ES2321298T3

ES2321298T3 - Moleculas de reconocimiento para el tratamiento y la deteccion de tumores.

Info

Publication number: ES2321298T3
Application number: ES04704545T
Authority: ES
Inventors: Steffen Goletz; Antje Danielczyk; Renate Stahn; Uwe Karsten
Original assignee: Glycotope GmbH
Current assignee: Glycotope GmbH
Priority date: 2003-01-23
Filing date: 2004-01-23
Publication date: 2009-06-04
Anticipated expiration: 2024-01-23
Also published as: PT2053063E; SI2053063T1; WO2004065423A3; WO2004065423A2; EP2053063A1; US9845361B2; PT1585770E; SI1585770T1; CY1108965T1; ES2427832T3; US20150005474A1; DK1585770T3; US8779102B2; EP1585770A2; DE502004008910D1; DE10303664A1; DK2053063T3; CY1114409T1; ATE421537T1; EP1585770B1

Abstract

Molécula de reconocimiento, caracterizada en que comprende una secuencia de aminoácidos, que contiene (i) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ó 2 y (ii) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ó 4 y (iii) la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 5 ó 6 y se une de forma específica al epítopo tumoral MUC1 glicosilado de modo que la fuerza de la unión en comparación con la unión al péptido no glicosilado de la misma longitud y secuencia peptídica aumenta al menos en un factor de 20.

Description

Moléculas de reconocimiento para el tratamiento y la detección de tumores.

La invención se refiere a moléculas de reconocimiento que se dirigen contra tumores, composiciones farmacéuticas que comprenden las moléculas de reconocimiento, procedimientos para la producción de las moléculas de reconocimiento y al uso de las moléculas de reconocimiento para la producción de una composición farmacéutica para el diagnóstico y terapia de enfermedades tumorales.

Las enfermedades tumorales pertenecen a las enfermedades más frecuentes de organismos, en particular de mamíferos como los seres humanos. El tratamiento con éxito de la enfermedad tumoral depende en particular del estado de desarrollo del tumor en el se empieza la terapia. Es ventajoso si se puede empezar la terapia a un tiempo, cuando el tumor muestra una expansión y difusión mínimas, entendiéndose por expansión el tamaño individual del tejido tumoral y por difusión la posible metástasis o infiltración en los órganos adyacentes. Un organismo que muestra una enfermedad tumoral, secreta determinadas sustancias complejas o moléculas más sencillas, que se pueden emplear para el diagnóstico de tumores en una fase temprana de la enfermedad - es decir, para tumores más pequeños. Las más conocidas de estas estructuras son marcadores tumorales. Los marcadores tumorales son generalmente sustancias químicas, que son más o menos específicas para un tipo de tumor determinado, o que aparecen aumentadas en asociación con un tumor. Los marcadores tumorales pueden por ejemplo ser de naturaleza celular, como por ejemplo oncogenes, determinados receptores de hormonas o antígenos de membrana, como por ejemplo CA 2, CA 3, CA 19-19 y otros. Los marcadores tumorales pueden sin embargo también ser marcadores humorales, que bien son producidos por el tumor o son inducidos por el tumor. Al grupo de los marcadores tumorales producidos por el tumor pertenecen en particular los antígenos, hormonas, enzimas y otros compuestos asociados a tumor. Los marcadores tumorales humorales inducidos por el tumor son por ejemplo enzimas, como la fosfatasa alcalina o por ejemplo la proteína de fase aguda (por ejemplo ferritina). Puesto que los marcadores tumorales en el estado de la técnica preferiblemente se detectan con métodos inmunológicos, también se usa para los marcadores tumorales con frecuencia el sinónimo antígeno tumoral. Antígenos tumorales conocidos son antígenos oncofetales, antígenos asociados a los grupos sanguíneos, antígenos específicos de órgano y otros antígenos, como por ejemplo CA 15-3.

El diagnóstico del cáncer con marcadores tumorales con moléculas de reconocimiento muestra muchos inconvenientes. De esta manera determinados marcadores tumorales también pueden aparecer en enfermedades no cancerosas, por lo que las moléculas de reconocimiento establecidas muestran una reacción positiva; además una no interacción de la molécula de reconocimiento no significa, que no está presente una enfermedad tumoral. Otro inconveniente es que las moléculas de reconocimiento conocidas en general son inespecíficas. Esto quiere decir que una prueba positiva sólo en casos poco frecuentes muestra de una forma segura un tipo específico de la enfermedad tumoral. Otro inconveniente, completamente decisivo de las moléculas de reconocimiento conocidas es además, que sólo se pueden usar condicionalmente para el seguimiento del desarrollo de tumores, por ejemplo tras una operación. Es decir, en general los marcadores tumorales conocidos no se pueden aplicar para la detección precoz o para el tratamiento posterior, especialmente no para profilaxis.

Junto a estos inconvenientes generales, se dan para las moléculas de reconocimiento contra antígenos tumorales, que sólo se diferencian en su glicosilación de los correspondientes antígenos en tejidos normales, inconvenientes especiales. Los anticuerpos deben ser dependientes de glicosilación y reflejar el cambio en el estado de glicosilación del antígeno en el tumor. De esta manera por ejemplo la glicosilación de MUC1 cambia en células de tumor de mama. Muestra una fuerte reducción en la longitud de la cadena de O-glicano y una reducción en la O-acetilación del ácido siálico.

Un inconveniente más de las moléculas de reconocimiento contra marcadores tumorales es que sólo hacen reconocible el tumor cuando este ya alcanzado un tamaño crítico. Es decir, los primeros estadios del crecimiento del tumor no se pueden determinar con las moléculas de reconocimiento conocidas, que se preparan contra marcadores tumorales.

La mucina polimorfa epitelial MUC1 es como molécula completa un reconocido marcador tumoral. Price M. et al., Tumor Biology 1989, 19 (1): 1-20 han descrito el análisis de una pluralidad de anticuerpos monoclonales contra la mucina MUC1. Debido a la complejidad de la molécula, que es muy grande, está fuertemente glicosilada, extracelular esencialmente compuesta de un gran número de polimorfos de repeticiones en tándem de 20 residuos de aminoácidos y respecto a las repeticiones en tándem está glicosilada de forma heterogénea, MUC1 posee una pluralidad de epítopos. Un inconveniente existente es, que no se sabe, qué epítopo de MUC1 como estructura diana es óptimo para la terapia y diagnóstico tumoral. Además es desventajoso, que los anticuerpos específicos de MUC1 convencionales (que producen un reconocimiento relativamente bueno de MUC1 en determinados tumores) también reconocen en alto grado tal MUC1 que se secreta de las células tumorales en el suero (shedding). Esta gran unión a MUC1 presente en suero en los pacientes de tumores es obviamente un inconveniente en la terapia de enfermedades tumorales con tales anticuerpos específicos de MUC1. Un inconveniente adicional es, que la mayoría de los anticuerpos específicos de MUC1 también muestran unión a muchos tejidos normales.

El objeto de la invención es por lo tanto, preparar moléculas de reconocimiento, con las que se pueda detectar un tumor de forma fácil, segura y eficaz, y que además se puedan usar en la profilaxis, terapia y/o tratamiento de tumores y metástasis, y que no muestran ninguna o poca unión a MUC1 secretada en suero y que no muestran ninguna o poca unión a tejidos normales.

La invención resuelve este problema técnico a través de la preparación de moléculas de reconocimiento que comprenden una secuencia de aminoácidos, que contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ó 2 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ó 4 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 5 ó 6, por lo que las moléculas de reconocimiento se unen de una manera específica al epítopo tumoral MUC1 glicosilado, que la fuerza de la unión en comparación con la unión al péptido no glicosilado de la misma longitud y secuencia peptídica aumenta en un factor >20.

Las definiciones de los términos, que se hacen a continuación, son aplicables mutatis mutandis a las explicaciones previamente hechas, estas y las siguientes.

Mediante el término molécula de reconocimiento se entiende, según la invención, una molécula que, especialmente en condiciones rigurosas, se une específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado. Las condiciones rigurosas son por ejemplo altas concentraciones de sal y lavados excesivos con detergentes suaves como NP-40 o Tween.

Mediante "epítopo tumoral MUC1 glicosilado" se entiende según la invención un epítopo que comprende al menos una secuencia PDTRP de las repeticiones en tándem de MUC1 y está glicosilado con GalNAc o Gal-GalNAc en la treonina de PDTRP.

Mediante una unión específica del epítopo tumoral MUC1 glicosilado se entiende según la invención una unión de las moléculas de reconocimiento según la invención que comprenden una de las siguientes propiedades de unión:

a): Unión en los métodos de prueba como se describe en el ejemplo 5 a la región PDTRP glicosilada dentro de una secuencia de repeticiones en tándem de MUC1, que comprende de 1 a 1,5 repeticiones en tándem (molécula de 30 aminoácidos ver ejemplo 5) y que está glicosilada en treonina con GalNAcalfa1-O-Thr (denominada en lo siguiente como GalNAc) o Galbeta1-3GalAcalfa1-O-Thr (en lo siguiente como Gal-GalNAc), estando la fuerza de la unión en comparación con el péptido no glicosilado de la misma longitud y secuencia peptídica aumentada múltiples veces. Se define un aumento múltiple en el que la proporción de unión del glicopéptido de MUC1 glicosilado en PDTRP respecto al péptido no glicosilado en una prueba como se describe en el ejemplo 5.1 (con el péptido MUC1 allí descrito, o sea glicopéptido con una longitud de 30 aminoácidos, que corresponde a 1,5 repeticiones en tándem), alcanza un factor de >4,5.

b): Unión en los métodos de prueba como se describe en el ejemplo 5.2 a múltiples repeticiones en tándem de MUC1 no glicosiladas, que consisten al menos de 3 repeticiones en tándem preferiblemente 5 repeticiones en tándem.

c): Una unión reducida estadísticamente significativa a MUC1 presente en suero de pacientes de carcinoma de colon, que se secreta de las células tumorales, en comparación con el anticuerpo de prueba CA15-3 (ejemplo 11) y HMFG-1 (ver también el ejemplo 11). El método de prueba se explica con más detalle en el ejemplo 11.

d): La interacción entre el antígeno y la molécula de reconocimiento como se describe en el ejemplo 6 aumentará o no estará influenciada mediante tratamiento con neuraminidasa.

e): No se produce unión o es casi no detectable a tejido normal de colon y se da una unión específica fuerte al tejido tumoral de colon (ver el ejemplo 6).

Las moléculas de reconocimiento según la invención poseen debido a las secuencias de aminoácidos que comprenden definidas según la invención, que se mencionan anteriormente y a continuación, una estructura que produce la interacción específica de las moléculas de reconocimiento con MUC1 en forma de una unión específica al epítopo tumoral MUC1 glicosilado con las propiedades de unión descritas.

En una forma de realización preferida de la invención la molécula de reconocimiento comprende una secuencia de aminoácidos, que contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 5, uniéndose la molécula de reconocimiento específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado.

En una forma de realización preferida adicional de la invención la molécula de reconocimiento comprende una secuencia de aminoácidos, que contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 4 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 6, uniéndose la molécula de reconocimiento específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado. Estas moléculas de reconocimiento muestran un aumento en la unión de un factor >20 según a). De forma ventajosa estas moléculas de reconocimiento muestran en gran parte al menos una de las siguientes propiedades:

f): una unión a repeticiones en tándem múltiples no glicosiladas como en b) con un factor de la proporción de unión a una repetición en tándem de MUC1 no glicosilada con 5 repeticiones en tándem respecto a un péptido de MUC1 no glicosilado con una repetición en tándem de >8 (para la secuencia del péptido y método de prueba ver el ejemplo 5). El método de prueba para la determinación del factor se explica con más detalle en el ejemplo 5.2.

g): un aumento en la fuerza de la unión por medio de un aumento en el número de repeticiones en tándem glicosiladas (región PDTR glicosilada múltiple) (ver el ejemplo 5.3).

De una manera ventajosa las moléculas de reconocimiento más preferidas poseen todas las propiedades de unión de a) a g).

Las moléculas de reconocimiento según la invención combinan las propiedades descritas y son de este modo ventajosas para el diagnostico y terapia tumorales. No se diferencian de anticuerpos conocidos debido sólo a su nueva secuencia, sino también debido a sus especificidades definidas contra MUC1, uniéndose específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado, mostrando sólo unión baja contra MUC1 en suero de pacientes de carcinoma de colon y prácticamente no uniéndose a tejido normal de colon y con fuerza a tejido tumoral de colon. Además las moléculas de reconocimiento según la invención reconocen tumores de colon ya como carcinoma in situ, pero no displasias leves y diferencian por lo tanto entre tumores peligrosos y enfermedades benignas. Con estas propiedades y su alta afinidad son especialmente adecuadas para el uso terapéutico pero también para el diagnóstico y por lo tanto ventajosas frente a anticuerpos contra MUC1 conocidos.

La combinación de propiedades de las moléculas de reconocimiento según la invención es sorprendente, ya que hasta ahora de los múltiples anticuerpos conocidos contra MUC1 no había ningún anticuerpo con las propiedades correspondientes.

Esto muestra la superioridad de las moléculas de reconocimiento según la invención frente a los anticuerpos de MUC1 convencionales.

Los anticuerpos convencionales tienen de esta manera claros inconvenientes frente a las moléculas de reconocimiento según la invención, como se describe brevemente a continuación a modo de ejemplo.

Ejemplos para diferencia en la especificidad fina: HMFG-1 (US5804187, US6315997) y C595 (WO0244217) se unen en los estudios mostrados en el ejemplo 5.1 al péptido de MUC1 independiente de la glicosilación y por lo tanto no al epítopo tumoral MUC1 glicosilado. HMFG-1 por ejemplo se une además también a tejido de colon normal. Por eso no muestran la unión ventajosa de las moléculas de reconocimiento según la invención. SM3 (US5683674), que proviene de inmunización con MUC1 derivada de material no tumoral humano (gotas de grasa de leche), se une a péptidos derivados de MUC1 glicosilados y no glicosilados según la prueba del ejemplo 5.1 casi de igual modo con un ligero aumento de un factor de ca. 1,5 y no muestra por lo tanto la unión ventajosa al epítopo tumoral. Además SM3 no muestra una marcada dependencia del número de repeticiones en tándem de MUC1 no glicosilados ni de los glicosilados (ejemplo 5.2 y 5.3). DF3 se describe como anticuerpo específico de MUC1, que se une preferiblemente independiente de glicosilación a péptidos derivados de MUC1 (WO9320841, US5506343). Además la unión de DF3 a MUC1 o células tumorales que llevan MUC1 se reduce drásticamente o se inhibe completamente mediante el tratamiento con neuraminidasa (Dai J. et al., 1998; Hinoda et al., 1992). HMGF-1 y DF-3 se unen además con fuerza a MUC1 tumoral en suero, sobre todo en pacientes de carcinoma de mama pero también en pacientes de carcinoma de colon (ver el ejemplo 11). Por lo tanto no muestra las propiedades de unión ventajosas de las moléculas de reconocimiento según la invención.

La caracterización de las moléculas de reconocimiento se realiza según la definición anterior esencialmente a través de las propiedades de unión respecto a tejido de colon normal y tumoral. Esto muestra que las moléculas de reconocimiento son ventajosas para la terapia y diagnóstico de tumores de colon y sus metástasis frente a los anticuerpos anti-MUC1 convencionales. No obstante las moléculas de reconocimiento no son solo ventajosas para el tratamiento y diagnóstico de carcinomas de colon y otros tumores gastrointestinales, sino también para otras enfermedades tumorales y metástasis, preferiblemente enfermedades tumorales y metástasis positivas para MUC1, por ejemplo carcinomas de mama, tumores gastrointestinales, que comprenden carcinomas de colon, carcinomas de estómago, cáncer colorrectal y cáncer del intestino delgado, carcinomas de páncreas, carcinomas de ovario, cáncer de pulmón, carcinomas de células renales, mieloma múltiple y/o sus metástasis. Esto se sostiene mediante los datos del ejemplo 6, en el que se muestra la unión específica de las moléculas de reconocimiento a células tumorales de diferentes enfermedades tumorales. La descripción detallada sobre las propiedades de unión respecto al carcinoma de colon sirve para ilustrar las ventajas y para la determinación de parámetros adecuados para la caracterización de la unión de las moléculas de reconocimiento según la invención.

En una forma de realización preferida una molécula de reconocimiento según la invención que se une específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado comprende:

a): una primera secuencia de aminoácidos, que contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ó 2 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ó 4 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 5 ó 6; y

b): una segunda secuencia de aminoácidos, que contiene la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 7 u 8 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 9 ó 10 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 11 ó 12.

La primera y segunda secuencias de aminoácidos pueden estar presentes en una o más, aquí preferiblemente dos, polipéptidos.

En lo siguiente las moléculas de reconocimiento según la invención, que se unen específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado en el sentido de la invención, para simplificar también se denominarán moléculas de reconocimiento que se unen a MUC1 o específicas.

Las moléculas de reconocimiento preferidas que se unen a MUC1 se caracterizan en que comprenden una serie definida de secuencias de aminoácidos individuales. La combinación de secuencias de aminoácidos produce una estructura de las moléculas de reconocimiento, que como propiedad muestra la combinación descrita anteriormente de las propiedades de unión respecto al epítopo tumoral MUC1 glicosilado. La secuencia de aminoácidos de estas moléculas de reconocimiento comprende uno o dos tripletes de secuencias definidas. Estas secuencias representan los dominios de unión y definen la especificidad de la molécula de reconocimiento. La molécula de reconocimiento de 1 triplete comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ó 2 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ó 4 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 5 ó 6. Las moléculas de reconocimiento específicas de MUC1, que están definidas por dos tripletes, comprenden para el primer triplete la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ó 2 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ó 4 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 5 ó 6 y para el segundo triplete la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 7 u 8 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 9 ó 10 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 11 ó 12. Por lo tanto el primer y el segundo triplete pueden estar presentes en una o más cadenas polipeptídicas, que en el último caso juntas forman la molécula de reconocimiento de unión. Posteriormente estos tripletes se denominan en el sentido de la invención secuencia triplete 1 para la primera secuencia de aminoácidos comprendida y secuencia triplete 2 para la segunda secuencia de aminoácidos comprendida, ver la definición a) y b) de la descripción anterior. La molécula de reconocimiento según la invención puede ser un anticuerpo, especialmente una IgG o IgM murina, quimérica o humana, una estructura scFv u otro fragmento derivado de anticuerpos como por ejemplo fragmentos Fab, F(ab)_{2}, Fv o F(v)_{2}.

En una forma de realización preferida las moléculas de reconocimiento que se unen a MUC1 según la invención comprenden como secuencia triplete 1 la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 5.

En una forma de realización preferida adicional las moléculas de reconocimiento que se unen a MUC1 según la invención comprenden como secuencia triplete 1 la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 4 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 6.

