KR102463078B1 - Muc-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

항-MUC1 항체, 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체, 및 이를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

Description

MUC-1에 특이적으로 결합하는 항체 및 이의 용도{Antibody specifically binding to MUC-1 and uses thereof}
항-MUC1 항체, 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체, 및 이를 포함하는 암의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물이 제공된다.
MUC1 (mucin-1)은 뮤신 (mucin) 당단백질의 일종이며, 다수의 당화된 세포외 도메인을 포함하는 막관통 당단백질이다. MUC1 길이는 세포 표면에서 200 내지 500 nm이고 MUC1은 정상 상피 세포의 정단막에 위치한다. MUC1은 유방, 위, 식도, 췌장, 요도, 폐, 신장 및 담낭과 같은 많은 장기의 선상 또는 내강 상피 세포에서 발현된다. 뮤신은 췌장, 폐, 유방, 난소 등의 암을 포함하여, 많은 암종에서 과발현된다. 뮤신과 암의 병적 연관성에 대하여 많은 연구가 진행되어 왔으며, 특히 MUC1에 대한 몇몇 항체가 당분야에 공지되어 있다.
그러나, 그들의 치료적 효능은 여전히 개선시킬 수 있으며, 이에 본 출원은 개선된 특징을 갖는 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
일 양상은 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
다른 양상은 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과, 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체를 제공한다.
또 다른 양상은 (i) 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 (ii) 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또 다른 양상은 (i) 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 (ii)상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체를 암의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다.
또 다른 양상은 (i) 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 (ii) 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체의 암의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 용도 또는 항암제 제조에 사용하기 위한 용도를 제공한다.
또 다른 양상은 (i) 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 (ii) 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터 및/또는 상기 재조합 벡터를 포함하는 재조합 세포를 제공한다.
또 다른 양상은 상기 (i) 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 (ii) 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계를 포함하는, (i) 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 (ii) 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체의 제조방법을 제공한다.
용어의 정의
원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체 (chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입 (anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입 (anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR (complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격 (framework)에 이식하여 제작된다.
일 구체예에서, 상기 항-MUC1 항체는 동물 유래 항체 (예컨대, 마우스 유래 항체), 키메릭 항체 (예컨대, 마우스-인간 키메릭 항체), 또는 인간화 항체일 수 있다. 상기 항체 또는 항원결합단편은 생체로부터 분리된 것 또는 비자연적으로 생산(non-naturally occurring)된 것일 수 있다. 상기 항체 또는 항원결합단편은 재조합적 또는 합성적으로 생산된 것일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 생체에서 분리된 것 또는 비자연적으로 생성된(non-naturally occurring) 것일 수 있다. 상기 항체 또는 항원 결합 단편은 합성적 또는 재조합적으로 생성된 것일 수 있다.
다른 예에서, 상기 항체는 인간을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함한 임의의 동물로부터 유래(분리)한 것일 수 있다. 예컨대, 상기 항체는 인간, 생쥐, 당나귀, 양, 토끼, 염소, 기니피그, 낙타, 말, 또는 닭의 항체일 수 있다. 여기서 인간 항체는 인간 면역글로불린의 아미노산 서열을 가진 항체로서, 인간 면역글로불린 라이브러리로부터 분리된 항체 또는 하나 이상의 인간 면역글로불린에 대하여 형질 이식되고 내재적 면역글로불린은 발현하지 않는 동물로부터 분리된 항체를 포함한다.
항-MUC1 항체는 단클론 항체 또는 다클론 항체일 수 있으며, 예컨대, 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다. 또는, 항-MUC1　항체는 마우스 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다.
상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 앞서 정의한 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 부위, 또는 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역을 제외한 나머지 부위는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)으로부터 유래한 것일 수 있고, 예컨대, 상기 모든 서브타입의 면역글로불린의 프레임워크 부위, 및/또는 경쇄 불변 영역 및/또는 중쇄 불변 영역으로부터 유래한 것일 수 있다.
완전한 항체 (예컨대, IgG 타입)는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
용어 "힌지 영역(hinge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.
동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
상기 "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)2, scFvFc, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 본 발명에서의 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.
Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다.
Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, 단쇄 Fv(single-chain Fv; scFv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 앞서 설명한 바와 같을 수 있으며, 예컨대, 1 내지 100개 아미노산 길이, 예컨대 2 내지 50개 아미노산 길이 또는 5 내지 25개 아미노산 길이의 것일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다.
상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
항원 결합 단편, 예컨대 scFV에 있어서, 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역은 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n (n은 (G4S)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.
용어 "길항제(antagonist)"는 표적물 (예를 들어, MUC1)의 생물학적 활성 중 하나 이상을 부분적으로나 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 포함하는 개념으로 해석된다. 예를 들어, "길항제" 항체는 항체가 결합하는 항원 (예를 들어, MUC1)의 생물학적 활성을 억제시키거나 감소시키는 항체를 의미한다. 길항제는 리간드(표적)에 대한 수용체에 결합하여, 수용체 인산화(phosphorylation)를 감소시키거나, 리간드에 의해 활성화되었던 세포를 무능력화시키거나, 또는 사멸시키는 작용을 할 수 있다. 또한, 길항제는 수용체-리간드 사이의 상호 작용을 완전히 단절시키거나, 리간드와 경쟁적으로 수용체에 결합하거나, 수용체의 3차 구조의 변화 또는 하향 조절(down regulation)에 의해 상기 수용체-리간드 간 상호 작용을 실질적으로 감소시킬 수 있다.
항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편
본 발명의 일 예는 MUC1 (Mucin-1)을 특이적으로 인식하거나 및/또는 특이적으로 결합 가능한 폴리펩타이드를 제공한다.
상기 MUC1은 인간 MUC1, 원숭이, 개, 래트, 또는 마우스 등의 MUC1일 수 있다. 일 예에서, 상기 인간 MUC1은 MUC1 isoform M2 (identifier: A6ZID5; NCBI reference number: ABS01294.1), MUC1 isoform 1 (identifier:　P15941-1), MUC1 isoform 2 (identifier:　P15941-2), MUC1 isoform 3 (identifier:　P15941-3), MUC1 isoform 4 (identifier:　P15941-4), MUC1 isoform 5 (identifier:　P15941-5), MUC1 isoform 6 (identifier:　P15941-6), MUC1 isoform Y (identifier:　P15941-7), MUC1 isoform 8 (identifier:　P15941-8), MUC1 isoform 9 (identifier:　P15941-9), MUC1 isoform F (identifier:　P15941-10), MUC1 isoform Y-LSP (identifier:　P15941-11), MUC1 isoform S2 (identifier:　P15941-12), MUC1 isoform M6 (identifier:　P15941-13), MUC1 isoform ZD (identifier:　P15941-14), MUC1 isoform T10 (identifier:　P15941-15), MUC1 isoform E2 (identifier:　P15941-16), 또는 MUC1 isoform J13 (identifier:　P15941-17) 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 인간 MUC1은 NCBI Reference Sequence: NP_001018016.1, NP_001018017.1, NP_001037855.1, NP_001037856.1, NP_001037857.1, NP_001037858.1, NP_001191214.1, NP_001191215.1, NP_001191216.1, NP_001191217.1, NP_001191218.1, NP_001191219.1, NP_001191220.1, NP_001191221.1, NP_001191222.1, NP_001191223.1, NP_001191224.1, NP_001191225.1, NP_001191226.1, NP_002447.4 등에서 제공되는 아미노산 서열을 가질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 각각의 아미노산 서열은 NCBI Reference Sequence: NM_001018016.2, NM_001018017.2, NM_001044390.2, NM_001044391.2, NM_001044392.2, NM_001044393.2, NM_001204285.1, NM_001204286.1, NM_001204287.1, NM_001204288.1, NM_001204289.1, NM_001204290.1, NM_001204291.1, NM_001204292.1, NM_001204293.1, NM_001204294.1, NM_001204295.1, NM_001204296.1, NM_001204297.1, NM_002456.5 등에서 제공되는 뉴클레오타이드 서열 (mRNA)에 의하여 암호화되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 단백질, 폴리펩타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드가 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열을 갖는다 함은 단백질, 폴리펩타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드가 상기 서열을 포함하거나, 상기 서열을 필수적으로 포함하여 이루어지거나, 상기 서열로 이루어진 것을 모두 의미하기 위하여 사용될 수 있다.
이들 폴리펩타이드는 항-MUC1 항체의 상보성결정부위(complementarity determining region, CDR)로서 사용 가능하다. 이 때, 상기 상보성결정부위는 통상적인 모든 방법에 의하여 결정될 수 있으며, 예컨대, IMGT definition(http://www.imgt.org/IMGT_vquest/share/textes/) 또는 Kabat definition(http://www.bioinf.org.uk/abs/)에 의하여 결정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 예에서, 상기 폴리펩타이드들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 포함하는 MUC1 표적 폴리펩타이드 분자가 제공된다.
상기 MUC1 표적 폴리펩타이드 분자는 앞서 설명한 항-MUC1 항체의 중쇄 상보성결정부위, 경쇄 상보성결정부위, 또는 이들의 조합; 또는 상기 중쇄 상보성결정부위를 포함하는 중쇄 가변영역, 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
상기 MUC1 표적 폴리펩타이드 분자는, 이에 한정되지 않지만, 항-MUC1 항체, 상기 항체의 항원결합단편, 또는 항-MUC1 항체 유사체 (항체와 유사한 골격과 기능을 갖는 구조체; 예컨대, 펩티바디, 나노바디, 등), 또는 다중 결합 항체 등의 전구체 또는 구성 부분 (예컨대, CDR)으로서 역할을 할 수 있다.
용어 "펩티바디(peptide + antibody)"는 펩타이드와 항체의 Fc 부분 등의 불변 부위의 전부 또는 일부가 융합된 융합 단백질로서, 항체와 유사한 골격과 기능을 갖는 단백질을 의미한다. 여기서 앞서 설명한 1종 이상의 펩타이드가 항원 결합 부위 (중쇄 및/또는 경쇄 CDR 또는 가변영역)로서 작용할 수 있다.
용어 "나노바디"는 단일-도메인 항체 (single-domain antibody)라고도 불리며, 항체의 단일 가변 도메인을 모노머 형태로 포함하는 항체 단편을 의미하며, 완전한 구조의 항체와 유사하게 특정 항원에 대하여 선택적으로 결합하는 특성을 갖는다. 나노바디의 분자량은 일반적으로 약 12 kDa 내지 약 15 kDa 정도로, 완전한 항체(두 개의 중쇄와 두 개의 경쇄 포함)의 일반적인 분자량 (약 150 kDa 내지 약 160 kDa)과 비교하여 매우 작으며, 경우에 따라서는 Fab 단편이나 scFv 단편보다 작다.
구체적으로, 본 발명은 MUC1을 특이적으로 인식하거나 및/또는 특이적으로 결합 가능한 폴리펩타이드를 제공한다. 상기 폴리펩타이드는 서열번호 1, 서열번호 7, 서열번호 16, 서열번호 19, 서열번호 27, 및 서열번호 33으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 포함할 수 있으며, 더욱 자세하게는 서열번호 2 내지 6, 서열번호 8 내지 15, 서열번호 17 내지 18, 서열번호 20 내지 26, 서열번호 28 내지 32, 및 서열번호 34 및 서열번호 38로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
상기 폴리펩타이드 및 이들의 적용 가능한 상보성결정부위를 아래의 표 1에 정리하였다. 하기 표 1에서, VH-CDR1, VH-CDR2, 및 VH-CDR3는 중쇄 상보성결정부위를 의미하고, VL-CDR1, VL-CDR2, 및 VL-CDR3는 경쇄 상보성결정부위를 의미한다.
명명 서열 서열번호
VH-CDR1 X1 -Y-W-M- X2 (X1=D or S; X2=N, S, or H) 1
VH-CDR1 DYWMN 2
VH-CDR1 DYWM S 3
VH-CDR1 S YWMN 4
VH-CDR1 S YWM S 5
VH-CDR1 S YWM H 6
VH-CDR2 X3 -I- X4 - X5 -K- X6 -Y- X7 - X8 - X9 - X10 - X11 -Y- X12 - X13 -S-V-K-G
(X3=Q, F, or V; X4=R or K; X5=N, S, Q, or Y; X6=P or A; X7=N or G; X8=Y, G, or S; X9=E or T; X10=T or K; X11=Y or E; X12=S, A, or V; X13=N, Q, or A)		 7
VH-CDR2 QIRNKPYNYETYYSNSVKG 8
VH-CDR2 QIRNKPYNYETYYS Q SVKG 9
VH-CDR2 QIR S KPYNYETYY AA SVKG 10
VH-CDR2 F IR S K A Y GGT T E Y AA SVKG 11
VH-CDR2 QI KQ KPYNYE K YY VQ SVKG 12
VH-CDR2 QI KQ KPY GG E K YY VQ SVKG 13
VH-CDR2 QIRNKPYNYE K YY AQ SVKG 14
VH-CDR2 V IR Y KPY GS E K YY AQ SVKG 15
VH-CDR3 A-M-I-T-S-D-G-Y-A- X14 -D-Y (X14=M or F) 16
VH-CDR3 AMITSDGYAMDY 17
VH-CDR3 AMITSDGYA F DY 18
VL-CDR1 X15 - X16 -S-Q-S- X17 -L- X18 -S-S- X19 - X20 - X21 -N-Y-L-A
(X15=K or R; X16=S or A; X17=L or V; X18=L, Y, or H; X19=N or S; X20=Q or G; X21=K or Y)		 19
VL-CDR1 KSSQSLLLSSNQKNYLA 20
VL-CDR1 KSSQS V LLSSNQKNYLA 21
VL-CDR1 KSSQS V L Y SSNQKNYLA 22
VL-CDR1 R SSQSLLLSSNQKNYLA 23
VL-CDR1 RA SQS V LLSSNQKNYLA 24
VL-CDR1 RA SQS V LLSS S QKNYLA 25
VL-CDR1 R SSQSLL H SSN GY NYLA 26
VL-CDR2 W- X22 -S- X23 -R- X24 - X25 (X22=A or G; X23=T or S; X24=E or A; X25=S or T) 27
VL-CDR2 WASTRES 28
VL-CDR2 WAS S RE T 29
VL-CDR2 WAS S R AT 30
VL-CDR2 W G STRES 31
VL-CDR2 W G STR A S 32
VL-CDR3 Q-Q- X26 -F- X27 - X28 -P- X29 -T (X26=C or S; X27=S or Q; X28=Y, T, or S; X29=L or Y) 33
VL-CDR3 QQCFSYPLT 34
VL-CDR3 QQ S FSYPLT 35
VL-CDR3 QQ S FS T P Y T 36
VL-CDR3 QQ S FS S P Y T 37
VL-CDR3 QQ S F QT P Y T 38
일 예에서, 상기 폴리펩타이드들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 상보성결정부위로 포함하는 항-MUC1 항체 또는 이의 항원결합단편이 제공된다.
