PT2046716E - Derivados de 1,3-difenilpropano substituídos, suas preparações e utilizações - Google Patents

Derivados de 1,3-difenilpropano substituídos, suas preparações e utilizações Download PDF

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Jean-Francois Delhomel
Remy Hanf
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Description

ΡΕ2046716 1 DESCRIÇÃO "DERIVADOS DE 1,3-DIFENILPROPANO SUBSTITUÍDOS, SUAS PREPARAÇÕES E UTILIZAÇÕES" 0 presente invento diz respeito a compostos substituídos derivados de 1,2-difenilpropano, às composições farmacêuticas que os contêm bem como às suas aplicações terapêuticas, em particular nos domínios da saúde humana e animal.
Os inventores demonstraram, de modo surpreendente, que os compostos do invento possuem de modo intrínseco propriedades agonistas de PPAR (Peroxisome Proli-ferator-Activated Receptor) .
As moléculas descritas neste invento possuem pois um particular interesse para o tratamento de complicações associadas com a síndrome metabólica, a resistência à insulina, a diabetes, as dislipidemias, a aterosclerose, as doenças cardiovasculares, a obesidade, a hipertensão, as doenças inflamatórias (asma, etc.)/ doenças neurodege-nerativas (Alzheimer, etc.), os cancros, etc., bem como para permitir a redução do risco global. Preferencialmente, os compostos do invento são úteis no tratamento das dislipidemias. 2 ΡΕ2046716 A diabetes, a obesidade e as dislipidemias (níveis plasmáticos elevados de colesterol LDL e trigli-céridos, colesterol HDL baixo, etc.) fazem parte dos facto-res de risco cardiovasculares claramente identificados que predispõem um indivíduo a desenvolver doença cardiovascular (Mensah M, 2004). Esses factores de risco são adicionados aos factores de risco relacionados com o estilo de vida, tais como, o tabagismo, a inactividade física e os regimes alimentares desequilibrados. Existe um efeito sinérgico entre esses diferentes factores: a presença simultânea de vários deles conduz a um dramático agravamento do risco cardiovascular e, sendo portanto apropriado falar de risco global ("global risk") para as doenças cardiovasculares. A prevalência das dislipidemias atingiu 43,6% da população em 2004 nos principais países desenvolvidos. A prevalência de diabetes, actualmente em acentuado crescimento, está em vias de se tornar cada vez mais significativa na epide-miologia das doenças cardiovasculares: a prevalência de diabetes é de facto estimada em 7,6% da população em 2010 (Fox-Tucker J, 2005) .
De acordo com a Sociedade Internacional de Ate-rosclerose (International Atherosclerosis Society, 2003), as doenças cardiovasculares são a principal causa de morte nos países industrializados e estão a tornar-se cada vez mais comuns nos países em desenvolvimento. Estas doenças incluem as doenças coronárias, a isquemia cerebral e as doenças arteriais periféricas. 3 ΡΕ2046716
Estes dados justificam pois a adopção de fortes medidas para reduzir significativamente a morbilidade e mortalidade cardiovasculares e a necessidade de encontrar tratamentos eficazes, complementares de uma mudança no estilo de vida, actuando sobre os factores de risco das doenças cardiovasculares e sobre as suas consequências, tornando-se uma emergência global.
Os compostos de acordo com o invento, através das suas propriedades agonistas de PPAR são de particular interesse para o tratamento de patologias relacionadas com a desregulação do metabolismo lipídico e/ou glicidico, tais como diabetes, obesidade, dislipidemias ou inflamação, bem como na redução do risco cardiovascular global.
Os PPAR (α, γ e δ) são, de facto conhecidos como estando envolvidos neste tipo de patologias (BP Kota et al., 2005): são comercializados ligandos destes receptores para o tratamento daquelas patologias (P Lefebvre et al., 2006) e numerosos moduladores PPAR, agonistas ou antagonistas, selectivos ou não, estão actualmente em desenvolvimento avançado. Um modulador PPAR com efeitos benéficos na resistência à insulina, obesidade, dislipidemias, hipertensão e/ou inflamação pode ser usado no tratamento da sindrome metabólica (ou sindrome X) (Liu Y e Miller A, 2005). A familia dos PPAR compreende três isoformas 4 ΡΕ2046716 designadas como α, γ e δ (igualmente denominada β) , cada uma codificada por um gene diferente. Estes receptores pertencem à superfamilia dos receptores nucleares e factores de transcrição que são activados através da ligação de determinados ácidos gordos e/ou seus metabolitos lipidicos. Os PPAR activados formam heterodimeros com os receptores do ácido 9-cis retinóico (RXR ou Receptor Retinóide X) e fixam-se a elementos de resposta específicos (PPRE ou Peroxime Proliferator Response Element) ao nível do promotor dos seus genes-alvo, permitindo assim o controlo da transcrição. 0 PPARa controla o metabolismo lipídico (hepático e muscular) e a homeostase da glucose, influencia o metabolismo intracelular dos lípidos e dos açúcares através de um controle directo da transcrição de genes que codificam as proteínas envolvidas na homeostase lipídica, exerce efeitos anti-inflamatórios e anti-proliferativos e evita os efeitos pró-aterogénicos de acumulação do colesterol nos macrófagos ao estimular o efluxo de colesterol (Lefebvre, P, L Chinetti, Fruchart JC e Staels B, 2006) . Os fibratos (fenofibrato, bezafibrato, ciprofi-brato, gemfibrozil), através do intermediário de PPARa, são deste modo utilizados clinicamente no tratamento de determinadas dislipidemias fazendo reduzir os triglicéridos e aumentando os níveis de HDL (High Density Lipoprotein). O PPARy é um regulador chave da adipogénese. Além disso, está envolvido no metabolismo lipídico dos 5 ΡΕ2046716 adipócitos maduros, na homeostase da glucose, particularmente na resistência à insulina, na inflamação, na acumulação de colesterol ao nível dos macrófagos e na proliferação celular (M Lehrke e Lazar MA, 2005) . O PPARy desempenha portanto um papel na patogénese da obesidade, na resistência à insulina e na diabetes. As tiazolidinedionas (Rosiglitazona, Troglitazona, etc.) são ligandos do receptor PPARy usados no tratamento de diabetes tipo 2.
Existem ligantes de PPARô (L-165041, GW501516 actualmente em desenvolvimento clínico), mas nenhum ligante PPARô é actualmente utilizado como medicamento. Este receptor é, no entanto, um alvo atraente para o desenvolvimento de medicamentos utilizados no tratamento das dislipidemias, aterosclerose, obesidade e resistência à insulina: o PPAR5 está de facto envolvido no controlo do metabolismo lipídico e glicídico, no balanço energético, na neurodegeneração, na obesidade, na formação de células espumosas e na inflamação (B Gross et al.r 2005).
Além do papel directo desempenhado pelos ligandos PPAR na regulação do metabolismo dos lípidos e dos glícidos, estas moléculas têm um espectro de acção pleiotrópica devido à grande variedade de genes-alvo dos PPAR. Estas propriedades tornam os vários alvos terapêuticos PPAR de interesse para o tratamento de doenças tais como a aterosclerose, a isquemia cerebral, a hipertensão, as doenças associadas com a neovascularização (retinopatias diabéticas, etc.), doenças inflamatórias e 6 ΡΕ2046716 auto-imunes (doença de Crohn, psoríase, esclerose múltipla, asma, etc.), as doenças neoplásicas (carcinogénese, etc.), as doenças neurodegenerativas, as complicações associadas com sindrome metabólica, a resistência à insulina, diabetes, as dislipidemias, as doenças cardiovasculares, obesidade, etc., bem como para permitir a redução do risco global.
Os compostos de acordo com o invento, devido às suas propriedades agonistas de PPAR, representam, portanto, um utensílio terapêutico vantajoso para a melhoria das patologias relacionadas com distúrbios do metabolismo lipídico e/ou glicídico, incluindo as dislipidemias, bem como para a redução do risco cardiovascular global.
Mais em geral, actuando simultaneamente sobre vários processos de regulação, os compostos de acordo com o invento representam um meio terapêutico benéfico para o tratamento de complicações associadas com a sindrome metabólica (cujas características são a obesidade, em particular obesidade abdominal, concentração anormal de lípidos no sangue (níveis elevados de triglicéridos e/ou níveis baixos de colesterol HDL (dislipidemia)), uma glicemia elevada e/ou resistência à insulina e hipertensão), aterosclerose, doenças cardiovasculares, a resistência à insulina, obesidade, hipertensão, diabetes, dislipidemias, doenças cardiovasculares, doenças inflamatórias (asma, etc.), patologias neurodegenerativas (Alzheimer, etc.), cancros, etc. bem como para permitir a redução do risco global. ΡΕ2046716 7
Morishita et al. (Morishita et al., "Synthesis and hypolipidaemic activity of 2-substituted isobutyric acid derivatives" Journal of Medicinal Chemistry, American Chemical Society, Washington, US, vol. 31, no. 6, Junho de 1988 (1988-06), páginas 1205-1209) divulgam compostos hipolipidemiantes, diferentes dos do presente invento. Os documentos DE 41 21 849 e Labaudinère R. et al., (Journal of Medicinal Chemistry, American Chemical Society, Washington, EUA, vol. 35, no. 17, 1992, páginas 3156-3169) descrevem inibidores da hidrolase do leucotrieno A4 no tratamento de inflamação crónica tal como tratamento do reumatismo, psoriase e outras doenças de pele, mas os compostos descritos diferem dos do presente invento. O mesmo é válido para o documento DE 4 6 27365 que divulga compostos fenólicos e derivados difenólicos como agentes para reduzir o nivel de fibrinogénio no plasma. 0 presente invento tem como objecto compostos de- rivados de 1,3-difenilpropano substituídos de fórmula geral (I) adiante:
na qual: 8 ΡΕ2046716
XI representa um átomo de halogéneo, um grupo RI ou Gl-Rl; X2 representa um átomo de hidrogénio; X3 representa um grupo R3; X4 representa um grupo G4-R4 no qual G4 representa um átomo de oxigénio; X5 representa um grupo R5; RI representa um grupo alquilo halogenado; R2 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo; R3 e R5, iguais ou diferentes, representam um grupo alquilo não substituído; R4 representa um grupo alquilo substituído com um grupo C00R9; G1 representa um átomo de oxigénio ou de enxofre; A representa: (i) um grupo-CR6R7 no qual: R6 representa um átomo de hidrogénio, e R7 representa um grupo hidroxilo ou um grupo-0R8, sendo R8 tal como adiante definido, (ii) um grupo carbonilo (CO) , 9 ΡΕ2046716 R8 representa um grupo alquilo, substituído ou não substituído com um grupo arilo ou cicloalquilo; D representa um átomo de carbono ligado a dois átomos de hidrogénio (CH2) , R9 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo não substituído; os seus estereoisómeros (diastereoisómeros, enan-tiómeros), puros ou em mistura, misturas racémicas, isómeros geométricos, tautómeros, sais, hidratos, solvatos, formas sólidas, assim como as misturas de todos estes.
No contexto do presente invento, o termo "alquilo" designa um grupo hidrocarboneto saturado, linear, ramificado ou cíclico, halogenado ou não, possuindo mais particularmente de 1 a 24, de preferência 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 átomos de carbono. Podem-se mencionar, por exemplo, metilo, trifluorometilo, etilo, n-propilo, isopro-pilo, n-butilo, isobutilo, terc-butilo, sec-butilo, penti-lo, neopentilo, n-hexilo ou ciclo-hexilo. 0 termo "cicloalquilo" designa um grupo alquilo tal como anteriormente definido e formando pelo menos um ciclo. Podem-se citar os grupos cicloalquilo com 3 a 8 átomos de carbono, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclo-heptilo e ciclo-octilo. 10 ΡΕ2046716 O termo "alquiloxilo" refere-se a uma cadeia alquilo ligado à molécula através de um átomo de oxigénio (ligação éter) . A cadeia de alquilo está de acordo com a definição anteriormente mencionada. A titulo de exemplo podem-se citar os grupos metoxilo, trifluorometoxilo, eto-xilo, n-propoxilo, isopropoxilo, n-butoxilo, iso-butoxilo, terc-butoxilo, sec-butoxilo ou hexiloxilo. O termo "arilo" refere-se a grupos aromáticos compreendendo de preferência 5 a 14 átomos de carbono, vantajosamente 6 a 14 átomos de carbono, eventualmente interrompidos por um ou mais heteroátomos seleccionados a partir de N, O, S ou P (mais especificamente designado como "heteroarilo"). Estes são geralmente monociclicos ou biciclicos e vantajosamente compreendem de 6 a 14 átomos de carbono, tais como fenilo, a-naftilo, β-naftilo, antra-cenilo ou fluorenilo. O termo "heterociclo de oxigénio ou enxofre" designa um grupo cicloalquilo tal como anteriormente definido interrompido por um ou vários heteroátomos seleccionados a partir de O e S. Podem-se citar a titulo de exemplo o pirano ou tiopirano.
Por átomo de halogéneo entende-se um átomo de bromo, cloro, flúor ou iodo.
Um radical alquilo halogenado é um radical 11 ΡΕ2046716 alquilo tal como definido anteriormente possuindo pelo menos um átomo de halogéneo, ou até mesmo completamente halogenado (perhalogenado).
Um aspecto particular do invento diz respeito aos compostos de fórmula geral (I) em que A representa um grupo carbonilo (CO).