En una forma de realización preferida las moléculas de reconocimiento que se unen a MUC1 según la invención comprenden como secuencia triplete 1 la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 5 y como secuencia triplete 2 la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 7, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 9 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 11.

En una forma de realización preferida adicional las moléculas de reconocimiento que se unen a MUC1 según la invención comprenden como secuencia triplete 1 la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 2, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 4 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 6 y como secuencia triplete 2 la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 8, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 10 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 12.

En una forma de realización adicional una molécula de reconocimiento se puede modificar a través de una o más mutaciones en una o más secuencias de aminoácidos seleccionada de SEQ ID NO. 1 a 12, por lo cual se sustituyen aminoácidos individuales por aminoácidos con propiedades fisicoquímicas análogas, que básicamente no cambian la estructura tridimensional del dominio de unión de la molécula de reconocimiento con ventaja, de modo que se mantiene la especificidad a MUC1 de la molécula de reconocimiento. Los aminoácidos con propiedades fisicoquímicas análogas en el sentido de la invención se pueden agrupar en 6 grupos diferentes y se muestran en la tabla 1.

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TABLA 1 Aminoácidos con propiedades fisicoquímicas análogas sin tener en cuenta el tamaño molecular

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Las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO. 1 a 12 o sus modificaciones en una molécula de reconocimiento específica de MUC1 en el sentido de la invención forman estructuras espaciales, por ejemplo los denominados bucles, que se caracterizan en que poseen una estructura terciara y/o estructura cuaternaria definible. La región de unión de una molécula de reconocimiento con el antígeno MUC1 se forma con residuos de aminoácidos, que proporcionan hasta seis bucles variables en la superficie de la molécula, y que interaccionan específicamente con MUC1.

En una forma de realización adicional de la invención se proporcionan moléculas de reconocimiento que se unen específicamente a MUC1, en las que se suprime al menos una secuencia de las secuencias triplete, que no participa directamente en la interacción con el antígeno MUC1.

En una forma de realización adicional las moléculas de reconocimiento comprenden al menos una de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 a 12 o sus variantes descritas anteriormente duplicadas o repetidas, por lo cual estas duplicaciones también pueden estar presentes como variantes de la misma secuencia de aminoácidos. Todas las moléculas de reconocimiento descritas en este párrafo reconocen de forma ventajosa el antígeno MUC1 específicamente. En lo siguiente estas moléculas de reconocimiento, que en sentido estricto debido a la omisión o multiplicación de secuencias no llevan secuencias triplete, también se denominan a pesar esto como secuencia triplete 1 o secuencia triplete 2, para simplificar la comprensión.

En una forma de realización adicional, las moléculas de reconocimiento según la invención, que se unen específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado, comprenden secuencias de aminoácidos que muestran una homología de al menos el 60%, preferiblemente el 70%, más preferiblemente el 80%, lo más preferiblemente el 90% respecto a las secuencias SEQ ID NO. 1 a 12.

Las moléculas de reconocimiento en el sentido de la invención pueden comprender además secuencias marco, que separan una de otra las secuencias de aminoácidos comprendidas en la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ó 2, y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ó 4 y la secuencia de aminoácidos 5 ó 6 o sus variantes anteriormente descritas, y secuencias marco, que separan una de otra las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO. 7 u 8, y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 9 ó 10 y la secuencia de aminoácidos 11 ó 12, o sus variantes anteriormente descritas. La primera y segunda secuencias de aminoácidos pueden estar presentes en una o más, preferiblemente dos cadenas polipeptídicas. Estas secuencias marco se denominan en el sentido de la invención como espaciadores o secuencias framework y pueden tener diferentes longitudes y secuencias. Por lo tanto también están explícitamente incluidas tales moléculas de reconocimiento, en las que no todas las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO. 1 a 12 o sus variantes descritas anteriormente están separadas mediante un espaciador. Además las moléculas de reconocimiento tienen preferiblemente secuencias flanqueantes de aminoácidos adicionales, que en el sentido de la invención también se denominan secuencias marco.

Las secuencias marco tienen en particular la función de poner las secuencias de aminoácidos descritas, que son responsables es decir participan en la unión específica de las moléculas de reconocimiento a MUC1, en una configuración y estructura espacial adecuadas, de modo que se puede realizar la unión a MUC1. Se puede prever, que las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO. 1 a 12 sin al menos una secuencia de aminoácidos adicional como secuencia marco no se pueden unir al antígeno MUC1 específicamente en el sentido de la invención. Además, las secuencias marco pueden dar a las moléculas de reconocimiento por ejemplo la estabilidad biológica y química necesarias, de modo que se puede formar la estructura espacial eficazmente y mantener para la función y uso en una forma funcional adecuada, que incluye la unión a MUC1.

En una forma de realización preferida las secuencias triplete se insertan en proteínas existentes mediante intercambio de secuencias de aminoácidos y/o mediante adición, por lo cual las secuencias de proteínas existentes sirven como secuencias marco en el sentido de la invención, o las secuencias marco provienen de proteínas adecuadas. Por ello estas secuencias marco se pueden cambiar por ejemplo a través de mutaciones, delaciones o inserciones. Para ello el experto en la materia usa métodos conocidos de la biología molecular, bioquímica e ingeniería de proteínas. Las proteínas preferidas para esto son proteínas de la superfamilia de las inmunoglobulinas, inhibidores de proteasas, lectinas, proteínas con fardos de hélices y lipocalina, como se publican por ejemplo en: Nygren y Uhlen, 1997; Nuttall S.D. et al., 1999 y Skerra, 2000.

En una forma de realización preferida adicional las secuencias marco son secuencias marco de anticuerpos de una o varias especies o secuencias de aminoácidos que mimetizan las secuencias consenso de las secuencias marco de anticuerpos murinos, humanos y/o de otros mamíferos. Una secuencia consenso es una secuencia idealizada, en la que en cada posición se sitúa el aminoácido más frecuente, cuando se comparan entre si muchas secuencias existentes, por ejemplo de bases de datos de anticuerpos. Por lo tanto las moléculas de reconocimiento aquí preferidas se caracterizan en que, las secuencias marco para la primera secuencia triplete 1 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ó 2, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ó 4 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 5 ó 6, o sus variantes descritas anteriormente, que son secuencias marco de anticuerpos de la cadena pesada variable VH, que en la bibliografía también se denominan secuencias framework, y las secuencias marco para la segunda secuencia triplete 2 comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 7 u 8, la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 9 ó 10 y la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 11 ó 12, o sus variantes descritas anteriormente, que son secuencias marco de anticuerpos de la cadena ligera variable VL.

Además son preferidas secuencias marco de anticuerpos de anticuerpos de mamíferos, especialmente preferidas son las secuencias marco de anticuerpos de origen humano y/o murino. Las secuencias marco se pueden por lo tanto combinar de secuencias marco de anticuerpos de diferentes especies. Estas secuencias marco de anticuerpos son conocidas para el experto en la materia y accesibles en varias bases de datos como la base de datos Kabat (imuno.bme.nwu.edu) o la base de datos del Centro Nacional para la Información en Biotecnología (www.ncbi.nih.gov). También se pueden alargar estas estructuras marco de anticuerpos a través de más aminoácidos, y/o cambiar a través de una o más mutaciones, por ejemplo, deleciones y/o inserciones, manteniéndose la unión específica al epítopo tumoral MUC1 glicosilado.

Si en una variante preferida de la invención se combinan las secuencias triplete con secuencias marco de anticuerpos, la molécula de reconocimiento representa una cadena variable de un anticuerpo o una estructura derivada de ella.

Las secuencias marco de anticuerpos especialmente preferidas en el sentido de la invención son para la cadena pesada variable las secuencias de aminoácidos correspondientes a FRH1, FRH2, FRH3 y FRH4 en la tabla 2 y para la cadena ligera variable las secuencias de aminoácidos correspondientes a FRL1, FRL2, FRL3 y FRL4 en la tabla 2, por lo cual las secuencias de aminoácidos de las secuencias triplete 1 y 2 se corresponden con las SEQ ID NO. 1 a 12 de las regiones CDR correspondientes. Por lo tanto las cadenas de anticuerpo pesada (VH) o ligera (VL) están compuestas como sigue: la VH: FRH1-CDRH1-FRH2-CDRH2-FRH3-CDRH3-FRH4 y la VL: FRL1-CDRL1-FRL2-CDRL2-FRL3-CDRL3-FRL4. La tabla 2 ilustra las posiciones en detalle. Las posiciones de los aminoácidos individuales o secuencias de aminoácidos corresponden a la numeración de los aminoácidos en las moléculas de anticuerpo según Kabat.

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(Tabla pasa a página siguiente)

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TABLA 2

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Las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO. 32 y 33 corresponden a secuencias de aminoácidos con secuencias marco preferidas para la cadena pesada variable. Las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO. 34 y 35 corresponden a secuencias de aminoácidos con secuencias marco preferidas para la cadena ligera variable. Por lo tanto es preferida la combinación SEQ ID NO. 32 y 34. Más preferida es la combinación SEQ ID NO. 33 y 35.

Las técnicas y métodos usados para la producción de estas secuencias son conocidas para el experto en la materia, de la misma manera el experto en la materia es capaz de elegir secuencias marco y/o mutaciones adecuadas.

En el sentido de la invención las moléculas de reconocimiento específicas para MUC1 pueden existir en varios formatos. La estructura básica de la molécula de reconocimiento son una o más cadenas polipeptídicas, que comprenden la secuencia triplete 1 o las secuencias triplete 1 y 2 y las secuencias marco según la invención descritas anteriormente. Por ejemplo, las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada variable está unida con la secuencia marco y la secuencia triplete 1 y la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable con la secuencia marco y la secuencia triplete 2 de forma covalente o no covalente, y pueden estar en una o más cadenas polipeptídicas. Varias cadenas polipeptídicas pueden estar unidas de forma covalente, por ejemplo a través de puentes disulfuro, o de forma no covalente, como molécula de reconocimiento.

A los diferentes formatos de las moléculas de reconocimiento según la invención pertenecen en particular las uniones de secuencias de tripletes con secuencias de aminoácidos más allá de las secuencias marco descritas anteriormente. En una variante preferida por lo tanto las moléculas de reconocimiento según la invención comprenden junto a las secuencias de triplete y las secuencias marco más secuencias accesorias. Las secuencias accesorias son en particular secuencias de aminoácidos, que primariamente no están implicadas en la configuración espacial de las secuencias de triplete tal como en forma de secuencias marco, sin embargo pueden tener influencia en esta de forma ventajosa a través de interacciones secundarias o terciarias. Por ejemplo las secuencias accesorias estabilizan el anticuerpo en forma de dominios constantes de un anticuerpo y producen una dimerización, produciéndose de esta manera una unión mejorada del anticuerpo, o por ejemplo una fusión de un scFv con un dominio de una proteína de la envuelta de un bacteriófago produce un aumento en la actividad de la unión de scFv, como se publica por ejemplo en Jensen K.B. et al., 2002.

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En una forma de realización las moléculas de reconocimiento pueden comprender secuencias de aminoácidos con secuencias marco basadas en anticuerpos y junto a las secuencias triplete secuencias accesorias adicionales. Las secuencias accesorias tienen en particular al menos una de las siguientes funciones:

a): Unión de una secuencia triplete con sus correspondientes secuencias marco adecuadas con al menos otra secuencia triplete más con sus correspondientes secuencias marco adecuadas, para por ejemplo crear o mejorar una capacidad de unión;

b): la estabilización de dominios, por ejemplo mediante un enlazador entre dos dominios de proteína o secuencias de aminoácidos, que interaccionan con otro en la misma o en una segunda cadena;

c): funciones efectoras para fines inmunológicos, por ejemplo mediante fusión con partes Fc de anticuerpos, quimioquinas, citoquinas, factores de crecimiento o partes de los mismos, o anticuerpos con otra especificidad o fragmentos de los mismos, para reclutar células del sistema inmune, por ejemplo macrófagos o partes del sistema del complemento;

d): fusión con etiquetas, por ejemplo secuencias de multimerización -por ejemplo la secuencia de la cola \mu de IgM o dominios de asociación de p53 o MBL- para la multimerización de la parte que se une a Core-1 para una unión multivalente o para la purificación de las moléculas de reconocimiento, por ejemplo etiqueta de His o para detección, por ejemplo etiqueta myc o para el marcaje o quelación de la molécula de reconocimiento, por ejemplo mediante secuencias ricas en lisina.

Las estructuras adecuadas son conocidas para el experto en la materia o las puede deducir mediante conclusiones lógicas o experiencia práctica del estado de la técnica.

Por lo tanto, formas de realización preferidas adicionales son moléculas de reconocimiento según la invención, que comprenden los siguientes formatos: fragmento de anticuerpo de cadena sencilla (scFv), fragmento Fv, fragmento (Fv)_{2}, fragmento Fab, fragmento F(ab)_{2}, multicuerpos (dia-, tria-, tetracuerpos), inmunoglobulinas de los isotipos IgG, IgM, IgA, IgE, IgD o sus subclases, por ejemplo IgG1, o moléculas de reconocimiento derivadas de inmunoglobulinas, que al menos comprenden un dominio constante.

Por "multicuerpo" se entiende según la invención un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla, estando unidas la cadena pesada variable y la cadena ligera variable entre si directamente o a través de un enlazador, de modo que una asociación de VH y VL no puede tener lugar de forma intramolecular sino sólo intermolecular y así se realiza la formación de dia-, tria- y/o tetracuerpos.

Por "enlazador" se entiende según la invención un aminoácido o una secuencia de aminoácidos de hasta 20 aminoácidos, que une la cadena pesada variable y la cadena ligera variable en un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla.

En una forma de realización preferida las moléculas de reconocimiento según la invención se componen de una cadena polipeptídica pesada y una ligera, por lo cual la secuencia de aminoácidos de la cadena pesada y la cadena ligera comprenden respectivamente una de las estructuras de triplete descritas anteriormente, que representan las regiones CDR del anticuerpo, las secuencias marco correspondientes que representan las secuencias marco del anticuerpo, y secuencias accesorias, que comprenden al menos uno de los dominios constantes del isotipo del anticuerpo. Ambas cadenas se pueden unir entre sí de forma covalente. Las regiones constantes y las regiones variables pueden además contener secuencias de anticuerpos de una o varias especies. Se pueden delecionar o mutar partes del dominio constante o el dominio constante entero, por ejemplo para cambiar las funciones efectoras de las secuencias accesorias, por ejemplo para evitar o mejorar la unión a receptores Fc. En una forma de realización preferida la molécula de reconocimiento es un anticuerpo o fragmento de anticuerpo murino, quimerizado, humanizado, parcialmente humano o humano. La quimerización se consigue por ejemplo mediante la unión de los dominios variables de anticuerpo con los dominios constantes de anticuerpo o fragmentos del dominio constante de anticuerpos de distintas especies. Preferidas son las secuencias de los dominios constantes de anticuerpos humanos. Ejemplos para anticuerpos murinos son mIgG-Panko1 que consta de las secuencias SEQ ID NO. 60 y 62 y mIgM-Panko2 que consta de las secuencias SEQ ID NO. 61 y 63. Ejemplos para anticuerpos quiméricos son las moléculas de reconocimiento cIgG-Panko1 que consta de las secuencias SEQ ID NO. 64 y 68 y cIgM-Panko2 que consta de las secuencias SEQ ID NO. 65 y 69.

Las secuencias marco de los anticuerpos se pueden elegir de tal manera, que las secuencias sean en gran parte homólogas a secuencias de anticuerpos humanos. La elección del origen de la especie de la secuencia marco depende también del uso. De esta manera para un uso terapéutico en determinadas áreas se prefieren la mayor proporción posible de secuencias marco humanas, sobre todo cuando se debe evitar una respuesta de anticuerpos humanos anti-ratón (HAMA). En otras áreas terapéuticas es ventajoso un xenocomponente, ya que estimulará el sistema inmune de forma suplementaria. Una combinación de ambas es especialmente adecuada en algunos casos, sobre todo cuando en una primera inmunización un xenocomponente es ventajoso y para usos posteriores un componente compatible con la especie y por lo tanto humano es ventajoso.

Se prefiere una homología a secuencias consenso humanas, por lo cual se prefieren para la cadena pesada variable HuHIII y para la cedan ligera variable HuKII. Especialmente preferida es una homología a secuencias de la línea germinal humana, que son conocidas para el experto en la materia y están disponibles en la base de datos V BASE (www.mrc-cpe.cam.ac.uk) o la base de datos del Centro Nacional para la Información en Biotecnología (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Las técnicas y métodos a usar para la producción de estas secuencias son conocidas para el experto en la materia, del mismo modo el experto en la materia es capaz de elegir las secuencias humanas adecuadas y/o realizar las mutaciones posiblemente necesarias de las secuencias.

En una forma de realización adicional las secuencias triplete, que en general comprenden los bucles de unión (regiones CDR) y que preferiblemente tienen la alta homología a las regiones de secuencia correspondientes en la secuencia de la línea germinal humana, se adaptan adicionalmente allí paso a paso por medio de mutaciones sencillas, sin dañar la unión específica al epítopo tumoral MUC1 glicosilado. Las moléculas de reconocimiento con estas secuencias se denominan aquí anticuerpos humanos parciales o fragmentos de anticuerpo.

En una forma de realización preferida adicional determinados aminoácidos de las secuencias marco de anticuerpos de una especie se cambian por otros, para generar normalmente menos regiones inmunógenas. Esto implica tecnologías que el experto en la materia conoce por si, por ejemplo tecnologías de la humanización, por ejemplo injerto de CDR, reconstrucción, mezcla de cadenas con mutaciones y desinmunización mediante mutaciones o deleciones de epítopos MHC humanos.

En una forma de realización preferida esto se refiere a una molécula de reconocimiento derivada de IgM con los correspondientes dominios constantes de una IgM, preferiblemente secuencias humanas. En el sentido de la invención las inmunoglobulinas están compuestas de la cadena ligera y la cadena pesada de un anticuerpo, por lo cual preferiblemente 2 cadenas ligeras y 2 pesadas representan una unidad. Las inmunoglobulinas del tipo IgM normalmente constan de 5 de esas unidades, que se unen adicionalmente a través de la cadena J para formar puentes disulfuro.

En una forma de realización especialmente preferida la cadena J no está presente, produciéndose igualmente la multimerización de las subunidades, pudiendo estar presentes estructuras hexa- y pentaméricas. Ejemplos para anticuerpos IgM quiméricos son las moléculas de reconocimiento cIgM-Panko1 que consta de las secuencias SEQ ID NO. 66 y 68 y cIgM-Panko2 que consta de las secuencias SEQ ID NO. 67 y 69.

En una forma de realización preferida las moléculas de reconocimiento se refieren fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla que comprenden una estructura de triplete 1 con las correspondientes secuencias marco de anticuerpo descritas anteriormente, que representan las regiones CDR de anticuerpos y secuencias marco de dominios variables de la cadena pesada de anticuerpos, y una estructura de triplete 2 con las correspondientes secuencias marco de anticuerpo descritas anteriormente, que representan las regiones CDR de anticuerpos y secuencias marco de dominios variables de la cadena ligera de anticuerpos, que están unidas covalentemente en forma de una proteína de fusión. Aquí las secuencias están unidas entre si de forma directa o través de un enlazador.