상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄의 상보성결정부위로서,
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR1),
서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR2), 및
서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3)
로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열은 하기 일반식 1의 아미노산 서열과 같다:
[일반식 1] (서열번호 1)
X1 -Y-W-M- X2
X1은 D 또는 S,
X2는 N, S, 또는 H이다.
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 CDR1로 사용 가능한 서열번호 1의 폴리펩타이드는, 예컨대, 서열번호 2 내지 6으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 자세한 서열을 상기 표 1과 서열목록에 기재되어 있으며, 기재된 아미노산 서열에서 진하게 밑줄로 그은 부분은 변형된 아미노산을 나타낸다.
상기 서열번호 7의 아미노산 서열은 하기 일반식 2의 아미노산 서열과 같다:
[일반식 2] (서열번호 7)
X3 -I- X4 - X5 -K- X6 -Y- X7 - X8 - X9 - X10 - X11 -Y- X12 - X13 -S-V-K-G
X3는 Q, F, 또는 V,
X4는 R 또는 K,
X5는 N, S, Q, 또는 Y,
X6은 P 또는 A,
X7은 N 또는 G,
X8은 Y, G, 또는 S,
X9는 E 또는 T,
X10은 T 또는 K,
X11은 Y 또는 E,
X12는 S, A, 또는 V,
X13은 N, Q, 또는 A이다.
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 CDR2로 사용 가능한 서열번호 7의 폴리펩타이드는, 예컨대, 서열번호 8 내지 15로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 자세한 서열을 상기 표 1과 서열목록에 기재되어 있으며, 기재된 아미노산 서열에서 진하게 밑줄로 그은 부분은 변형된 아미노산을 나타낸다.
상기 서열번호 16의 아미노산 서열은 하기 일반식 3의 아미노산 서열과 같다:
[일반식 3] (서열번호 16)
A-M-I-T-S-D-G-Y-A- X14 -D-Y
X14는 M 또는 F이다.
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 CDR3으로 사용 가능한 서열번호 16의 폴리펩타이드는, 예컨대, 서열번호 17 내지 18로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 자세한 서열을 상기 표 1과 서열목록에 기재되어 있으며, 기재된 아미노산 서열에서 진하게 밑줄로 그은 부분은 변형된 아미노산을 나타낸다.
상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄의 상보성결정부위로서,
서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR1),
서열번호 27의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR2), 및
서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR3)
로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하는 것일 수 있다.
상기 서열번호 19의 아미노산 서열은 하기 일반식 4의 아미노산 서열과 같다:
[일반식 4] (서열번호 19)
X15 - X16 -S-Q-S- X17 -L- X18 -S-S- X19 - X20 - X21 -N-Y-L-A
X15는 K 또는 R,
X16은 S 또는 A,
X17은 L 또는 V,
X18은 L, Y, 또는 H,
X19는 N 또는 S,
X20은 Q 또는 G,
X21은 K 또는 Y이다.
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 CDR1로 사용 가능한 서열번호 19의 폴리펩타이드는, 예컨대, 서열번호 20 내지 26으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 자세한 서열을 상기 표 1과 서열목록에 기재되어 있으며, 기재된 아미노산 서열에서 진하게 밑줄로 그은 부분은 변형된 아미노산을 나타낸다.
상기 서열번호 27의 아미노산 서열은 아래 일반식 5의 아미노산 서열과 같다:
[일반식 5] (서열번호 27)
W- X22 -S- X23 -R- X24 - X25
X22는 A 또는 G,
X23은 T 또는 S,
X24는 E 또는 A,
X25는 S 또는 T이다.
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 CDR2로 사용 가능한 서열번호 27의 폴리펩타이드는, 예컨대, 서열번호 28 내지 32로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 자세한 서열을 상기 표 1과 서열목록에 기재되어 있으며, 기재된 아미노산 서열에서 진하게 밑줄로 그은 부분은 변형된 아미노산을 나타낸다.
상기 서열번호 33의 아미노산 서열은 하기 일반식 6의 아미노산 서열과 같다:
[일반식 6] (서열번호 33)
Q-Q- X26 -F- X27 - X28 -P- X29 -T
X26은 C 또는 S,
X27은 S 또는 Q,
X28은 Y, T, 또는 S,
X29는 L 또는 Y이다.
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄 CDR3으로 사용 가능한 서열번호 27의 폴리펩타이드는, 예컨대, 서열번호 34 내지 38로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 자세한 서열을 상기 표 1과 서열목록에 기재되어 있으며, 기재된 아미노산 서열에서 진하게 밑줄로 그은 부분은 변형된 아미노산을 나타낸다.
일 예에서, 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(VH-CDR1), 서열번호 7의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(VH-CDR2), 및 서열번호 16의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성결정부위, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성결정부위를 포함하는 중쇄 가변영역;
서열번호 19의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(VL-CDR1), 서열번호 27의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(VL-CDR2), 및 서열번호 33의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(VL-CDR3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성결정부위, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역;
상기 중쇄 상보성결정부위와 경쇄 상보성결정부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 2 내지 6으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR1), 서열번호 8 내지 16로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR2), 및 서열번호 17 내지 18로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 중쇄 상보성결정부위, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성결정부위를 포함하는 중쇄 가변영역;
서열번호 20 내지 26으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR1), 서열번호 28 내지 32로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR2), 및 서열번호 34 내지 38로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR3)로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 경쇄 상보성결정부위, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역;
상기 중쇄 상보성결정부위와 경쇄 상보성결정부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 2 내지 6으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR1), 서열번호 8 내지 16로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR2), 및 서열번호 17 내지 18로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3)를 포함하는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 20 내지 26으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR1), 서열번호 28 내지 32로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR2), 및 서열번호 34 내지 38로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR3)를 포함하는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 하기 표 2 및 표 3에 조합된 중쇄 가변영역의 CDR 서열과 경쇄 가변영역의 CDR 서열을 포함하는 것일 수 있다.
중쇄 가변영역의 명명 VH-CDR1 서열번호 VH-CDR2 서열번호 VH-CDR3 서열
번호
VH0:VH-chimera DYWMN 2 QIRNKPYNYETYYSNSVKG 8 AMITSDGYAMDY 17
VH1 DYWMN 2 QIRNKPYNYETYYS Q SVKG 9 AMITSDGYAMDY 17
VH2 DYWMN 2 QIR S KPYNYETYY AA SVKG 10 AMITSDGYAMDY 17
VH3 DYWM S 3 F IR S K A Y GGT T E YAASVKG 11 AMITSDGYA F DY 18
VH4 DYWMN 2 QIRNKPYNYETYYSNSVKG 8 AMITSDGYAMDY 17
VH5 S YWM N 4 QI KQ KPYNYE K YY VQ SVKG 12 AMITSDGYAMDY 17
VH6 S YWM S 5 QI KQ KPY GG EKYY VQ SVKG 13 AMITSDGYA F DY 18
VH7 DYWMN 2 QIRNKPYNYETYYSNSVKG 8 AMITSDGYAMDY 17
VH8 S YWM N 4 QIRNKPYNYE K YY AQ SVKG 14 AMITSDGYAMDY 17
VH9 S YWM H 6 V IRYKPY GS E K YY AQ SVKG 15 AMITSDGYA F DY 18
경쇄 가변영역의 명명 VL-CDR1 서열번호 VL-CDR2 서열번호 VL-CDR3 서열번호
VL0:VL-chimera KSSQSLLLSSNQKNYLA 20 WASTRES 28 QQCFSYPLT 34
VL1 KSSQSLLLSSNQKNYLA 20 WASTRES 28 QQCFSYPLT 34
VL2 KSSQS V LLSSNQKNYLA 21 WASTRES 28 QQ S FSYPLT 35
VL3 KSSQS V L Y SSNQKNYLA 22 WASTRES 28 QQ S FS T P Y T 36
VL4 R SSQSLLLSSNQKNYLA 23 WASTRES 28 QQCFSYPLT 34
VL5 RA SQS V LLSSNQKNYLA 24 WAS S RE T 29 QQ S FSYPLT 35
VL6 RA SQS V LLSS S QKNYLA 25 WAS S R AT 30 QQ S FS S P Y T 37
VL7 R SSQSLLLSSNQKNYLA 23 WASTRES 28 QQCFSYPLT 34
VL8 R SSQSLLLSSNQKNYLA 23 W G STRES 31 QQ S FSYPLT 35
VL9 R SSQSLL H SSN GY NYLA 26 W G STR A S 32 QQ S F QT P Y T 38
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 2 또는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR1), 서열번호 8, 서열번호 9, 또는 서열번호 14의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR2), 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3)을 포함하는 중쇄 상보성결정부위, 또는 상기 중쇄 상보성결정부위를 포함하는 중쇄 가변영역;
서열번호 21, 서열번호 22, 서열번호 23, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR1), 서열번호 28, 서열번호 29, 또는 서열번호 31의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR2), 및 서열번호 34, 서열번호 35, 또는 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR3)을 포함하는 경쇄 상보성결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역;
상기 중쇄 상보성결정부위와 경쇄 상보성결정부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR1), 서열번호 8 또는 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR2), 및 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3)을 포함하는 중쇄 상보성결정부위, 또는 상기 중쇄 상보성결정부위를 포함하는 중쇄 가변영역;
서열번호 21, 서열번호 23, 또는 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR1), 서열번호 28 또는 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR2), 및 서열번호 34 또는 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR3)을 포함하는 경쇄 상보성결정부위, 또는 상기 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 가변영역;
상기 중쇄 상보성결정부위와 경쇄 상보성결정부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
1) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR1), 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR2), 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3), 서열번호 21의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR1), 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR2), 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR3);
2) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR1), 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR2), 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3), 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR1), 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR2), 및 서열번호 36의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR3);
3) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR1), 서열번호 9의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR2), 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3), 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR1), 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR2), 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR3);
4) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR1), 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR2), 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3), 서열번호 23의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR1), 서열번호 28의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR2), 및 서열번호 34의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR3); 또는
5) 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR1), 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR2), 서열번호 17의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3), 서열번호 24의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR1), 서열번호 29의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR2), 및 서열번호 35의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR3);
를 포함하는 것일 수 있다.
상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 일반식 1 내지 6의 상보성결정부위로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 상보성결정부위에 더하여, 하나 이상의 중쇄 가변영역의 프레임워크 서열, 하나 이상의 경쇄 가변영역의 프레임워크 서열, 또는 하나 이상의 중쇄 가변영역의 프레임워크 서열과 하나 이상의 경쇄 가변영역의 프레임워크 서열을 포함할 수 있다. 상기 경쇄 가변영역의 프레임워크 서열과 경쇄 가변영역의 프레임워크 서열의 일 예는 하기 표 4 내지 표 7에 나타낸다.