Um outro aspecto particular do invento diz respeito aos compostos de fórmula geral (I) em que A representa um grupo-CR6R7, R6 representa um átomo de hidrogénio e R7 representa um grupo hidroxilo.
Um outro aspecto preferido do invento diz respeito aos compostos de fórmula geral (I) em que A representa um grupo-CR6R7, R6 representa um átomo de hidrogénio e R7 representa um grupo -0R8, sendo R8 tal como anteriormente definido. Em particular, R8 representa um grupo alquilo tendo de preferência 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono. Ainda mais preferencialmente, R8 representa um grupo alquilo substituído por um grupo arilo ou, compreendendo em particular o referido grupo ciclo-alquilo ou arilo 6 átomos de carbono.
Outro objecto particular do invento diz respeito aos compostos de fórmula geral (I) em que X3 e X5, iguais ou diferentes, representam respectivamente um grupo R3 e R5, R3 e R5 são iguais ou diferentes, representam um grupo alquilo não substituído. 12 ΡΕ2046716
Preferencialmente, X3 e X5, iguais ou diferentes, representam respectivamente um grupo R3 e R5, R3 e R5, iguais ou diferentes, representam um grupo alquilo não substituído, tendo de preferência 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono. Ainda mais preferencialmente, X3 e X5, iguais ou diferentes, representam um grupo metilo.
Um outro aspecto particular do invento diz respeito aos compostos de fórmula geral (I), em que X4 representa um grupo G4-R4, sendo G4 tal como definido anterior-mente, e representando R4 um grupo alquilo substituído com o grupo C00R9, em particular com COOH. Ainda mais preferencialmente, X4 representa um grupo -0C(CH3) 2COOH ou -OCH2COOH.
Um aspecto particular do invento diz respeito aos compostos de fórmula geral (I) em que R9 representa preferencialmente um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo com 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 átomos de carbono.
Um aspecto particular do invento diz respeito aos compostos de fórmula geral (I) em que X4 está de acordo com a fórmula -0C (CH3) 2COOR9, sendo R9 tal como anteriormente definido e representando preferencialmente um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo com 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 átomos de carbono.
Um objecto particular do invento refere-se a compostos de fórmula geral (I) em que XI é um grupo RI ou G1R1 ΡΕ2046716 13 G1 é tal como definido anteriormente, e RI representa um grupo alquilo halogenado.
Preferencialmente, RI representa um grupo alquilo halogenado com 1, 2 ou 3 átomos de carbono.
Ainda mais preferencialmente, XI representa um grupo -CF3, -OCF3, - SCF3, -ORCF3, R representa um grupo alquilo tal como definido anteriormente.
Um objecto particular do invento diz respeito a compostos de fórmula geral (I) em que XI representa um átomo de halogéneo (bromo, cloro, flúor, iodo). Preferencialmente, XI representa um átomo de cloro ou um átomo de bromo.
Os compostos que fazem parte do presente invento bem como os compostos comparativos são indicados adiante:
Composto 1: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometilo-xi)fenil]-3-oxopropil]fenoxi]-2-metilpropanóico
o 14 ΡΕ2046716
Composto 2 : Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometil-tio)fenil]-3-oxopropil]fenoxi]-2-metilpropanóico
Composto 3: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-bromofenil]-3-oxo-propil]fenoxi]-2-metilpropanóico
Composto 4 : Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometil)-fenil]-3-oxopropil]fenoxi]-2-metilpropanóico
Composto 5 (comparativo): Ácido 2-[4-[3-[4-cloro-2-hidroxi-fenil]-3-oxo-propil]feniltio]-2-metilpropanóico
15 ΡΕ2046716
Composto 6: Ácido 2-[2-metil-4-[3-[4-(3,3,3-trifluoropropi-loxi)fenil]-3-oxopropil]fenoxi]-2-metilpropanóico
Composto 7: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-hidroxi-3-[4-(tri-fluorometiltio)fenil]propil]fenoxi]-2-metilpropanóico
Composto 8: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-(3-(piridin-3-ilmetoxi)-3-(4-(trifluorometoxi)fenil)propil)fenoxi]-2-metilpropanóico
Composto 9: Ácido 2-[4-(3-(4-iodobenziloxi)-3-(4-(trifluo-rometoxi)fenil)propil)-2,6-dimetilfenoxi]-2-metilpropanóico 16 ΡΕ2046716
COO Η
Composto 10: Ácido 2-[4-(3-metoxi-3-(4-(trifluorometoxi)fe-nil)propil)-2,6-dimetilfenoxi]-2-metilpropanóico
COOH
Composto 11: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(3,3,3-trifluo-ropropiloxi)fenil]-3-oxopropil]fenoxi]-2-metilpropanóico
COOH
Composto 12 : Ácido 2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(2,2,2- trifluoroetoxi)fenil)propil)fenoxi)-2-metilpropanóico
17 ΡΕ2046716
Composto 13: Ácido 2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(2,2,2-tri-fluoroetilthio)fenil)propil)fenoxi)-2-metilpropanóico
Composto 14 (comparativo): Ácido 2-(4-(3-(4-cloro-2-(me-tiltio)fenil)-3-oxo-propil)-2,6-dimetilfenoxi)-2-metilpropanóico
Composto 15 (comparativo): Ácido 2-(4-(3-(2,4-bis(trifluo-rometil)fenil)-3-oxo-propil)-2,6-dimetilfenoxi)-2-metilpropanóico
COOH
Composto 16 (comparativo) : Ácido 2- (4- (3-(2-fluoro-4-(tri-fluorometil)fenil)-3-oxo-propil)-2,6-dimetilfenoxi)-2-metilpropanóico
COOH O 18 ΡΕ2046716
Composto 17 (comparativo): Ácido 2-(4-(3-(2-fluoro-4-(2,2, 2-trifluoroetoxi)fenil)-3-oxo-propil)-2,6-dimetilfenoxi)-2-metilpropanóico
,-COOH
Composto 18 (comparativo): Ácido 2-(2,6-dimetil-4-(3-(2-me-til-4 - (2,2,2-trifluoroetoxi)fenil)-3-oxo-propil)fenoxi)-2-metilpropanóico
COOH
Composto 19 (comparativo): Ácido 2-(4-(3-(2-metoxi-4-(2,2, 2-trifluoroetoxi)fenil)-3-oxo-propil)-2,6-dimetilfenoxi) -2-metilpropanóico
Composto 20 (comparativo) : Ácido 2- (4-(3-(2-hidroxi-4-(tri-fluorometil)fenil)-3-oxo-propil)-2,6-dimetilfenoxi)-2-me-tilpropanóico
COOH 19 ΡΕ2046716
Composto 21 (comparativo) : Ácido 2- (4- (3-(2-metoxi-4-(tri-fluorometil)fenil)-3-oxo-propil)-2,6-dimetilfenoxi) -2-me-tilpropanóico
COOH
Composto 22 (comparativo): Ácido 2-(2,6-dimetil-4-(3-(2-isopropiloxi-4-(trifluorometil)fenil)-3-oxo-propil)fenoxi)-2-metilpropanóico
0
COOH
Composto 23: Ácido 2-(2,6-dimetoxi-4-(3-oxo-3-(4-(trifluo-rometoxi)fenil)propil)fenoxi)-2-metilpropanóico
Composto 24 (comparativo) : Ácido 2- (4- (3- (2-fluoro-4-(tri-fluorometil)fenil)-3-oxo-propil)-2,6-dimetoxifenoxi)-2-metilpropanóico
COOH 20 ΡΕ2046716
Composto 25: Ácido 2-metil-2-(2-metil-4-(3-oxo-3-(4-(tri-fluorometiltio)fenil)propil)fenoxi)propanóico
COOH O
F
Composto 26: Ácido 2-metil-2-(2-metil-4-(3-oxo-3-(4-(tri-fluorometoxi)fenil)propil)fenoxi)propanóico
COOH
Composto 27 (comparativo) : Ácido 2- (4- (3-(2-fluoro-4-(tri-fluorometil)fenil)-3-oxopropil)feniltio)-2-metilpropanóico
COOH
Composto 28: Ácido 2-metil-2-(3-(3-oxo-3-(4-(trifluorometoxi) fenil)propil)fenoxi)propanóico
21 ΡΕ2046716
Composto 29: Ácido 2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(trifluo-rometoxi)fenil)propil)fenoxi)propanóico
Composto 30: Ácido 2-(4-(3-hidroxi-3-(4-(trifluorometoxi)-fenil)propil)-2,6-dimetilfenoxi)-2-metilpropanóico
Composto 31: 2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(trifluorometo- xi)fenil)propil)fenoxi)-2-metilpropanamida
Composto 32 (comparativo): Ácido 2-(4-(3-(hidroxi-imino)-3-(4-(trifluorometoxi)fenil)propil)-2,6-dimetilfenoxi) -2-metilpropanóico
22 ΡΕ2046716
Composto 33 (comparativo): Ácido 2-(4-(3-(metoxi-imino)-3-(4- (trifluorometoxi)fenil)propil)-2,6-dimetilfenoxi)-2-me-tilpropanóico
Composto 34: Ácido 4-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(trifluoro-metoxi)fenil)propil)fenoxi)-2,2-dimetilbutanóico
Composto 35: 2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(trifluorometo xi) fenil)propil)fenoxi)-2-metilpropanoato de tertiobutilo
Composto 36: 2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(trifluorometo xi) fenil) propil) fenoxi) -2-metilpropanoato de isopropilo
23 ΡΕ2046716
Composto 37 : Ácido 2,2-difluoro-2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4 - (trifluorometoxi)fenil)propil)fenoxi)acético
Composto 38: Ácido 2-(2-metoxi-4-(3-oxo-3-(4-(trifluorometoxi) fenil)propil)feniltio)-2-metilpropanóico
Os compostos preferidos do presente invento são os que são citados na reivindicação 7. 0 invento diz respeito mais preferencialmente aos seguintes compostos:
Composto 1: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometoxi) fenil]-3-oxopropil]fenoxi]-2-metilpropanóico;
Composto 2: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometil-tio)fenil]-3-oxopropil]fenoxi]-2-metilpropanóico;
Composto 3: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-bromofenil]-3-oxopropil] fenoxi]-2-metilpropanóico; - 24 - ΡΕ2046716
Composto 4: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometil)-fenil]-3-oxopropil]fenoxi]-2-metilpropanóico;
Composto 11: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(3,3,3-trifluo-ropropiloxi)fenil]-3-oxopropil]fenoxi]-2-metilpropanóico
Composto 36: Ácido 2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(trifluoro-metoxi)fenil)propil)fenoxi)-2-isopropil-metilpropanóico
Os compostos deste invento incluem os seus estereoisómeros (diastereoisómeros, enantiómeros), puros ou em mistura, suas misturas racémicas, seus isómeros geométricos, seus tautómeros, seus sais, seus hidratos, seus solvatos, suas formas sólidas bem como as misturas de quaisquer destes.
Os compostos de acordo com o invento podem conter um ou vários centros assimétricos. 0 presente invento inclui os estereoisómeros (diastereoisómeros, enantiómeros) , puros ou misturados, assim como as misturas racémicas e os isómeros geométricos. Quando se pretende uma mistura enantiomericamente pura (ou enriquecida), a mesma pode ser obtida por purificação do produto final ou dos seus intermediários quirais, ou por sintese assimétrica usando os métodos conhecidos da técnica (por exemplo, utilizando reagentes e catalisadores quirais). Determinados compostos do invento podem ter diferentes formas tautoméricas estáveis e todas essas formas e suas misturas estão incluídas no invento. 25 ΡΕ2046716 0 presente invento diz igualmente respeito aos sais "farmaceuticamente aceitáveis" dos compostos do invento. De um modo geral, este termo designa os sais pouco ou não-tóxicos obtidos a partir de bases ou de ácidos, orgânicos ou inorgânicos. Estes sais podem ser obtidos durante a etapa final de purificação do composto do invento, ou por incorporação do sal no composto já purificado.
Determinados compostos de acordo com invento e seus sais podem ser estáveis em várias formas sólidas. 0 presente invento inclui todas as formas sólidas dos compostos de acordo com o invento o que inclui as formas amorfas, polimorfos, mono- e poli-cristalinas.
Os compostos do invento podem existir sob forma livre ou sob forma solvatada, por exemplo, com solventes farmaceuticamente aceitáveis tais como água (hidratos) ou etanol.
Os compostos do invento marcados com um ou mais isótopos estão também incluidos no invento: estes compostos são estruturalmente idênticos, mas diferem pelo facto de pelo menos um átomo da estrutura estar substituído por um isótopo (radioactivo ou não) . Exemplos de isótopos que podem ser incluidos na estrutura dos compostos de acordo com o invento podem ser seleccionados a partir de hidrogénio, carbono, oxigénio, enxofre, tais como 2H, 3H, 26 ΡΕ2046716 13C, 14C, 18S, 170, 350, respectivamente. Os isótopos radioactivos 3H e 14C, são particularmente preferidos porque são fáceis de preparar e de detectar no âmbito de estudos de biodisponibilidade in vivo de substâncias. Os isótopos pesados (tal como 2H) são particularmente preferidos pois são utilizados como padrões internos, em estudos analíticos. 0 presente invento tem igualmente colmo objecto um processo de síntese dos compostos de fórmula geral (I) tal como definida anteriormente. 0 processo do presente invento compreende: - um passo de colocar em contacto (i), em meio básico ou em meio ácido, pelo menos um composto de fórmula (A) com pelo menos um composto de fórmula (B):
o (B) em que XI, X2, X3, X4 e X5 possuem os significados indicados anteriormente, depois, - e (ii) um passo de redução dos compostos assim obtidos, 27 ΡΕ2046716 - e eventualmente (iii) um passo de inserção de grupos funcionais.