Aquí son preferidos formatos scFv sin enlazador o con un enlazador de 1 a 9 aminoácidos de longitud. Estos anticuerpos scFv forman estructuras multiméricas (por ejemplo, dia-, tria-, tetracuerpos), que en el sentido de la invención también se denominan multicuerpos y muestran debido a la multivalencia una mayor avidez por el epítopo tumoral MUC1 glicosilado. Como se explica en el ejemplo 8 el multicuerpo con la secuencia SEQ ID NO. 45 se une en una prueba de unión celular radioactiva varias veces mejor a la línea de células tumorales de mama T47D que el anticuerpo scFv con la secuencia SEQ ID NO. 36. Estos fragmentos multivalentes en formato dia/triacuerpo son formas de realización especialmente preferidas de la invención y debido a sus propiedades farmacocinéticas mejoradas son ventajosas para la terapia tumoral. Secuencias preferidas son las seceuncias SEQ ID NO. 36 a 47. Especialmente preferidas son las secuencias SEQ ID NO. 48 a 59.

Formas de realización especialmente preferidas de las moléculas de reconocimiento según la invención son las moléculas de reconocimiento que comprenden las secuencias SEQ ID NO. 48 a 59, SEQ ID NO. 61, 63, 65 ó 69, puesto que estas como se describe con más detalle en los ejemplos muestran una combinación de todas las propiedades de unión de a) a h).

En una forma de realización preferida adicional las moléculas de reconocimiento están fusionadas, químicamente acopladas, asociadas covalente o no covalentemente con (i) dominios de inmunoglobulinas de diferentes especies, (ii) moléculas de enzimas, (iii) dominios de interacción, (iv) secuencias señal, (v) colorantes fluorescentes, (vi) toxinas, (vii) anticuerpos catalíticos, (viii) uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con otra especificidad, (ix) componentes citolíticos, (x) inmunomoduladores, (xi) inmunoefectores, (xii) antígenos de MHC de clase I o clase II, (xiii) quelantes para el marcaje radioactivo, (xiv) radioisótopos, (xv) liposomas, (xvi) dominios transmembrana, (xvii) virus y/o células. Las células pueden ser células bacterianas, de levadura, vegetales, de insecto, y/o de mamífero. Preferidas son las células de mamífero como por ejemplo células murinas, humanas o de hámster. Especialmente preferidas son las células efectoras. "Células efectoras" en el sentido de la invención son células, preferiblemente células humanas, que median reacciones inmunes, como por ejemplo macrófagos, células dendríticas, linfocitos y células NK. Además las moléculas de reconocimiento se pueden fusionar en particular con una etiqueta, que permite la detección de la molécula de reconocimiento y su purificación, como por ejemplo una etiqueta myc o una etiqueta His. En el sentido de la invención estas moléculas combinadas se denominan "construcciones". Las tecnologías para la producción de estas construcciones son conocidas para el experto en la materia, asimismo el experto en la materia será capaz de elegir las secuencias y componentes adecuados y unirlas con las moléculas de reconocimiento según la invención en una manera adecuada.

En una forma de realización preferida adicional las moléculas de reconocimiento descritas basadas en anticuerpos o fragmentos de anticuerpos se fusionan con péptidos o proteínas que no derivan de inmunoglobulinas. Por ejemplo, se fusiona el dominio de multimerización de una molécula no inmunoglobulina con un scFv, especialmente el extremo C-terminal de la cadena alfa de la proteína de unión a C4, como se describe en Tonye Libyh M. et al., 1997, y así se construye una molécula de reconocimiento multivalente.

En una forma de realización adicional se fusiona un scFv con un dominio transmembrana de una molécula no inmunoglobulina, por ejemplo con el dominio transmembrana de c-erb B2, h-PDGFR, del receptor humano de transferrina o de los receptores de la asialoglicoproteína (Liao et al., 2000), y por lo tanto permite la expresión de las moléculas de unión en la superficie de células.

Una forma de realización preferida adicional de la invención comprende moléculas de reconocimiento según la invención, que además comprenden secuencias de aminoácidos que se unen específicamente a macrófagos u otras células inmunoefectoras. Por ejemplo las moléculas de reconocimiento según la invención comprenden además un sitio de unión a anticuerpo contra CD64, con lo cual en forma de anticuerpo o fragmentos de anticuerpo biespecífico (diacuerpos) se produce la unión a macrófagos a células tumorales positivas para MUC1, lo que lleva a su lucha y/o su destrucción.

En una forma de realización preferida de la invención se refiere a moléculas de reconocimiento específicas de MUC1 marcadas radioactivamente. Una forma preferida son moléculas de reconocimiento basadas en anticuerpos o fragmentos de anticuerpo. Una forma de realización preferida adicional son moléculas de reconocimiento según la invención marcadas radioactivamente en forma de cadena sencilla (incluyendo dia-, tria-, tetracuerpos). Formas preferidas adicionales son fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla e inmunoglobulinas completas marcados radioactivamente, por ejemplo anticuerpos IgM o IgG murinos, quiméricos o humanizados o fragmentos de anticuerpos murinos o humanizados según la invención. La invención no está naturalmente limitada a estos anticuerpos, que están marcados radioactivamente y estos formatos de anticuerpos.

En una forma de realización preferida se refiere a moléculas de reconocimiento marcadas con radiactividad o marcadas con toxina, que poseen componentes xenógenos, por ejemplo componentes murinos, en la región Fc de los anticuerpos, de modo que los anticuerpos radioactivos tienen una estancia más corta en la sangre de seres humanos y se eliminan más rápidamente. Ejemplos para esto son las moléculas de reconocimiento mIgG-Panko1 que comprende las secuencias SEQ ID NO. 60 y 62 y mIgG-Panko2 que comprende las secuencias SEQ ID NO. 61 y 63. Una variante preferida adicional son tales moléculas de reconocimiento basadas en anticuerpos, en las cuales los componentes murinos están minimizados, pero que aún contienen componentes murinos, que son responsables de la eliminación de la sangre (depuración). El experto en la materia sabe cómo establecer tales componentes convenientes.

Los fragmentos de anticuerpos como los fragmentos multivalentes scFv preferidos especialmente sin o con enlazadores muy cortos ofrecen frente a los anticuerpos monoclonales intactos una ventaja para el direccionamiento a tumores sólidos. Con los anticuerpos intactos, que en estudios de biodistribución muestran un enriquecimiento específico en áreas tumorales, se advierte mediante un examen más preciso del tumor una distribución de los anticuerpos no homogénea con enriquecimiento principalmente en las zonas de los márgenes. Debido a necrosis tumorales, a la distribución no homogénea así como a una presión tisular intersticial aumentada, las zonas centrales del tumor no se pueden alcanzar con estas construcciones de anticuerpos. Por el contrario, los fragmentos de anticuerpos más pequeños muestran un marcaje del tumor rápido, penetran más profundamente en el tumor y al mismo tiempo se eliminan relativamente rápido del torrente sanguíneo. La constante de disociación de fragmentos monovalentes de anticuerpos como Fab y scFv es con frecuencia demasiado baja, lo que resulta en una estancia corta en las células tumorales. Por lo tanto los fragmentos y construcciones de anticuerpos multivalentes como por ejemplo multicuerpos (diacuerpos, tria/tetracuerpos), F(ab')_{2} y otros minicuerpos (construcciones de anticuerpos multivalentes que comprende el dominio de unión y una secuencia de multimerización, por ejemplo scFv y el dominio CH3 de una IgG) ofrecen en la terapia tumoral muchas ventajas. Los fragmentos de anticuerpos multivalentes en formato dia/triacuerpos (multicuerpos) son formas de realización preferidas de la invención y debido a sus propiedades farmacocinéticas mejoradas son ventajosos para la terapia tumoral y se han desarrollado adicionalmente para su uso en la terapia tumoral. Se pueden usar como vehículo para el enriquecimiento específico de por ejemplo sustancias citotóxicas como agentes quimioterapéuticos o radionúclidos en tumores. Mediante la elección de radionúclidos adecuados se pueden destruir las células tumorales sobre una distancia de varios diámetros celulares, de modo que también se pueden cubrir las células tumorales negativas para el antígeno en un área tumoral y se puede compensar la mala penetración del anticuerpo en tumores sólidos al menos parcialmente.

Una forma de realización especialmente preferida de la invención son multicuerpos marcados radioactivamente, que reúnen propiedades farmacocinéticas especialmente ventajosas en combinación con una retención tumoral, penetración tumoral, vida media en suero y proporción de reparto suero a tumor mejoradas frente a las inmunoglobulinas completas y scFv. Más ventajas son la alta avidez y la expresión bacteriana, que permite la preparación de estas moléculas de reconocimiento a coste favorable. De este modo este formato de las moléculas de reconocimiento según la invención ventajosamente preferidas es apropiado para el tratamiento de pequeños tumores primarios, metástasis y enfermedades residuales mínimas.

Una forma de realización preferida de la invención son moléculas de reconocimiento no marcadas radioactivamente. Una forma de realización preferida aquí son moléculas de reconocimiento basadas en anticuerpos o fragmentos de anticuerpos.

Formas de realización preferidas adicionales son moléculas de reconocimiento según la invención basadas en IgG e IgM quiméricas o humanizadas acopladas a toxinas o agentes citostáticos y en particular multicuerpos (dia-, tria-, tetracuerpos) con propiedades farmacocinéticas especialmente ventajosas como se han descrito anteriormente.

Una forma de realización preferida adicional son liposomas, que están cargados por ejemplo con toxinas o agentes citostáticos, y que llevan en su superficie moléculas de reconocimiento según la invención.

El experto en la materia es capaz de elegir radioisótopos, toxinas y agentes citostáticos adecuados. Las técnicas, procesos, dosis y formulaciones adecuadas son conocidos para el experto en la materia.

Una forma de realización preferida de las construcciones de la invención son células efectoras del sistema inmune, en cuya superficie están unidas moléculas de reconocimiento según la invención, que dirigen/llevan las células efectoras a las células tumorales que tienen MUC1 y mediante las cuales se media su lucha y/o destrucción. Las células efectoras preferidas son macrófagos, células dendríticas y células NK, que se extraen del paciente y se acoplan ex vivo con las moléculas de reconocimiento. Más preferidas son líneas celulares de estos tipos de células. El acoplamiento se logra por ejemplo a través de moléculas de reconocimiento biespecíficas, que además de la parte específica para MUC1 comprenden aminoácidos adicionales que median una unión a las células efectoras. Por ejemplo estas son anticuerpos biespecíficos, componentes del complemento o dominios constantes de anticuerpos.

Una forma de realización preferida adicional son aquí macrófagos del paciente, que tras su obtención se acoplan con un anticuerpo biespecífico por ejemplo en forma de anticuerpo completo, preferiblemente fragmentos Fab químicamente acoplados o más preferiblemente diacuerpos, que por un lado reconocen CD64 y por otro son específicos de MUC1 según la invención. Estos macrófagos, que llevan la molécula de reconocimiento biespecífica a través de la especificidad por CD64, se volverán a introducir en el paciente en una formulación adecuada, para combatir los tumores positivos para MUC1. Las técnicas utilizadas para este fin y los procedimientos, dosis y formulaciones adecuados son conocidos para el experto en la materia. Una forma de realización preferida adicional son macrófagos del paciente, que tras su obtención se unen con un anticuerpo o fragmento de anticuerpo de la invención específico de MUC1 que comprende la parte constante de un anticuerpo, que se unen a los macrófagos a través de los receptores Fc conocidos por si. Para ello, las moléculas de reconocimiento bien como anticuerpos completos, preferiblemente IgG o IgM quiméricos o humanizados, o como fragmentos de anticuerpo, por ejemplo scFv, Fab o multicuerpos en forma de una proteína de fusión o químicamente acopladas con parte de los dominios constantes de los anticuerpos conocida para el experto en la materia, se pueden unir a los macrófagos. Estos macrófagos que llevan moléculas de reconocimiento se volverán a introducir en el paciente en una formulación adecuada, para combatir los tumores positivos para MUC1. Las técnicas utilizadas para esto y los procedimientos, dosis y formulaciones adecuados son conocidos para el experto en la materia.

Una forma de realización preferida adicional de las construcciones de la invención son líneas celulares o células del cuerpo como las células efectoras descritas anteriormente, que se transfectan con moléculas que comprenden moléculas de reconocimiento específicas para MUC1 según la invención y elementos adicionales, que producen expresión y anclaje a la membrana, por ejemplo dominios transmembrana y que median la activación de las células efectoras mediante el contacto con una célula tumoral que lleva MUC1. Los elementos adecuados son conocidos para el experto en la materia. Por ejemplo, se transfecta una línea celular dendrítica con un vector que comprende una molécula de reconocimiento, que comprende un scFv o multicuerpo según la invención y un dominio transmembrana y dominio de activación. En otro ejemplo los macrófagos se transfectan con virus para tal fin. En este las células efectoras que llevan moléculas de reconocimiento se suministran a un paciente en una formulación adecuada para combatir los tumores positivos para MUC1. Las técnicas utilizadas para esto y los procedimientos, dosis y formulaciones adecuados son conocidos para el experto en la materia.

La invención se refiere también a un proceso para la producción de moléculas de reconocimiento o construcciones según la invención, para lo que se pueden usar moléculas de ácido nucleico, que comprenden una o más secuencias genéticas que codifican al menos una de las moléculas de reconocimiento o construcciones según la invención anteriormente descritas. Debido al código genético degenerado estas moléculas de ácido nucleico pueden tener secuencias muy diferentes. La elección del codón depende también de la célula que se usa para la producción de la molécula de reconocimiento, ya que en células diferentes procedentes de organismos diferentes con frecuencia se prefieren codones diferentes y la tasa de expresión puede estar muy influida, por ejemplo en los genes eucariotas los codones preferidos usados para arginina AGA y AGG sólo están representados raramente en bacterias. Aquí aparecen los codones CGC y CGU claramente con más frecuencia. La moléculas de ácido nucleico según la invención es en una forma de realización preferida un ADN genómico, un ADNc y/o un ARN. Los criterios para la elección de los codones adecuados y la producción de una molécula de ácido nucleico adecuada son conocidos para el experto en la materia.

En un proceso según la invención se usan vectores para la expresión de moléculas de reconocimiento, en particular en células. En el sentido de la invención se entiende por un vector una molécula de ácido nucleico según la invención, que sirve para la expresión de la molécula de reconocimiento y que comprende una secuencia de ácido nucleico que comprende una o más secuencias genéticas que codifican al menos una de las moléculas de reconocimiento anteriormente descritas y especialmente al menos un promotor que dirige la expresión de la molécula de reconocimiento. Por supuesto, los vectores pueden además comprender elementos adicionales, que son conocidos para el experto en la materia y que sirven por ejemplo en la propagación de los vectores en la producción en células adecuadas y en la clonación. Las secuencias de ácidos nucleicos pueden estar presentes en uno o más vectores, por ejemplo la cadena pesada de una inmunoglobulina según la invención puede estar codificada por un vector y la cadena ligera por otro. Además el dominio variable de la cadena ligera y el dominio variable de la cadena pesada pueden estar codificados en el mismo vector bajo un promotor como una proteína de fusión. Además en el sentido de la invención las secuencias de ácidos nucleicos según la invención que codifican parte de una molécula de reconocimiento se pueden expresar mediante diferentes promotores conocidos para el experto en la materia.

Las diferentes secuencias de ácidos nucleicos pueden estar presentes en un vector común. Cada secuencia se puede expresar mediante su propio promotor, igual o diferente, o las secuencias pueden estar presentes en un vector bicistrónico bajo un promotor. De esta manera por medio de diferentes promotores se pueden alcanzar diferentes tasas de expresión de partes de las moléculas de reconocimiento, que mejoran la formación de la molécula de reconocimiento total frente a la misma tasa de expresión de las diferentes partes. Además se pueden usar promotores que sean inducibles para mejorar la expresión de la molécula de reconocimiento. Además, los vectores pueden comprender otros elementos reguladores conocidos por el experto en la materia, por ejemplo un potenciador, que aumentan la expresión de la molécula de reconocimiento o partes de la misma, por ejemplo el potenciador de CMV o secuencias potenciadoras de inmunoglobulinas. Las moléculas de ácido nucleico y vectores pueden comprender secuencias de ácido nucleico suplementarias, que sirven como secuencias señal para la secreción de la molécula de reconocimiento o partes de la misma, que son conocidas para el experto en la materia, por ejemplo PelB, OmpA o MalE para sistemas celulares procariotas o el péptido señal del receptor de células T, de cadenas de inmunoglobulinas, de t-PA o EPO para sistemas celulares eucariotas [Boel et al., 2000; Herrera et al., 2000]. Esto facilita de forma ventajosa la purificación y/o mejora el rendimiento de la molécula de reconocimiento. Los métodos para la producción de los ácidos nucleicos y vectores anteriormente descritos, promotores, potenciadores y construcciones de vectores adecuados así como los criterios para su elección son conocidos para el experto en la materia y se explican con más detalle en los ejemplos.

El vector puede además comprender secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas virales. El virus mismo se referirá como forma especial de un vector, cuyo material genético comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula de reconocimiento según la invención. En una forma preferida la molécula de reconocimiento es una proteína de fusión con una proteína de la envuelta del virus o partes de la misma, que permite que no sólo el material genético que comprende la secuencia de ácido nucleico de la molécula de reconocimiento sino que también la molécula de reconocimiento misma esté presente en la superficie del virus activa para la unión, por ejemplo una molécula de reconocimiento scFv según la invención como proteína de fusión con una proteína de la envuelta de adenovirus, poxvirus o virus de la vacuna adecuados para el uso en terapia génica. Esto media dirigir los virus a una célula tumoral que expresa MUC1, por lo cual tiene lugar la expresión de la molécula de reconocimiento por la célula tumoral. Esto se puede usar para la expresión de la molécula de reconocimiento in vivo en organismos o in vitro en cultivo celular. Preferiblemente se usan sistemas conocidos que usan un virus auxiliar para la replicación, para por ejemplo garantizar la seguridad de métodos de terapia génica que comprenden uno de estos vectores. Los métodos para la producción de los vectores virales descritos, para la infección y expresión de las moléculas de reconocimiento son conocidos para el experto en la materia.

El vector puede comprender una proteína de fusión de una molécula de reconocimiento según la invención y una proteína o péptido que se une específicamente a un virus. Las moléculas de reconocimiento obtenidas se pueden usar de esta manera con ventaja para dirigir el virus a una célula que expresa MUC1. Así, por ejemplo la transferencia de material genético puede estar mediada a través de infecciones, lo que hace posible expresar moléculas específicas, codificadas a través del material genético del virus, en células in vivo en organismos en forma de una terapia génica o in vitro en cultivo de células.

