PT2035445E - Polinucleótidos que codificam novos variantes de pcsk9 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAM NOVOS VARIANTES DE PCSK9 CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção fornece novos polinucleótidos que codificam polipéptidos de PCSK9b e PCSK9c, fragmentos e homólogos dos mesmos. Também são proporcionadoa vetores, células hospedeiras, anticorpos, e métodos recombinantes e sintéticos para a produção dos ditos polipéptidos. A invenção refere-se ainda a utilização diagnóstica e terapêutica destes novos polipéptidos de PCSK9b e PCSK9c no diagnóstico, tratamento, e/ou prevenção de várias doenças e/ou distúrbios relacionado com estes polipéptidos. ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A aterosclerose é uma doença das artérias responsáveis pela doença cardíaca coronária (CVD) que está subjacente a maioria das mortes nos países industrializados (Lusis, 2000).Vários fatores de risco para doença coronária já estão bem estabelecidos: dislipidemias, hipertensão, diabetes, tabaquismo, má alimentação, sedentarismo e estresse. As dislipidemias mais clinicamente relevantes e comuns são caracterizadas por um aumento em partículas de beta-lipoproteínas (VLDL e LDL) com hipercolesterolemia na ausência ou na presença de hipertrigliceridemia (Fredrickson et al, 1967). Uma elevação isolada de colesterol LDL é um dos fatores de risco mais comuns para DCV. Estudos com gêmeos (Austin et al, 1987) e dados familiares (Perusse, 1989; Rice et al, 1991) têm mostrado a importância dos fatores genéticos no desenvolvimento da doença, particularmente quando suas complicações ocorrem precocemente na vida. Foram identificadas formas mendelianas de hipercolesterolemia: em primeiro lugar a forma dominante autossómica (ADH) (Khachadurian, 1964) e, posteriormente, a forma recessiva autossómica (ARH), inicialmente descrita como "hiperlipoproteinemia tipo pseudohomozigótico II" (Morganroth et al, 1967) . ADH é um distúrbio genético heterogéneo. A sua forma mais frequente e arquetipica é a hipercolesterolemia familiar (FH) com uma frequência de 1 em 500 para os heterozigotos e 1 por milhão de homozigotos (Goldstein et al, 1973) . A doença é co-dominante com homozigotos sendo afetada mais cedo e muito mais severamente do que os heterozigotos. FH é causada por mutações no gene que codifica o recetor de LDL (Goldstein & Brown, 1978) (LDLR E, 19pl3.l-pl3,3) (MIN 143890) . É caracterizada por um aumento seletivo dos níveis de colesterol LDL no plasma dando origem a xantomas no tendão e pele, arco corneai e depósitos cardiovasculares que conduzem a aterosclerose prematura e progressiva, a CHD e mortalidade (que ocorre antes dos 55 anos) . A segunda forma de ADH é familiar com defeito de apo B-100 (FDB) causada por mutações no gene da apolipoproteína B (ApoB em 2p23-p24), que codifica o ligando do recetor de LDL (Inneraty et al, 1987) (MIN 144010). A existência de um maior nível de heterogeneidade genética em ADH (Saint-Jore et al, 2000) tem sido relatada e a implicação de um terceiro locus chamado HCHOLA3 (anteriormente FH3) foi detetada e mapeada em Ip34.1-p32 numa família francesa (Varret et al, 1999) (MIM 603776) . Estes resultados foram confirmados por Hunt et al. numa grande família de Utah (Hunt et al, 2000). PCSK9, para Pró-Proteína Convertase Subtilisina Kexina de tipo 9 (também referida como HCHOLA3, NARC-I, ou FH3) é uma protease que pertence à subfamília de proteinase K da família subtilase secretora (Naureckiene et al. , Arch, de Biochem. E Biophy., 420:55-57 (2003)). PCSK9 tem mostrado desempenhar um papel na homeostase do colesterol através da regulação da secreção de recetor de apolipoproteína. Pode também ter um papel na diferenciação de neurónios corticais do cérebro (Seidah et al., PNAS 100(3):928-933 (2003)). 0 gene PCSK9 de tipo selvagem contém 12 exões. A proteína traduzida contém um péptido de sinal na terminação NH2-, e em células e tecidos uma forma de zimogénio de cerca de 74 kDa (precursor) da proteína de comprimento completo é encontrada no retículo endoplasmático. Durante o processamento inicial na célula, a prodomínio péptido de cerca de 14 kDa é clivado autocataliticamente para produzir uma proteína madura de cerca de 60 kDa contendo o domínio catalítico e um domínio C-terminal, muitas vezes referida como o domínio rico em cisteína-histidina (CHRD) (Figura 1) . Esta forma de cerca de 60 kDa de PCSK9 é segregada a partir de células do fígado. A forma segregada de PCSK9 parece ser a espécie fisiologicamente ativa, embora um papel funcional intracelular do cerca de 60 kDa não tenha sido descartado. Várias formas mutantes de PCSK9 são conhecidas, incluindo S127R, N157K, F216L, R218S, e D374Y, com S127R, F216L, e D374Y sendo ligada a hipercolesterolemia autossómica dominante (ADH). Benjannet et al. (J. Biol. Chem., 279(47):48865-48875 (2004)) demonstraram que as mutações de S127R e D374Y resultam numa diminuição significativa do nível de pró-PCSK9 processado no ER para formar o zimogénio segregado ativo. Como um consequência acredita-se que PCSK9 de tipo selvagem aumenta a taxa de renovação do recetor de LDL, causando a inibição da depuração de LDL (Maxwell et al., PNAS, 102(6):2069-2074 (2005); Benjannet et al., e Lalanne et al); enquanto mutações utossómicas dominantes de PCSK9 a resultam em níveis aumentados de LDLR, a depuração aumentada de LDL circulante, e uma diminuição correspondente dos níveis de colesterol no plasma (Rashid et al., PNAS, 102(15) :5374-5379 (2005) .

Lalanne et al. demonstraram que o catabolismo de LDL foi prejudicada e síntese de lipoproteína contendo apolipoproteína B foi reforçada em dois pacientes que portam mutações S127R em PCSK9 (J. Lipid Research, 46:1312-1319 (2005)) . Sun et al. também forneceram evidências de que as formas mutantes de PCSK9 também são a causa de hipercolesterolemia dominante invulgarmente grave em consequência do seu efeito de aumentar a secreção de apolipoproteina B (Sun et al, Hum. Mol. Genet., 14(9): 1161-1169 (2005)). Estes resultados foram consistentes com os resultados anteriores que demonstraram que a sobreexpressão mediada por adenovirus dos resultados PCSK9 em ratinhos em hipercolesterolemia grave devido a decréscimos drásticos na quantidade de recetor de LDL Dubuc et al., Thromb. Vase. Biol., 24:1454-1459 (2004), para além dos resultados que demonstram formas mutantes de PCSK9 também reduzem o nivel de recetor de LDL (Park et al., J. Biol. Chem., 279:50630-50638 (2004). O super-expressão de PCSK9 em linhas celulares, incluindo células derivadas do fígado, e em fígados de ratinhos in vivo, resulta numa pronunciada redução em níveis de atividade funcional de proteína LDLR e LDLR sem mudanças em nível de ARNm de LDLR (Maxwell K. N., Breslow J. L., Proc. Nat. Amer. Sei., 101:7100-7105 (2004); Benjannet S. et al., J. Bio. Chem. 279 : 48865-48875 (2004)) .

Utilizando os exemplos anteriores, é evidente a disponibilidade de novas formas de PCSK9 proporcionar uma oportunidade para a identificação de agonistas de PCSK9, bem como, para a identificação de inibidores da PCSK9. Tudo o que pode ser terapeuticamente útil em circunstâncias diferentes. A presente invenção também se refere a vetores recombinantes, que incluem as moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção, e a células hospedeiras contendo os vetores recombinantes, bem como a métodos de produzir tais vetores e células hospedeiras, além de sua utilização na produção de polipéptidos ou péptidos PCSK9b e PCSK9c utilizando técnicas recombinantes. Métodos sintéticos para a produção dos polipéptidos e polinucleótidos da presente invenção são proporcionados. Também são proporcionados métodos de diagnóstico para a deteção de doenças, distúrbios, e/ou condições relacionados com os polipéptidos e polinucleótidos de PCSK9b e PCSK9c, e utilizações dos polipéptidos em métodos terapêuticos para o tratamento de tais doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico isoladas, que compreendem, ou alternativamente consistem em, um polinucleótido que codifica a proteína PCSK9b tendo a sequência de aminoácido mostrada nas Figuras 1A-C (SEQ ID N0:2), respetivamente, ou a sequência de aminoácido codificado pelo clone de ADNc, PCSK9b (também referido como PCSK9-b), depositado como Número de depósito ATCC® PTA-7622 em 10 de maio de 2006. A presente invenção fornece moléculas de ácido nucleico isoladas, que compreendem, ou alternativamente consistem em, um polinucleótido que codifica the PCSK9c proteína tendo a sequência de aminoácido mostrada nas Figuras 1A-D (SEQ ID NO:4), respetivamente, ou a sequência de aminoácido codificado pelo clone de ADNc, PCSK9c (também referido como PCSK9-C), depositado como Número de depósito ATCC® PTA-7622 em 10 d emaio de 2006. A presente invenção também se refere a vetores recombinantes, que incluem as moléculas de ácido nucleico isoladas da presente invenção, e a células hospedeiras contendo os vetores recombinantes, bem como a métodos de produzir tais vetores e células hospedeiras, além da sua utilização na produção de polipéptidos ou péptidos PCSK9b ou PCSK9c utilizando técnicas recombinantes. Métodos sintéticos para a produção dos polipéptidos e polinucleótidos da presente invenção são proporcionados. Também são proporcionados métodos de diagnóstico para a deteção de doenças, distúrbios, e/ou condições relacionados com os polipéptidos e polinucleótidos de PCSK9b ou PCSK9c, e utilizações do polipéptido em métodos terapêuticos para o tratamento de tais doenças, distúrbios, e/ou condições. A invenção fornece ainda um polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c isolado tendo uma sequência de aminoácido codificada por um polinucleótido descrito no presente documento. A invenção refere-se ainda a um polinucleótido que codifica um fragmento de polipéptido da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4, ou um fragmento de polipéptido codificado pela sequência de ADNc incluído no clone depositado, que é hibridizável a SEQ ID N0:1 ou SEQ ID N0:3. A invenção refere-se ainda a um polinucleótido que codifica um domínio de polipéptido da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4 ou um domínio de polipéptido codificado pela sequência de ADNc incluído no clone depositado, que é hibridizável a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3. A invenção refere-se ainda a um polinucleótido que codifica um epítopo de polipéptido da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4 ou um epítopo de polipéptido codificado pela sequência de ADNc incluído no clone depositado, que é hibridizável a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3. A invenção refere-se ainda a um polinucleótido que codifica um polipéptido da SEQ ID N0:2 ou SEQ ID NO:4 ou a sequência de ADNc incluído no clone depositado, que é hibridizável a SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:3, tendo atividade biológica. A invenção refere-se ainda a um polinucleótido que é um variante da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:3. A invenção refere-se ainda a um polinucleótido que é um variante alélico da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO:3.

Além disso, um polinucleótido que codifica um homólogo de espécie da SEQID N0:2 ou SEQID NO: 4 é descrito no presente documento. A invenção refere-se ainda a um polinucleótido que representa a sequência complementar (antisense) da SEQ ID NO :1 ou SEQ ID NO :4. A invenção refere-se ainda a um polinucleótido capaz de hibridizar sob condições restringentes a qualquer urn dos polinucleótidos especificados no presente documento, em que o dito polinucleótido não hibridiza sob condições restringentes a uma molécula de ácido nucleico tendo uma sequência nucleotidica de somente resíduos A ou de somente resíduos T. A invenção refere-se ainda a uma molécula de ácido nucleico isolada da SEQ ID N0:2 ou SEQ ID N0:4, em que o fragmento de polinucleótido compreende uma sequência nucleotidica que codifica um subtilisina protease K proteinase. A invenção refere-se ainda a uma molécula de ácido nucleico isolada da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO: 3, em que o fragmento de polinucleótido compreende uma sequência nucleotidica que codifica a sequência identificada como SEQ ID N0:2 ou SEQ ID NO: 4 ou o polipéptido codificado pela sequência de ADNc incluído no clone depositado, que é hibridizável a SEQ ID N0:1 ou SEQ ID N0:3. A invenção refere-se ainda a uma molécula de ácido nucleico isolada da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO: 3, em que o fragmento de polinucleótido compreende toda a sequência nucleotidica da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO: 3 ou a sequência de ADNc incluída no clone depositado, que é hibridizável a SEQ ID NO:1 ou SEQ ID NO:3. A invenção refere-se ainda a uma molécula de ácido nucleico isolada da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO: 3, em que a sequência nucleotidica compreende deleções nucleotídicas sequenciais desde a terminação C ou a terminação N. A invenção refere-se ainda a um polipéptido isolado que compreende uma sequência de aminoácido que compreende um fragmento de polipéptido da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou a sequência codificada incluído no clone depositado.

Ainda é descrito no presente documento um fragmento de polipéptido da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou a sequência codificada incluído no clone depositado, tendo atividade biológica.

Ainda é descrito no presente documento um domínio de polipéptido da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou a sequência codificada incluído no clone depositado.

Ainda é descrito no presente documento um epítopo de polipéptido da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 ou a sequência codificada incluído no clone depositado. A invenção refere-se ainda a uma proteína de comprimento completo da SEQ ID NO: 2 orSEQ ID NO: 4 ou a sequência codificada incluído no clone depositado.

Além disso, um variante da SEQ ID N0:2 ou SEQ ID N0:4 é descrito no presente documento.

Além disso, um variante alélico da SEQ ID N0:2 ou SEQ ID NO:4 é descrito no presente documento.

Além disso, um homólogo de espécie da SEQ ID N0:2 ou SEQ ID NO:4 é descrito no presente documento.

Além disso, o polipéptido isolado da SEQ ID N0:2 orSEQ ID NO:4 é descrito no presente documento, em que a proteína de comprimento completo compreende deleções de aminoácido sequencial desde a terminação C ou a terminação N. A invenção refere-se ainda a um anticorpo isolado que se liga especificamente ao polipéptido isolado da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4. A invenção refere-se ainda à utilização do polipéptido da SEQ ID N0:2 ou SEQ ID N0:4 ou o polinucleótido da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:3 num método para a prevenção, tratamento ou melhora de uma condição médica, que compreende administrar a um indivíduo mamífero uma quantidade terapeuticamente eficaz do dito polipéptido ou do dito polinucleótido. A invenção refere-se ainda a um método de diagnóstico de uma condição patológica ou uma suscetibilidade a uma condição patológica num indivíduo que compreende as etapas de: (a) determinar a presença ou ausência de uma mutação no polinucleót ido da SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID N0:3; e (b) diagnosticar uma condição patológica ou uma suscetibilidade a uma condição patológica com base na presença ou ausência da dita mutação. A invenção refere-se ainda a um método de diagnóstico de uma condição patológica ou uma suscetibilidade a uma condição patológica num indivíduo que compreende as etapas de: (a) determinar a presença ou quantidade de expressão do polipéptido da SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 numa amostra biológica; e (b) diagnosticar uma condição patológica ou uma suscetibilidade a uma condição patológica com base na presença ou quantidade de expressão do polipéptido.

Além disso, um método para a identificação de um parceiro de ligação ao polipéptido da SEQ ID N0:2 ou SEQ ID NO:4 é descrito no presente documento, o método que compreende as etapas de: (a) por em contato o polipéptido da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4 com um parceiro de ligação; e (b) determinar se o parceiro de ligação efetua uma atividade do polipéptido. A invenção refere-se ainda a um gene que corresponde à sequência de ADNc da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:3.

Além disso, um método de identificar uma atividade num ensaio biológico é descrito no presente documento, em que o método compreende as etapas de: (a) expressar a SEQ NO:1 ou SEQ ID NO: 3 numa célula; (b) isolar o sobrenadante; (c) detetar uma atividade num ensaio biológico; e (d) identificar a proteína em o sobrenadante tendo a atividade.

Além disso, um processo para produzir sequências polinucleotidicas que codificam produtos génicos tendo atividade alterada selecionados a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID N0:4 atividade é descrito no presente documento, o processo que compreende as etapas de: (a) embaralhamento uma sequência nucleotídica da SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NO:3; (b) expressar the resultante shuffled sequência nucleotidicas; e (c) selecting for atividade alterada selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 atividade em comparação com a atividade selecionado a partir do grupo que consiste na SEQ ID N0:2 ou SEQ ID N0:4 atividade do produto génico da dita sequência nucleotídica não modificada.

Além disso, uma sequência polinucleotídica embaralhada produzida por um processo de embaralhamento é descrito no presente documento, em que a dita molécula de ADN embaralhada codifica um produto génico tendo tolerância aprimorada a um inibidor de qualquer uma das atividades selecionadas a partir do grupo que consiste na atividade da SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4. A invenção refere-se ainda ao polipéptido proporcionado como SEQ ID N0:2 ou SEQ ID N0:4, além do seu ácido nucleico codificante, para utilização num método para a prevenção, tratamento ou melhora de uma condição médica, em que a condição médica é um distúrbio reprodutivo. A invenção refere-se ainda ao polipéptido proporcionado como SEQ ID N0:2 ou SEQ ID N0:4, além do seu ácido nucleico codificante, para utilização num método para a prevenção, tratamento ou melhora de uma condição médica, em que a condição médica é um distúrbio relacionado com sinalização e/ou atividade aberrante de PCSK9. A invenção refere-se ainda ao polipéptido proporcionado como SEQ ID N0:2 ou SEQ ID N0:4, além do seu ácido nucleico codificante, para utilização num método para a prevenção, tratamento ou melhora de uma condição médica, em que a condição médica é um distúrbio cardiovascular, hipercolesterolemia, hipercolesterolemia autossómica dominante; distúrbios associados a função de recetor de LDL aberrante; distúrbios associados a apolipoproteina B; distúrbios associados a hipercolesterolemia autossómica recessiva; distúrbios associados a colesterol elevado; distúrbios associados a LDL elevado; distúrbios associados a taxa de depuração reduzida de LDL no fígado; distúrbios associados a produção de apoB de LDL elevado; hipercolesterolemia familiar; distúrbios de metabolismo de lípido; LDL elevado; deposições de colesterol; xantomas nos tendões; ateroma; arteriosclerose prematura, doença cardíaca coronária; apolipoproteína B defeituosa familiar; hipersensibilidade a estatina; disordesr associado a degradação acelerada de LDLR, distúrbios de diferenciação neural. A invenção refere-se ainda ao polipéptido proporcionado como SEQ ID N0:2 ou SEQ ID N0:4, além do seu ácido nucleico codificante, para utilização num método para a prevenção, tratamento ou melhora de uma condição médica, em que a condição médica é um distúrbio metabólico. A invenção refere-se ainda ao polipéptido proporcionado como SEQ ID N0:2 ou SEQ ID N0:4, além do seu ácido nucleico codificante, para utilização num método para a prevenção, tratamento ou melhora de uma condição médica, em que a condição médica é um distúrbio metabólico selecionado a partir do grupo que consiste em: dislipidemia, dislipidemia diabética, dislipidemia mista, hipercolesteremia, hipertrigliceridemia, diabetes melitus do tipo II, diabetes do tipo I, resistência à insulina, hiperlipidemia, obesidade, anorexia nervosa.

