doente que, após a colheita, são acoplados com um anticorpo biespecifico, por exemplo, sob a forma de um anticorpo completo, preferencialmente quimicamente acoplado a fragmentos de Fab, ou mais preferencialmente, dicorpos os quais, por um lado, reconhecem o CD64 e, por outro lado, são específicos de MUC1 de acordo com a invenção. Esses macrófagos, que transportam as moléculas de reconhecimento biespecificas através da especificidade de CD64, são novamente administradas ao doente numa formulação adequada, a fim de combaterem o tumor positivo a MUC1. As técnicas utilizadas para este fim, bem como os métodos, doses e formulações adequados, são conhecidas dos peritos no estado da técnica. Uma outra concretização preferida envolve macrófagos dos doentes que, após a colheita, são acoplados com um anticorpo específico de MUC1 ou um fragmento de anticorpo de acordo com a invenção compreendendo a porção constante de um anticorpo, o qual se liga aos macrófagos através dos receptores de Fc conhecidos. As moléculas de reconhecimento podem ligar-se aos macrófagos quer como anticorpos completos, preferencialmente IgG ou IgM quiméricos ou humanizados, ou como um fragmento de anticorpo, por exemplo, scFv, Fab ou multi-corpos sob a forma de uma proteína de fusão ou quimicamente acopladas com uma porção do domínio constante dos anticorpos, cuja porção é conhecida dos peritos no estado da técnica. Os macrófagos que transportam as moléculas de reconhecimento são novamente administrados ao doente numa formulação adequada, a fim de combaterem o tumor positivo a MUC1. As técnicas utilizadas para este fim, bem como os métodos, dosagens e formulações adequadas são conhecidas dos peritos no estado da técnica.

Uma outra concretização preferida das construções da invenção envolve linhas celulares ou células do corpo, tais como as células 40 efectoras acima descritas, as quais são transfectadas com moléculas que compreendem as moléculas de reconhecimento específicas de MUC1 de acordo com a invenção e elementos adicionais que causam a expressão e a ancoragem na membrana, por exemplo, o domínio transmembranar e a activação mediada das células efectoras por contacto com uma célula tumoral que transporta o MUC1. Os elementos apropriados são conhecidos dos peritos no estado da técnica. Por exemplo, uma linha de célula dendrítica é transfectada com um vector que compreende uma molécula de reconhecimento a qual compreende um scFv ou multicorpo de acordo com a invenção e um domínio transmembranar e um domínio de activação. Num outro exemplo, os macrófagos são transfectados por via virai para este fim. As células efectoras que transportam as moléculas de reconhecimento são novamente administradas ao doente numa formulação adequada, a fim de combaterem o tumor positivo a MUCl. As técnicas utilizadas para este fim, bem como os métodos, dosagens e formulações adequadas são conhecidos dos peritos no estado da técnica.

A invenção diz também respeito a um processo para a produção de moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção ou construções nas quais moléculas de ácidos nucléicos que compreendem uma ou mais sequências genéticas que codificam pelo menos uma das moléculas de reconhecimento acima descritas e/ou construções, de acordo com a invenção. Devido ao código genético degenerado, as referidas moléculas de ácido nucleico podem ter sequências muito diferentes. A escolha do codão também depende igualmente das células utilizadas para produzirem as moléculas de reconhecimento, porque diferentes códões frequentemente são preferidos em células diferentes de organismos diferentes, e pode haver uma forte influência sobre a taxa de expressão, por exemplo, os codões de arginina AGA e AGG 41 preferencialmente utilizados em genes eucarióticos são raramente vistos em bactérias onde os codões CGC e CGU são claramente mais frequentes. Nas concretizações preferidas a molécula do ácido nucleico da invenção é um ADN genómico, um ADNc e/ou um ARN. Os critérios para seleccionar codões adequados e a produção de uma molécula do ácido nucleico adequada são conhecidos dos peritos no estado da técnica.

De acordo com a invenção são utilizados vectores para a expressão das moléculas de reconhecimento, especialmente nas células. No âmbito da invenção, um vector é entendido como sendo uma molécula de ácido nucleico de acordo com a invenção, a qual serve para expressar a molécula de reconhecimento e compreende uma sequência de ácido nucleico a qual inclui uma ou mais sequências genéticas que codificam, pelo menos, para uma das moléculas de reconhecimento acima descritas que, em particular, incluem pelo menos um promotor que actua na expressão da molécula de reconhecimento. Evidentemente, os vectores podem compreender elementos adicionais conhecidos dos peritos no estado da técnica, os quais são utilizados, por exemplo, na multiplicação de vectores para a produção em células adequadas e para clonagem. As sequências de ácido nucleico podem estar presentes num ou mais vectores, numa concretização preferida, por exemplo, a cadeia pesada de uma imunoglobulina de acordo com a invenção é codificada por um vector e a cadeia leve por outro vector. Numa outra concretização preferida os domínios variáveis da cadeia leve e os domínios variáveis da cadeia pesada são codificados como proteína de fusão sobre o mesmo vector com um promotor. Além disso, no sentido da invenção, as sequências de ácido nucleico que codificam para porções de uma molécula de reconhecimento podem ser expressas por 42 diferentes promotores bem conhecidos dos peritos no estado da técnica.

As diferentes sequências de ácido nucleico podem estar presentes num vector comum. Cada sequência pode ser expressa pelo seu próprio promotor, pelo mesmo promotor ou diferentes promotores, ou as sequências podem estar presentes num vector bicistrónico num promotor. Preferencialmente através dos diferentes promotores são alcançadas diferentes taxas de expressão das moléculas de reconhecimento melhorando a formação da molécula de reconhecimento completa quando comparada com uma taxa de expressão igual dos diferentes componentes. É também preferido utilizar promotores que podem ser induzidos para melhorar a expressão da molécula de reconhecimento. De uma forma particularmente preferida os vectores também compreendem outros elementos reguladores conhecidos dos peritos no estado da técnica, por exemplo, amplificadores que reforçam a expressão da molécula de reconhecimento ou dos seus componentes, por exemplo, o amplificador CMV ou as sequências amplificadoras da imunoglobulina. As moléculas e os vectores de ácido nucleico compreendem preferencialmente sequências de ácido nucleico adicionais que servem como sequências de sinal para a secreção de moléculas de reconhecimento ou dos seus componentes e são conhecidas por si só dos peritos no estado da técnica, por exemplo, PelB, OmpA ou MalE para sistemas de células procarióticas, ou o péptido de sinal do receptor de células T, de cadeias de imunoglobulina, de t-PA ou EPO para sistemas de células eucarióticas [Boel et al. , 2000, Herrera et al.r 2000]. De uma forma vantajosa, isto facilita a purificação e/ou melhora o rendimento das moléculas de reconhecimento. Os métodos para a produção dos ácidos nucleicos e vectores acima descritos, promotores adequados, amplificadores e construções de vectores, bem 43 como os critérios para a sua selecção são conhecidos dos peritos no estado da técnica e serão explicados em pormenor nos exemplos. 0 vector pode além disso compreender sequências de ácido nucleico que codificam para proteínas virais. O vírus em si será referido como uma forma particular de um vector, cujo material qenético compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica para a molécula de reconhecimento, de acordo com a invenção. Numa concretização preferida a molécula de reconhecimento é uma proteína de fusão com uma proteína capsidial do vírus ou os seus componentes, tornando possível que não apenas o material genético compreenda a sequência de ácido nucleico da molécula de reconhecimento, mas também que a própria molécula de reconhecimento esteja presente à superfície do vírus num estado de ligação activo, por exemplo, uma molécula de reconhecimento de scFv de acordo com a invenção como uma proteína de fusão com uma proteína capsidial de adenovírus, pox-vírus ou vírus de vacinia adequados para aplicações terapêuticas génicas. Esta medeia o direccionamento do vírus para uma célula tumoral que expressa o MUCl, de modo a que a expressão da molécula de reconhecimento na célula tumoral tenha lugar. Isto pode ser utilizado na expressão da molécula de reconhecimento in vivo no organismo ou in vitro numa cultura celular. São preferencialmente utilizados sistemas conhecidos que utilizam um vírus ajudante para a replicação, de modo a garantir a segurança de um método de terapia génico que compreenda o referido vector. Os métodos para a produção de vectores virais descritos acima, para a infecção e expressão das moléculas de reconhecimento são bem conhecidos dos peritos no estado da técnica. 0 vector pode compreender uma proteína de fusão de uma molécula de reconhecimento, de acordo com a invenção e uma proteína ou péptido 44 que se liga especif icamente a um vírus. Vantajosamente, as moléculas de reconhecimento obtidas podem ser utilizadas para dirigir o vírus para uma célula que expressa o MUC1. Assim, por exemplo, a transferência do material genético pode ser mediada por infecções, permitindo assim uma expressão de moléculas específicas, codificadas pelo material genético do vírus nas células in vivo no organismo sob a forma de uma terapia genética ou in vitro em uma cultura de células. 0 processo de obtenção das moléculas de reconhecimento compreende a incorporação de um ou mais vectores de acordo com a invenção, que incluem uma ou mais moléculas de ácido nucleico da invenção, numa célula hospedeira apropriada, a cultura desta célula hospedeira em condições adequadas, e disponibilização de uma ou mais moléculas de reconhecimento a partir das células ou do meio de cultura. No âmbito da invenção, o termo "incorporação de vectores" é entendido como representando tecnologias conhecidas dos peritos no estado da técnica, através dos quais o referido vector é introduzido numa célula hospedeira, por exemplo, a eletroporação, a transfecção utilizando lípidos catiónicos, ou infecção, permanecendo aí de uma maneira transitória ou estável. No âmbito da invenção, o termo "disponibilizar uma ou mais moléculas de reconhecimento" é entendido como representando tecnologias conhecidas dos peritos no estado da técnica, por meio das quais as moléculas de reconhecimento expressas durante o processo de cultura são obtidas a partir do sobrenadante de cultura e/ou a partir das células, por exemplo, várias etapas de purificação química das proteínas, por exemplo, de fraccionamento, concentração, precipitação e/ou cromatografia. As técnicas e os procedimentos a serem utilizados neste método são conhecidos dos peritos no estado da técnica, e um especialista na técnica será também capaz de seleccionar células 45 hospedeiras e condições de cultura adequadas, bem como métodos para a disponibilização de células e/ou de sobrenadantes de cultura. Por exemplo, conforme apresentado acima, um perito no estado da técnica irá seleccionar sequências de ácido nucleico com codões adequados e sequências promotoras adaptadas à célula hospedeira, de forma a obter-se a expressão mais elevada possível de moléculas de reconhecimento activas. Numa concretização preferida um perito no estado da técnica vai utilizar, por exemplo, passos cromatográficos de afinidade, por exemplo, a cromatografia na proteína A ou na proteína G ou na proteína L, ou por exemplo, a cromatograf ia de afinidade de iões metálicos, através de um marcador His adicionalmente introduzido. Isto será ilustrado com maior pormenor nos exemplos.

Para além dos passos explicitamente mencionados acima, o termo "obtenção" também compreende passos adicionais, tais como o tratamento prévio do material de partida ou tratamentos adicionais, do produto final. Os procedimentos de pré-tratamento são por si só conhecidos dos peritos no estado da técnica. Outros processos de tratamento compreendem para além dos processos de disponibilização acima descritos também, por exemplo, a composição final e/ou a formulação da molécula de reconhecimento obtida por meio do processo de produção em formas adequadas de utilização e/ou de administração. 0 tipo das referidas formas de utilização e/ou de administração, por exemplo, solução, liofilizado ou comprimido, vai depender da aplicação pretendida. É conhecido dos peritos no estado da técnica qual a forma de administração que é adequado para o efeito. Dependendo da forma de administração, a molécula de reconhecimento produzida utilizando o método de acordo com a invenção pode estar presente juntamente com os excipientes, veículos ou outras substâncias activas. Os excipientes são 46 46 células como preferencialmente adjuvantes, outras substâncias activas, preferencialmente moléculas imunoestimuladoras, tais como as interleucinas. A molécula de reconhecimento produzida utilizando o método de acordo com a invenção também pode ser quimicamente modificada noutros passos de tratamento. Preferencialmente, a molécula de reconhecimento está adequadamente ligada a uma ou mais moléculas adicionais, ou seja, pela interacção química ou física. Como moléculas adicionais no âmbito da invenção servem preferencialmente outras proteínas ou péptidos que são covalentemente ou não covalentemente ligados com a molécula de reconhecimento produzida por meio do método de acordo com a invenção. Por exemplo, a fim de produzir moléculas de reconhecimento biespecíficas, uma molécula de reconhecimento de acordo com a invenção que reconhece especificamente o antigénio de MUCl é ligada com uma segunda molécula que se liga especificamente com por exemplo uma célula imunoefectora (por exemplo, macrófagos, células NK, células dendríticas), ou por exemplo, uma ligação com interleucinas (por exemplo, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15), quimiocinas ou factores de crescimento, e em virtude do efeito destas moléculas através da ligação da molécula de reconhecimento de acordo com a invenção, os imunoefectores são direccionados para o núcleo das células 1 tumorais positivas, combatendo-as e/ou destruindo-as, por exemplo. Como descrito acima, as referidas moléculas adicionais ou os seus componentes também podem fazer parte da própria molécula de reconhecimento, caso em que não seriam ligadas por meio dos métodos químicos ou físicos aqui descritos depois da expressão da molécula de reconhecimento. No âmbito da invenção, "imunoefectores", são entendidos como sendo aqueles componentes da invenção capazes de, directa ou indirectamente efectuarem o combate e/ou a destruição das células tumorais positivas de MUCl, por exemplo, as células imunoefectoras, tais como macrófagos, células NK, 47 dendríticas, ou moléculas efectoras, tais como proteínas ou péptidos do sistema complementar. Adequadas como moléculas adicionais no âmbito do método de acordo com a invenção são especialmente adequadas as substâncias que desenvolvem um efeito terapêutico ou de diagnóstico, por exemplo, os radioisótopos ou as toxinas. Estas substâncias são ligadas com as moléculas de reconhecimento, utilizando procedimentos conhecidos, por exemplo, os radioisótopos são directamente incorporados (por exemplo, iodo) ou ligados através de um agente de quelação covalentemente acoplado (por exemplo, ítrio, índio, bismuto). As etapas do processo de tratamento adicional são conhecidas dos peritos no estado da técnica técnica.

As células utilizadas de acordo com a invenção para expressarem as moléculas de reconhecimento podem ser células procarióticas ou eucarióticas, por exemplo de bactérias, leveduras (preferencialmente S. cerevisiae ou P. pastoris), insectos (D. melanogaster), plantas, células de mamíferos (preferencialmente, hamsteres, ratos ou linhas de células humanas) ou de organismos transgénicos, tais como animais e plantas. Preferencialmente, E. coli é utilizada para a expressão das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção num sistema procariótico, e as linhas celulares de mamíferos NSO, SP2/0, CH0-K1, CHOdhfr-, COS-1, COS-7, HEK293, K562, Namalwa ou Percy 6 para a expressão num sistema eucariótico. A invenção diz ainda respeito a composições para fins terapêuticos, profilácticos ou de diagnóstico, que compreendem, pelo menos uma molécula de reconhecimento de acordo com a invenção numa forma adequada em particular numa forma farmaceuticamente adequada ou composição. Mais especificamente, a composição farmacêutica 48 compreende materiais adicionais e substâncias, por exemplo, excipientes medicinais e/ou técnico-farmacêuticos. No âmbito da invenção, as composições farmacêuticas utilizadas para fins terapêuticos e profiláticos, bem como as composições farmacêuticas utilizadas como agente de diagnóstico in vivo serão consideradas como fármacos. Noutra concretização preferida estão envolvidas composições para diagnóstico ex vivo, que podem conter materiais e substâncias adicionais. Esta concretização será ilustrada em maior detalhe na descrição de agentes de diagnóstico. "Fármacos ou composições farmacêuticas", aqui utilizadas como sinónimos são substâncias de acordo com a invenção e preparações de substâncias destinadas a curar, aliviar ou evitar doenças, estados de sofrimento, defeitos físicos ou desconforto pela aplicação no ou dentro do corpo humano. De acordo com a invenção, os excipientes medicinais de acordo com a invenção são substâncias utilizadas como ingredientes activos na produção de fármacos. Os excipiente técnico-farmacêuticos servem para formular adequadamente o fármaco ou a composição farmacêutica e, se são necessários apenas durante o processo de produção, podem até ser removidos posteriormente, ou podem fazer parte da composição farmacêutica como veículos farmaceuticamente toleráveis. Exemplos de portadores farmaceuticamente toleráveis serão dados a seguir. A formulação do fármaco ou a formulação da composição farmacêutica é opcionalmente efectuada em combinação com um veículo farmaceuticamente tolerável e/ou diluente. Exemplos de veículos farmaceuticamente toleráveis são conhecidos dos peritos no estado da técnica e compreendem, por exemplo soluções de cloreto de sódio tamponadas com fosfato, água, emulsões tais como por ex. emulsões de óleo/água, diversos tipos de detergentes, soluções estéreis etc. Os fármacos ou composições farmacêuticas compreendendo tais veículos podem ser formulados por 49 meio de métodos convencionais bem conhecidos. Estes fármacos ou composições farmacêuticas podem ser administrados a um indivíduo numa dose adequada, por exemplo, num intervalo de 1 pm a 10 pg de moléculas de reconhecimento por dia, e doente. As doses de 1 mg a 1 g são preferidas. É preferida a administração de doses num número tão pequeno e tão baixas quanto possível, preferivelmente uma dose única, por exemplo de uma molécula de reconhecimento marcada com radioactividade. A administração pode ser efectuada por várias vias, por exemplo, por via intravenosa, intraperitoneal, intrarectal, intragastrointestinal, intranodal, intramuscular, local, por exemplo, intratumoral, mas também por via subcutânea, intradérmica ou sobre a pele ou através da mucosa. A administração de ácidos nucleicos pode também ser efectuada sob a forma de uma terapia genética, por exemplo, por meio de vectores virais descritos acima. O tipo de dosagem e via de administração podem ser determinadas pelo médico assistente, de acordo com factores clínicos. Como é conhecido dos peritos no estado da técnica, o tipo de dosagem vai depender de diversos factores, tais como por ex. o tamanho, a superfície corporal, a idade, o sexo ou a condição geral de saúde do doente, mas também do agente particular a ser administrado, do período de tempo e do tipo de administração, bem como de outros medicamentos eventualmente administrados em paralelo.

Uma "composição de vacina" é uma composição farmacêutica para a imunização activa profilática ou terapêutica de doentes que provoca uma resposta imunitária específica contra o epítopo tumoral de MUC1 glicosilado no doente através da rede imunológica.

Mais especificamente, as composições farmacêuticas ou fármacos compreendem uma substância farmacológica a qual inclui uma ou mais 50 moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção e/ou moléculas de ácido nucleico que as codificam, numa solução ou forma de administração adequada. A sua administração pode ser efectuada individualmente com os excipientes correspondentes descritos para fármacos ou composições farmacêuticas, ou em combinação com um ou mais adjuvantes, por exemplo, QS-21, GPI-0100 ou outras saponinas, emulsões de água-óleo, como por exemplo adjuvantes de montanida, polilisina, compostos de poliarginina, compostos de ADN, como por exemplo CPG, Detox, vacinas bacterianas, como por exemplo a vacina da febre tifoide ou vacinas de BCG, sais tais como fosfatos de cálcio, e/ou outros materiais apropriados que aumentam o efeito, preferencialmente moléculas imunoestimuladoras, tais como as interleucinas, por exemplo, IL-2, IL-12, IL-4 e/ou factores de crescimento, tais como por exemplo GM-CSF. Estes são misturados com as moléculas de reconhecimento da invenção de acordo com métodos conhecidos e administrados numa formulação e dosagem adequada. As formulações, as dosagens e os componentes adequados são conhecidos dos peritos no estado da técnica. A produção dos medicamentos ou das composições farmacêuticas, decorre de acordo com métodos conhecidos por si só.