El proceso para la obtención de las moléculas de reconocimiento según la invención comprende la incorporación de uno o más vectores que contienen una o más moléculas de ácido nucleico en una célula huésped adecuada, el cultivo de esta célula huésped en condiciones adecuadas y la preparación de una o más moléculas de reconocimiento de las células o el medio de cultivo. Mediante el término "incorporación de vectores" se entiende en el sentido de la invención tecnologías por si conocidas para el experto en la materia con las que el vector se introduce en una célula huésped, por ejemplo electroporación, transfección usando lípidos catiónicos o infección y permanece allí de forma transitoria o estable. Mediante el término "preparación de una o más moléculas de reconocimiento" se entiende en el sentido de la invención tecnologías por si conocidas para el experto en la materia con las cuales se obtienen las moléculas de reconocimiento expresadas durante el proceso del sobrenadante del cultivo de cultivo y/o las células, por ejemplo diferentes pasos de purificación química de proteínas por ejemplo fraccionamiento, concentración, precipitación, y/o cromatografía. Los métodos y técnicas a usar en el proceso son conocidos para el experto en la materia, asimismo el experto en la materia es capaz de elegir células huésped y condiciones de cultivo adecuadas así como métodos para la producción a partir de las células y/o sobrenadante del cultivo. Aquí el experto en la materia elige, por ejemplo, como ya se ha descrito anteriormente, secuencias de ácido nucleico con codones adecuados y secuencias promotoras adaptadas a la célula huésped, para obtener una expresión lo más alta posible de moléculas de reconocimiento activas. En una forma de realización preferida el experto en la materia por ejemplo usa pasos de cromatografía de afinidad, por ejemplo cromatografía en proteína A o proteína G o proteína L o por ejemplo cromatografía de afinidad de iones metálicos a través de una etiqueta de His adicionalmente introducida. En los ejemplos esto se explica con más detalle.

El término "obtención" comprende junto a los pasos explícitamente nombrados antes también pasos adicionales, como el tratamiento previo del material de partida o tratamientos posteriores del producto final. Los procesos del tratamiento previo son de por si conocidos para el experto en la materia. Los procedimientos posteriores comprenden además de los procesos de preparación anteriormente descritos también por ejemplo la composición y/o formulación final de la molécula de reconocimiento obtenida con el proceso de producción en formas adecuadas para uso y/o administración. El tipo de la forma de uso o administración, por ejemplo solución, liofilizado o comprimido, depende del uso deseado. El experto en la materia sabe qué formas de administración son adecuadas para cada fin. Dependiendo de la forma de administración la molécula de reconocimiento según la invención puede presentarse junto con agentes auxiliares, vehículos u otros principios activos. Los agentes auxiliares aquí son preferiblemente adyuvantes, principios activos adicionales, preferiblemente moléculas inmunoestimuladoras, como interleuquinas. La molécula de reconocimiento producida con el proceso según la invención también se puede modificar químicamente en pasos de tratamiento adicionales. Preferiblemente, la molécula de reconocimiento se une aquí con una o más moléculas adicionales en forma adecuada, es decir, a través de interacción física o química. Como moléculas adicionales en el sentido de la invención se usan preferiblemente otras proteínas o péptidos, que unen de forma covalente o no covalente a la molécula de reconocimiento producida mediante el procedimiento según la invención, por ejemplo para producir una molécula de reconocimiento biespecífica, mediante unión de una molécula de reconocimiento según la invención, que reconoce específicamente el antígeno MUC1, con una segunda molécula, que por ejemplo se une específicamente a una célula efectora (por ejemplo, macrófagos, células NK, células dendríticas) o por ejemplo una unión con interleuquinas (por ejemplo, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15), quimioquinas, o factores de crecimiento, por lo cual a través de la acción de estas moléculas a través de la unión de la molécula de reconocimiento según la invención los inmunoefectores se dirigen a las células tumorales positivas para Core-1 y estas por ejemplo, se combaten y/o destruyen. Estas moléculas adicionales o partes de las mismas como ya se ha descrito anteriormente también pueden ser parte de la molécula de reconocimiento misma y en este caso no unen a través de los métodos químicos o físicos aquí descritos tras la expresión de la molécula de reconocimiento. Por "inmunoefectores" se entiende en el sentido de la invención tales componentes de la invención que pueden ocasionar de forma directa o indirecta un combate y/o destrucción de células tumorales positivas para MUC1, por ejemplo, células inmunoefectoras, como por ejemplo macrófagos, células NK, células dendríticas, o moléculas efectoras, como por ejemplo proteínas o péptidos del sistema del complemento. Como moléculas adicionales en el ámbito de los procesos según la invención son adecuadas sustancias en particular, las que desarrollan un efecto terapéutico o diagnóstico, por ejemplo radioisótopos o toxinas. Estas sustancias se unen a las moléculas de reconocimiento por medio de procedimientos conocidos por si, por ejemplo los radioisótopos se incorporan bien directamente (por ejemplo yodo) o se unen a través de un quelante acoplado covalentemente (por ejemplo itrio, indio, bismuto). Los pasos del procedimiento de los tratamientos adicionales son conocidos para el experto en la materia.

Las células usadas para la expresión de las moléculas de reconocimiento según la invención pueden ser células procariotas o eucariotas, por ejemplo células bacterianas, de levadura (preferiblemente S. cerevisiae o P. pastoris), de insecto (D. melanogaster), vegetales, de mamífero (preferiblemente líneas celulares de hámster, ratón o humanas) u organismos como animales y plantas transgénicos. Preferiblemente se usan para la expresión de las moléculas de reconocimiento según la invención en un sistema procariota E. coli y para la expresión en un sistema eucariota la líneas celulares de mamífero NS0, SP2/0, CHO-K1, CHOdhfr-, COS-1, COS-7, HEK293, K562, Namalwa o Percy 6.

La invención se refiere además a composiciones para fines terapéuticos, profilácticos o diagnósticos que comprenden al menos una molécula de reconocimiento según la invención en una forma o composición adecuada, en particular farmacéuticamente adecuada. La composición farmacéutica comprende en particular materiales y sustancias adicionales, por ejemplo agentes auxiliares médicos y/o farmacéuticos-técnicos. En el sentido de la invención se consideran como fármacos tanto tales composiciones farmacéuticas que se usan con fines terapéuticos y profilácticos, como tales composiciones farmacéuticas que se emplean in vivo como agentes de diagnóstico. En una forma de realización preferida adicional se refiere a composiciones para el diagnóstico ex vivo que pueden contener materiales y sustancias adicionales. Esta forma de realización se explica con más detalle en la descripción de agentes de diagnóstico.

"Fármacos o composiciones farmacéuticas", que se usan aquí como sinónimos, son materiales y preparaciones según la invención que están destinados para curar, aliviar o evitar enfermedades, afecciones, defectos físicos o trastornos patológicos a través de su aplicación sobre o en el cuerpo humano. Los agentes auxiliares médicos son según la invención tales sustancias que se usan para la producción como principios activos de fármacos. Los agentes auxiliares farmacéuticos-técnicos sirven para la formulación adecuada de los fármacos o de las composiciones farmacéuticas y se pueden incluso eliminar después, siempre que sólo se necesiten durante el proceso de producción, o pueden estar como soporte farmacéuticamente aceptable de la composición farmacéutica. Ejemplos de soportes farmacéuticamente aceptables se dan más adelante. La formulación del fármaco o formulación de la composición farmacéutica se realiza opcionalmente en combinación con un soporte y/o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de soportes farmacéuticamente aceptables adecuados son conocidos para el experto en la materia y comprenden, por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato, agua, emulsiones como por ejemplo emulsiones aceite/agua, distintos tipos de detergentes, soluciones estériles, etc. Los fármacos o composiciones farmacéuticas que comprenden tales soportes se pueden formular por medio de métodos convencionales conocidos. Estos fármacos o composiciones farmacéuticas se pueden administrar a un individuo en dosis adecuadas, por ejemplo en un intervalo de 1 \mug a 10 g de moléculas de reconocimiento por día y paciente. Se prefieren dosis de 1 mg a 1 g. Se prefiere una administración de dosis tan pocas y pequeñas como sea posible y más preferido dosis única, por ejemplo de una molécula de reconocimiento marcada radioactivamente. La administración se puede realizar por varias vías, por ejemplo intravenosa, intraperitoneal, intrarrectal, intragastrointestinal, intranodal, intramuscular, local, por ejemplo en el tumor, pero también subcutánea, intradérmica o sobre la piel o a través de mucosa. La administración de ácidos nucleicos también se puede realizar en forma de terapia génica, por ejemplo por medio de vectores virales anteriormente descritos. El tipo de dosis y la vía de administración pueden ser determinados por el médico de acuerdo a factores clínicos. El experto en la materia sabe que el tipo de dosis depende de varios factores, como por ejemplo el tamaño, la superficie corporal, la edad, el sexo o el estado de salud general del paciente, pero también de medios especiales que se administran, la duración y tipo de la administración y otros medicamentos, que posiblemente se administren en paralelo.

Una "composición vacuna" es una composición farmacéutica para la inmunización profiláctica o terapéutica activa de pacientes, para provocar una respuesta inmune específica contra el epítopo tumoral MUC1 glicosilado en el paciente a través de la red inmunológica.

Las composiciones farmacéuticas o el fármaco comprenden en particular una sustancia farmacológica que contiene una o más moléculas de reconocimiento según la invención y/o las moléculas de ácido nucleico que codifican estas en una solución o forma de administración adecuada. Estas se pueden administrar solas con los correspondientes agentes auxiliares descritos en fármacos o composiciones farmacéuticas o en combinación con uno o más adyuvantes, por ejemplo QS-21, GPI-0100 u otras saponinas, emulsiones agua-aceite como por ejemplo adyuvante Montanide, polilisina, compuestos de poliarginina, compuestos de ADN como por ejemplo CpG, Detox, vacunas bacterianas como por ejemplo vacuna del tifus o vacuna BCG, sales como por ejemplo fosfato de calcio y/o otra sustancia adecuada para potenciar el efecto; preferiblemente moléculas inmunoestimuladoras, como interleuquinas, por ejemplo IL-2, Il-12, IL-4 y/o factores de crecimiento, por ejemplo GM-CSF. Estas se mezclan en métodos conocidos con moléculas de reconocimiento según la invención y se administran en una formulación y dosis adecuadas. Las formulaciones, dosis y componentes adecuados son conocidos para el experto en la materia.

La producción de los fármacos o composiciones farmacéuticas se produce según métodos conocidos por si.

Los fármacos o composiciones farmacéuticas se usan para profilaxis o tratamiento de enfermedades tumorales y/o metástasis, en particular para el tratamiento de enfermedades tumorales y metástasis positivas para MUC1, como por ejemplo, carcinomas de mama, tumores gastrointestinales, incluyendo carcinomas de colon, carcinomas de estómago, cáncer colorrectal y cáncer del intestino delgado, carcinomas de páncreas, carcinomas de ovario, carcinomas de hígado, cáncer de pulmón, carcinomas de células renales, mieloma múltiple. El tratamiento se dirige por ejemplo contra tumores primarios, enfermedades tumorales residuales, recaídas y/o metástasis. El tratamiento de los tumores también se puede emplear como tratamiento adyuvante. El uso de los fármacos también se puede emplear para profilaxis de enfermedades tumorales positivas para MUC1. El uso profiláctico se dirige por ejemplo a una profilaxis del tumor así como de metástasis. Los agentes tumorales se administran en una forma adecuada según métodos conocidos. Una variante preferida es la inyección o administración intravenosa de los fármacos, local en cavidades corporales, por ejemplo intraperitoneal, intrarrectal, intragastrointestinal, local por ejemplo directo en el tumor órgano o vasos linfáticos (intranodal), pero también subcutánea, intradérmica o sobre la piel, intramuscular. Preferiblemente, también se pueden combinar los tipos de administración, pudiéndose administrar en diferentes días de tratamiento o en un día de tratamiento. De esta manera se pueden combinar también 2 ó más fármacos o composiciones farmacéuticas según la invención o uno o más fármacos según la invención con uno o más fármacos o tratamientos tumorales, como por ejemplo terapia de anticuerpos, quimioterapia o radioterapia, se pueden administrar o aplicar al mismo tiempo o separados. Las formulaciones, dosis y combinaciones de componentes adecuados son conocidas para el experto en la materia o se puede determinar según métodos conocidos.

El procedimiento para la producción de los fármacos o composiciones farmacéuticas según la invención comprende los pasos de la producción de moléculas de reconocimiento y además el paso de formular las moléculas de reconocimiento según la invención en forma farmacéuticamente aceptable. Las moléculas de reconocimiento preferidas aquí se han descrito anteriormente como formas de realización para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades tumorales y profilaxis, así como más adelante en más detalle en los agentes de diagnóstico in vivo.

Las moléculas de reconocimiento o construcciones según la invención se pueden usar por lo tanto preferiblemente para la producción de una composición farmacéutica, para profilaxis, diagnóstico, control de la evolución y/o tratamiento de enfermedades tumorales. El uso de las moléculas de reconocimiento y/o el fármaco o las composiciones farmacéuticas para profilaxis y/o tratamiento de enfermedades tumorales, incluyendo tumores y metástasis es además preferido.

En una forma de realización preferida la enfermedad cancerosa o el tumor que se trata o se evita de forma profiláctica o cuya reaparición se evita se selecciona del grupo de enfermedades cancerosas o enfermedades tumorales de la región de garganta-nariz-oído, de los pulmones, del mediastino, del aparato digestivo, del sistema urogenital, del sistema ginecológico, del pecho, del sistema endocrino, de la piel, sarcomas de hueso y tejido blandos, mesoteliomas, melanomas, neoplasias del sistema nervioso central, enfermedades cancerosas o enfermedades tumorales en edad infantil, linfomas, leucemias, síndromes paraneoplásticos, metástasis sin tumor primario conocido (síndrome CUP), carcinomatosis peritoneales, tumores malignos y/o metástasis tumorales relacionados con inmunosupresión.

En particular los tumores se puede referir a los siguientes tipos de cáncer: adenocarcinoma de mama, de próstata y del intestino grueso; todas las formas de cáncer de pulmón que empiezan en el conducto bronquial; cáncer de médula ósea, melanoma, hepatoma, neuroblastoma; papiloma; apudoma, coristoma, branquioma; síndrome carcinoide maligno; enfermedad carcinoide del corazón; carcinoma (por ejemplo, carcinoma de Walker, carcinoma de células basales, carcinoma basoescamoso, carcinoma de Brown-Pearce, carcinoma ductal, tumor de Ehrlich, carcinoma in situ, carcinoma de cáncer-2, carcinoma de células de Merkel, cáncer de mucosa, carcinoma de pulmón no microcítico, carcinoma de pulmón microcítico, carcinoma papilar, carcinoma escirroso, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma bronquial, carcinoma de células escamosas y carcinoma de células en transición); trastorno funcional histocístico; leucemia (por ejemplo en relación con leucemia de células B, leucemia de células mezcladas, leucemia de linfocitos nulos, leucemia de células T, leucemia crónica de células T, leucemia asociada a HTLV-II, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia de mastocitos y leucemia mieloide); histocitiosis maligna, enfermedad de Hodgkin, linfoma no Hodgkin, tumor de células plasmáticas solitarias; reticuloendoteliosis, condroblastoma, condroma, condrosarcoma; fibroma; fibrosarcoma; tumores de células gigantes; histiocitoma; lipoma; liposarcoma; leucosarcoma; mesotelioma; mixoma; mixosarcoma; osteoma; osteosarcoma; sarcoma de Ewing; sinovioma; adenofibroma; adenolinfoma; carcinosarcoma, cordoma, craniofarinioma, disgerminoma, hamartoma; mesenquinoma; mesonefroma, miosarcoma, ameloblastoma, cementoma; odontoma; teratoma; timoma, corioblastoma, adenocarcinoma, adenoma; colangioma; colesteatoma; cilindroma; cistadenocarcinoma, cistadenoma; tumor de célula granulares; ginadrobastoma; hidradenoma; tumor de células de isletas; tumor de células de Leydig; papiloma; tumor de células de Sertoli, tumor de célula tecales, liomioma; liomiosarcoma; mioblastoma; mioma; miosarcoma; rabdomioma, rabdomiosarcoma; ependinoma; ganglioneuroma, glioma; meduloblastoma, meningioma; neurilemoma; neuroblastoma; neuroepitelioma, neurofibroma, neuroma, paraganglioma, paraganglioma no cromafínico, angioqueratoma, hiperplasia angiolinfoide con eosinófilos; angioma esclerosante; angiomatosis; glomagioma; hemagioendotelioma; hemagioma; hemagiopericitoma, hemagiosarcoma; linfangioma, linfangiomioma, linfangiosarcoma; pinealoma; cistosarcoma filoides; hemangiosarcoma; linfangiosarcoma; mixosarcoma, carcinoma de ovario; sarcoma (por ejemplo, sarcoma de Ewing, experimentalmente, sarcoma de Kaposi y sarcoma de mastocitos); neoplasias (por ejemplo, neoplasias de huesos, neoplasias de mama, neoplasias del sistema digestivo, neoplasias colorrectales, neoplasias de hígado, neoplasias de páncreas, neoplasias de hipófisis, neoplasias de testículo, neoplasia orbital, neoplasia de cabeza y cuello, del sistema nervioso central, neoplasia del órgano auditivo, de la pelvis, del aparato respiratorio y del aparato urogenital); neurofibromatosis y displasia cervical de células escamosas.

En una forma de realización preferida adicional la enfermedad cancerosa o el tumor que se trata o se evita de forma profiláctica o cuya reaparición se evita se selecciona del grupo de enfermedades cancerosas o enfermedades tumorales que comprenden células que contienen MUC1 en la definición según la invención, seleccionadas del grupo: tumores de la región de garganta-nariz-oído que comprenden tumores en la nariz interna, senos nasales, nasofaringe, los labios, cavidad oral, orofaringe, laringe, hipofaringe, oídos, glándulas salivares y paragangliomas, tumores de pulmones que comprenden carcinoma de pulmón no microcítico, carcinoma de pulmón microcítico, tumores del mediastino, tumores aparato digestivo que comprenden tumores del esófago, del estómago, del páncreas, del hígado, de la vesícula biliar y conductos biliares, del intestino delgado, carcinomas del colon y recto, y carcinoma anal, tumores urogenitales que comprenden tumores de los riñones, uréter, la vejiga, próstata, uretra, el pene y los testículos, tumores ginecológicos que comprenden tumores cervicales, de la vagina, la vulva, carcinoma de endometrio, enfermedad maligna de trofoblastos, carcinoma de ovario, tumores de los oviductos (trompas de Falopio), tumores de cavidad abdominal, carcinomas de mama, tumores de órganos endocrinos que comprenden tumores del tiroides, paratiroides, glándula suprarrenal, tumores endocrinos del páncreas, tumores carcinoides y síndrome carcinoide, neoplasias endocrinas múltiples, sarcoma óseo y de tejido blando, mesotelioma, tumores de piel, melanomas que comprenden melanomas cutáneos e intraoculares, tumores del sistema nervioso central, tumores en edad infantil que comprenden retinoblastoma, tumor de Wilms, neurofibromatosis, neuroblastoma, familia de tumores del sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma, linfomas que comprenden linfomas no Hodgkin, linfoma cutáneo de células T, linfomas primarios de sistema nervioso central, enfermedad de Hodgkin, leucemias que comprenden leucemias agudas, leucemias crónicas mieloide y linfopática, neoplasias de células plasmáticas, síndrome mielodisplástico, síndrome paraneopláestico, metástasis sin tumor primario conocido (síndrome CUP), carcinomatosis peritoneal, tumores malignos asociados a inmunosupresión que incluyen tumores malignos relacionados con SIDA como sarcoma de Kaposi, linfoma asociado con SIDA, linfoma del sistema nervioso central asociado con SIDA, enfermedad de Hodgkin asociado con SIDA, tumores anogenitales asociados con SIDA, tumores malignos asociados trasplantes, tumores metastasizados que incluyen metástasis cerebrales, metástasis pulmonares, metástasis hepáticas, metástasis óseas, metástasis pleurales y pericardiales y ascitis malignos.