중쇄 가변영역의 프레임워크 FR1 서열번호 FR2 서열번호
VH0:VH-chimera EVKVDETGGGLVQPGRPMKLSCVVSGITFS 39 WVRQSPEKGLEWVA 49
VH1 EVKVVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGITFS 40 WVRQAPGKGLEWVG 50
VH2 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGITFG 41 WVRQAPGKGLEWVG 50
VH3 EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFG 42 WVRQAPGKGLEWVG 50
VH4 EVKVVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFS 43 WVRQAPGKGLEWVA 51
VH5 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFS 44 WVRQAPGKGLEWVA 51
VH6 EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS 45 WVRQAPGKGLEWVA 51
VH7 QVKVVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGITFS 46 WVRQAPGKGLEWVA 51
VH8 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGITFS 47 WVRQAPGKGLEWVA 51
VH9 QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS 48 WVRQAPGKGLEWVA 51
중쇄 가변영역의 프레임워크 FR3 서열번호 FR4 서열번호
VH0:VH-chimera RFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDMGIYYCTW 52 WGQGTSVTVSS 58
VH1 RFTISRDDSKSIAYLQMSSLKTEDTAVYYCTW 53 WGQGTLVTVSS 59
VH2 RFTISRDDSKSIAYLQMSSLKTEDTAVYYCTW 53 WGQGTLVTVSS 59
VH3 RFTISRDDSKSIAYLQMSSLKTEDTAVYYCTW 53 WGQGTLVTVSS 59
VH4 RFTISRDDAKSSVYLQMSSLRAEDTAVYYCTW 54 WGQGTLVTVSS 59
VH5 RFTISRDDAKSSLYLQMSSLRAEDTAVYYCAW 55 WGQGTLVTVSS 59
VH6 RFTISRDDAKSSLYLQMSSLRAEDTAVYYCAW 55 WGQGTLVTVSS 59
VH7 RFTISRDDSKSTVYLQMSSLRAEDTAVYYCTW 56 WGQGTLVTVSS 59
VH8 RFTISRDDSKSTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAW 57 WGQGTLVTVSS 59
VH9 RFTISRDDSKSTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAW 57 WGQGTLVTVSS 59
경쇄 가변영역의 프레임워크 FR1 서열번호 FR2 서열번호
VL0:VL-chimera DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTLIC 60 WYQQKPGQSPKLLIY 65
VL1 DIVMTQSPDSLAVSLGERATISC 61 WYQQKPGQPPKLLIY 66
VL2 DIVMTQSPDSLAVSLGERATISC 61 WYQQKPGQPPKLLIY 66
VL3 DIVMTQSPDSLAVSLGERATISC 61 WYQQKPGQPPKLLIY 66
VL4 EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSC 62 WYQQKPGQAPRLLIY 67
VL5 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC 63 WYQQKPGQAPRLLIY 67
VL6 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC 63 WYQQKPGQAPRLLIY 67
VL7 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC 64 WYLQKPGQSPQLLIY 68
VL8 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC 64 WYLQKPGQSPQLLIY 68
VL9 DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC 64 WYLQKPGQSPQLLIY 68
경쇄 가변영역의 프레임워크 FR3 서열번호 FR4 서열번호
VL0:VL-chimera GVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVKAEDLAVYYC 69 FGAGTKLELK 75
VL1 GVPDRFSGSGSGTEFTLTISSVQAEDVAVYYC 70 FGQGTKLEIK 76
VL2 GVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLQAEDVAVYYC 71 FGQGTKLEIK 76
VL3 GVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLQAEDVAVYYC 71 FGQGTKLEIK 76
VL4 GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYC 72 FGQGTKLEIK 76
VL5 GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC 73 FGQGTKLEIK 76
VL6 GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC 73 FGQGTKLEIK 76
VL7 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC 74 FGQGTKLEIK 76
VL8 VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC 74 FGQGTKLEIK 76
VL9 GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC 74 FGQGTKLEIK 76
일 예에서, 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
상기 중쇄 상보성결정부위 (상기 표 2에서 VH0 내지 VH9)를 포함하는 중쇄 가변영역, 상기 경쇄 상보성결정부위 (상기 표 3에서 VL0 내지 VL9)를 포함하는 경쇄 가변영역, 또는 이들의 조합일 수 있다. 예컨대, 상기 중쇄 가변영역은 서열번호 77 내지 86으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있으며, 상기 경쇄 가변영역은 서열번호 87 내지 96으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
따라서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 77 내지 86으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역;
서열번호 87 내지 96으로 이루어지는 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역; 또는
이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 78, 서열번호 81, 서열번호 84, 또는 서열번호 85의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 89, 서열번호 90, 서열번호 91, 서열번호 92, 서열번호 94, 또는 서열번호 95의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 78, 서열번호 81, 또는 서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역; 및
서열번호 89, 서열번호 91, 또는 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
1) 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 89의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역;
2) 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역;
3) 서열번호 78의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역;
4) 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역;
5) 서열번호 81의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 92의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역; 또는
6) 서열번호 84의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역 및 서열번호 91의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역;
을 포함하는 것일 수 있다.
용어, "에피토프(epitope)"는 항원 결정 부위(antigenic determinant)로서, 항체에 의해 인지되는 항원의 일부분을 의미하는 것으로 해석된다. 일 구체예에 따르면, 상기 에피토프는 MUC1 단백질 내의 부위, 예컨대, 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드일 수 있다.
따라서, 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 에피토프에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
다중 결합 항체
본 발명의 일 예는 MUC1을 특이적으로 인식하거나 및/또는 특이적으로 결합 가능한 폴리펩타이드를 포함하는 다중 결합 항체 또는 다중 특이적 항체에 관한 것이며, 더욱 자세하게는 MUC1을 특이적으로 인식하거나 및/또는 특이적으로 결합 가능한 폴리펩타이드와 함께, 제2 타겟을 특이적으로 인식하거나 및/또는 특이적으로 결합 가능한 폴리펩타이드을 포함하는 이중 특이 항체일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "다중 결합 항체" 는 2개 또는 그 이상의 상이한 항원을 인식 및/또는 결합하거나, 동일한 항원의 서로 다른 부위를 인식 및/또는 결합하는 항체를 의미하는 것으로, 상기 다중 결합 항체 중 하나의 항원 결합 부위가 앞서 설명한 폴리펩타이드를 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 일 예는 MUC1에 특이적으로 결합하는 제1 항원-결합 도메인 및 CD3에 특이적으로 결합하는 제2 항원-결합 도메인을 포함하는 이중 특이 항원-결합 분자에 관한 것이다. 자세하게는, 본 발명의 일 예는, 본 발명에 따른 MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 T 세포 활성화 항원에 대해 특이적인 1개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는, 이중 특이 항체에 관한 것이다.
상기 이중 특이 항체에서, 상기 T 세포 활성화 항원이 CD3 T 세포 보조수용체(CD3; cluster of differentiation 3) 항원 (예컨대, 항-CD3 epsilon (ε) 항원)일 수 있으며, 상기 이중 특이 항체는, CD3 항원에 대한 항원 결합 부위를 포함하는 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다.
구체적으로 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 이중 특이 항체 (즉, 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체)에 관한 것이다. 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체는 각각의 항원인 MUC1 및 CD3에 대한 친화도 및 활성을 유지하면서 상승 효과를 발휘할 수 있다.
상기 이중 특이 항체는 제1 항원인 MUC1에 특이적으로 결합하며, 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 위에서 설명한 것과 동일한 것일 수 있다.
또한, 상기 이중 특이 항체는 제2 항원인 CD3에 특이적으로 결합하며, 구체적으로 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함할 수 있다. 상기 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 사람, 원숭이, 마우스 등의 CD3에 결합하는, 항체 또는 이의 항원-결합 단편일 수 있다. 상기 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 예를 들면, T 세포-매개된 세포사멸이 이롭거나 바람직한 환경 하에, CD3을 발현하는 T 세포를 표적화하거나, T 세포 활성화를 자극하는데 유용하다. 본 발명의 항-CD3 항체, 또는 이의 항원 결합 단편은, 특정 세포 유형, 예를 들면, 종양 세포 또는 감염성 병원체(infectious agent)에 대해 CD3-매개된 T 세포 활성화를 지시하는 이중 특이 항체의 부분으로서 포함될 수 있다.
상기 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 CD3에 특이적으로 결합하는 항체라면 제한 없이 사용할 수 있으며, 예컨대, OKT3 항체 또는 이의 항원 결합 단편, UCHT-1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, SP34 항체 또는 이의 항원 결합 단편 등을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 OKT3 항체는 마우스 또는 인간화된 면역글로불린 IgG2a 이소타입의 단클론항체일 수 있다. 상기 UCHT-1 항체는 인간 T 세포 수용체(TCR)/CD3 복합체의 ~20kDa CD3ε 소단위와 반응하는 것으로 알려져 있으며, SP34 항체는 CD3ε 소단위에 결합하는 것으로 알려져 있다. 상기 OKT3 항체, UCHT-1 항체, 또는 SP34 항체의 입수 방법은 통상적으로 당 업계에 잘 알려져 있다.
일 구체예에서, 상기 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 하기 폴리펩타이드로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 CDR 서열, 바람직하게는 6개 CDR 서열을 포함할 수 있다 (아래 표 8 참조):
서열번호 97의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR1),
서열번호 98의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR2),
서열번호 99의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VH-CDR3),
서열번호 100의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR1),
서열번호 101의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR2), 및
서열번호 102의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (VL-CDR3).
더욱 자세하게는, 상기 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 103의 아미노산 서열을 갖는 중쇄 가변영역, 및 서열번호 104 또는 서열번호 105의 아미노산 서열을 갖는 경쇄 가변영역을 포함하는 것일 수 있다.
CD3 항체 서열 서열번호
VH-CDR1 GYTFTRYT 97
VH-CDR2 INPSRGYT 98
VH-CDR3 ARYYDDHYSLDY 99
VL-CDR1 ASSSVSY 100
VL-CDR2 DTS 101
VL-CDR3 QQWSSNPFT 102
VH QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSS 103
VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQIT 104
상기 항-CD3 항체의 항원 결합 단편은, 항-CD3 항체의 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에 따른 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체는 상기 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편이, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 C 말단 또는 N 말단에 연결된 것일 수 있다.
예를 들면, 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 N 말단 또는 C 말단에 결합된 항 CD3 항체 scFv (anti-MUC1 heavy chain N-term-anti-CD3 scFv 또는 anti-MUC1 heavy chain C-term-anti-CD3 scFv), 항-MUC1 경쇄 N 말단 또는 C 말단에 결합된 항 CD3 항체 scFv (anti-MUC1 light chain N-term-anti-CD3 scFv 또는 anti-MUC1 light chain C-term-anti-CD3 scFv)일 수 있다. 또한, 항-CD3 scFv 가 monovalent 또는 divalent 로 결합되어 있는 이중항체를 포함하여 항-MUC1 항체의 항원결합부위와 항-CD3 항체의 항원결합부위가 하나씩 있거나(1+1), 두 개와 하나씩 있어 하나의 이중항체 내에 3개의 항원결합 부위가 있거나 (1+2 또는 2+1), 항원결합 부위가 2개씩 4개 있는 (2+2) 형태의 이중 특이 항체일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
일 예에서, 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체는 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 중쇄 또는 경쇄의 C 말단 또는 N 말단, 예컨대 경쇄의 N 말단에 연결된 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체는 MUC1에 대한 완전한 항체 (예컨대 IgG형 항체) 및 상기 항체의 경쇄의 N 말단에 연결된 항-CD3 항체의 항원 결합 단편 (예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2)을 포함하는 것일 수 있다.
상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체에 있어서, 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 또한 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분, 예컨대 scFv 단편 내의 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역도 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항-CD3 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 연결하는 펩타이드 링커와 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분을 연결하는 펩타이드 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n (n은 (GGGGS)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체는 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 위치하는 경쇄의 N 말단에 결합된 항 CD3 항체의 scFv 형태일 수 있다. 상기와 같이 항 CD3 항체 scFv가 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 위치하는 경쇄의 N 말단에 결합된 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체는 항 CD3 항체 scFv가 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편에 위치하는 경쇄의 C 말단에 결합된 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체보다 암세포에 대한 세포 독성, 암세포 증식 억제 효과, 및/또는 암의 치료 효과가 더 우수할 수 있다.
의약 용도 (medical use)
다른 양상은 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 양상은 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량을 암의 예방 또는 치료를 필요로 하는 대상에게 투여하는 단계를 포함하는, 암의 예방 또는 치료방법을 제공한다. 상기 암의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용할 수 있다. 본 명세서에서 제공되는 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 MUC1의 작용제 (agonist)로서의 기능을 나타내므로, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 효능 (예컨대, 암세포 사멸 등의 항암 효능)을 충분히 발휘하기 위해서, 적용 대상 암은 해당 암세포가 MUC1을 발현하는 것이 유리할 수 있으며, 예를 들면 MUC1을 발현하는 고형암일 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 예는 고형암 표적지향 및 치료가 향상된 MUC-1에 특이적으로 결합하는 신규한 항체 및 이의 용도에 관한 것이다.
일 예에서, 상기 암은 혈액암 (예컨대, B세포 림프종 등), 골수암, 갑상선암, 자궁암 (예컨대, 자궁경부암), 피부암, 흑색종, 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 전립선암, 및 췌장암, 또는 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편이 특이적으로 결합하는 항원의 에피토프가 30% 이상 발현되는 고형암으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물 또는 방법에 있어서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 약학적 유효량은, 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 및 부형제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제와 함께 제공될 수 있다.
상기 약학적으로 허용되는 담체는, 항체의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 약학적 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학적 조성물, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 적절한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 약학적 조성물, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 용어 "약학적 유효량"은 상기 유효성분(즉, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편)이 소망하는 효과, 즉 암을 예방 및/또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미하며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
또한, 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.
한편, 상기 약학적 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.
상기 약학적 조성물의 투여 대상 또는 상기 예방 및/또는 치료 방법의 투여 대상 환자는 포유류, 예컨대 인간, 원숭이 등의 영장류, 또는 래트, 마우스 등의 설치류 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니며, 기존의 항암제, 예컨대 상기 표적 세포막 단백질(예컨대, MUC1)에 대한 길항제에 대하여 내성이 생긴 암환자일 수 있다.
폴리펩타이드, 재조합 벡터, 및 항제의 제조 방법
본 발명의 다른 예는 상기한 바와 같은 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 일 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 2 내지 6, 서열번호 8 내지 15, 서열번호 17 내지 18, 서열번호 20 내지 26, 서열번호 28 내지 32, 및 서열번호 34 및 서열번호 38로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 것일 수 있다.
또 다른 구체예에서, 상기 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 77 내지 96으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는 것일 수 있다.
또 다른 예는 상기 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.
또 다른 예는 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 세포를 제공한다.