Os fármacos ou composições farmacêuticas são utilizados na profilaxia ou no tratamento de doenças tumorais e/ou metástases, especialmente no tratamento de doenças tumorais positivas para MUCl e metástases, tais como os carcinomas mamários, tumores gastrointestinais, incluindo os carcinomas do cólon, os carcinomas do estômago, o cancro do intestino grosso e o cancro do intestino delgado, carcinomas do pâncreas, carcinomas do ovário, carcinomas hepáticos, cancro do pulmão, carcinomas de células renais, mieloma múltiplo. Por exemplo, o tratamento é dirigido contra tumores 51 primários, doenças tumorais residuais mínimas, recidivas e/ou metástases. 0 tratamento dos tumores também pode ser efectuado como um tratamento adjuvante. Os fármacos também podem ser usados na profilaxia de doenças tumorais positivas para MUC1. Por exemplo, a aplicação profilática é dirigida para a profilaxia de tumores e metástases. Os agentes de tumores são administrados de uma forma adequada, de acordo com métodos conhecidos. Uma variante preferida é a injecção ou administração dos fármacos por via intravenosa, localmente, em cavidades corporais, por exemplo, por via intraperitoneal, intrarectal, intragastrointestinal, localmente, por exemplo, directamente no tumor, em órgãos ou vasos linfáticos (intranodal), mas também por via subcutânea, intradérmica ou sobre a pele, e intramuscularmente. Os tipos de administração preferencialmente também podem ser combinados, neste caso a administração pode ser feita em dias diferentes de tratamento ou num dia de tratamento. Neste caso, também é possível combinar dois ou mais fármacos de acordo com a invenção ou composições farmacêuticas ou um ou mais fármacos de acordo com a invenção com um ou mais fármacos ou tratamentos tumorais, tais como, por exemplo terapias com anticorpos, quimioterapias ou radioterapias, que são administrados ou aplicados ao mesmo tempo ou separadamente no tempo. As formulações, dosagens e combinações de componentes adequados são conhecidas dos peritos no estado da técnica ou podem ser por eles determinadas de acordo com métodos conhecidos. 0 processo para a produção do medicamento de acordo com a invenção ou da composição farmacêutica compreende as etapas de produção de moléculas de reconhecimento e compreende adicionalmente a etapa de formulação das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção numa forma farmaceuticamente tolerável. As moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção preferidas para este fim 52 foram descritas acima mais detalhadamente como concretizações do tratamento de doenças tumorais e profilaxia, bem como descritas em agentes de diagnóstico in vivo a seguir.

Por conseguinte, as moléculas de reconhecimento ou construções de acordo com a invenção e as substâncias e composições produzidas utilizando o método de acordo com a invenção podem ser utilizadas preferencialmente na profilaxia, diagnóstico, acompanhamento e/ou tratamento de doenças tumorais. Além disso, é preferida a utilização das moléculas de reconhecimento, dos vectores e/ou do fármaco ou da composição farmacêutica na profilaxia e/ou no tratamento de doenças cancerígenas, incluindo tumores e metástases.

Numa concretização preferida a doença ou tumor canceroso a ser tratado ou profilacticamente impedido, ou cujo reaparecimento é impedido, é seleccionada a partir do grupo de doenças cancerígenas ou doenças tumorais no domínio da otorrinolaringologia, dos pulmões, mediastino, tracto gastrointestinal, sistema urogenital, sistema ginecológico, mama, sistema endócrino, pele, ossos e sarcomas de tecidos moles, mesoteliomas, melanomas, neoplasias do sistema nervoso central, doenças cancerosas ou doenças tumorais durante a infância, linfomas, leucemias, síndromas paraneoplásicos, metástases com tumor primário desconhecido (síndroma de CUP) , carcinomatoses peritoneais, doenças malignas relacionadas com a imunossupressão e/ou metástases tumorais.

Mais especificamente, os tumores podem compreender os seguintes tipos de cancro: adenocarcinoma da mama, próstata e intestino grosso; todas as formas de cancro do pulmão a partir do tubo brônquico; cancro da medula óssea, melanoma, hepatoma, neuroblastoma; papiloma; apudoma, coristoma, branquioma; síndroma 53 carcinóide maligno; doença cardíaca carcinóide, carcinoma (por exemplo, carcinoma de Walker, carcinoma de células basais, carcinoma de células escamosas basais, carcinoma de Brown-Pearce carcinoma ductal, tumor de Ehrlich, carcinoma in situ, carcinoma cancro-2, carcinoma de células de Merkel, cancro das mucosas, carcinoma brônquico não parvicelular, carcinoma das células da pituitária, carcinoma papilar, carcinoma cirroso, carcinoma bronquíolo-alveolar, carcinoma brônquico, carcinoma espinocelular e carcinoma de células de transição); perturbação funcional histiocítica; leucemia (por exemplo, em relação com a leucemia de células B, leucemia de células mistas, leucemia de células nulas, leucemia de células T, leucemia crónica de células T, leucemia associada a HTLV-II, leucemia linfocitica aguda, leucemia linfocitica crónica, leucemia de mastócitos, e leucemia mielóide) ; histiocitose maligna, doença de Hodgkin, linfoma de não Hodgkin, tumor de células plasmáticas solitárias; reticuloendoteliose, condroblastoma; condroma, condrossarcoma; fibroma; fibrossarcoma, tumores de células gigantes; histiocitoma; lipoma; lipossarcoma; leucosarcoma; mesotelioma; mixoma; mixossarcoma; osteoma; osteossarcoma; sarcoma de Ewing; sinovioma; adenofibroma; adenolinfoma; carcinossarcoma, cordoma, craniofaringeoma, disgerminoma, hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma, miossarcoma, ameloblastoma, cementoma; odontoma; teratoma; timoma, corioblastoma; adenocarcinoma, adenoma; colangioma; colesteatoma; cilindroma; cistadenocarcinoma, cistoadenoma; tumor da célula granulosa; ginadroblastoma; hidradenoma; tumor de células de ilhotas; tumor da célula de Leydig; papiloma; tumor da célula de Sertoli, tumor da célula de teca, leiomioma, leiomiossarcoma; mioblastoma; mioma; miossarcoma; rabdomioma; rabdomiossarcoma; ependimoma; ganglioneuroma, glioma; meduloblastoma, meningioma; neurilemoma; neuroblastoma; neuroepitelioma, neurofibroma, neuroma, 54 paraganglioma, paraganglioma não cromafina, angioqueratoma, hiperplasia angiolinfóide com eosinofilia; angioma esclerosante; angiomatose; glomangioma; hemangioendotelioma; hemangioma; hemangiopericitoma, hemangiossarcoma; linfangioma, linfangiomioma, linfangiossarcoma; pinealoma; cistossarcoma filode; hemangiossarcoma; linfangiossarcoma; mixossarcoma, carcinoma do ovário; sarcoma (por exemplo, sarcoma de Ewing, experimentalmente, sarcoma de Kaposi e sarcoma de mastócitos); neoplasias (por exemplo, neoplasias ósseas, neoplasias mamárias, neoplasias do sistema digestivo, neoplasias colorretais, neoplasias do fígado, neoplasias do pâncreas, neoplasias da hipófise, neoplasias do testículo, neoplasias orbitais, neoplasias da cabeça e do pescoço, do sistema nervoso central, neoplasias do órgão da audição, pélvica, do tracto respiratório e do tracto urogenital); neurofibromatose e displasia de células escamosas cervicais.

Numa outra concretização preferida, a doença ou tumor canceroso a ser tratado ou profilaticamente impedido, ou cujo reaparecimento é impedido, é seleccionado a partir do grupo de doenças cancerosas ou de doenças tumorais compreendendo células, incluindo o MUC1 na definição de acordo com a invenção, seleccionadas a partir do grupo de: tumores do domínio da otorrinolaringologia, compreendendo os tumores do interior do nariz, seios nasais, nasofaringe, lábios, cavidade oral, orofaringe, laringe, hipofaringe, ouvido, glândulas salivares, e paragangliomas, tumores dos pulmões, compreendendo carcinomas brônquicos não parvicelulares, carcinomas brônquicos parvicelulares, tumores do mediastino, tumores do tracto gastrointestinal, compreendendo os tumores do esófago, estômago, pâncreas, fígado, vesícula e das vias biliares, intestino delgado, cólon e carcinomas rectais e carcinomas anais, tumores urogenitais compreendendo os tumores dos rins, ureter, bexiga, glândula da 55 próstata, uretra, pénis e testículos, tumores ginecológicos compreendendo os tumores do colo do útero, vagina, vulva, cancro uterino, doença de trofoblasto maligna, carcinoma do ovário, tumores do tubo uterino (Tuba Faloppii), tumores da cavidade abdominal, carcinomas mamários, os tumores de órgãos endócrinos, compreendendo os tumores da tiróide, paratiróide, córtex adrenal, tumores do pâncreas endócrinos, tumores carcinóides e síndroma carcinóide, neoplasias endócrinas múltiplas, sarcomas dos ossos e dos tecidos moles, mesoteliomas, tumores cutâneos, melanomas compreendendo melanomas cutâneos e intraoculares, tumores do sistema nervoso central, tumores durante a infância, compreendendo o retinoblastoma, tumor de Wilms, neurofibromatose, neuroblastoma, sarcoma de Ewing da família dos tumores, rabdomiossarcoma, linfomas que compreendem linfomas de não Hodgkin, linfomas de células T cutâneos, linfomas primários do sistema nervoso central, doença de Hodgkin, leucemias incluindo as leucemias agudas, leucemias linfáticas e mielóide crónica, neoplasias de células plasmáticas, síndromas de mielodisplasia, síndromas paraneoplásicas, metástases com tumores primários desconhecidos (síndroma de CUP) , carcinomatose peritoneal, malignidade relacionada com a imunossupressão compreendendo neoplasias relacionadas com a SIDA tais como o sarcoma de Kaposi, linfomas associados com a SIDA, linfomas associados com a SIDA do sistema nervoso central, doença de Hodgkin associada com a SIDA, e tumores anogenitais associados com a SIDA, malignidades relacionadas com transplantes, tumores metastisados compreendendo metástases cerebrais, metástases pulmonares, metástases hepáticas, metástases ósseas, metástases pleurais e pericárdicas, e ascites malignas.

Numa outra concretização preferida a doença ou tumor canceroso a ser tratado ou profilaticamente impedido, ou cujo reaparecimento é 56 impedido, é seleccionada a partir do grupo que compreende doenças cancerosas ou doenças tumorais tais como carcinomas mamários, tumores gastrointestinais, incluindo carcinomas do cólon, carcinomas do estômago, cancro do intestino grosso e cancro do intestino delgado, carcinomas do pâncreas, carcinomas do ovário, carcinomas hepáticos, cancro do pulmão, carcinomas de células renais, mielomas múltiplos.

Noutra concretização preferida as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção são utilizadas na profilaxia de carcinomas mamários ou do ovário em mulheres que têm um elevado risco de cancro da mama.

Noutra concretização preferida a doença ou tumor canceroso ou a metastização a serem tratados ou profilaticamente impedidos, ou cujo reaparecimento é impedido, é especificamente seleccionada a partir do grupo de tumores gastrointestinais e preferencialmente carcinomas do cólon, carcinomas do estômago e carcinomas do recto.

As moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção podem ser directamente empregues no tratamento ou na profilaxia de doenças tumorais ou serem acopladas com estruturas efectoras adicionais. De acordo com a invenção, "estruturas efectoras" são entendidas como sendo compostos químicos ou bioquímicos, moléculas ou átomos que directamente ou indirectamente causam destruição ou danos, incluindo, por exemplo, a redução de crescimento ou a inibição do crescimento de células tumorais. Por exemplo, estes incluem radioisótopos, toxinas, agentes citostáticos e outras moléculas efectoras tais como citocinas e quimiocinas ou outras estruturas que representam os próprios efectores ou estão acoplados às referidas moléculas efectoras, por exemplo, lipossomas carregados com toxinas ou agentes citostáticos, que transportam as moléculas 57 de reconhecimento de acordo com a invenção. Neste último exemplo dos lipossomas, são consideradas que para além da molécula de reconhecimento para a especificidade de tumor, também transportam aquelas moléculas que são responsáveis pela absorção de estruturas efectoras ou dos seus componentes nas células, tais como por exemplo os anticorpos contra os receptores que causam uma endocitose mediada pelo receptor. Nesses casos, as moléculas de reconhecimento compreendem preferencialmente um domínio transmembranar possibilitando a sua inserção na membrana lipossomal, ou noutra forma de realização preferida as moléculas de reconhecimento são quimicamente acopladas sobre a superfície do lipossoma. As técnicas utilizadas para este fim são conhecidas dos peritos no estado da técnica, incluindo a produção dos lipossomas. A ligação das moléculas de reconhecimento com outras estruturas efectoras também decorre de acordo com métodos conhecidos por si só. Como já definido acima, a ligação pode ser efectuada por exemplo, directamente por carga covalente ou não covalente, por acoplamento químico, o qual pode necessitar de uma molécula química ou biológica adicional, por exemplo, um agente de quelação ou ligante, ou sob a forma de proteínas ou péptidos de fusão, através da fusão. As moléculas de reconhecimento são empregues no tratamento de doenças tumorais com tumores que transportam o MUC1 ou na profilaxia, a qual, por exemplo, impede a formação de tumores primários ou metástases. Um objectivo preferido é o tratamento da doença residual mínima e de metástases. As moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção são administradas numa formulação adequada, de uma só vez ou repetidamente, em intervalos apropriados e com doses adequadas.

Numa concretização preferida as moléculas de reconhecimento radioactivas acima descritas, de acordo com a invenção são 58 combinadas com uma aplicação de moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 não marcadas, de acordo com a invenção. Isto contribui para uma melhoria do ruido de fundo e uma ligação mais especifica ao tumor na medida em que as pequenas quantidades de moléculas que transportam o MUC1 no sangue são neutralizadas. São preferencialmente utilizadas moléculas de IgG e mais preferencialmente as moléculas de reconhecimento derivadas de IgM, por exemplo, um clgMG ou uma sua forma humanizada, porque esta ligam-se principalmente ao antigénio de MUC1 no sangue, reduzindo, assim, a carga de fundo e a radioactividade do soro e aumentando a focalização relativa no tumor, enquanto limita a penetração em tecidos e tumores em virtude do tamanho das moléculas. Os procedimentos e tecnologias utilizadas para este fim são conhecidas dos peritos no estado da técnica, e um especialista na tecnologia será igualmente capaz de conceber uma dose, formulações, via de aplicação, e altura de administração adequados das referidas moléculas de reconhecimento não marcadas. 0 processo para a produção de um agente de diagnóstico, compreende as etapas do processo de acordo com a invenção para a produção de moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 de acordo com a invenção e, além disso, compreende a etapa de formulação das moléculas de reconhecimento numa utilizável como diagnóstico. 0 termo "agente de diagnóstico". De acordo com a invenção, o termo "agente de diagnóstico" define substâncias de acordo com a invenção e preparações de substâncias cujo objectivo é o de reconhecer doenças, estados de sofrimento, defeitos físicos ou desconforto por aplicação, em ou no corpo humano. Preferencialmente, as partes do corpo humano são entendidas como sendo preferencialmente fluidos 59 corporais, tais como sangue, soro sanguíneo, linfa, urina, fluido espinal, ou esperma, biopsias de tecidos ou amostras. A formulação do agente de diagnóstico compreende preferencialmente a modificação das moléculas de reconhecimento produzidas com substâncias que permitem a detecção do antigénio de MUC1. As substâncias adequadas são conhecidas do estado da técnica. Com base na selecção de uma substância, um perito no estado da técnica será capaz de tomar as medidas adequadas a fim de formular um agente de diagnóstico.

De acordo com a invenção, também é possível para fins de diagnóstico, acoplar substâncias às moléculas de reconhecimento, através de métodos conhecidos por si só, que facilitam a detecção de antigénios de MUCl e/ou as suas células portadoras, por exemplo, por biotinilação, marcação por fluorescência, marcação radioactiva ou ligação da enzima das moléculas de reconhecimento.

Num outro método de diagnóstico e prognóstico do tumor são utilizadas moléculas de reconhecimento da invenção, as quais reconhecem os antigénios de MUCl no soro de seres humanos. Também, contra os antecedentes das moléculas de reconhecimento, a propriedade de ligação muito menor de MUCl no soro, em comparação com os anticorpos conhecidos HMFG-1 e DF-3 (teste de CA15-3), isto é possível e vantajoso, porque as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção, são capazes de distinguir claramente entre o soro normal e o soro tumoral, mesmo naqueles casos em que a ligação no soro de doentes com carcinoma do cólon, é baixa. A determinação é preferencialmente qualitativa, quantitativa e/ou em quantidades relativas dependentes do tempo, de acordo com 60 métodos conhecidos. De acordo com a invenção, os mesmos métodos também são utilizados no acompanhamento de doenças tumorais e para controlar o curso do tratamento, incluindo o acompanhamento das respostas imunológicas, e para o controlo e dosagem de tratamentos tumorais. As técnicas utilizadas em tais métodos são bem conhecidas, por si só, por exemplo, ELISA, transferência de Western, FACS (triagem da célula activada por fluorescência), MACS (triagem da célula magneticamente activada), ADCC (citotoxicidade celular dependente do anticorpo), CDC (citotoxidade dependente do complemento), imunocitoquimica e imuno-histoquimica.

Nos métodos preferidos de acordo com a invenção para o diagnóstico e prognóstico in vitro do tumor utilizam-se as moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 de acordo com a invenção em métodos conhecidos por si só para detectar o antigénio do epitopo tumoral de MUC1 glicosilado no soro ou em preparações de tecido. Nestes métodos, o antigénio de MUC1, o MUC1 presente em complexos imunológicos e/ou o MUC1 ligado a células é detectado, e a presença do antigénio de MUC1 é determinada qualitativamente, quantitativamente e/ou em quantidades relativas, de acordo com métodos conhecidos por si só. De acordo com a invenção, os mesmos métodos são empregues no acompanhamento de doenças tumorais e para controlar o curso dos tratamentos. As técnicas utilizadas em tais métodos são bem conhecidas, por si só, por exemplo, ELISA, transferência de Western, FACS (triagem da célula activada por fluorescência), MACS (triagem da célula magneticamente activada), ADCC (citotoxicidade celular dependente do anticorpo), CDC (citotoxidade dependente do complemento), imunocitoquimica e imuno-histoquímica. 61

Uma concretização preferida é um teste rápido de tecido em que as amostras de tecido são coradas com moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção marcadas por fluorescência num método imuno-histológico. Num outro método preferido a molécula de reconhecimento, de acordo com a invenção, preferencialmente um anticorpo do isotipo de IgG, é combinado com um outro anticorpo que reconhece especificamente o antigénio de núcleo 1, preferencialmente o isotipo de IgM. A vantagem é que, por exemplo, no diagnóstico do carcinoma gastrointestinal (por exemplo, carcinomas colorectais e carcinomas gástricos), o reconhecimento, numa fase precoce e, ao mesmo tempo, o prognóstico em relação ao curso da doença e/ou do risco de metastasização no fígado é possível, em níveis mais elevados de núcleo 1 e do antigénio de MUC1 indicam um prognóstico mais desfavorável quanto ao decurso, e níveis mais elevados de núcleo 1 indicam uma probabilidade de metastasização no fígado várias vezes maior. Numa outra concretização preferida os anticorpos e as moléculas de reconhecimento são directamente marcadas com vários corantes fluorescentes, por exemplo, Cy3 e Cy5 ou Cy3 e FITC. Numa concretização, em que a intensificação do sinal é vantajosa, os anticorpos e/ou as moléculas de reconhecimento são reforçados por anticorpos secundários marcados ou por biotina-estreptavidina. Neste caso é vantajosa a utilização de diversos isotipos e/ou sequências de espécies na região constante dos anticorpos. As técnicas e os métodos utilizados para este fim, por exemplo, de marcação e imuno-histologia, bem como a selecção dos formatos adequados de moléculas de reconhecimento são conhecidos dos peritos no estado da técnica. 0 método de diagnóstico descrito acima não se encontra limitado a tumores gastrointestinais, mas pode ser utilizado em qualquer doença tumoral envolvendo o antigénio de MUC1. 62

Para um teste de tumor sorológico, numa outra concretização preferida da invenção combina a determinação de MUC1, como descrito acima, com a determinação de outros marcadores tumorais sorológicos, por exemplo, PSA, CEA ou AFP. Uma concretização preferida neste caso é a determinação de MUC1 e do antigénio do núcleo 1. Numa concretização preferida, o MUC1 é imobilizado a partir do soro numa fase sólida, utilizando um anticorpo especifico de MUC1, e detectado com uma molécula de reconhecimento de acordo com a invenção como anticorpo de detecção, que se liga especificamente ao epitopo tumoral de MUC1 glicosilado, e o antigénio do núcleo 1 é detectado em MUC1, imobilizado por meio de um anticorpo necrófago anti-MUCl, tal como as moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 de acordo com a invenção, utilizando um anticorpo de antinúcleo 1 especifico. Este teste de diagnóstico combina o reconhecimento precoce com uma declaração de prognóstico quanto ao curso da doença e/ou a probabilidade de metastasização no fígado. As técnicas utilizadas para este fim, por exemplo, a marcação e a sorologia, incluindo os métodos de detecção, são conhecidas dos peritos no estado da técnica. Os métodos de diagnóstico acima descritos não estão limitados aos tumores gastrointestinais, mas podem ser utilizados em qualquer tumor que transporta o antigénio de MUC1. Os testes serológicos descritos acima são utilizados no diagnóstico, acompanhamento ao longo de uma doença tumoral, e no prognóstico dos tumores MUCl positivos.