En una forma de realización preferida adicional la enfermedad cancerosa o el tumor que se trata o se evita de forma profiláctica o cuya reaparición se evita se selecciona del grupo de enfermedades cancerosas o enfermedades tumorales de carcinomas de mama, tumores gastrointestinales, incluyendo carcinomas de colon, carcinomas de estómago, cáncer colorrectal y cáncer del intestino delgado, carcinomas del páncreas, carcinomas de ovario, carcinomas de hígado, cáncer de pulmón, carcinomas de células renales, mieloma múltiple.

En una forma de realización preferida adicional las moléculas de reconocimiento según la invención se usan para profilaxis de carcinomas de mama u ovario en mujeres con alto riesgo de cáncer de mama.

En particular en otra forma de realización preferida la enfermedad tumoral, el tumor o metástasis que se trata, se previene de forma profiláctica o cuya reaparición se evita se selecciona del grupo de los tumores gastrointestinales y de ellos preferiblemente carcinomas de colon, carcinomas de estómago y carcinomas rectales.

Las moléculas de reconocimiento según la invención se pueden usar para la producción de una composición farmacéutica para el tratamiento o profilaxis de enfermedades tumorales de forma directa o se pueden acoplar con estructuras efectoras adicionales. Por "estructuras efectoras" se entiende según la invención aquellos compuestos, moléculas o átomos químicos o bioquímicos que de forma directa o indirecta producen destrucción o daño, incluyendo por ejemplo retraso del crecimiento o inhibición del crecimiento de células tumorales. Por ejemplo, aquí se incluyen radioisótopos, toxinas, agentes citostáticos y otras moléculas efectoras como por ejemplo citoquinas y quimioquinas u otras estructuras que representan efectores ellas mismas o que se acoplan a moléculas efectoras, por ejemplo liposomas cargados con toxinas o agentes citostáticos, que llevan las moléculas de reconocimiento según la invención. En el último ejemplo de los liposomas en particular también se refiere a tales estructuras efectoras que junto a las moléculas de reconocimiento para la especificidad del tumor también llevan tales moléculas que son responsables de una absorción de las estructuras efectoras o partes de las mismas en las células, como por ejemplo anticuerpos contra receptores que ocasionan endocitosis mediada por receptor. Preferiblemente las moléculas de reconocimiento comprenden en estos casos un dominio transmembrana, que les permite una inserción en la membrana del liposoma o en otra forma de realización preferida las moléculas de reconocimiento se acoplan químicamente sobre la superficie del liposoma. Las técnicas empleadas aquí son conocidas para el experto en la materia, incluyendo la producción de liposomas. También la unión de las moléculas de reconocimiento con las otras estructuras efectoras se produce por método conocidos por sí. Los acoplamientos pueden ocurrir como ya se ha descrito anteriormente directamente mediante carga covalente o no covalente, mediante acoplamiento químico, en el cual se puede necesitar una molécula química o biológica adicional, por ejemplo un quelante o un enlazador, o en forma de proteínas o péptidos de fusión mediante fusión. Las moléculas de reconocimiento se emplean en el tratamiento de enfermedades tumorales con tumores que llevan MUC1 o para profilaxis que por ejemplo evitan la formación de tumores primarios o metástasis. El objetivo preferido es por lo tanto el tratamiento de enfermedades residuales mínimas y de metástasis. Las moléculas de reconocimiento según la invención se administran en una formulación adecuada una vez o repetidamente a intervalos de tiempo y dosis adecuados.

En una forma de realización preferida las moléculas de reconocimiento radioactivas descritas anteriormente según la invención se combinan con una aplicación de moléculas de reconocimientos no marcadas específicas para MUC1 según la invención. Esto sirve para mejorar el fondo y por lo tanto una unión más específica al tumor, saturando las pequeñas cantidades de moléculas que llevan MUC1 en sangre. Preferiblemente se usan moléculas de IgG y más preferiblemente moléculas de reconocimiento derivadas de IgM, por ejemplo una cIgMG o la forma humanizada de la misma, puesto que estas sobre todo se unen al antígeno MUC1 en sangre y por lo tanto disminuyen el fondo y la carga de radioactividad en suero y aumentan el dirigimiento al tumor, al tiempo que debido al tamaño de la molécula se limita la penetración en tejidos y tumores. Los procedimientos y tecnologías usados aquí son conocidos para el experto en la materia, asimismo el experto en la materia puede suministrar una dosis adecuada, formulaciones, vías de aplicación y tiempos de administración de las moléculas de reconocimiento no marcadas.

El procedimiento para la producción de un agente de diagnóstico comprende los pasos del procedimiento según la invención para la producción de moléculas de reconocimiento específicas para MUC1 según la invención y además el paso de formular las moléculas de reconocimiento en una forma diagnósticamente utilizable.

La composición farmacéutica según la invención puede ser un "agente de diagnóstico". Como agente diagnóstico se definen sustancias y preparaciones de sustancias que se pretende que mediante su uso sobre o en el cuerpo humano o partes del mismo reconozcan enfermedades, afecciones, defectos físicos o trastornos patológicos. Como parte del cuerpo humano preferiblemente se entienden líquidos corporales, como sangre, suero sanguíneo, linfa, orina, líquido cerebroespinal o esperma, o biopsias o muestras de tejidos.

La formulación del agente de diagnóstico comprende preferiblemente la modificación de las moléculas de reconocimiento producidas con sustancias que permiten la detección del antígeno MUC1. Las sustancias adecuadas son conocidas en el estado de la técnica. Partiendo de la elección de la sustancia el experto en la materia es capaz de tomar medidas adecuadas para la formulación del agente diagnóstico.

Según la invención, para el diagnóstico también se pueden acoplar sustancias según métodos por si conocidos a las moléculas de reconocimiento, que facilitan la detección de antígenos MUC1 y/o las células que lo llevan, por ejemplo a través de biotinilización, marcaje fluorescente, marcaje radioactivo o acoplamiento de enzimas a las moléculas de reconocimiento.

En un procedimiento adicional para el diagnóstico tumoral y pronóstico se usan moléculas de reconocimiento según la invención que reconocen los antígenos MUC1 en suero de seres humanos. Esto es también posible y ventajoso antes que por el fondo por la propiedad de las moléculas de reconocimiento que en comparación con los anticuerpos conocidos HMFG-1 y DF-3 (prueba CA15-3) unen mucho menos MUC1 en suero, ya que las moléculas de reconocimiento según la invención pueden distinguir claramente ente suero normal y suero tumoral, incluso cuando la unión en pacientes de tumor de colon es baja.

La determinación es preferiblemente cualitativa, cuantitativa y/o en cantidades relativas a lo largo del tiempo según métodos conocidos por sí. Los mismos procedimientos se emplean según la invención para el seguimiento de enfermedades tumorales y para el control del curso del tratamiento incluyendo la evaluación de respuestas inmunes y para el control y dosificación de tratamientos tumorales. Los métodos usados en los procedimientos son conocidos por sí, por ejemplo ELISA, inmunotransferencia, FACS (separación de células activada por fluorescencia), MACS (separación de células activada por magnetismo), ADCC (citotoxidad celular dependiente de anticuerpos), CDC (citotoxicidad dependiente del complemento), inmunocitoquímica e inmunohistoquímica.

En los procedimientos preferidos según la invención para el diagnóstico y pronóstico tumoral in vitro se usan moléculas de reconocimiento específicas para MUC1 según la invención en procesos conocidos por sí, para detectar el epítopo tumoral MUC1 glicosilado en suero o preparaciones de tejido. De este modo se detecta el antígeno MUC1, MUC1 presente en complejos inmunes y/o MUC1 unido a células y se determina la presencia del antígeno MUC1 de forma cualitativa, cuantitativa y/o en cantidades relativas según métodos conocidos por sí. Los mismos procedimientos se emplean según la invención para el seguimiento de enfermedades tumorales y para el control del curso del tratamiento. Los métodos usados en los procedimientos son conocidos por sí, por ejemplo ELISA, inmunotransferencia, FACS (separación de células activada por fluorescencia), MACS (separación de células activada por magnetismo), ADCC (citotoxidad celular dependiente de anticuerpos), CDC (citotoxicidad dependiente del complemento), inmunocitoquímica e inmunohistoquímica.

Una forma de realización preferida es una prueba rápida en tejido, en donde en un procedimiento histológico la muestra de tejido se tiñe con moléculas de reconocimiento según la invención marcadas con fluorescencia. En un procedimiento preferido adicional la molécula de reconocimiento según la invención, preferiblemente un anticuerpo del isotipo IgG, se combina con un anticuerpo adicional, que específicamente reconoce el antígeno Core-1, preferiblemente del isotipo IgM. La ventaja de esto es que por ejemplo para el diagnóstico de carcinomas gastrointestinales (por ejemplo carcinomas colorrectales y carcinomas de estómago) reconocen estos en una fase temprana y al mismo tiempo se puede dar un pronóstico relativo al curso de la enfermedad y/o el riesgo de metástasis hepática, por lo cual un nivel más alto de Core-1 y antígeno MUC1 significa un peor pronóstico de evolución y un nivel más alto de Core-1 una probabilidad varias veces mayor de metástasis hepática. En una forma de realización preferida adicional los anticuerpos y moléculas de reconocimiento están marcados directamente con diferentes colorantes fluorescentes, por ejemplo Cy3 y Cy5 o Cy3 y FITC. En una forma de realización, en la que una intensificación de la señal es ventajosa, los anticuerpos y/o moléculas de reconocimiento se aumentan por medio de anticuerpos secundarios marcados o biotina-estreptavidina. Por lo tanto es ventajoso, usar isotipos y/o secuencias de especies diferentes en la región constante del anticuerpo. Las tecnologías y métodos usados aquí, por ejemplo el marcaje y la inmunohistología, así como la elección del formato adecuado de las moléculas de reconocimiento, son conocidos para el experto en la materia. El procedimiento diagnóstico descrito no está restringido a tumores gastrointestinales, sino que se puede usar para cualquiera de las enfermedades tumorales que contienen antígeno MUC1.

En una forma de realización preferida adicional de la invención se combinan para una prueba tumoral serológica la determinación del antígeno MUC1, como se ha descrito anteriormente, con la determinación de otros marcadores tumorales serológicos, por ejemplo PSA, CEA o AFP. Una forma de realización preferida aquí es la determinación de los antígenos MUC1 y Core-1. En una forma de realización preferida aquí el antígeno MUC1 de suero se inmoviliza en una fase sólida con ayuda de un anticuerpos específico para MUC1 y se detecta con una molécula de reconocimiento según la invención, que se une específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado, como anticuerpo de detección y el antígeno Core-1 se detecta sobre el MUC1 inmovilizado con ayuda de un anticuerpo de captura anti-MUC1 como las moléculas de reconocimiento específicas de MUC1 según la invención, con un anticuerpo anti-Core-1 específico. Esta prueba diagnóstica une un reconocimiento temprano con una manifestación de pronóstico sobre el curso de la enfermedad y/o la probabilidad de metástasis hepática. Las tecnologías usadas aquí, por ejemplo el marcaje y la serología, incluyendo los métodos de detección, son conocidas para el experto en la materia. Los procedimientos diagnósticos descritos no están restringidos a tumores gastrointestinales, sino que se pueden usar para cualquier tumor que contenga antígeno MUC1. Las pruebas serológicas descritas se usan para el diagnóstico, el seguimiento del curso de la enfermedad tumoral y el pronóstico de tumores positivos para MUC1.

Para el diagnóstico in vivo las moléculas de reconocimiento según la invención se marcan con métodos adecuados conocidos por sí y se facilitan como agentes de diagnóstico para métodos de diagnóstico por imagen por sí conocidos, por ejemplo radioinmunodiagnóstico, métodos PET o endoscopia inmunofluorescente, por ejemplo por medio de acoplamiento y/o carga con moléculas apropiadas, por ejemplo isótopos radioactivos, por ejemplo indio, o colorantes fluorescentes, por ejemplo Cy3, Cy2, Cy5 o FITC. En una forma de realización preferida los multicuerpos según la invención se unen de forma covalente con un quelante adecuado (por ejemplo DOTA o DTPA) y se cargan con indio-111 y se usan como agentes de diagnóstico in vivo. Estos se administran por ejemplo de forma intravenosa en una dosis adecuada para el individuo y se mide la localización del antígeno MUC1 y un potencial tumor según procedimientos conocidos por sí. Los procedimientos y tecnologías aquí usados, incluyendo el procedimiento de diagnóstico por imagen, son conocidos para el experto en la materia, asimismo el experto en la materia puede proporcionar una dosis y formulaciones adecuadas.

En una forma de realización preferida adicional las inmunoglobulinas, preferiblemente IgG, se marcan radioactivamente como se ha descrito anteriormente y se explica con más detalle en los ejemplos, por ejemplo con indio-111, y se proporcionan como agentes de diagnóstico, que se pueden dar localmente en el tumor o en los vasos sanguíneos aferentes o eferentes del tumor. De esta manera se pueden determinar el tamaño del tumor y los ganglios linfáticos afectados. Los procedimientos y tecnologías aquí usados son conocidos para el experto en la materia, asimismo el experto en la materia puede proporcionar una dosis y formulaciones adecuadas.

Las moléculas de reconocimiento marcadas radioactivamente de la invención usadas como agentes de diagnóstico también se pueden administrar por otras vías de aplicación. Para ello vías preferidas son intraperitoneal, intranodal o intrarrectal o intragastrointestinal. Intraperitoneal es especialmente ventajosa para la determinación de tumores, que son accesibles a través de peritoneo y/o se metastatizan en este, por ejemplo carcinomas de ovario y determinados carcinomas gastrointestinales. La administración intrarrectal o intraintestinal es ventajosa para determinados tumores gastrointestinales y su localización y determinación de tamaño. En determinados casos se pueden usar administración intranodal para infiltrar directamente ganglios linfáticos individuales.

Las moléculas de reconocimiento radioactivas descritas anteriormente según la invención que contienen agentes de diagnóstico in vivo se pueden aplicar combinadas con moléculas de reconocimiento específicas para MUC1 no marcadas según la invención. Esto sirve para mejorar el fondo. Los procedimientos y tecnologías aquí usados son conocidos para el experto en la materia, asimismo el experto en la materia puede proporcionar una dosis adecuada, formulaciones, vías de aplicación y tiempo de la administración de las moléculas de reconocimiento no
marcadas.

En una forma de realización preferida adicional las moléculas de reconocimiento según la invención, preferiblemente inmunoglobulinas, multicuerpos o fragmentos de anticuerpos, más preferiblemente IgG, Fab y multicuerpos, se pueden marcar con un colorante fluorescente y facilitar como agentes de diagnóstico in vivo. Las vías de aplicación preferidas son aquí intrarrectal, intragastrointestinal, intraperitoneal, intravenosa y en vasos sanguíneos aferentes o eferentes. Una forma de realización particularmente preferida del agente de diagnóstico sirve para la localización de carcinomas gastrointestinales, que se lleva a cabo a través de una endoscopia fluorescente tras la aplicación de las moléculas de reconocimiento marcadas con fluorescencia. En una forma de realización preferida adicional del agente de diagnóstico se combina una molécula de reconocimiento según la invención con al menos un anticuerpo contra un antígeno tumoral adicional, preferiblemente un anticuerpo anti-Core-1. Preferiblemente se usan diferentes colorantes fluorescentes que permiten una distinción de la molécula de reconocimiento y el anticuerpo, con lo cual se combinan una manifestación de pronóstico con un reconocimiento temprano y mayor número de casos. Los colorantes fluorescentes preferidos son tales con fluorescencia de fondo más baja, que son conocidos para el experto en la materia. Los procedimientos y tecnologías usados aquí, incluyendo el diagnóstico por la imagen, por ejemplo endoscopia de fluorescencia, son conocidos para el experto en la materia, asimismo el experto en la materia puede proporcionar una dosis adecuada, formulaciones, vías de aplicación y tiempo de la administración de las moléculas de reconocimiento no marcadas.

La invención presenta varias ventajas: Las moléculas de reconocimiento específicas de MUC1 según la invención reconocen tipos tumorales de forma específica, con lo que se pueden usar composiciones farmacéuticas con estas moléculas de reconocimiento con ventaja en muchos pacientes de tumores con diferentes indicaciones para un diagnóstico y/o terapia. Además las moléculas de reconocimiento de forma ventajosa se unen muy poco a áreas no accesibles in vivo en tejidos normales. Esto es una ventaja particular frente a los anticuerpos marcadores tumorales conocidos y una propiedad sobresaliente de las moléculas de reconocimiento según la invención. Una ventaja particular de las moléculas de reconocimiento según la invención es la gran especificidad por el tejido tumoral. Esto se basa especialmente en la alta especificidad por un epítopo tumoral MUC1 glicosilado definido. La mucina epitelial polimorfa MUC1 es como molécula completa un marcador tumoral reconocido. Debido a la complejidad de la molécula que es muy grande, está muy glicosilada, esencialmente consta de un gran número de repeticiones en tándem polimórficas de 20 residuos de aminoácidos en estado extracelular y tiene glicosilación heterogénea con respecto a las repeticiones en tándem, MUC1 posee tiene una multiplicidad de epítopos. Las moléculas de reconocimiento según la invención que en el sentido de la invención se unen específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado, detectan un epítopo definido en MUC1, lo que produce una gran especificidad de las moléculas de reconocimiento para tejido tumoral. Especialmente ventajoso es además que las moléculas de reconocimiento según la invención solo reconocen en baja cantidad tal MUC1 liberada al suero a partir de las células tumorales (shedding). Esta unión reducida a MUC1 presente en suero es una gran ventaja en la terapia de enfermedades tumorales con las moléculas de reconocimiento según la invención. Además las moléculas de reconocimiento según la invención muestran una gran afinidad. En particular, se da la posibilidad de construir fragmento de poca valencia, como scFv y multicuerpos. La posibilidad de estos diferentes formatos es ventajosa para el desarrollo de agentes terapéuticos.