Além disso, um método de identificar um composto que modula a atividade biológica de PCSK9b e/ou PCSK9c, que compreende as etapas de: (a) combinar um composto modulador candidato com PCSK9b e/ou PCSK9c tendo a sequência apresentada na SEQ ID N0:2 ou SEQ ID N0:4; e (b) medir um efeito do composto modulador candidato na atividade de PCSK9b e/ou PCSK9c é descrito no presente documento.

Além disso, um método de identificar um composto que modula a atividade biológica de PCSK9b e/ou PCSK9c é descrito no presente documento, o método que compreende as etapas de: (a) combinar um composto modulador candidato com PCSK9b e/ou PCSK9c tendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4; e (b) medir um efeito do composto modulador candidato na atividade de PCSK9b e/ou PCSK9c, em que o dito método opcionalmente inclui a adição de um substrato de PCSK9 adequado antes, durante, ou após a adição do dito composto modulador candidato.

Além disso, um método de identificar um composto antagonista que modula a atividade biológica de PCSK9b e/ou PCSK9c é descrito no presente documento, o método que compreende as etapas de: (a) combinar um composto modulador candidato com PCSK9b e/ou PCSK9c tendo a sequência apresentada na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4 na presença de um substrato de PCSK9 adequado; e (b) identificar composto antagonistas medindo um efeito do composto modulador candidato na atividade de PCSK9b e/ou PCSK9c, em que o dito composto antagonista identificado diminui a atividade de proteinase de PCSK9b e/ou PCSK9c.

Além disso, um método de identificar um agonista composto que modula a atividade biológica de PCSK9b e/ou PCSK9c é descrito no presente documento, o método que compreende as etapas de: (a) combinar um composto modulador candidato com PCSK9b e/ou PCSK9c tendo a sequência apresentada na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4 na presença de um substrato de PCSK9 adequado; e (b) identificar compostos agonistas medindo um efeito do composto modulador candidato na atividade de PCSK9b e/ou PCSK9c, em que o dito composto agonista identificado aumenta a atividade de proteinase de PCSK9b e/ou PCSK9c.

Além disso, um método de identificar um composto que modula a atividade biológica de PCSK9b e/ou PCSK9c é descrito no presente documento, o método que compreende as etapas de: (a) combinar um composto modulador candidato com uma célula hospedeira expressar PCSK9b e/ou PCSK9c tendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4; e (b) medir um efeito do composto modulador candidato na atividade do PCSK9b e/ou PCSK9c expresso.

Além disso, um método de identificar um composto antagonista que modula a atividade biológica de PCSK9 de tipo selvagem é descrito no presente documento, o método que compreende as etapas de: (a) combinar um composto modulador candidato com PCSK9b e/ou PCSK9c tendo a sequência apresentada na SEQ ID N0:2 ou SEQ ID N0:4 na presença de um substrato de PCSK9 adequado; e (b) identificar composto antagonistas medindo um efeito do composto modulador candidato na atividade de PCSK9, em que o dito composto antagonista identificado diminui a atividade de proteinase de PCSK9.

Além disso, um método de identificar um agonista composto que modula a atividade biológica de PCSK9 é descrito no presente documento, o método que compreende as etapas de: (a) combinar um composto modulador candidato com PCSK9b e/ou PCSK9c tendo a sequência apresentada na SEQ ID NO: 2 ou SEQ ID NO: 4 na presença de um substrato de PCSK9 adequado; e (b) identificar compostos agonistas medindo um efeito do composto modulador candidato na atividade de PCSK9, em que o dito composto agonista identificado aumenta a atividade de proteinase de PCSK9.

Além disso, um método de identificar um composto que modula a atividade biológica de PCSK9 é descrito no presente documento, o método que compreende as etapas de: (a) combinar um composto modulador candidato com uma célula hospedeira expressar PCSK9b e/ou PCSK9c tendo a sequência como apresentada na SEQ ID NO:2 ou SEQ ID NO:4; e (b) medir um efeito do composto modulador candidato na atividade do PCSK9b e/ou PCSK9c expresso.

Além disso, um método de rastreio para um composto é que capaz de modular a atividade biológica de PCSK9b e/ou PCSK9c é descrito no presente documento, o método que compreende as etapas de: (a) fornecer uma célula hospedeira descrito no presente documento; (b) determinar a atividade biológica de PCSK9b e/ou PCSK9c na ausência de um composto modulador; (c) por em contato a célula com o composto modulador; e (d) determinar a atividade biológica de PCSK9b e/ou PCSK9c na presença do composto modulador; em que uma diferença entre a atividade de PCSK9b e/ou PCSK9c na presença do composto modulador e na ausência do composto modulador indica um efeito de modulação do composto.

Além disso, um método de rastreio para um composto é que capaz de modular a atividade biológica de PCSK9 é descrito no presente documento, o método que compreende as etapas de: (a) fornecer uma célula hospedeira que compreende PCSK9b e/ou PCSK9c; (b) determinar a atividade biológica de PCSK9 na ausência de um composto modulador; (c) por em contato a célula com o composto modulador; e (d) determinar a atividade biológica de PCSK9 na presença do composto modulador; em que uma diferença entre a atividade de PCSK9 na presença do composto modulador e na ausência do composto modulador indica um efeito de modulação do composto.

Além disso, uma truncagem de N-terminal de PCSK9 (SEQ ID NO: 5) é descrito no presente documento, em que a dita truncagem de N-terminal resulta na deleção de qualquer lugar entre cerca de 1 e cerca de 218 aminoácidos a partir da terminação N da SEQ ID NO: 5, e em que a dita truncagem de N-terminal resulta em atividade biológica de PCSK9 elevada, incluindo, mas não limitado a níveis de proteína LDLR diminuída, e/ou captação de LDL diminuída por LDLR.

Além disso, uma truncagem de N-terminal de PCSK9 (SEQ ID NO: 5) é descrito no presente documento, em que a dita truncagem de N-terminal resulta na deleção de qualquer lugar entre cerca de 1 e cerca de 218 aminoácidos a partir da terminação N da SEQ ID NO:5, incluindo, mas não limitado a níveis de proteína LDLR diminuída, e/ou captação de LDL diminuída por LDLR, e em que a dita atividade biológica de PCSK9 elevada é pelo menos cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 100 %, ou mais de atividade biológica de PCSK9 elevada de tipo selvagem. Neste contexto, o termo "cerca de" deve ser interpretado como significando qualquer lugar entre 1,2,3, 4, ou 5 por cento mais ou inferior à quantidade citada. Alternativamente, a dita atividade biológica de PCSK9 elevada pode ser pelo menos cerca de lx, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, ou lOx mais que atividade biológica de PCSK9 de tipo selvagem. Neste contexto, o termo "cerca de" deve ser interpretado como significando qualquer lugar entre 0,lx, 0,2x, 0,3x, 0,4x, 0,5x, 0,6x, 0,7x, 0,8x, ou 0,9x mais ou inferior à quantidade citada.

Conforme é utilizado no presente documento os termos "modular" ou "modula" referem-se a um aumento ou diminuição na quantidade, qualidade ou efeito de um particular atividade, ADN, ARN, ou proteína de PCSK9b e/ou PCSK9c. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS/DESENHOS O arquivo desta patente contém pelo menos uma figura executada a cores. As cópias desta patente com Figura(s) colorida(s) será proporcionado pelo Escritório Marcas e Patentes através de solicitação pagamento da taxa necessária.

As figuras 1A-C mostram a sequência polinucleotídica (SEQ ID NO:I) e sequência deduzida de aminoácido (SEQ ID NO:2) dos novos variantes de PCSK9, PCSK9b da presente invenção. A abreviatura de uma letra padrão para aminoácidos é usada para ilustrar a sequência deduzida de aminoácido. A sequência polinucleotídica contém uma sequência de 3175 nucleótidos (SEQ ID NO: 1), que codifica um polipéptido de 315 aminoácidos (SEQ ID NO:2). Uma análise do polipéptido de PCSK9b determinou que compreendia as seguintes características: um domínio catalítico localizado desde cerca do aminoácido 10 até cerca de aminoácido 256 da SEQ ID NO:2 denotado em itálico, com a tríade catalítica canónica residindo nos aminoácidos D17, H57, e S217 da SEQ ID N0:2 denotado por sublinhado duplo; e seis resíduos de cisteína conservados localizados nos aminoácidos C54, C86, C132, C154, C189, e C206 da SEQ ID N0:2 denotado em negrito, com ligações dissulfureto preditas para formar entre os seguintes pares de cisteína: C54 e C86, e C154 e C189; e um domínio predito de ligação de ião Ca2+ predito para formar entre os resíduos D191, P162, e V164 da SEQ ID N0:2, denotado por um asterisco (*) abaixo do resíduo de aminoácido.

As figuras 2A-D mostram a sequência polinucleotídica (SEQ ID NO:3) e sequência deduzida de aminoácido (SEQ ID NO: 4) dos novos variante PCSK9, PCSK9c da presente invenção. A abreviatura de uma letra padrão para aminoácidos é usada para ilustrar a sequência deduzida de aminoácido. A sequência polinucleotídica contém uma sequência de 3756 nucleótidos (SEQ ID N0:3), que codifica um polipéptido de 523 aminoácidos (SEQ ID NO:4). Uma análise do polipéptido de PCSK9b determinou que compreendia as seguintes características: um domínio catalítico localizado desde cerca do aminoácido 10 até cerca de aminoácido 256 da SEQ ID NO: 4 denotado em itálico, com a tríade catalítica canónica residindo nos aminoácidos D17, H57, e S217 da SEQ ID NO:4 denotado por sublinhado duplo; e seis resíduos de cisteína conservados localizados nos aminoácidos C54, C86, C132, C154, C189, e C206 da SEQ ID NO: 4 denotado em negrito, com ligações dissulfureto preditas para formar entre os seguintes pares de cisteína: C54 e C86, e C154 e C189; e um domínio predito de ligação de ião Ca2+ predito para formas entre os resíduos D191, P162, e V164 da SEQ ID NO:4, denotado por um asterisco (*) abaixo do resíduo de aminoácido.

As Figuras 3A-C mostram as regiões de identidade e similaridade entre as sequências dos polipéptidos codificados PCSK9b e PCSK9c da presente invenção com a sequência da proteína PCSK9 humana de tipo selvagem (PCSK9; Acesso GENBANK® n°: gi|NM_174936; SEQ ID N0:5); bem como a sequência de um variante conhecido do polipéptido de PCSK9 de tipo selvagem (variante PCSK9; Acesso GENBANK® n°: gi|AK124635; SEQ ID NO:6). 0 alinhamento foi realizado utilizando o algoritmo CLUSTALW utilizando parâmetros padrão como descrito no presente documento (VECTOR NTI® suite de programas). Os aminoácidos sombreados de escuro representam regiões de identidade coincidente. Os aminoácidos sombreados de claro representam regiões de similaridade de coincidência. Pontos ("·") entre os resíduos indicam regiões com lacuna de não identidade para os polipéptidos alinhados. A localização dos aminoácidos de tríade catalítica conservados são denotados por um asterisco (*). A Figura 4 mostra um quadro ilustrando a percentagem de identidade e percentagem de similaridade entre os polipéptidos de PCSK9b e PCSK9c da presente invenção com PCSK9 e seu variante. Como mostrado, o domínio catalítico de tanto PCSK9b como PCSK9c compartem 100 % de identidade com o domínio catalítico de PCSK9. Os valores de percentagem de identidade e percentagem de similaridade foram determinados utilizando o algoritmo CLUSTALW utilizando parâmetros padrão como descrito no presente documento (VECTOR NTI® suite de programas). A Figura 5 fornece um diagrama esquemático dos variantes de PCSK9b e PCSK9c em comparação com o PCSK9 de tipo selvagem. Como mostrado, tanto os variantes PCSK9b como PCSK9c começam do intrão original 3. PCSK9b tem um novo local de splicing no exão 9 que causes um deslocamento e truncagem precoce do domínio C-terminal como uma consequência de um codão de terminação em grelha. A Figura 6 mostra um perfil de expressão dos polipéptidos de PCSK9b e PCSK9c humanos. A figura ilustra o nível de expressão relativo de PCSK9b e PCSK9c entre várias fontes de tecido de ARNm. A identidade de cada tecido é proporcionada no Quadro IV no Exemplo 3. Como mostrado, os polipéptidos de PCSK9b e PCSK9c foram expressos predominantemente no cerebelo do cérebro e fígado, em níveis de aproximadamente 3500 vezes superior ao tecido menos expresso. Expressão significativa foi observada no pulmão, em vasos sanguíneos pulmonares, e tecidos do Trato gastrointestinal. Os dados de expressão foram obtidos medindo os níveis de ARNm de PCSK9b e PCSK9c em estado estacionário por meio de PCR quantitativa utilizando the par de iniciadores de PCR proporcionado como SEQ ID NO:10 e 11, e sonda TAQMAN® (SEQ ID NO: 12) como descrito no Exemplo 3 no presente documento. A Figura 7 mostra o resultado de sobre-expressão de variantes de PCSK9b e PCSK9c em células HER e CHO. O painel "A" mostra o nível observado de expressão de PCSK9, enquanto o Painel "B" mostra o nível observado de expressão de LDLR, após células HEK terem sido transfetadas transitoriamente com PCSK9 de tipo selvagem (WT), PCSK9 mutante D374Y, e plasmídeos de PCSK9b e PCSK9c. Os plasmídeos de variante PCSK9b são representados como "#3114", "#3115", enquanto os plasmídeos de variante PCSK9c são representados como "#3116" e "#3117"). Os dados de expressão foram obtidos medindo os níveis de ARNm de PCSK9b e PCSK9c de estado estacionário por meio de PCR quantitativa como descrito no Exemplo 4 no presente documento. A Figura 8 mostra o resultado de análise de western blot de tanto lisados celulares como meios condicionados de células HEK e CHO transfectadas transitoriamente com variantes PCSK9b e PCSK9c utilizando anticorpo específico de PCSK9. O painel "A" mostra o Western blot de PCSK9 em lisados celulares de células HEK transfectadas com PCSK9 utilizando anticorpo contra PCSK9, enquanto o Painel "B" mostra i Western blot de PCSK9 de meios condicionados de células CHO transfectadas transitoriamente com variantes de PCSK9. Plasmídeos de variante de PCSK9b são representados como "#3114", "#3115", enquanto os plasmídeos de variante de PCSK9c são representados como "#3116" e "#3117"). PCSK9 de tipo selvagem é representado como "WT", enquanto o PCSK9 mutantw D374Y é representado como "D374Y". Como mostrado, ambas as proteínas variantes PCSK9b e PCSK9c foram secretadas pelas células transfectadas como evidenciado por sua deteção em meios condicionados apesar dos variantes que não possuem um péptido de sinal. Western blots foram realizados de acordo com o método descrito em Exemplo 4 no presente documento. A Figura 9 mostra o resultado de projetado para avaliar se o variante PCSK9b e PCSK9c são capazes de diminuir a ligação de LDL ao LDLR. 0 painel A mostra o resultado da captação de Dil de LDL em células HepG2 transfectadas com PCSK9b e PCSK9c, enquanto o Painel B mostra o resultado de Western blot em lisados celulares de células CHO transfectadas com PCSK9b ou PCSK9c. Tanto anticorpos contra PCSK9 como LDLR foram usados para os Western Blots. Plasmídeos de variante de PCSK9b são representados como "3114", "3115"; os plasmídeos de variante de PCSK9c são representados como "3116" e "3117"); PCSK9 de tipo selvagem é representado como "WT"; o PCSK9 mutante D374Y é representado como "D3"; vetor somente é representado como "vec", e células incubada em meio contendo 10 % de FBS é representado como "FBS", enquanto células encubadas em 5 % lipoproteína deficiente serum crescimento meio é representado como "LPDS". Como mostrado em painel "A", transfeção transitória de células HepG2 com tanto proteínas de variante PCSK9b como PCSK9c resultou num nível diminuído de captação de Dil de LDL que superou o nível observado para PCSK9 de tipo selvagem. Como mostrado no painel "B", a transfeção transitória de células CHO com o PCSK9c variante resultou em nível de proteína de LDLR diminuído, enquanto transfeção transitória de variante b não pareceu afetar o nível de proteína LDLR sob estas condições. A etiqueta de anticorpo anti-PCSK9 é mostrada em verde, enquanto etiqueta de anticorpo anti-LDLR é mostrada em vermelho. Os ensaios de captação de Dil de LDL e Western blots foram realizados de acordo com os métodos descritos no Exemplo 4 no presente documento.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção pode ser compreendida mais facilmente por referência à seguinte descrição detalhada de as formas de realização preferidas da invenção e the Exemplos incluído no presente documento. A invenção fornece novas sequências humanas que codificam variantes de PCSK9 das mesmas, PCSK9b e PCSK9c, além de formas truncadas N-terminais de PCSK9. PCSK9 têm sido implicadas na incidência de uma variedade de doenças e/ou distúrbios, incluindo hipercolesterolemia, seus distúrbios cardiovasculares relacionados, além de outros distúrbios conhecido na técnica ou descritos no presente documento.