용어 "벡터(vector)"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위한 수단을 의미한다. 예를 들어, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터 및 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-연관 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 상기 재조합 벡터로 사용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예를 들면, pSC101, pGV1106, pACYC177, ColE1, pKT230, pME290, pBR322, pUC8/9, pUC6, pBD9, pHC79, pIJ61, pLAFR1, pHV14, pGEX 시리즈, pET 시리즈 및 pUC19 등), 파지 (예를 들면, λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예를 들면, SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 재조합 벡터에서 상기 폴리뉴클레오타이드는 프로모터에 작동적으로 연결될 수 있다. 용어 "작동 가능하게 연결된(operatively linked)"은 뉴클레오타이드 발현 조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)과 다른 뉴클레오타이드 서열 사이의 기능적인 결합을 의미한다. 상기 조절 서열은 "작동 가능하게 연결(operatively linked)"됨으로써 다른 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독을 조절할 수 있다.
상기 재조합 벡터는, 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 상기 발현용 벡터는 당업계에서 식물, 동물 또는 미생물에서 외래의 단백질을 발현하는 데 사용되는 통상의 것을 사용할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 구축될 수 있다.
상기 재조합 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 사용되는 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예를 들어, pLλ 프로모터, CMV promoter, trp 프로모터, lac 프로모터, tac 프로모터, T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 벡터에 포함되는 진핵 세포에서 작동하는 복제원점은 f1 복제원점, SV40 복제원점, pMB1 복제원점, 아데노 복제원점, AAV 복제원점 및 BBV 복제원점 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 포유동물 세포의 게놈으로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
상기 재조합 세포는 상기 재조합 벡터를 적절한 숙주 세포에 도입시킴으로써 얻어진 것일 수 있다. 상기 숙주세포는 상기 재조합 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 또는 발현시킬 수 있는 세포로서 당업계에 공지된 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 원핵 세포로는, 예를 들어, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있으며, 진핵 세포에 형질 전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 효모(Saccharomyces cerevisiae), 곤충 세포, 식물 세포 및 동물 세포, 예를 들어, Sp2/0, CHO(Chinese hamster ovary) K1, CHO DG44, PER.C6, W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, Huh7, 3T3, RIN, MDCK 세포주 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 폴리뉴클레오타이드 또는 이를 포함하는 재조합 벡터의 숙주 세포 내로의 운반(도입)은, 당업계에 널리 알려진 운반 방법을 사용할 수 있다. 상기 운반 방법은 예를 들어, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 또는 전기 천공 방법 등을 사용할 수 있고, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법, 칼슘 포스페이트 침전법, 전기 천공법, 리포좀-매개 형질감염법 및 유전자 밤바드먼트 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
상기 형질 전환된 숙주 세포를 선별하는 방법은 선택 표지에 의해 발현되는 표현형을 이용하여, 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어, 상기 선택 표지가 특정 항생제 내성 유전자인 경우에는, 상기 항생제가 함유된 배지에서 형질전환체를 배양함으로써 형질전환체를 용이하게 선별할 수 있다.
또 다른 예는 상기 재조합 세포에서 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계를 포함하는 폴리펩타이드 또는 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법을 제공한다. 상기 폴리뉴클레오타이드를 발현시키는 단계는 상기 재조합 세포를 여기에 포함된 폴리뉴클레오타이드의 발현을 허용하는 조건 하에서 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 상기 폴리펩타이드 또는 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 제조 방법은 상기 발현시키는 단계 또는 배양하는 단계 이후에 폴리펩타이드 또는 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 분리 및/또는 정제하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
항-MUC1 항체, 및 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체는 암세포의 성장을 효과적으로 저해할 수 있으므로, 암의 예방 또는 치료 효과가 우수하다.
도 1은 췌장암 특이적인 MP1 단클론 항체의 말초혈액 및 정상 췌장상피세포와 췌장암세포 결합반응을 나타낸다: (과립구(granulocytes), 림프구(lymphocytes), 단핵세포(monocytes), 정상 췌장상피세포(H6C7), 5종의 췌장암 세포주(AsPC1, BxPC3, Capan-1 Capan-2, PANC-1))
도 2a는 췌장암 조직에서의 면역조직화학염색 (Immunohistochemistry, IHC) 결과이고, 도 2b는 유방암 조직에서의 IHC 결과를 나타내며, 도면 내의 T는 Tumor 부위를 나타낸다.
도 3은 MP1 단클론 항체의 웨스턴블롯(western blot) 결과를 나타낸다.
도 4는 LC-MS/MS로 분석하여 동정된 MUC1의 아미노산 서열을 나타낸다.
도 5는 MUC1 항원에 대한 MP1 단클론 항체의 반응도 검정 (ELISA) 결과를 나타낸다.
도 6은 MUC1 항원에 대한 MP1 단클론 항체의 반응도 검정 (IP-Western blot(IB)) 결과를 나타낸다.
도 7A 및 도 7B는 MP1에 반응하는 췌장암 세포주 표면의 항원 정량 결과를 나타낸다.
도 7C 및 도 7D는 circular peptide array 방법을 이용한 MP1 단클론항체의 에피토프 매핑 결과를 나타낸다.
도 8은 MP1 인간화 항체의 췌장암세포 결합 반응을 나타내며, 염색 세포주는 Capan-2이고 중쇄 및 경쇄 항체 유전자 조합 및 세포결합 양성도(%)를 기재하였다.
도 9는 LCC 타입의 항-MUC1/OKT3 항체의 구조를 나타낸다.
도 10A 및 도 10B는 LCC 타입의 항-MUC1/OKT3 항체의 췌장암 세포인 AsPC1에 대해 세포표면 결합을 나타낸 결과이다.
도 11은 LCC 타입의 항-MUC1/OKT3 항체의 췌장암 세포인 Capan-2 및 AsPC1에 대해 cytotoxicity를 나타낸 결과이다.
도 12는 LCN 타입의 항-MUC1/OKT3 항체의 구조를 나타낸다.
도 13은 LCN 타입의 항-MUC1/OKT3 항체의 췌장암 세포인 Capan-1에 대해 cytotoxicity를 나타낸 결과이다.
도 14는 LCN 타입의 항-MUC1/OKT3 항체의 췌장암 세포인 AsPC1에 대해 cytotoxicity를 나타낸 결과이다.
도 15는 LCN 타입의 항-MUC1/OKT3 항체의 췌장암 세포인 Capan-2 및 AsPC1, 위암 세포인 SNU-601, 유방암 세포인 T47D에 대해 cytotoxicity를 나타낸 결과이다.
도 16은 췌장암 세포인 AsPC-1을 주사하여 종양을 유도한 NOG 마우스 동물 모델에 항-MUC1/OKT3 항체를 투여하여 암세포의 치료 효과를 확인한 결과이다.
이하 본 발명을 다음의 실시예에 의하여 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. MP1 단클론 항체 발굴
췌장암에 특이적인 새로운 항체를 개발하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였으며, 개발 항체는 췌장암뿐만 아니라 유방암과 위암에서도 일부 발현하며 고형암 특이적 항체로 MP1이라고 명명하기로 하였다.
실시예 1-1. MP 단클론 항체 제작을 위한 타겟 부위 설계 및 선정방법
췌장암에서 발현되는 특이적인 항원에 대한 단클론 항체를 개발하기위해, 다양한 췌장암 세포주 AsPC1, BxPC3, Capan-1 Capan-2, PANC-1를 마우스에 면역화한 후 이에 대한 단클론 항체를 세포 융합 방법으로 확립하였다. 이 후 하이브리도마 선별 과정에서 췌장암 세포주에 양성이면서 정상 췌장 세포주인 H6C7와 말초혈액에 음성인 항체를 골라 선별하였다.
실시예 1-2. 하이브리도마 제조 항체 선별
췌장암 특이적 단클론 항체를 개발하기 위하여 5종의 췌장암 세포주 (AsPC1, BxPC3, Capan-1 Capan-2, PANC-1)를 동수로 혼합하여 6주령의 Balb/c 암컷 마우스 한 마리당 1x107의 수만큼 마우스복강(IP; intraperitoneal cavity)으로 3주간의 간격으로 세 번 주입하여 면역하였다. 상기와 같이 면역화된 쥐의 비장을 절제하여 단일 세포 부유액을 수득하고 RPMI1640으로 2회 정도 세척한 후, 0.4% trypan blue (sigma)를 1:1(v/v)으로 섞은 후 현미경으로 염색되지 않은 세포를 측정하는 트립판 블루 (trypan blue) 염색법으로 세포수를 계수하였다. 세포융합 partner 세포로는 X63 mouse myeloma 세포주 (ATCC CRL-1580)를 사용하였으며 상기 비장세포와 동일하게 세척 후 세포수를 계수하였다. 상기 골수 (myeloma) 세포와 비장세포를 혼합한 후 PEG(polyethylene glycol) 1500을 첨가하여 세포를 융합시킨 후 세포를 원심분리하였다. 융합된 하이브리도마 세포는 1xHAT가 포함된 RPMI(20% FBS, hypoxanthine-aminopterin-thymidine)에 현탁시켜 96-웰 플레이트에 150 ul 분주한 후 37 ℃ 5% CO2 배양기에서 배양하였다. 상기 융합 후 일정기간 HAT가 포함된 배지에서 선별과정을 진행하고, 군락을 형성한 웰이 관찰되면 HT 배지로 교체하여 37 ℃ 5% CO2 배양기에서 48시간 배양 후 정상 췌장 세포주 H6C7과 면역에 사용된 5종의 췌장암 세포주 AsPC1, BxPC3, Capan-1 Capan-2, PANC-1을 각각 다음과 같이 형광염색을 실행하고 유세포 측정기로 분석하였다. 준비된 세포에 하이브리도마 배양 상층액을 100 ul씩 넣고 4 ℃에서 30분간 반응시킨 후 PBS 3 ml을 넣고 1700 rpm에서 3분간 원심분리하여 결합하지 않은 항체를 수세하고 결합된 항체를 확인하기 위해 이차항체인 goat anti-Mouse Ig-FITC(Jackson ImmunoResearch, USA)을 200배 희석하여 넣은 후 4 ℃에서 15분간 반응시킨 후 PBS 3 ml로 위와 동일한 방법으로 수세한 후 유세포 분석기로 측정하였다.
실시예 1-3.
말초 혈액에 대한 결합 정도를 확인하기 위해 PBMC(peripheral blood mononuclear cells, Zenbio)에 하이브리도마 상층액을 100 ul 넣고 4 ℃에서 30분간 반응시킨 후 PBS 3 ml을 넣고 1700 rpm에서 3분간 원심분리 하여 결합하지 않은 항체를 세척하고 결합된 항체를 확인하기 위해 이차항체인 goat anti-Mouse Ig-FITC (Jackson ImmunoResearch, USA)을 200배 희석하여 넣은 후 4 ℃에서 15분간 반응시킨 후 PBS 3 ml로 위와 동일한 방법으로 세척한 후 유세포 분석기로 측정하여 그 결과를 기재하였다 (도 1). 도 1은 췌장암 특이적인 MP1 단클론 항체의 말초혈액과 정상 췌장 상피세포 (H6C7) 및 여러 종류의 췌장암 세포와의 반응도 검사 결과를 나타낸다.
도 1에 나타난 바와 같이 상기 방법에서 다양한 췌장암 세포주에 양성이면서 정상 췌장상피세포인 H6C7과 말초혈액의 과립구(granulocytes)와 림프구(lymphocytes) 및 단핵세포(monocytes)에 모두 음성인 단클론 항체 (이하 MP1으로 명명함)를 선별하고, 최종적으로 제한 희석 (limiting dilution)을 통해 단일 콜로니의 MP1 하이브리도마 세포를 확보하였다.
실시예 2. 다양한 세포주에서의 항체 발현 분석
실시예 2-1. 다양한 세포주에서 항체 발현
KCLB (Korean Cell Line Bank)와 ATCC　(American Type Culture Collection)를 통해 확보한 다양한 암 세포주에서의 MP1 단클론 항체의 결합 여부를 유세포 분석기(flow cytometry)로 확인하였다. 구체적으로 암세포주는 KCLB(Korean Cell Line Bank)와 ATCC　(American Type Culture Collection)에서 제시된 배양배지와 방법에 따라 10%heat inactivated FBS가 첨가된 RPMI1640 배지 혹은 DMEM 배지를 이용해 37 ℃에서 5% CO2 상태의 배양기를 이용해 배양하였다. 또한 인간 췌장상피세포주인 H6C7는 kerafast사에서 구매하여 Keratinocyte SFM((Invitrogen Cat#:17005042)를 이용해 37 ℃에서 5% CO2 상태의 배양기를 이용해 배양하였다.
상기 배양된 다양한 암세포에 본 발명의 MP1 단클론 항체를 각각 넣어 4 ℃에서 30분간 반응시킨 후 PBS로 수세하고, FITC-conjugated goat anti mouse IgG(Jackson ImmunoResearch, USA)를 넣어 4 ℃에서 15분간 배양하였다. 다시 PBS로 수세한 후 FACS caliber(Becton Dickinson, USA)로 분석하여 다양한 고형암 세포주에서의 MP1 항체의 반응도를 확인하였다 (표 9).
하기 표 9과 표 10에 기재한 바와 같이, MP1 단클론항체는 췌장암 및 위암, 유방암, 폐암 세포주 일부와 피부암, 전립선암 세포주에서는 높게 결합하는 반면, 정상 췌장상피세포주인 H6C7을 포함한 T세포, B세포 및 뇌암, 담도암, 대장암 세포주에서는 결합하지 않거나 약하게 결합이 나타나는 것을 확인하였다. PBMC는 정상 혈액세포에는 음성이라는 것을 나타낸 것이다.