Num outro método publicado as moléculas de reconhecimento específico de MUCl de acordo com a invenção são utilizadas no diagnóstico in vivo. Para este fim as moléculas de reconhecimento são marcadas usando métodos adequados conhecidos por si só e, 63 portanto, feitos para métodos de imagiologia conhecidos por si só acessíveis aos seres humanos, por exemplo radioimunodiagnósticos, métodos de mapeamento PET ou endoscopia por imunofluorescência, por exemplo, através do acoplamento e/ou carga com as moléculas apropriadas, por exemplo os isótopos radioactivos, tais como índio, ou corantes fluorescentes, por exemplo Cy3, Cy2, Cy5 ou FITC. Numa concretização preferida, os multicorpos de acordo com a invenção são covalentemente acoplados com um agente quelante adequado (por exemplo, DOTA ou DTPA) e, carregados com índio-111, utilizado em diagnósticos in vivo. Numa forma de concretização preferida são administrados por via intravenosa numa dose apropriada ao indivíduo, e a localização do antigénio de MUC1 e de um tumor potencial é medida de acordo com métodos conhecidos por si só. Os métodos e tecnologias utilizados para este fim, incluindo os métodos de imagiologia, são conhecidos dos peritos no estado da técnica. Um perito pode igualmente conceber uma dosagem e formulações adequadas.

Numa outra concretização preferida, as imunoglobulinas, preferencialmente a IgG, são marcadas com radioactividade como acima descrito e ilustrado em maior detalhe nos exemplos, por exemplo, com índio-111, e administradas localmente no tumor ou nos vasos sanguíneos que fornecem ou evacuam o tumor. Numa concretização, isto é utilizado para determinar o tamanho do tumor e, numa outra concretização para determinar gânglios linfáticos afectados. Os métodos e tecnologias utilizados para este fim são conhecidos dos peritos no estado da técnica. O perito pode igualmente conceber uma dosagem e formulações adequadas.

As moléculas de reconhecimento marcadas com radioactividade de acordo com a invenção podem também ser administradas por outras 64 vias de aplicação. As vias preferidas são intraperitoneal, intranodal ou intrarectal e intragastrointestinal, respectivamente. A via intraperitoneal é particularmente vantajosa na determinação de tumores acessíveis através do peritoneu e/ou que nele se metastizam, por exemplo, carcinomas do ovário e certos carcinomas gastrointestinais. A administração intrarectal ou intragastrointestinal é vantajosa em alguns tumores gastrointestinais e na localização e determinação das dimensões dos mesmos. Em alguns casos, pode ser utilizada a via intranodal para infiltração directa nos gânglios linfáticos singulares.

As moléculas de reconhecimento radioactivas acima descritas de acordo com a invenção podem ser combinadas com uma aplicação de moléculas de reconhecimento específicas de MUC1 não marcadas de acordo com a invenção para agentes de diagnóstico in vivo. Isto serve para melhorar o ruído de base. Os métodos e tecnologias utilizados para este fim são conhecidos dos peritos no estado da técnica, e um perito pode igualmente conceber uma dosagem, formulações, via de aplicação, e altura de administração adequados das moléculas de reconhecimento não marcadas.

Noutra concretização preferida, as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção, preferencialmente as imunoglobulinas, multicorpos ou fragmentos de anticorpos, mais preferencialmente IgG, Fab e multicorpos, são marcadas com um corante fluorescente e administrados ín vivo. As vias de aplicação preferidas são intrarectal, intragastrointestinal, intraperitoneal, intravenosa e no fornecimento ou evacuação dos vasos sanguíneos. Uma concretização particularmente preferida serve para localizar carcinomas gastrointestinais, através da endoscopia de fluorescência a seguir à aplicação das moléculas de reconhecimento 65 marcadas por fluorescência. Numa concretização preferida uma molécula de reconhecimento de acordo com a invenção é combinada com pelo menos um anticorpo contra um outro antigénio tumoral, preferencialmente um anticorpo anti-núcleo 1. Preferencialmente são utilizados diferentes corantes fluorescentes que permitem a diferenciação das moléculas de reconhecimento e dos anticorpos, combinando assim uma declaração de prognóstico com um reconhecimento precoce e um maior número de casos. Os corantes fluorescentes preferidos são aqueles que têm uma fluorescência menor na linha de base, que são conhecidos dos peritos no estado da técnica. Os métodos e tecnologias utilizados para este fim, incluindo os métodos de imagiologia, por exemplo, a endoscopia por fluorescência, são conhecidos dos peritos no estado da técnica, e um perito pode igualmente conceber uma dosagem, formulações, via de aplicação, e altura de administração adequados das referidas moléculas de reconhecimento não marcadas. A invenção apresenta várias vantagens: As moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 de acordo com a invenção reconhecem os tipos de carcinomas de uma maneira especifica, razão pela qual elas podem ser utilizadas com vantagem no diagnóstico e/ou tratamento de um grande número de doentes com tumores com diferentes indicações. Além disso, as moléculas de reconhecimento ligam-se vantajosamente numa extensão muito baixa em áreas no tecido normal ou inacessíveis in vivo. Comparado com os marcadores tumorais conhecidos, isto é uma vantagem especial e uma notável propriedade das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção. Uma vantagem especial das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção é a sua elevada especificidade para o tecido tumoral. Em particular, isto é devido à elevada especificidade para um epitopo tumoral de MUC1 glicosilado definido. 0 polimorfo 66 epitelial MUC1 de mucina, na forma da molécula global, é um marcador tumoral reconhecido. Como consequência da complexidade da molécula, que é muito grande, altamente glicosilada e extracelular que consiste essencialmente num grande número de repetições paralelas polimórficas de resíduos de 20 aminoácidos, e possui glicosilação heterogénea em relação às repetições paralelas, o MUC1 tem uma variedade de epitopos. As moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção que se ligam ao epitopo tumoral de MUC1 glicosilado especificamente no âmbito da invenção, detectam um epitopo definido em MUC1, resultando em uma elevada especificidade das moléculas de reconhecimento para o tecido do tumor. Além disso, é especialmente vantajoso que as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção só reconhecem em baixa medida aqueles MUC1 libertados no soro por células tumorais (Shedding). Essa ligação reduzida a MUCl presente no soro num doente com tumor é uma grande vantagem na terapia de doenças tumorais utilizando as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção. Além disso, as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção apresentam uma elevada afinidade. Por esta razão é dada a possibilidade de construir fragmentos de baixa valência, tais como scFv e multicorpos. A possibilidade destes diferentes formatos é vantajosa para o desenvolvimento de agentes terapêuticos.

Seguidamente a invenção será explicada mais em detalhe com base em exemplos, sem ser por eles limitada.

Exemplos 1. Preparação de scFv com diferentes comprimentos de ligação, que reconhecem especificamente o epitopo tumoral de MUCl glicosilado 67

Os scFv específico de MUC1 com as sequências SEQ ID NO. 36 a 59 foram produzidos por amplificação de PCR e subsequente clonagem das cadeias variáveis num vector de expressão bacteriana. Este vector inclui o promotor lacZ, um local de ligação de ribossoma (RBS), a origem M13, a sequência de sinal pelB para secreção no periplasma, um gene de resistência à ampicilina, e uma cassete de clonagem para acoplar um marcador da hexa-histidina para uma purificação eficiente e um marcador de c-myc na extremidade de terminal C dos scFv (Fig. 1) . Para diferentes comprimentos de ligação, VH e VL foram amplificados com iniciadores específicos de tal forma que 22 nucleótidos na extremidade 3' do VH e na extremidade 5' de VL formaram uma região complementar (Fig. 2, PCR I e PCR II). A seguir à purificação, os dois fragmentos de PCR foram ligados num SOE-PCR (Fig. 2, PCR III), e o fragmento de PCR foi clonado no vector acima descrito através de Ncol/Notl. 2. Expressão Bacteriana e Purificação de scFv que Especificamente Reconhece o Epitopo Tumoral de MUC1 glicosilado

Os fragmentos de anticorpos do Exemplo 1 foram expressos em Escherichia coli e purificados. Para este efeito, o plasmídeo correspondente foi transformado em E. coli electrocompetente por meio de eletroporação e cultivado em meio de 2xTY (10 g de extracto de levedura, 16 g de triptona, 5 g de NaCl por litro) , com 100 pg/ml de ampicilina durante a noite. Esta cultura foi diluída 1:100 com meio 2xTY a que foi adicionado 100 pg/ml de ampicilina e 0,5% de glicose e incubada a 37 °C até um OD60onm de cerca de 0,6 ter sido atingida. Posteriormente, à cultura foi adicionada com 1 mM de IPTG para a indução e incubada a 25 °C durante mais 5 horas. As bactérias foram colhidas por centrifugação a 4000xg durante 20 minutos, o sedimento da célula foi novamente suspenso em tampão TES 68 (30 mM de Tris-HCl, pH 8,0, 20% de sacarose, 1 mM de EDTA) e incubadas em gelo durante 20 minutos. Seguidamente adicionou-se, 5 mM de MgS04, e a suspensão foi incubada em gelo durante mais 20 minutos. A fracção de periplasma foi obtida por centrifugação a 4OOOxg durante 60 minutos e dializada contra tampão de ligação (50 mM de tampão fosfato, pH 8,0, 300 mM de NaCl, 10 mM de imidazol) a 4 °C durante a noite. Os fragmentos de anticorpo contidos na fracção de periplasma foram purificados por cromatografia de afinidade de ião metálico (HiTrap Chelating HP, Amersham Pharmacia Biotech) , utilizando o marcador His de terminal C. Para este efeito, a fracção dializada foi carregada numa coluna previamente equilibrada com tampão de ligação, e as proteínas de não ligação foram eliminadas da coluna por lavagem com tampão de lavagem (50 mM de tampão fosfato, pH 8,0, 300 mM de NaCl, 30 mM de imidazol). Seguidamente, os fragmentos de anticorpos foram eluídos com tampão de eluição (50 mM de tampão fosfato, pH 8,0, 300 mM de NaCl, 300 mM de imidazol). 3. Clonagem de Vectores para a Expressão de Anticorpos de IgG e IgM Quiméricos que Reconhecem Especificamente o Epitopo Tumoral de MUC1 Glicosilado

O fragmento de ADN de Ncol/Xhol do vector scFv, o que codifica para VH (FIG. 1), foi clonado no vector líder BS cortado em Ncol/Sall (FIG. 3) . O vector líder BS inclui uma cassete de clonagem para introduzir a sequência do péptido de sinal do receptor da célula T na extremidade 5' e uma sequência dadora de união na extremidade 3' das sequências dos domínios variáveis (FIG. 3) . A sequência de VL do anticorpo correspondente foi amplificada com iniciadores específicos para introduzir o local de restrição Ncol na extremidade 5' e o local de restrição Nhel na extremidade 3' no PCR 69 utilizando a sequência de scFv como molde e, depois da digestão com Ncol/Nhel, clonada no mesmo vector lider BS digerido. Posteriormente, cada fragmento HindIII/BamHI do vector lider BS foi clonado no correspondente vector de expressão eucariótico. Estes vectores (pEFpuroCYlVH, pEFpuroCpVH e pEFneoCKVL) incluem o promotor EF-Ioí e o amplificador HCMV, a origem SV40, o sinal de poliadenilação BGH, o gene de resistência à puromicina no vector para a cadeia pesada e o gene de resistência à neomicina no vector para a cadeia leve, bem como as sequências do genoma da região γΐ constante humana ou da região μ para a cadeia pesada ou da região κ constante humana, para a cadeia leve (iniciadores para amplificação do ADN humano genómico e o mapa do vector, ver a FIG. 3) . 4. Expressão Eucariótica dos Anticorpos de IgG e IgM Quiméricos, que Reconhecem Especificamente o Epitopo Tumoral de MUC1 Glicosilado, em Células CHO e a sua Purificação

Para expressar os anticorpos quiméricos clgG-Pankol que consistem nas sequências SEQ ID NO. 64 e 68, cIgG-Panko2 que consistem nas sequências SEQ ID NO. 65 e 69, clgM-Pankol que consistem nas sequências SEQ ID NO. 66 e 68, e cIgM-Panko2 que consistem das sequências SEQ ID NO. 67 e 69, as células CHOdhfr (ATCC No. CRL-9096) foram cotransfectadas com uma mistura de vectores para as cadeias pesada e leve (1:3) por meio de eletroporação (106 células/ml, 500 V, 50 ps) e cultivadas em meio de selecção (meio CHO-S-SFM II (Life Technologies), suplemento de HT (Biochrom), 400 pg/ml de G418, 5 pg/ml de puromicina) durante 2 semanas. A seguir à clonagem das células individuais numa placa de 96 poços, os sobrenadantes foram testados num teste de ELISA (péptido de MUC1 glicosilado (30-meros, ver abaixo), como antigénio, FcyI-POD anti- 70 humano acoplado ou FC5p-POD anti-humano acoplado (Dianova) como anticorpo secundário), e o clone com a maior taxa de produção de anticorpo foi seleccionado (cerca de 0,5 pg/106 células/24 h) .

Para a produção de anticorpos, as células CHO transfectadas de forma estável que segregam o IgG e o IgM quiméricos, respectivamente, foram cultivadas em balões ou frascos de cultura em meio CHO-S-SFM II, suplementado com suplemento de HT, até ter sido alcançada uma densidade celular de cerca de 1 x 106 células/ml. Após a remoção das células do sobrenadante da cultura celular por centrifugação (400xg, 15 minutos), o anticorpo quimérico foi purificado usando uma coluna de proteína A (HiTrap r-proteína A FF, Amersham Pharmacia Biotech) para o IgG quimérico ou uma coluna de afinidade de anticorpo Fc54 anti-humano para o IgM quimérico. A fracção de anticorpo purificada eluído pela súbita mudança de pH foi novamente tamponada em PBS e concentrada utilizando tubos de centrifugação Centriprep (corte de 50 kDa, Millipore).

5. Análise de scFv e Anticorpos, que Reconhecem Especificamente o Epitopo Tumoral de MUC1 glicosilado, num teste de ELISA

Diversos péptidos e glicopéptidos sintéticos foram usados como antigénios: um péptido de 30-meros não-glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSA; um péptido de 30-meros glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDT[GalNAca]RPAPGSTAPPAHGVTSA, uma série de péptidos MUC1 não glicosilados de comprimentos variáveis, com a sequência [VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG] n em que n = 1, 3 e 5 (TR1, TR3 e TR5), e uma série de péptidos MUC1 glicosilados de diferentes comprimentos, com a sequência A[HGVTSAPDT(GalNAca)RPAPGSTAPPA]n em que n = 1, 3 e 5 (TRlg, TR3g e TR5g). 71 A partir das respectivas soluções de reserva (1 mg em 1 ml de H20 bidestilada), com as aliquotas mantidas a -20 °C, foi produzida uma diluição de 1 pg/ml em PBS ou 10 pg/ml em bidestilado. 50 μΐ/poço da solução acima foi pipetada numa placa de microtitulação, e a placa de teste foi incubada durante a noite (utilizando uma placa de imunoanálise NUNC Maxisorp F96 e a incubação a 4 °C para os péptidos em PBS; utilizando placas Nunclon TC e secagem dos péptidos a 37 °C para os péptidos em H20 bidestilada) . No dia seguinte, a placa de ensaio foi lavada 3 vezes com PBS/0,2% de Tween. Posteriormente, os locais de ligação não específicos foram bloqueados com 2% de BSA em PBS, e 50 μΐ do primeiro anticorpo foi aplicado (anticorpos de murino: 10-10000 ng/ml de PBS/1% de BSA; IgG quimérico: 1-100 ng/ml em PBS/1% de BSA; scFv: 50-500 ng/ml em PBS/1% de BSA) . Depois de três etapas de lavagem com PBS/0,2% de Tween, os correspondentes anticorpos secundários acoplados à peroxidase foram empregues para detectar as construções de anticorpos especificamente ligados (um Fcyl anti-rato ou anti-humano para o anticorpo completo, um anticorpo marcador anti-His para o scFv). Para detectar o anticorpo secundário ligado foi realizada uma reacção colorimétrica com TMB (3,3', 5,5'- tetrametilbenzidina). Após 15 minutos, a reacção foi parada através da adição de 2,5 N de H2SC>4. A medição foi realizada utilizando um fotómetro de placa de microtitulação com um filtro de 4 50 nm em forma dupla em relação a um filtro de referência de 630 nm. Os resultados representativos estão ilustrados nas Figs. 4 a 8. 5.1. Ligação da Região de PDTRP Glicosilado dentro de uma Sequência de Repetição Paralela de MUC1 72 A FIG. 4 mostra a ligação preferida das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção ao péptido de MUC1 glicosilado. Duas moléculas de reconhecimento com diferentes sequências no loop em formato de IgG são comparadas. As construções de anticorpo de mlgG-Pankol (SEQ ID NO. 60 e SEQ ID NO. 62) e de mIgG-Panko2 (SEQ ID NO. 61 e SEQ ID NO. 63) ligam-se ao 30-mero de uma maneira altamente especifica, preferencialmente ao péptido glicosilado, e só fracamente, ou de maneira nenhuma, à sequência de péptido não glicosilado. Em comparação com o mlgG-Pankol e o mIgG-Panko2, a FIG. 5 ilustra a ligação dos anticorpos HMFG-1 específicos de MUC1, C595 e SM3 ao 30-meros não glicosilado e glicosilado (exemplo representativo). Os três anticorpos HMFG-1, C595 e SM3 mostraram nenhuma ou apenas uma ligeira dependência da glicosilação com um factor (proporção do péptido glicosilada/não glicosilado) de < 1,2 para todos os três anticorpos. Os anticorpos são utilizados para a diferenciação e não fazem parte das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção. Em contrapartida resulta um factor de > 4,5 (na FIG. 5: 5.1) para mlgG-Pankol e um factor de > 20 (na FIG. 5: 22.1) para mIgG-Panko2 sob as mesmas condições. A FIG. 6 ilustra diferentes formatos das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção na sua ligação específica preferida para o péptido de MUC1 glicosilado. 5.2. Ligação a Múltiplas Repetições Paralelas de MUC1 não glicosiladas

Como um exemplo representativo, a FIG. 7 mostra a dependência da ligação das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção, mlgG-Pankol e mIgG-Panko2, no número de repetições paralelas não-glicosiladas em comparação com os anticorpos C595 e SM3 específicos 73 de MUC1. A relação do sinal entre o péptido TR5 e o do péptido TR1 representa um factor que reflecte o grau de dependência de ligação do número de repetições. Com mlgG-Pankol e mIgG-Panko2 resultam factores de > 3 (na FIG. 7: 3.9) e > 8 (na FIG. 7: 12.7), respectivamente, enquanto nas mesmas condições os anticorpos C595 específicos de MUC1 (factor 1.1) e SM3 (factor 2.1) não mostram nenhuma ou apenas uma ligeira dependência. 5.3. Ligação a Múltiplas Repetições Paralelas de MUC1 glicosilado

Como um exemplo representativo, a FIG. 8 mostra a dependência da ligação das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção mIgG-Panko2 do número de repetições paralelas (regiões múltiplas de PDTR glicosilado) em comparação com os anticorpos específicos de MUCl C595 e SM3. O mIgG-Panko2 mostra uma dependência adicional do número de repetições paralelas glicosiladas, enquanto a ligação dos anticorpos C595 e SM3 específicos de MUCl é independente de um aumento no número de repetições. 6. Coloração Imuno-histológicao e Imunocitológico com Moléculas de Reconhecimento que Reconhecem Especificamente o Epitopo Tumoral de MUCl glicosilado

Para a coloração imuno-histológica, secções congeladas de amostras do tecido correspondente foram secas ao ar e fixadas com 10% de formaldeído em PBS durante 15 minutos. Para reduzir a actividade da peroxidase endógena, os cortes foram tratados com 3% de peróxido de hidrogénio em PBS e, a seguir ao bloqueio dos locais de ligação não específicos com soro de coelho foram incubados com uma molécula de reconhecimento específica de MUCl na forma de um anticorpo primário. Posteriormente, as preparações foram incubadas com um 74 anticorpo secundário correspondente (IgG anti-rato, acoplado com POD) . A reacção de coloração foi realizada usando o substrato da peroxidase diaminobenzidina, e o contraste com hematoxilina. A molécula de reconhecimento de acordo com a invenção de exemplo mIgM-Panko2 sofre uma reacção com apenas um pequeno número de estruturas no tecido normal. Estas são principalmente encontradas em regiões imunoprivilegiadas do corpo, por exemplo, na superfície apical de células de certos duetos glandulares e, portanto, estão localizadas em áreas inacessíveis ou dificilmente acessíveis a um anticorpo in vivo (Tabela 3) . Além disso, a coloração no tecido normal mamário é fraca em comparação com o tecido tumoral e é encontrado somente na membrana apical.