A continuación la invención se explica en más detalle por medio de ejemplos, sin estar restringida a estos ejemplos.

Ejemplos 1. Producción de scFv con diferentes longitudes de enlazador, que reconocen específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado

Se produjeron scFv específicos de MUC1 con las secuencias SEQ ID NO. 36 a 59 mediante amplificación por PCR y clonación posterior de las cadenas variables en un vector de expresión en bacterias. Este vector contiene el promotor LacZ, un sitio de unión a ribosomas (RBS), el origen de M13, la secuencia señal de pelB para secreción en el periplasma, un gen de resistencia a ampicilina y un casete de clonación para acoplar una etiqueta de hexa-histidina para purificación eficaz y una etiqueta myc al extremo C-terminal de scFv (Fig. 1). Para las diferentes longitudes de enlazador se amplificaron V_{H} y V_{L} con cebadores específicos de modo que los 22 nucleótidos del extremo 3' de V_{H} y del extremo 5' de V_{L} formaran una región complementaria (Fig.2, PCR I y PCR II). Posteriormente, tras purificación, ambos fragmentos de PCR se unieron en una SOE-PCR (Fig. 2, PCR III) y el fragmento de PCR se clonó en el vector descrito anteriormente a través de NcoI/NotI.

2. Expresión bacteriana y purificación de los scFv, que reconocen específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado

Los fragmentos de anticuerpo del ejemplo 1 se expresaron en E. coli y se purificaron. Para ello el plásmido correspondiente se transformó en E. coli electrocompetentes mediante electroporación y se cultivaron durante la noche en medio 2xTY (10 g de extracto de levadura, 16 g de triptona, 5 g de NaCl por L) con ampicilina 100 \mug/mL. Este cultivo se diluyó 1:100 con medio 2xTY, que estaba suplementado con ampicilina 100 \mug/ml y glucosa al 0,5% y se incubó a 37ºC hasta que se alcanzó una OD_{600 \ nm} de ca. 0,6. Después se añadió ITPG 1 mM al cultivo para la inducción y este se incubó a 25ºC durante 5 horas adicionales. Las bacterias se recogieron mediante centrifugación a 4000xg durante 20 minutos, el precipitado celular se resuspendió en tampón TES (Tris-HCl 30 mM, pH 8,0, sacarosa al 20%, EDTA 1 mM) y se incubó durante 20 minutos en hielo. Posteriormente se añadió MgSO_{4} 5 mM y la suspensión se incubó en hielo durante 20 minutos más. La fracción de periplasma se obtuvo mediante centrifugación a 4000 x g durante 60 minutos y se dializó durante la noche a 4ºC frente tampón de unión (tampón fosfato 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 10 mM). Los fragmentos de anticuerpo contenidos en la fracción periplasmática se purificaron mediante el uso de las etiquetas His C-terminales por medio de cromatografía de afinidad con iones metálicos (HiTrap Chelating HP, Amersham Pharmacia Biotech). Para ello la fracción dializada se cargo en una columna equilibrada anteriormente con tampón de unión y las proteínas no unidas se lavaron de la columna con tampón de lavado (tampón fosfato 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 30 mM). Posteriormente los fragmentos de anticuerpo se eluyeron con tampón de elución (tampón fosfato 50 mM, pH 8,0, NaCl 300 mM, imidazol 300 mM).

3. Clonación de vectores para la expresión de anticuerpos IgG e IgM quiméricos, que reconocen específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado

El fragmento de ADN NcoI/XhoI del vector de scFv que codifica para la V_{H} (Fig. 1), se clonó en el vector BS-Leader cortado con NcoI/SalI (Fig. 3). El vector BS-Leader contiene un casete de clonación para introducir la secuencia del péptido señal del receptor de células T en el extremo 5' así como una secuencia donante de ayuste en el extremo 3' de las secuencias de los dominios variables (Fig. 3). La secuencia V_{L} del anticuerpo correspondiente se amplificó con cebadores específicos para introducir el sitio de corte de NcoI en el extremo 5' y el sitio de corte de NheI en el extremo 3' usando la secuencia scFv como molde y tras digestión con NcoI/NheI se clonó en vector BS-Leader igualmente digerido. Después se clonó cada fragmento HindIII/BamHI del vector BS-Leader en el vector de expresión eucariota. Estos vectores (pEFpuroC\gamma1V_{H}, pEFpuroC\muV_{H} y pEFneoC\kappaV_{L}) contienen el promotor de EF-1\alpha y el potenciador de HCMV, el origen de SV40, la señal de poliadenilación de BGH, el gen de resistencia a puromicina en el vector para la cadena pesada y el gen de resistencia a neomicina en el vector para la cadena ligera así como las secuencias genómicas de la región constante humana \gamma1 o la región \mu para la cadena pesada o la región constante humana \kappa para la cadena ligera (cebador para la amplificación del ADN genómico humano y mapa del vector ver Fig. 3).

4. Expresión eucariota de anticuerpos quiméricos IgG e IgM, que reconocen específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado, en células CHO y su purificación

Para la expresión de los anticuerpos quiméricos cIgG-Panko1 que consta de las secuencias SEQ ID NO. 64 y 68, cIgG-Panko2 que consta de las secuencias SEQ ID NO. 65 y 69, cIgM-Panko1 que consta de las secuencias SEQ ID NO. 66 y 68 y cIgM-Panko2 que consta de las secuencias SEQ ID NO. 67 y 69 se cotransfectaron células CHOdfr- (ATCC-NO. CRL-9096) con una mezcla de los vectores para la cadena pesada y la cadena ligera (1:3) mediante electroporación (10^{6} células/ml, 500 V, 50 \mus) y se cultivaron en medio de selección (Medio CHO-S-SFM II (Life Technologies), suplemento HT (Biochrom), G418 400 \mug/ml, puromicina 5 \mug/ml) durante 2 semanas. Tras la clonación de células individuales en una placa de 96 pocillos se probaron los sobrenadantes en ELISA (péptido MUC1 glicosilado (30-meros, ver posteriormente) como antígeno, anti-Fc\gamma1 humano acoplado a POD o anti Fc5\mu humano acoplado a POD (Dianova) como anticuerpo secundario) y se seleccionó el clon con la mayor tasa de producción de anticuerpo (ca. 0,5 \mug/10^{6} células/24 horas).

Para la producción de anticuerpo las células CHO establemente transfectadas que secretan IgG o IgM quiméricos se cultivaron en botellas de agitación o cultivo en botella en medio CHO-S-SFM II completado mediante el suplemento HT hasta que se alcanzó una densidad celular de ca. 1 x 10^{6} células/ml. Tras la separación de las células del sobrenadante del cultivo celular mediante centrifugación (400 xg, 15 minutos) los anticuerpos quiméricos se purificaron mediante el uso de una columna de proteína A (HiTrap rProtein A FF, Amersham Pharmacia Biotech) para la IgG quimérica o una columna de afinidad del anticuerpo anti Fc5\mu humano para la IgM quimérica. La fracción de anticuerpo purificada eluida mediante cambio rápido de pH se cambió tampón PBS y se concentró usando tubos de centrifugación Centriprep (punto de corte de 50 kDa, Millipore).

5. Análisis de los scFv y anticuerpos, que reconocen específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado, en ELISA

Como antígenos se usaron varios péptidos y glicopéptidos sintéticos: un 30-mero no glicosilado con la secuencia APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTSA; un 30-mero glicosilado con la secuencia APPAHGVTSAPDT[GalNAc\alpha]RPAPGSTAPPAHGVTSA, una serie de péptidos de MUC1 no glicosilados de longitud variable de la secuencia [VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG]_{n}, en donde n = 1, 3 y 5 (TR1, TR3 y TR5), y una serie de péptidos de MUC1 glicosilados de longitud variable de la secuencia A[HGVTSAPDT(GalNAc\alpha)RPAPGSTAPPA]_{n}, en donde n = 1, 3 y 5 (TR1g, TR3g y TR5g).

De las respectivas soluciones madre (1 mg en 1 ml de H_{2}O bidestilada), conservadas a -20ºC en alícuotas, se preparó una dilución de 1 \mug/ml en PBS o 10 \mug/ml en agua bidestilada. De ella se pipetearon 50 \mul/pocillo en una placa de microtitulación y la placa de prueba se incubó durante la noche (para péptidos en PBS uso de inmunoplaca F96 MAXISORP de NUNC e incubación a 4ºC; para péptidos en agua bidestilada uso de placas TC de Nunclon y secado del péptido a 37ºC). Al día siguiente la placa de ensayo se lavó 3X con PBS/Tween20 al 0,2%. Posteriormente se bloquearon los sitios de unión no específica con BSA al 2% en PBS y se aplicaron 50 \mul del primer anticuerpo (Anticuerpo murino: 10-10000 ng/ml en PBS/BSA al 1%; IgG quimérica: 1-100 ng/ml en PBS/BSA al 1%; scFv: 50-500 ng/ml en PBS/BSA al 1%). Tras tres pasos de lavado con PBS/Tween20 al 0,2% se emplearon los correspondientes anticuerpos secundarios acoplados a peroxidasa para la detección de las construcciones de anticuerpo unidas específicamente (un Fc\gamma1 anti-ratón o anti-humano para los anticuerpos completos, un anticuerpo anti-etiqueta de His para scFv). Para la detección del anticuerpo secundario unido se realizó una reacción colorimétrica con TMB (3,3',5,5'-tetrametilbencidina). Después de ca. 15 minutos se paró la reacción mediante adición de H_{2}SO_{4} 2,5 N. La medida se realizó con un fotómetro de placas de microtitulación con un filtro de 450 nm en modo dual frente a un filtro de referencia a 630 nm. Los resultados representativos se representan en las figuras 4 a 8.

5.1. Unión a la región PDTRP glicosilada en una secuencia de repetición en tándem de MUC1

La figura 4 muestra la unión de las moléculas de reconocimiento preferidas según la invención al péptido de MUC1 glicosilado. Se comparan dos moléculas de reconocimiento con secuencias bucle variables en formato IgG. Las construcciones de anticuerpo mIgG-Panko1 (SEQ ID NO. 60 y SEQ ID NO. 62) y mIgG-Panko2 (SEQ ID NO. 61 y SEQ ID NO. 63) se unen con alta especificidad al 30-mero, preferiblemente al péptido glicosilado y solo débilmente o en absoluto a la secuencia de péptido no glicosilado. En comparación con mIgG-Panko1 y mIgG-Panko2, en la figura 5 se representa la unión de los anticuerpos específicos de MUC1 HMFG-1, C595 y SM3 al 30-mero no glicosilado y glicosilado (ejemplo representativo). Los tres anticuerpos HMFG-1, C595 y SM3 no muestran ninguna dependencia o ligera de la glicosilación con un factor (proporción péptido glicosilado/no glicosilado) para los tres anticuerpos de < 1,2. Los anticuerpos se usan para diferenciación y no son parte de las moléculas de reconocimiento según la invención. Por el contrario, se da un factor de > 4,5 para mIgG-Panko1 (en la Fig. 5: 5,1) y un factor de > 20 para mIgG-Panko2 (en la Fig. 5: 22,1) en las mismas condiciones.

En la figura 6 se representan diferentes formatos de las moléculas de reconocimiento según la invención en su unión específica preferida al péptido de MUC1 glicosilado.

5.2. Unión a repeticiones en tándem de MUC1 múltiples no glicosiladas

La figura 7 muestra como ejemplo representativo la dependencia de unión de las moléculas de reconocimiento según la invención mIgG-Panko1 y mIgG-Panko2 del número de repeticiones en tándem no glicosiladas en comparación con los anticuerpos específicos de MUC1 C595 y SM3. La proporción de la señal con el péptido TR5 a la de con el péptido TR1 representa un factor que refleja el grado de dependencia de la unión del número de repeticiones. Para mIgG-Panko1 y mIgG-Panko2 se producen factores de > 3 (en la Fig. 7: 3,9) o > 8 (en la Fig. 7: 12,7), por el contrario los anticuerpos específicos de MUC1 C595 (factor 1,1) y SM3 (factor 2,1) no muestran ninguna o sólo una baja dependencia en las mismas condiciones.

5.3. Unión a repeticiones en tándem de MUC1 múltiples glicosiladas

La figura 8 muestra como ejemplo representativo la dependencia de unión de la molécula de reconocimiento según la invención mIgG-Panko2 del número de repeticiones en tándem (múltiples regiones PDTR glicosiladas) en comparación con los anticuerpos específicos de MUC1 C595 y SM3. mIgG-Panko2 muestra una dependencia adicional del número de repeticiones en tándem glicosiladas, mientras que la unión de los anticuerpos específicos de MUC1 C595 y SM3 es independiente de un aumento del número de repeticiones.

6. Tinción inmunohistológica e inmunocitológica con moléculas de reconocimiento que reconocen específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado

Para la tinción inmunohistológica los cortes congelados de muestras de tejido adecuadas se secaron al aire y se fijaron 15 minutos con formaldehido al 10% en PBS. Para la reducción de la actividad peroxidasa endógena los cortes se trataron con peróxido de hidrógeno al 3% en PBS y tras bloquear los sitios de unión inespecíficos con suero de conejo se incubaron con una molécula de reconocimiento específica para MUC1 según la invención en forma de un anticuerpo primario. Posteriormente las preparaciones se incubaron con un anticuerpo secundario apropiado (IgG anti-ratón acoplada a POD). La reacción de tinción se llevó a cabo mediante el uso de sustrato de la peroxidasa diaminobencidina y la contratinción con hematoxilina.

La molécula de reconocimiento según la invención de ejemplo mIgG-Panko2 reacciona sólo con unas pocas estructuras en tejido normal. Estas se encuentran principalmente en regiones inmunoprivilegiadas del cuerpo, por ejemplo en la superficie apical de células de determinados conductos glandulares, y por lo tanto en áreas que para un anticuerpo en vivo son inaccesibles o muy poco accesibles (tabla 3). Además las tinciones en tejido normal de mama son en comparación con tejido tumoral muy tenues y se encuentran sólo en la membrana apical.

TABLA 3 Reacción de tejidos humanos normales con el anticuerpo específico de MUC1 mIgG-Panko2

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Las moléculas de reconocimiento reivindicadas reaccionan positivamente con gran número de tumores. Los datos en la tabla 4 muestran que las moléculas de reconocimiento específicas para MUC1 reconocen un gran porcentaje de pacientes con tumores de una indicación, que es diferente de indicación a indicación. En adenomas del intestino grueso la tinción se correlaciona con el grado de displasia. Los adenomas de colon no reaccionan o sólo muy débilmente con mIgG-Panko2, mientras que los carcinomas de colon son positivos. El tejido de páncreas normal sólo es débilmente positivo, por el contrario los carcinomas de páncreas muestran una reacción muy fuerte con la molécula de reconocimiento según la invención mIgG-Panko2.

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TABLA 4 Reacción de tejidos tumorales humanos con mIgG-Panko2

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Para las tinciones inmunocitológicas se usó inmunofluorescencia. Para ello las células apropiadas se secaron en portaobjetos y se fijaron con formaldehido al 5% durante 10 minutos. Tras bloquear los sitios de unión inespecífica con BSA (al 1% en PBS) las células se incubaron con la molécula de reconocimiento según la invención en forma de anticuerpo primario. Posteriormente se lavaron 3 veces con PBS y se incubaron con los anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia apropiados (IgG-FITC anti-ratón o Fab-Cy2 anti-humano, Dianova). Tras varios lavados con PBS las células se embebieron en Mowiol.

Se probaron diferentes líneas celulares con las moléculas de reconocimiento específicas de MUC1 en la inmunofluorescencia. Una serie de líneas celulares tumorales reaccionaron positivamente (Tabla 5 y las figuras 9 y 10).

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TABLA 5 Reactividad de diferentes líneas celulares con el anticuerpo específico para MUC1 mIgG-Panko2

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La figura 9 muestra un marcaje de fluorescencia de ejemplo de células T47D, una línea celular de carcinoma de mama, con mIgG-Panko2. La figura 10 muestra un ejemplo de marcaje de fluorescencia de células K562 con cIgG-Panko1.

Con ayuda de inmunohistología y marcaje de inmunofluorescencia también se investigó la dependencia de neuraminidasa del epítopo tumoral MUC1 glicosilado. Para ello los cortes o las células se preincubaron con neuraminidasa (0,02 U/ml PBS + Ca^{2+} 0,01 M) durante una hora a temperatura ambiente, posteriormente se lavaron con PBS y después se marcaron como anteriormente. Como muestran las tablas 6 y 7 la unión de las moléculas de reconocimiento según la invención al epítopo tumoral MUC1 glicosilado en el sentido de la invención es independiente de neuraminidasa o aumenta mediante el tratamiento con neuraminidasa.

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TABLA 6 Tinciones inmunohistológicas de tejidos humanos con mIgG-Panko2 antes y después del tratamiento con neuraminidasa

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TABLA 7 Marcaje de inmunofluorescencia de dos líneas celulares tumorales con mIgG-Panko2 antes y después del tratamiento con neuraminidasa

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7. Quelación y marcaje radioactivo de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos que reconocen específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado

Mediante conjugación, se unió covalentemente un quelante, que permite la unión de un metal radioactivo, a los anticuerpos mIgG-Panko2 y cIgG-Panko1 o a los formatos scFv con las secuencias DEQ ID NO. 36 y 45. Como quelantes se emplearon los productos comerciales de la empresa Macrocyclics (Dallas, EE.UU.), ácido p-isotiocianatobencil-dietilentriaminipentaacético (p-SCN-Bz-DTPA) y ácido p-isotiocianatobencil-1,4,7,10-tetraazaciclododecan-1,4,7,10-tetraacético (p-SCN-Bz-DOTA). Ambos quelantes son adecuados para acoplar un anticuerpo con marcaje radioactivo [Brechbiel et al., 1986; Kozak et al., 1989; Stimmel et al., 1995].

La conjugación se realizó mediante reacción del grupo isotiocianato del quelante con grupo \varepsilon-amino libre del aminoácido lisina en el anticuerpo. Se forma un enlace N-C covalente entre el quelante y el anticuerpo.

Primero se debe intercambiar el tampón del anticuerpo purificado o el fragmento de anticuerpo purificado a tampón de acoplamiento de pH 8,7. Para ello se realiza una ultrafiltración en un cartucho de filtración (Centriprep YM-50 o YM-10; Millipore). Esto se realiza mediante diluciones múltiples con un volumen de 10 veces y filtración a través de una membrana con tamaño de poro definido por centrifugación. Por lo tanto se intercambia el PBS por el tampón de acoplamiento alcalino (carbonato de sodio 0,05 M, cloruro de sodio 0,15 M, pH 8,7).