As condições para a execução do passo (i) em meio ácido ou básico e o passo (ii) estão ao alcance do perito na técnica e podem variar bastante. Os protocolos de sintese podem ser em particular os que são apresentados na secção de "Exemplos" do presente invento. A colocação em contacto destes dois compostos é realizada vantajosamente de modo estequiométrico. É realizada de preferência a uma temperatura ambiente (entre cerca de 18°C e 25°C) e à pressão atmosférica.
Em meio básico, a reacção é preferencialmente realizada na presença de uma base forte, tal como um hidróxido de metal alcalino, tal como hidróxido de sódio ou um alcóxido de metal alcalino, tal como etóxido de sódio.
Em meio ácido, a reacção é preferencialmente realizada na presença de um ácido forte, tal como ácido clorídrico.
Os compostos assim obtidos podem ser isolados por métodos convencionais conhecidos pelos peritos na técnica. Podem posteriormente ser utilizados principalmente como medicamentos ou produtos cosméticos. 0 presente invento tem igualmente como objecto os 28 ΡΕ2046716 compostos, tal como anteriormente descritos, como medicamentos . 0 presente invento tem igualmente como objecto uma composição farmacêutica que compreende um suporte farmaceuticamente aceitável, pelo menos um composto tal como anteriormente descrito, eventualmente em associação com um ou vários outros terapêutica princípios activos e/ou cosméticos. É vantajosamente uma composição farmacêutica para o tratamento de complicações associadas com a síndrome metabólica, resistência à insulina, diabetes, dislipide-mias, aterosclerose, doenças cardiovasculares, obesidade, hipertensão, doenças inflamatórias (asma, etc.), patologias neurodegenerativas (Alzheimer, etc.), ou cancros, etc. A composição farmacêutica de acordo com o invento é preferencialmente utilizado no tratamento de dislipidemias. É preferencialmente uma composição farmacêutica para o tratamento de factores de risco cardiovascular associados às desregulação do metabolismo lipídico e/ou glicídico (hiperlipidemia, diabetes tipo II, obesidade, etc.), permitindo uma diminuição do risco global.
Outro objecto do invento diz respeito a uma composição nutricional que inclua, pelo menos, um composto tal como anteriormente descrito. 29 ΡΕ2046716
Outro objecto do invento é a utilização de pelo menos um composto tal como descrito anteriormente para a preparação de composições farmacêuticas destinadas ao tratamento de diversas patologias, nomeadamente as relacionadas com distúrbios metabólicos entre os quais se pode citar as dislipidemias. Mais geralmente, o invento tem como objecto a utilização de pelo menos um composto tal como descrito anteriormente para a preparação de composições farmacêuticas para o tratamento de factores de risco para as doenças cardiovasculares associadas aos distúrbios do metabolismo lipídico e/ou glicidico e destinadas deste modo a reduzir o risco total. A título de exemplo (e de modo não limitativo) , os compostos de acordo com o invento podem de modo vantajoso ser administrados em combinação com outros agentes terapêuticos e/ou cosméticos, comercializados ou em desenvolvimento, tais como: anti-diabéticos: os secretores de insulina (sulfonilureias (glibenclamida, glimepirida, gli-clazida, etc) e glinidas (repaglinida, nategli-nida, etc)), inibidores da alfa-glicosidase, ago-nistas de PPARy (tiazolidinodionas tais como rosiglitazona, pioglitazona), agonistas mistos PPARa/PPARy (tesaglitazar, muraglitazar), os pan-PPAR (compostos que activam simultaneamente as três isoformas de PPAR), biguanidas (metformina), inibidores da dipeptidil peptidase IV (MK-431, a ΡΕ2046716 30 vildagliptin) agonistas do receptor do peptídeo-1 tipo glucagon (GLP-1) (GLP-1) (exenatida), etc. - insulina - moléculas hipolipidemiantes e/ou hipocoleste-rolemiantes: fibratos (fenofibrato, gemfibrozil), inibidores da HMG CoA redutase ou hidroxilmetil-glutaril Coenzima A redutase (estatinas, tais como a atorvastatina, sinvastatina, fluvastati-na), inibidores da absorção do colesterol (ezeti-mibe , fitoesteróis), inibidores da CETP ou Cholesteryl Ester Transfer Protein (torcetrapib), inibidores da ACAT ou Acil-Coenzima A colesterol acilTransferase (Avasimibe, Eflucimibe), inibidores MTP (Microsomal Triglyceride Tranfer Protein) , agentes sequestrantes de ácidos biliares (colestiramina), vitamina E, ácidos gordos poli-insaturados, ácidos gordos ómega 3, derivados do tipo ácido nicotinico (niacina), etc. - agentes anti-hipertensivos e agentes hipoten- sores: inibidores ACE (Angiotensin-Converting
Enzyme) (captopril, enalapril, quinapril e rami-pril), antagonistas dos receptores da angioten-sina II (losartan, valsartan, telmisartan, eposartan, irbesartan, etc.), beta-bloqueadores (atenolol, metoprolol, labetalol, propranolol), diuréticos tiazidicos e não tiazidicos (furo- ΡΕ2046716 31 semida, indapamida, hidroclorotiazida, anti-aldosterona), vasodilatadores, bloqueadores dos canais de cálcio (nifedipina, felodipina ou amlodipina, diltiazem ou verapamil), etc. agentes anti-plaquetários: Aspirina, Ticlo-pidina, Dipiridamol, Clopidogrel, flurbiprofeno, etc. - agentes anti-obesidade: Sibutramina, inibidores da lipases (orlistat), agonistas e antagonistas PPARô, antagonistas dos receptor canabinóide CB1 (rimonabant), etc. agentes anti-inflamatórios: por exemplo, corticosteróides (prednisona, betametasona, dexa-metasona, prednisolona, metilprednisolona, hidro-cortisona, etc), os AINEs ou Anti-inflamatórios Não Esteróides derivados de indole (indometacina, sulindac), os AINEs do grupo dos arilcarboxilicos (ácido tiaprofénico, diclofenac, etodolac, flur-biprofeno, ibuprofeno, cetoprofeno, naproxeno, nabumetona, alminoprofeno) , os AINEs derivados de oxicam (meloxicam, piroxicam, tenoxicam), os AINEs do grupo dos fenamatos, os inibidores selectivos da C0X2 (celecoxib, rofecoxib), etc. - agentes anti-oxidantes: por exemplo o probucol, etc. ΡΕ2046716 32 agentes utilizados no tratamento da insuficiência cardíaca: diuréticos tiazidícos ou não-tiazidícos (furosemida, indapamida, hidrocloroti-azida, anti-aldosterona) , inibidores de ACE (ca-ptopril, enalapril, quinapril e ramipril), digi-tálicos (digoxina, digitoxina), beta-bloqueadores (atenolol, metoprolol, labetalol, propranolol), inibidores de Fosfodiesterases (enoximona, mil-rinona), etc. - agentes utilizados para o tratamento de insuficiência coronária: beta-bloqueadores (atenolol, metoprolol, labetalol, propanolol), bloqueadores do canal de cálcio (nifedipina, felodipina ou amlodipina, bepridilo, diltiazem ou verapamil), agentes doadores de NO (trinitrine, dinitrato de isossorbida, molsidomina), Amiodarona, etc. - anti-cancerígenos: agentes citotóxicos (agentes que interagem com o ADN, agentes alquilantes, cisplatina e derivados) , agentes citostáticos (análogos GnRH (Gonatropin-Releasing Hormone), análogos da somatostatina, progestativos, anti-estrogénios, inibidores de aromatase, etc.), moduladores da resposta imune (interferão, IL2, etc), etc. anti-asmáticos, tais como os broncodilatadores 33 ΡΕ2046716 (agonistas dos receptores beta-2), corticoste-róides, cromoglicato, antagonistas dos receptores de leucotrienos (montelucaste), etc. - corti-costeróides utilizados no tratamento de patologias da pele, tais como psoriase e dermatites vasodilatadores e/ou agentes anti-isquémicos (buflomedil, extracto de Ginkgo Biloba, naftidro-furilo, pentoxifilina, piribedil), etc. 0 invento diz igualmente respeito a um método de tratamento de doenças relacionadas com o metabolismo lipidico e/ou glicidico, compreendendo a administração a um sujeito, incluindo um ser humano, de uma quantidade eficaz de um composto ou de uma composição farmacêutica tal como definidos anteriormente. Para os fins do invento, o termo "quantidade eficaz" refere-se a uma quantidade do composto suficiente para produzir o resultado biológico pretendido. Para os fins do presente invento, o termo "sujeito" significa um mamifero, e mais particularmente um humano. 0 termo "tratamento" designa o tratamento curativo, sintomático ou preventivo. Os compostos do presente invento podem ser utilizados em sujeitos (como mamíferos, particularmente os seres humanos) que sofrem de uma doença declarada. Os compostos do presente invento podem igualmente ser utilizados para atrasar ou abrandar a 34 ΡΕ2046716 progressão ou evitar uma progressão mais avançada da doença, melhorando assim o estado dos sujeitos. Os compostos do presente invento podem finalmente ser administrados a indivíduos não doentes, mas que poderiam desenvolver a doença ou que têm um risco elevado de desenvolver a doença.
As composições farmacêuticas de acordo com o invento compreendem vantajosamente um ou vários excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Pode-se citar a título de exemplo, soluções salinas fisiológicas, isotó-nicas, tamponizadas, etc., compatíveis com a utilização farmacêutico e conhecidas do perito na técnica. As composições podem conter um ou vários agentes ou veículos seleccionados a partir de dispersantes, solubilizantes, estabilizantes, conservantes, etc. Os agentes ou veículos utilizáveis nas formulações (líquidas e/ou injectáveis e/ou sólidas) incluem a metilcelulose, hidroximetilcelulose, carboximetilcelulose, polisorbato 80, manitol, gelatina, lactose, óleos vegetais, acácia, lipossomas, etc. As composições podem ser formuladas sob a forma de suspensões injectáveis, géis, óleos, comprimidos, supositórios, pós, cápsulas, aerossóis, etc., eventualmente por meio de formas galénicas ou dispositivos que assegurem libertação prolongada e/ou retardada. Para este tipo de formulação, utiliza-se vantajosamente um agente tal como a celulose, carbonatos ou amidos.
Os compostos ou composições do invento podem ser administrados de diferentes modos e sob diferentes formas. 35 ΡΕ2046716
Assim, podem ser por exemplo administrados de modo sistémico, por via oral, parentérica, por inalação ou por injecção, como, por exemplo por via intravenosa, intramuscular, subcutânea, transdérmica, intra-arterial, etc. Para as injecções, os compostos são geralmente acondicionados sob a forma de suspensões liquidas, que podem ser injectadas através de seringas ou de perfusões, por exemplo .
Entende-se que a taxa de fluxo e/ou a dose injectada podem ser adaptadas pelos peritos na técnica, dependendo do paciente, da patologia, do modo de administração, etc. Tipicamente, os compostos são administrados em doses que podem variar de 1 μρ a 2 g por administração, preferencialmente de 0,1 mg a 1 g por administração. As administrações podem ser diárias ou várias vezes por dia, conforme necessário. Por outro lado, as composições de acordo com o invento podem compreender, além disso, outros agentes ou ingredientes activos.
LEGENDAS DAS FIGURAS
Abreviaturas utilizadas nas figuras: - Cpd = composto - Ctrl = controlo - mpk = mg/kg/dia - Colesterol LDL = Colesterol de Lipoproteina de
Baixa Densidade 36 ΡΕ2046716 - Colesterol HDL = Colesterol de Lipoproteína de Alta Densidade - Colesterol VLDL = Colesterol de Lipoproteína de Muito Baixa Densidade
Figuras 1-1 a 1-18: Avaliação in vitro das propriedades activadoras dos PPAR dos compostos de acordo com o invento em função da dose A activaçao dos PPAR é avaliada in vitro numa linha de fibroblastos de rim de macaco (COS-7), medindo a actividade transcricional das quimeras constituintes do domínio de ligação a ADN do factor de transcrição Gal4 de levedura e do domínio de ligação ao ligando dos diferentes PPAR.
Os compostos são testados em doses compreendidas entre IO”7 e 100 μΜ nas quimeras Gal4-PPAR α, γ, δ. O factor de indução, ou seja, a relação entre luminescência induzida pelo composto e a luminescência induzida pelo controlo, é medida para cada condição. Quanto mais elevado for o factor de indução, mais o composto possui um carácter de PPAR.