MP1은 다양한 췌장암 세포에서 양성반응을 보이며, 정상 췌장상피세포에는 음성반응을 보여 췌장암 치료제로 쓰일 수 있음을 나타낸다.
Origin Cell line MP1 Origin Cell line MP1
PBMC lymphocyte - Cervix HeLa S3 ++
monocyte - SiHa +
granulocyte - Skin A431 +++
T cell H9 - Melanoma HS294T -
CEM 7 - MDA-MB435 -
CEM20 - Sk-MEL-28 +
Molt4 - Gland
& Breast		 CAMA-1 +++
Jurkat - MCF7 ++
B cell ARH-77 - ZR-75-1 +
Daudi - T-47D +++
Ramos - JIMT-1 -
RPMI 8226 - MDAMB453 -
Raji - SK-BR3 -
BJAB + BT20 ++
Myeloid U937 - MDAMB231 -
THP-1 + MDAMB468 -
MOLM-13 - HS578T -
kasumi-1 - Colon HT-29 -
HL-60 - COLO 205 -
Erythroid HEL - LS 174T -
Bone
marrow		 K562 - SNU C1 +
KG-1 - SW620 -
Thyroid TPC-1 +++ DLD-1 -
Brain Daoy - SW-480 -
H4 - HCT 116 -
Hs683 - SNU C2A -
SNB-19 - SNUC4 -
Lung NCI H417 - Stomach SNU 719 -
HCC-1195 + KATOIII +
HCC-1588 - SNU668 -
HCC-2279 - SNU16 -
HCC-95 - Hs 746T -
NCI-H23 - AGS +++
calu-3 - MKN 28 -
A549TA + MKN 74 -
NCI-H460 - MKN-45 -
NCI-H1299 + SNU601 +++
SK-MES-1 - Prostate PC-3 -
L132 +++ DU145 +++
Liver HEPG2 - Pancreas H6C7 -
Hep3B.1-7 - AsPC-1 +++
SK-HEP-1 - BxPC-3 -
PLC/PRF/5 - Capan-1 +
Huh-7 - Capan-2 +++
biliary
tract		 SNU-308 - MIA PaCa-2 -
SNU-245 - PANC-1 -
Kidney 786-O -
The percentage of MP1 positive cells were calculated by FACS analysis.
- : less than 20% of positive cells, +20-30%, ++: 40-70%, +++: 60-100%
MP1 항체가 양성인 고형암 종류
solid cancer 종류 양성 암세포주 수 / 염색 암세포주 수
Pancreas 3/6
Breast 5/11
Stomach 2/10
Cervix 2/2
Prostate 1/2
Lung 4/11
Thyroid 1/1
Skin 1/1
Melanoma 1/3
실시예 2-2. IHC (Immunohistochemistry) 분석
인체의 췌장암 및 유방암조직에서 MP1 단클론 항체의 결합항원 분포를 면역조직화학염색(Immunohistochemistry, IHC)법으로 확인하였다. 인체의 췌장암 및 유방암 조직은 충북대학교 병원에서 얻었으며, 충북대학교 병원 병리과에서 파라핀 절편을 제작했다.
염색하고자 하는 인체의 유방암 조직을 통상적인 방법으로 포르말린 고정 후 파라핀 포매하여 마이크로 array 절편을 제작하였다. 그런 다음 슬라이드 상에 올려 염색 판독용 단일 조직 슬라이드를 제작하였다. 이어서 MP1 항체를 이용하여 다음과 같은 방법으로 면역조직화학 염색을 수행하였다. 자일렌 (Xylene)을 10분씩 3번 처리하고 에탄올을 100%, 80%, 50% 순으로 처리하고 마지막 증류수로 세척함으로써 탈 파라핀 과정을 진행하였다. 1 X TBS 로 세척 후, 10 mM Citric acid (pH 6.0) 항원 재생 용역에 슬라이드를 넣고 20분간 전자레인지에서 항원 재생하였다. 수돗물을 이용하여 서서히 슬라이드 온도를 낮추고 1 X TBS 에 10분간 보관하였다. 1차 항체로 마우스 MP1 항체를 조직에 처리하여 상온 1시간 반응 후 1 X TBS 로 3회 세척하고 2차 항체로 항 마우스 항체-HRP 접합체를 상온에서 30분간 반응시켰다. 1 X TBS 로 3회 세척하고 DAB 발색을 1분 30초간 하였으며, 1 X TBS 로 3회 세척하고 Counter staining을 45초간 하고 흐르는 수돗물에 슬라이드를 넣고 10분간 세척하였다. 탈수 과정은 탈 파라핀 과정의 역순으로 진행하고 봉입하여 현미경 판독 또는 사진 촬영을 하였다.
도 2A 및 도 2B에서 보듯이, MP1 단클론 항체가 인지하는 항원은 정상 조직에는 분포하지 않았고, 암조직 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다.
실시예 3. MP1 단클론 항체에 대한 항원 분석
실시예 3-1. MP1 단클론 항체의 항원 사이즈 확인
본 발명의 MP1 단클론 항체가 인지하는 항원의 단백질 크기를 알아보기 위해 웨스턴 블롯(western blot)을 실행하였다. MP1에 대한 항원 발현이 높은 췌장암 세포주 Capan-2에 protease inhibitor cocktail (Sigma, Cat. #: 1136170001)이 포함된 세포 용해 용액(NP40 cell lysis buffer, Thermo Fisher Scientific)에 용해(lysis)시킨 후, 8% SDS polyacrylamide gel에 전기영동시켜, Immobilon-P membrane(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)에 transfer하였다. 이후 정제된 MP1 단클론 항체를 membrane에 처리한 후, ECL system(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)에서 발색시켜 밴드를 확인하였다 (도 3). 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 측정 결과 MP1 단클론 항체가 인지하는 항원의 사이즈는 대략 300 kDa 근처로 확인되었다.
실시예 3-2. MP1 단클론 항원의 분리 분석
본 발명의 MP1 단클론 항체가 인지하는 항원을 동정하기 위해 면역침강법 (Immunoprecipitation)을 수행하였다. 우선 MP1 단클론 항체에 대한 반응성이 높은 세포주인 Capan-2 세포주를 1x107 cells/ml로 세포 용해용액 (NP40 cell lysis buffer, Thermo Fisher Scientific)에 용해(lysis)시킨 후 원심분리를 통해 세포 잔존물을 제거하고 상층액을 모아 MP1 항체가 인지하는 항원분리 재료로 사용하였다. 단백질-G 세파로스 (Protein-G Sepharose)에 MP1 단클론 항체를 넣어 4 ℃에서 4시간동안 혼합 후 1X PBS로 2회 세척한 후, 미리 만들어 놓은 Capan-2 라이세이트(lysate)를 넣고 4 ℃에서 4시간동안 혼합 후 1X PBS로 2회 세척하였다. 이로부터 얻은 면역복합체 (immune complex)를 SDS-폴리아크릴아마이드 젤 전기영동 (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)을 수행한 후 gel을 Coomassie Brilliant Blue G-250 염색 후 300 kDa 근처의 MP1에 대한 항원으로 추정되는 band를 잘라 LC-MS/MS 분석을 프로테옴텍에 동정의뢰하였다. 동정은 LC-MS/MS로 분석하여 얻어진 결과를 MASCOT로 프로세싱하였다.
상기와 같은 일련의 분석으로 획득된 protein hit 100종을 세포 표면에 발현하면서 300kDa 근처의 단백질 사이즈를 가진 항원으로 분석범위를 한정하여 선별한 결과 MUC1을 MP1 단클론 항체에 대한 항원으로 선정할 수 있었다 (도 4). MP1에서 분리된 펩타이드 서열은 QGGFLGLSNIK (서열번호 107)이다.
실시예 3-3. ELISA를 통한 MP1 단클론 항체의 항원 동정 결과 검증
LC-MS/MS에서 얻어진 항원 동정 결과를 검증하기 위하여 재조합 단백질 MUC1(Sino Biological, Cat. #: 12123-HCCH)에 대한 MUC1 단클론 항체의 반응성을 ELISA 및 Western blotting assay로 확인하였다.
Maxisorp ELISA plate에 well당 재조합 단백질 MUC1을 100 ng 넣어 37 ℃에서 한 시간 반응시켜 항원을 코팅한 뒤, 1x blocking 용액 (sigma)을 well 당 200 ul 넣고 37 ℃에서 한 시간 반응시켜 블로킹하였다. 상기 준비된 플레이트에 MP1 단클론 항체 및 대조군 항체, PBS 100 ul을 각각 넣은 후 37 ℃에서 한 시간 반응시키고 PBS로 수세하여 결합하지 않는 항체는 제거하였다. 이후 Goat anti-Mouse IgG-HRP(Jackson ImmunoResearch, USA)을 희석하여 넣어주고 30 분간 반응시킨 후 PBS로 수세한 뒤 TMB 용액을 well 당 50 ul씩 넣어 10분간 반응시킨 후 황산 50 ul를 넣어 반응을 중지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 재조합 단백질 MUC1에 대해 MP1 단클론 항체는 도 5와 같이 반응성을 나타내었다. 도 5는 MP1 단클론 항체에 대한 항원이 MUC1이라는 것을 ELISA로 검증한 결과이다.
실시예 3-4. IP 및 IB를 통한 MP1 단클론 항체의 항원 동정 결과 검증
상기 실험에서 MP1 단클론 항체가 MUC1을 항원으로 인지한다는 것을 웨스턴 블롯 (western blot)으로 한번 더 검정하였다. 실시예 3-2에 기술한 바와 동일하게 다양한 췌장암 세포주 BXPC3, Capan-1, Capan-2, PANC1 용해액을 준비하고, 단백질-G 세파로스 (Protein-G Sepharose)에 상용화된 MUC1 항체 (BioXCell, Cat. # C595(NCRC48))와 MP1 단클론 항체를 각각 4 ℃에서 4시간동안 혼합 후 1X PBS로 2회 세척한 후, 미리 만들어 놓은 라이세이트(lysate)를 넣고 4 ℃에서 4시간동안 혼합 후 1X PBS로 2회 세척하였다. 이로부터 얻은 면역복합체 (immune complex)를 10분간 끓인 후 8 % SDS polyacrylamide gel에 전기영동시켜, Immobilon P membrane(Millipore Corporation, Billerica, MA, USA)에 transfer하였다. 이후 정제된 MP1 단클론 항체를 membrane에 처리한 후, ECL system(GE Healthcare, Buckinghamshire, UK)에서 발색시켜 밴드를 확인하였다. 상용화된 MUC1 항체와 췌장암 세포주를 반응시킨 면역복합체 (immune complex)를 MP1 항체로 western blotting을 한 결과, Capan-2 라이세이트 단독 및 MP1과 췌장암 세포주 라이세이트의 면역복합체 (immune complex) 샘플과 동일한 300 kDa 위치에서 밴드를 확인할 수 있었다. 도 6은 MP1 단클론 항체에 대한 항원이 MUC1이라는 것을 웨스턴 블롯(western blot)으로 검증한 결과이다.
실시예 4. 세포 표면 항원 정량화
췌장암 세포 표면상의 MP1 단클론 항체에 결합하는 항원의 발현 수준은 세포 표면 항원들을 측정하기 위한 정량적 유동 세포측정법 키트인 QIFIKIT(Dako, Cat.#: K0078)을 사용하여 측정하였다. 산정 그래프를 통한 Bead의 평균 형광강도(MFI)의 비교로 세포주들의 항체 결합능력(ABC, Antibody Binding affinity)을 계산할 수 있다. 도 7A는 MP1 단클론 항체를 QIFIKIT를 사용하여 다양한 췌장암 세포주들 (AsPC1, BxPC3, Capan-1, Capan-2, PANC1)의 세포 표면상에서 검출된 MP1에 반응하는 항원의 발현 수준을 나타낸 결과이다.
실시예 5. 에피토프 맵핑 (epitope mapping)
다음은 에피토프 맵핑에 사용한 MUC-1 항원의 일부 서열(아미노산 895 ~ 1264번째 아미노산 서열임) 이다 (표 11). 항원 동정 검증에 사용한 재조합 MUC-1 항원의 아미노산 서열을 포함한 부위를 선정하여 circular peptide array 를 통해 에피토프 맵핑을 진행하였다.
도 7B에서 확인할 수 있는 바와 같이, MP1 항체는 PAHGVTS 서열을 포함한 펩타이드에 용량 의존적으로 결합하였으며, 따라서, MP1의 항원 결합부위 즉, 에피토프는 PAHGVTS (서열번호 109)로 확인되었다.
MUC-1 Isoform 2　(identifier:　P15941-2) (895번 아미노산 내지 1264번 아미노산)
PAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSAPDNRPALGSTAPPVHNVTSASGSASGSASTLVHNGTSARATTTPASKSTPFSIPSHHSDTPTTLASHSTKTDASSTHHSSVPPLTSSNHSTSPQLSTGVSFFFLSFHISNLQFNSSLEDPSTDYYQELQRDISEMFLQIYKQGGFLGLSNIKFRPGSVVVQLTLAFREGTINVHDVETQFNQYKTEAASRYNLTISDVSVSDVPFPFSAQSGAGVPGWGIALLVLVCVLVALAIVYLIALAVCQCRRKNYGQLDIFPARDTYHPMSEYPTYHTHGRYVPPSSTDRSPYEKVSAGNGGSSLSYTNPAVAATSANL (서열번호 108)
실시예 6. MP1 항체 가변영역의 서열 및 아이소타입 (isotype) 분석
실시예 6-1. 아이소타입(isotype)결정
실시예 1에서 제조된 MP1 단클론 항체의 아이소타입을 결정하기 위해 mouse immunoglobulin isotyping ELISA kit (BD Biosciences, USA)로 분석하였다. 그 결과 MP1 단클론 항체는 mouse IgG2a/kappa light chain으로 확인되었다.