Tabela 3: Reacção de tecido normal humano com o anticorpo mlgG-Panko2 específico de MUC1.

Reactividade

Tipo de tecido

Epiderme

Estômago

Intestino delgado estrato basal estrato espinhoso estrato granuloso estrato córneo células não epidérmicas epitélio foveolar glândulas fúndicas glândulas corporais mucosa + /- Cólon mucosa

Peito + duetos glandulares 75 Baço ácinos células mioepiteliais trabéculas lienis células reticulares linfócitos macrófagos +

Endotélio Próstata Fígado Rins + Gânglios Linfáticos

Vesícula Biliar Cérebro

Glândula Adrenal Timo hepatócitos duetos biliares glomérulos epitélio capsular túbulo proximal túbulo distai túbulo colector linfócitos macrófagos células reticulares mucosa neurónios células gliais meninges células ependimais córtex adrenal medula adrenal células reticulares epiteliais góbulos de Hassall linfócitos macrófagos + -/ + -/ + + -/ + 76 Bexiga Coração Pâncreas

Tecido sinovial Tecido Muscular urotélio endocárdio miocárdio mesotélio duetos glandulares ácinos ilhéus de Langerhans tecido conjuntivo músculo liso músculo esquelético + +

As moléculas de reconhecimento reivindicadas dão uma reacção positiva com uma variedade de tumores. Os dados na Tabela 4 mostram que as moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 reconhecem uma elevada percentagem de doentes com tumores de uma indicação, o que difere de uma indicação para a outra. Em adenomas do intestino grosso, a coloração correlaciona-se com o grau de displasia. Os adenomas do cólon não reagem com mIgG-Panko2 ou apenas muito ligeiramente, enquanto os carcinomas do cólon são positivos. 0 tecido normal do pâncreas é apenas ligeiramente positivo, enquanto os carcinomas do pâncreas mostram uma reacção muito forte com a molécula de reconhecimento m!gG-Panko2 de acordo com a invenção.

Tabela 4: Reacção do tecido tumoral humano com m!gG-Panko2. ripo de tecido % de Casos Positivos idenoma tubular 25 i/ilosidades tubulares 25 i/ilosidades 33 30 77

Sarcinoma da mucosa transitória adenocarcinoma adenocarcinoma papilar adenocarcinoma mucoso adenocarcinoma produtor de mucina sarcinoma da célula em anel de sinete 90 67 67 100 100 81 90 14 42 50 100 87 91 100 netástases hepáticas

Carcinomas do Estômago

Carcinomas Hepáticos oem diferenciados noderadamente diferenciados ligeiramente diferenciados

Carcinomas do Pâncreas

Carcinomas Mamários carcinomas primários metástases

Carcinomas das Células Renais

Foi utilizada imunofluorescência para a coloração imunocitológica. Para este efeito, as células apropriadas foram secas em lâminas de microscópio e fixadas com 5% de formaldeido durante 10 minutos. A seguir ao bloqueio dos locais de ligação não específicos com BSA (1% em PBS), as células foram incubadas com as moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção na forma de anticorpos primários. Isto foi seguido por lavagem, 3 vezes com PBS e incubação com o anticorpo secundário marcado por fluorescência correspondente (IgG-FITC anti-rato ou Fab-Cy2 anti-humano, Dianova). Depois de lavagens repetidas com PBS, as células foram embebidas em Mowiol. 78 Várias linhagens celulares foram testadas com moléculas de reconhecimento específicas de MUC1 em imunofluorescência. Um certo número de linhagens de células tumorais deu uma reacção positiva (Tabela 5 e FIGS. 9 e 10) .

Tabela 5: Reactividade de várias linhas celulares com o anticorpo m!gG-Panko2específico de MUC1.

Linhas de células Reactividade ZR-75-1 Positiva T47D Positiva U266 (positiva) LN78 Positiva HT29 Negativa HCT15 (positiva) HepG2 Negativa K562 Positiva MCF-7 Positiva HEK293 (positiva) A FIG. 9 exemplifica a marcação por fluorescência das células T47D, uma linha celular do carcinoma mamário, com mIgG-Panko2. A FIG. 10 exemplifica a marcação por fluorescência das células K562 com clgG-Pankol.

Usando a marcação por imuno-histologia e imunofluorescência, a dependência da neuraminidase do epitopo tumoral de MUC1 glicosilado foi também investigada. Para este efeito, as secções ou células foram pré-incubadas com neuraminidase (0,02 U/ml de PBS + 0,01 M de Ca2+) durante uma hora à temperatura ambiente, posteriormente lavadas com PBS e, em seguida, marcadas como acima descrito. Como ilustrado nas Tabelas 6 e 7, a ligação das moléculas de reconhecimento da invenção ao epitopo tumoral de MUC1 glicosilado é 79 independente da neuraminidase no âmbito da invenção ou é aumentado pelo tratamento com neuraminidase.

Tabela 6: Coloração Imuno-histológica de tecidos humanos com mlgG-Panko2 antes e depois do tratamento com neuraminidase.

Reactividade não tratada Reactividade depois do tratamento com Neuraminidase

Tecidos normais do cólon

Adenoma do cólon + + Carcinoma do cólon ++ ++ Carcinoma da mama ++ +++

Tabela 7: Marcação por Imunofluorescência de duas linhas celulares tumorais com mIgG-Panko2 antes e depois do tratamento com neuraminidase.

Reactividade não tratada Reactividade depois do tratamento com Neuraminidase K562 + ++ ZR-75—1 +++ ++++ 7. Quelação e Marcação Radioactiva de Anticorpos e de Fragmentos de Anticorpos que Reconhecem Especificamente o Epitopo Tumoral de MUC1 Glicosilado

Foi covalentemente ligado aos anticorpos mIgG-Panko2 e clgG-Pankol ou aos formatos scFv com as sequências SEQ ID NO. 36 e 45, através de conjugação, um agente de quelação que permite a ligação de um metal radioactivo. Os produtos comerciais da firma Macrocyclics (Dallas, E.U.A.), ácido p-isotiocianato-benzil-di- etilenotriaminapenta-acético (p-SCN-Bz-DTPA) e ácido p-iso-tiocianatobenzil-1,4,7,10-tetra-azaciclododecano-l,4,7,10-tetra-acético (p-SCN-Bz-DOTA) foram empregues como agentes de quelação. 80

Ambos os agentes quelantes são adequados para se ligarem a anticorpos para a sua marcação com radioactividade [Brechbiel et al., 1986; Kozak et al.r 1989; Stimmel et al., 1995]. A conjugação ocorre, através da reacção do grupo de isotiocianato no agente quelante com um grupo ε-amino livre do aminoácido lisina do aminoácido no anticorpo. Forma-se uma ligação covalente N-C entre o agente quelante e o anticorpo. O anticorpo purificado ou o fragmento de anticorpo purificado tem de primeiro que ser novamente tamponado em tampão de acoplamento, pH 8,7. Para este efeito foi realizada uma ultraf iltração numa unidade de filtração (Centriprep YM-50 ou YM-10; Millipore). Isto foi efectuado através de repetidas diluições com um volume de 10 vezes e filtração através de uma membrana de poros definidos usando a centrifugação. Desta forma, o PBS foi substituído por tampão de acoplamento alcalino (0,05 M de carbonato de sódio, 0,15 M de cloreto de sódio, pH 8,7). A quelação foi realizada utilizando os agentes quelantes bifuncionais p-SCN-Bz-DTPA e p-SCN-BZ-DOTA, respectivamente. Para a reacção quelante, a proteína (1 a 10 mg/ml) em tampão de acoplamento e uma solução do agente quelante de 1 mg/ml em 2% de DMSO/água foram misturados de tal modo que um excesso molar de quelante fosse assegurado. Seguiu-se incubação da mistura a 37 °C durante 1 hora. Posteriormente, o agente quelante não ligado foi retirado por ultrafiltração no mesmo vaso (Centriprep YM50 ou YM-10; Millipore) e, como descrito acima, este foi novamente tamponado para pH 4,2, num tampão de carga (0,15 M de acetato de sódio, 0,15 M de cloreto de sódio, pH 4,2), necessários para a marcação radioactiva. A concentração proteica durante e depois desta etapa 81 foi reajustada novamente para 1-10 mg/ml utilizando uma medição por UV a 280 nm.

Encontraram-se condições para a reacção quelante que permitem a marcação com radioactividade do anticorpo sem reduzir substancialmente a sua bioactividade. O anticorpo quelado foi carregado com um metal radioactivo, produzindo assim o radioanticorpo. Os isótopos 11:Líndio e 90ítrio foram utilizados para o carregamento. Ambos têm propriedades químicas e físico-químicas comparáveis, sendo ligados como iões trivalentes (mIn3+, 90Y3+) pelo agente quelante. O anticorpo marcado com 111índio é um γ-emissor e é usado clinicamente para encontrar a dose individual para o doente, enquanto o 90ítrio é um β-emissor que é utilizado terapeuticamente. As semi-vidas são de 67 horas para o inIn e de 64 horas para o 90Y. O cloreto de 111índio da empresa NEN (Perkin Elmer, Bélgica) foi utilizado para o carregamento. O metal radioactivo é fornecido em uma solução de ácido clorídrico. A solução de 111InCl3 foi levada primeiro para uma concentração de 1 M de HC1. Posteriormente, esta foi diluída com 0,05 M de HC1 para uma actividade específica de 80-320 mCi/ml, e uma sua alíquota foi utilizada para incorporação no anticorpo quelado, em que o volume adicionado da solução acídica de mInCl3 de HCl deve ser igual ao volume da solução de anticorpo fornecida no tampão de acoplamento de pH 4,2, a fim de assegurar a estabilidade ao pH. O período de incubação foi de 1 hora a 37 °C, com eventual mistura cuidadosa.

Posteriormente, o filtro foi novamente inserido na unidade de filtração e tamponado de novo, como descrito acima, em tampão de fosfato, pH 7,2, incluindo um teor fisiológico de cloreto de sódio. 82

Assim, efectua-se a separação do anticorpo marcado com radioactividade de elevado peso molecular e 11:LInCl3 não ligado. A quantificação da incorporação de 11:LIn no anticorpo quelado foi feita utilizando cromatografia em camada fina. A taxa de incorporação do metal radioactivo foi de 80-99% da radioactividade empregue. 8. Testes de Ligação Celular e Análise de Scatchard de Moléculas de Reconhecimento Marcadas com Radioactividade que Reconhecem Especificamente o Epitopo Tumoral de MUC1 Glicosilado

Foram utilizadas diferentes linhas de células tumorais para testar a capacidade de ligação das moléculas de reconhecimento marcadas com radioactividade. Em cada determinação dupla, um número definido de células foram colocadas num recipiente de 1,5 ml e incubadas com quantidades crescentes de anticorpos. A seguir à lavagem, a quantidade de anticorpos ligados foi determinada com base na taxa de contagem. Este valor foi representado num diagrama como a razão da quantidade ligada/não ligada em função da quantidade ligada. O declive na região linear da curva foi determinado, e a intersecção da abcissa foi determinada (análise de Scatchard, ver abaixo). São necessárias lxlO5 células por lote. Após pré-incubação das células durante uma hora sobre gelo, a quantidade necessária de células foi colocada num recipiente reaccional, centrifugada (5 minutos a lOOOxg, 25 °C) , e o sobrenadante foi removido. Seguidamente perfez-se o volume até 200 μΐ com PBS/0,1% de Tween20/1% de BSA, subtraindo a quantidade de moléculas de reconhecimento a ser ainda adicionada. Seguidamente, a molécula de reconhecimento correspondente foi adicionada para fazer um volume final de 200 μΐ (cerca de 40 a 500 ng, dependendo da molécula de reconhecimento), e os lotes foram incubados durante uma hora a 4-8 °C. Após a 83 centrifugação (5 minutos, lOOOxg, 25 °C), o sobrenadante foi removido e o agregado das células foi cuidadosamente novamente suspenso em 500 μΐ de PBST/1% de BSA. Depois de uma outra lavagem, o agregado celular foi medido no recipiente do contador gama. As taxas de contagem especificas foram determinadas nas soluções iniciais de concentração definida, o valor em cpm/ng foi usado como uma base de relativização dos valores medidos do anticorpo ligado. Os valores da abcissa são representados como moléculas ligadas de anticorpos por célula (r) . O valor da ordenada respectivo é o quociente entre a ligação (r) e a ligação livre, com a ligação livre a representar a diferença da quantidade total e a quantidade de anticorpo ligado (valores em M na FIG. 12) . A intersecção da abcissa indica o número de locais de ligação/célula. O declive da linha recta fornece a constante de associação de Kass em [M_1 ] . A FIG. 11 exemplifica a análise de Scatchard da ligação das moléculas de reconhecimento marcadas com radioactividade em formato de scFv com a sequência SEQ ID NO. 36 (scFv monovalente, FIG. 11a) e 45 (multicorpo, FIG. 11b) a células T47D, um Kass de 4,5xl06 M_1 e 5,3xl05 locais de ligação/célula para o scFv monovalente e um Kass de 1,9χ107 M-1 e 2,6xl06 locais de ligação/célula para o multicorpo foram obtidos nestas condições.

Na Tabela 8, a constante de associação e o número de locais de ligação de células de vários anticorpos e formatos de anticorpos em células K5 62 são resumidos e comparados com o HMFG-1 que foi utilizado e testado nas mesmas condições.

Tabela 8: teste de ligação celular e análise de Scatchard com moléculas de reconhecimento marcadas com radioactividade em células K562 . 84 Anticorpo mIgG-Panko2 HMFG-1 clgG-Pankol cIgG-Panko2 SEQ ID NO. 36 SEQ ID NO. 46

Kass [M-l] 9,5 x 10 8 2.7 x 10 8 1,2 x 10 8 6, 1 x 10 8 1.8 x 10 7 4.9 x 10 7 Número de locais de ligação/célula 1.0 x 10 5 6,3 x 10 4 1,9 x 10 5 1.1 x 10 5 5,5 x 10 9 4,8 x 10 5 9. Biodistribuição de Moléculas de Reconhecimento Marcadas com Radioactividade que Reconhecem Especificamente o Epitopo Tumoral de MUC1 Glicosilado, num modelo tumoral in vivo

Como modelo de tumor, o tecido do carcinoma do cólon humano (xenoenxerto No. 5841), foi transplantado por via subcutânea em ratos pelados (Ncr: nu/nu, fêmeas). Como um outro modelo tumoral 107 células cancerosas da mama ZR-75-1 positivas para MUC1, foram injectadas por via subcutânea em ratos pelados (Ncr: nu/nu, fêmeas). Após cerca de 3-4 semanas, o tumor é possivel de sentir sob a pele. A cada rato que transporta o tumor (n=5 em cada ponto de tempo) foi administrado 5 pg de 111In-marcado de mIgG-Panko2 em 200 μΐ na veia da cauda. Os ratos foram sacrificados após 5 minutos, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h e 72 h, e foi determinada a distribuição da radioactividade no tumor, no soro e nos órgãos. A FIG. 12 ilustra a acumulação especifica de mIgG-Panko2 no tumor em % ID/g de tumor (em relação à dose injectada e ao peso do tumor) num um modelo de tecido transplantado. Em contrapartida, existe uma depleção de radioactividade nos órgãos e no soro ao longo do perfil do tempo, como indicado. A FIG. 13 resume os resultados com o modelo ZR-75-1. A absorção especifica de mIgG-Panko2 marcado com radioactividade no tumor atinge mais de 85% de ID/g de tumor depois 85 de 72 horas, em que a acumulação nos órgãos e no soro é muito baixa e comparável com ratos saudáveis. 10. Detecção de MUC1 Secretório Especifico de Tumor num teste de Sanduíche ELISA com as Moléculas de Reconhecimento que Reconhecem Especificamente o Epitopo Tumoral de MUC1 Glicosilado O MUC1 secretório especifico do tumor pode ser detectado num teste de sanduíche de ELISA. Um anticorpo específico de MUC1 foi utilizado como anticorpo necrófago do MUC1, e uma molécula de reconhecimento de acordo com a invenção servem para detectar o MUC1 específico do tumor. Para detectar o MUC1 secretório positivo do núcleo 1, uma molécula de reconhecimento, de acordo com a invenção é utilizada como necrófago, por exemplo, e um anticorpo específico de núcleo 1 serve para a detecção do antigénio do núcleo 1. Um terceiro anticorpo acoplado com enzima ou com fluorescência tem de ser utilizado para detectar o anticorpo secundário.