La quelación se realizó con los quelantes bifuncionales p-SCN-Bz-DTPA o p-SCN-Bz-DOPA. Para la reacción de quelación se mezclaron proteína (1-10 mg/ml) en tampón de acoplamiento y una solución del quelante de 1 mg/ml en DMSO al 2%/agua de modo que se aseguró un exceso molar del quelante. Siguió una incubación de la mezcla durante 1 hora a 37ºC. Posteriormente se eliminó el quelante no unido mediante ultrafiltración en el mismo recipiente (Centriprep YM-50 o YM-10; Millipore) y como se ha descrito anteriormente se intercambió el tampón a pH 4,2 en el tampón de carga (acetato de sodio 0,15 M, cloruro de sodio 0,15 M, pH 4), necesario para el radiomarcaje. La concentración de proteína durante y después de este paso se volvió a ajustar a 1-10 mg/ml con ayuda de una medida con UV a 280 nm.

Se tuvieron que encontrar condiciones para la reacción de quelación que permitieran un radiomarcaje del anticuerpo sin disminuir sustancialmente su bioactividad.

El anticuerpo quelado se cargo con un metal radioactivo por lo que produjo un radio-anticuerpo. Para la carga se usaron los isótopos ^{111}indio y ^{90}itrio. Ambos tienen propiedades físicas y fisicoquímicas comparables y se unen a través del quelante como iones trivalentes (^{111}In^{3+}, ^{90}Y^{3+}). El anticuerpo marcado con ^{111}indio es un emisor \gamma y se usa en clínica para determinar la dosis individual de los pacientes, mientras que ^{90}itrio es un emisor \beta, que se usa terapéuticamente. Las vidas medias son de 67 horas para ^{111}In y de 64 horas para ^{90}Y.

Para la carga se usó cloruro de ^{111}indio de la empresa NEN (Perkin Elmer, Bélgica). El radiometal se suministra en solución de ácido clorhídrico. Esta solución de ^{111}InCl_{3} se lleva primero durante un tiempo corto a una concentración de HCl de 1 M. Posteriormente se diluyó con HCl 0,05 M a una actividad específica de 80-320 mCi/ml y de ella se usa una alícuota para incorporación en el anticuerpo quelado, por lo cual el volumen usado de ácido HCl solución de ^{111}InCl_{3} debería igualar el volumen de la solución de anticuerpo suministrada en tampón de acoplamiento de pH 4,2, para asegurar la estabilidad del pH. El tiempo de incubación fue de 1 hora a 37ºC mezclando cuidadosamente de forma ocasional.

A continuación se insertó la pieza del filtro en el cartucho de filtración y como se ha descrito anteriormente se intercambió el tampón a tampón fosfato pH 7,2 con concentración fisiológica de cloruro de sodio. De esta manera se produjo una separación de los anticuerpos de alto peso molecular marcados radioactivamente y el ^{111}InCl_{3} no unido. La cuantificación de la incorporación de ^{111}In en el anticuerpo quelado se realizó mediante cromatografía de capa fina. La tasa de incorporación del radiometal estaba entre 80-99% de la radioactividad usada.

8. Pruebas de unión a células y análisis por Scatchard de moléculas de reconocimiento marcadas radioactivamente que reconocen específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado

Se usaron varias líneas de células tumorales para probar la capacidad de unión a células de las moléculas de reconocimiento radiomarcadas. Para ello en cada doble determinación se colocaron un número determinado de células en un recipiente de 1,5 ml y se incubaron con cantidades crecientes de anticuerpo. Después de lavar se determinó la cantidad de anticuerpo unido mediante la tasa de cuentas. Este valor se representó en un diagrama como la proporción unido/no unido frente a la cantidad unida y se determinó la pendiente en la zona lineal de la curva y se determinó el punto de corte con el eje de abscisas (análisis por Scatchard, ver más adelante). Se usaron 1x10^{6} células por determinación. Después de preincubar las células durante una hora en hielo se colocó la cantidad necesaria de células en un recipiente de reacción, se centrifugaron (5 minutos, 1000xg, 25ºC) y se retiró el sobrenadante. Después se llenó con PBS/Tween20 al 0,1%/BSA al 1% hasta un volumen de 200 \mul menos la cantidad de molécula de reconocimiento aún por añadir. Posteriormente se añadió la molécula de reconocimiento correspondiente hasta un volumen final de 200 \mul (ca. 40 a 500 ng, según la molécula de reconocimiento) y las determinaciones se incubaron durante una hora a 4-8ºC. Después de centrifugar (5 minutos, 1000xg, 25ºC) se eliminó el sobrenadante y el precipitado de células se resuspendió cuidadosamente en 500 \mul de PBST/BSA al 1%. Tras volver a lavar el precipitado de células se midió en el recipiente en un contador gamma. Se determinaron las tasas de cuentas específicas en las soluciones iniciales de concentración definida, el valor en cpm/ng se uso como base para la relativización de los valores medidos de anticuerpo unido. Los valores de abscisa representan moléculas de anticuerpo unidas por célula (r). El valor correspondiente de ordenadas es el cociente de unión (r) a unión libre, representando la unión libre la diferencia de la cantidad total y la cantidad unida de anticuerpo (en la figura 12 valores en M). El punto de corte de abscisas expresa la cantidad de sitios de unión/célula. De la pendiente la línea recta se obtiene la constante de asociación Kas en [M^{-1}].

En la figura 11 se representan ejemplos de los análisis por Scatchard de la unión de moléculas de reconocimiento marcadas radioactivamente en formato scFv con las secuencias SEQ ID NO. 36 (scFv monovalente, Fig. 11a) y 45 (multicuerpo, Fig. 11b) a células T47D, obteniéndose en estas condiciones para los scFv monovalentes una Kas de 4,5 x 10^{6} M^{-1} y 5,3 x 10^{6} sitios de unión/célula así como para los multicuerpos una Kas de 1,9 x 10^{7} M^{-1} ó 2,6 x 10^{6} sitios de unión/célula.

En la tabla 8 se resumen las constantes de asociación y la cantidad de sitios de unión por célula de diferentes anticuerpos y formatos de anticuerpos en células K562 y se comparan con HMFG-1, que se usó y probó en las mismas condiciones.

TABLA 8 Prueba de unión a células y análisis por Scatchard con moléculas de reconocimiento a células K562

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9. Biodistribución de las moléculas de reconocimiento marcadas radioactivamente, que reconocen específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado, en un modelo tumoral in vivo

Como modelo tumoral se trasplantó subcutáneamente tejido de carcinoma de colon humano (xenoinjerto #5841) en ratones desnudos (Ncr: nu/nu, hembras). Como un modelo tumoral adicional se inyectaron subcutáneamente 10^{7} células de cáncer de mama ZR-75-1 positivas para MUC1 en ratones desnudos (Ncr: nu/nu, hembras). Después de ca. 3-4 semanas el tumor es palpable bajo la piel. A cada uno los ratones que tienen tumor (por cada punto de tiempo n = 5) se les administró i.v. 5 \mug de mIgG-Panko2 marcado con ^{111}In en 200 \mul en la vena de la cola. Después de 5 min, 1 h, 4 h, 8 h, 24 h, 48 h y 72 h los ratones se sacrificaron y determinó la distribución de la radioactividad en el tumor, en suero y en los órganos. La acumulación específica de mIgG-Panko2 en el tumor como % DI/g de tumor (relativa a la dosis inyectada y el peso del tumor) en el modelo de tejido trasplantado se representa en la figura 12. Por el contrario, se encuentra en los órganos y el suero una disminución de radioactividad a lo largo del tiempo indicado. En la figura 13 se resumen los resultados con el modelo ZR-75-1. La absorción específica de mIgG-Panko2 marcado radioactivamente en el tumor llega después de 72 horas hasta el 85% DI/g de tumor, siendo la acumulación en los órganos y el suero muy baja y comparable con ratones sanos.

10. Detección de MUC1 secretora específica de tumor en ELISA sándwich con moléculas de reconocimiento que reconocen específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado

MUC1 secretora específica de tumor se puede detectar en ELISA sándwich. Para se usa un anticuerpo específico de MUC1 como anticuerpo de captura de MUC1 y una molécula de reconocimiento según la invención para la detección de MUC1 específica de tumor. Para detectar MUC1 secretora Core-1 positiva, se usa por ejemplo una molécula de reconocimiento como captador y un anticuerpo específico de Core-1 para la detección del antígeno Core-1. Se debe usar un tercer anticuerpo acoplado a enzima o fluorescencia para la detección del segundo anticuerpo.

Como ejemplo se analizaron los sobrenadantes de tres líneas de células tumorales (K562, ZR-75-1 y T47D). Los resultados se representan en la tabla 9. Se sembraron 10^{5} células por ml de medio de cultivo celular, se cultivaron 4 días sin cambio de medio, posteriormente se tomó una alícuota y el sobrenadante de cultivo se separó del precipitado de células mediante centrifugación. 50 \mul de estos sobrenadantes no diluidos se usaron en el ELISA. El ELISA sándwich se realizó cubriendo una placa de microtitulación con anticuerpo de captura (HMFG-1 o mIgG-Panko2, 1 \mug/ml) en PBS durante la noche a 4ºC. Se probaron tres concentraciones diferentes de anticuerpo para el recubrimiento (1 \mug/ml, 2 \mug/ml y 4 \mug/ml). El recubrimiento con 1 \mug/ml se encontró que era el más sensible en ELISA sándwich. Posteriormente las placas recubiertas con el anticuerpo se lavaron dos veces con PBS y se bloquearon durante 1,5 horas en BSA al 5%, Tween 20 al 0,05% en PBS a temperatura ambiente. El tampón de bloqueo se eliminó, las placas se lavaron una vez más con Tween 20 al 0,1% en PBS (tampón de lavado), se añadieron las muestras y se incubaron 1,5 horas a temperatura ambiente. Como controles negativos se usaron el medio de cultivo celular o BSA al 2% en tampón de lavado (tampón de dilución para el segundo anticuerpo). No se disponía de control positivo. Para el ELISA sándwich de MUC1-Core-1, tras tres lavados, se realizó el tratamiento con neuraminidasa en los pocillos previstos para ello. Para este fin se diluyó la solución de neuraminidasa (DADE, Behring, Alemania) en tampón de imidazol (0,68 g de imidazol, 0,19 g de CaCl_{2} y 0,4 g de NaCl en 100 ml de H_{2}O, pH 6,8) 1:5 y se incubaron 50 \mul/pocillo durante 30 minutos a 37ºC. Como control se incubó el tampón de imidazol sin solución de neuraminidasa en un pocillo correspondiente. Posteriormente, los pocillos se lavaron tres veces y se añadió mIgG-Panko2 biotinilado (EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotina, Pierce) o un anticuerpo anti-Core-1 (mIgM-Karo4) para la detección de MUC1 o MUC1 que lleva Core-1 en BSA al 2% en tampón de lavado y se incubó una hora adicional a temperatura ambiente. Tras tres lavados adicionales siguió la adición de estreptavidina acoplada a peroxidasa o un anticuerpo anti-IgM(\mu) acoplado a peroxidasa (Dianova) diluido 1:300 ó 1:5000 en BSA al 2% en tampón de lavado y una incubación a temperatura ambiente durante 1 hora. Posteriormente se lavaron las placas dos veces en tampón de lavado y una vez en PBS. La reacción de tinción se realizó en ácido cítrico 25 mM, tampón fosfato pH 5,0 con H_{2}O_{2} al 0,04% y 0,4 mg/ml de O-fenilendiamina (Sigma) en la oscuridad a temperatura ambiente. La reacción de tinción se paró mediante adición de ácido sulfúrico 2,5 N (concentración final 0,07 N) y se midió en un lector de ELISA a 492 nm con un filtro de referencia de 620 nm.

TABLA 9 Análisis de MUC1 secretora específica de tumor en sobrenadantes de cultivo de dos líneas celulares y detección de Core-1 antes y después del tratamiento con neuraminidasa en ELISA sándwich

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11. Detección de MUC1 en suero de pacientes de carcinoma de colon mediante moléculas de reconocimiento que reconocen específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado

Para la detección de MUC1 soluble en suero de pacientes se usó un ELISA sándwich como se ha descrito anteriormente. Como anticuerpo de captura se usó el anticuerpo anti-MUC1 115D8 (captador en la prueba comercial CA 15-3) o mIgG-Panko2 (1 \mug/ml en PBS). Tras bloquear con BSA al 2%/PBS se aplicaron los sueros. Se investigaron 24 sueros diferentes de pacientes de carcinoma de colon en diferentes diluciones (de no diluido hasta diluido 1:32). Como estándar se usaron diluciones de un suero definido de un paciente de carcinoma de mama (152 U/ml, prueba Enzymun CA 15-3, Boehringer Mannheim). Como valor límite se establecieron 23 U/ml (valor medio para sueros normales en la bibliografía). Para la detección de MUC1 unido se compararon mIgG-Panko2 con otros dos anticuerpos anti-MUC1, DF3 (anticuerpo de detección en la prueba CA 15-3) y HMFG-1. Los tres anticuerpos se utilizaron biotinilados (EZ-Link Sulfo-NH-LC-biotina, Pierce) y tras tres lavados con PBS + Tween20 al 0,1% se acoplaron a estreptavidina-POD (1:300 en BSA al 0,2%/PBS) y se detectaron con TMB como sustrato de peroxidasa (comparar anteriormente).

En la tabla 10 se resumen los datos. MUC1 soluble en suero de pacientes de carcinoma de colon se une claramente menos a la molécula de reconocimiento según la invención mIgG-Panko2 que a los anticuerpos anti-MUC1 conocidos DF3 y HMFG-1.

TABLA 10 Detección de MUC1 de suero en ELISA mediante el uso de diferentes anticuerpos anti-MUC1

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12. Terapia tumoral para la reducción de tumores positivos para MUC1 con moléculas de reconocimiento marcadas radioactivamente, que reconocen específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado, en un modelo tumoral in vivo

El potencial terapéutico de mIgG-Panko2 se investigó en el modelo tumoral ZR-75-1 (ver el ejemplo 9). Las moléculas de reconocimiento queladas (ver el ejemplo 7) se cargaron aquí con ^{90}itrio (un emisor \beta para destruir las células tumorales) (pH 4,5, 37ºC, 30 minutos; comparar con la incorporación de ^{111}indio) y se controló la estabilidad en la cromatografía de capa fina.

Una semana a ocho semanas después de la inyección subcutánea de las células ZR-75-1 (dependiendo del tamaño deseado del tumor como modelo para el tratamiento de tumores sólidos medianos (ca. 0,3 cm^{3}) o grandes (> 0,5 cm^{3}) o para tratamiento de enfermedad residual mínima (< 0,05 cm^{3})) a los ratones que tienen tumores se les administró 200 \mul i.v. en la vena de la cola. La solución de inyección contenía mIgG-Panko2 marcado con ^{90}Y (100 \muCi por dosis; actividad específica 3 mCi/mg de anticuerpo) en PBS con Ca/Mg con suero fetal de ternera al 4% como protección de radiolisis. Los grupos control recibieron la misma inyección sin molécula de reconocimiento marcada radioactivamente o un anticuerpo control marcado radioactivamente (^{90}Y-MOPC21).

Se midieron y compararon el peso corporal y el tamaño del tumor dos veces por semana. El crecimiento relativo del tumor se determinó teniendo en cuenta el tamaño de cada tumor al principio del tratamiento. Una segunda inyección (50 \muCi por dosis) se inyectó ca. tres semanas después del primer tratamiento. Este tipo de tratamiento produjo en todos los animales investigados un efecto antitumoral fuerte. En el tratamiento de tumores pequeños (< 0,05 cm^{3}) o medianos (ca. 0,3 cm^{3}) se pudo inhibir completamente el crecimiento tumoral durante el periodo completo de tiempo de observación (6 semanas) (Fig. 14a y 14b). En animales con tumores muy grandes (> 0,5 cm^{3}) al inicio del tratamiento se impidió el crecimiento del tumor durante alrededor de tres semanas (Fig. 14c). No se pudo dar una segunda inyección en el grupo control debido al tamaño del tumor ya no razonable.

El tratamiento con un anticuerpo irrelevante marcado con ^{90}Y (MOPC21) en las mismas dosis sólo produjo una pequeña reducción del crecimiento del tumor en comparación con los animales no tratados (Fig. 14d), que puede ser debido a la radiación inespecífica mediante una eliminación lenta del anticuerpo en el suero.

Aparte de una mielotoxicidad baja el tratamiento con mIgG-Panko2 marcado con ^{90}Y no mostró efectos secundarios.

13. Detección de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo de las moléculas de reconocimiento, que reconocen específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado, en un modelo in vitro

Se investigó la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) de las moléculas de reconocimiento según la invención en una prueba de liberación de europio. Las células diana (ZR-75-1 o MCF-7; 5 x 10^{6}) se incubaron durante 10 minutos a 4ºC en 800 \mul de tampón de europio (HEPES 50 mM, pH 7,4, NaCl 93 mM, KCl 5 mM, MgCl_{2} 2 mM, ácido dietilentriamino-pentaacético 10 mM, acetato de europio (III) 2 mM), se electroporaron en un multiporador (Eppendorf) (710 V, 1 pulso, 30 \mus) y posteriormente se incubaron 10 minutos más en hielo. Después las células se lavaron 5 veces en RPMI 1640/SFT al 5% y se sembraron en una placa de 96 pocillos de fondo redondeado (Nunc) (5 x 10^{3} en 100 \mul por pocillo). Después de la adición de 20 \mul de mIgG-Panko2, HMFG-1, cIgG-Panko1 o cIgG-Panko2 a diferentes concentraciones (de 0,2 a 25 \mug/ml concentración final en 200 \mul de volumen de incubación) o los controles correspondientes (medio, hIgG isotipo control) se añadieron como células efectoras células sanguíneas periféricas humanas (80 \mul/pocillo, para la preparación ver el ejemplo 14)), usando una proporción células efectoras/células diana de 5 hasta 100 a 1. Para determinar la liberación espontánea se añadieron 80 \mul de RPMI/SFT sin células efectoras. La liberación máxima se determinó tras la lisis completa de las células diana con etanol. Tras una incubación de 4 a 20 horas en un incubador a 37ºC la placa se centrifugó a 500 xg 5 minutos y se pipetearon 20 \mul de cada muestra en 200 \mul por pocillo de solución potenciadora (PerkinElmer Wallac). Tras una incubación de 15 minutos a temperatura ambiente se determinó la fluorescencia (fluorímetro Victor^{2}, PerkinElmer Wallac). La citotoxicidad específica se obtiene de la ecuación (lisis experimental - lisis espontánea)/(lisis máxima -lisis espontánea).

Las IgG quiméricas de Panko1 y Panko2 muestran una alta lisis específica de las células diana positivas para MUC1 (Fig. 15a). La IgG murina de Panko2 muestra una citotoxicidad algo más baja que las moléculas de reconocimiento quiméricas, pero un efecto claramente mayor que el anticuerpo murino anti-MUC1 HMFG-1, en el que sólo se observa una lisis ligera para la concentración más alta probada (Fig. 15b).