Figuras 1-1, 1-2, 1-3: Avaliação in vitro das propriedades activadoras de PPAR alfa, γ, δ do composto 1
Figuras 1-4, 1-5, 1-6: Avaliação in vitro das propriedades activadoras de PPAR alfa, γ, δ do composto 2 ΡΕ2046716 37
Figuras 1-7, 1-8, 1-9: Avaliação in vitro das propriedades activadoras de PPAR alfa, γ, δ do composto 3 Figuras 1-10, 1-11, 1-12 : Avaliação in vitro das propriedades activadoras de PPAR alfa, γ, δ do composto 4 Figuras 1-13 1-14, 1-15: Avaliação in vitro das propriedades activadoras de PPAR alfa, γ, δ do composto 5 Figuras 1-16, 1-17, 1-18 : Avaliação in vitro das propriedades activadoras de P PAR alfa, γ, δ do composto 7
Figuras 2-1 a 2-7: Avaliação in vivo, no murganho ApoE2/E2, das propriedades em relação ao peso corporal, das das propriedades propriedades hipolipidemiantes estimuladoras da síntese de colesterol HDL, dos compostos de acordo com o invento 0 efeito dos compostos de acordo com o invento é avaliado in vivo em murganhos humanizados para a isoforma E2 de apolipoproteína E (E2/E2). 0 peso corporal, os níveis plasmáticos de colesterol total, de colesterol HDL, de triglicéridos e de 38 ΡΕ2046716 ácidos gordos livres, foram medidos em murganhos dislipidémicos E2/E2 após 8 dias de tratamento por via oral com os compostos de acordo com o invento. Estes parâmetros são comparados com aqueles obtidos com os animais de controlo (não tratadas com os compostos de acordo com o invento): a diferença medida reflecte o efeito sobre o peso corporal e o efeito hipolipidemiante dos compostos de acordo com o invento
Figura 2-1: Ganho de peso corporal após 8 dias de tratamento com o composto 1, administrado a 5, 10 e 5 0 mp k
Figura 2-2: Nivel plasmático de colesterol, após 8 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 5, 10 e 50 mpk;
Figura 2-3: Nivel plasmático de colesterol HDL após 8 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 5, 10 e 50 mpk
Figura 2-4: Nivel plasmático de triglicéridos, após 8 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 5, 10 e 50 mpk.
Figura 2-5: Nivel plasmático de ácidos gordos livres, após 8 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 5, 10 e 50 mpk. 39 ΡΕ2046716 A eficácia dos compostos de acordo com o invento é também avaliada através da medição, no tecido hepático, da expressão de genes envolvidos no metabolismo lipidico e/ou glicidico e dissipação de energia. Os niveis de expressão de cada gene são normalizados em relação ao nivel da expressão de gene de referência 36B4. 0 factor de indução, ou seja, a relação entre o sinal relativo (induzido pelo composto de acordo com o invento) e a média dos valores relativos ao grupo de controlo, é posteriormente calculada. Quanto maior for este factor, maior o carácter activador do composto na expressão do gene. 0 resultado final é representado como a média dos valores de indução em cada grupo experimental.
Figura 2-6: Expressão de PDK4 (Pyruvate Deshydrogenase Kinase, isoforma • 4) no tecido hepático, nos murganhos E2/E2 após 8 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 5, 10 e 50 mpk
Figura 2-7: Expressão de ApoCIII (Apolipoproteína C3) no tecido hepático, nos murganhos E2/E2 após 8 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 5, 10 e 50 mpk
Figuras 3-1 a 3-5: Avaliação in vivo em murganhos C57BI6, das propriedades sobre o peso corporal, das propriedades hipolipidemiantes e estimulantes da síntese de colesterol HDL dos compostos de acordo com o invento. 40 ΡΕ2046716 O efeito dos compostos de acordo com o invento é avaliado in vivo em murganhos C57BI6 através da medição da evolução do peso corporal, medição das concentrações plasmáticas de colesterol HDL e triglicéridos após 14 dias de tratamento por via oral com os compostos de acordo com o invento. Estes parâmetros são comparados com aqueles obtidos com os animais de controlo (não tratadas com os compostos de acordo com o invento): a diferença medida reflecte o efeito sobre o peso corporal e efeito hipolipidemiante dos compostos de acordo com o invento.
Figura 3-1: Ganho de peso corporal após 14 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 3, 10 e 30 mpk
Figura 3-2: Nivel plasmático de colesterol HDL após 14 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 3, 10 e 30 mpk
Figura 3-3: Nivel plasmático de triglicéridos após 14 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 3, 10 e 30 mpk
A eficácia dos compostos de acordo com o invento é também avaliada através da medição, no tecido hepático, da expressão de genes envolvidos no metabolismo lipidico. Os niveis de expressão de cada gene são normalizados em relação ao nivel da expressão do gene de referência 36B4. O 41 ΡΕ2046716 factor de indução é posteriormente calculado. Quanto maior for este factor, maior o carácter activador do composto na expressão do gene. 0 resultado final é representado como a média dos valores de indução em cada grupo experimental.
Figura 3-4: Expressão de PDK4 (Pyruvate Deshydrogenase Kinase, isoforma 4) no tecido hepático nos murganhos C57BI6 após 14 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 3, 10 e 30 mpk
Figura 3-5: Expressão de ApoClll (Apolipoproteína C3) no tecido hepático nos ratinhos C57BI6 após 14 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 3, 10 e 30 mpk
Figuras 4-1 a 4-9: Avaliação In vivo, em murganhos db/db, das propriedades sobre o peso corporal, das propriedades anti-diabéticas, hipolipidemiantes e estimuladoras da síntese de colesterol HDL, dos compostos de acordo com o invento O efeito dos compostos de acordo com o invento é avaliado in vivo em murganhos db/db através da medição da evolução do peso corporal, medição dos níveis plasmáticos de glucose, insulina, colesterol total e triglicéridos, bem como pela análise da distribuição do colesterol nas diferentes fracções de lipoproteícas plasmáticas após 28 dias de tratamento por via oral com os compostos de acordo 42 ΡΕ2046716 com o invento. Estes parâmetros são comparados com aqueles obtidos com os animais de controlo (não tratadas com os compostos de acordo com o invento): a diferença medida reflecte o efeito sobre o peso corporal, sobre a resistência a insulina, o efeito hipolipidemiante dos compostos de acordo com o invento.
Figura 4-1: Ganho de peso corporal após 2 8 dias de tratamento com o composto 1, administrado a 50 mpk
Figura 4-2: Glicemia após 28 dias de tratamento com o composto 1, administrado a 50 mpk
Figura 4-3: Insulinemia após 28 dias de tratamento com o composto 1, administrado a 50 mpk
Figura 4-4: Nivel plasmático de colesterol após 14 dias de tratamento com o composto 1 e o composto 3, administrados a 50 mpk
Figura 4-5: Distribuição do colesterol nas diferentes fracções de lipoproteícas plasmáticas após 28 dias de tratamento com o composto 1 e o composto 3, administrados a 50 mpk
Figura 4-6: Nivel plasmático de triglicéridos após 28 dias de tratamento com o composto 1 e composto 3, administrados a 50 mpk 43 ΡΕ2046716
Figura 4-7: Nível plasmático de ácidos gordos livres após 28 dias de tratamento com o composto 1 e o composto 3, administrados a 50 mpk. A eficácia dos compostos de acordo com o invento é igualmente avaliada através da medição, nos tecidos hepáticos e musculares (esqueléticos), da expressão de genes envolvidos no metabolismo glicídico e dissipação de energia. Os níveis de expressão de cada gene são normalizados em relação ao nível de expressão de genes de referência 36B4 no tecido hepático ou 18S no músculo-esquelético gastrocnémio. O factor de indução, ou seja, a relação entre o sinal relativo (induzido pelo composto de acordo com o invento) e a média dos valores relativos ao grupo de controlo, é posteriormente calculado. Quanto maior for este factor, maior o carácter activador do composto na expressão do gene. O resultado final é representado como média dos valores de indução de indução em cada grupo experimental.
Figura 4-8: Expressão de PDK4 (Pyruvate Deshydrogenase Kinase, isoforma 4) no tecido hepático, em murganhos db/db, após 28 dias de tratamento com o composto 1 e o composto 3, administrados a 50 mpk
Figura 4-9: Expressão de UCP2 (uncoupling protein 2) no músculo-esquelético, em murganhos db/db, 44 ΡΕ2046716 após 28 dias de tratamento com os compostos 1 e 3, administrados a 50 mpk
Figura 5: Avaliação in vitro das propriedades anti-inflamatórias dos compostos de acordo com o invento através da medição da secreção de MCPl por monócitos tratados com os compostos de acordo com o invento e estimulados com PMA
Os efeitos anti-inflamatórios dos compostos de acordo com o invento foram avaliados através da medição da secreção da MCPl (Monocyte Chemotactic Protein-1) por monócitos THP1 tratados durante 24 horas com os compostos de acordo com o invento e simultaneamente estimulados com PMA (12-miristato-13-acetato deforbol, provoca uma resposta inflamatória das células e sua diferenciação em macrófagos). Quanto menor a quantidade de MCPl segregada, mais o composto de acordo com o invento inibe a reacção inflamatória.
ANÁLISES ESTATÍSTICAS
O O O
Os estudos estatísticos realizados consistem num teste T de Student (°/00/00°) e/ou uma Análise de Variância univariada a um factor (ANOVA), seguida de um teste de Tukey (*/**/***) . os resultados são comparados em relação ao grupo de controlo, de acordo com o valor do parâmetro p: °/*: p <0,05; °°/**: p <0,01; °°°/***: p <0,001. 45 ΡΕ2046716
EXEMPLOS
Os reagentes e catalisadores convencionais estão disponíveis comercialmente (Aldrich, Alfa Aesar, Acros, Fluka ou Lancaster, conforme o caso).
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Protão (RMN de 1H) foram registados num espectrómetro Bruker AC300P. Os desvios químicos estão expressos em ppm (partes por milhão) e as multiplicidades pelas abreviaturas usuais.
Exemplo 1: Descrição de protocolos gerais para a síntese dos compostos descritos A maior parte dos compostos de acordo com 0 invento podem ser obtidos, sobretudo, por redução, de acordo com um dos protocolos adiante mencionados, de compostos reivindicados e/ou descritos no pedido de patente US200517 6808.
Os outros compostos podem ser facilmente obtidos por métodos de preparação similares bem conhecidos e ao alcance do perito na técnica.
Procedimento geral A: redução difenilpropen-2- onas com trietilsilano A difenilpropen-2-ona é dissolvida em dicloro-metano. É adicionado trietilsilano, e posteriormente, gota 46 ΡΕ2046716 a gota, ácido trifluoroacético (7,5 equivalentes). A mistura reaccional é colocada sob agitação à temperatura ambiente e o progresso da reacção é seguido por cromatografia em camada fina. Uma vez consumido o material de partida, a mistura é lavada com água. A fase aquosa é extraída com diclorometano, as fases orgânicas são combinadas, secas em sulfato de magnésio e posteriormente o solvente é removido através de evaporação sob pressão reduzida. 0 resíduo da evaporação é purificado por cromatografia sobre sílica gel (HPLC preparativa, LiChrospher (Merck) RP18 12pm 100Â, coluna: 25*250 mm).
Procedimento Geral B: redução de difenilpropen-2-onas pelo tetraclorossilano
Dissolve-se difenilpropen-2-ona em acetonitrilo. É adicionado iodeto de sódio e posteriormente tetraclorossilano gota a gota. A mistura reaccional é colocada sob agitação agitada à temperatura ambiente, o progresso da reacção é seguido por cromatografia em camada fina. Uma vez consumido o material de partida (30 minutos a 2 horas), a mistura é diluída com clorofórmio e posteriormente lavada com água. A fase aquosa é extraída com clorofórmio, as fases orgânicas são combinadas e lavadas com solução saturada de sulfito de sódio e posteriormente seca-se em sulfato de magnésio. O solvente é removido através de evaporação sob pressão reduzida. O resíduo da evaporação é purificado por cromatografia sobre sílica gel (HPLC preparativa, LiChrospher (Merck) RP18 12pm 100Â, coluna: 25*250 mm). 47 ΡΕ2046716
Procedimento Geral C: redução de difenilpropen-2-onas por paládio em carvão A difenilpropen-2-ona é dissolvida em etanol sendo posteriormente adicionado paládio em carvão (10%) numa quantidade catalítica. A mistura reaccional é agitada sob atmosfera de hidrogénio à pressão atmosférica e temperatura ambiente. Uma vez consumido o material de partida, o catalisador é removido por filtração, o solvente é evaporado sob pressão reduzida e o resíduo da evaporação é purificado por cromatografia rápida.
Procedimento Geral D: Síntese dos álcoois A difenilpropan-3-ona é dissolvida em etanol. É adicionado borohidreto de sódio. A mistura reaccional é mantida 16 horas, sob agitação, a 50°C, o meio é arrefecido e hidrolisada. Os solventes são removidos através de evaporação sob pressão reduzida, o resíduo é retomado com solução aquosa diluída de ácido clorídrico e extraído com diclorometano. A fase orgânica é lavada com água, seca em sulfato de magnésio, o diclorometano é removido através de evaporação sob pressão reduzida e o resíduo é purificado por cromatografia em sílica gel (HPLC preparativa, LiChrospher (Merck) coluna RP18 100Â, 12pm: 25*250 mm). ΡΕ2046716 48
Procedimento Geral E: Síntese dos éteres 0 difenilpropan-3-ol é dissolvido numa mistura de água/álcool 1/3:2/3 na presença de uma quantidade catalítica de ácido trifluoroacético. Após 16 h de agitação a 60°C, a mistura é evaporada sob pressão reduzida e o resíduo de evaporação é purificado por cromatografia em sílica gel (HPLC preparativa, LiChrospher (Merck) RP18 12 pm 100Â, coluna: 25*250 mm) .