Os sobrenadantes de três linhas celulares tumorais (K562, ZR-75-1 e T47D) foram analisados como exemplos. Os resultados estão ilustrados na Tabela 9. 105 células por ml de meio de cultura celular foram semeadas, cultivadas durante 4 dias, sem a substituição do meio, uma aliquota foi posteriormente extraída, e o sobrenadante da cultura de células foi separado do agregado celular por centrifugação. 50 μΐ de sobrenadantes não diluídos foram utilizados no teste de ELISA. O teste de sanduíche de ELISA foi realizado pelo revestimento da placa de microtitulação com anticorpo necrófago (HMFG-1 ou mIgG-Panko2, 1 pg/ml) em PBS a 4 °C durante a noite. Três concentrações diferentes do anticorpo foram testadas no revestimento (1 pg/ml, 2 pg/ml e 4 pg/ml). O revestimento com 1 pg/ml foi verificado ser o mais sensível no 86 teste de sanduíche de ELISA. Posteriormente, as placas revestidas foram lavadas duas vezes com PBS e bloqueadas, em 5% de BSA, 0,05% de Tween 20 em PBS durante 1,5 horas à temperatura ambiente. O tampão de bloqueio foi removido, as placas foram lavadas mais uma vez com 0,1% de Tween 20 em PBS (tampão de lavagem), as amostras foram adicionadas e incubadas à temperatura ambiente durante 1,5 horas. Meio de cultura celular ou 2% de BSA em tampão de lavagem (tampão de diluição para o anticorpo secundário) foi utilizado como controlo negativo. O controlo positivo não esteve disponível. Para um teste de sanduíche de ELISA de núcleo 1 de MUC1, o tratamento com neuraminidase foi realizado, depois de se lavar três vezes, nos poços destinados para esse fim. Para este objectivo, uma solução de neuraminidase (Dade Behring, Alemanha) foi diluída, 1:5, em tampão de imidazol (0,68 g de imidazol, 0,19 g de CaCl2 e 0,4 g de NaCl em 100 ml de H20, pH 6,8) e incubada a 50 μΐ/poço durante 30 minutos a 37 °C. Como controlo, o tampão de imidazol sem solução de neuraminidase foi incubado num poço correspondente. De seguida os poços foram lavados três vezes e, o mIgG-Panko2 biotinilado (EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotina, Pierce) ou um anticorpo de anti-núcleo 1 (mIgM-Karo4) para detectar o MUC1 ou o MUC1 que suporta o núcleo 1, foi adicionado em 2% de BSA em tampão de lavagem e incubado à temperatura ambiente durante mais uma hora. Após três novas lavagens seguiu-se a adição de estreptavidina acoplada à peroxidase ou a um anticorpo de IgM (μ) anti-rato acoplado à peroxidase (Dianova) diluiu-se 1:300 e 1:5000, respectivamente, em 2% de BSA em tampão de lavagem e incubou-se durante 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, as placas foram lavadas duas vezes em tampão de lavagem e uma vez em PBS. A reacção de coloração foi realizada em 25 mM de ácido cítrico, tampão de fosfato, pH 5,0, com 0,04% de H202 e 0,4 mg/ml de o-fenilenodiamina (Sigma), no escuro, à temperatura ambiente. A reacção de coloração foi parada, através da adição de 87 ácido sulfúrico 2,5 N (concentração final de 0,07 N) e medida num leitor de ELISA a 492 nm com um filtro de referência de 620 nm.

Tabela 9: Análise do MUC1 secretório especifico do tumor em sobrenadantes de cultura de duas linhas celulares e detecção do núcleo 1, antes e depois do tratamento com neuraminidase em um teste de sanduíche de ELISA

Necrófago Ab HMFG-1 mIgG-Panko2 Detecção-Ab mIgG-Panko2 anti-Núcleo-1 (m!gM-Karo4) Linha celular - Neuraminidase + Neuraminidase K562 + - + ZR-75-1 +++ - + T47D ++ - +++ 11. Detecção de MUC1 no Soro de Doentes com Carcinoma do Cólon através das Moléculas de Reconhecimento que Reconhecem Especificamente o Epitopo Tumoral de MUC1 glicosilado

Um teste de sanduíche de ELISA, como descrito acima foi utilizado para detectar MUC1 solúvel em soros de doentes. O anticorpo 115D8 anti-MUCl (necrófago no teste comercial CA 15-3) ou mIgG-Panko2 (1 pg/ml de PBS) foi utilizado como anticorpo necrófago. Após o bloqueio com 2% de BSA/PBS, os soros foram aplicados. 24 diferentes soros de doentes de carcinomas do cólon em diferentes diluições (de não diluído a 1:32 diluído) foram investigados. As diluições de um soro definido de um doente com carcinoma mamário (152 U/ml, Teste CA 15-3 Enzymun, Boehringer Mannheim) foram usadas como padrão. Um limite de 23 U/ml (valor médio para os soros normais na literatura) foi estabelecido. Para detectar o MUC1 ligado, o mIgG-Panko2 foi comparado com dois outros anticorpos anti-MUCl, ou seja, DF3 (anticorpo de detecção no teste CA 15-3) e HMFG-1. Todos os três anticorpos foram utilizados biotinilados (EZ-Link sulfo-NHS-LC- 88 biotina, Pierce) e, após três lavagens com PBS + 0,1% de Tween 20, foram acoplados com estreptavidina-POD (1:300 em 0,2% de BSA/PBS) e detectados com TMB como substrato de peroxidase (ver acima).

Os dados estão resumidos na Tabela 10. O MUC1 solúvel no soro de doentes com carcinoma do cólon dá uma ligação significativamente menor com a molécula de reconhecimento mIgG-Panko2 de acordo com a invenção em comparação com os anticorpos DF3 e HMFG-1 anti-MUCl bem conhecidos.

Tabela 10: Detecção de MUC1 no soro num teste de ELISA utilizando diferentes anticorpos anti-MUCl.

Anticorpo Anticorpo de Amostras acima do limite/amostras % necrófago Detecção totais 115D8 DF3 20/24 83 115D8 HMFG-1 19/24 79 115D8 mIgG-Panko2 8/24 33 mIgG-Panko2 m!gG-Panko2 8/24 33 1/12 8 12. Terapia Tumoral para a Redução de Tumores Positivos a MUC1 num Modelo Tumoral in vivo com Moléculas de Reconhecimento Marcadas com Radioactividade que Reconhecem Especificamente o Epitopo do Tumor de MUC1 glicosilado O potencial terapêutico de mIgG-Panko2 foi investigado no modelo tumoral ZR-75-1 (ver o Exemplo 9) . Para este efeito, as moléculas de reconhecimento queladas (ver o Exemplo 7) foram carregadas (pH 4,5, 37 °C, 30 minutos; comparar com a incorporação de 111indio) , com 90ítrio (um β-emissor para destruir as células tumorais) e a estabilidade foi controlada por cromatografia em camada fina.

Uma semana a oito semanas após a injecção subcutânea das células ZR-75-1 (dependendo do tamanho do tumor pretendido como modelo para o tratamento dos tumores sólidos de tamanho médio (cerca de 0,3 89 cm3) ou grandes (> 0,5 cm3) ou o tratamento de doença residual mínima (< 0,05 cm3)), administrou-se 200 μΐ i. v. aos ratos que transportam o tumor na veia da cauda. A solução injectável continha o mIgG-Panko2 marcado com 90Y (100 pCi por dose; actividade específica: 3 mCi/mg de anticorpo) em Ca/Mg-PBS com 4% de soro fetal de bovino para proteger da radiólise. Os grupos de controlo receberam a mesma injecção sem molécula de reconhecimento radioactivamente marcada e com anticorpos de controlo marcados com radioactividade (90Y-MOPC21) . O peso corporal e o tamanho do tumor foram medidos duas vezes por semana e comparados. O crescimento relativo do tumor foi determinado considerando o respectivo tamanho do tumor, no início do tratamento. Uma segunda injecção (50 pCi por dose) foi dada cerca de três semanas após o primeiro tratamento. Este tipo de tratamento resultou num forte efeito anti-tumoral em todos os animais testados. Ao tratar tumores pequenos (< 0,05 cm3) ou de tamanho médio (cerca de 0,3 cm3), foi possível inibir completamente o crescimento tumoral durante todo o período de observação (6 semanas; FIGS. 14a e 14b) . Em animais com tumores muito grandes (> 0,5 cm3) no início do tratamento, foi possível suprimir o crescimento tumoral durante cerca de três semanas (FIG. 14c) . Uma segunda injecção não foi possível no grupo controlo devido ao tamanho do tumor, já não dentro dos limites do que é razoável. O tratamento com um anticorpo (MOPC21) marcado por 90Y irrelevante na mesma dosagem, dá apenas uma pequena redução do crescimento tumoral em comparação com os animais não tratados (FIG. 14d), o que pode ser devido a irradiação inespecífica como um resultado da deplecção relativamente lenta do anticorpo no soro. 90

Para além de uma mielotoxicidade mínima, o tratamento com o mlgG-Panko2 marcado por 90Y não mostrou nenhuns efeitos colaterais. 13. Detecção de citotoxicidade celular dependente do anticorpo de Moléculas de Reconhecimento, que Reconhecem Especificamente o Epitopo Tumoral de MUC1 glicosilado, num modelo in vitro A citotoxicidade celular dependente de anticorpos (ADCC) das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção foi investigada em um ensaio de libertação de európio. As células-alvo (ZR-75-1 ou MCF-7; 5xl06) foram incubadas durante 10 minutos a 4 °C em 800 μΐ de tampão de európio (50 mM de HEPES, pH 7,4, 93 mM de NaCl, 5 mM de KC1, 2 mM de MgCl2, 10 mM de ácido dietilenotriaminapenta-acético, 2 mM de acetato de európio (III) ) , (710 V, 1 pulsação, 30 ps) electroporadas num Multiporador (Eppendorf), e posteriormente incubadas em gelo durante mais 10 minutos. Posteriormente, as células foram lavadas 5 vezes em RPMI 1640/5% de FCS e depositadas numa placa de fundo redondo de 96 poços (Nunc, 5xl03 em 100 μΐ por poço) . Após a adição de 20 μΐ de mIgG-Panko2, de HMFG-1, de clgG-Pankol ou cIgG-Panko2 em diferentes concentrações (0,2 a 25 pg/ml de concentração final em 200 μΐ de volume de incubação) ou os controlos correspondentes (meio, isotipo de controlo hlgG), as células do sangue periférico humano (80 μΐ/poço, preparação, ver o Exemplo 14) foram adicionadas como células efectoras, utilizando uma proporção célula efectora/ célula alvo de 5 a 100 para 1. 80 μΐ de RPMI/FCS sem células efectoras não foi adicionado para determinar a liberação espontânea. A libertação máxima foi determinada após a lise completa das células-alvo com etanol. Após a incubação numa incubadora a 37 °C durante 4 a 20 horas, a placa foi centrifugada a 500xg durante 5 minutos, e 20 μΐ da amostra foi pipetada em cada poço com 200 μΐ da solução de 91 amplificação (Perkin-Elmer Wallac). Após incubação durante 15 minutos à temperatura ambiente, a fluorescência foi determinada (Fluorómetro Victor2, Perkin-Elmer Wallac). A citotoxidade especifica é obtida a partir da equação (lise experimental-lise espontânea)/(lise máxima-lise espontânea).

Os IgGs quiméricos de Pankol e Panko2 apresentam uma elevada lise especifica das células-alvo positivas para MUC1 (FIG. 15a) . 0 IgG de murino de Panko2 mostra uma citotoxicidade mais baixa em comparação com as moléculas de reconhecimento quiméricas, mas um efeito claramente maior do que o anticorpo HMFG-1 anti-MUCl de murino para o qual se observe uma ligeira lise apenas na concentração mais elevada testada (FIG. 15b). 14. Análise de Ligação das Moléculas de Reconhecimento, que Reconhecem Especificamente o Epitopo Tumoral de MUC1 Glicosilado, às Células Sanguíneas Humanas A expressão de MUC1 sobre células hematopoiéticas pode ser detectada por meio de diversos anticorpos anti-MUCl. No entanto, vários resultados com diferentes anticorpos de anti-MUCl permitem a conclusão de que o reconhecimento de MUC1 não epitelial é altamente dependente da especificidade fina do respectivo anticorpo, e que a variação dos padrões de glicosilação de MUC1 estão presentes nas células. A ligação das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção a células sanguíneas humanas foi investigada utilizando citometria de fluxo.

As células sanguíneas periféricas humanas foram obtidas a partir do sangue de dadores saudáveis utilizando a centrifugação de densidade (Ficoll-Hypaque) . A camada celular foi removida e lavada 3 vezes 92 com RPMI 1640/5% de FCS. As células foram utilizadas, tanto no estado fresco ou criopreservadas e descongeladas em RPMI 1640/10% de FCS antes da sua utilização na coloração da célula ou como células efectoras no ensaio de ADCC (ver o Exemplo 13) . Para estimular as células T humanas, as células sanguíneas isoladas foram incubadas em RPMI/FCS + 1 pg/ml de PHA + 60 U/ml de LIS-2 numa incubadora durante 3 a 8 dias. A estimulação foi monitorizada em citometria de fluxo, através da detecção do marcador de activação CD25.

As células sanguíneas isoladas foram incubadas com mlgG-Pankol, mIgG-Panko2, HMFG-1 ou DF3 e com um controlo de isotipo mlgGl como controlo durante uma hora sobre o gelo. A seguir à lavagem com PBS, as células foram incubadas com Ig anti-rato de cabra conjugado com Cy3 (Dianova) e/ou com um marcador específico CD (CD3, CD14, CD19) , anticorpo marcado de FITC (30 minutos, 4 °C, no escuro). A seguir à lavagem, as células foram analisadas utilizando a citometria de fluxo. Nenhum dos anticorpos testados se liga a células T não activadas. Depois da estimulação de PHA, a expressão MUC1 em células T humanas é regulada para cima. Este MUC1 é fortemente detectado pelo HMFG-1 e DF3, mas apenas numa quantidade mínima, por Panko2. 0 Pankol não apresenta qualquer ligação às células sanguíneas estimuladas por PHA (FIG. 16) . O Panko2 e DF3 não reconhecem MUC1 nem nos monócitos nem nas células B. Em contraste, o HMFG-1 e o Pankol dão uma fraca ligação aos monócitos e o HMFG-1 também às células B (FIG. 16), sendo as densidades de superfície detectada significativamente menores do que aquelas em células T activadas.

Legendas das Figuras 93 FIG. 1: Vector para a clonagem e expressão bacteriana de fragmentos de anticorpo de cadeia simples. FIG. 2: Diagrama de clonagem para a preparação de fragmentos de anticorpo de cadeia simples que têm diferentes comprimentos de ligante. FIG. 3: Sistema de vector para a clonagem e expressão eucariótica de anticorpos quiméricos em formato IgM ou IgGl. FIG. 4: Ligação das moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção, mlgG-Pankol e mIgG-Panko2, ao péptido de MUC1 glicosilado e não glicosilado num teste de ELISA. 0 30-meros não-glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS e o 30-meros glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDT[GalNAca]RPAPGSTAPPAHGVTSA foram utilizados como antigénios e ligados em PBS à placa. Os anticorpos mlgG-Pankol e mIgG-Panko2 foram empregues numa concentração de 0,5 pg/ml no teste de ELISA. FIG. 5: Comparação da ligação especifica dos anticorpos anti-MUCl, HMFG-1, C595 e SM3 com o mlgG-Pankol e o mIgG-Panko2 ao péptido de MUC1 glicosilado e não glicosilado em vim teste de ELISA, o 30-meros não glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS e o 30-mer glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDT[GalNAca]RPAPGSTAPPAHGVTSA foram utilizados como antigénios e secos em H20 na placa. Os anticorpos foram utilizados numa concentração de 10 pg/ml no teste de ELISA. FIG. 6: Ligação especifica de vários formatos preferidos de moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção num teste de ELISA, exemplificada usando o péptido de MUC1 de 30-meros não 94 glicosilado e glicosilado. O 30-meros não glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS e o 30-meros glicosilado com a sequência APPAHGVTSAPDT[GalNAca]RPAPGSTAPPAHGVTSA foram utilizados como antigénios e ligados em PBS à placa. Os dois formatos scFv, SEQ ID NO. 36 e 45 foram utilizados com 0,5 pg/ml, o IgG de murino com 0,1 pg/ml e o IgG quimérico com 0,01 pg/ml.Uma vez que são utilizados para os diversos formatos anticorpos secundários diferentes, os dados de ELISA devem ser avaliados apenas qualitativamente. FIG. 7: Dependência da ligação das moléculas de reconhecimento mlgG-Pankol e mIgG-Panko2 de acordo com a invenção no número de repetições paralelas em péptidos MUC1 não glicosilados em comparação com os anticorpos específicos de MUC1, SM3 e C595 em um teste de ELISA. Uma série de péptidos de MUCl não glicosilados de diferentes comprimentos, com a sequência [VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG]n em que n = 1, 3 e 5 (TR1, TR3 e TR5), foram utilizados como antigénios e em H20 secos na placa. Os anticorpos foram empregues numa concentração de 10 pg/ml. FIG. 8: Dependência da ligação da molécula de reconhecimento mlgG-Pankol de acordo com a invenção, no número de repetições paralelas (regiões de PDTR glicosiladas múltiplas) em comparação com os anticorpos específicos de MUCl, SM3 e C595 num teste de ELISA. Uma série de péptidos de MUCl glicosilados de diferentes comprimentos, com a sequência A [HGVTSAPDT (GalNAca) RPAPGSTAPPA] n, em que n = 1, 3 e 5 (TRlgg, TR3g e TR5g), foram utilizados como antigénios e em H20 secos na placa. Os anticorpos foram empregues numa concentração de 10 pg/ml. 95 FI6. 9: Marcação por fluorescência de células da linha celular tumoral T47D (carcinoma mamário) com a molécula de reconhecimento mIgG-Panko2 especifica de MUC1. FI6. 10: Marcação por fluorescência de células da linha celular tumoral K562 (leucemia eritróide) com a molécula de reconhecimento clgG-Pankol especifica de MUC1. FIG. 11: Diagrama de Scatchard para a análise da ligação celular de moléculas de reconhecimento especificas de MUC1 marcada com radioactividade. Os dados de ligação dos dois formatos scfv, a SEQ ID NO. 36 (a) e a SEQ ID NO. 45 (b) são exemplificados, r: moléculas ligadas por célula, A: concentração empregue da molécula de reconhecimento marcada com radioactividade [M] , x: percentagem ligada às células [M] . A diferença A-x representa a concentração de moléculas de reconhecimento livres no lote. A equação da linha recta correspondente é dada em cima, o declive da linha recta representa a constante de associação. FIG. 12: Acumulação especifica da molécula de reconhecimento marcada com radioactividade, mIgG-Panko2, num tumor num modelo de xenotransplante de rato. A cada rato que transporta o tumor (n = 5 por ponto no tempo), foi administrado i.v. 5 pg de mIgG-Panko2 marcado com 111In. Os ratos foram sacrificados após o período indicado, e a acumulação no tumor, em relação à dose injectada e ao peso do tumor (%ID/g) foi determinada. FIG. 13: Acumulação específica elevada da molécula de reconhecimento marcada com radioactividade, mIgG-Panko2, num tumor num modelo de célula tumoral ZR-75-1 no rato. A cada rato que transporta o tumor (n = 6 por ponto no tempo) , foi administrado 96 i.v. com 5 pg de mIgG-Panko2 marcado com 111In. Os ratos foram sacrificados após o período, conforme indicado, e a acumulação no tumor, no soro e nos órgãos, em relação à dose injectada e ao peso do tumor ou do órgão (%ID/g) foi determinada. FI6. 14: A inibição do crescimento tumoral em ratos que transportam tumores depois do tratamento com a molécula de reconhecimento marcada com radioactividade, mIgG-Panko2. No 8o dia (14a; pequenos tumores: < 0,05 cm3), no 36° dia (14b; tumores médios: cerca de 0,3 cm3) e no 57° dia (14c; tumores grandes: > 0,5 cm3) depois da injecção subcutânea das células ZR-75-1, aos ratos que transportam o tumor foram administrados 200 μΐ i.v. na veia caudal. A solução injectável continha o mIgG-Panko2 marcado com 90Y (100 μΟί por dose; actividade específica: 3 mCi/mg de anticorpo) em Ca/Mg-PBS com 4% de soro fetal de bovino para proteger da radiólise. Os grupos de controlo receberam a mesma injecção, mas sem molécula de reconhecimento radioactivamente marcada. No caso dos tumores com tamanho pequeno e médio foi efectuada uma segunda injecção (50 μΟί) cerca de 3 semanas mais tarde. A FIG. 14d mostra o tratamento dos ratos que suportam tumores com 90Y-mIgG-Panko2 em comparação com um anticorpo de controlo irrelevante radiomarcado 90Y-MOPC21. FIG. 15: Mediação específica de citotoxicidade celular dependente de anticorpos pelas moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção, Pankol e Panko2. Os anticorpos foram usados numa concentração de 0,2 a 25 pg/ml. (a) Os formatos clgG de Pankol e Panko2 mostram uma lise específica elevada das células ZR-75-1 positivas para MUC1. (b) O Panko2 mlgG também medeia a lise celular do tumor específica e mostra um efeito significativamente maior do que o anticorpo HMFG-1, anti-MUCl de murino, para o qual foi 97 observada uma lise ligeira somente na concentração testada mais elevada (25 pg/ml). FIG. 16: Análise de ligação de moléculas de reconhecimento de acordo com a invenção a células sanguíneas humanas. As células sanguíneas periféricas humanas foram obtidas a partir do sangue de dadores saudáveis por meio de centrifugação de densidade. Para estimular as células T humanas, as células sanguíneas isoladas foram incubadas em RPMI/FCS + 1 pg/ml de PHA + 60 U/ml de hIL-2 numa incubadora durante 3 a 8 dias. As células sanguíneas isoladas foram incubadas com mlgG-Pankol, mIgG-Panko2, HMFG-1, DF3 ou mlgGl (controlo) e coradas com Ig anti-rato de cabra conjugado com Cy3 (Dianova) e/ou com um marcador específico CD (CD3, CD14, CD19), anticorpo marcado FITC. Depois da lavagem, as células foram analisadas utilizando a citometria de fluxo.