Na presente invenção, "isolado" refere-se a material removido do seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se for de ocorrência natural), e assim é alterado "pela mão do homem" do seu estado natural. Por exemplo, um polinucleótido isolado pode ser parte de um vetor ou de uma composição de matéria, ou pode ser contido dentro de uma célula, e ainda ser "isolado" porque esse vetor, composição de matéria, ou célula particular não é o ambiente original do polinucleótido. 0 termo "isolado" não se refere a bibliotecas de ADN genómico ou de ADNc, célula inteira total ou preparações de ARNm, preparações de ADN genómico (incluindo aqueles separados por meio de eletroforese e transferidas para blots), preparações de ADN genómico de células inteiras tosquiadas ou outras composições onde a técnica demonstra nenhuma característica distintiva do polinucleótido /sequências da presente invenção.

Em formas de realização especificas, os polinucleótidos da invenção são cerca de pelo menos 15, pelo menos 30, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 125, pelo menos 500, pelo menos 837, pelo menos 903, pelo menos 1000, ou pelo menos 1554 nucleótidos contínuos, mas são inferior ou igual a 300 kb, 200 kb, 100 kb, 50 kb, 15 kb, 10 kb, 7,5 kb, 5 kb, 2,5 kb, 2,0 kb, ou 1 kb, em comprimento. Neste contexto, cerca de significa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 nucleótidos mais longo ou mais curto na extremidade 5' ou 3', ou ambas. Numa forma de realização adicional, os polinucleótidos da invenção compreendem uma porção das sequências codificantes, como revelado no presente documento, mas não compreendem a totalidade ou uma porção de qualquer intrão. Em outra forma de realização, os polinucleótidos que compreendem sequências codificantes não contêm sequências codificantes de um gene flanqueante genómico (isto é, 5' ou 3' ao gene de interesse no genoma). Em outras formas de realização, os polinucleótidos da invenção não contêm a sequência codificante de mais de 1000, 500, 250, 100, 50, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2, ou 1 gene(s) franqueante(s) genómico(s).

Conforme é utilizado no presente documento, um "polinucleótido" refere-se a uma molécula tendo uma sequência ácido nucleico contida na SEQ ID NO: 1 ou SEQ ID NO: 3, ou o ADNc contido no clone depositado com o ATCC®. Por exemplo, o polinucleótido pode conter a sequência nucleotídica da sequência de comprimento completo de ADNc, incluindo as sequências não traduzidas 5' e 3' , a região codificante, com ou sem uma sequência sinal, a região codificante de proteína secretada, bem como fragmentos, epítopos, domínios, e variantes da sequência de ácido nucleico. Além disso, conforme é utilizado no presente documento, um "polipéptido" refere-se a uma molécula tendo a sequência de aminoácido traduzida gerada a partir do polinucleótido como amplamente definido.

Na presente invenção, a sequência de comprimento completo identificada como SEQ ID N0:1 ou SEQ ID NOP:3 foi gerada por sequências sobrepostas contidas em um ou mais clones (análise contig). Clones representativos contendo a totalidade da sequência para SEQ ID N0:1 e SEQ ID NO:3 foi depositado com a Coleção Americana de Culturas Celulares (American Type Culture Collection) ("ATCC®"). Como mostrado no Quadro 1, cada clone é identificado por um ID de Clone de ADNc (Identificador) e o Número de depósito ATCC®. A ATCC® está localizada em 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, EUA. O depósito ATCC® foi feito em conformidade com os termos do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento interNaClonal do depósito de microrganismos para fins de procedimento de patente. O clone depositado para PCSK9b é inserido no vetor pSport2 (Invitrogen). O clone depositado para PCSK9c é inserido no vetor pSportl (Invitrogen). A menos que seja indicado de outro modo, todas as sequências nucleotidicas determinadas pelo sequenciamento de uma molécula de ADN no presente documento foram determinou utilizando um sequenciador ADN automático (tal como o Modelo 373, preferentemente um Modelo 3700, de Applied Biosystems, Inc.), e todas as sequências de aminoácidos de polipéptidos codificados por moléculas de ADN determinadas no presente documento foram preditas por tradução de uma sequência de ADN determinada acima. Portanto, como é conhecido na técnica para qualquer sequência de ADN determinada por esta abordagem automatizada, qualquer sequência nucleotidica determinada no presente documento pode conter some erros. Sequências nucleotidicas determinadas por automação são tipicamente pelo menos cerca de 90 % idênticas, mais tipicamente de pelo menos cerca de 95 % a pelo menos cerca de 99, 9 % idênticas à sequência nucleotídica real da molécula de ADN sequenciada. A sequência real pode ser mais precisamente determinada por outras abordagens incluindo métodos de sequenciamento de ADN manual bem conhecidos na técnica. Como é também conhecido na técnica, uma única inserção ou deleção numa sequência nucleotídica determinada em comparação com a sequência real causará um deslocamento na tradução da sequência nucleotídica tal que a sequência de aminoácido predita codificada por uma sequência nucleotídica determinada será completamente diferente da sequência de aminoácido realmente codificada pela molécula de ADN sequenciada, começando no ponto de tal uma inserção ou deleção.

Utilizando a informação proporcionada no presente documento, tal como a sequência nucleotídica nas Figuras 1A-C (SEQ ID N0:1), uma molécula de ácido nucleico da presente invenção que codifica o polipéptido de PCSK9b pode ser obtido utilizando procedimentos de clonagem e rastreio padrão, tal como aqueles para ADNc de clonagem utilizando ARNm como material de partida.

Utilizando a informação proporcionada no presente documento, tal como a sequência nucleotídica nas Figuras 2A-D (SEQ ID NO :3), uma molécula de ácido nucleico da presente invenção que codifica o polipéptido de PCSK9c pode ser obtido utilizando procedimentos de clonagem e rastreio padrão, tal como aqueles para ADNc de clonagem utilizando ARNm como material de partida.

Um "polinucleótido" da presente invenção também inclui aqueles polinucleótidos capazes de hibridizar, sob condições de hibridização restringentes, a sequências contidas na SEQ ID NO: 1, i complemento das mesmas, ou o ADNc dentro do clone depositado com a ATCC®. "Condições de hibridização restringentes" refere-se a uma incubação durante a noite a 42 graus C numa solução que compreende 50 % de formamida, 5x SSC (750 mM de NaCl, 75 mM de citrato de trissódio), 50 mM de fosfato de sódio (pH 7,6), 5x solução de Denhardt, 10 % de sulfato de dextrano, e 20 pg/ml de ADN de esperma de salmão cizalhado, desnaturado, seguido por lavagem dos filtros em 0,1 x SSC at cerca de 65 graus C.

Também são contempladas moléculas de ácido nucleico que hibridizam aos polinucleótidos da presente invenção em condições de hibridização de menor restringência. Mudanças na restringência de hibridização e deteção de sinal são principalmente conseguidas através da manipulação de concentração de formamida (menores percentagens de formamida resultam em restringência diminuída); condições de sal, ou temperatura. Por exemplo, condições de menor restringência incluem uma incubação durante a noite a 37 graus C numa solução que compreende 6X SSPE (20X SSPE = 3 M de NaCl; 0,2 M de NaH2P04; 0,02 M de EDTA, pH 7,4), 0,5 % de SDS, 30 % de formamida, 100 ug/ml ADN de bloqueio de esperma de salmão; seguido por lavagens a 50 graus C com IX SSPE, 0,1 % de SDS. Além disso, para conseguir restringência ainda menor, lavagens realizado seguindo hibridização restringente pode ser feita a maiores concentrações de sal (por exemplo, 5X SSC).

Observe-se que variações nas condições acima podem ser conseguidas através da inclusão e/ou substituição de reagentes de bloqueio alternados usados para suprimir fundo em experiências de hibridização. Os reagentes de bloqueio típicos incluem reagente de Denhardt, BLOTTO, heparina, ADN de esperma de salmão desnaturado, e formulações patenteadas comercialmente disponíveis. A inclusão de reagentes de bloqueio específicos pode requerer modificação das condições de hibridização descritas acima, devido a problemas com compatibilidade.

Obviamente, um polinucleótido que hibridiza somente a sequências poliA+ (tal como qualquer trato poliA+ 3' terminal de um ADNc mostrado na sequência listing), ou a um estiramento complementar de resíduos T (ou LI), não seria incluído na definição de "polinucleótido" uma vez que tal um polinucleótido hibridizaria a qualquer molécula de ácido nucleico contendo um estiramento poli (a) ou o complemento dos mesmos (por exemplo, praticamente qualquer clone de cadeia dupla de ADNc gerado utilizando oligo dT como um iniciador). 0 polinucleótido da presente invenção pode ser composto de qualquer poliribonucleótido ou polideoxribonucleótido, que pode ser ARN ou ADN não modificado ou ARN ou ADN modificado. Por exemplo, polinucleótidos podem ser compostos de ADN de cadeia simples ou dupla, ADN é que uma mistura de regiões de cadeia simples ou dupla, ARN de cadeia simples e dupla, e ARN é que mistura de regiões de cadeia simples ou dupla, qmoléculas híbridas que compreendem ADN e ARN que pode ser de cadeia simples ou, mais tipicamente, de cadeia dupla ou uma mistura de regiões de cadeia simples ou dupla. Além disso, o polinucleótido pode ser composto de regiões de cadeia tripla que compreendem ARN ou ADN ou tanto ARN como ADN. Um polinucleótido pode também conter uma ou mais bases modificadas ou estruturas de ADN ou ARN modificadas para estabilidade ou por outras razões. Bases "modificadas" incluem, por exemplo, bases tritiladas e bases incomuns tais como inosina. Uma variedade de modificações pode ser feita ao ADN e ARN; assim, "polinucleótido" abrange formas quimicamente, enzimaticamente, ou metabolicamente modificadas. 0 polipéptido da presente invenção pode ser composto de aminoácidos unidos entre si por meio de ligações peptídicas ou ligações peptídicas modificadas, isto é, isósteres de péptido, e pode conter aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos codificados pelo gene. Os polipéptidos podem ser modificados por meio de processos naturais, tais como processamento pós-traducional, ou por meio de técnicas de modificação química que são bem conhecidas na técnica.

Tais modificações são bem descritas em textos básicos e em mais monografias mais detalhadas, bem como numa literatura de investigação voluminosa. Modificações podem ocorrer em qualquer lugar num polipéptido, incluindo a estrutura peptidica, as cadeias laterais do aminoácido e as terminações amino ou carboxilo. Será apreciado que o mesmo tipo de modificação pode estar presente em graus iguais ou variáveis em diversos locais num dado polipéptido. Também, um dado polipéptido pode conter muitos tipos de modificações. Os polipéptidos podem ser ramificados, por exemplo, como um resultado de ubiquitinação, e podem ser cíclicos, com ou sem ramificação. Os polipéptidos cíclicos, ramificados, e ramificados cíclicos podem resultar dos processos naturais de pós-tradução ou podem ser produzidos por meio de métodos sintéticos. As modificações incluem acetilação, acilação, ADP-ribosilação, amidação, união covalente de flavina, união covalente de uma fração heme, união covalente de um nucleótido ou derivado de nucleótido, união covalente de um lípido ou derivado de lípido, união covalente de fosfotidilinositol, reticulação, ciclização, formação de ligação dissulfurreto, demetilação, formação de reticulações covalentes, formação de cisteína, formação de piroglutamato, formilação, gama-carboxilação, glicosilação, formação de âncora de GPI, hidroxilação, iodação, metilação, miristoilação, oxidação, pegilação, processamento proteolítico, fosforilação, prenilação, racemização, selenoilação, sulfatação, adição mediada por ARN de transferência de aminoácidos a proteínas tais como arginilação, e ubiquitinação. (Veja-se, por exemplo, Proteins - Structure and Molecular Properties, 2a Ed., T. Ε. Creighton, W. Η. Freeman e Company, Nova Iorque (1993); Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academic Press, Nova Iorque, pgs. 1-12 (1983); Seifter et al., Met Enzymol 182:626-646 (1990); Rattan et al., Ann NYAcad Sci 663:48-62 (1992) .) "SEQ ID NO:X" refere-se a uma sequência polinucleotídica enquanto "SEQ ID NO:Y" refere-se a uma sequência polipeptidica, ambas as sequências são identificadas por um número inteiro especificado no Quadro I. "Um polipéptido tendo atividade biológica" refere-se a polipéptidos exibindo atividade similar, mas não necessariamente idêntica a, uma atividade de um polipéptido da presente invenção, incluindo formas maduras, como medido num ensaio biológico particular, com ou sem dependência de dose. Em the case onde dependência de dose does exist, it necessidade não ser identical to that do polipéptido, mas rather substancialmente similar to the dependência de dose numa dada atividade em comparação com o polipéptido da presente invenção (isto é, o polipéptido candidato exibirá atividade superior ou não mais de cerca de 25 vezes menos e, preferentemente, não mais de cerca de dez vezes menos atividade, e o mais preferentemente, não mais de cerca de três vezes menos atividade com relação ao polipéptido da presente invenção.) 0 termo "organismo" como referido no presente documento quer dizer que abrange qualquer organismo referenciado no presente documento, embora preferentemente a organismos eucarióticos, mais preferentemente a mamíferos, e o mais preferentemente a seres humanos. A presente invenção abrange a identificação de proteínas, ácidos nucleicos, ou outras moléculas, que se ligam a polipéptidos e polinucleótidos da presente invenção (por exemplo, num interação recetor-ligando). Os polinucleótidos da presente invenção podem também ser usados em ensaios de captura de interação (tal como, por exemplo, que foi descrito por Ozenbergerand Young (Mol Endocrinol., 9(10):1321-9, (1995); e Ann. N. Y. Acad. Sci., 7;766:279-81, (1995)). O polinucleótido e polipéptidos da presente invenção são úteis como sondas para a identificação e isolamento de ADNc de comprimento completo e/ou ADN genómico que correspondem aos polinucleótidos da presente invenção, como sondas para hibridizar e descobrir novas, sequências de ADN relacionadas, como sondas para a clonagem posicionai desta ou uma sequência relacionada, como sonda para "subtrair" sequências conhecidas no processo de descoberta de outros novos polinucleótidos, como sondas para quantificar a expressão génica, e como sondas para microarranjos.

Além dissp, polinucleótidos e polipéptidos da presente invenção podem compreender um, dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, ou mais domínios de membrana.

Também, métodos para refinar adicionalmente a função biológica dos polinucleótidos e/ou polipéptidos da presente invenção são descritos no presente documento.

Especificamente, os polinucleótidos e polipéptidos da invenção podem ser usados para identificar ortólogos, homólogos, parálogos, variantes, e/ou variantes alélicos da invenção. Também são descritos no presente documento métodos de utilizar os polinucleótidos e polipéptidos da invenção para identificar a totalidade de região codificante da invenção, regiões não codificantes da invenção, sequências reguladoras da invenção, e formas secretadas, maduras, pro-, repro- da invenção (conforme for aplicável) .

Também são descritos no presente documento métodos para a identificação dos locais de glicosilação s no polinucleótidos e polipéptidos da invenção, e a subsequente alteração, deleção, e/ou adição dos ditos locais para um número de características desejáveis que incluem, mas não são limitadas a, aumento de dobramento de proteína, inibição de agregação de proteína, regulação de tráfego intracelular a organelos, aumento de resistência a proteólise, modulação de antigenicidade de proteína, e mediação de adesão intercelular.

Além disso, métodos são descritos no presente documento para evoluir os polinucleótidos e polipéptidos da presente invenção utilizando técnicas de evolução molecular num esforço de criar e identificar novos variantes com características estruturais, funcionais, e/ou físicas desejadas.

Ainda outros métodos experimentais e procedimentos atualmente disponíveis para derivar designações funcionais são descritos no presente documento. Estes procedimentos incluem, mas não são limitados a localização de clones em arranjos, micro-arranjo tecnologia, métodos baseados em PCR (por exemplo, PCR quantitativa), metodologia anti-sense, experiências de knockout de gene, e outros procedimentos que poderiam usar informação de sequência a partir de clones para construir um iniciador ou um parceiro híbrido. Polinucleótidos e Polipéptidos da invenção

Caracteristicas do polipéptido Codificado pelo Polinucleótido No:l 0 polipéptido deste polinucleótido proporcionado como SEQ ID N0:2 (Figuras 1A-C), codificado pela sequência polinucleotídica de acordo com a SEQ ID N0:1 (Figuras 1A-C) , e/ou codificado pelo polinucleótido contido no clone depositado, PCSK9b (também referido como PCSK9-b), é um variante do polipéptido de PCSK9 humano (PCSK9; Acesso GENBANK® n°: gi|NM_174936; SEQ ID N0:5). Um alinhamento do polipéptido de PCSK9b com PCSK9 em adição a um variante PCSK9 conhecido (PCSK9 variante; Acesso GENBANK® n°: gi|AK124635; SEQ ID NO:6) é proporcionado nas Figuras 3A-C. A percentagem de identidade e valores de similaridade entre o polipéptido de PCSK9b a estes polipéptidos é proporcionado na Figura 4. A sequência nucleotídica determinada do ADNc de PCSK9b nas Figuras 1A-C (SEQ ID NO:I) contém uma grelha de leitura aberta que codifica uma proteína de cerca de 315 resíduos de aminoácidos, com uma massa molecular deduzida de cerca de 33,2 kDa. A sequência de aminoácido do polipéptido de PCSK9b predito é mostrada nas Figuras 1A-C (SEQ ID NO:2). 0 polipéptido de PCSK9b foi predito que compreende um domínio catalítico localizado desde cerca do aminoácido 10 até cerca de aminoácido 256 da SEQ ID NO:2, com a tríade catalítica canónica residindo nos aminoácidos D17, H57, e S217 da SEQ ID NO:2; e seis resíduos de cisteína conservados localizados nos aminoácidos C54, C86, C132, C154, C189, e C206 da SEQ ID NO:2, com ligações dissulfureto preditas para formar entre os seguintes pares de cisteína: C54 e C86, e C154 e C189; e um domínio predito de ligação de Ca2+ de ião predito para formar entre os resíduos D191, P162, e V164 da SEQ ID NO:2. Neste contexto, o termo "cerca de" pode ser interpretado que significa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 aminoácidos além dos limites N-terminal e/ou C-terminal das localizações de aminoácido referenciadas acima.