Processo geral F; síntese das oximas e dos éteres de oxima O difenilpropan-3-ona é dissolvido em piridina. É adicionado cloridrato de O-alquilhidroxilamina. Após 16h de refluxo, a mistura é evaporada sob pressão reduzida e o resíduo de evaporação é purificado por cromatografia rápida sobre sílica gel.
Exemplo 2: Síntese dos compostos descritos
Composto 1 do invento: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4- (trifluorometoxi)fenil]-3-oxopropil]fenoxi]-2-metilpropanóico
49 ΡΕ2046716
Este composto foi preparado de acordo com o procedimento geral B, a partir do ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometoxi)fenil]-3-oxo-prop-2-enil]fenoxi]-2-metilpropanóico utilizando 15 equivalentes de iodeto de sódio e 15 equivalentes de tetraclorossilano;
Aspecto: sólido branco; pf = 64-66°C. RMN de ΧΗ (300 MHz, CDC13, δ ppm) : 1,52 (s, 6H) , 2,22 (s, 6H) , 2,96 (t, 2H, J = 7,51 Hz), 3,26 (t, 2H, J = 7,51 Hz), 6,87 (s, 2H) , 7,28 (d, 2H, J = 8,61 Hz), 8,01 (d, 2H, J = 8,61 Hz). MS (ES-MS): 423,3 (M-l).
Composto 2 do invento: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometiltio)fenil]-3-oxopropil]fenoxi]-2-metilpropanóico
Este composto foi preparado de acordo com o processo geral A, a partir do ácido 2-[2, 6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometiltio)fenil]-3-oxo-prop-2-enil]fenoxi]-2-metilpropanóico usando 1 equivalente de trietilsilano;
Aspecto: sólido branco, pf = 83-85°C. 50 ΡΕ2046716 RMN de 7H (300 MHz, CDC13, δ ppm): 1,52 (s, 6H) 2,23 (s, 6H) , 2,97 (t, 2H, J = 7,59 Hz), 3,2 9 (t, 2H, J : 7,59 Hz) , 6, 88 (s , 2H), 7,74 (d, 2H, J = 8,46 Hz) , 7, 99 (d 2H, J = 8, 46H z) . MS (ES-MS): 439, 2 (M-l).
Composto 3 do invento: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-bromofenil]-3-oxopropil]fenoxi]-2-metilpropanóico
Este composto foi preparado de acordo com o procedimento geral A, a partir do ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3- [4-bromofenil]-3-oxo-prop-2-enil]fenoxi]-2-metilpropanóico usando 1 equivalente de trietilsilano;
Aspecto: óleo viscoso branco. RMN de ΧΗ (300 MHz, CDC13, δ ppm) : 1,52 (s, 6H) , 2,23 (s, 6H) , 2,96 (t, 2H, J = 7,60 Hz), 3,24 (t, 2H, J = 7,02 Hz), 6,89 (s, 2H) , 7,61 (d, 2H, J = 8,46 Hz), 7,83 (d, 2H, J = 8,46 Hz). MS (ES-MS): 417,2 (M-l) 79Br e 419,2(M-1) 81Br
Composto 4 do invento: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometil)fenil]-3-oxo-propil]fenoxi-2-metilpro-panóico 51 ΡΕ2046716
Este composto foi preparado de acordo com o processo geral A, a partir do ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometil)fenil]-3-oxo-prop-2-enil]fenoxi]-2-metilpropanóico usando 1 equivalente de trietilsilano;
Aspecto: óleo viscoso amarelado.
RMN de XH (3 !0 0 MHz, . CDC13, δ ppm): 1,52 (s, 6H) 2,23 (s, 6H) , 2,98 (t , 2H, J = 7,29 Hz) , 3,30 (t, 2H, J : 7,29 Hz), 6,88 (s, 2H) , 7,72 (d, 2H, J = 8,17 Hz), 8, 06 (d 2H, J = 8 , 17Hz). MS (ES-MS) : 407,4 (Μ-1). Composto 5: Ácido 2- [4- [3 -[4-cloro-2-hidrox if e nil]-3-oxo-propil]feniltio]-2-metilpropanóico
Este composto foi preparado de acordo com o procedimento geral B, a partir do ácido 2-[4-[3-[4-cloro-2-hidroxifenil]-3-oxo-prop-2-enil]feniltio]-2-metil-propa-nóico utilizando 5 equivalentes de iodeto de sódio e 5 equivalentes de tetraclorossilano; ΡΕ2046716 52
Aspecto: sólido branco, pf = 136-137°C. RMN de ΧΗ (300 MHz, CDC13, δ ppm): 1,52 (s, 6H) , 3, 08 (t, 2H, J = 7,59 Hz ), 3, 30 (t, 2H, J = 7,59 Hz) , 6, 87 (dd, 1H, J = 1, 8S ) Hz, J = 8/ 79 Hz), 7,02 (d , 1H, J = 1,89 Hz) , 7,22 (d, 2H, J = 7, 89 Hz ), 7,47 (d, 2H, J = 8,19 Hz) , 7, 66 (d, 1H, J = 8,46 Hz) , 12,38 (s, 1H) . MS (ES- -MS) : 377,01 (M-l).
Composto 6: Ácido 2-[2-metil-4-[3-[4-(3,3,3- trifluoropropiloxi)fenil]-3-oxopropil]fenoxi]-2-metilpropanóico
Este composto foi preparado por redução de acordo com o processo geral C a partir do 2- (4-(3-(4-hidro-xifenil)-3-oxo-prop-l-enil)-2-metilfenoxi)-2-metilpropa-noato de terc-butilo, seguido de uma sequência O-alquilação do fenol/acidólise de éster terc-butílico de acordo com a patente US2005176808.
Aspecto: óleo viscoso incolor. RMN de (300 MHz, CDC13, δ ppm) : 1,60 (s, 6H) , 53 ΡΕ2046716 2.23 (s, 3H), 2,61-2,70 (m, 2H), 2, 95-2, 99 (m, 2H) , 3,19- 3.24 (m, 2H) , 4,26 (t, 2H, J = 6,5 Hz), 6,77 (d, 1H, J = 8,5 Hz), 6,93 (d, 2H, J = 8, 9 Hz), 6, 93-6, 98 (m, 1H) , 7,06 (d, 1H, J = 2,1 Hz), 7,95 (d, 2H, J = 8,9 Hz). MS (ES-MS) : 437,3 (M-l).
Composto 10 do invento: Ácido 2-[4-(3-metoxi-3-(4- (trifluorometoxi)fenil)propyl)-2,6-dimetilfenoxi]-2-me-tilpropanóico
COOH
Este composto foi preparado de acordo com o processo geral E, a partir de uma solução de ácido 2-(4- (3-hidroxi-3-(4-(trifluorometoxi)fenil)propil)-2,6-dimetilfenoxi)-2-metilpropanóico numa mistura água/metanol 1/3:2/3.
Aspecto: óleo viscoso incolor. RMN de XH (300 MHz , CDC13 , δ ppm) : 1,46 (s, 6H) , 1, 91 -2, 21 (m, 2H) , 2,15 (s, 6H) , 2 , 49 -2, 69 (m, 2H) , 3, 83 (s, 3H) 4,69 (dd, 1H, J = 7,7 Hz J = = 5,1 Hz) , 6, 78 (s, 2H) , 7, 19 (d, 2H, J = 8,5 Hz) , 7, 36 (d, 2H, J = 8, 5 Hz) • MS (ES-MS ) : 458,3 (M + NH4 + ), 463,2 (M+ Na+) , 479, 2 (M+ K+) . 54 ΡΕ2046716
Composto 12 do invento: Ácido 2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(2,2,2-trifluoroetoxi)fenil)propil)fenoxi)-2-metilpropanóico
COOH
Este composto foi preparado por redução de acordo com o processo geral C do 2-(4-(3-(4-hidroxifenil)-3-oxo-prop-l-enil)-2,6-dimetil-fenoxi)-2-metilpropanoato de terc-butilo, seguido por uma sequência O-alquilação de fe-nol/acidólise do éster terc-butílico de acordo com a patente US2005176808.
Aspecto: sólido branco, pf = 98-99°C. RMN de (300 MHz, CDC13, δ ppm) : 1,45 (s, 6H) , 2,17 (s, 6H) , 2,89 (m, 2H) , 3,18 (m, 2H), 4,40 (q, 2H, J = 8,1 Hz), 6,82 (s, 2H) , 6,95 (d, 2H, J = 9,1 Hz), 7,93 (d, 2H, J = 9,1 Hz). MS (ES-MS): 437,4 (M-l).
Composto 17: Ácido 2-(4-(3-(2-fluoro-4-(2,2,2-trifluoroetoxi)fenil)-3-oxo-propil)-2,6-dimetilfenoxi)-2-metilpropanóico
COOH
Este composto foi preparado por redução de acordo 55 ΡΕ2046716 com o processo geral C a partir do 2- (4- (3- (2-fluoro-4-hidroxifenil)-3-oxo-prop-l-enil)-2,6-dimetilfenoxi)-2-metilpropanoato de terc-butilo, seguido por uma sequência O-alquilação de fenol/acidólise de éster terc-butílico de acordo com a patente US2005176808.
Aspecto: óleo viscoso incolor. RMN de (300 MHz, CDC13, δ ppm) : 1,51 (s, 6H) , 2,21 (s, 6H) , 2,92 (t, 2H, J = 7,6 Hz); 3,23 (t, 2H, J = 7.6 Hz J = 3,1 Hz), 6,70 (dd, J = 8,7 Hz J = 2,3 Hz), 6,81 (dd, J = 12,6 Hz J = 2,3 Hz), 6,86 (s) , 7,91 (t, 1H, J = 8.7 Hz). MS (MALDI-TOF) : 479 (M + Na+) .
Composto 30 do invento: Ácido 2-(4-(3-hidroxi-3-(4- (trifluorometoxi)fenil)propil)-2,6-dimetilfenoxi)-2-me-tilpropanóico
Este composto foi preparado de acordo com o procedimento geral D, a partir do ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometiloxi)fenil]-3-oxo-propil]-fenoxi]-2-metilpropanóico utilizando 4 equivalentes de borohidreto de sódio. ΡΕ2046716 56
Aspecto: óleo viscoso incolor. RMN de 1R (300 MHz, CDC13, δ ppm) : 1,46 (s, 6H) , 1,94-2,10 (m, 2H) , 2,17 (s, 6H) , 2, 46-2, 66 (m, 2H) , 4,69 (dd, 1H, J = 7,6 Hz J = 5,5 Hz), 6,78 (s, 2H) , 7,17 (d, 2H, J = 8,3 Hz), 7,34 (d, 2H, J = 8,3 Hz). MS (ES-MS): 425,3 (M-l).
Composto 33: Ácido 2-(4-(3-(metoxi-imino)-3-(4-(trifluorometoxi)fenil)propil)-2,6-dimetilfenoxi)-2-metil-propanóico
Este composto foi preparado de acordo com o processo geral F, a partir do ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3 -[4-(trifluorometoxi)fenil]-3-oxo-propil]-fenoxi]-2-metil-propanóico.
Aspecto: óleo viscoso amarelado. RMN de 1H (300 MHz, CDC13, δ em ppm): 1,49 (s, 6H) , 2,2 1 (s, 6H), 2, 71-2,77 (m, 2H), 2,95-3,01 (m, 2H) , 4,01 (s, 3H) , 6,82 (s, 2H), 7, 17 (d, 2H, J = 8,7 Hz) , 7,59 ( d, 2H, J = 8 ,7 Hz) . MS (ES-QTOF) : 476 (M + Na+) . 57 ΡΕ2046716
Composto 35 do invento: 2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3- (4- (trifluorometoxi)fenil)propil)fenoxi)-2-metilpropano- ato de terc-butilo
Este composto foi preparado por redução de acordo com o processo geral C a partir de 3-(4-hidroxi-3,5-dimetilfenil)-1-(4-(trifluorometoxi)fenil)propan-l-ona, seguido por uma sequência O-alquilação de fenol/acidólise do éster terc-butílico de acordo com a patente US200517 6808.
Aspecto: óleo viscoso incolor. RMN de (300 MHz, CDC13, δ ppm): 1,42 (s , 6H) , 1,51 (s, 9H) , 2,21 (s, 6H) , 2,94 (t, 2H, J = 7,9 Hz) , 3,25 (t, 2H, J = 7,9 Hz), 6,82 (s, 2H) , 7,28 (d, 2H, . J = 9,1 Hz) , 8 01 (d, 2H, J = 9,1 Hz) . Os outros compostos podem ser obtidos de acordo com métodos de preparação semelhantes aos procedimentos gerais de A a F e ao alcance de um perito na técnica.
Exemplo 3: Avaliação in vitro das propriedades activadoras dos PPAR pelos compostos de acordo com o invento 58 ΡΕ2046716
As propriedades activadoras dos PPAR pelos compostos de acordo com o invento são avaliadas in vitro.
Principio A activação dos PPAR é avaliada in vitro numa linha de fibroblastos de rim de macaco (COS-7), medindo a actividade transcricional das quimeras constituintes do dominio de ligação ao ADN do factor de transcrição Gal4 da levedura e do dominio de ligação ao ligando dos diferentes PPAR. Os compostos são testados em doses compreendidas entre 10~7 e 100 mM, nas quimeras Gal4-PPAR α, γ, δ.