As moléculas de reconhecimento, Pankol e Panko2, não mostram nenhuma ou somente uma ligação mínima às células sanguíneas humanas. Em contraste, os anticorpos específicos de MUC1, HMFG-1 e DF3 ligam-se fortemente às células T estimuladas por PHA, e HMFG-1 também se liga às células B e aos monócitos.

Referências Bibliográficas

Boel E. et al., J. Immunol. Methods 239, 153-66 (2000).

Brechbiel M. W. et al., Inorg. Chem. 25, 2772-2781 (1986) Chothia C. et al. , Science 233, 755-758 (1986). Chothia C. et al. , Nature 342, 877-883 (1989). Chothia C. et al., J. Mol. Biol . 227, 799-817 (1992).

Chothia C. & Lesk A.M., J. Mol. Biol. 196, 901-917 (1987). Dai J. et al., Tumor Biol. 19 (suppl. 1), 100-110 (1998). 98

Herrera A. M. et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 273, 557-559 (2000) .

Hinoda Y. et al. Gastroenterol. Jpn. 27, 390-395 (1992).

Jensen K. B. et al., Biochem. Biophys. Res. Com. 298, 566-573 (2002) .

Kozak R. W. et al., Câncer Res. 49, 2639-2644 (1989).

Liao et al., Biotechnol. Bíoeng. 73, 313-323 (2000).

Martin A. C. R. & Thornton J. M., J. Mol. Biol. 263, 800-815 (1996) .

Nuttall S. D. et al., Proteins 36, 217-227 (1999).

Nygren P. A. & Uhlen M., Cur. Opin. Struc. Biol. 7, 463-469 (1997). Rooman M. J. et al., Protein Eng. 3, 23-27 (1989).

Skerra A,. J. Mol. Recog. 13, 167-187 (2000).

Stimmel J. B. et al., Bioconjug. Chem. 6, 219-225 (1995).

Tonye Libyh M. et al., Blood 90(10), 3978-83 (1997).

Patente norte-americana No. 5,506,343 Patente norte-americana No. 5,683,674 Patente norte-americana No. 5,804,187 Patente norte-americana No. 6,315,997 Patente WO 02/44217 Patente WO 93/20841

Wu S. & Cygler M., J. Mol. Biol. 229, 597-601 (1993).

Lista de Sequências

Sequências CDR

DAWMD

NYWMN SEQ ID NO. 1 SEQ ID NO. 2 SEQ ID NO. 3 SEQ ID NO. 4

EIRSKANNHATYYAESVKG

EIRLKSNNYTTHYAESVKG 99

SEQ ID NO. 5 GGYGFDY SEQ ID NO. 6 HYYFDY SEQ ID NO. 7 RSSQSIVHSNGNTYLE SEQ ID NO. 8 RSSKSLLHSNGITYFF SEQ ID NO. 9 KVSNRFS SEQ ID NO. 10 QMSNLAS SEQ ID NO. 11 FQGSHVPLT SEQ ID NO. 12 AQNLELPPT

Sequências CDR (variantes das estruturas canónicas)

SEQ ID NO. 13 NYWVN SEQ ID NO. 14 NYWIN SEQ ID NO. 15 NYWYN SEQ ID NO. 16 NYWWN SEQ ID NO. 17 DAWID SEQ ID NO. 18 DAWVD SEQ ID NO. 19 DAWYD SEQ ID NO. 20 DAWWD SEQ ID D10 . 2 1 EIRSKANNYATYYAESVKG SEQ ID NO. 22 EIRLKSNKYTTHYAESVKG SEQ ID NO. 23 EIRLKSNSYTTHYAESVKG SEQ ID NO. 24 RPSQSIVHSNGNTYLE SEQ ID NO. 25 RSSQSIVHSNGNTYFE SEQ ID NO. 26 RPSQSIVHSNGNTYFE SEQ ID NO. 27 RPSKSLLHSNGITYFF SEQ ID NO. 28 RSSKSLLHSNGITYLF 100 SEQ ID NO. 29 RPSKSLLHSNGITYLF SEQ ID NO. 30 FQGSHPPLT SEQ ID NO. 31 AQNLEPPPT cadeias pesadas variáveis SEQ ID NO. 32

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA

TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS SEQ ID NO. 33

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSS cadeias leves variáveis SEQ ID NO. 34

DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRA SEQ ID NO. 35

DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNL

ASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRA

Associações VH/VL

Pankol SEQ ID NO. 32 SEQ ID NO. 34

Panko2 SEQ ID NO. 33 SEQ ID NO. 35 101

Diferentes formatos de cadeia Fv simples SEQ NO. 36

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS ASSGGGGSGGGGSGGSARDIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWY LQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVP LTFGDGTKLELKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 37

EVKLVE S GGGLVQ PGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS ASSGSGSSADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPK

LLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKL ELKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 38

TYYAESVKGRF1' ISRDVS KSSVYLQMUNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS ASS GGSSAD IVZíTQ*? PI*S L PV SLGDQASIS CRSSQSIVHSNGNTYLEWYIiQKPGQS PKL

LKRAAAHHHHHHGAAEQKDISEEDLNGAA SEQ ID NO. 39

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS ASSGSSADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLL IYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLEL KRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA 102 SEQ ID NO. 40

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGlyYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS AS S S SADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRS SQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQS PKLLI YKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELK RAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 41

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS ASSSADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIY KVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKR AAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 42

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS ASSADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYK VSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRA AAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 43

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS ASADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKV SNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRAA AHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 44

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA 103

TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS

AADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVS

NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRAAA

HHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 45

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS ADIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSN RFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRAAAH HHHHHGAAEQKLISEEVHQ SEQ ID NO. 46

EVKLVE S GGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRnVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSS DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRAAAHH HHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 47

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSD IVLTQTPLSLFVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRF SGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRAAAHHH HHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 48

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT

THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA

SSGGGGSGGGGSGGSARDIVMTQAAFSNFVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYL

QKPGLSPQLLIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDF~LRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPP 104 TFGGGTKLEIKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 49

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA S SGSGS SADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQL LIYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLE IKRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 50

EVKLVE S GGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA SSGGSSADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLL IYQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEI KRAAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 51

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA SSGSSADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLI YQMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIK RAAAHIUIHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 52

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA SSSSADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIY QMSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKR AAAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ 1DNO. 53 105

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA S S SADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRS SKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLS PQLLIYQ MSNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRA AAHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 54

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA S SADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQM SNLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRAA AHHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 55

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA SADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMS NLASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRAAA HHHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 56 EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA ADIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSN LASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRAAAH HHHHHGAAEQKLISEEDLNGAA. SEQ ID NO. 57

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT

THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSA

DIVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNL 106

ASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRAAAHH HHHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ 1D NO. 58

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSSD IVMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNLA SGVPDRFSSSGSGTDFTLR1SRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRAAAHHH HHHGAAEQKLISEEDLNGAA SEQ ID NO. 59

EVKLVE S GGGLVQ PGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQS PEKGLEWVAE1RLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSDI VMTQAAFSNPVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNLAS GVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRAAAHHHH HHGAAEQKLISEEDLNGAA

Anticorpos de Murino cadeia leve de IgGl de murinos (cadeia k) SEQ ID NO. 60

DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRADAAP TVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDST YSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC SEQ ID NO. 61

DIVMTQAAFSNFVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNL

ASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRADAAP

TVSIFPPSSEQLTSGGASWCFLNNFYPKDINVKWKIDGSERQNGVLNSWTDQDSKDST 107

YSMSSTLTLTKDEYERHNSYTCEATHKTSTSPIVKSFNRNEC cadeia pesada do IgGl de murinos SEQ ID NO. 62

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSA KTTPPSVYPLAPGSAAQTNSMYTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESD LYTLSSSVTVPS S PRPSETVTCNVAHPAS STKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVS SVFI FPPKPKDVLTITLTPKVTCVWDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNS TFR SVSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYTIPPPKEQMAK DKVSLTCMITDFFPEOITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEA GNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK SEQ 10 NO. 63

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT

THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSAK

TTPPSVYPLAPGSAAQTNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGSLSSGVHTFPAVLESDL

YTLSSSVTVPSSPRPSETVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRDCGCKPCICTVPEVSSVFIF

PPKPKDVLT1TLTPKVTCVWDISKDDPEVQFSWFVDDVEVHTAQTQPREEQFNSTFRS

VSELPIMHQDWLNGKEFKCRVNSAAFPAPIEKTISKTKGRPKAPQVYT1PPPKEQMAKD

KVSLTCMITDFFPEOITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMNTNGSYFVYSKLNVQKSNWEAG

NTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK

Anticorpo de murino mlgG-Pankol SEQ 10 NO. 60 SEQ 10 NO. 62 mlgG-Panko2 SEQ 10 NO. 61 SEQ 10 NO. 63 108

Anticorpo quimérico (Rato/Humano) cadeia pesada de IgGl quimérico (cadeia gama) SEQ ID NO. 64

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA

TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSG

STKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS

GLYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLG

GPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQ

YNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPS

RDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVD

KSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO. 65 EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSGS TKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYSLSSWTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG P S VFLFP PKPKDTLMISRT PEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK cadeia pesada de um IgM quimérico (cadeia mu) SEQ ID NO. 66

EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCAASGFTFSDAWMDWVRQSPEKGLEWVAEIRSKANNHA

TYYAESVKGRFTISRDVSKSSVYLQMNNLRAEDTGIYYCTRGGYGFDYWGQGTTLTVSG

SASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVL

RGGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHWCKVQHPNGNKEKNVPLPV1AELPPKVSVFVPP

RDGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKV 109

TSTLTIKESDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLT KSTKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWN SGERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTG FSPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCV VAHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY SEQ ID NO. 67 EVKLVESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFTFSNYWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRLKSNNYT THYAESVKGRFTISRDDSKSSVSLQMNNLRVEDTGIYYCTRHYYFDYWGQGTTLTVSGS ASAPTLFPLVSCENSPSDTSSVAVGCLAQDFLPDSITLSWKYKNNSDISSTRGFPSVLR GGKYAATSQVLLPSKDVMQGTDEHWCKVQHPNGNKEKNVPLPVIAELPPKVSVFVPPR DGFFGNPRKSKLICQATGFSPRQIQVSWLREGKQVGSGVTTDQVQAEAKESGPTTYKVT S TLTIKE SDWLGQSMFTCRVDHRGLTFQQNASSMCVPDQDTAIRVFAIPPSFASIFLTK S TKLTCLVTDLTTYDSVTISWTRQNGEAVKTHTNISESHPNATFSAVGEASICEDDWNS GERFTCTVTHTDLPSPLKQTISRPKGVALHRPDVYLLPPAREQLNLRESATITCLVTGF SPADVFVQWMQRGQPLSPEKYVTSAPMPEPQAPGRYFAHSILTVSEEEWNTGETYTCW AHEALPNRVTERTVDKSTGKPTLYNVSLVMSDTAGTCY cadeia leve de um IgG 1 ou de IgM quimérico (cadeia kapa) SEQ ID NO. 68

DIVLTQTPLSLPVSLGDQASISCRSSQSIVHSNGNTYLEWYLQKPGQSPKLLIYKVSNR FSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGDGTKLELKRTVAAP SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO. 69

DIVMTQAAFSNFVTLGTSASISCRSSKSLLHSNGITYFFWYLQKPGLSPQLLIYQMSNL

ASGVPDRFSSSGSGTDFTLRISRVEAEDVGVYYCAQNLELPPTFGGGTKLEIKRTVAAP

SVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDST

YSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 110

Anticorpo quimérico clgG-Pankol SEQ ID NO. 64 SEQ ID NO. 68 clgG-Panko2 SEQ ID NO. 65 SEQ ID NO. 69 clgM-Pankol SEQ ID NO. 66 SEQ ID NO. 68 clgM-Pankol SEQ ID NO. 67 SEQ 10 NO. 69

Protocolo das Sequências

<110> Glycotope GmbH <120> Moléculas de reconhecimento para o tratamento de detecção de tumores <130> GLY12 912PCTEPD1 <140> PCT/DE2004/000132 <141> 2004-01-23 <150> DE 103 03 664.4 <151> 2003-01-23 <160> 69 <170> Patentln Ver. 2.1 111

<210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 1

Asp Ala Trp Mtet Asp 1 ' 5

<210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 2

Asn Tyr trp Met Asn 1 5 <210> 3 112

<211> 19 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 3

Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15

Vai Lys Gly

<210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 4

Glu He Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 15

Vai Lys Gly 113 113 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Sequência artificila <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 5 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado

Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr 1 5

<210> 6 <211> 6 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 6

His Tyr Tyr Phe Asp Tyr i 5 114

<210> 7 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 7

Arg Ser Ser Gin Ser Ile Vai His Ser A$n Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 1 5 . 10 15

<210> 8 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 8

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu H13 Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Ph@ 15 10 15 <210> 9 <211> 7 115 <212> PRT <213> <220> Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 9

Lys Vai Ser Asn Arg Pbe Ser 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> <220> Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 10 Gin 1 Ser Asn Leu Ala Ser 5 <210> 11 <211> 9 116

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 11

Phe Gin Gly Ser His Vai Pro Leu Thr 1 5

<210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 12

Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr 1 5

<210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 117 <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 13

Asn Tyr Trp Vai Asn 1 5

<210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 14

Asn Tyr Trp lie Asn 1 5

<210> 15 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 118 <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 15

Asn Tyr Trp Tyr Asn 1 5

<210> 16 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 16

Asm Tyr Trp Trp Asn 1 5

<210> 17 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado 119 < 4 Ο Ο > 17

Asp Ala Trp Ile Asp 1 5

<210> 18 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 18

Asp Alâ Trp Vai Asp 1 ' 5

<210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado 120 <400> 19

Asp Ala Trp Tyr Asp 1 5 <210> 20 <211> 5 <212> PRT <213> <220> Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 20

Asp Ala Trp Trp Asp 1 5 <210> 21 <211> 19 <212> PRT <213> <220> Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 21 121

Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu Ser 15 10 15

Vai Lys G1y

<210> 22 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 22

Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Lys Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu Ser 1 5 10 IS-

Vai Lys Gly

<210> 23 <211> 19 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado 122 < 4 Ο Ο > 23

Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Ser Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu Ser 15 10 15

Vai Lys Gly

<210> 24 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 24

Arg Pro Ser Gin Ser Ile Vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 15 10 15

<210> 25 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado 123 < 4 Ο Ο > 25 hxg Ser Ser Gin Ser ile Vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Phe Glu 15 10 15

<210> 26 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 26

Arg Pro Ser Gin Ser Ile Vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Phe Glu 1 5 10 15

<210> 27 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 27 124Arg Pro Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe X 5 10 15 <210> 28 <211> 16 <212> PRT <213> <220> Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral MUCl glicosilado <400> 28Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Phe 1 5 10 15 <210> 29 <211> 16 <212> PRT <213> <220> Sequência artificial <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUCl glicosilado <400> 29 125

Arg Pro Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly lie Thr Tyr Leu Phe 15 10 15

<210> 30 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 30

Phe Gin Gly Ser- His Pro Pro Leu Thr 1 5

<210> 31 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 31 126

Ala Gin Asn Leu Glu Pro Pro Pro Thr 1 5

<210> 32 <211> 118 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 32

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 r 25 30 Trp Met Asp Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Gl u 50 55 60 Ser Vai Lys GlY Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Vai Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Thr Leu Thr Vai Ser Ser 115 127

<210> 33 <211> 117 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 33

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20- 25 30 Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Vai Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg H i 3 Tyr Tyr' Phe Asp Tyr Trp Gly Glrt Gly Thr Thr 100 105 110

Leu Thr Vai Ser Ser <210> 34 <211> 114 128

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 34

Asp Gin Ala Ser 20 Ile Ser Cys Arg Asn Gly Asn 35 Thr Tyr Leu Glu Trp 40 Pro Lys 50 Leu Leu Ile Tyr Lys 55 Vai Asp Arg €5 Phe Ser Gly Ser 70 Gly Ser Ser Arg Vai Glu Ala 85 Glu Asp Leu Ser His Vai Pro Leu Thr Phe Gly 100

Ser 25 Ser Gin Ser Ile Vai 30 His Ser Tyr Leu Gin Lys Pro Gly 45 Gin Ser Ser Asn Arg Phe 60 Ser Gly Vai Pro Gly Thr Asp 75 Phe Thr Leu Lys Ile 80 Gly Vai 90 Tyr Tyr Cys Phe Gin 95 Gly Asp Gly 105 Thr Lys Leu Glu 110 Leu Lys

Arg Ala

<210> 35 <211> 114 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 129 <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 35

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Leu Ser 35 40 45 Pro cm Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pr o Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Arg Ala

<210> 36 <211> 275 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado 130 <400> 36 131

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Vai Axg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Val Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Vai Ser Ser Alâ Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ala Arg Asp Ile Vai Leu Thr Gin Thr Pro 130 135 140 Leu Ser Leu Pro Vai Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg 145 150 155 160 Ser Ser Gin Ser Ile Vai Hís Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu G1 u Trp 165 170 175 Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val 180 185 190 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Sex Gly Ser Gly Ser 195 200 205 Gly Thr Asp Phs Thr Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu 210 215 220 Gly Vai , Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser His Val Pro Leu Thr Phe Gly 225 230 235 240 Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala Ala His His His His 245 250 255 His His Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn 260 265 270

Gly Ala Ala 275 132

<210> 37 <211> 266 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 37 133

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phs Thr Ile Ser Arg Asp Vai Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Fhe Asp Tyr Trp Gly Glh Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Vai Ser Ser Ala Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ala Asp 115 120 125 Ile vai Leu Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Vai Ser Leu Gly Asp 130 135 140 Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Ile Vai His Ser Asn 145 150 155 160 Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro 165 170 175 Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro Asp 180 185 190 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser 195 200 205 Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser 210 215 220 His Vai Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg 225 230 235 240 Ala Ala Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu 245 250 255 Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 260 265 134 134 <210> 38 <211> 265 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re iconhece o epitopo tumoral de <400> 38 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 135

Glu Vai Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ma Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Val Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Vâl Ser Ser Ala Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Asp Ile 115 120 125 Vai Leu Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gin 130 135 140 Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin. Ser Ile Val His Ser Asn Gly 145 150 155 160 Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys 165 170 175 Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg 180 185 190 Phe Ser Gly Ser Gly Ser Giy Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg 195 200 205 Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser His 210 215 220 Vai Pro Leu Thr Phg Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala 225 230 235 240 Ala Ais His His His His His His Gly AI a Ala Glu Gin Lys Leu ile 245 250 255 Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 260 265 136 136 <210> 39 <211> 264 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 39 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 137 GLu Vai Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 3Ô Trp Met Asp Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser vsl Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Val Ser Lys Ser Ser 65 70 75 SO Vai Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 T vr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Ser Gly Ser Ser Ala Asp ile Val 115 120 125 Leu Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gin Ala 130 135 140 Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn 145 150 155 160 Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu 165 170 175 Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val 195 200 205 Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser His Val 210 215 220 Pr o Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala ‘225 230 235 240 Ala His His His His His His Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu Ile Ser 245 250 255 Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 260 138 138 <210> 40 <211> 263 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 40 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 139