Uma vez que o polipéptido de PCSK9b retém a tríade catalítica do polipéptido de PCSK9 de tipo selvagem, para além das suas cisteinas conservadas, é esperado que o polipéptido de PCSK9b retenha pelo menos alguma atividade biológica de PCSK9, incluindo, mas não limitado a atividade de proteinase, atividade convertase, atividade de subtilisina-kexina isozima-l/local I protease, atividade autocatalítica de clivagem do PCSK9, PCSK9b, PCSK9c, ou outras variantes de PCSK9 entre aminoácidos que correspondem a aminoácidos Gin-151 e Ser-152; atividade reguladora de expressão génica dependente de esterol (Maxwell et al.r J Lipide Res. 2003; 44: 2109-2119), atividade reguladora de expressão génica dependente de insulina (Shimomura et al., Proc Natl Acad Sei LI SA. 1999; 96:13656-13661), atividade reguladora de expressão génica dependente de fator de transcrição de LXR (Repa et al., Genes Dev. 2000; 14:2819-2830); atividade reguladora de proteína de recetor de LDL (Maxwell et al., Proc Natl Acad

Sci USA. 2004; 101: 7100-7105); atividade de regulação positiva dependente de estatina (Dubuc et al., ArteriosclerThromb Vase Biol. 2004; 24: 1454-1459) .

Em confirmação de PCSK9b reter a atividade biológica de PCSK9, ensaios de captação de Dil de LDL foram realizados e PCSK9b foi mostrado que tem atividade de PCSK9. Surpreendentemente, encontrou-se que PCSK9b tem maior atividade que PCSK9 de tipo selvagem. O ensaio de captação de Dil de LDL é um ensaio funcional padronizado para o recetor de LDLR, e atividade de PCSK9 de tipo selvagem age para reduzir a atividade de LDLR. Portanto captação de Dil de LDL por células pode ser usada como um ensaio funcional substituto para medir a atividade de PCSK9. A expressão transitória de PCSK9b agiu para diminuir a captação de Dil-LDL em células HepG2, em comparação com controlo de vetor, indicando que PCSK9b é competente para expressar atividade de funcional PCSK9 em LDLR (Fig 9) . Neste ensaio, PCSK9b mostrou maior atividade que PCSK9 de tipo selvagem, embora não tao alto como PCSK9c.

Consequentemente, PCSK9b retêm a capacidade de PCSK9 de tipo selvagem para modular a atividade funcional em LDLR. PCSK9b foi mostrado que tem cerca de 25 % mais função que PCSK9 de tipo selvagem como demonstrado no ensaio de captação de LDL (veja-se Figura 9A) . Consequentemente, a invenção refere-se ainda a uma truncagem de N-terminal de PCSK9, tal como PCSK9c, por exemplo, (SEQ ID NO:2), em que a dita a truncagem de N-terminal resulta numa elevação de atividade biológica de PCSK9, incluindo, mas não limitado a níveis de proteína LDLR diminuída e/ou captação de LDL diminuída por LDLR, e em que a dita atividade biológica de PCSK9 elevada é pelo menos cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 100 %, ou mais que a atividade biológica de PCSK9 elevada de tipo selvagem. Neste contexto, o termo "cerca de" deve ser interpretado como significando qualquer lugar entre 1, 2, 3, 4, ou 5 por cento mais ou inferior à quantidade citada. Alternativamente, a dita atividade biológica de PCSK9 elevada pode ser pelo menos cerca de lx, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, ou lOx mais que a atividade biológica de PCSK9 de tipo selvagem. Neste contexto, o termo "cerca de" deve ser interpretado como significando qualquer lugar entre 0,lx, 0,2x, 0,3x, 0,4x, 0,5x, 0,6x, 0,7x, 0,8x, ou 0,9x mais ou inferior à quantidade citada.

Um polinucleótido que compreende um polipéptido que codifica pelo menos cerca de 279 aminoácidos contíguos da SEQ ID N0:2 é descrito no presente documento. Além disso, um polinucleótido que compreende pelo menos cerca de 837 nucleótidos contíguos da SEQ ID N0:1 é descrito no presente documento. Neste contexto, o termo "cerca de" deve ser interpretado como que significa 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 mais ou menos aminoácidos na terminação N ou C, ou ambos, ou 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 nucleótidos na extremidade 5 primo ou 3 primo, ou ambas. Preferentemente, os polipéptidos e/ou polipéptidos codificados pelos ditos polinucleótidos retêm atividade biológica.

Um polinucleótido que não possui o codão de partida de iniciação, além de, a metinona do polipéptido codificado resultante de PCSK9b, é descrito no presente documento. Especificamente, o polinucleótido corresponde a nucleótidos 253 a 1194 da SEQ ID NO:l, e o polipéptido corresponde a aminoácidos 2 a 315 da SEQ ID NO:2. Também são descritos vetores recombinantes que compreendem a dita sequência codificante, e células hospedeiras que compreendem o dito vetor.

Como descrito no presente documento, mutações misense do PCSK9 de tipo selvagem nas localizações de aminoácido S127R, F216L, e D374Y têm mostrado resultar em função aberrante da proteína PCSK9 resultante na incidência de hipercolesterolemia (Attie, A.D., Art. Thromb. and Vasc. Biol, . 2004; 24:1337) . Consequentemente, as mesmas mutações nas correspondentes posições de aminoácido do polipéptido de PCSK9b da presente invenção seria útil em métodos de diagnosticar pacientes suscetíveis à incidência de hipercolesterolemia. Deveria ser observado que PCSK9b não possui um aminoácido correspondente para a mutação S127R por conta de splicing alternativo (veja-se alinhamento proporcionado em Figuras 3A-C).

Um polinucleótido da SEQ ID NO:2 é descrito no presente documento, em que a serina na posição de aminoácido 47 é substituída com uma leucina. Também, um polipéptido da SEQ ID NO: 2 que não possuem o codão de partida de iniciação, além disso, a metionina do polipéptido de PCSK9b codificado resultante é descrito no presente documento, em que serina na posição de aminoácido 47 é substituída com uma leucina. Polinucleótidos que codificam estes polipéptidos são também descritoss no presente documento. Também são descritos no presente documento vetores recombinantes que compreendem a dita sequência codificante, e células hospedeiras que compreendem o dito vetor.

Um polinucleótido da SEQ ID NO:2 é descrito no presente documento, em que o ácido aspártico na posição de aminoácido 205 é substituído com uma tirosina. Também, um polipéptido da SEQ ID NO: 2 que não possui o codão de partida de iniciação, além de, a metionina do polipéptido codificado resultante de PCSK9b é descrito no presente documento, em que o ácido aspártico na posição de aminoácido 205 é substituído com uma tirosina. Polinucleótidos que codificam estes polipéptidos são também proporcionados. Também são descritos no presente documento vetores recombinantes que compreendem a dita sequência codificante, e células hospedeiras que compreendem o dito vetor .

Uma vez que o polipéptido de PCSK9b representa uma forma variante do polipéptido de PCSK9 de tipo selvagem (PCSK9; Acesso GENBANK® n° : gi|NM-174936; SEQ ID N0:5), é esperado que o padrão de expressão do variante PCSK9b é igual ou similar ao polipéptido de PCSK9. 0 polipéptido de PCSK9 de tipo selvagem foi determinado que é predominantemente expresso em fígado e tecido neuronal, e a uma menor extensão em células mesenquimais renais e epitélio intestinal (Seidah et al. , PNAS 100(3):928-933 (2003)). O perfil de expressão projetado para medir os níveis de ARNm de estado estacionário que codifica os polipéptidos de PCSK9b e PCSK9c confirmou que compartiam to padrão de expressão no fígado e neuronal predominante de PCSK9 de tipo selvagem. Especificamente, PCSK9b e PCSK9c foram predominantemente expressos em fígado e cerebelo em níveis que eram mais de 3500 vezes aquele do tecido com a menor expressão (o coração). PCSK9b e PCSK9c foram também expressos relativamente alto no pulmão e sua vasculatura associada. PCSK9b e PCSK9c foram também expressos por todo o trato gastrointestinal (Veja-se Figura 6). A expressão de PCSK9b e PCSK9c no cerebelo indica que PCSK9b e PCSK9c pode funcionar em diferenciação neuronal.

Os polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9b da presente invenção, incluindo moduladores e/ou fragmentos dos mesmos, têm utilizações que incluem detetar, prognosticar, tratar, prevenir, e/ou melhorar as seguintes doenças e/ou distúrbios: hipercolesterolemia autossómica dominante; distúrbios associados a função de recetor de LDL aberrante; distúrbios associados a apolipoproteína B; distúrbios associados a hipercolesterolemia autossómica recessiva; distúrbios associados a colesterol elevado; distúrbios associados a LDL elevado; distúrbios associados a taxa de depuração reduzida de LDL no fígado; distúrbios associados a produção de apoB de LDL elevado; hipercolesterolemia familiar; distúrbios de metabolismo de lipido; LDL elevado; deposições de colesterol; xantomas nos tendões; ateroma; arteriosclerose prematura, doença cardíaca coronária; apolipoproteína B defeituosa familiar; hipersensibilidade a estatina; distúrbios associados a degradação acelerada de LDLR.

Os polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9b da presente invenção, incluindo moduladores e/ou fragmentos dos mesmos, têm utilizações que incluem detetar, prognosticar, tratar, prevenir, e/ou melhorar as seguintes doenças e/ou distúrbios: distúrbios de diferenciação neural.

Os polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9b da presente invenção, incluindo moduladores e/ou fragmentos dos mesmos, têm utilizações que incluem detetar, prognosticar, tratar, prevenir, e/ou melhorar as seguintes doenças e/ou distúrbios cardiovasculares: enfarte do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, arritmias, cardiomiopatia, aterosclerose, esclerose arterial, doença microvascular, embolismo, trombose, edema pulmonar, palpitação, dispneia, angina, hipotensão, síncope, sopro cardíaco, ECG aberrante, cardiomiopatia hipertrófica, a síndrome de Marfan, morte súbita, síndrome de QT prolongado, defeitos congénitos, infeções virais cardíacas, doença cardíaca valvular, hipertensão, entre outros revelados no presente documento, particularmente na secção de "Distúrbios cardiovasculares" e abaixo.

De forma similar, polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9b podem ser úteis para melhorar cardiovascular doenças e sintomas que resultam indiretamente dos vários efeitos não cardiovasculares, que incluem, mas não são limitado a, o seguinte, obesidade, tabaquismo, síndrome de Down (associado a defeito dos coxins endocárdicos); anormalidades ósseas das extremidades superiores (associado a defeito do septo atrial na sindrome de Holt-Oram); distrofias musculares (associadas a cardiomiopatia); hemocromatose e doença de armazenamento de glicogénio (associado a infiltração do miocárdio e cardiomiopatia restritiva); surdez congénita (associado a intervalo de QT prolongado e arritmias cardíacas sérias); doença de Raynaud (associado a hipertensão pulmonar primária e vasoespasmo coronário); distúrbios do tecido conjuntivo, isto é, a sindrome de Marfan, sindromes de Ehlers-Danlosand Hurler, e distúrbios relacionados de metabolismo de mucopolissacárido (dilatação aórtica, válvula mitras colapsada, uma variedade de anomalias arteriais) ; acromegalia (hipertensão, aterosclerose coronária acelerada, defeitos de condução, cardiomiopatia); hipertiroidismo (insuficiência cardíaca, fibrilação atrial); hipotiroidismo (efusão pericárdica, doença arterial coronária); artrite reumatoide (pericardite, doença da válvula aórtica); escleroderma (cor pulmonale, fibrose do miocárdio, pericardite); lupus eritematoso sistémico (valvulite, miocardite, pericardite); sarcoidose (arritmias, cardiomiopatia) ; efeitos pós-menopausa, Infeções por clamídia, doença do ovário policístico, doença tiroide, alcoolismo, dieta, e dermatite exfoliativa (alto índice de insuficiência cardíaca), por exemplo.

Além disso, polinucleótidos e polipéptidos, incluindo fragmentos e/ou antagonistas dos mesmos, têm utilizações que incluem, diretamente ou indiretamente, tratar, prevenir, diagnosticar, e/ou prognosticar as seguintes infeções cardiovasculares, não limitantes: invasão da corrente sanguínea, bacteriemia, sepse, infeção por Streptococcus pneumoniae, infeção por estreptococos do grupo a, infeção por estreptococos do grupo b, infeção por Enterococcus, infeção por estreptococos do grupo D não enterocócica, infeção por estreptococos do grupo C não enterocócica, infeção por estreptococos do grupo G não enterocócica, infeção por Streptoccus viridans, infeção por Staphilococcus aureus, infeção por estafilococos coagulase negativo, infeção por bacilos Gram negativos, infeção por Enterobacteriaceae, infeção por Psudomonas spp., infeção por Acinobacter spp., infeção por Flavobacterium meningosepticum, infeção por Aeromonas spp., infeção por Stenotrophomonas maltophilia, infeção por cocobacilos Gram negativos, infeção por Haemophilus influenza, infeção por Branhamella catarrhalis, infeção anaeróbia, infeção por Bacteriodes fragilis, infeção por Clostridium, infeção fúngica, infeção por Candida spp., infeção por Candida spp. não albicans, infeção por Hansenula anómala, infeção por Malassezia furfur, infeção por micobactérias não tuberculosas, infeção por Mycobacterium avium, infeção por Mycobacterium chelonae, infeção por Mycobacterium fortuitum, infeção por espiroqueta, infeção por Borrelia burgdorferi, além de qualquer outra doença e/ou distúrbio cardiovascular (por exemplo, não sepse) implicado pelos agentes causadores listados acima ou em qualquer lugar no presente documento.

Os polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9b da presente invenção, incluindo moduladores e/ou fragmentos dos mesmos, têm utilizações que incluem detetar, prognosticar, tratar, prevenir, e/ou melhorar as seguintes doenças e/ou distúrbios metabólicos: dislipidemia, dislipidemia diabética, dislipidemia mista, hipercolesteremia, hipertrigliceridemia, diabetes melitus do tipo II, diabetes do tipo I, resistência à insulina, hiperlipidemia, obesidade, e/ou anorexia nervosa. A presente invenção também abrange combinações terapêuticas de um modulador de PCSK9b com uma estatina para o tratamento, prevenção e/ou melhora de uma doença ou distúrbio referenciado no presente documento, particularmente dislipidemia. Estatinas representativas incluem, mas não são limitado a, o seguinte: pravastatina, lovastatina, cerivastatina, simvastatina, pitivastatina, atorvastatina ou rousuvastatina.

Os polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9b da presente invenção, incluindo moduladores e/ou fragmentos dos mesmos, têm utilizações que incluem modular atividade de transdução de sinal, em várias células, tecidos, e organismos, e particularmente em fígado, cérebro, adipose de mamífero, omento, baço, tecidos inflamatórios, macrófagos, neutrófilos, histiomonócitos sinoviais, neutrófilos, e hitiócitos epiteloides.

Os polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9b da presente invenção, incluindo moduladores e/ou fragmentos dos mesmos, têm utilizações que incluem detetar, prognosticar, tratar, prevenir, e/ou melhorar os seguintes distúrbios hepáticos: hepatoblastoma, icterícia, hepatite, doenças metabólicas hepáticas e condições que são atribuíveis à diferenciação de células progenitoras de hepatócitos, cirrose, cistos hepáticos, abscesso pirogénico, abscesso amébico, cisto de hidátide, cistadenocarcinoma, adenoma, hiperplasia nodular focal, hemangioma, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, e angiosarcoma, doença hepática granulomatosa, transplante hepático, hiperbilirrubinemia, icterícia, doença hepática de parénquima, hipertensão portal, doença hepatobiliar, parénquima hepático, fibrose hepática, anemia, cálculos biliares, colestase, toxicidade a tetracloreto de carbono, toxicidade a berílio, toxicidade a cloreto de vinilo, coledocolitiase, necrose hepatocelular, metabolismo aberrante de aminoácidos, metabolismo aberrante de hidratos de carbono, síntese aberrante de proteínas, síntese aberrante de glicoproteinas, degradação aberrante de proteínas, degradação aberrante de glicoproteinas, metabolismo aberrante de fármacos, metabolismo aberrante de hormonas, degradação aberrante de fármacos, degradação aberrante de fármacos, regulação aberrante de metabolismo de lípido, regulação aberrante de metabolismo de colesterol, glicogénese aberrante, glicogenólise aberrante, glicólise aberrante, gliconeogénese aberrante, hiperglicemia, intolerância à glicose, hiperglicemia, captação de glicose hepática diminuída, captação de glocogénio hepático diminuída, resistência hepática a insulina, desvio de glicose sistémica portal, resistência periférica à insulina, anomalias hormonais, níveis aumentados de glucagon sistémico, níveis diminuídos de cortisol sistémico, níveis aumentados de insulina sistémica, hipoglicemia, gliconeogénese diminuída, conteúdo de glicogénio hepático diminuído, resistência hepática a glucagon, níveis elevados de aminoácidos aromáticos sistémicos, níveis diminuídos de aminoácidos de cadeia ramificada sistémicos, encefalopatia hepática, transaminação de aminoácido hepática aberrante, desaminação oxidativa de aminoácido hepático aberrante, síntese de amónia aberrante, síntese de albumina aberrante, hipoalbuminemia, função de citocromos b5 aberrantes, função de P450 aberrante, função de glutatione S-aciltransferase aberrante, síntese de colesterol aberrante, e síntese de ácido biliar aberrante.

Além disso, polinucleótidos e polipéptidos, incluindo fragmentos e/ou antagonistas dos mesmos, têm utilizações que incluem, diretamente ou indiretamente, tratar, prevenir, diagnosticar, e/ou prognosticar as seguintes, não limitantes, infeções hepáticas: doença hepática causada por infeção de sepse, doença hepática causada por bacteriemia, doença hepática causada por infeção de pneumonia Pneumococcal, doença hepática causada por síndrome do choque tóxico, doença hepática causada por Listeriosis, doença hepática causada por doença de legionários, doença hepática causada por infeção por brucelose, doença hepática causada por infeção por Neisseria gonorrhoeae, doença hepática causada por infeção por Yersinia, doença hepática causada por salmonelose, doença hepática causada por Nocardiosis, doença hepática causada por infeção por espiroqueta, doença hepática causada por infeção por Treponema pallidum, doença hepática causada por infeção por Brrelia burgdorferi, doença hepática causada por Leptospirosis, doença hepática causada por infeção por Coxiella burnetii, doença hepática causada por infeção por Rickettsia richettsii, doença hepática causada por infeção por Chlamydia trachomatis, doença hepática causada por infeção por Chlamydia psittaci, doença hepática causada por infeção por virus da hepatite, doença hepática causada por infeção por vírus Epstein-Barr em além de qualquer outra doença e/ou distúrbio hepático implicado pelos agentes causadores listados acima ou em qualquer lugar no presente documento.