Protocolo
Cultura de Células
As células COS-7 são provenientes da ATCC e elas são cultivadas num meio DMEM suplementado com 10% (vol/vol) de soro fetal de vitelo, 100 U/mL de penicilina (Gibco, Paisley, UK) e 2 mM de L-glutamina (Gibco, Paisley, UK). As células são incubadas a 37°C sob uma atmosfera humidificada contendo 5% de CO2.
Descrição dos plasmideos usados na transfecção
Os plasmideos Gal4(RE)_TkpGL3, pGal4-hPPARa, pGal4-hPPARy, pGal4-hPPARô pGal4-cp foram descritos na 59 ΡΕ2046716 literatura (Raspe E et al., 1999). As construções pGal4- hPPARa, pGal4-hPPARy e pGal4-hPPARô foram obtidos por clonagem no vector pGal4-cp de fragmentos de ADN amplificados por PCR correspondentes aos dominios DEF dos receptores nucleares PPARa, PPARy e PPARô humanos.
Transfecção
As células COS-7 em suspensão são transfectadas com 150 ng de ADN por poço, com uma proporção de PPAR-pGal4/Gal4 (RE) _TkpGL3 de 1/10 na presença de soro de vitela fetal a 10%. As células são de seguida semeadas em placas de 96 poços (4xl04 células/poço) e incubadas durante 24 horas a 37°C. A activação com os compostos a testar ocorre durante 24h a 37°C num meio isento de soro. No final da experiência, as células são lisadas e a actividade de luciferase é determinada com a ajuda do Steady-LiteMR HTS (Perkin Elmer) ou do Steady Glow Luciferase (Promega), de acordo com as recomendações do fornecedor.
Resultados
Os compostos do invento foram testados em três isoformas de PPAR. Os resultados obtidos com os compostos 1, 2, 3, 4, 5 e 7 encontram-se pormenorizados nas figuras (1-1) a (1-18).
Os inventores demonstram um aumento significativo e dependente da dose, da actividade luciferase nas células 60 ΡΕ2046716 transfectadas com os plasmídeos pGal4-hPPAR e tratadas com os compostos de acordo com o invento.
De forma inesperada, os dados experimentais apresentados mostram que os compostos de acordo com o invento ligam-se aos PPAR in vitro e induzem a activação da actividade de transcrição.
Exemplo 4: Avaliação in vivo no murganho ApoE2/E2, das propriedades sobre o peso corporal, das propriedades hipolipidemiantes, e estimuladoras da sintese de colesterol HDL, dos compostos de acordo com o invento
Principio
As propriedades sobre o peso corporal e as propriedades hipolipidemiantes dos compostos de acordo com o invento foram avaliadas in vivo através da medição do peso corporal, pela determinação de lípidos no plasma e por análise de expressão genética dos genes alvo dos PPAR após tratamento do murganho E2/E2 dislipidémico com os compostos de acordo com o invento. O modelo de murganho utilizado é o murganho do tipo ApoE2/E2, murganhos transgénicos para a isoforma E2 da apolipoproteina E humana (Sullivan PM et al., 1998). Nos seres humanos, esta apolipoproteina, constituinte das lipoproteinas de baixa e muito baixa densidade (LDL-VLDL), está presente em três isoformas, E2, E3 e E4. A forma E2 61 ΡΕ2046716 tem uma mutação num aminoácido na posição 158, que enfraquece consideravelmente a afinidade desta proteína em relação ao receptor nas LDL. A depuração das VLDL é, portanto, quase nula. Isto produz uma acumulação de lipoproteínas de baixa densidade e uma hiperlipidemia mista denominada de tipo III (colesterol e triglicéridos elevados). 0 PPARa regula a expressão de genes envolvidos no transporte de lípidos (apolipoproteínas tais como Apo AI, Αρο AII e Apo ClII, transportadores de membrana, tais como as FAT) ou o catabolismo dos lípidos (ACO, CPT-I e CPT-II, enzimas da β-oxidação de ácidos gordos). Um tratamento com os activadores de PPARa resulta, assim, quer em seres humanos quer em roedores, numa diminuição dos triglicéridos em circulação. A medição de lípidos plasmáticos após o tratamento com os compostos de acordo com o invento é, portanto, um indicador do carácter agonista de PPAR e, em conformidade, do carácter hipolipidemiante dos compostos de acordo com o invento.
Um tratamento com os activadores de PPAR resulta também, por vezes, quer em seres humanos quer em roedores, num aumento da Nível plasmático colesterol HDL. A medição da Nível plasmático de colesterol HDL, permite portanto demonstrar o carácter estimulador da síntese de colesterol HDL dos compostos de acordo com o invento.
As propriedades agonistas de PPARa previamente 62 ΡΕ2046716 medidas in vitro, devem ser traduzidas ao nivel hepático por uma sobre-expressão dos genes alvo directamente sob o controlo do receptor PPARa: os genes estudados nesta experiência são os Apo CIII (apolipoproteína envolvida no metabolismo lipidico) e PDK-4 (Pyruvate Dehydrogenase Kinase isoforma 4, enzima do metabolismo glicidico). A medição da actividade de transcrição de genes alvo de PPARa após tratamento com os compostos de acordo com o invento é, em conformidade, também um indicador de propriedades hipolipidemiantes dos compostos de acordo com o invento.
Protocolo
Tratamento dos animais
Os murganhos transgénicos Apo E2/E2 foram mantidos sob um ciclo de luz/obscuridade de 12/12 horas a uma temperatura constante de 20 ± 3°C. Após uma semana de aclimatação, os murganhos foram pesados e divididos em grupos de 6 animais de tal modo que a distribuição do seu peso corporal e dos seus niveis plasmáticos de lipidos determinada pela primeira vez antes da experiência sejam uniformes. Os compostos testados foram suspensos em carboximetilcelulose (Sigma C4888) e administrados através de sonda intra-gástrica, uma vez por dia durante 8 dias com a dose seleccionada. Os animais tiveram livre acesso à água e alimentação (dieta padrão). A ingestão de alimentos e ganho de peso foram registados ao longo de toda a 63 ΡΕ2046716 experiência. No final da experiência, os animais foram anestesiados após um jejum durante 4 horas, foi efectuada uma amostragem de sangue em anticoagulante (EDTA) e os murganhos foram pesados e sacrificados. 0 plasma foi separado por centrifugação a 3.000 rpm durante 20 minutos, as amostras foram armazenadas a +4°C.
As amostras de figado foram recolhidas e imediatamente congeladas em azoto liquido e armazenadas a -80°C para análise posterior.
Medição de lipídios plasmáticos
As concentrações plasmáticas de lípidos (colesterol e triglicéridos) são medidas através de ensaios enzimáticos (bioMérieux-Lyon-France) de acordo com as recomendações do fornecedor.
Os níveis plasmáticos de colesterol e triglicéridos foram medidos após 8 dias de tratamento por via oral com os compostos de acordo com o invento; estes níveis são comparados com aqueles obtidos com os animais de controlo (não tratados com os compostos de acordo com o invento): a diferença medida reflecte o efeito dos compostos hipolipidemiantes de acordo com o invento.
Medição do colesterol HDL
As lipoproteínas de baixa densidade (VLDL e LDL) 64 ΡΕ2046716 são precipitadas por fosfotungstato. 0 precipitado é removido por centrifugação. 0 colesterol HDL presente no sobrenadante foi quantificado por meio de ensaios enzimáticos (bioMérieux- Lyon- France) de acordo com as recomendações do fornecedor.
Análise da expressão genética por RT-PCR quanti- tativa 0 ARN total é extraido a partir de fragmentos de fígado, utilizando o estojo NucleoSpin® 96 ARN (Macherey Nagel, Hoerdt, France) de acordo com as instruções do fabricante. 1 μρ de ARN total (quantificado utilizando estojo de quantificação RiboGreen ARN (Molecular Probes)) é, seguidamente, transcrito de forma inversa em ADN complementar por uma reacção de 1 hora a 37 °C num volume total de 20 μΐ contendo tampão IX (Sigma), 1,5 mM de DTT, 0,18 mM de dNTPs (Promega), 200 ng de pdN6 (Amersham) , 30U de inibidor de ARNase (Sigma) e 1 μΐ de MMLV-RT (Sigma).
As experiências de PCR quantitativo foram realizadas utilizando o MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System (Biorad, Marnes-la-Coquette, France) e foram realizadas utilizando o estojo iQ SYBR Green Supermix conforme as recomendações do fornecedor, em placas de 96 poços em 5 μΐ de reacções de transcrição reversa diluidas com uma temperatura de hibridação de 55°C. Utilizaram-se pares de iniciadores específicos para os genes estudados: 65 ΡΕ2046716 PDK4: iniciador sentido directo: 5'-TACTCCACT-GCTCCAACACCTG-3' (SEQ ID NO:l) e iniciador sentido reverso 5'-GTTCTTCGGTTCCCTGCTTG-3' (SEQ IDNO: 2))
ApoCIII: iniciador sentido directo: 5'-CTCTTGGCT-CTCCTGGCATC-3'(SEQ ID NO:3) e iniciador sentido reverso 5'-GCATCCTGGACCGTCTTGGA-3' (SEQ ID NO: 4). A quantidade de fluorescência é directamente proporcional à quantidade de ADN complementar presente no inicio da reacção e amplificado durante a PCR. Para cada alvo estudada, é produzida uma gama de diluições sucessivas de um conjunto constituído por alguns μΐ de diferentes reacções de transcrição reversa. Os níveis de expressão relativa de cada alvo são deste modo determinados utilizando as curvas de eficiência obtidas com os pontos da gama.
Os níveis de expressão de genes de interesse são de seguida normalizados em relação ao nível de expressão dos genes de referência 36B4 (cujos os iniciadores específicos são: iniciador sentido directo: 5'-CATGCTCAACATCT-CCCCCTTCTCC-3' (SEQ ID NO: 7) e iniciador sentido reverso: 5'-GGGAAGGTGTAATCCGTCTCCACAG-3'(SEQ IDNO: 8)). 0 factor de indução, ou seja, a relação entre o sinal relativo (induzido pelo composto do invento) e a média dos valores relativos do grupo de controlo, é então calculada para cada amostra. Quanto maior for este factor, maior o carácter activador de expressão genética do composto. 0 resultado final é representado como a média dos valores de indução em cada grupo experimental. ΡΕ2046716 66
Resultados
Peso corporal A Figura 2-1 compara o ganho de peso dos animais após oito dias de tratamento com o composto 1 administrado a 5, 10 e 50 mpk com o ganho de peso dos animais de controlo. Inesperadamente, determinou-se nos animais tratados com o composto 1 uma perda de peso corporal.
Medição dos lipídios plasmáticos
As figuras 2-2 e 2-3 comparam os níveis plasmáticos de colesterol total e de colesterol HDL após 8 dias de tratamento com o composto ladministrado a 5, 10 e 50 mpk com os níveis obtidos com os animais de controlo. Inesperadamente, os níveis circulantes de colesterol total foram muito significativamente reduzidos e os níveis de colesterol HDL foram muito significativamente aumentados pelo tratamento.
As figuras 2-4 e 2-5 comparam os níveis plasmáticos de triglicéridos e de ácidos gordos livres após 8 dias de tratamento com o composto ladministrado a 5, 10 e 50 mpk com os níveis obtidos com os animais de controlo. Inesperadamente, os níveis circulantes de triglicéridos e de ácidos gordos livres foram reduzidos de forma significativa pelo tratamento. ΡΕ2046716 67
Análise da expressão de genes por RT-PCR quanti- tativa
Os inventores demonstraram igualmente que os compostos de acordo com o invento são, in vivo, reguladores da expressão de genes alvo dos PPAR. Os resultados apresentados nas figuras 2-6 e 2-7 mostram que o composto 1 administrado a 5, 10 e 50 mpk durante 8 dias a murganhos E2/E2 induziu um aumento significativo na expressão hepática de genes que codificam para PDK4 (figura 2-6) e uma redução na expressão hepática do gene que codifica para ApoCIII (Figura 2-7). O conjunto destes genes codificam enzimas fortemente envolvidas no metabolismo dos lipidos e dos glicidos e o facto de a sua expressão ser modulada pelos compostos de acordo com o invento reforça a ideia de que estes compostos apresentam um grande interesse potencial no quadro das patologias metabólicas.
Conclusão
De forma inesperada, os dados experimentais mostram que os compostos de acordo com o invento induzem in vivo uma diminuição de peso corporal, estimulam a sintese de colesterol HDL em paralelo com um efeito hipolipi-demiante (diminuição dos niveis plasmáticos de colesterol total, de triglicéridos e de ácidos gordos livres). Além disso, os dados experimentais apresentados mostram que os compostos de acordo com o invento modulam a expressão de 68 ΡΕ2046716 genes regulados por activação dos PPAR que codificam as enzimas fortemente envolvidas no metabolismo dos lipidos e dos glicidos.
Exemplo 5: Avaliação In vivo no murganho C57BI6, das propriedades sobre o peso corporal, das propriedades hipolipidemiantes e estimulantes da síntese de colesterol HDL, dos compostos de acordo com o invento.
Princípio
As propriedades sobre o peso corporal e as propriedades hipolipidemiantes dos compostos de acordo com o invento foram avaliadas in vivo através da medição do peso corporal, pela determinação de lipidos plasmáticos e por análise da expressão genética de genes alvo dos PPAR após tratamento por via oral, com os compostos de acordo com o invento, do murganho C57B16.