실시예 6-2. MP1 항체 가변영역 서열 분석
MP1 항체 유전자는 Mouse Ig-Primer Set (Merck Millipore, Cat. #:69831)을 이용하여 클로닝하였다. MP1 하이브리도마로부터 분리한 RNA로부터 Mouse Ig-Primer Set을 이용하여 PCR을 수행하고, 이를 pGEM-T 벡터(Promega, Cat. #: A3600)에 삽입한 후, 시퀀싱을 통해 DNA 염기서열을 확인하였으며, IMGT site (www.imgt.org)를 통해 마우스 항체 유전자를 확인하였다. 표 12는 분석된 MP1 항체의 중쇄 및 경쇄 가변영역에서의 서열을 나타낸다. 하기 기재된 아미노산 서열에서 진하게 밑줄로 그은 부분은 상보성결정부위를 나타낸다. 하기 표 12에서 서열위치는 Kabat numbering system 기준에 의하여 작성한 것이다.
명명 서열 서열위치 길이 서열
번호
MP1 VH-FR1 EVKVDETGGGLVQPGRPMKLSCVVSGITFS 1-30 30 39
MP1 VH-CDR1 DYWMN 31-35 5 2
MP1 VH-FR2 WVRQSPEKGLEWVA 36-49 14 49
MP1 VH-CDR2 QIRNKPYNYETYYSNSVKG 50-68 19 8
MP1 VH-FR3 RFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDMGIYYCTW 69-100 32 52
MP1 VH-CDR3 AMITSDGYAMDY 101-112 12 17
MP1 VH-FR4 WGQGTSVTVSS 113-123 11 59
MP1 Ab VH EVKVDETGGGLVQPGRPMKLSCVVSGITFS DYWMN WVRQSPEKGLEWVA QIRNKPYNYETYYSNSVKG RFTISRDDSKSSVYLQMNNLRAEDMGIYYCTW AMITSDGYAMDY WGQGTSVTVSS 1-123 123 77
MP1 VL-FR1 DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTLIC 1-23 23 61
MP1 VL-CDR1 KSSQSLLLSSNQKNYLA 24-40 17 20
MP1 VL-FR2 WYQQKPGQSPKLLIY 41-55 15 66
MP1 VL-CDR2 WASTRES 56-62 7 28
MP1 VL-FR3 GVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVKAEDLAVYYC 63-94 32 70
MP1 VL-CDR3 QQCFSYPLT 95-103 9 34
MP1 VL-FR4 FGAGTKLELK 104-113 10 76
MP1 Ab VL DIVMSQSPSSLAVSVGEKVTLIC KSSQSLLLSSNQKNYLA WYQQKPGQSPKLLIY WASTRES GVPDRFTGSGSGTDFTLTINSVKAEDLAVYYC QQCFSYPLT FGAGTKLELK 1-113 113 87
실시예 7. MP1 인간화 항체 (humanized antibody) 개발
이중항체를 제조하기에 앞서 생쥐 기원의 항체의 인체 투여 시 인간 항-생쥐항체 (human anti-mouse antibody; HAMA)반응에 의해 나타나는 면역원성을 감소시키고, Druggability가 높은 항체를 확보하기 위해 MP1 가변영역 (variable region)과 나머지 부분을 인간의 Fc로 대체한 인간화 항체를 제작하였다. 선별한 인간화 항체는 항원 특이성 및 친화도가 본래의 마우스 유래 MP1 항체와 유사함을 확인하였다.
실시예 7.1 In silico Humanization에 의한 재조합 항체 서열 선정
마우스 항체 MP1 (중쇄 아미노산 서열: SEQ ID NO 77; 경쇄 아미노산 서열: SEQ ID NO: 87)의 중쇄 및 경쇄 각각의 CDR 부위 서열은 VH-CDR1: SEQ ID NO: 2 (DYWMN); VH-CDR2: SEQ ID NO: 8 (QIRNKPYNYETYYSNSVKG); VH-CDR3: SEQ ID NO: 17 (AMITSDGYAMDY); VL-CDR1: SEQ ID NO: 20 (KSSQSLLLSSNQKNYLA); VL-CDR2: SEQ ID NO: 28 (WASTRES); VL-CDR3: SEQ ID NO: 34 (QQCFSYPLT)이다. 마우스 항체 MP1 중쇄와 경쇄 아미노산 서열을 최대한 유사하게 유지하면서 항원 결합력이 동등하거나 우수한 인간화 항체를 사람 항체 유전자를 코딩하고 있는 germline의 서열을 기반으로 Framework region에 대한 서열부위를 in silico 방법으로 재조합하여 선별하였다. 마우스 항체 MP1의 중쇄, 경쇄 각각 서열과 가장 유사성이 높아 인간화 재조합 항체 서열의 backbone으로 사용한 사람 항체 Germline 유전자는 아래 표 13과 같다.
상기 선별된 인간화 항체의 중쇄 가변영역의 아미노산 서열과 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을 아래 표 14에 나타내었다. 하기 기재된 아미노산 서열에서 진하게 밑줄로 그은 부분은 상보성결정부위를 나타낸다.
Human Ab Germline
Heavy chain Light chain
IGHV3-49*04 IGKV4-1*01
IGHV3-7*01 IGKV2-28*01
IGHV3-33*01 IGKV3-20*01
중쇄 가변영역 아미노산 서열 서열번호
VH1
(MP1-H349-V1)		 EVKVVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGITFS DYWMN WVRQAPGKGLEWVG QIRNKPYNYETYYSQSVKG RFTISRDDSKSIAYLQMSSLKTEDTAVYYCTW AMITSDGYAMDY WGQGTLVTVSS 78
VH2(MP1-H349-V2) EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGITFG DYWMN WVRQAPGKGLEWVG QIRSKPYNYETYYAASVKG RFTISRDDSKSIAYLQMSSLKTEDTAVYYCTW AMITSDGYAMDY WGQGTLVTVSS 79
VH3(MP1-H349-V3) EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCTASGFTFG DYWMS WVRQAPGKGLEWVG FIRSKAYGGTTEYAASVKG RFTISRDDSKSIAYLQMSSLKTEDTAVYYCTW AMITSDGYAFDY WGQGTLVTVSS 80
VH4(MP1-H37-V1) EVKVVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFS DYWMN WVRQAPGKGLEWVA QIRNKPYNYETYYSNSVKG RFTISRDDAKSSVYLQMSSLRAEDTAVYYCTW AMITSDGYAMDY WGQGTLVTVSS 81
VH5(MP1-H37-V2) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGITFS SYWMN WVRQAPGKGLEWVA QIKQKPYNYEKYYVQSVKG RFTISRDDAKSSLYLQMSSLRAEDTAVYYCAW AMITSDGYAMDY WGQGTLVTVSS 82
VH6(MP1-H37-V3) EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYWMS WVRQAPGKGLEWVA QIKQKPYGGEKYYVQSVKG RFTISRDDAKSSLYLQMSSLRAEDTAVYYCAW AMITSDGYAFDY WGQGTLVTVSS 83
VH7(MP1-H333-V1) QVKVVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGITFS DYWMN WVRQAPGKGLEWVA QIRNKPYNYETYYSNSVKG RFTISRDDSKSTVYLQMSSLRAEDTAVYYCTW AMITSDGYAMDY WGQGTLVTVSS 84
VH8(MP1-H333-V2) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGITFS SYWMN WVRQAPGKGLEWVA QIRNKPYNYEKYYAQSVKG RFTISRDDSKSTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAW AMITSDGYAMDY WGQGTLVTVSS 85
VH9(MP1-H333-V3) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFS SYWMH WVRQAPGKGLEWVA VIRYKPYGSEKYYAQSVKG RFTISRDDSKSTLYLQMSSLRAEDTAVYYCAW AMITSDGYAFDY WGQGTLVTVSS 86
경쇄 가변영역 아미노산 서열 서열번호
VL1(MP1-L41-V1) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISC KSSQSLLLSSNQKNYLA WYQQKPGQPPKLLIY WASTRES GVPDRFSGSGSGTEFTLTISSVQAEDVAVYYC QQCFSYPLT FGQGTKLEIK 88
VL2(MP1-L41-V2) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISC KSSQSVLLSSNQKNYLA WYQQKPGQPPKLLIY WASTRES GVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLQAEDVAVYYC QQSFSYPLT FGQGTKLEIK 89
VL3(MP1-L41-V3) DIVMTQSPDSLAVSLGERATISC KSSQSVLYSSNQKNYLA WYQQKPGQPPKLLIY WASTRES GVPDRFSGSGSGTEFTLTISSLQAEDVAVYYC QQSFSTPYT FGQGTKLEIK 90
VL4(MP1-L320-V1) EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSC RSSQSLLLSSNQKNYLA WYQQKPGQAPRLLIY WASTRES GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYC QQCFSYPLT FGQGTKLEIK 91
VL5(MP1-L320-V2) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASQSVLLSSNQKNYLA WYQQKPGQAPRLLIY WASSRET GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQSFSYPLT FGQGTKLEIK 92
VL6(MP1-L320-V3) EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSC RASQSVLLSSSQKNYLA WYQQKPGQAPRLLIY WASSRAT GIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYC QQSFSSPYT FGQGTKLEIK 93
VL7(MP1-L228-V1) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC RSSQSLLLSSNQKNYLA WYLQKPGQSPQLLIY WASTRES GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC QQCFSYPLT FGQGTKLEIK 94
VL8(MP1-L228-V2) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC RSSQSLLLSSNQKNYLA WYLQKPGQSPQLLIY WGSTRESG VPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC QQSFSYPLT FGQGTKLEIK 95
VL9(MP1-L228-V3) DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISC RSSQSLLHSSNGYNYLA WYLQKPGQSPQLLIY WGSTRAS GVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYC QQSFQTPYT FGQGTKLEIK 96
실시예 7.2 인간화 재조합 항체의 발현 및 분석
상기 표 14의 중쇄 9종 (VH1 내지 VH9를 포함)과 경쇄 9종 (VL1 내지 VL9를 포함)의 발현 유전자에 해당하는 아미노산 서열을 codon-optimization하여 DNA 서열을 합성하고, 합성한 DNA를 이용하여 사람 Fc 부위 유전자 (중쇄는 사람 IgG1 Fc 유전자, 경쇄는 사람 Ig kappa constant 유전자)에 overlap PCR 로 연결시켜, ExpiCHO-S Expression system kit (Gibco, USA)에 포함된 pcDNA3.4 vector에 클로닝하였다. 제작된 인간화 MP1 항체의 경쇄 및 중쇄 발현 플라스미드를 ExpiCHO-S expression system kit(Invitrogen/Life technologies)를 이용하여 ExpiCHO-S 세포주에 transfection시켜 48웰 스케일로 일시발현 생산하였다.
발현된 인간화항체 배양액을 이용해 1) 췌장암 세포주 Capan-2에 염색하여 세포표면 결합 유무를, 2) 항-human Ig 항체 sandwich ELISA 를 통해 인간화 항체 발현 유무를 확인하였다. 전체 81종의 중쇄, 경쇄 조합 (즉, 표 14에 기재된 9종의 중쇄 가변영역에서 선택된 어느 하나의 중쇄 가변영역을 포함하는 중쇄 및 표 14에 기재된 9종의 경쇄 가변영역에서 선택된 어느 하나의 경쇄 가변영역을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체 조합) 중에서 원래 마우스 항체 또는 키메릭 항체의 세포 표면 결합과 유사한 패턴의 결합을 보여주는 인간화항체 조합을 확인할 수 있었으며, 일시발현 시킨 인간화 항체의 발현 정도를 확인한 sandwich ELISA 결과를 토대로 전반적으로 항체 발현이 되었음을 확인할 수 있었다 (표 15).
항체
(VH#/VL#)		 Capan-2 세포표면 결합 (%) expression
(sandwich ELISA)		 항체
(VH#/VL#)		 Capan-2 세포표면 결합 (%) expression
(sandwich ELISA)
VH8/VL3 28.5 1.6380 VH4/VL8 11.4 0.9107
VH1/VL5 27.2 1.7730 VH4/VL7 11 0.9468
VH4/VL4 18.1 1.5129 VH7/VL5 10.2 1.5669
VH4/VL5 16.9 2.1846 VH8/VL6 9.97 2.3048
VH1/VL4 15.8 1.1142 VH1/VL1 7.95 0.7590
VH8/VL4 15.6 0.6951 VH4/VL2 7.2 1.8891
VH1/VL2 13.5 1.3022 VH8/VL8 7.16 0.7846
VH7/VL4 12.7 1.0518 VH9/VL2 7.04 1.2997
VH7/VL3 11.5 1.8322 VH8/VL1 6.65 1.5327
VH8/VL2 11.4 2.1098 VH8/VL5 6.61 0.6999
상기 표 15에서 세포표면 결합(%)은 음성대조군 대비 세포표면에 항체가 결합한 양성률을 %로 나타낸 것이며, expression (sandwich ELISA)은 sandwich ELISA 의 450 nm OD value이다.