Os polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9b, incluindo fragmentos e/ou antagonistas dos mesmos, pode têm utilizações que incluem identificação de moduladores de função de PCSK9b incluindo anticorpos (para a deteção ou neutralização), moduladores de ocorrência natural e moduladores de molécula pequena. Os anticorpos contra domínios da proteína PCSK9b poderiam ser usados como agentes de diagnóstico de distúrbios metabólicos de lípido, incluindo hipercolesterolemia, entre outros. 0 nível de expressão de PCSK9b também pode ser útil como um biomarcador para predizer quais pacientes podem estar em risco de desenvolver hipercolesterolemia, e/ou aqueles pacientes que pode estar em risco de sendo excessivamente sensível a terapêutica com estatina.

Os polipéptidos e polinucleótidos de PCSK9b têm utilizações adicionais que incluem diagnosticar doenças relacionadas com the super e/ou subexpressão de PCSK9b identificando mutações no gene PCSK9b utilizando sequências PCSK9b como sondas ou determinando proteína PCSK9b ou Níveis de expressão de ARNm. Os polipéptidos de PCSK9b podem ser úteis para o rastreio de compostos que afetam a atividade da proteína. Péptidos PCSK9b podem também ser usados para a geração de anticorpos específicos e como isca em rastreios de híbrido de duas leveduras para encontrar proteínas que interagem especificamente com PCSK9b (descrito em qualquer lugar no presente documento).

Também são descritos no presente documento polinucleótidos que compreendem, ou alternativamente que consistem em, uma sequência que codifica os seguintes polipéptidos de deleção de PCSK9b N-terminais: M1-R315, S2-R315, P3-R315, W4-R315, K5-R315, D6-R315, G7- R315, G8-R315, S9-R315, L10-R315, V11-R315, E12-R315, V13-R315, Y14-R315, L15-R315, L16-R315, D17-R315, T18-R315, S19-R315, I20-R315, Q21-R315, S22-R315, D23-R315, H24-R315, R25-R315, E26-R315, I27-R315, E28- R315, G29-R315, R30-R315, V31-R315, M32-R315, V33-R315, T34-R315, D35-R315, F36-R315, E37-R315, N38-R315, V39-R315, P40-R315, E41-R315, E42-R315, D43-R315, G44-R315, T45-R315, R46-R315, F47-R315, H48-R315, R49-R315, Q50-R315, A51-R315, S52-R315, K53-R315, C54-R315, D55-R315, S56-R315, H57-R315, G58-R315, T59-R315, H60-R315, L61-R315, A62-R315, G63-R315, V64-R315, V65-R315, S66-R315, G67-R315, R68-R315, D69-R315, A70-R315, G71-R315, V72-R315, A73-R315, K74-R315, G75-R315, A76-R315, S77-R315, M78-R315, R79-R315, S80-R315, L81-R315, R82-R315, V83-R315, L84-R315, N85-R315, C86-R315, Q87-R315, G88-R315, K89-R315, G90-R315, T91-R315, V92-R315, S93-R315, G94-R315, T95-R315, L96-R315,197-R315, G98-R315,L99-R315, E100-R315, F101-R315, I102-R315, R103-R315, K104-R315, S105-R315, Q106-R315, L107-R315, V108- R315, Q109-R315, PI 10-R315, V111-R315, G1 12-R315, P113-R315, L114-R315, V115-R315, V116-R315, L117-R315, L118-R315, P119-R315, L120-R315, A121-R315, G122-R315, G123-R315, Y124-R315, S125-R315, R126-R315, V127-R315, L128-R315, N129-R315, A130-R315, A131-R315, C132-R315, Q133-R315, R134-R315, L135-R315, A136-R315, R137-R315, A138-R315, G139-R315, V140-R315, V141-R315, L142- R315, V143-R315.T144-R315, A145-R315, A146- R315, G147-R315, N148-R315, F149-R315, R150-R315, D151-R315, D152-R315, A153-R315, C154-R315, L155- R315, Y156-R315, S157-R315, P158-R315, A159-R315, S160-R315, A161-R315, P162-R315, E163-R315, V164-R315, I165-R315, T166-R315, V167-R315, G168-R315, AI 69-R315.T170-R315, N171-R315, A172-R315, Q173-R315, D174- R315, Q175-R315, P176-R315, V177-R315, T178-R315, L179-R315, G180-R315, T181-R315, L182-R315, G183-R315, T184-R315, N185-R315, F186-R315, G187-R315, R188-R315, C189-R315, V190-R315, D191-R315, L192-R315, FI 93- R315, A194-R315, P195-R315, G196-R315, E197-R315, D198-R315, 1199-R315, 1200-R315, G201-R315, A202-R315, S203-R315, S204-R315, D205-R315, C206-R315, S207-R315, T208-R315, C209-R315, F210-R315, V211-R315, S212- R315, Q213-R315, S214-R315, G215-R315, T216-R315, S217-R315, Q218-R315, A219-R315, A220-R315, A221- R315, H222-R315, V223-R315, A224-R315, G225-R315, I226-R315, A227-R315, A228-R315, M229-R315, M230- R315, L231-R315, S232-R315, A233-R315, E234-R315, P235-R315, E236-R315, L237-R315, T238-R315, L239-R315, A240-R315, E241-R315, L242-R315, R243-R315, Q244-R315, R245-R315, L246-R315, 1247-R315, H248-R315, F249- R315, S250-R315, A251-R315, K252-R315, D253-R315, V254-R315, 1255-R315, N256-R315, E257-R315, A258-R315, W259-R315, F260-R315, P261-R315, E262-R315, D263-R315, Q264-R315, R265-R315, V266-R315, L267-R315, T268-R315, P269-R315, N270-R315, L271-R315, V272-R315, A273-R315, A274-R315, L275-R315, P276-R315, P277- R315, S278-R315, T279-R315, H280-R315, G281-R315, A282-R315, G283-R315, P284-R315, F285-R315, C286- R315, R287-R315, L288-R315, A289-R315, A290-R315, V291-R315, L292-R315, Q293-R315, D294-R315, C295-R315, V296-R315, V297-R315, S298-R315, T299-R315, L300-R315, G301-R315, A302-R315, Y303-R315, T304-R315, D305- R315, G306-R315, H307-R315, S308-R315, e/ou H309-R315 da SEQ ID NO:2. Sequências polipeptídicas codificadas por estes polinucleótidos são também descritas no presente documento. Além disso, polinucleótidos que codificam um polipéptido que é pelo menos tão longo como qualquer um dos polipéptidos mencionados anteriormente são descritos no presente documento. Estes polipéptidos de deleção de PCSK9b N-terminais podem ser usados como epítopos imunogénico e/ou antigénico como descrito em qualquer lugar no presente documento.

Também são descritos no presente documento polinucleótidos que compreendem, ou alternativamente que consistem em, uma sequência que codifica os seguintes polipéptidos de deleção de PCSK9b C-terminal: M1-R315, Ml-P314, M1-R313, M1-L312, M1-P311, M1-R310, M1-H309, M1-S308, MI-H307, MI-G306, MI-D305, MI-T304, MI-Y303, MI-A302, MI-G301, MI-L300, MI-T299, MI -5298, M1-V297, M1-V296, Ml-C295, M1-D294, M1-Q293, M1-L292, M1-V291, M1-A290, M1-A289, M1-L288, M1-R287, Ml- C286, M1-F285, M1-P284, M1-G283, Ml-A282, M1-G281, M1-H280, M1-T279, M1-S278, M1-P277, M1-P276, Ml- L275, M1-A274, M1-A273, M1-V272, M1-L271, M1-N270, Ml-P269, M1-T268, M1-L267, M1-V266, M1-R265, M1-Q264, M1-D263, M1-E262, M1-P261, M1-F260, M1-W259, M1-A258, M1-E257, Ml-N256, MI-1255, M1-V254, M1-D253, Ml- K252, M1-A251, Ml-S250, M1-F249, M1-H248, MI-1247, M1-L246, M1-R245, M1-Q244, M1-R243, M1-L242, M1-E241, M1-A240, M1-L239, M1-T238, Ml-L237, M1-E236, M1-P235, M1-E234, M1-A233, M1-S232, M1-L231, M1-M230, Ml- M22 9, M1-A228, M1-A227, MI-1226, M1-G225, Ml-A224, M1-V223, M1-H222, M1-A221, M1-A220, M1-A219, MI-0218, M1-S217, M1-T216, M1-G215, M1-S214, M1-Q213, M1-S212, Ml-V211, M1-F210, M1-C209, M1-T208, MI-3207, M1-C206, M1-D205, M1-S204, M1-S203, M1-A202, M1-G201, MI-1200, MI-1199, Ml-D198, M1-E197, M1-G196, M1-P195, MI-A194, M1-F193, M1-L192, M1-D191, M1-V190, M1-C189, M1-R188, M1-G187, M1-F186, Ml-N185, MI- 1184, M1-G183, M1-L182, M1-T181, M1-G180, Ml-L179, M1-T178, M1-V177, M1-P176, M1-Q175, M1-D174, MI-0173, MI-A172, M1-N171, M1-T170, M1-A169, M1-G168, M1-V167, M1-T166, MI-1165, M1-V164, M1-E163, M1-P162, M1-A161, Ml- S160, M1-A159, M1-P158, M1-S157, M1-Y156, M1-L155, M1-C154, M1-A153, M1-D152, M1-D151, Ml- R150, M1-F149, M1-N148, Ml-G147, M1-A146, M1-A145, M1-T144, M1-V143, M1-L142, M1-V141, M1-V140, M1-G139, MI-A138, M1-R137, M1-A136, M1-L135, Ml- R134, M1-Q133, M1-C132, M1-A131, M1-A130, M1-N129, M1-L128, M1-V127, M1-R126, M1-S125, M1-Y124, M1-G123, M1-G122, Ml- A121, M1-L120, MI-P119, M1-L118, M1-L117, M1-V116, M1-V115, M1-L114, M1-P113, M1-G112, Ml-Vlll, MI-P110, M1-Q109, Ml- VI0 8, M1-L107, M1-Q106, Ml- S105, M1-K104, M1-R103, MI- 1102, M1-F101, Ml-El0 0, M1-L99, M1-G98, MI-197, M1-L96, Ml-T95, M1-G94, MI- 393, M1-V92, M1-T91, M1-G90, M1-K89, Ml-G88, M1-Q87, M1-C86, M1-N85, M1-L84, M1-V83, M1-R82, Ml- L81, Ml- S80, M1-R79, M1-M78, M1-S77, M1-A76, M1-G75, Ml-K74, M1-A73, M1-V72, M1-G71, M1-A70, M1-D69, M1-R68, Ml- G67, M1-S66, M1-V65, M1-V64, M1-G63, M1-A62, M1-L61, Ml- H60, M1-T59, M1-G58, M1-H57, M1-S56, M1-D55, M1-C54, Ml- K53, M1-S52, M1-A51, M1-Q50, M1-R49, M1-H48, M1-F47, Ml- R46, M1-T45, M1-G44, M1-D43, M1-E42, M1-E41, M1-P40, Ml- V39, M1-N38, M1-E37, M1-F36, M1-D35, M1-T34, M1-V33, Ml- M32, M1-V31, M1-R30, M1-G29, M1-E28, MI-127, M1-E26, Ml- R25, M1-H24, M1-D23, M1-S22, M1-Q21, MI-120, M1-S19, Ml- T18, M1-D17, M1-L16, M1-L15, MI-YI4, M1-V13, M1-E12, Ml-

Vll, MI-LIO, M1-S9, M1-G8, e/ou M1-G7 da SEQ ID NO: 2 . Sequências polipeptídicas codificadas por estes polinucleótidos são também descritas no presente documento. Além disso, polinucleótidos que codificam um polipéptido que é pelo menos tão longo como qualquer um dos polipéptidos mencionados anteriormente são descritos no presente documento. Estes polipéptidos de deleção de PCSK9b C-terminal podem ser usados como epitopos imunogénicos e/ou antigénicos como descritos em qualquer lugar no presente documento.

Polipéptidos que compreendem sequências polipeptidicas que correspondem a, por exemplo, regiões internas do

polipéptido de PCSK9b (por exemplo, qualquer combinação de deleções de polipéptido de PCSK9b tanto N como C-terminal) da SEQ ID NO: 2 são descritos no presente documento. Por exemplo, regiões internas poderiam ser definidas pela equação: aminoácido NX para aminoácido CX, em que NX refere-se a qualquer aminoácido de polipéptido de deleção N-terminal de PCSK9b (SEQ ID N0:2), e onde CX refere-se a qualquer aminoácido de polipéptido de deleção C-terminal de PCSK9b (SEQ ID N0:2). Polinucleótidos que codificam estes polipéptidos são também descritos no presente documento. Estes polipéptidos podem ser usados como um epítopo imunogénico e/ou antigénico como descrito em qualquer lugar no presente documento.

Também são descritos no presente documento epítopos imunogénicos e/ou antigénicos do polipéptido de PCSK9b.

Muitas sequências polinucleotídicas, tal como sequências EST, estão publicamente disponíveis e acessíveis através de bases de dados de sequência. Algumas destas sequências são relacionadas com a SEQ ID N0:1 e pode ter estado publicamente disponível antes de conceção da presente invenção. Preferentemente, tais polinucleótidos relacionados são especificamente excluídos do âmbito da presente invenção. Listar cada sequência relacionada seria inconveniente. Consequentemente, preferentemente excluído da presente invenção são um ou mais polinucleótidos que consistem em uma sequência nucleotídica descrita pela fórmula geral de a-b, onde a é qualquer número inteiro entre 1 e 3161 da SEQ ID N0:1, b é um número inteiro entre 15 e 3175, onde tanto a como e b correspondem às posições de resíduos de nucleótido mostrados na SEQ ID N0:1, e onde b é superior ou igual a a+14.

Características do polipéptido Codificado pelo Polinucleótido No:2 0 polipéptido deste polinucleótido proporcionado como SEQ ID N0:4 (Figuras 2A-D), codificado pela sequência polinucleotídica de acordo com a SEQ ID NO: 3 (Figuras 2A-D), e/ou codificado pelo polinucleotido contido no clone depositado, PCSK9c (também referido como PCSK9-C), é um variante do polipéptido de PCSK9 humano (PCSK9; Acesso GENBANK® n°: gi|NM_174936; SEQ ID N0:5). Um alinhamento do polipéptido de PCSK9c com PCSK9 além de um variante de PCSK9 conhecido (variante de PCSK9; Acesso GENBANK® n° : gi|AK124635; SEQ ID NO:6) é proporcionado nas Figuras 3A-C. A percentagem de identidade e valores de similaridade entre o polipéptido de PCSK9c e estes polipéptidos é proporcionado na Figura 4. A sequência nucleotidica determinada do ADNc de PCSK9c nas Figuras 2A-D (SEQ ID NO:3) contém uma grelha de leitura aberta que codifica uma proteína de cerca de 523 resíduos de aminoácidos, com uma massa molecular deduzida de cerca de 55,2 kDa. A sequência de aminoácido de the polipéptido de PCSK9c predito é mostrada nas Figuras 2A-D (SEQ ID NO:4). 0 polipéptido de PCSK9c foi predito para compreender um domínio catalítico localizado desde cerca do aminoácido 10 até cerca de aminoácido 256 da SEQ ID NO:4, com a tríade catalítica canónica residindo nos aminoácidos D17, H57, e S217 da SEQ ID NO:4; e seis resíduos de cisteína conservados localizados nos aminoácidos C54, C86, C132, C154, C189, e C206 da SEQ ID NO:4 com ligações dissulfureto preditas para formar entre os seguintes pares de cisteína: C54 e C86, e C154 e C189; e um domínio predito de ligação de ião Ca2+ predito para formar entre os resíduos D191, P162, e V164 da SEQ ID NO:4. Neste contexto, o termo "cerca de" pode ser interpretado como que significa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10 aminoácidos além dos limites N-terminal e/ou C-terminal das localizações de aminoácido referenciadas acima.

Uma vez que o polipéptido de PCSK9c retém a tríade catalítica do polipéptido de PCSK9 de tipo selvagem, em adição a suas cisteínas conservadas, é esperado que o polipéptido de PCSK9c retenha a atividade biológica de PCSK9, incluindo, mas não limitado a atividade de proteinase, atividade de convertase, atividade de subtilisina-kexina isozima-l/local I protease, atividade autocatalitica clivando a PCSK9, PCSK9b, PCSK9c, ou outros variantes de PCSK9 entre os aminoácidos que correspondem aos aminoácidos Gln-151 e Ser-152; atividade reguladora de expressão génica dependente de esterol (Maxwell et ai., J Lipid Res. 2003; 44: 2109-2119), atividade reguladora de expressão génica dependente de insulina (Shimomura et al. , Proc Natl Acad Sei USA. 1999; 96: 13656-13661), atividade reguladora de expressão génica dependente de fator de transcrição de LXR (Repa et al., Genes Dev. 2000; 14: 2819-2830); atividade reguladora de proteína de recetor de LDL (Maxwell et al. , Proc Natl Acad Sei USA. 2004; 101: 7100-7105); atividade de regulação positiva dependente de estatina (Dubuc et al., Arterioscler Thromb Vase Biol. 2004; 24 : 1454-1459) .