14. Análisis de la unión de moléculas de reconocimiento, que reconocen específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado, a células sanguíneas humanas

Se pudo detectar una expresión de MUC1 en células hematopoyéticas mediante diferentes anticuerpos anti-MUC1. Sin embargo diferentes resultados con diferentes anticuerpos anti-MUC1 llegan a la conclusión que el reconocimiento de MUC1 no epitelial depende fuertemente de la especificidad fina de cada anticuerpo y en las células existen patrones variables de glicosilación de MUC1. La unión de las moléculas de reconocimiento según la invención a células sanguíneas humanas se investigó mediante citometría de flujo.

Se recogieron células sanguíneas periféricas humanas de sangre de donantes sanos por medio de centrifugación en gradiente (Ficoll-Hypaque). La capa de células se recogió y se lavó 3 veces con RPMI 1640/SFT al 5%. Las células se usaron recientes o se crioconservaron y antes de su uso en la tinción celular o como células efectoras en la prueba ADCC (ver el ejemplo 13) se descongelaron en medio RPMI 1640/SFT al 10%. Para la estimulación de células T humanas, las células sanguíneas aisladas se incubaron en RPMI/SFT + PHA 1 \mug/ml + hIL-2 60 U/ml de 3 a 8 días en un incubador. La estimulación se controló por citometría de flujo mediante la detección del marcador de activación CD25.

Las células sanguíneas aisladas se incubaron con mIgG-Panko1, mIgG-Panko2, HMFG-1 o DF3 y como control con un isotipo control mIgG1 durante una hora en hielo. Tras el lavado con PBS las células se incubaron (30 min, 4ºC, en la oscuridad) con IgG de cabra anti-ratón conjugada con Cy3 (dianova) y/o con un anticuerpo marcado con FITC específico de marcadores CD (CD3, CD14, CD19). Tras el lavado las células se analizaron por citometría de
flujo.

Ninguno de los anticuerpos probados se une a células T no activadas. Tras la estimulación con PHA la expresión de MUC1 en células T humanas se regula por aumento. Este MUC1 se detecta fuertemente mediante HMFG-1 y DF3 y sólo a un bajo nivel por Panko2. Panko1 no muestra unión a células sanguíneas estimuladas con PHA (Fig. 16). Panko2 y DF3 no reconocen MUC1 de monocitos ni de células B. Por el contrario, HMFG-1 y Panko1 se unen poco a monocitos y HMFG-1 también a células B (Fig. 16), siendo las densidades de superficie que se detectan claramente más bajas que las de las células T activadas.

Leyenda de las figuras

Fig. 1: Vector para la clonación y expresión bacteriana de fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla.

Fig. 2: Esquema de clonación para la producción de fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla con diferente longitud del enlazador.

Fig. 3: Sistema de vectores para la clonación y expresión eucariota de anticuerpos quiméricos en formato IgG1 o IgM.

Fig. 4: Unión de las moléculas de reconocimiento según la invención mIgG-Panko1 y mIgG-Panko2 a péptido de MUC1 glicosilado y no glicosilado en ELISA. Como antígeno se usó el 30-mero no glicosilado con la secuencia APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS y el 30-mero glicosilado con la secuencia APPAHGVTSAPDT[GalNAc\alpha]RPAPGSTAPPAHGVTSA y se unieron a la placa en PBS. Los anticuerpos mIgG-Panko1 y mIgG-Panko2 se añadieron a una concentración de 0,5 \mug/ml en el ELISA.

Fig. 5: Comparación de la unión específica de los anticuerpos anti-MUC1 HMFG-1, C595 y SM3 con mIgG-Panko1 y mIgG-Panko2 al péptido de MUC1 glicosilado y no glicosilado en ELISA. Como antígeno se usó el 30-mero no glicosilado con la secuencia APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS y el 30-mero glicosilado con la secuencia APPAHGVTSAPDT[GalNAc\alpha]RPAPGSTAPPAHGVTSA y se secaron en H_{2}O en la placa. Los anticuerpos se añadieron a una concentración de 10 \mug/ml en el ELISA.

Fig. 6: Unión específica de diferentes formatos preferidos de moléculas de reconocimiento según la invención en ELISA, por ejemplo al péptido 30-mero de MUC1 glicosilado y no glicosilado. Como antígeno se usó el 30-mero no glicosilado con la secuencia APPAHGVTSAPDTRPAPGSTAPPAHGVTS y el 30-mero glicosilado con la secuencia APPAHGVTSAPDT[GalNAc\alpha]RPAPGSTAPPAHGVTSA y se unieron a la placa en PBS. Se añadieron ambos formatos scFv SEQ ID NO. 36 y 45 a 0,5 \mug/ml, la IgG murina a 0,1 \mug/ml y la IgG quimérica a 0,01 \mug/ml. Puesto que para los diferentes formatos se usaron diferentes anticuerpos secundarios, los datos del ELISA se valoran sólo de forma cualitativa.

Fig. 7: Dependencia de la unión de las moléculas de reconocimiento según la invención mIgG-Panko1 y mIgG-Panko2 del número de repeticiones en tándem en péptidos de MUC1 no glicosilados en comparación con los anticuerpos específicos de MUC1 SM3 y C595 en ELISA. Como antígeno se usó una serie de péptidos de MUC1 glicosilados de longitud variable de la secuencia [VTSAPDTRPAPGSTAPPAHG]_{n}, en donde n = 1, 3 y 5 (TR1, TR3 y TR5), y se secaron en H_{2}O en la placa. Los anticuerpos se añadieron a una concentración de 10 \mug/ml.

Fig. 8: Dependencia de la unión de la molécula de reconocimiento según la invención mIgG-Panko2 del número de repeticiones en tándem (múltiples regiones PDTR glicosiladas) en comparación con los anticuerpos específicos de MUC1, SM3 y C595 en ELISA. Como antígeno se usó una serie de péptidos de MUC1 glicosilados de longitud variable de la secuencia A[HGVTSAPDT(GalNAc\alpha)RPAPGSTAPPA]_{n}, en donde n = 1, 3 y 5 (TR1g, TR3g y TR5g), y se secaron en H_{2}O en la placa. Los anticuerpos se añadieron a una concentración de 10 \mug/ml.

Fig. 9: Marcaje de fluorescencia de células de la línea de células tumorales T47D (carcinoma de mama) con la molécula de reconocimiento mIgG-Panko2.

Fig. 10: Marcaje de fluorescencia de células de la línea de células tumorales K562 (leucemia eritroide) con la molécula de reconocimiento específica de MUC1 cIgG-Panko1.

Fig. 11: Diagrama de Scatchard para el análisis de la unión a células de moléculas de reconocimiento específicas de MUC1 marcadas radioactivamente. Como ejemplos se presentan aquí los datos de unión de los dos formatos scFv SEQ ID NO. 36 (a) y SEQ ID NO. 45 (b). r: moléculas unidas por célula, A: concentración añadida de la molécula de reconocimiento radioactivamente marcada [M], x: parte unida a la célula [M]. La diferencia A-x representa la concentración de moléculas de reconocimiento libres en el ensayo. Arriba se da la ecuación de la recta correspondiente, en donde la pendiente de la recta reproduce la constante de asociación.

Fig. 12: Enriquecimiento específico de la molécula de reconocimiento mIgG-Panko2 marcada radioactivamente en el tumor en un modelo xenotrasplantado de ratón. A cada ratón que tiene tumor (por cada punto temporal n=5) se les administró i.v. 5 \mug de mIgG-Panko2 marcado con ^{111}In. Los ratones se sacrificaron en los puntos de tiempos dados y se determinaron la concentración en el tumor, referida a la dosis inyectada y el peso del tumor (%DI/g).

Fig. 13: Enriquecimiento altamente específico de la molécula de reconocimiento mIgG-Panko2 marcada radioactivamente en el tumor en un modelo de ratón de células tumorales ZR-75-1. A cada ratón con tumores (por cada punto temporal n=6) se les administró i.v. 5 \mug de mIgG-Panko2 marcado con ^{111}In. Los ratones se sacrificaron en los puntos de tiempos dados y se determinaron la concentración en el tumor, en el suero y en los órganos, referidas a la dosis inyectada y el peso del tumor o el órgano (%DI/g).

Fig. 14: Inhibición del crecimiento tumoral en ratones con tumores tras el tratamiento con la molécula de reconocimiento mIgG-Panko2 marcada radioactivamente. En el día 8 (14a; tumores pequeños: < 0,05 cm^{3}), en el día 36 (14b; tumores medianos: ca. 0,3 cm^{3}) o en el día 57 (14c; tumores grandes: > 0,5 cm^{3}) tras la inyección subcutánea de las células ZR-75-1 se administró a los ratones con tumores 200 \mul i.v. en la vena de la cola. La solución de inyección contenía mIgG-Panko2 marcado con ^{90}Y (100 \muCi por dosis; actividad específica 3 mCi/mg de anticuerpo) en PBS-Ca/Mg con suero fetal de ternera al 4% para protección de radiolisis. A los grupos control se les administró la misma inyección sin molécula de reconocimiento marcada radioactivamente. En tumores pequeños y medianos se dio una segunda inyección (50 \muCi) ca. 3 semanas después.

La Fig. 14d muestra el tratamiento de ratones con tumores con ^{90}Y-mIgG-Panko2 en comparación con un anticuerpo control irrelevante marcado radioactivamente ^{90}Y-MOPC21.

Fig. 15: Mediación específica de la citotoxidad celular dependiente de anticuerpo a través de las moléculas de reconocimiento según la invención Panko1 y Panko2. Los anticuerpos se añadieron en una concentración de 0,2 a 25 \mug/ml. (a) El formato cIgG de Panko1 y Panko2 muestran lisis muy específica de las células ZR-75-1 positivas para MUC1. (b) mIgG-Panko2 media igualmente una lisis de células tumorales específica y muestra claramente un efecto mayor que el anticuerpo murino anti-MUC1 HMFG-1, para el que sólo se observa una ligera lisis a la concentración más alta probada (25 \mug/ml).

Fig. 16: Análisis de la unión de las moléculas de reconocimiento según la invención a células sanguíneas humanas. Se obtuvieron células sanguíneas periféricas humanas a partir de sangre de donantes sanos por medio de centrifugación en densidad. Para la estimulación de células T humanas se incubaron las células sanguíneas aisladas en RPMI/SFT + PHA 1 \mug/ml + hIL2 60 U/ml durante 3 a 8 días en un incubador. Las células sanguíneas aisladas se tiñeron con mIgG-Panko1, mIgG-Panko2, HMFG-1, DF3 o mIgG1 (control) y con Ig de cabra anti-ratón conjugadas con Cy3 (dianova) y/o con un anticuerpo marcado con FITC específico de marcador CD (CD3, CD14, CD15). Después de lavar las células se analizaron mediante citometría de flujo.

Las molécula de reconocimiento Panko1 y Panko2 no muestran unión a células sanguíneas humanas o muy poca. Por el contrario los anticuerpos específicos de MUC1 HMFG-1 y DF3 se unen fuertemente a las células T estimuladas con PHA y HMFG-1 también a células B y monocitos.

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Wu S & Cygler M. J Mol Biol 229, 597-601 (1993).

Secuencias de CDR

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20

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Cadena pesada variable

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21

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Cadena ligera variable

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22

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Pares VH/VL

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23

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Diferentes formatos Fv de cadena sencilla

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24

25

250

26

27

28

280

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Anticuerpo murino

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Cadena ligera de una IgG1 murina (cadena kappa)

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29

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Cadena pesada de IgG1 murina

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30

\newpage

Anticuerpos murinos

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31

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Anticuerpos quiméricos (ratón/humano)

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Cadena ligera de IgG1 quimérica (cadena gamma)

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32

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Cadena pesada de una IgM quimérica (cadena mu)

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33

34

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Cadena ligera de una IgM o IgM quimérica (cadena kappa)

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35

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\vskip1.000000\baselineskip

Anticuerpos quiméricos

\vskip1.000000\baselineskip

36

Claims

1. Molécula de reconocimiento, caracterizada en que comprende una secuencia de aminoácidos, que contiene

(i): la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 1 ó 2 y

(ii): la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 3 ó 4 y

(iii): la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 5 ó 6

y

\quad: se une de forma específica al epítopo tumoral MUC1 glicosilado de modo que la fuerza de la unión en comparación con la unión al péptido no glicosilado de la misma longitud y secuencia peptídica aumenta al menos en un factor de 20.

\vskip1.000000\baselineskip

2. Molécula de reconocimiento según la reivindicación 1, caracterizada en que comprende una secuencia de aminoácidos, que contiene las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO. 1 y SEQ ID NO. 3 y SEQ ID NO. 5 y se une específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado.

3. Molécula de reconocimiento según la reivindicación 1, caracterizada en que comprende una secuencia de aminoácidos, que contiene las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO. 2 y SEQ ID NO. 4 y SEQ ID NO. 6 y se une específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado.

4. Molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada en que comprende además una secuencia de aminoácidos que contiene

(i): la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO, 7 u 8 y

(ii): la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 9 ó 10 y

(iii): la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO. 11 ó 12

y

se une específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado.

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5. Molécula de reconocimiento según la reivindicación 2, caracterizada en que además comprende una secuencia de aminoácidos que contiene las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO. 7 y SEQ ID NO. 9 y SEQ ID NO. 11 y se une específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado.

6. Molécula de reconocimiento según la reivindicación 3, caracterizada en que además comprende una secuencia de aminoácidos que contiene las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO. 8 y SEQ ID NO. 10 y SEQ ID NO. 12 y se une específicamente al epítopo tumoral MUC1 glicosilado.

7. Molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizada en que además comprende secuencias marco, que separan entre sí y/o flanquean las secuencias de aminoácidos, en donde las secuencias marco son secuencias marco de anticuerpo.

8. Molécula de reconocimiento según la reivindicación 7, caracterizada en que las secuencias marco de anticuerpo para la molécula de reconocimiento según las reivindicaciones 1, 2 ó 3, son secuencias de la cadena pesada variable VH y las secuencias marco de anticuerpo para las secuencias adicionales de la molécula de reconocimiento según las reivindicaciones 4, 5 ó 6 son secuencias de la cadena ligera variable VL.

9. Molécula de reconocimiento según la reivindicación 7 u 8, caracterizada en que las secuencias marco de anticuerpo son de origen murino o humano.

10. Molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizada en que las secuencias marco de anticuerpo

a): FRH1, FRH2, FRH3 y FRH4 para la cadena pesada variable VH son las siguientes secuencias de aminoácidos, en donde la posición del aminoácido corresponde a la numeración según Kabat:

37

38

39

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b): FRL1, FRL2, FRL3 y FRL4 para la cadena ligera variable VL son las siguientes secuencias de aminoácidos, en donde la posición del aminoácido corresponde a la numeración según Kabat:

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40

41

42

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11. Molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada en que la molécula de reconocimiento comprende una combinación de las secuencias SEQ ID NO. 32 y 34 o las variantes humanizadas de estas secuencias.

12. Molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada en que la molécula de reconocimiento comprende una combinación de las secuencias SEQ ID NO. 33 y 35 o las variantes humanizadas de estas secuencias.

13. Molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, caracterizada en que comprende un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla, un multicuerpo, un fragmento Fab, una proteína de fusión de un fragmento de anticuerpo con péptidos y/o proteínas y/o una inmunoglobulina de los isotipos IgG, IgM, IgA, IgE, IgD y/o sus subclases.

14. Molécula de reconocimiento según la reivindicación 13, caracterizada en que comprende un anticuerpo o fragmento de anticuerpo murino, quimerizado, humanizado, humano o parcialmente humano.

15. Molécula de reconocimiento según la reivindicación 14, caracterizada en que comprende al menos una secuencia según SEQ ID NO. 36 a 47, SEQ ID NO. 60, 62, 64, 66 ó 68 o las variantes humanizadas de estas
secuencias.

16. Molécula de reconocimiento según la reivindicación 14, caracterizada en que comprende al menos una secuencia según SEQ ID NO. 48 a 59, SEQ ID NO. 61, 63, 64, 65 ó 69 o las variantes humanizadas de estas
secuencias.

17. Construcción caracterizada en que las moléculas de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 están fusionadas, químicamente acopladas, asociadas de forma covalente o no covalente con (i) dominios de inmunoglobulinas de diferentes especies, (ii) moléculas enzimáticas, (iii) dominios de interacción, (iv) dominios para estabilización, (v) secuencias señal, (vi) colorantes fluorescentes, (vii) toxinas, (viii) anticuerpos catalíticos, (ix) uno o más anticuerpos o fragmentos de anticuerpos con otra especificidad, (x) componentes citolíticos, (xi) inmunomoduladores, (xii) inmunoefectores, (xiii) antígenos de MHC de clase I o clase II, (xiv) quelantes para marcaje radioactivo, (xv) radioisótopos, (xvi) liposomas, (xvii) dominios transmembrana, (xviii) virus y/o (xix) células.

18. Molécula de ácido nucleico que comprende secuencias de ácido nucleico que codifican las secuencias de aminoácidos de al menos una molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o una construcción según la reivindicación 17.

19. Molécula de ácido nucleico según la reivindicación 18, en donde un primer vector codifica la cadena pesada y un segundo vector la cadena ligera de una molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o una construcción según la reivindicación 17.

20. Casete de expresión o vector que comprende una molécula de ácido nucleico según la reivindicación 18 ó 19, y un promotor que está operativamente unido con la molécula de ácido nucleico.

21. Composición farmacéutica que comprende al menos una

(i): molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16; y/o

(ii): una construcción según la reivindicación 17; y/o

(iii): una molécula de ácido nucleico que codifica la molécula de reconocimiento

opcionalmente con un soporte o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

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22. Procedimiento para la preparación de moléculas de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o construcciones según la reivindicación 17 que comprenden

(i): introducción de una o más secuencias de ácido nucleico que codifican la secuencia de aminoácidos de al menos una molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en un virus o una célula huésped; y

(ii): cultivo de la célula huésped o el virus en condiciones adecuadas; y

(iii): obtención de la molécula de reconocimiento o la construcción, la célula efectora que lleva la molécula de reconocimiento o construcción, o el virus que reconoce específicamente el epítopo tumoral MUC1 glicosilado.

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23. Uso de una molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 o la construcción según la reivindicación 17 para la producción de una composición farmacéutica para la profilaxis, prevención, diagnóstico, reducción, terapia, control de la evolución y/o tratamiento posterior de enfermedades tumorales y/o metástasis.

24. Uso según la reivindicación 23, caracterizado en que las moléculas de reconocimiento comprenden IgG o fragmentos de las mismas.

25. Uso según la reivindicación 23, caracterizado en que las moléculas de reconocimiento comprenden multicuerpos.

26. Uso de una molécula de reconocimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 para el diagnóstico tumoral y pronóstico in vitro, detectando el epítopo tumoral MUC1 glicosilado en suero o en preparaciones de tejido.