Protocolo
Tratamento dos animais
Murganhos fêmea C57BI6 foram mantidos sob um ciclo de luz/obscuridade de 12/12 horas a uma temperatura constante de 20 ± 3°C. Após uma semana de aclimatação, os murganhos foram pesados e divididos em grupos de 6 animais seleccionados de tal modo que a distribuição do seu peso corporal e os seus níveis plasmáticos de lipidos 69 ΡΕ2046716 determinada pela primeira vez antes da experiência sejam uniformes. Os compostos testados foram suspensos em carboximetilcelulose (Sigma C4888) e administrados através de sonda intra-gástrica, uma vez por dia durante 14 dias com a dose seleccionada. Os animais tiveram livre acesso à água e alimentação (dieta padrão). A ingestão de alimentos e ganho de peso foram registados durante toda a experiência. No fim da experiência, os animais foram anestesiados após um jejum de 4 horas, foi efectuada uma amostragem de sangue em anticoagulante (EDTA) e os murganhos foram pesados e sacrificados. 0 plasma foi separado por centrifugação a 3000 rpm durante 20 minutos, as amostras foram armazenadas a +4°C. Foram recolhidas amostras de tecido hepático e imediatamente congeladas em azoto liquido e armazenadas a -80°C para análise posterior.
Medição de colesterol HDL
As lipoproteinas de baixa densidade (VLDL e LDL) foram precipitadas por Fosfotungstato. O precipitado é removido por centrifugação. O colesterol HDL presente no sobrenadante foi quantificado por meio de ensaios enzimá-ticos (bioMérieux-Lyon-Franca) de acordo com as recomendações do fornecedor.
Medição de triglicéridos plasmáticos
As concentrações plasmáticas de triglicéridos foram medidas por ensaios enzimáticos (bioMérieux-Lyon-Franca), de acordo com as recomendações do fornecedor. 70 ΡΕ2046716
Análise da expressão genética por RT-PCR quan- titativa O ARN total foi extraído a partir de fragmentos de fígado, utilizando o estojo NucleoSpin® 96 ARN (Macherey Nagel, Hoerdt, France) de acordo com as instruções do fabricante. 1 μρ de ARN total (quantificado por espectro-fotometria) foi de seguida sujeito a transcrição reversa em ADN complementar por reacção de 1 hora a 37 °C num volume total de 20 μΐ contendo tampão IX (Sigma), 1,5 mM de DTT, 0,18 mM de dNTPs (Promega), 200 ng de pdN6 (Amersham) , 30U de inibidor de ARNase (Sigma) e 1 μΐ de MMLV-RT (Sigma).
As experiências de PCR quantitativo foram realizadas utilizando o MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System (Biorad, Marnes-la-Coquette, France) e foram realizadas utilizando o estojo iQ SYBR Green Supermix conforme as recomendações do fornecedor, em placas de 96 poços em 5 μΐ de reacções de transcrição reversa diluídas com uma temperatura de hibridação de 55°C. Utilizaram-se pares de iniciadores específicos para os genes estudados: PDK4: iniciador sentido directo: 5'-TACTCCACTG-CTCCAACACCTG-3'(SEQ ID NO:l) e iniciador sentido reverso 5'-GTTCTTCGGTTCCCTGCTTG-3' (SEQ ID NO: 2))
ApoCIII: iniciador sentido directo: 5'-CTCTTGGC- 71 ΡΕ2046716 TCTCCTGGCATC-3'(SEQ ID N0:3) e iniciador sentido reverso 5'-GCATCCTGGACCGTCTTGGA 3' (SEQ ID NO: 4). A quantidade de fluorescência é directamente proporcional à quantidade de ADN complementar presente no inicio da reacção e amplificado durante a PCR. Para cada alvo estudada, é produzida uma gama de diluições sucessivas de um conjunto constituído por alguns μΐ de diferentes reacções de transcrição reversa. Os níveis de expressão relativa de cada alvo são deste modo determinados utilizando as curvas de eficiência obtidas com os pontos da gama.
Os níveis de expressão de genes de interesse foram de seguida normalizados em relação ao nível de expressão dos genes de referência 36B4 (cujos iniciadores específicos são: iniciador sentido directo: 5'-CATGCTCAAC-ATCTCCCCCTTCTCC-3'(SEQ ID NO: 7) e iniciador sentido reverso: 5'-GGGAAGGTGTAATCCGTCTCCACAG-3'(SEQ IDNO: 8)). 0 factor de indução foi em seguida calculado para cada amostra. Quanto maior for este factor, maior o carácter activador de expressão genética do composto. 0 resultado final é representado como a média dos valores de indução em cada grupo experimental.
Resultados
Peso corporal A figura 3-1 compara o ganho de peso dos animais 72 ΡΕ2046716 após 14 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 3, 10 e 30 mpk e o ganho de peso dos animais de controlo.
Inesperadamente, mediu-se uma perda de peso corporal nos animais tratados com o composto 1.
Medição dos lipídios plasmáticos A figura 3-2 compara os níveis plasmáticos de colesterol HDL após 14 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 3, 10 e 30 mpk com os níveis obtidos com os animais de controlo. Inesperadamente, os níveis circulantes de colesterol HDL foram muito significativamente aumentados pelo tratamento. A figura 3-3 compara os níveis plasmáticos de triglicéridos após 14 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 3, 10 e 30 mpk com os níveis obtidos com os animais de controlo. Inesperadamente, os níveis circulantes de triglicéridos foram reduzidos de forma significativa pelo tratamento.
Análise da expressão genética por RT-PCR quanti- tativo
Os inventores demonstraram também que os compostos de acordo com o invento são, in vivo, reguladores da expressão de genes alvo dos PPAR. Os resultados apresentados nas figuras 3-4 e 3-5 mostram que o composto 1 administrado a 3, 10 e 30 mpk, durante 14 dias a murganhos C57BI6, induziu um aumento significativo na expressão 73 ΡΕ2046716 hepática de genes que codificam para PDK4 (figura 3-4) e uma redução na expressão hepática dos genes que codificam para ApoCIII (figura 3-5) . 0 conjunto destes genes codificam enzimas fortemente envolvidas no metabolismo dos lipidos e dos glicidos e o facto de a sua expressão ser modulada pelos compostos de acordo com o invento reforça a ideia de que estes compostos apresentam um grande interesse potencial no quadro das patologias metabólicas.
Conclusão
De forma inesperada, os dados experimentais mostram que os compostos de acordo com o invento induzem in vivo uma diminuição de peso corporal, estimulam a síntese de colesterol HDL em paralelo com um efeito hipolipi-demiante (diminuição dos níveis plasmáticos de triglicé-ridos). Além disso, os dados experimentais apresentados mostram que os compostos de acordo com o invento modulam a expressão de genes regulados por activação dos PPAR que codificam as enzimas fortemente envolvidas no metabolismo dos lipidos e dos glicidos.
Exemplo 6: Avaliação in vivo, nos murganhos db/db, das propriedades sobre o peso corporal, das propriedades anti-diabetes, hipolipidemiantes e estimulantes da síntese de colesterol HDL, dos compostos de acordo com o invento.
Princípio
As propriedades sobre o peso corporal, a resis- - 74 - ΡΕ2046716 tência à insulina e as propriedades hipolipidemiantes dos compostos de acordo com o invento foram avaliadas in vivo através da medição do peso corporal, medição dos níveis plasmáticos de glucose e de insulina, a determinação de lípidos plasmáticos, análise da distribuição do colesterol nas diferentes fracções lipoproteícas plasmáticas e por análise da expressão genética de genes alvo dos PPAR após o tratamento por via oral, com os compostos de acordo com o invento, do murganho db/db.
Protocolo
Tratamento dos animais
Murganhos fêmea db/db foram mantidos sob um ciclo de luz/obscuridade de 12/12 horas a uma temperatura constante de 20 ± 3°C. Após uma semana de aclimatação, os murganhos foram pesados e divididos em grupos de 8 animais seleccionados de tal modo que a distribuição do seu peso corporal e os seus níveis plasmáticos de lípidos determinada pela primeira vez antes da experiência sejam uniformes. Os compostos testados foram suspensos em carboximetilcelulose (Sigma C4888) e administrados através de sonda intra-gástrica, uma vez por dia durante 28 dias com a dose seleccionada. Os animais tiveram livre acesso à água e alimentação (dieta padrão). A ingestão de alimentos e ganho de peso foram registados durante toda a experiência. No fim da experiência, os animais foram anestesiados após um jejum de 4 horas, foi efectuada uma 75 ΡΕ2046716 amostragem de sangue em anticoagulante (EDTA) e os murganhos foram pesados e sacrificados. 0 plasma foi separado por centrifugação a 3000 rpm durante 20 minutos, as amostras foram armazenadas a +4°C. Foram recolhidas amostras de tecido hepático e de tecido muscular esquelético foram recolhidas e imediatamente congeladas em azoto liquido e armazenadas a -80°C para análise posterior.
Medição da glicemia e da insulinemia plasmática A glucose plasmática no murino é determinada de acordo com um método enzimo-colorimétrico usando o estojo Glucose RTU (Biomérieux) . A glucose é convertida em ácido glucónico pela acção da glucose oxidase e esta reacção liberta peróxido de hidrogénio. O peróxido de hidrogénio é doseado de acordo com a reacção de Trinder que, pela acção de uma peroxidase na presença de fenol e 4-amino-antipirina, produz água e um produto colorido, quinona-imina. A intensidade da coloração devida à quinona-imina é proporcional à quantidade de glucose presente na amostra. A determinação da insulina no murino é efectuada pelo método de Elisa (usando o estojo INSKR020 do fornecedor Crystal chem). Um anticorpo anti-insulina de murganho é revestido sobre uma microplaca. O soro para o ensaio de insulina é então depositado sobre esta placa. Um anticorpo anti-insulina de cobaia vai reconhecer o complexo insulina/anticorpo monoclonal anti-insulina de murganho fixar-se. Finalmente, um anticorpo anti-cobaia marcado com 76 ΡΕ2046716 peroxidase é adicionado para fixando-se ao anticorpo anti-insulina de cobaia. A reacção colorimétrica é realizada por adição do substrato da enzima OPD (Orto Fenil Diamina). A intensidade da cor é proporcional à quantidade de insulina presente na amostra.
Medição de lípidos plasmáticos
As concentrações plasmáticas de lípidos (colesterol total e triglicéridos) são medidas através de ensaios enzimáticos (bioMérieux, Lyon, França) de acordo com as recomendações do fornecedor.
Análise da distribuição do colesterol em fracções lipoproteícas plasmáticas.
As diferentes fracções lipídicas (VLDL, LDL, HDL) do plasma foram separadas por cromatografia em Gel-Filtração. As concentrações de colesterol foram de seguidas medidas em cada fracção por ensaios enzimáticos (bioMérieux, Lyon, França), de acordo com as recomendações do fornecedor .
Análise da expressão genética por RT-PCR quantitativo
Tecido hepático 0 ARN total foi extraído a partir de fragmentos 77 ΡΕ2046716 de fígado, utilizando o estojo NucleoSpin® 96 ARN (Macherey Nagel, Hoerdt, França) de acordo com as instruções do fabricante.
Tecido esqueletal 0 ARN total foi extraído a partir de fragmentos de músculo esqueletal gastrocnémico utilizando o estojo RNeasy® Fibrous Tissue estojo (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. 1 μg de ARN total (quantificado por espectro-fotometria) foi de seguida sujeito a transcrição reversa para ADN complementar por reacção de 1 hora a 37 °C num volume total de 20 μΐ contendo tampão IX (Sigma), 1,5 mM DTT, 0,18 mM de dNTPs (Promega), 200 ng de pdN6 (Amersham), 30 U de inibidor de ARNase (Sigma) e 1 μύ de MMLV-RT (Sigma).
As experiências de PCR quantitativo foram realizadas utilizando o MyiQ Single-Cor Real-Time PCR Detection System (Biorad, Marnes-la-Coquette, França) e foram realizadas utilizando o estojo iQ SYBR Green Supermix conforme recomendações do fornecedor, em placas de 96 poços, em 5 μΐ de reacção de transcrição reversa diluída com uma temperatura de hibridação de 55°C. Foram utilizados pares de iniciadores específicos dos estudos. PDK4: iniciador sentido directo: 5'-TACTCCACTGCT- 78 ΡΕ2046716 CCAACACCTG-3'(SEQ ID N0:1) e iniciador sentido reverso 5'-GTTCTTCGGTTCCCTGCTTG-3' (SEQ ID NO: 2)) UCP2: iniciador sentido directo: 5'-GTCGGAGATACC-AGAGCACTGTCG-3 '(SEQ ID NO: 5) e iniciador sentido reverso 5'-CACATCAACAGGGGAGGCGA-3' (SEQ ID NO: 6) A quantidade de fluorescência emitida é directamente proporcional à quantidade de ADN complementar presente no inicio da reacção e amplificado durante a PCR. Por cada alvo estudado, é preparada uma gama por diluições sucessivas de um conjunto constituído por alguns microlitros de diferentes reacções de transcrição reversa. Os níveis de expressão relativa a cada alvo e são determinados utilizando as curvas de eficiência obtidas com os pontos da gama.