Em confirmação de PCSK9c reter a atividade biológica de PCSK9, ensaios de captação de Dil de LDL foram realizados e PCSK9c foi mostrado que têm atividade de PCSK9. Surpreendentemente, encontrou-se que PCSK9c tem maior atividade que PCSK9 de tipo selvagem. O ensaio de captação de Dil de LDL é um ensaio funcional padronizado para o recetor de LDLR, e atividade de PCSK9 de tipo selvagem age para reduzir a atividade de LDLR. Portanto, a captação de Dil de LDL por células pode ser usado como um ensaio funcional substituto para medir a atividade de PCSK9. A expressão transitória de PCSK9c agiu para diminuir a captação de Dil-LDL em células HepG2, em comparação com controlo de vetor, indicando que PCSK9c é competente para expressar atividade funcional PCSK9 em LDLR (Fig 9) . Neste ensaio, PCSK9c mostrou maior atividade que tanto PCSK9 de tipo selvagem como PCSK9b. Consequentemente, PCSK9c retêm a capacidade de PCSK9 de tipo selvagem para modular a atividade funcional em LDLR. PCSK9c foi mostrado que tem cerca de 50 % mais função que PCSK9 de tipo selvagem como demonstrado na captação de ensaio de LDL (veja-se Figura 9A) . Consequentemente, a invenção refere-se ainda a uma truncagem de N-terminal de PCSK9, tal como PCSK9c, por exemplo, (SEQ ID NO:4), em que a dita truncagem de N-terminal resulta num elevação de atividade biológica de PCSK9, incluindo, mas não limitado a níveis de proteína LDLR diminuída e/ou captação de LDL diminuída por LDLR, e em que a dita atividade biológica de PCSK9 elevada é pelo menos cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 100 %, ou mais que a atividade biológica de PCSK9 elevada de tipo selvagem. Neste contexto, o termo "cerca de" deve ser interpretado como significando qualquer lugar entre 1, 2, 3, 4, ou 5 por cento mais ou inferior à quantidade citada. Alternativamente, a dita atividade biológica de PCSK9 elevada pode ser pelo menos cerca de lx, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, ou lOx mais que a atividade biológica de PCSK9 de tipo selvagem. Neste contexto, o termo "cerca de" deve ser interpretado como significando qualquer lugar entre 0,lx, 0,2x, 0,3x, 0,4x, 0,5x, 0,6x, 0,7x, 0,8x, ou 0,9x mais ou inferior à quantidade citada.

Um polinucleótido que compreende um polipéptido que codifica pelo menos cerca de 301 aminoácidos contíguos da SEQ ID NO: 4 é descrito no presente documento. Também descrito no presente documento é um polipéptido que compreende pelo menos cerca de 496 aminoácidos da SEQ ID NO: 4. Também descrito no presente documento é um polipéptido que compreende pelo menos cerca de 518 aminoácidos da SEQ ID NO:4. Também descrito no presente documento é um polinucleótido que compreende pelo menos cerca de 903 nucleótidos contíguos da SEQ ID NO:3. Também descrito no presente documento é um polinucleótido que compreende pelo menos cerca de 1488 nucleótidos contíguos da SEQ ID NO:3. Também descrito no presente documento é um polinucleótido que compreende pelo menos cerca de 1554 nucleótidos contíguos da SEQ ID NO:3. Neste contexto, o termo "cerca de" deve ser interpretado como que significa 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 mais ou menos aminoácidos na terminação N ou C, ou ambas, ou 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ou 20 nucleótidos na extremidade 5 prima ou 3 prima, ou ambas. Preferentemente, os polipéptidos e/ou polipéptidos codificados pelos ditos polinucleótidos retêm atividade biológica.

Um polinucleótido que não possui o codão de partida de iniciação, além da metionina do polipéptido codificado resultante de PCSK9c é descrito no presente documento. Especificamente, o polinucleótido corresponde aos nucleótidos 884 a 2049 da SEQ ID NO:3, e o polipéptido corresponde aos aminoácidos 2 a 523 da SEQ ID NO:4. Também são descritos no presente documento vetores recombinantes que compreendem a dita sequência codificante, e células hospedeiras que compreendem o dito vetor.

Uma vez que o polipéptido de PCSK9c representa uma forma variante do polipéptido de PCSK9 de tipo selvagem (PCSK9; Acesso GENBANK® n°: gi|NM_174936; SEQ ID NO:5), é esperado que o padrão de expressão do variante de PCSK9c é igual ou similar ao polipéptido de PCSK9.

Como descrito no presente documento, mutações misense do PCSK9 de tipo selvagem nas localizações de aminoácido S127R, F216L, e D374Y têm mostrado resultar em função aberrante da proteína PCSK9 resultante na incidência de hipercolesterolemia (Attie, A.D., Art. Thromb. and Vasc. Biol, . 2004; 24:1337) . Consequentemente, as mesmas mutações nas correspodentes posições de aminoácido do polipéptido de PCSK9c da presente invenção seria útil em métodos de diagnosticar pacientes susceptíveis à incidência de hipercolesterolemia. Deveria ser observado que PCSK9c não possui um aminoácido correspondente para a mutação S127R por conta do splicing alternativo (veja-se alinhamento proporcionado em Figuras 3A-C).

Um polinucleótido da SEQ ID NO:4 é descrito no presente documento, em que a serina na posição de aminoácido 47 é substituída com uma leucina. Um polipéptido da SEQ ID NO: 4 que não possui o codão de partida de iniciação, em adição a, a metionina do polipéptido codificado resultante de PCSK9c é descrito no presente documento, em que serina na posição de aminoácido 47 é substituída com uma leucina. Polinucleótidos que codificam estes polipéptidos são também descritos no presente documento. Também são descritos no presente documento vetores recombinantes que compreendem a dita sequência codificante, e células hospedeiras que compreendem o dito vetor.

Um polinucleótido da SEQ ID NO:4 é descrito no presente documento, em que o ácido aspártico na posição de aminoácido 205 é substituído com uma tirosina. Um polipéptido da SEQ ID NO: 4 que não possui o codão de partida de iniciação, para além de, a metionina do polipéptido codificado resultante de PCSK9c é descrito no presente documento, em que ácido aspártico na posição de aminoácido 205 é substituído com uma tirosina.

Polinucleótidos que codificam estes polipéptidos são também descritos no presente documento. Também são descritos no presente documento vetores recombinantes que compreendem a dita sequência codificante, e células hospedeiras que compreendem o dito vetor. O polipéptido de PCSK9 de tipo selvagem foi determinado que é predominantemente expresso em fígado e tecido neuronal, e a uma menor extensão em células mesenquimais renais e epitélio intestinal (Seidah et ai., PNAS 100(3):928-933 (2003)).

Perfil de expressão projetado par amedir os níveis de ARNm de estado estacionário que codifica os polipéptidos de PCSK9b e PCSK9c confirmou que compartem o padrão de expressão de fígado e neuronal predominante de PCSK9 de tipo selvagem. Especificamente, PCSK9b e PCSK9c foram predominantemente expressos em fígado e cerebelo em níveis que foram superiores a 3500 vezes que do tecido com a menor expressão (o coração). PCSK9b e PCSK9c foram também expressos relativamente altamente no pulmão e sua vasculatura associada. PCSK9b e PCSK9c foram também expressos por todo o trato gastrointestinal (Veja-se a Figura 6) . A expressão de PCSK9b e PCSK9c no cerebelo indica que PCSK9b e PCSK9c pode funcionar em diferenciação neuronal.

Os polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9c da presente invenção, incluindo moduladores e/ou fragmentos dos mesmos, têm utilizações que incluem detetar, prognosticar, tratar, prevenir, e/ou melhorar as seguintes doenças e/ou distúrbios: hipercolesterolemia autossómica dominante; distúrbios associados a função de recetor de LDL aberrante; distúrbios associados a apolipoproteína B; distúrbios associados a hipercolesterolemia autossómica recessiva; distúrbios associados a colesterol elevado; distúrbios associados a LDL elevado; distúrbios associados a taxa de depuração reduzida de LDL no fígado; distúrbios associados a produção de apoB de LDL elevado; hipercolesterolemia familiar; distúrbios de metabolismo de lípido; LDL elevado; deposições de colesterol; xantomas nos tendões; ateroma; arteriosclerose prematura, doença cardíaca coronária; apolipoproteína B defeituosa familiar; hipersensibilidade a estatina; distúrbios associados a degradação acelerada de LDLR.

Os polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9c da presente invenção, incluindo moduladores e/ou fragmentos dos mesmos, têm utilizações que incluem detetar, prognosticar, tratar, prevenir, e/ou melhorar as seguintes doenças e/ou distúrbios: distúrbios de diferenciação neural.

Os polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9c da presente invenção, incluindo moduladores e/ou fragmentos dos mesmos, têm utilizações que incluem detetar, prognosticar, tratar, prevenir, e/ou melhorar as seguintes doenças e/ou distúrbios cardiovasculares: enfarte do miocárdio, insuficiência cardíaca congestiva, arritmias, cardiomiopatia, aterosclerose, esclerose arterial, doença microvascular, embolismo, trombose, edema pulmonar, palpitação, dispneia, angina, hipotensão, síncope, sopro no coração, ECG aberrante, cardiomiopatia hipertrófica, a síndrome de Marfan, morte súbita, síndrome de QT prolongado, defeitos congénitos, infeções virais cardíacas, doença cardíaca valvular, hipertensão, entre outros revelado no presente documento, particularmente na secção "Distúrbios cardiovasculares" e abaixo.

De forma similar, polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9c podem ser úteis para melhorar doenças e sintomas cardiovasculares que resultam indiretamente de vários efeitos não cardiovascular, que incluem, mas não são limitado a, o seguinte, obesidade, tabaquismo, síndrome de Down (associado a defeito dos coxins endocárdicos); anormalidades ósseas das extremidades superiores (associado a defeito do septo atrial na síndrome de Holt-Oram); distrofias musculares (associado a cardiomiopatia); hemocromatose e doença de armazenamento de glicogénio (associado a infiltração do miocárdio e cardiomiopatia restritiva); surdez congénita (associado a intervalo de QT prolongado e arritmias cardíacas sérias); doença de Raynaud (associado a hipertensão pulmonar primária e vasoespasmo coronário); distúrbios do tecido conjuntivo, isto é, a síndrome de Marfan, síndromes de Ehlers-Danlosand Hurler, e distúrbios relacionados de metabolismo de mucopolissacárido (dilatação aórtica, válvula mitras colapsada, uma variedade de anomalias arteriais); acromegalia (hipertensão, aterosclerose coronária acelerada, defeitos de condução, cardiomiopatia); hipertiroidismo (insuficiência cardíaca, fibrilação atrial); hipotiroidismo (efusão pericárdica, doença arterial coronária); artrite reumatoide (pericardite, doença da válvula aórtica); escleroderma (cor pulmonale, fibrose do miocárdio, pericardite); lupus eritematoso sistémico (valvulite, miocardite, pericardite); sarcoidose (arritmias, cardiomiopatia); efeitos pós-menopausa, Infeções por clamídia, doença do ovário policístico, doença tiroide, alcoolismo, dieta, e dermatite exfoliativa (alto índice de insuficiência cardíaca), por exemplo.

Além disso, polinucleótidos e polipéptidos, incluindo fragmentos e/ou antagonistas dos mesmos, têm utilizações que incluem, diretamente ou indiretamente, tratar, prevenir, diagnosticar, e/ou prognosticar as seguintes, não limitantes, infeções cardiovascular: invasão da corrente sanguínea, bacteriemia, sepse, infeção por Streptococcus pneumoniae, infeção por estreptococos do grupo a, infeção por estreptococos do grupo b, infeção por Enterococcus, infeção por estreptococos do grupo D não enterocócica, infeção por estreptococos do grupo C não enterocócica, infeção por estreptococos do grupo G não enterocócica, infeção por Streptoccus viridans, infeção por Staphilococcus aureus, infeção por estafilococos coagulase negativo, infeção por bacilos Gram negativos, infeção por Enterobacteriaceae, infeção por Psudomonas spp., infeção por Acinobacter spp., infeção por Flavobacterium meningosepticum, infeção por Aeromonas spp., infeção por Stenotrophomonas maltophilia, infeção por cocobacilos Gram negativos, infeção por Haemophilus influenza, infeção por Branhamella catarrhalis, infeção anaeróbia, infeção por

Bacteriodes fragilis, infeção por Clostridium, infeção fúngica, infeção por Candida spp., infeção por Candida spp. não albicans, infeção por Hansenula anómala, infeção por Malassezia furfur, infeção por micobactérias não tuberculosas, infeção por Mycobacterium avium, infeção por Mycobacterium chelonae, infeção por Mycobacterium fortuitum, infeção por espiroqueta, infeção por Borrelia burgdorferi, além de qualquer outra doença e/ou distúrbio cardiovascular (por exemplo, não sepse) implicado pelos agentes causadores listados acima ou em qualquer lugar no presente documento.

Os polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9c da presente invenção, incluindo moduladores e/ou fragmentos dos mesmos, têm utilizações que incluem detetar, prognosticar, tratar, prevenir, e/ou melhorar as seguintes doenças e/ou distúrbios metabólicos: dislipidemia, dislipidemia diabética, dislipidemia mista, hipercolesteremia, hipertrigliceridemia, diabetes melitus do tipo II, diabetes do tipo I, resistência à insulina, hiperlipidemia, obesidade, e/ou anorexia nervosa. A presente invenção também abrange combinações terapêuticas de um modulador de PCSK9c com uma estatina para o tratamento, prevenção e/ou melhora de uma doença ou distúrbio referenciado no presente documento, particularmente dislipidemia. Estatinas representativas incluem, mas não são limitado a, the following: pravastatina, lovastatina, cerivastatina, simvastatina, pitivastatina, atorvastatina ou rousuvastatina.

Os polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9c da presente invenção, incluindo moduladores e/ou fragmentos dos mesmos, têm utilizações que incluem modular atividade de transdução de sinal, em várias células, tecidos, e organismos, e particularmente em fígado, cérebro, adipose de mamífero, omento, baço, tecidos inflamatórios, macrófagos, neutrófilos, histiomonócitos sinoviais, neutrófilos, e hitiócitos epiteloides.

Os polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9c da presente invenção, incluindo moduladores e/ou fragmentos dos mesmos, têm utilizações que incluem detetar, prognosticar, tratar, prevenir, e/ou melhorar os seguintes distúrbios hepáticos: hepatoblastoma, icterícia, hepatite, doenças metabólicas hepáticas e condições que são atribuíveis à diferenciação de células progenitoras de hepatócitos, cirrose, cistos hepáticos, abscesso pirogénico, abscesso amébico, cisto de hidátide, cistadenocarcinoma, adenoma, hiperplasia nodular focal, hemangioma, carcinoma hepatocelular, colangiocarcinoma, e angiosarcoma, doença hepática granulomatosa, transplante hepático, hiperbilirrubinemia, icterícia, doença hepática de parénquima, hipertensão portal, doença hepatobiliar, parénquima hepático, fibrose hepática, anemia, cálculos biliares, colestase, toxicidade a tetracloreto de carbono, toxicidade a berílio, toxicidade a cloreto de vinilo, coledocolitiase, necrose hepatocelular, metabolismo aberrante de aminoácidos, metabolismo aberrante de hidratos de carbono, síntese aberrante de proteínas, síntese aberrante de glicoproteínas, degradação aberrante de proteínas, degradação aberrante de glicoproteínas, metabolismo aberrante de fármacos, metabolismo aberrante de hormonas, degradação aberrante de fármacos, degradação aberrante de fármacos, regulação aberrante de metabolismo de lípido, regulação aberrante de metabolismo de colesterol, glicogénese aberrante, glicogenólise aberrante, glicólise aberrante, gliconeogénese aberrante, hiperglicemia, intolerância à glicose, hiperglicemia, captação de glicose hepática diminuída, captação de glocogénio hepático diminuída, resistência hepática a insulina, desvio de glicose sistémica portal, resistência periférica à insulina, anomalias hormonais, níveis aumentados de glucagon sistémico, níveis diminuídos de cortisol sistémico, níveis aumentados de insulina sistémica, hipoglicemia, gliconeogénese diminuída, conteúdo de glicogénio hepático diminuído, resistência hepática a glucagon, níveis elevados de aminoácidos aromáticos sistémicos, níveis diminuídos de aminoácidos de cadeia ramificada sistémicos, encefalopatia hepática, transaminação de aminoácido hepática aberrante, desaminação oxidativa de aminoácido hepático aberrante, síntese de amónia aberrante, síntese de albumina aberrante, hipoalbuminemia, função de citocromos b5 aberrantes, função de P450 aberrante, função de glutatione S-aciltransferase aberrante, síntese de colesterol aberrante, e síntese de ácido biliar aberrante.

Além disso, polinucleótidos e polipéptidos, incluindo fragmentos e/ou antagonistas dos mesmos, têm utilizações que incluem, diretamente ou indiretamente, tratar, prevenir, diagnosticar, e/ou prognosticar as seguintes, não limitantes, infeções hepáticas: doença hepática causada por infeção de sepse, doença hepática causada por bacteriemia, doença hepática causada por infeção de pneumonia Pneumococcal, doença hepática causada por síndrome do choque tóxico, doença hepática causada por Listeriosis, doença hepática causada por doença de legionários, doença hepática causada por infeção por brucelose, doença hepática causada por infeção por Neisseria gonorrhoeae, doença hepática causada por infeção por Yersinia, doença hepática causada por salmonelose, doença hepática causada por Nocardiosis, doença hepática causada por infeção por espiroqueta, doença hepática causada por infeção por Treponema pallidum, doença hepática causada por infeção por Brrelia burgdorferi, doença hepática causada por Leptospirosis, doença hepática causada por infeção por Coxiella burnetii, doença hepática causada por infeção por Rickettsia richettsii, doença hepática causada por infeção por Chlamydia trachomatis, doença hepática causada por infeção por Chlamydia psittaci, doença hepática causada por infeção por virus da hepatite, doença hepática causada por Epstein-Barrvírus infeção em além de qualquer outra doença e/ou distúrbio hepático implicado pelos agentes causadores listados acima ou em qualquer lugar no presente documento.

Os polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9c, incluindo fragmentos e/ou antagonistas dos mesmos, pode ter utilizações que incluem identificação de moduladores de PCSK9c função incluindo anticorpos (para a deteção ou neutralização), moduladores de ocorrência natural e moduladores de molécula pequena. Anticorpos contra domínios da proteína PCSK9c poderiam ser usados como agentes de diagnóstico de distúrbios metabólicos de lípido, incluindo hipercolesterolemia, entre outros. 0 nível de expressão de PCSK9c também pode ser útil como um biomarcador para predizer quais pacientes podem estar em risco de desenvolver hipercolesterolemia, e/ou aqueles pacientes que pode estar em risco de sendo excessivamente sensível a terapêutica com estatina.