Glu vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Vai Ser Lys Ser Ser 65 70 ?5 r 80 Vai Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr vai Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser Ala Asp Ile Vai Leu 115 120 125 Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Vai Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser 130 135 140 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Ile val His Ser Asn Gly Asn Thr 145 150 155 160 Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu 165 170 175 Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser 180 185 190

<210> 41 <211> 262 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> 140 <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 41

Gly Ser Gly 195 Ser Gly Thr Asp Phe 200 Thr Leu Lys Ile Ser 205 Arg vai Glu Ala Glu 210 Asp Leu Gly Vai Tyr Tyr 215 Cys Phe Gin Gly 220 Ser His Vai Pro Leu 225 Thr Phe G1 y Asp Gly 230 Thr Lys Leu Glu Leu 235 Lys Arg Ala Ala Ala 240 His His His His His 245 His Gly jAlJ- 3 Ala Glu 250 Gin Lys Leu Ile Ser 255 Glu Glu Asp Leu Asn 260 Gly Ala Ala *

<210> 42 <211> 261 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 42 141

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gi y Gly Leu Vai Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Vai Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Tyr Leu Gin Me £ Asn Asn Leu Arg AI s Glu Asp Thr Gly Ile Tyr S5 90 95 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Vai Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ala Asp Ile Vai Leu Thr 115 120 125 Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Vai Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile 130 135 140 Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Ile Vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr 145 150 155 160 Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu lie 165 170 175 tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly 180 185 190 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala 195 200 205 Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Vai Pro Leu 210 215 220 Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Aia Ala Ala His 225 230 235 240 His His His His His Gly Ala Ala Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu 245 250 255 Asp Leu Asn Gly Ala Ala 260 142 142 <210> 43 <211> 260 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 43 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 143

Giu Vai Lys Leu Vai Giu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 ib 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile ser Arg Asp Vai Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Vai Ser Ser Ala Ser Ala Asp lie vai Leu Thr Gin Thr 115 120 125 Pr o Leu Ser Leu Pro Vai Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys 130 135 140 Arg Ser Ser Gin Ser Ile Vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu 14 5 150 155 160 Trp Tyr Leu Gin Lys Fro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys 155 170 175 Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly 180 185 190 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp 195 200 205 Leu Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser His Vai Pro Leu Thr Phe 210 215 220 Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala Ala His His His 225 230 235 240 His His His Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 245 250 255

Asn Gly Ala Ala 260 144

<210> 44 <211> 259 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 44 145

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 ' ! 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr rie Ser Arg Asp Vai Ser Lys Ser Ser 65 70 75 50 Vai Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 6 5 90 95 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp G1 y Gin Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Vai Ser Ser Ala Ala Asp Ile Vai Leu Thr Gin Thr Pro 115 120 125 Leu Ser Leu Pro Vai' Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg 130 135 140 Ser Ser Gin Ser Ile Vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp 145 150 155 160 Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Vai 165 170 175 Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser ISO 185 190

Giy Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu AI a Glu Asp Leu 195 200 205 Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly Ser His Vai Pro Leu Thr Phe Gly 210 215 220 Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala Ala His His His HiS 225 230 235 240 His His Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn 245 250 255

Gly Ala Ala 146 146 <210> 45 <211> 255 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 45 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 147

GiU 1 val Lys Leu Ser Met Lys Leu 20 Trp Met Asp 35 Trp Ala Glu 50 Ile Arg Ser 65 Val Lys Gly Vai Tyr Leu Gin Tyr Cys Thr Arg '100 Thr Leu Thr 115 Val Ser Leu 130 Pro Val Ser 145 Gin. Ser Ile Leu Gin LyS Pro Asn Arg Phe Ser 180 T’nr Asp Phe 195 Thr Vai Tyr 210 Tyr Cys Gly 225 Thr Lys Leu Bis Gly Ala Ala

Val 5 Glu Ser Gly Ser Cys Ala Ala Val Arg Gin Ser 40 Ser Lys Ala 55 Asn Arg Phe 70 Thr Ile Met 85 Asn Asn Leu Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Ala Asp 120 Ser Leu Gly 135 Asp Vai Bis 150 Ser Asn Gly Gin 165 Ser Pro Gly Val Pro Asp Leu Lys Ile Ser 200 Phe Gin Gly 215 Ser Glu Leu 230 Lys Arg Glu Gin Leu 245

Gly Gly 10 Leu Val Ser 25 Gly Phe Thr Pro Glu Lys Gly Asn His Ala Thr 60 Ser Arg Asp 75 Val Arg Ala 90 Glu Asp Phe 105 Asp Tyr Trp lie Val Leu Thr Gin Ala Ser Ile 140 Gly Asn Thr 155 Tyr Lys Leu 170 Leu Ile Arg 185 Phe Ser Gly Arg Val Glu Ala His Val Pro Leu 220 Ala Ala Ala 235 His Ile Ser 250 Glu Glu

Gin Pro Gly 15 Gly Phe Ser 30 Asp Ala Leu 45 Glu Trp Val Tyr Tyr Ala Glu Ser Lys ser Ser so Thr Gly Ile 95 Tyr Gly Gin 110 ciy Thr Gin 125 Thr Pro Leu Ser Cys Arg Ser Leu Glu Trp Tyr 160 Tyr Lys Val 175 Ser Ser Gly 190 Ser Gly Glu 205 Asp Leu Gly Thr Phe Gly Asp His His His His 240 Val His Gin 255 148 148 <210> 46 <211> 257 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 46 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 149

Glu 1 Val Lys Leu Ser Met Lys Leu 20 Trp Met A$p 35 Trp Ala Glu 50 Ile Arg Ser 65 Val Lys Gly Vai Tyr Leu Gin Tyr Cys Thr Arg 100 Thr Leu Thr 115 Val Leu Pro 130 Val Ser Gin 145- Ser Ile Val Gin Lys Pro Gly Arg Phe Ser Gly 180 Asp Phe Thr 195 Leu Tyr Tyr 210 Cys Phe Thr 225 Lys Leu Glu Gly Aiâ Ala Glu

Val 5 Glu Ser Gly Ser Cys Ala Ala Val Arg Gin Ser 40 Ser Lys Ala 55 Asn Arg Phe 70 Thr Ile Met 85 Asn Asn Leu Gly Gly Tyr Gly Ser Ser Asp Ile 120 Leu Gly Asp 135 Gin His Ser 150 Asn Gly Gin 165 Ser Pro Lys Val Pro Asp Arg Lys Ile Ser Arg 200

Gin Gly Ser His 215 Leu Lys Arg Ala 230 Gin Lys Leu Ile 24 5

Gly Gly 10 Leu Val Ser 25 Gly Phe Thr Pro Glu Lys Gly Asn His Ala Thr 60 Ser Arg Asp 75 Vai Arg Ala 90 Glu Asp Phe 105 Asp Tyr Trp Val Leu Thr Gin Ala Ser lie Ser 140 Asn Thr Tyr 155 Leu Leu Leu 170 Ile Tyr Phe 185 Ser Gly Ser Val Glu Ala Glu Val Pro Leu Thr 220 Ala Ala His 235 HÍS Ser Glu 250 Glu Asp

Gin Pro Gly 15 Gly Phe Ser Asp 3Q Ala Leu 45 Glu Trp Val Tyr Tyr Ala Glu Ser Lys Ser Ser 80 Thr Gly Ile 95 Tyr Gly Gin 110 Gly Thr Thr 125 Pro Leu Ser Cys Arg Ser Ser Glu Trp Tyr Leu 160 Lys Val Ser 175 Asn Gly Ser 190 Gly Thr Asp 205 Leu Gly Val Phe Gly Asp Gly His His His His 240 Leu Asn Gly 255 Ala

Ala 150 150 <210> 47 <211> 256 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 47 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 151

Glu Vai Lys Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys AI a Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Val Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Vai Ser Asp Ile Vai Leu Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu 115 120 125 Pro Vai Ser Leu Gly Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin 130 135 140 Ser Ile Vai His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin 145 150 155 160 Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg 165 170 175 Phe Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 180 185 190 Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr 195 200 205 Tyr Cys Phe Gin Gly Ser Hxs Vai Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr 210 215 220 Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His His Gly 225 230 235 240 AI a Ala Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala AXâ 245 250 255 152 152 <210> 48 <211> 274 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 48 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 153

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Set Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Vai Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Kis Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Vai Ser Ser Ala Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 115 120 125 Gly Ser Gly Gly Ser Ala Arg Asp Ile Vai Met Thr Gin Ala Ala Phe 130 135 140 Ser Asn Pro Vai Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser 145 150 155 160 Ser Lys Ser Leut Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr 165 170 '175 Leu Gin Lys Pro Gly Leu Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Gin Met Ser 180 185 190 Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly 195 200 205 Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly 210 215 220 Vai Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly 225 230 235 240 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His 245 250 255 His Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly 260 265 - 270

Ala Ala 154 <210> 49 <211> 265 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial : molécula de que re iconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 49 reconhecimento 155

Giu Vai Lys Leu Val G1 u Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr I le Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp G1 y Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Lêu Thr Vai Ser Ser Alá Ser Ser Gly Ser Gly Ser Ser Ala Asp Ile 115 120 125 Vai Met Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser 130 135 140 Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly 145 150 3 55 160 Ile Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Leu Ser Pro Gin 165 170 175 Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg 180 185 190

Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg 195 200 205 Val Glu Ala Glu ASp Val Gly Val Tyr Tvr Cys Ala Gin Asn Leu Glu 210 215 220 Leu Pro Pro Thr Phe G.ly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala 225 230 235 240 Ala Ala His His His His His His Giy Ala Ala Glu Gin Lys Leu Ile 245 250 255

Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 260 265 156 156 <210> 50 <211> 264 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 50 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 157 0112 Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Giy Arg Phe Thr Ile Sèr Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Ser Gly Gly Ser Ser Ala Asp Ile Val 115 120 125 Met Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser AI a 130 135 140 Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile 145 150 155 160 Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Leu Ser Pro Gin Leu 165 170 175 Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe 180 185 190 158

Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 Glu Ala Glu Asp vai Gly Vai Tyr. 210 215 I?ro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr 22S 230 Ala Bis His His His His His Gl.y 245 Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 260

Phe Thr Leu Arg lie 205 Ser Arg Vai Tyr Cys Ala Gin 220 Asn Leu Glu Leu Lys Leu Glu 235 Ile Lys Arg Ala Ala 240 Ala Ala 250 Glu Gin Lys Leu Ile 255 Ser

<210> 51 <211> 263 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 51 159

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin. Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg HiS Tyr Tyr. Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Vai Ser Ser Ala Ser Ser Gly Ser Ser Ala Asp Ile Val Met 115 120 125 Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser 130 135 140 Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu Hís Ser Asn Gly Ile Thr 14S 150 155 160 Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Leu Ser Pro Gin Leu Leu 165 170 175 Ile Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 180 185 190 Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu 195 200 205 Ala Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro 210 215 220 Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala 225 230 235 240 HlS HiS Hís HiS His His Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu 245 250 255 Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 260 160 160 <210> 52 <211> 262 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re iconhece o epitopo tumoral de <400> 52 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 161

Glu Vai Lys Leu Vai Gl li Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Vai Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Vál Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ser' Ala Asp Ile Vai Met Thr 115 120 125 Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro Vai Thr Leu Gly rhr Ser Ala Ser ile 130 135 140 Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr 145 150 155 160 Phe Ph.e Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Leu Ser Pro Gin Leu Leu Ile 165 170 175 Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Ser 180 18 5 190 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Vai Glu Ala 195 200 205 G1 u Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Pro 210 215 220 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His 22 5 230 235 240 His His His His His Gly Ala AI â Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu 245 250 255

Asp Leu Asn Gly Ala Ala 260 162 162 <210> 53 <211> 261 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 53 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 163

Glu Vai Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Vai Ser Ser Ala Ser Ser Ser Ala Asp Ile Val Met Thr Gin 115 120 125 Ala Ala Phe Ser Asn. Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ai a Ser He Ser 130 135 140 Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Phe 145 150 155 160 Phe Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Leu Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr 165 170 175 Gin Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser 180 185 190 Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu 195 200 205 Asp Vai Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr 2.10 215 220 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His 225 230 235 '240 HAs HiS His His Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp 245 250 255

Leu Asn Gly Ala Ala 260 164 164 <210> 54 <211> 260 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 54 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 165

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 S 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 4 5 Ala Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala 'Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 7 5 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Vai Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Vai Ser Ser Ala Ser Ser Ala Asp Ile Vai Met Thr Gin Ala 115 .120 125 Ala Phe Ser Asn Prô Vai Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys 130 135 140 Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe 145 150 155 160 Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Leu Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin 165 170 175 Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Asp- Arg Phe Ser Ser Ser Gly 180 185 190 Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp 195 • 200 205 Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe 210 215 220 Gly Gly Gly Thx Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His 225 230 235 240 HÍS His His Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 245 250 255

Asn Gly Ala Ala 260 <210> 55 <211> 259 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 55 16 6 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 167

Giu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Het Lys Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met. Asn Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Giu Xle Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr Sis Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp ASp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Vai Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 35 Tyr Cys Thr Arg HÍS Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Vai Ser Ser Ala Ser Ala Asp Ile Vai Met Thr Gin Ala Ala 115 120 > 125 Phe Ser Asn Pro Vai Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg 130 135 140 Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe Trp 145 150 155 160 Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Leu Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met 165 170 175 Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser 180 185 190

Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai 195 200 205 Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly 210 215 220 Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His 225 230 235 240 His His Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu lie Ser Glu Glu Asp Leu Asn 24 5 250 255

Gly Ala Ala 168 168 <210> 56 <211> 258 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 56 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 169

Glu Vai Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 - 10 15 Ser Het Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp( Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Val Ser Ser Ala Ala Asp Ile Val Met Thr Gin Ala Ala Phe 115 120 125 Ser Asn Pro Val Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser 130 135 14 0 Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr 14 5 150 155 160 Leu Gin Lys Pro Gly Leu Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser 165 170 175 Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly 180 185 190 Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly 195 200 205 Vai Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly 210 215 220 Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His 225 230 235 24 0 His Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly 245 250 255

Ala Ala 170 <210> 57

<211> 257 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 57 171

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Phe Thr Phe- Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Vai Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Vai Ser Ser Ala Asp Ile Vai Met Thr Gin Ala Ala Phe Ser 115 120 125 Asn Pro Vai Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser 130 135 140 Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly ile Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu 145 150 155 160 Gin Ly$ Pro Gly Leu Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn 165 170 175 Leu Ala Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr 180 185 190 Asp Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly 195 200 205 Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly 210 215 220 Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Ala His His His His HiS His 225 230 235 240 Gly Ala Ala Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala 245 250 255

Ala 172 172 <210> 58 <211> 256 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 58 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 173

Glu Vai Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys- Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu lie Arg Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Vai Ser Ser Asp Ile Val Met Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn 115 120 125 Pr o Vai Thr Leu Gjl y Thr Ser Ala Ser lie Ser Cys Arg Ser Ser Lys 130 135 140 Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gin 145 150 155 160 Lys Pro Gly Leu Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn Leu 165 170 175 Ala Ser Gly Vai Pro Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp 180 185 190 Phe Thr Leu Arg Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr 195 200 205 Tyr Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr 210 215 220 Lys Leu Glu I le Lys Arg Ala Ala Ala His His His His His His Gly 225 230 235 240 Ala Ala Glu G1 r Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 245 250 255 174 174 <210> 59 <211> 255 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 59 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 175 GIu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu' Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 4 0 45 Ma Glu Ile Arg Leu Lya Ser Asn Asn Tyr Thr Thr Bis Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Vai Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Vai Ser Asp Ile Vai Met Thr Glh Ala Ala Phe Ser Asn Pro 115 120 125 Vai Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser $er Lys Ser 130 135 140 Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gin Lys 145 150 155 160 Pro Gly Leu Ser Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn Leu Ala 165 170 175 Ser Gly Vai Pro Âsp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe 180 185 190

Thr Leu Arg Ile Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai Gly Val Tyr Tyr 195 200 205 Cys Ala Gin Asn Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Giy Gly Thr Lys 210 215 220 Leu Glu Ile Lys Arg Al a Ala Al a His His His His His His Gly Ala 225 230 235 240 Ala Glu Gin Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Asn Gly Ala Ala 245 250 255 176 176 <210> 60 <211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 60 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 177

Asp Ile Vai Lea Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Vai Ser Leu Gly 1 5 10 15 Asp Gin Ala Ser rie Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Ile Vai His Ser 20 25 30 Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95 Ser His Vai Pro Leu Thr Phe Gly Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Vai Ser I le Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gin Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser vai Vai Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyx Pro LyS Asp ile Asn Vai Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gin Asn çiy Vai Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser fcíet Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205

Pro Ile Vai Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215 <210> 61 <211> 219 178

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 61 179

Asp Ile Vai Met Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro Vai Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser 20 25 30 As η Gly Ile Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Leu Ser 35 40 45 Pro Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Met Ser Asn. Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu AI a Glu Asp Vai Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala Gin Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Vai Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu 115 120 125 Gin Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Vai Vai Cys Phe Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Lys Asp Ele Asn Vai Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg 145 150 155 160 Gin Asn Gly Vai Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Sar Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu 180 185 190 Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser 195 200 205 Pro Ile Vai Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys 210 215

<210> 62 <211> 441 <212> PRT 180 <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 62 181

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly 1 5

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala 20

Trp Met Asp Trp Vai Arg Gin Ser 35 <30

Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn 50 S5

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile 65 * 70

Vai Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu 85

Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly 100

Thr Leu Thr Vai Ser Ala Lys Thr 115 1.20

Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gin Thr 130 135

Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu 145 150

Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His 165

Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser 1.80

Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn 195 200

Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro 210 215 lie Cys Thr Val Pro Glu Val Ser 225 230

Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr 245

Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp 260

Val Asp Asp Val Glu Val His Thr 275 280

Gin Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser 290 295

Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 10 15

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 25 30

Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 45

Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 60

Ser Arg Asp Val Ser Lys Ser Ser 75 80

Arg Ala Glu Asp Thr Gly lie Tyr 90 95

Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 105 110

Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu 125

Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys 140

Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser 155 160

Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser 170 175

Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg 185 190

Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr 205

Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys 220

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys 235 240

Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val 250 255

Pro Glu Val Gin Phe Ser Trp Phe 265 270

Ala Gin Thr Gin Pro Arg Glu Glu 285

Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His 300 182

182 Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe 305 310 Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325 Pro Lys Ala Pro Gin Vai Tyr Thr Ile 340 345 Ala Lys Asp LyS Vai Ser Leu Thr Cys 355 360 G1 u Asp Ile Thr Vai Glu Trp Gin Trp 370 375 Tyr Lys Asn Thr Gin Pro Ile Met Asn 385 390 Tyr Ser Ly$ Leu Asn Vai Gin Lys Ser 405 Phe Thr Cys Ser Vai Leu His Glu Gly 4 20 425 Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 4 35 440 <210> 63 <211> 440 <212> PRT

Lys Cys Arg Vai Asn Ser Ala 315 320 Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg 330 335 Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met 350 Het Ile Thr Asp Phe Phe Pro 365 Asn Gly Gin Pro Ala Glu Asn 380 Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val 395 400 Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr 410 415 Leu His Asn His His Thr Glu 430 <213> Sequência artificial <220> ial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado <223> Descrição da sequência artifi que reconhece o epitopo tumoral de <400> 63 183

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Vai Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 4 5 Ma Glu He Arg Leu Lys Ser Àsn Asn Tyr Thr Thr HiS Tyr Ala Glu 50 55 50 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Vai Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 35 90 95 Tyr Cys Thr Arg Mis Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Vai Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Vai Tyr Pro Leu Ala 115 120 125 184