상기 표 15에 제작한 81종의 항체 중에서 Capan-2 세포 표면 결합(%)가 높은 20개 항체를 나타내었다. 표 12에서 확인할 수 있는 바와 같이, VH8/VL3 (중쇄8번/경쇄3번 조합의 항체; 즉, 표 14의 중쇄 가변영역 VH8을 포함하는 중쇄, 및 표 14의 경쇄 가변영역 VL3을 포함하는 경쇄를 포함하는 항체; 이하 같다), VH1/VL5, VH4/VL4, VH4/VL5, VH1/VL4, VH8/VL4, VH1/VL2, VH7/VL4, VH7/VL3, VH8/VL2, VH4/VL8, 및 VH4/VL7 항체가 Capan-2 세포 표면 결합이 우수하였다.
1차 일시발현에서 양성도가 높은 인간화항체 중쇄 및 경쇄 조합의 항체유전자를 48웰에서 6웰 스케일로 확장하여 일시발현을 다시 실행한 후 발현된 항체는 Capan-2 췌장암세포주와의 결합력을 재확인하였다 (도 8).
도 8과 같이, VH1/VL5, VH4/VL4, VH4/VL5, VH1/VL4, VH1/VL2, 및 VH7/VL4 항체가 Capan-2 세포 표면 결합이 우수하였다.
실시예 8. in vitro efficacy: T-cell engaging bispecific Ab / format optimization
실시예 8-1. 인간화 MP1 항체를 이용한 T cell engaging 이중항체의 발현
다양한 이중항체 형태 중에서 T 세포 활성 및 높은 항암 기능을 보이며, 동시에 Fc 부위를 보유하여 반감기가 원래의 항체에 가깝게 유지되는 tetravalent bispecific antibody 를 발현시켰다. T 세포 활성을 위한 항-CD3 항체는 T 세포 활성을 보이는 OKT3 항체의 인간화 항체 가변영역을 이용하였다. 인간화 OKT3 항체의 서열은 US 20090202532 A1 특허에서 인용하여 사용하였으며, 하기 표 13에서 서열번호 103, 서열번호 105 및 서열번호 106에 해당하는 서열이다. 서열번호 103은 인간화 OKT3 항체의 중쇄 가변영역 아미노산 서열이고, 서열번호 104는 인간화 OKT3 항체의 경쇄 가변영역 아미노산 서열이고, 서열번호 105는 인간화 OKT3 항체의 scFv 항체의 아미노산 서열을 나타낸다. 인간화 OKT3 항체는 중쇄 가변영역 서열 및 경쇄 가변영역 서열 사이에 [GGGS]n=5 linker 로 연결된 single chain Fv(scFv)로 구성하였고 인간화 MP1 항체의 경쇄 N 말단 (LCN version) 또는 C 말단 (LCC version)에 [GGGS]n=3 linker로 연결되도록 하였다.
인간화 OKT3 scFv는 interdomain disulfide 결합을 유도하여 stability 를 높이기 위해, 중쇄 가변영역의 44번 글리신 (glycine)과 경쇄 가변영역의 100번 글리신 (glycine)을 시스테인 (cysteine)으로 교체하였다 (Protein Engineering, Design & Selection vol. 25 no. 7 pp. 321- 329, 2012).
이중항체로 발현시키기 위해 인간화 MP1 중쇄 유전자 (상기 표 11에서 VH1 내지 VH9 중 어느 하나의 중쇄를 암호화하는 유전자) plasmid와 LCN 또는 LCC 타입의 인간화 MP1 경쇄-OKT3scFv 유전자 (상기 표 11에서 VL4 또는 VL5의 경쇄 상보성결정부위를 포함하는 경쇄 서열을 암호화하는 유전자-OKT3scFv 유전자) plasmid 를 1 : 1.7 비율로 ExpiCHO-S 세포에 transfection 하였다. 7일 또는 10일 경과 후, transfection 시킨 이중항체 배양액을 이용해 항체 발현 (항 human Ig 을 이용한 sandwich ELISA), 세포주 결합 (세포표면 염색 및 Flow cytometer 분석), Cytotoxicity assay 를 수행하였으며, 활성이 확인된 이중항체 배양액은 Protein A affinity chromatography 방법으로 정제하였다.
상기와 같이 제작한 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체의 서열(항-MUC1 항체의 경쇄 서열 및 항-CD3 항체의 scFv 서열)을 아래 표 13에 나타내었다. 항-CD3 항체 (OKT3 scFv)가 항-MUC1 항체의 경쇄의 C 말단에 결합한 형태를 LCC, 경쇄의 N 말단에 결합한 형태를 LCN으로 표기하였다.
아래 표 16에서 LCC 타입의 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체로 (도 9 참조), LCC version humanized MP1 Light chain #4-OKT3scFv는 표 14의 경쇄4번(VL4)의 경쇄 가변영역 (서열번호 91)을 포함하는 경쇄 서열 (서열번호 110)의 C 말단에 인간화 OKT3 scFv 항체 (서열번호 106)가 결합한 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체의 경쇄 서열 (서열번호 112)를 나타낸다. LCC version humanized MP1 Light chain #5-OKT3scFv는 표 14의 경쇄5번(VL5)의 경쇄 가변영역 (서열번호 92)을 포함하는 경쇄 서열 (서열번호 111)의 C 말단에 인간화 OKT3 scFv 항체 (서열번호 106)가 결합한 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체의 경쇄 서열 (서열번호 113)를 나타낸다.
아래 표 16에서 LCN 타입의 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체로 (도 12 참조), LCN version humanized MP1 Light chain #4-OKT3scFv은 표 14의 경쇄4번(VL4)의 경쇄 가변영역 (서열번호 91)을 포함하는 경쇄 서열 (서열번호 110)의 N 말단에 인간화 OKT3 scFv 항체 (서열번호 106)가 결합한 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체의 경쇄 서열 (서열번호 114)를 나타낸다. LCN version humanized MP1 Light chain #4-OKT3scFv은 표 14의 경쇄5번(VL5)의 경쇄 가변영역 (서열번호 92)을 포함하는 경쇄 서열 (서열번호 111)의 C 말단에 인간화 OKT3 scFv 항체 (서열번호 106)가 결합한 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체의 경쇄 서열 (서열번호 115)를 나타낸다.
상기 4종의 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체의 경쇄 서열에서 항-MUC1 항체의 경쇄와 인간화 OKT3 scFv 항체 사이는 [GGGS]n=3 linker로 연결하였다. 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체의 중쇄는 표 14의 중쇄1번 내지 중쇄9번(VH1 내지 VH9)의 중쇄 가변영역 (서열번호 78 내지 서열번호 86)을 포함하는 중쇄 서열을 사용하였다.
이중항체 발현에 사용한 CD3 항체 및 이를 이용한 이중항체의 경쇄 서열 서열번호
humanized OKT3
CD3 Ab VH		 QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSS 103
humanized OKT3
CD3 Ab VL		 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR 105
humanized OKT3 scFv QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKCLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQCTKLQITR 106
VL4 경쇄 EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSQSLLLSSNQKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYCQQCFSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 110
VL5 경쇄 EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVLLSSNQKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASSRETGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSFSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 111
LCC version humanized MP1 Light chain #4-OKT3scFv EIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSQSLLLSSNQKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYCQQCFSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGSGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKCLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQCTKLQITR 112
LCC version humanized MP1 Light chain #5-OKT3scFv EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVLLSSNQKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASSRETGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSFSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGECGGGSGGGSGGGSQVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKCLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQCTKLQITR 113
LCN version humanized MP1 Light chain #4-OKT3scFv QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKCLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQCTKLQITRGGGSGGGSGGGSEIVMTQSPGTLSLSPGERATLSCRSSQSLLLSSNQKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASTRESGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRVEPEDFAVYYCQQCFSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 114
LCN version humanized MP1 Light chain #5-OKT3scFv QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKCLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISRDNSKNTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARYYDDHYSLDYWGQGTPVTVSSGGGSGGGSGGGSGGGSGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQCTKLQITRGGGSGGGSGGGSEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVLLSSNQKNYLAWYQQKPGQAPRLLIYWASSRETGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQSFSYPLTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC 115
실시예 8-2. LCC 타입 인간화 MP1 이중항체의 기능 분석
실시예 8-1에서 제조한 LCC 타입의 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체에 대해서 MUC1 항원에 대해 양성인 AsPC1 췌장암 세포 표면 결합력과 세포독성 분석 (Cytotoxicity assay)를 수행하였다. 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체가 단백질 수준으로 발현됨을 항 human Ig/항 human Ig-HRP를 이용한 Sandwich ELISA로 확인하였으며 (표 17), 이들 이중항체들은 MUC1 항원 양성인 췌장암 세포인 AsPC1에 결합함을 세포표면 염색 및 유세포분석을 통해 확인하였다 (도 10).
대조군으로는 항-mesothelin/OKTscFv 인간화 이중항체 (MSTN-OKT3)를 사용하였다. 상기 MSTN-OKT3는 국제 공개공보 (WO 2012/087962)에 기재된 h7D9.v3 항체의 서열을 사용하여, 상기 h7D9.v3 항체의 경쇄의 C 말단에 인간화 OKT3 scFv 서열 (서열번호 106)이 결합된 LCC 타입의 이중 특이 항체이다.
항체 Expression 항체 Expression
VH1/VL5 2.4501 VH1/VL4 1.8550
VH2/VL5 1.4389 VH2/VL4 1.2238
VH3/VL5 1.5525 VH3/VL4 1.2721
VH4/VL5 2.2260 VH4/VL4 1.5691
VH5/VL5 1.2155 VH5/VL4 0.7501
VH6/VL5 1.3825 VH6/VL4 0.9205
VH7/VL5 2.1425 VH7/VL4 1.5371
VH8/VL5 1.7722 VH8/VL4 1.6626
VH9/VL5 1.2984 VH9/VL4 1.0687
상기 표 17에서, expression (sandwich ELISA)은 sandwich ELISA 의 450 nm OD value이며, 일 예에서, 항체 "VH1/VL5"는 표 14의 중쇄1번(VH1)의 중쇄 가변영역 (서열번호 78)을 포함하는 중쇄 및 표 14의 경쇄5번(VL5)의 경쇄 가변영역 (서열번호 92)의 C 말단에 인간화 OKT3 scFv 항체 (서열번호 106)가 결합한 경쇄 (서열번호 113)를 포함하는 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체를 의미한다.
상기 표 17에서 항체들이 발현되었음에도 불구하고 도 10에서 유세포 분석에서 음성을 보이는 것은 인간화 항체 조합 과정에서 원래 항체의 친화력(affinity)를 소실하였기 때문이다. 또한, 도 10에서 확인할 수 있는 바와 같이, 이중 특이 항체 조합 중 경쇄4번-OKT3 scFv 항체와 함께 발현시킨 이중 특이 항체 조합 (즉, 표 14의 중쇄1번 내지 중쇄9번 중 어느 하나의 중쇄 가변영역과 경쇄4번의 경쇄 가변영역의 C 말단에 인간화 OKT3 scFv 항체가 결합한 경쇄를 포함하는 이중 특이 항치)은 모두 세포표면 결합이 나타났으나, 경쇄5번-OKT3 scFv 항체와 함께 발현시킨 이중 특이 항체 조합은, 중쇄1번/경쇄5번, 중쇄2번/경쇄5번, 중쇄7번/경쇄5번 조합만이 세포표면 결합이 나타났다.
발현시킨 이중 특이 항체들은 타깃 세포로서 Capan-2 와 AsPC-1 세포주를, 효능발휘 세포(effector cell)로서 사람 T 세포를 사용하여 Cytotoxicity assay 를 수행하였다. 타깃 세포와 효능발휘 세포의 비율은 1:10 으로 하였으며, 이중항체 투입양은 1 ug/ml로 동일하게 하였다. 48시간 후, 타깃세포의 사멸 여부는 EZ-Cytox (DogenBio, Cat.#: EZ-1000) 를 이용해 측정하고, 다음과 같은 공식으로 % Cytotoxicity 를 계산하고, 이를 도 11에 나타내었다.
% Cytotoxicity = (1-(항체투여 웰 측정값/타깃 및 효능세포 웰 측정값))X100
도 11에서 확인할 수 있는 바와 같이, 실시예 8-2에서 제조한 LCC 타입의 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체는 대조군 항체(MSTN-OKT3)보다 효과가 낮았으며, Cytotoxicity가 30% 미만으로 효과가 잘 보이지 않았다.
실시예 8-3. LCN 타입 인간화 MP1 이중항체의 기능 분석 (1)
실시예 8-1에서 제조한 LCN 타입의 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체에 대해서 MUC1 항원에 대해 양성인 Capan-1, AsPC1 췌장암 세포 표면 결합력과 세포독성 분석 (Cytotoxicity assay)를 수행하였다.
상기 표 16과 같이 발현시킨 LCN 타입의 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체가 단백질 수준으로 발현됨을 항 human Ig/항 human Ig-HRP를 이용한 Sandwich ELISA로 확인하였으며, 이들 이중 특이 항체들은 MUC1 항원 양성인 췌장암 세포인 Capan-1, AsPC1에 결합함을 세포표면 염색 및 유세포분석을 통해 확인하였다.
이러한 결과를 도 13 및 도 14에 나타내었다. 대조군으로는 표 12의 마우스 MUC1 항체의 중쇄 가변영역 (서열번호 77)을 포함하는 중쇄 및 표 14의 경쇄4번(VL4)의 경쇄 가변영역 (서열번호 91)을 포함하는 경쇄 서열 (서열번호 110)의 N 말단에 인간화 OKT3 scFv 항체가 결합한 경쇄를 포함하는 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체 (chi/4)를 사용하였다.