Polipéptidos e polinucleótidos de PCSK9c têm utilizações adicionais que incluem diagnosticar doenças relacionadas com a super e/ou subexpressão de PCSK9c identificando mutações no gene PCSK9c utilizando sequências de PCSK9c como sondas ou determinando proteína PCSK9c ou níveis de expressão de ARNm. Os polipéptidos PCSK9c podem ser úteis para o rastreio de compostos que afetam a atividade da proteína. Péptidos PCSK9c podem também ser usados para a geração de anticorpos específicos e como isca em rastreios de híbrido de duas leveduras para encontrar proteínas que especificamente interagem com PCSK9c (descrito em qualquer lugar no presente documento).

Também são descritos no presente documento polinucleótidos que compreendem, ou alternativamente que consistem em, uma sequência que codifica os seguintes polipéptidos de deleção PCSK9c N-terminal: M1-Q523, S2- Q523, P3-Q523, W4-Q523, K5-Q523, D6-Q523, G7- Q523, G8-Q52 3, S9-Q523, L10-Q523, V11-Q523, E12-Q523, V13-Q523, Y14-Q52 3, L15-Q523, L16-Q523, D17-Q523, T18-Q523, S19-Q523, 120-Q523, Q21-Q523, S22-Q523, D23-Q523, H24-Q523, R25-Q523, E26-Q523, 127-Q523, E28- Q523, G29-Q523, R30-Q523, V31-Q523, M32-Q52 3, V33-Q523, T34-Q523, D35-Q523, F36-Q523, E37-Q523, N38- Q523, V39-Q523, P40-Q523, E41-Q523, E42-Q52 3, D43-Q523, G44-Q523, T45-Q523, R46-Q523, F47-Q523, H48-Q523, R49-Q523, Q50-Q523, A51-Q523, S52-Q523, K53-Q523, C54-Q523, D55-Q523, S56-Q523, H57-Q523, G58-Q523, T59-Q523, H60-Q523, L61-Q523, A62-Q523, G63-Q523, V64-Q523, V65-Q523, S66-Q523, G67-Q523, R68-Q523, D69-Q523, A70-Q523, G71-Q523, V72-Q523, A73-Q523, K74-Q523, G75-Q523, A76-Q523, S77-Q523, M78-Q523, R79-Q523, S80-Q523, L81-Q523, R82-Q523, V83-Q523, L84-Q523, N85-Q523, C86-Q523, Q87-Q523, G88-Q523, K89-Q523, G90-Q523, T91-Q523, V92-Q523, S93-Q523, G94-Q523, T95-Q523, L96-Q523, I97-Q523, G98- Q523, L99-Q523, E100-Q523, F101-Q52 3, 1102-Q523, R103-Q523, K104-Q523, S105-Q523, Q106-Q52 3, L107-Q523, V108-Q523, Q109-Q523, P110-Q523, Vlll-Q523, G112-Q523, P113-Q523, L114-Q523, V115-Q523, V116-Q52 3, L117-Q523, L118-Q523, P119-Q523, L120-Q523, A121-Q52 3, G122-Q523, G123-Q523, Y124-Q523, S125-Q523, R126-Q52 3, V127-Q523, L128-Q523, N129-Q523, A130-Q523, A131-Q52 3, C132-Q523, Q133-Q523, R134-Q523, L135-Q523, A136-Q523, R137-Q523, A138-Q523, G139-Q523, V140-Q523, V141-Q52 3, L142-Q523, V143-Q523, T144-Q523, A145-Q523, A146-Q52 3, G147-Q523, N148-Q523, F149-Q523, R150-Q523, D151-Q523, D152-Q523, A153-Q523, C154-Q523, L155-Q523, Y156-Q52 3, S157-Q523, P158-Q523, A159-Q523, S160-Q523, A161-Q52 3, P162-Q52 3, E163-Q523, V164-Q523, I165-Q523, T166-Q523, V167-Q523, G168-Q523, A169-Q523, T170-Q523, N171-Q52 3, A172-Q523, Q173-Q523, D174-Q523, Q175-Q523, P176-Q52 3, V177-Q523, T178-Q523, L179-Q523, G180-Q523, T181-Q52 3, L182-Q523, G183-Q523, T184-Q523, N185-Q523, F186-Q52 3, G187-Q523, R188-Q523, C189-Q523, V190-Q523, D191- Q523, L192-Q523, F193-Q523, A194-Q523, P195-Q523, G196- Q52 3, El97-Q52 3, D198-Q523, 1199-Q523, 1200-Q523, G201- Q52 3, A202-Q523, S203-Q523, S204-Q523, D205-Q523, C206- Q52 3, S207-Q523, T208-Q523, C209-Q523, F210-Q523, V211- Q52 3, S212-Q523, Q213-Q523, S214-Q523, G215-Q523, T216- Q523, S217-Q523, Q218-Q523, A219-Q523, A220-Q523, A221- Q52 3, H222-Q523, V223-Q523, A224-Q523, G225- Q523, 1226- Q52 3, A227-Q523, A228-Q523, M229-Q523, M230-Q523, L231- Q523, S232-Q523, A233-Q523, E234- Q523, P235-Q523, E236- Q52 3, L237-Q523, T238-Q523, L239-Q523, A240-Q523, E241- Q52 3, L242-Q523, R243- Q523, Q244-Q523, R245-Q523, L246- Q52 3, I247-Q523, H248-Q523, F249-Q523, S250-Q523, A251- Q523, K252- Q523, D253-Q523, V254-Q523, I255-Q523, N256- Q523, E257-Q523, A258-Q523, W259-Q523, F260-Q523, P261- Q52 3, E262-Q523, D263-Q523, Q264-Q523, R265-Q523, V266- Q52 3, L267-Q523, T268-Q523, P269-Q523, N270- Q523, L271- Q523, V272-Q523, A273-Q523, A274-Q523, L275-Q523, P276- Q52 3, P277-Q523, S278-Q523, T279- Q523, H280-Q523, G281- Q52 3, A282-Q523, G283-Q523, W284-Q523, Q285-Q523, L286- Q523, F287-Q523, C288- Q523, R289-Q523, T290-Q523, V291- Q52 3, W292-Q523, S293-Q523, A294-Q523, H295-Q523, S296- Q52 3, G297- Q523, P298-Q523, T299-Q523, R300-Q523, M301- Q52 3, A302-Q523, T303-Q523, A304-Q523, I305-Q523, A306- Q52 3, R307-Q523, C308-Q523, A309-Q523, P310-Q523, D311- Q523, E312-Q523, E313-Q523, L314-Q523, L315- Q523, S316- Q52 3, C317-Q523, S318-Q523, S319-Q523, F320-Q523, S321- Q52 3, R322-Q523, S323-Q523, G324- Q523, K325-Q523, R326- Q523, R327-Q523, G328-Q523, E329-Q523, R330-Q523, M331- Q52 3, E332-Q523, A333- Q523, Q334-Q523, G335-Q523, G336- Q52 3, K337-Q523, L338-Q523, V339-Q523, C340-Q523, R341- Q523, A342- Q523, H343-Q523, N344-Q523, A345-Q523, F346- Q52 3, G347-Q523, G348-Q523, E349-Q523, G350-Q523, V351- Q523, Y352-Q523, A353-Q523, I354-Q523, A355-Q523, R356- Q523, C357-Q523, C358-Q523, L359-Q523, L360- Q523, P361- Q523, Q362-Q523, A363-Q523, N364-Q523, C365-Q523, S366- Q523, V367-Q523, H368-Q523, T369- Q523, A370-Q523, P371- Q523, P372-Q523, A373-Q523, E374-Q523, A375-Q523, S376- Q52 3, M377-Q523, G378- Q523, T379-Q523, R380-Q523, V381- Q52 3, H382-Q523, C383-Q523, H384-Q523, Q385-Q523, Q386- Q52 3, G387- Q523, H388-Q523, V389-Q523, L390-Q523, T391- Q523, G392-Q523, C393-Q523, S394-Q523,- S395-Q523, H396- Q52 3, W397-Q523, E398-Q523, V399-Q523, E400-Q523, D401- Q52 3, L402-Q523, G403-Q523, T404-Q523, H405- Q523, K406- Q523, P407-Q523, P408-Q523, V409-Q523, L410-Q523, R411- Q52 3, P412-Q523, R413-Q523, G414- Q523, Q415-Q523, P416- Q52 3, N417-Q523, Q418-Q523, C419-Q523, V420-Q523, G421- Q52 3, H422-Q523, R423- Q523, E424-Q523, A425-Q523, S426- Q52 3, I427-Q523, H428-Q523, A429-Q523, S430-Q523, C431- Q523, C432- Q523, H433-Q523, A434-Q523, P435-Q523, G436- Q52 3, L437-Q523, E438-Q523, C439-Q523, K440-Q523, V441- Q52 3, K442-Q523, E443-Q523, H444-Q523, G445-Q523, 1446- Q523, P447-Q523, A448-Q523, P449-Q523, Q450- Q523, E451- Q523, Q452-Q523, V453-Q523, T454-Q523, V455-Q523, A456- Q52 3, C457-Q523, E458-Q523, E459- Q523, G460-Q523, W461- Q523, T462-Q523, L463-Q523, T464-Q523, G465-Q523, C466- Q52 3, S467-Q523, A468- Q523, L469-Q523, P470-Q523, G471- Q52 3, T472-Q523, S473-Q523, H474-Q523, V475-Q523, L476- Q52 3, G477- Q523, A478-Q523, Y479-Q523, A480-Q523, V481- Q52 3, D482-Q523, N483-Q523, T484-Q523, C485-Q523, V486- Q523, V487-Q523, R488-Q523, S489-Q523, R490-Q523, D491- Q52 3, V492-Q523, S493-Q523, T494-Q523, T495- Q523, G496- Q52 3, S497-Q523, T498-Q523, S499-Q523, E500-Q523, G501- Q523, A502-Q523, V503-Q523, T504- Q523, A505-Q523, V506- Q523, A507-Q523, I508-Q523, C509-Q523, C510-Q523, R511- Q523, S512-Q523, R513- Q523, FI514-Q523, L515-Q523, A516- Q523, e/ou Q517-Q523 da SEQ ID NO:4. Sequências polipeptídicas codificadas por estes polinucleótidos são também descritas no presente documento. Além disso, um polipéptido que é pelo menos tão longo como qualquer um dos polipéptidos mencionados anteriormente é descrito no presente documento. Estes polipéptidos de deleção PCSK9c N-terminal podem ser usados como epítopos imunogénicos e/ou antigénicos como descritos em qualquer lugar no presente documento.

Também são descritos no presente documento polinucleótidos que compreendem, ou alternativamente que consistem em, uma sequência que codifica os seguintes polipéptidos de deleção PCSK9c C-terminal: M1-Q523, Ml-L522, M1-E521, M1-Q520, M1-S519, M1-A518, Ml- Q517, Ml-A516, M1-L515, M1-H514, M1-R513, M1-S512, M1-R511, M1-C510, M1-C509, MI-1508, M1-A507, M1-V506, M1-A505, M1-T504, Ml-V503, M1-A502, M1-G501, M1-E500, M1-S499, M1-T498, M1-S497, M1-G496, M1-T495, MI- 1494, M1-S493, M1-V492, M1-D491, Ml-R490, M1-S489, M1-R488, M1-V487, M1-V486, M1-C485, M1-T484, M1-N483, M1-D482, M1-V481, M1-A480, M1-Y479, M1-A478, Ml-G477, M1-L476, M1-V475, M1-H474, M1-S473, MI-1472, M1-G471, M1-P470, M1-L469, M1-A468, M1-S467, M1-C466, M1-G465, Ml-T464, M1-L463, M1-T462, M1-W461, M1-G460, M1-E459, M1-E458, M1-C457, M1-A456, M1-V455, M1-T454, M1-V453, M1-Q452, Ml-E451, MI-0450, M1-P449, M1-A448, M1-P447, MI-1446, M1-G445, M1-H444, M1-E443, M1-K442, M1-V441, M1-K440, M1-C439, Ml-E438, M1-L437, M1-G436, M1-P435, M1-A434, M1-H433, M1-C432, M1-C431, M1-S430, M1-A429, M1-H428, MI- 1427, M1-S426, Ml-A425, M1-E424, M1-R423, M1-H422, M1-G421, M1-V420, M1-C419, M1-Q418, M1-N417, Ml- P416, M1-Q415, M1-G414, M1-R413, Ml-P412, M1-R411, M1-L410, M1-V409, M1-P408, M1-P407, M1-K406, Ml- H405, M1-T404, M1-G403, M1-L402, M1-D401, M1-E400, Ml-V399, M1-E398, M1-W397, M1-H396, M1-S395, MI- 3394, Ml-C393, M1-G392, M1-T391, M1-L390, M1-V389, M1-H388, M1-G387, M1-Q386, M1-Q385, M1-H384, MI- 0383, M1-H382, M1-V381, Ml-R380, M1-T379, M1-G378, M1-M377, M1-S376, M1-A375, M1-E374, M1-A373, Ml- P372, M1-P371, M1-A370, M1-T369, M1-H368, Ml-V367, M1-S366, M1-C365, M1-N364, M1-A363, M1-Q362, Ml-P361, M1-L360, M1-L359, M1-C358, M1-C357, M1-R356, M1-A355, MI-1354, M1-A353, M1-Y352, M1-V351, M1-G350, M1-E349, Ml- G34 8, M1-G347, M1-F346, M1-A345, M1-N344, M1-H343, M1-A342, M1-R341, M1-C340, M1-V339, Ml- L338, M1-K337, M1-G336, Ml-G335, M1-Q334, M1-A333, M1-E332, M1-M331, M1-R330, M1-E329, M1-G328, Ml- R327, M1-R326, M1-K325, M1-G324, M1-S323, Ml-R322, M1-S321, M1-F320, M1-S319, M1-S318, M1-C317, M1-S316, M1-L315, M1-L314, M1-E313, M1-E312, M1-D311, M1-P310, Ml-A309, M1-C308, M1-R307, M1-A306, MI-1305, M1-A304, M1-T303, M1-A302, M1-M301, M1-R300, M1-T299, M1-P298, M1-G297, Ml-S296, M1-H295, M1-A294, MI-5293, M1-W292, M1-V291, M1-T290, M1-R289, M1-C288, M1-F287, M1-L286, M1-Q285, M1-W284, Ml-G283, Ml- A282, M1-G281, M1-H280, M1-T279, M1-S278, Ml-P277, M1-P276, M1-L275, M1-A274, M1-A273, M1-V272, M1-L271, M1-N270, M1-P269, M1-T268, M1-L267, M1-V266, M1-R265, Ml-Q264, M1-D263, M1-E262, M1-P261, M1-F260, Ml- W259, Ml-A258, M1-E257, M1-N256, MI-1255, M1-V254, M1-D253, M1-K252, M1-A251, M1-S250, M1-F249, M1-FI248, MI-1247, M1-L246, Ml-R245, M1-Q244, M1-R243, M1-L242, M1-E241, M1-A240, M1-L239, M1-T238, M1-L237, Ml- E236, MI-P235, MI-E234, MI-A233, MI-3232, MI-L231, MI-M230, MI-M229, MI-A228, MI-A227, MI -1226, MI-G225, M1-A224, M1-V223, M1-H222, M1-A221, M1-A220, M1-A219, M1-Q218, M1-S217, M1-T216, M1-G215, M1-S214, MI-0213, M1-S212, M1-V211, M1-F210, M1-C209, M1-T208, M1-S207, M1-C206, M1-D205, M1-S204, M1-S203, Ml- A202, M1-G201, MI-1200, MI-1199, M1-D198, M1-E197, M1-G196, M1-P195, M1-A194, M1-F193, M1-L192, M1-D191, M1-V190, M1-C189, M1-R188, Ml-G187, M1-F186, M1-N185, M1-T184, M1-G183, M1-L182, M1-T181, M1-G180, Ml- L17 9, M1-T178, M1-V177, M1-P176, M1-Q175, Ml-D174, M1-Q173, M1-A172, M1-N171, M1-T170, M1-A169, Ml-G168, M1-V167, M1-T166, MI-1165, M1-V164, M1-E163, M1-P162, M1-A161, M1-S160, M1-A159, M1-P158, M1-S157, M1-Y156, Ml-L155, M1-C154, M1-A153, M1-D152, M1-D151, M1-R150, M1-F149, M1-N148, M1-G147, M1-A146, Ml- A1 45, MI-T1 44, MI-VI43, MI—LI 42, MI-VI41, MI-VI40, MI-GI39, MI-A1 38, MI-RI37, MI-A1 36, MI—LI 35, MI-RI34, M1-Q133, M1-C132, M1-A131, Ml-A130, M1-N129, M1-L128, M1-V127, M1-R126, M1-S125, M1-Y124, M1-G123, MI- 6122, M1-A121, M1-L120, M1-P119, M1-L118, Ml-L117, M I-Vl 16, M1-V115, MI-L114, MI-P113, Ml-Gl 12, Ml-Vlll, MI-P110, M1-Q109, M1-V108, M1-L107, M1-Q106, M1-S105, M1-K104, M1-R103, MI-1102, M1-F101, Ml-ElOO, Ml- L99, Ml-G98, MI-197, M1-L96, M1-T95, M1-G94, M1-S93, M1-V92, Ml-T91, M1-G90, M1-K89, M1-G88, M1-Q87, MI- 086, M1-N85, Ml-L84, M1-V83, M1-R82, M1-L81, M1-S80, M1-R79, M1-M78, Ml-S77, M1-A76, M1-G75, M1-K74, Ml- A73, M1-V72, M1-G71, Ml-A70, M1-D69, M1-R68, M1-G67, M1-S66, M1-V65, M1-V64, Ml-G63, M1-A62, M1-L61, M1-H60, M1-T59, M1-G58, M1-H57, Ml-S56, M1-D55, M1-C54, M1-K53, M1-S52, M1-A51, M1-Q50, Ml-R49, M1-H48, M1-F47, M1-R46, M1-T45, M1-G44, M1-D43, Ml-E42, M1-E41, M1-P40, M1-V39, M1-N38, M1-E37, M1-F36, Ml-D35, M1-T34, M1-V33, M1-M32, M1-V31, M1-R30, M1-G29, Ml-E28, MI-127, M1-E26, M1-R25, M1-H24, M1-D23, M1-S22, Ml-Q21, MI-120, M1-S19, M1-T18, M1-D17, M1-L16, M1-L15, Ml-Y14, M1-V13, M1-E12, Ml-Vll, MI-LIO, M1-S9, M1-G8, e/ou Ml-G7 da SEQ ID NO:4. Sequências polipeptídicas codificadas por estes polinucleótidos são também descritas no presente documento. Além disso, um polipéptido que é pelo menos tão longo como qualquer um dos polipéptidos mencionados anteriormente é descrito no presente documento. Estes polipéptidos de deleção PCSK9c C-terminal podem ser usados como epitopos imunogénicos e/ou antigénicos como descritos em qualquer lugar no presente documento.