Pro Gly Ser Ala Ala Gin Thr Asn 130 135

Vai Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro 145 150

Ser Leu Ser Ser Gly Vai His Thr 165

Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Vai 180

Ser Glu Thr Vai Thr Cys Asn Vai 195 200

Vai Asp Lys Lys Ile Vai Pro Arg 210 215

Cys Thr Vai Pro Glu Vai Ser Ser 225 230

Lys Asp Vai Leu Thr Ile Thr Leu 245

Vai Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro 260

Asp Asp Vai Glu Vai His Thr Ala 275 . 280

Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Vai 290 295

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe 305 310

Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr 325

Lys Ala Pro Gin Vai Tyr Thr Ile 340

Lys Asp Lys Vai Ser Leu Thr Cys 355 360

Asp Ile Thr Vai Glu Trp Gin Trp 370 375

Lys Asn Thr Gin Pro Ile Met Asn 385 390

Ser Lys Leu Asn Vai Gin Lys Ser 405

Ihr Cys Ser Vai Leu His Glu Gly 420

Ser Met Vai Thr Leu Gly Cys : 140

Vai Thr Vai Thr Trp Asn Ser ( 155

Phe Pro Ala Vai Leu Glu Ser i 170 175

Thr Vai Pro Ser Ser Pro Arg 1 185 190

Ala His Pro Ala Ser Ser Thr 1 205

Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys 220

Vai Phe Ile Phe Pro Pro Lys 1 235 ;

Thr Pro Lys Vai Thr Cys Vai \ 250 255

Glu Vai Gin Phe*Ser Trp Phe ϊ 265 270

Gin Thr Gin Pro Arg Glu Glu i 285

Ser Glu Leu Pro Ile Met His t 300

Lys Cys Arg Vai Asn Ser Ala l 315 :

Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg I 330 335

Pro Pro Pro Lys Glu Gin Met ΐ 345 350

Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro C '365

Asn Gly Gin Pro Ala Glu Asn 1 380

Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Vai 1 395 4

Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr £ 410. 415

Leu His Asn His His Thr Glu I 425 430

Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys 435 440 185 185 <210> 64 <211> 447 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 64 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 186

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly 1 5

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala 20

Trp Met Asp Trp Vai Arg Gin Ser 35 40

Ala Glu lie Arg Ser Lys Ala Asn 50 55

Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ile 65 70

Vai Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu 85

Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly 100

Thr Leu Thr Vai Ser Gly Ser Thr 115 120

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser 130 135

Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His 165

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser 180

Leu Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys 1SS 200

Thr Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu 210 215

Thr Cvs Pro Pro Cys Pro Ala Pro 225 230

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 245

Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai 260

Vai Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp 275 280

Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 10 15

Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 25 30

Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp vai 45

Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 60

Ser Arg Asp Vai Ser Lys Ser Ser 75 80

Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 90 95

Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 105 110

Lys Gly Pro Ser Vai Phe Pro Leu 125

Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys 140

Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser 155 160

Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gin Ser 170 175

Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser 185 190

Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn 205

Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His 220

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai 235 240

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr 250 255

Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu 265 270

Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys 285 187

<210> 65 <211> 446 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <400> 65

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu lie Ar g Leu Lys Ser Asn Asn Tyr Thr Thr Hís Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg Phe Thr Ila Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 lio 188

Leu Thr VaX Ser Gly Ser Thr Lys Gly Fro Ser Vai Phe Pro Leu Ala 115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu 130 135 140

Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly 145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Vai His Thr Phe Pro Âla Vai Leu Gin Ser Ser 165 Π0 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Ser Leu 180 185 190

Gly Thr Gin Thr Tyr Ile Cys Asn Vai Asn His Lys Pro Ser Asn Thr 195 200 205

Lys Vai Asp Lys Lys Vai Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Vai Phe 225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro 245 250 255

Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His Glu Asp Pro Glu Vai 260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai His Asn Ala Lys Thr 275 * 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Vai Vai Ser Vai 290 ' 295 300

Leu Thr Vai Leu His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys 305 310 315 320

Lys Vai Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr lie Ser 325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gin Pro Arg Glu Pro Gin Vai Tyr Thr Leu Pro Pro 340 345 350

Ser Arg Asp Glu Lsu Thr Lys Asn Gin Vai Ser Leu Thr Cys Leu Vai 355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly 370 375 380

Gin Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Vai Leu Asp Ser Asp 385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser Arg Trp 405 410 415

Gin Gin Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met His Glu Ala Leu His 420 425 430

Asn His Tyr Thr Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 435 440 445 189 189 <210> 66 <211> 570 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 66 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 190

Glu Vai Lys Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Vai Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Ala 20 25 30 Trp Met Asp Trp Vai Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Vai 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Ser Lys Ala Asn Asn His Ala Thr Tyr Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Vai Lys Gly Arg phe Thr Ile Ser Arg Asp Vai Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Tyr Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Ala Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg Gly Gly Tyr Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110 Thr Leu Thr Vai Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu 115 120 125 Vai Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Vai Ala Vai Gly 130 135 140 Cys Leu Ala Gin Asp Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Lys 145 150 155 160 Tyr Lys Asn Asn Ser Asp Ile Ser Ser Thr Arg Gly Phe Pro Ser Vai 165 170 175 Leu Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser Gin Vai Leu Leu Pro Ser 180 185 190 Lys Asp Vai Met Gin Gly Thr Asp Glu His Vai Vai Cys Lys Vai Gin 195 200 205 His Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys Asn Vai Pro Leu Pro Vai Ile Ala 210 215 220 Glu Leu Pro Pro Lys Vai Ser Vai Phe Vai Pro Pro Arg Asp Gly Phe 225 230 235 240 Phe Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Gin Ala Thr Gly Phe 245 250 255 Ser Pro Arg Gin Ile Gin Vai Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gin Vai 260 265 270 191

Gly Ser Gly Vai Thr Thr Asp Gin 275 280

Gly Pro Thr Thr Tyr Lys Vai Thr 290 295

Asp Trp Leu Gly Gin Ser Met Phe 305 310

Leu Thr Phe Gin Gin Asn Ala Ser 325

Thr Ala lie Arg Vai Phe Ala Ile 340

Leu Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr 355 360

Tyr Asp Ser Vai Thr Ile Ser Trp 370 375

Lys Thr His Thr Asn Ile Ser Glu 385 390

Ala Vai Gly Glu Ala Ser Ile Cys 405

Arg Phe Thr Cys Thr Vai Thr His 420

Gin Thr Ile Ser Arg Pro Lys Gly 435 440

Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu 450 455

Thr Ile Thr Cys Leu Vai Thr Gly 465 470

Gin Trp Met Gin Arg Gly Gin Pro 485

Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gin

SOO

Ser Ile Leu Thr Vai Ser Glu Glu 515 520

Thr Cys Vai Vai Ala His Glu Ala 530 535

Thr Vai Asp Lys Ser Thr Gly Lys 545 550

Vai Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr 565

Vai Gin Ala Glu Ala Lys Glu Ser 285

Ser Thr Leu Thr lie Lys Glu Ser 300

Thr Cys Arg Vai Asp His Arg Gly 315 320

Ser Met Cys Vai Pro Asp Gin Asp 330 335

Pro Pro Ser Phe Ala Ser Ile Phe 345 350

Cys Leu Vai Thr Asp Leu Thr Thr 365

Thr Arq Gin Asn Gly Glu Ala Vai 380

Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser 395 400

Glu Asp Asp Trp Asn Ser Gly Glu 410 415

Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys 425 430

Vai Ala Leu His Arg Pro Asp Vai 445

Gin Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala 4 60

Phe Ser Pro Ala Asp Vai Phe Vai 475 480

Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Vai Thr 4 90 4 95

Ala Pro Gly Arg Tyr Phe Ala His 505 510

Glu Trp Asn Thr Gly Glu Thr Tyr 525

Leu Pro Asn Arg Vai Thr Glu Arg 540

Pro Thr Leu Tyr Asn Vai Ser Leu 555 560

Cys Tyr 570 192 192 <210> 67 <211> 569 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 67 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 193

Glu Val Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser As n Asn Tyr Thr Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ser 65 70 75 80 Vai Ser Leu Gin Met Asn Asn Leu Arg Val Glu Asp Thr Gly Ile Tyr 85 90 95 Tyr Cys Thr Arg His Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 100 105 110 Leu Thr Va.l Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr Leu Phe Pro Leu Val 115 120 125 Ser Cys Glu Asn Ser Pro Ser Asp Thr Ser Ser Val Ala Val Gly Cys 130 135 140 Leu Ala Gin Asp Phe Leu Pro Asp Ser Ile Thr Leu Ser Trp Lys Tyr 145 150 155 160 Lys Asn Asn Ser Asd Ils Ser Se.r Thr Arg Gly Phe Pro Ser Vsl Leu 165 170 175 Arg Gly Gly Lys Tyr Ala Ala Thr Ser Gin Val Leu Leu Pro Ser Lys 180 185 190 Aâp vai Met Gin Gly The Asp Glu HiS Val Val Cys Lys Val Gin His 195 200 205 Pro Asn Gly Asn Lys Glu Lys Asn Val Pro Leu Pro Val Ile Ala Glu 210 215 220 Leu Pro Pro Lys val Ser Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Phe 225 230 235 240 Gly Asn Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ilô Cys Gin Ala Thr Gly Phe Ser 245 250 255 Pro Arg Gin Ile Gin Val Ser Trp Leu Arg Glu Gly Lys Gin Val Gly 260 265 270 Ser Gly Val Thr Thr Asp Gin Val Gin Ala Glu Ala Lys Glu Ser- Gly 275 280 285 Pro Thr Thr Tyr Lys Vai Thr Ser Thr Leu Thr Ile Lys Glu Se r Asp 290 295 300 194

Trp Leu Giy Gin Sar Met Phe Thr Cys Arg Vai Asp His Arg Giy Leu 305 310 315 320 Thr Phe G1 π Gin Asn Ais Ser Ser Met Cys Vai Pro Asp Gin Asp Thr 325 330 335 Ala Ile Arg Vai Phe Ala Ile Pro Pro Ser Phs Ala Ser Ile Phe Leu 34 0 345 350 Thr Lys Ser Thr Lys Leu Thr Cys Leu Vai Thr Asp Leu Thr Thr Tyr 355 360 365 Asp Ser Vai Thr Ile Ser Trp Thr Arg Gin Asn Giy Glu Ala Vai Lys 370 375 380 Thr His Thr Asn Ile Ser Glu Ser His Pro Asn Ala Thr Phe Ser Ala 365 390 395 400 Vai Giy Glu Ala Ser Ile Cys Glu Asp Asp Trp Asn Ser Giy Glu Arg 405 410 415 Phe Thr Cys Thr Vai Thr HÍS Thr Asp Leu Pro Ser Pro Leu Lys Gin 420 425 430 Thr Ile Ser Arg Pro Lys Giy Vai Ala Leu His Arg Pro Asp Vai Tyr 435 440 445 Leu. Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gin Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr 450 455 460 Ile Thr Cys Leu Vai Thr Giy Phe Ser Pro Ala Asp Vai Phe Vai Gin 465 470 475 480 Trp Met Gin Arg Giy Gin Pro Leu Ser Pro Glu Lys Tyr Vai Thr Ser 485 4 90 495 Ala Pro Met Pro Glu Pro Gin Ala Pro Giy Arg Tyr Phe Ala His Ser 500 505 510 Ile Leu Thr Vai Ser Glu Glu Glu Trp Asn Thr Giy Glu Thr Tyr Thr 515 520 525 Cys Vai Vai Ala His Glu Ala Leu Pro Asn Arg Vai Thr Glu Arg Thr 530 535 540 Vai Asp Lys Ser Thr Giy Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Vai Ser Leu Vai 545 550 555 560 Met Ser Asp Thr Ala Giy Thr Cys Tyr δ65 195 195 <210> 68 <211> 219 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artif que re :conhece o epitopo tumoral de <400> 68 icial: molécula de reconhecimento MUC1 glicosilado 196

Asp Ile Vai Leu Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Vai Ser Leu Gly 15 10 15

Asp Gin Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gin Ser Ile Vai His Ser 20 25 30

Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Vai Ser Asn Arg Phe Ser Gly Vai Pro 50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80

Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Leu Gly Vai Tyr Tyr Cys Phe Gin Gly 85 90 95

Ser His Vai Pro Leu Thr Phe Giy Asp Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 1Ô0 105 ' 110

Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125

Gin Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190

Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 69 <211> 219 197

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição da sequência artificial: molécula de reconhecimento que reconhece o epitopo tumoral de MUC1 glicosilado <4 0 0> 6 9 198

Asp ile Vai Met Thr Gin Ala Ala Phe Ser Asn Pro Vai Thr Leu Gly 1 5 10 15 Thr Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu HiS Ser 20 25 30 Asn Gly Ile Thr Tyr Phe Phe Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Leu Ser 35 40 45 Pr o Gin Leu Leu Ile Tyr Gin Het Ser Asn Leu Ala Ser Gly Vai Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Ser Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Arg Ile 65 70 75 80 Ser Arg Vai Glu Ala Glu Asp Vai* Gly Vai Tyr Tyr Cys Ala Gin ! Asn 85 90 95 Leu Glu Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly G1 y Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 Arg Thr Vai Ala Ala Pro Ser Vai Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu 115 120 125 Gin Leu Lys Ser Gly Thr AI a Ser Vai Vai Cys Leu Leu Asn Asn Phe 130 135 140 Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Vai Gin Trp Lys Vai Asp Asn Ala Leu Gin 145 150 155 160 Ser Gly Asn Ser Gin Glu Ser Vai Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser 165 170 175 Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 180 185 190 Lys His Lys Vai Tyr Ala Cys Glu Vai Thr His Gin çiy Leu Ser Ser 195 200 205 Pro Vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

Lisboa, 18 de Setembro de 2013.

Claims

1 Reivindicações 1. Molécula de reconhecimento, caracterizada por compreender as sequências de aminoácidos seguintes (i) sequência de aminoácidos possuindo uma homologia de pelo menos 60%, preferencialmente 70%, mais preferencialmente 80%, ainda mais preferencialmente 90% em relação à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 1 ou 2; e (ii) sequência de aminoácidos possuindo uma homologia de pelo menos 60%, preferencialmente 70%, mais preferencialmente 80%, ainda mais preferencialmente 90% em relação à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 3 ou 4, e (iii) sequência de aminoácidos possuindo uma homologia de pelo menos 60%, preferencialmente 70%, mais preferencialmente 80%, ainda mais preferencialmente de 90% em relação à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 5 ou 6; e que se liga especificamente ao epitopo tumoral MUC1 glicosilado de tal forma que a força da ligação é aumentada pelo menos por um factor de 2 0 em comparação com a ligação ao péptido não glicosilado com o mesmo comprimento e sequência péptidica.

2. Molécula de reconhecimento de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender ainda as sequências de aminoácidos seguintes: (i) sequência de aminoácidos possuindo uma homologia de pelo menos 60%, preferencialmente 70%, mais preferencialmente 80%, 2 ainda mais preferencialmente 90% em relação à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 7 ou 8; e (ii) sequência de aminoácidos possuindo uma homologia de pelo menos 60%, preferencialmente 70%, mais preferencialmente 80%, ainda mais preferencialmente 90% em relação à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 9 ou 10, e (iii) sequência de aminoácidos possuindo uma homologia de pelo menos 60%, preferencialmente 70%, mais preferencialmente 80%, ainda mais preferencialmente 90% em relação à sequência de aminoácidos SEQ ID NO: 11 ou 12; e que se liga especificamente ao epitopo tumoral MUC1 glicosilado de tal forma que a força da ligação é aumentada pelo menos por um factor de 2 0 em comparação com a ligação ao péptido não glicosilado com o mesmo comprimento e sequência péptidica.

3. Molécula de reconhecimento de acordo com a reivindicação 1, ou 2, caracterizada por pelo menos um aminoácido de pelo menos uma sequência de acordo com a SEQ ID N° la 12 ser substituído por um aminoácido com propriedades físico-químicas semelhantes e por a molécula de reconhecimento se ligar especificamente ao epitopo tumoral de MUC1 glicosilado de forma que a intensidade de ligação em relação ao péptido não glicosilado com o mesmo comprimento e sequência péptidica é aumentada de pelo menos um factor de 20. 3

4. Molécula de reconhecimento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada por a sequência SEQ ID NO: 1, ou 2 estar substituída com uma variante estrutural canónica equivalente das SEQ ID NOs: 13 a 20 e/ou pelo menos uma sequência das sequências SEQ ID NO: 3 ou 4 estar substituída com uma variante estrutural canónica equivalente da SEQ ID NOs: 21 a 2 3 e/ou pelo menos uma sequencia da SEQ ID NO: 7 ou 8 estar substituída com uma variante estrutural canónica equivalente da SEQ ID N° 24 a 29 e/ou pelo menos uma sequência das SEQ ID NO: 11 ou 12 estar substituída com uma variante estrutural canónica equivalente da SEQ ID NO: 30 ou 31, e por a molécula de reconhecimento se ligar especificamente ao epitopo tumoral glicosilado MUC1 de tal forma que a força da ligação se encontra aumentada de pelo menos um factor de 20 em comparação com a ligação do péptido não glicosilado com o mesmo comprimento e sequência peptídica.

5. Molécula de reconhecimento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por a cadeia variável pesada VH e a cadeia variável leve VL encontrarem-se em diferentes cadeias polipéptidicas.

6. Molécula de reconhecimento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada por a cadeia variável pesada VH e a cadeia variável leve VL encontrarem-se directamente ligadas numa proteína de fusão.

7. Molécula de reconhecimento de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, caracterizada por compreender uma imunoglobulina dos isotipos IgG, IgM, IgA, IgE, IgD e/ou as suas subclasses. 4

8. Molécula de reconhecimento que se encontra fundida, acoplada quimicamente, associada covalentemente, ou não covalentemente com um ou vários anticorpos ou fragmentos de anticorpo possuindo uma especificidade diferente, um fragmento de anticorpo de cadeia simples, multicorpos, fragmento Fab, proteína de fusão de um fragmento de anticorpo com péptidos ou proteínas derivadas de uma molécula de reconhecimento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizada por a molécula de reconhecimento se ligar especificamente ao epitopo tumoral MUC1 glicosilado de tal forma que a força da ligação se encontra aumentada de pelo menos um factor de 20 em comparação com a ligação do péptido não glicosilado com o mesmo comprimento e sequência peptídica.

9. Construção compreendendo moléculas de reconhecimento de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada por as moléculas de reconhecimento se encontrarem fundidas, acopladas quimicamente, ou associadas não covalentemente com sequências adicionais e/ou estruturas.

10. Construção de acordo com a reivindicação 9, caracterizada por as moléculas de reconhecimento se encontrarem fundidas, acopladas quimicamente, ou associadas covalentemente, ou não covalentemente com (i) domínios de imunoglobulina de diferentes espécies, (ii) moléculas de enzima, (iii) domínios de interacção, (iv) domínios para estabilização, (v) sequências de sinal, (vi) corantes fluorescentes, 5 (vii) toxinas, (viii) anticorpos catalíticos, (ix) componentes citolíticos, (x) imunomoduladores (xi) imunoefectores, (xii) antigénios de CMH de classe I ou de classe II, (xiii) , de quelantes para marcação radioactiva, (xiv) radioisótopos, (xv) lipossomas, (xvi) domínios transmembranares, (xvii) vírus e/ou (xviii) células.

11. Molé cuia de ácido nucleico que compreende sequências de ácido nucleico as quais codificam para a sequência de aminoácidos de, pelo menos, uma molécula de reconhecimento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou uma construção de acordo com a reivindicação 9, ou 10.

12. Molé cuia de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11, em que um primeiro vector codifica para a cadeia pesada e um segundo vector codifica para a cadeia leve de uma molécula de reconhecimento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, ou para uma construção de acordo com a reivindicação 9, ou 10.

13. Cassete de expressão ou vector que compreende uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11 ou 12, e um promotor que se encontra operacionalmente ligado ao ácido nucleico.

14. Célula hospedeira compreendendo pelo menos um vector ou cassette de expressão de acordo com a reivindicação 13. 6

15. Composição que compreende (i) pelo menos uma molécula de reconhecimento, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8; (ii) pelo menos uma construção de acordo com a reivindicação 9 ou 10, e/ou (iii) pelo menos uma molécula de ácido nucleico de acordo com a reivindicação 11 ou 12.

16. Composição de acordo com a reivindicação 15, caracterizada por a composição ser uma composição farmacêutica, opcionalmente com um veiculo e/ou um adjuvante farmaceuticamente aceitável. Lisboa, 18 de Setembro de 2013.