도 13 및 도 14에 나타난 바와 같이, 중쇄1번/경쇄4번 ("1/4", 즉, 표 14의 중쇄1번(VH1)의 중쇄 가변영역 (서열번호 78)을 포함하는 중쇄 및 표 14의 경쇄4번(VL4)의 경쇄 가변영역 (서열번호 91)의 N 말단에 인간화 OKT3 scFv 항체 (서열번호 106)가 결합한 경쇄 (서열번호 114)를 포함하는 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체; 이하 같다.), 중쇄4번/경쇄4번 ("4/4"), 중쇄7번/경쇄4번 ("7/4") 조합의 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체가 대조군과 비교하여 암세포에 대한 독성 효과가 우수한 것을 확인하였다.
이러한 결과는 LCC 타입의 이중 특이 항체 (실시예 8-2)보다 LCN 타입의 이중 특이 항체 (실시예 8-3)가 Cytotoxicity를 보이는 데 용이한 암세포와 T 세포간 미세거리를 좀 더 가깝게 유지하여 결합할 수 있으며, 이를 통해 좀더 높은 Cytotoxicity를 보일 수 있음을 나타낸다.
실시예 8-4. LCN 타입 인간화 MP1 이중항체의 기능 분석 (2)
실시예 8-1에서 제조한 LCN 타입의 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체에 대해서 MUC1 항원에 대해 양성인 AsPC-1 및 Capan-2 (췌장암 세포주), SNU-601 (위암 세포주), T47D (유방암 세포주) 세포주에 대해 Cytotoxicity assay를 수행하여, in vitro 세포 독성 효과를 확인하고 그 결과를 도 15에 나타내었다.
항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체로는 인간화 비율이 더 높은 중쇄1번/경쇄5번 조합의 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체, 즉, 표 14의 중쇄1번(VH1)의 중쇄 가변영역 (서열번호 78)을 포함하는 중쇄 및 표 14의 경쇄5번(VL5)의 경쇄 가변영역 (서열번호 92)의 N 말단에 인간화 OKT3 scFv 항체 (서열번호 106)가 결합한 경쇄 (서열번호 115)를 포함하는 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체를 사용하였다.
도 15에 나타난 바와 같이, 투여한 LCN 타입의 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체의 농도에 비례하여 암세포에 대한 세포 독성 효과를 보이는 것을 확인하였다.
실시예 9. 췌장암 마우스 실험모델을 이용한 인간화 이중항체의 치료효과 평가
항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체의 in vivo 면역항암 효과를 확인하기 위해, 인체 유래의 췌장암 세포주인 AsPC-1을 이식한 NOG 마우스 동물 모델을 대상으로 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체의 투여에 의한 종양의 크기 감소 여부를 평가하였다. 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체는 실시예 8-4에서 사용한 항체와 동일한 항체를 사용하였다 (LCN 타입의 중쇄1번/경쇄5번 조합의 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체).
마우스 모델 준비
마우스는 실질적인 사람 면역세포에 의한 항체의 항암 효과를 평가하기 위해 T 세포, B세포, NK세포 및 대식세포, 수지상세포의 기능이 결핍되어 있는 NOG 마우스(NOD/Shi-scid, IL-2RγKO mice, 코아텍)를 사용하였다. 5x106개의 췌장암 세포주 AsPC-1을 8주령의 NOG 마우스 옆구리에 피하 주사(I.P., intraperitoneal injection)하고 1-2주 경과 후에 100 ~ 150 mm3의 종양의 부피가 형성된 마우스를 각 그룹당 5마리씩을 선별하여 실험에 사용하였다.
Human PBMC 준비
Zenbio사로부터 구입한 Human Cryopreserved Peripheral Blood Mononuclear Cell(PBMC)은 항체 주입 10일 전에 10% FBS가 포함된 RPMI1640(GeneDireX,Cat#:CC112-0500)으로 해동 후 1일차에 IFN-r(jw크레아젠, Cat#: HIFNG-100) 250 ng/ml 처리하고 2일차에 IL-2(jw크레아젠, JW-H031-0100) 30 ng/ml, OKT3 항체(Miltenyi Biotec, Cat#:130-093-387) 50 ng/ml을 첨가한 후 5일간 놔두었다. 그 후 배양 6일차부터 배양 16일차까지 IL-2 30 ng/ml, IFN-r 50 ng/ml를 10% FBS가 첨가된 RPMI1640 배지(에서 배양하여 PBMC의 수를 확장시켰다.
인간화 MP1 이중 항체의 항암 효능 평가
종양이 형성된 NOG 마우스는 여섯 그룹으로 나눠 0일차에 한 그룹은 PBS 200 μl를 복강(intraperitoneal)에 주입하고, 다섯 그룹의 마우스는 마리당 5x106 세포수의 PBMC를 복강에 주입하였다 (즉, 1XPBS로 5×106 cells/0.2 mL 되도록 현탁액을 조제하여 복강에 주입하였다). 이 후 네 그룹의 마우스에 상기 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체를 각각 1 mg/kg, 3 mg/kg로 PBMC 주입 후 3, 7, 10, 14일차에 총 4회 정맥내 주사 (I.V., intravenous injection)한 후 피하에 주입한 암세포의 크기를 관찰 및 측정하였다.
도 16은 항-MUC1/항-CD3 이중 특이 항체를 이용한 사람 PBMC를 주입한 인간화 조건의 마우스 췌장암 동물 모델에서의 in vivo 항암 효능을 나타내는 결과이다. PBMC만 투여군 (Control-PBMC) 대비 항체 투여군 (MP1-1mg/kg 및 MP1-3mg/kg)이 높은 항암 효과 (Tumor growth inhibition; TGI)를 나타내었다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> Cyron Therapeutics Co., Ltd. <120> Antibody specifically binding to MUC-1 and uses thereof <130> DPP20215659KR <160> 115 <170> koPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR1 <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Xaa is Asp or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (5) <223> Xaa is Asn, Ser, or His <400> 1 Xaa Tyr Trp Met Xaa 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR1 <400> 2 Asp Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR1 <400> 3 Asp Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR1 <400> 4 Ser Tyr Trp Met Asn 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR1 <400> 5 Ser Tyr Trp Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR1 <400> 6 Ser Tyr Trp Met His 1 5 <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR2 <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Xaa is Gln, Phe, or Val <220> <221> MOD_RES <222> (3) <223> Xaa is Arg or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> Xaa is Asn, Ser, Gln, or Tyr <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Xaa is Pro or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> Xaa is Asn or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (9) <223> Xaa is Tyr, Gly, or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> Xaa is Glu or Thr <220> <221> MOD_RES <222> (11) <223> Xaa is Thr or Lys <220> <221> MOD_RES <222> (12) <223> Xaa is Tyr or Glu <220> <221> MOD_RES <222> (14) <223> Xaa is Ser, Ala, or Val <220> <221> MOD_RES <222> (15) <223> Xaa is Asn, Gln, or Ala <400> 7 Xaa Ile Xaa Xaa Lys Xaa Tyr Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Tyr Xaa Xaa Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR2 <400> 8 Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Asn Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 9 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR2 <400> 9 Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ser Gln Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 10 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR2 <400> 10 Gln Ile Arg Ser Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Thr Tyr Tyr Ala Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 11 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR2 <400> 11 Phe Ile Arg Ser Lys Ala Tyr Gly Gly Thr Thr Glu Tyr Ala Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 12 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR2 <400> 12 Gln Ile Lys Gln Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Lys Tyr Tyr Val Gln Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 13 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR2 <400> 13 Gln Ile Lys Gln Lys Pro Tyr Gly Gly Glu Lys Tyr Tyr Val Gln Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 14 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR2 <400> 14 Gln Ile Arg Asn Lys Pro Tyr Asn Tyr Glu Lys Tyr Tyr Ala Gln Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 15 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR2 <400> 15 Val Ile Arg Tyr Lys Pro Tyr Gly Ser Glu Lys Tyr Tyr Ala Gln Ser 1 5 10 15 Val Lys Gly <210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR3 <220> <221> MOD_RES <222> (10) <223> Xaa is Met or Phe <400> 16 Ala Met Ile Thr Ser Asp Gly Tyr Ala Xaa Asp Tyr 1 5 10 <210> 17 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR3 <400> 17 Ala Met Ile Thr Ser Asp Gly Tyr Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 18 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VH-CDR3 <400> 18 Ala Met Ile Thr Ser Asp Gly Tyr Ala Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 19 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VL-CDR1 <220> <221> MOD_RES <222> (1) <223> Xaa is Lys or Arg <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> Xaa is Ser or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Xaa is Leu or Val <220> <221> MOD_RES <222> (8) <223> Xaa is Leu, Tyr, or His <220> <221> MOD_RES <222> (11) <223> Xaa is Asn or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (12) <223> Xaa is Gln or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (13) <223> Xaa is Lys or Tyr <400> 19 Xaa Xaa Ser Gln Ser Xaa Leu Xaa Ser Ser Xaa Xaa Xaa Asn Thr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 20 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VL-CDR1 <400> 20 Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Leu Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 21 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VL-CDR1 <400> 21 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Leu Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 22 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VL-CDR1 <400> 22 Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 23 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VL-CDR1 <400> 23 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Leu Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 24 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VL-CDR1 <400> 24 Arg Ala Ser Gln Ser Val Leu Leu Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 25 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VL-CDR1 <400> 25 Arg Ala Ser Gln Ser Val Leu Leu Ser Ser Ser Gln Lys Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 26 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VL-CDR1 <400> 26 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser Ser Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu 1 5 10 15 Ala <210> 27 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VL-CDR2 <220> <221> MOD_RES <222> (2) <223> Xaa is Ala or Gly <220> <221> MOD_RES <222> (4) <223> Xaa is Thr or Ser <220> <221> MOD_RES <222> (6) <223> Xaa is Glu or Ala <220> <221> MOD_RES <222> (7) <223> Xaa is Ser or Thr <400> 27 Trp Xaa Ser Xaa Arg Xaa Xaa 1 5 <210> 28 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VL-CDR2 <400> 28 Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser 1 5 <210> 29 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_VL-CDR2 <400> 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Thr Phe Gly Gln Cys Thr 225 230 235 240 Lys Leu Gln Ile Thr Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 245 250 255 <210> 115 <211> 255 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic_LCN version humanized MP1 Light chain #5-OKT3scFv <400> 115 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Cys Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val 50 55 60 Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Ala Phe 65 70 75 80 Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Ser Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Pro Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr 130 135 140 Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile 145 150 155 160 Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln 165 170 175 Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu 180 185 190 Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp 195 200 205 Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr 210 215 220 Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Cys Thr 225 230 235 240 Lys Leu Gln Ile Thr Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 245 250 255

Claims (19)

  1. (1) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR1, 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR2, 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR3, 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR1, 서열번호 28의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR2, 및 서열번호 35의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR3;
    (2) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR1, 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR2, 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR3, 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR1, 서열번호 28의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR2, 및 서열번호 34의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR3;
    (3) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR1, 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR2, 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR3, 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR1, 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR2, 및 서열번호 35의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR3;
    (4) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR1, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR2, 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR3, 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR1, 서열번호 28의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR2, 및 서열번호 34의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR3;
    (5) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR1, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR2, 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR3, 서열번호 24의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR1, 서열번호 29의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR2, 및 서열번호 35의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR3; 또는
    (6) 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR1, 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR2, 서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어지는 VH-CDR3, 서열번호 23의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR1, 서열번호 28의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR2, 및 서열번호 34의 아미노산 서열로 이루어지는 VL-CDR3을 포함하는, 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 제1항에 있어서,
    (1) 서열번호 78의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 89의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변영역;
    (2) 서열번호 78의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 91의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변영역;
    (3) 서열번호 78의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 92의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변영역;
    (4) 서열번호 81의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 91의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변영역;
    (5) 서열번호 81의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 92의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변영역; 또는
    (6) 서열번호 84의 아미노산 서열로 이루어지는 중쇄 가변영역 및 서열번호 91의 아미노산 서열로 이루어지는 경쇄 가변영역을 포함하는,
    항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서, 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편은, MUC1을 발현하는 암세포의 세포사멸을 유도하는 활성을 갖는 것인, 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항-MUC1 항체는 단클론 항체인, 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 서열번호 109의 아미노산 서열을 포함하는 펩타이드를 특이적으로 인식하는 것인, 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 상기 항-MUC1 항체의 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항-MUC1 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체인, 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 따른 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 항-CD3 항체의 항원 결합 단편을 포함하고,
    상기 항-CD3 항체의 항원 결합 단편은 상기 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 경쇄의 N 말단에 직접 또는 링커를 통해 연결된 것이고,
    상기 항-CD3 항체의 항원 결합 단편은 항-CD3 항체의 scFv인 것인,
    이중 특이 항체.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서,
    상기 항-CD3 항체는, OKT3 항체, UCHT-1 항체, 또는 SP34 항체인, 이중 특이 항체.
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 제9항에 있어서, 상기 항-CD3 항체의 항원 결합 단편은,
    서열번호 97의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 (VH-CDR1),
    서열번호 98의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 (VH-CDR2),
    서열번호 99의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 (VH-CDR3),
    서열번호 100의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 (VL-CDR1),
    서열번호 101의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 (VL-CDR2), 및
    서열번호 102의 아미노산 서열로 이루어지는 폴리펩타이드 (VL-CDR3)
    를 포함하는 것인, 이중 특이 항체.
  15. 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제9항의 이중 특이 항체를 포함하는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암은 혈액암, 골수암, 갑상선암, 자궁암, 피부암, 흑색종, 유방암, 대장암, 폐암, 위암, 전립선암, 및 췌장암으로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상의 암인, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  17. 제1항, 제2항, 및 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항의 항-MUC1 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 또는 제9항의 이중 특이 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  18. 제17항의 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 재조합 벡터.
  19. 제18항의 재조합 벡터를 포함하는, 재조합 세포.
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