Os níveis de expressão de genes de interesse foram de seguida normalizados no tecido hepático em relação ao nível de expressão do gene de referência 36B4 (cujos iniciadores específicos são: iniciador sentido directo: 5'-CATGCTCAACATCTCCCCCTTCTCC-3'(SEQ ID NO: 7) e iniciador sentido reverso: 5'-GGGAAGGTGTAATCCGTCTCCACAG-3' (SEQ ID NO: 8)) e, no tecido muscular esquelético em relação com o nível de expressão do gene de referência 18S (cujos iniciadores específicos são: iniciador sentido directo: 5'-C GGACAC GGACAGGAT T GACAG-3 ' (SEQ ID NO: 9) e iniciador sentido reverso: 5'-AATCTCGGGTGGCTGAACGC-3' (SEQ ID NO: 10)) . O factor de indução foi então calculado para cada 79 ΡΕ2046716 amostra. Quanto maior for este factor, maior o carácter activador de expressão do gene do composto. 0 resultado final é representado como média dos valores de indução em cada grupo experimental.
Resultados
Peso corporal A figura 4-1 compara o ganho de peso dos animais após 28 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 50 mpk com o ganho de peso dos animais de controlo. Inesperadamente, mediu-se uma perda de peso corporal nos animais tratados com o composto 1.
Medição da glicemia e da insulinemia
As figuras 4-2 e 4-3 comparam os niveis plasmá-ticos de glucose e de insulina após 28 dias de tratamento com o composto 1 administrado a 50 mpk. Inesperadamente, a glicemia e a insulinemia foram significativamente diminuídas pelo tratamento.
Medição de lipídos plasmáticos A figura 4-4 compara os niveis plasmáticos de colesterol total após 28 dias de tratamento com os compostos 1 e 3, administradas a 50 mpk com os niveis obtidos com os animais de controlo. Inesperadamente, os niveis 80 ΡΕ2046716 totais de colesterol foram significativamente aumentados. A figura 4-5 mostra que esse aumento do colesterol total plasmático corresponde um aumento significativo da fracção colesterol HDL induzido pelo tratamento dos animais com os compostos 1 e 3 a 50 mpk.
As figuras 4-6 e 4-7 comparam os niveis plas-máticos de triglicéridos e ácidos gordos livres, após 28 dias de tratamento com os compostos 1 e 3, administrados a 50 mpk com os niveis obtidos com os animais de controlo. Inesperadamente, os niveis circulantes de triglicéridos e ácidos gordos livres foram muito significativamente diminuídos pelo tratamento.
Análise da expressão genética por RT-PCR quanti- tativa
Os inventores demonstraram igualmente que os compostos de acordo com o invento são, in vivo, reguladores da expressão de genes alvo dos PPAR. Os resultados apresentados nas Figuras 4-8 e 4-9 mostram que os compostos 1 e 3 administrados a 50 mpk durante 28 dias em murganhos db/db, induzem um aumento significativo da expressão hepática de genes que codificam PDK4 (figura 4-8) e uma redução na expressão no músculo-esquelético do gene que codifica UCP2 (Fig. 4-9). O conjunto destes genes codificam enzimas fortemente envolvidas no metabolismo dos lípidos, dos glícidos e de dissipação de energia e o facto de a sua expressão ser modulada pelos compostos de acordo com o 81 ΡΕ2046716 invento, reforça a ideia de que estes compostos possuem um grande interesse potencial no contexto das patologias metabólicas.
Conclusão
De forma inesperada, os dados experimentais apresentados mostram que os compostos de acordo com o invento induzem in vivo uma perda de peso corporal, um aumento da sensibilidade à insulina, estimulam a síntese de colesterol HDL em paralelo com um efeito hipolipidemiante (diminuição de níveis plasmáticos de triglicéridos). Além disso, os dados experimentais apresentados mostram que os compostos de acordo com o invento modulam a expressão de genes regulados pela activação dos PPAR, que codificam enzimas fortemente envolvidas no metabolismo de lípidos, de glícidos e de dissipação de energia.
Exemplo 7: Avaliação in vitro das propriedades anti-inflamatórias dos compostos de acordo com o invento
Principio
Os efeitos anti-inflamatórios dos compostos de acordo com o invento foram avaliados através da medição da secreção de MCP 1 (Monocyte chemotactic protein-1) por monócitos tratados durante 24 horas com os compostos de acordo com o invento e simultaneamente estimulados com PMA (12-miristato-13-acetato de forbol, provoca uma resposta 82 ΡΕ2046716 inflamatória das células e sua diferenciação em macró-fagos). Quanto menor a quantidade de MCP1 segregada, mais o composto do invento inibe a reacção inflamatória.
Protocolo
Cultura e tratamento de células THP-1. A linha de monócitos humanos THP1 (proveniência ATCC) foi cultivada em meio RPMI1640 suplementado com 25 mM Hepes (Gibco; 42401-018), 1% de glutamina (Gibco, 25030-24), 1% de penicilina/estreptomicina (Biochrom AG; A 2213) e 10% de soro de vitelo fetal descomplementado (FCS. Gibc; 26050-088).
As células semeadas em placas de 24 poços (Primaria BD Falcon) a uma densidade de 870.000 células/poço são posteriormente incubadas a 37 °C e 5% de CCq durante 24 horas em meio de cultura contendo 0,2% de soro de vitelo fetal na presença de 5 ng/mL de 12-miristato-13-acetato de forbol (PMA) e 1 μΜ do composto 3 de acordo com o invento. O composto de acordo com o invento é dissolvido em dime-tilsulfóxido (DMSO, Fluka; 41640). O efeito dos compostos de acordo com o invento é comparado com o efeito do DMSO isolado.
Medição da secreção de MCP1 O meio de tratamento é recuperado e a concentração de MCP1 é medida utilizando o estojo Elisa "Human 83 ΡΕ2046716 MCPl Elisa Set" (BD OptEIA; 555179) de acordo com as recomendações do fabricante. A MCPl é fixada sobre uma placa e reconhecida por um anticorpo especifico anti-MCPl. 0 anticorpo é, por sua vez, especificamente reconhecido por um segundo tipo de anticorpos acoplados a uma enzima peroxidase. A coloração resultante da actividade enzimática é proporcional à quantidade de MCPl fixada e pode ser medida por espectrofotometria. É produzida uma gama a partir de um ponto de concentração conhecido e utilizada para calcular a concentração de MCPl em cada amostra. 0 factor de indução, ou seja, a razão entre o sinal induzido pelo composto de acordo com o invento, e o sinal do grupo de controlo, foi de seguida calculado. Quanto menor for este factor, mais o composto possui um carácter inibidor de secreção da MCPl. 0 resultado final é representado como média de valores de indução para cada grupo experimental.
Resultados
Os inventores demonstraram em monócitos in vitro, que os compostos de acordo com o invento possuem efeitos anti-inflamatórios. Os resultados apresentados na figura 5 mostram que o composto 3 de acordo com o invento, a 1 μΜ, induziu um decréscimo significativo na secreção de MCPl pelos monócitos. 84 ΡΕ2046716
Conclusão
De forma inesperada, os dados experimentais apresentados mostram que os compostos de acordo com o invento possuem uma acção anti-inflamatória em monócitos estimulados com PMA
Conclusão Geral
Os inventores mostraram que os compostos de acordo com o invento conduzem a uma perda de peso corporal, possuem propriedades hipolipidemiantes, baixando os niveis plasmáticos de colesterol e triglicéridos, propriedades estimulantes da síntese de colesterol HDL bem como propriedades anti-diabéticas. Além disso, os inventores demonstraram que os compostos de acordo com o invento, são reguladores da expressão de genes que codificam enzimas fortemente envolvidas no metabolismo lipídico, glicídico e de dissipação de energia.
Os inventores demonstraram igualmente que os compostos de acordo com o invento possuem propriedades anti-inflamatórias.
Estes resultados, obtidos in vivo e in vitro, atestam o potencial terapêutico dos compostos de acordo com o invento, em relação a patologias importantes, tais como as dislipidemias, a diabetes de tipo 2 e a obesidade. 85 ΡΕ2046716
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Lisboa, 4 de novembro de 2013

Claims (11)

  1. ΡΕ2046716 1 REIVINDICAÇÕES 1. Compostos derivados de 1,3-difenilpropano substituído de fórmula geral (I):
    em que: XI representa um átomo de halogéneo, um grupo Rl ou Gl-Rl; X2 representa um átomo de hidrogénio; X3 representa um grupo R3; X4 representa G4-R4 no qual G4 representa um átomo de oxigénio; X5 representa um grupo R5; Rl representa um grupo alquilo halogenado; R3 e R5, iguais ou diferentes, representam um grupo alquilo não substituído; G1 representa um átomo de oxigénio ou de enxofre; R4 representa um grupo alquilo substituído com um grupo C00R9; A representa (I) um grupo -CR6R7 em que: 2 ΡΕ2046716 R6 representa um átomo de hidrogénio, R7 representa um grupo hidroxilo ou um grupo -0R8, representando R8 um grupo alquilo, substituído ou não substituído por um grupo arilo, heteroarilo ou cicloal-quilo; ou (ii) um grupo carbonilo, D representa um átomo de carbono ligado a dois átomos de hidrogénio, R9 representa um átomo de hidrogénio ou um grupo alquilo não substituído, os seus estereoisómeros, diastereoisómeros, enantiómeros puros ou em mistura, misturas racémicas, isómeros geométricos, tautómeros, sais, hidratos, solvatos, formas sólidas bem com as misturas destes.
  2. 2. Compostos de acordo com a reivindicação 1, caracterizados por A representar um grupo carbonilo (CO).
  3. 3. Compostos de acordo com a reivindicação 1 ou a 2, caracterizados por X4 representar um grupo G4R4, no qual G4 representa um átomo de oxigénio e R4 representa um grupo alquilo compreendendo 1-10 átomos de carbono e substituído com um grupo -COOR9, sendo R9 tal como definido na reivindicação 1.
  4. 4. Compostos de acordo com a reivindicação 3 3 ΡΕ2046716 caracterizados por o grupo X 4 possuir a fórmula OC (CH3) 2COOR9, sendo R9 tal como definido na reivindicação 1.
  5. 5. Compostos de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizados por R3 e R5 re presentarem um grupo alquilo não substituído compreendendo 1, 2, 3 ou 4 átomos de carbono.
  6. 6. Compostos de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizados por XI representar um átomo de halogéneo ou um grupo G1R1, sendo G1 tal como definido na reivindicação 1 e RI representa um grupo alquilo halogenado que possui 1, 2 ou 3 átomos de carbono.
  7. 7. Compostos de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizados por serem selec-cionados a partir de: Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometoxi)fe-nil]-3-oxo-propil]fenoxi]-2-metilpropanóico, Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometiltio)-fenil]-3-oxo-propil]fenoxi]-2-metilpropanóico, Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-bromofenil]-3-oxo-propil] fenoxi]-2-metilpropanóico, Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(trifluorometil)fenil] -3-oxo-propil]fenoxi]-2-metilpropanóico, Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-hydroxi-3-[4-(trifluo-rometiltio)fenil]propil]fenoxi]-2-metilpropanóico, 4 ΡΕ2046716 Ácido 2-[2,6-dimetil-4-(3-(pyridin-3-ilmetoxi)-3-(4- (trifluorometoxi)fenil)propil)fenoxi]-2-metilpropanóico, Ácido 2-[4- (3-(4-iodobenziloxi)-3-(4-(trifluoro-metoxi)fenil)propil)-2,6-dimetilfenoxi]-2-metilpropanóico, Ácido 2-[4-(3-metoxi-3-(4-(trifluorometoxi)fe-nil)propil)-2,6-dimetilfenoxi]-2-metilpropanóico, Ácido 2-[2,6-dimetil-4-[3-[4-(3,3,3-trifluoropro-piloxi)fenil]-3-oxopropil]fenoxi]-2-metilpropanóico, Ácido 2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(2,2,2-triflu-oroetoxi)fenil)propil)fenoxi)-2-metilpropanóico, Ácido 2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(2,2,2-triflu-oroetiltio)fenil)propil)fenoxi)-2-metilpropanóico, Ácido 2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(trifluorometoxi) fenil)propil)fenoxi)propanóico, Ácido 2-(4-(3-hidroxi-3-(4-(trifluorometoxi)fenil) propil)-2,6-dimetilfenoxi)-2-metilpropanóico, Ácido 4-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(trifluorometoxi) fenil)propil)fenoxi)-2,2-dimetilbutanóico, 2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(trifluorometoxi)-fenil)propil)fenoxi)-2-metilpropanoato de terc-butilo, 2-(2,6-dimetil-4-(3-oxo-3-(4-(trifluorometoxi)fenil) propil) fenoxi) -2-metilpropanoato de isopropilo.
  8. 8. Composição farmacêutica compreendendo, num suporte farmaceuticamente aceitável, pelo menos um composto tal como definido em uma das reivindicações 1 a 7, eventualmente em associação com um ou vários outros princípios activos terapêuticos e/ou cosméticos. 5 ΡΕ2046716
  9. 9. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, para o tratamento de complicações associadas com a sindrome metabólica, resistência à insulina, diabetes, dislipidemias, aterosclerose, doenças cardiovasculares, obesidade, hipertensão, doenças inflamatórias, doenças neurodegenerativas, ou cancros.
  10. 10. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, para o tratamento das dislipidemias.
  11. 11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 8, para o tratamento de factores de risco cardiovasculares associados às desregulações do metabolismo lipidico e/ou glicidico. Lisboa, 4 de novembro de 2013
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