Polipéptidos que compreendem sequências polipeptidicas que correspondem a, por exemplo, regiões internas do polipéptido de PCSK9c (por exemplo, qualquer combinação de tanto deleções polipéptido de PCSK9c N como C-terminal) da SEQ ID NO:4 são descritos no presente documento. Por exemplo, regiões internas poderiam ser definidas pela equação: aminoácido NX para aminoácido CX, em que NX refere-se a qualquer aminoácido de polipéptido de deleção N-terminal de PCSK9c (SEQ ID NO:4), e onde CX refere-se a qualquer aminoácido de polipéptido de deleção C-terminal de PCSK9c (SEQ ID NO:4). Polinucleótidos que codificam estes polipéptidos são também descritos no presente documento. Estes polipéptidos podem ser usados como um epítopo imunogénico e/ou antigénico como descrito em qualquer lugar no presente documento.

Também são descritos no presente documento epítopos imunogénicos e/ou antigénicos do polipéptido de PCSK9c.

Muitas sequências polinucleotidicas, tal como sequências EST, estão publicamente disponíveis e acessíveis através de bases de dados de sequência. Algumas destas sequências são relacionadas com a SEQ ID NO: 3 e pode ter estado publicamente disponível antes de conceção da presente invenção. Preferentemente, tais polinucleótidos relacionados são especificamente excluídos do âmbito da presente invenção. Para listar cada sequência relacionada seria inconveniente. Consequentemente, estão preferentemente excluído da presente invenção um ou mais polinucleótidos que consistem em uma sequência nucleotídica descrita pela fórmula geral de a-b, onde a é qualquer número inteiro entre 1 e 3742 da SEQ ID NO:3, b é um número inteiro entre 15 e 3756, onde tanto a como b correspondem às posições de resíduos de nucleótido mostrado na SEQ ID NO:3, e onde b é superior ou igual a a+14.

Características do polipéptido Codificado por Polinucleótido No:3

Além disso, uma truncagem de N-terminal de PCSK9 (SEQ ID NO: 5) é descrito no presente documento, em que a dita truncagem de N-terminal resulta na deleção de qualquer lugar entre cerca de 1 e cerca de 218 aminoácidos a partir da terminação N da SEQ ID NO: 5, e em que a dita truncagem de N-terminal resulta em atividade biológica de PCSK9 elevada, incluindo, mas não limitado a níveis de proteína LDLR diminuída, e/ou captação de LDL diminuída por LDLR. Polinucleótidos que codificam tal truncagens de PCSK9 são proporcionados como SEQ ID NO:38. os inventores são os primeiros a descobrir que as truncagens N-terminais de PCSK9 resultam em níveis elevados de atividade biológica de PCSK9. Tais formas truncadas podem também enormemente facilitar a identificação de moduladores de molécula pequena de PCSK9 também. Experiências projetadas para avaliar se a truncagem da terminação N de PCSK9 resulta em atividade biológica elevada foram realizadas. Por exemplo, a truncagem da terminação N por 15 aminoácidos resultou em aumentos significantes em atividade de PCSK9 (dados não mostrados), embora não tão significante como aquela observada para os variantes de PCSK9b e PCSK9c (veja-se as Figuras 9A-B). Além disso, a truncagem foi tolerado por PCSK9 até uma truncagem de cerca de 218 aminoácidos, após o que os níveis diminuídos de atividade biológica de PCSK9 foram observados (dados não mostrados).

Além disso, uma truncagem de N-terminal de PCSK9 (SEQ ID NO: 5) é descrito no presente documento, em que a dita truncagem de N-terminal resulta na deleção de qualquer lugar entre cerca de 1 e cerca de 218 aminoácidos a partir da terminação N da SEQ ID NO:5, incluindo, mas não limitado a níveis de proteína LDLR diminuída e/ou captação de LDL diminuída por LDLR, e em que a dita atividade biológica de PCSK9 elevada é pelo menos cerca de 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 100 %, ou mais que a atividade biológica de PCSK9 elevada de tipo selvagem. Neste contexto, o termo "cerca de" deve ser interpretado como significando qualquer lugar entre 1, 2, 3, 4, ou 5 por cento mais ou inferior à quantidade citada. Alternativamente, a dita atividade biológica de PCSK9 elevada pode ser pelo menos cerca de lx, 2x, 3x, 4x, 5x, 6x, 7x, 8x, 9x, ou lOx mais que a atividade biológica de PCSK9 de tipo selvagem. Neste contexto, o termo "cerca de" deve ser interpretado como significando qualquer lugar entre 0,lx, 0,2x, 0,3x, 0,4x, 0,5x, 0,6x, 0,7x, 0,8x, ou 0,9x mais ou inferior à quantidade citada.

Preferentemente, um N-terminal deleção mutant de PCSK9 (SEQ ID NO: 5) é pelo menos cerca de 15 aminoácidos, mas inferior a cerca de 218 aminoácidos, da SEQ ID NO:5. Formas truncadas de PCSK9 podem ser criadas utilizando técnicas de biologia molecular (veja-se Exemplo 13), clivagem proteolitica, processamento pós-traducional, síntese química, etc., entre outros métodos conhecidos na técnica. A região codificante de PCSK9 que codifica polinucleótidos é representada pelos nucleótidos 292 a 2367 da SEQ ID NO :38.

Também são descritos no presente documento polinucleótidos que compreendem, ou alternativamente que consistem em, uma sequência que codifica os seguintes polipéptidos de deleção PCSK9c N-terminal: M1-Q692, G2-Q692, T3-Q692, V4-Q692, S5-Q692, S6-Q692, R7- Q692, R8-Q692, S9-Q692, W10-Q692, W11-Q692, P12-Q692, L13-Q692, P14-Q692, L15-Q692, L16-Q692, L17-Q692, L18-Q692, L19-Q692, L20-Q692, L21-Q692, L22-Q692, L23-Q692, G24-Q692, P25-Q692, A26-Q692, G27-Q692, A28- Q692, R29-Q692, A30-Q692, Q31-Q692, E32-Q692, D33-Q692, E34-Q692, D35-Q692, G36-Q692, D37-Q692, Y38- Q692, E39-Q692, E40-Q692, L41-Q692, V42-Q692, L43-Q692, A44-Q692, L45-Q692, R46-Q692, S47-Q692, E48- Q692, E49-Q692, D50-Q692, G51-Q692, L52-Q692, A53-Q692, E54-Q6 92, A55-Q692, P56-Q692, E57-Q692, H58- Q692, G59-Q692, T60-Q692, T61-Q692, A62-Q692, T63-Q692, F64-Q692, H65-Q6 92, R66-Q692, C67-Q692, A68- Q692, K69-Q692, D70-Q692, P71-Q692, W72-Q692, R73-Q692, L74-Q692, P75-Q692, G76-Q692, T77-Q692, Y78- Q692, V79-Q692, V80-Q692, V81-Q692, L82-Q692, K83-Q692, E84-Q692, E85-Q692, T86-Q692, H87-Q692, L88- Q692, S89-Q692, Q90-Q692, S91-Q692, E92-Q692, R93-Q6 92, T94—Q692, A95—Q692, R96—Q692, R97—Q692, L98- Q692, Q99-Q692, A100-Q692, Q101-Q692, A102-Q692, A103-Q692, R104-Q692, R105-Q692, G106-Q692, Y107- Q692, LI08- Q692, T109-Q692, K110-Q692, 1111-Q692, L112-Q692, H113- Q692, V114-Q692, F115-Q692, H116-Q692, G117-Q692, L118- Q692, L119-Q692, P120-Q692, G121-Q692, F122-Q692, L123- Q692, V124-Q6 92, K125-Q692, M126-Q692, 5127-Q692, G128- Q692, D129-Q692, L130-Q692, L131-Q692, E132-Q692, L133- Q692, A134-Q6 92, L135-Q692, K136-Q692, L137-Q692, P138- Q692, H139-Q692, V140-Q692, D141-Q692, Y142- Q692, 1143- Q692, E144-Q6 92, E145-Q692, D146-Q692, S147-Q692, S148- Q692, V149-Q692, F150-Q692, A151-Q692, Q152-Q692, S153- Q692, 1154-Q6 92, P155-Q692, W156-Q692, N157-Q692, L158- Q692, E159-Q692, R160-Q692, 1161-Q692, T162- Q692, P163- Q6 92, PI64-Q6 92, R165—Q692, Y166—Q692, R167—Q692, A168 — Q692, D169-Q692, E170-Q692, Y171- Q692, Q172-Q692, P173- Q692, P174-Q692, D175-Q692, G176-Q692, G177-Q692, S178- Q692, L179-Q692, V180- Q692, E181-Q692, V182-Q692, L183- Q692, L184-Q692, L185-Q692, D186-Q692, T187-Q692, SI 88- Q692, 1189-Q692, Q190-Q692, S191-Q692, D192-Q692, H193- Q692, R194-Q692, E195-Q692, I196-Q692, E197-Q692, G198- Q692, R199-Q692, V200-Q692, M201-Q692, V202-Q692, T203- Q6 92, D204-Q692, F205-Q692, E206-Q692, N207-Q692, V208- Q692, P209-Q692, E210-Q692, E211-Q692, D212-Q692, G213- Q692, T214-Q692, R215-Q692, F216-Q692, H217-Q692, R218- Q6 92, Q219-Q692, A220-Q692, S221-Q692, K222-Q692, C223- Q692, D224-Q6 92, S225-Q692, H226-Q692, G227-Q692, T228- Q692, H229-Q692, L230-Q692, A231-Q692, G232-Q692, V233- Q692, V234-Q6 92, S235-Q692, G236-Q692, R237-Q692, D238- Q692, A239-Q692, G240-Q692, V241-Q692, A242-Q692, K243- Q692, G244-Q6 92, A245-Q692, S246-Q692, M247-Q692, R248- Q692, S249-Q692, L250-Q692, R251-Q692, V252-Q692, L253- Q692, N254-Q6 92, C255-Q692, Q256-Q692, G257-Q692, K258- Q6 92, G259-Q692, T260-Q692, V261-Q692, S262-Q692, G263- Q692, T2 64-Q6 92, L265—Q692, 1266—Q692, G267—Q692, L268 — Q692, E269-Q692, F270-Q692, 1271- Q692, R272-Q692, K273- Q692, S274-Q692, Q275-Q692, L276-Q692, V277-Q692, Q278- Q692, P279-Q692, V280- Q692, G281-Q692, P282-Q692, L283- Q692, V284-Q692, V285-Q692, L286-Q692, L287-Q692, P288- Q692, L289- Q692, A290-Q692, G291-Q692, G292-Q692, Y293- Q692, S294-Q692, R295-Q692, V296-Q692, L297-Q692, N298- Q692, A299-Q692, A300-Q692, C301-Q692, Q302-Q692, R303- Q692, L304-Q6 92, A305-Q692, R306-Q692, A307- Q692, G308- Q692, V309-Q692, V310-Q692, L311-Q692, V312-Q692, T313- Q692, A314-Q6 92, A315-Q692, G316- Q692, N317-Q692, F318- Q692, R319-Q692, D320-Q692, D321-Q692, A322-Q692, C323- Q692, L324-Q6 92, Y325- Q692, S326-Q692, P327-Q692, A328- Q692, S329-Q692, A330-Q692, P331-Q692, E332-Q692, V333- Q692, 1334- Q692, T335-Q692, V336-Q692, G337-Q692, A338- Q6 92, T339-Q692, N340-Q692, A341-Q692, Q342-Q692, D343- Q692, Q344-Q6 92, P345-Q692, V346-Q692, T347-Q692, L348- Q692, G349-Q692, T350-Q692, L351-Q692, G352- Q692, T353- Q692, N354-Q6 92, F355-Q692, G356-Q692, R357-Q692, C358- Q692, V359-Q692, D360-Q692, L361-Q692, F362-Q692, A363- Q692, P364-Q692, G365-Q692, E366-Q692, D367-Q692, 1368— Q692, 1369-Q692, G370-Q692, A371-Q692, S372-Q692, S373- Q692, D37 4-Q6 92, C375-Q692, S376-Q692, T377-Q692, C378- Q6 92, F379-Q692, V380-Q692, S381-Q692, Q382-Q692, S383- Q692, G384-Q6 92, T385-Q692, S386-Q692, Q387-Q692, A388- Q692, A389-Q692, A390-Q692, H391-Q692, V392-Q692, A393- Q6 92, G394-Q692, I395-Q692, A396-Q692, A397-Q692, M398- Q692, M399-Q692, L400-Q692, S401-Q692, A402-Q692, E403- Q692, P404-Q692, E405-Q692, L406-Q692, T407-Q692, L408- Q692, A409-Q692, E410-Q692, L411-Q692, R412-Q692, Q413- Q692, R414-Q692, L415-Q692, 1416- Q692, H417-Q692, F418- Q692, S419-Q692, A420-Q692, K421-Q692, D422-Q692, V423- Q692, I424-Q6 92, N425- Q692, E426-Q692, A427-Q692, W428- Q692, F429-Q692, P430-Q692, E431-Q692, D432-Q692, Q433- Q6 92, R434- Q692, V435-Q692, L436-Q692, T437-Q692, P438- Q692, N439-Q692, L440-Q692, V441-Q692, A442-Q692, A443- Q692, L444-Q6 92, P445-Q692, P446-Q692, S447-Q692, T448- Q692, H449-Q692, G450-Q692, A451-Q692, G452- Q692, W453- Q692, Q454-Q6 92, L455-Q692, F456-Q692, C457-Q692, R458- Q692, T459-Q692, V460-Q692, W461- Q692, S462-Q692, A463- Q692, H4 64-Q6 92, S465—Q692, G466—Q692, P467—Q692, T468 — Q692, R469-Q692, M470- Q692, A471-Q692, T472-Q692, A473- Q692, V474-Q692, A475-Q692, R476-Q692, C477-Q692, A478- Q692, P479- Q692, D480-Q692, E481-Q692, E482-Q692, L483- Q692, L484-Q692, S485-Q692, C486-Q692, S487-Q692, S488- Q692, F489-Q692, S490-Q692, R491-Q692, S492-Q692, G493- Q692, K494-Q692, R495-Q692, R496-Q692, G497- Q692, E498- Q692, R499-Q692, M500-Q692, E501-Q692, A502-Q692, Q503- Q692, G504-Q6 92, G505-Q692, K506- Q692, L507-Q692, V508- Q692, C509-Q692, R510-Q692, A511-Q692, H512-Q692, N513- Q6 92, A514-Q6 92, F515- Q692, G516-Q692, G517-Q692, E518- Q692, G519-Q692, V520-Q692, Y521-Q692, A522-Q692, 1523- Q692, A524- Q692, R525-Q692, C526-Q692, C527-Q692, L528- Q692, L529-Q692, P530-Q692, QS31-Q692, A532-Q692, N533- Q692, C534-Q6 92, S535-Q692, V536-Q692, H537-Q692, T538- Q692, A539-Q692, P540-Q692, P541-Q692, A542- Q692, E543- Q692, A544-Q6 92, S545-Q692, M546-Q692, G547-Q692, T548- Q692, R549-Q692, V550-Q692, H551- Q692, C552-Q692, H553- Q692, Q554-Q692, Q555-Q692, G556-Q692, H557-Q692, V558- Q692, L559-Q692, T560- Q692, G561-Q692, C562-Q692, S563- Q692, S564-Q692, H565-Q692, W566-Q692, E567-Q692, V568- Q6 92, E569- Q692, D570-Q692, L571-Q692, G572-Q692, T573- Q692, H57 4-Q6 92, K575-Q692, P576-Q692, P577-Q692, V578- Q692, L579-Q692, R580-Q692, P581-Q692, R582-Q692, G583- Q692, Q584-Q692, P585-Q692, N586-Q692, Q587- Q692, C588- Q692, V589-Q692, G590-Q692, H591-Q692, R592-Q692, E593- Q692, A594-Q692, S595-Q692, 1596- Q692, H597-Q692, A598- Q692, S599-Q692, C600-Q692, C601-Q692, H602-Q692, A603- Q692, P604-Q692, G605- Q692, L606-Q692, E607-Q692, C608- Q6 92, K609-Q692, V610-Q692, K611-Q692, E612-Q692, H613- Q692, G614- Q692, I615-Q692, P616-Q692, A617-Q692, P618- Q692, Q619-Q692, E620-Q692, Q621-Q692, V622-Q692, T623- Q692, V624-Q6 92, A625—Q692, C626—Q692, E627—Q692, E628 — Q692, G629-Q692, W630-Q692, T631-Q692, L632- Q692, T633- Q692, G634-Q692, C635-Q692, S636-Q692, A637-Q692, L638-Q692, P639-Q692, G640-Q692, T641- Q692, S642-Q692, H643-Q692, V644-Q6 92, L645—Q692, G646—Q692, A647—Q692, Y648 — Q692, A64 9-Q6 92, V650— Q692, D651—Q692, N652—Q692, T653 — Q692, C654-Q692, V655-Q692, V656-Q692, R657-Q692, S658-Q692, R65 9- Q692, D660—Q692, V661—Q692, S662—Q692, T663 — Q692, T664-Q692, G665-Q692, S666-Q692, T667-Q692, S668-Q692, E 6 6 9-Q6 92, G670—Q692, A671—Q692, V672—Q692, T673 — Q692, A67 4-Q6 92, V675-Q692, A676-Q692, 1677- Q692, C678-Q692, C679-Q692, R680-Q692, S681-Q692, R682-Q692, H683-Q692, L684-Q692, A685-Q692, e/ou Q686-Q692 da SEQ ID NO:5. Sequências polipeptídicas codificadas por estes polinucleótidos são também descritas no presente documento como SEQ ID NO: 38. Além disso, polinucleót idos que codificam um polipéptido que é pelo menos tão longo como qualquer um dos polipéptidos mencionados anteriormente são descritos no presente documento. Estes polipéptidos de deleção PCSK9c N-terminal podem ser usados como epítopos imunogénicos e/ou antigénicos como descritos em qualquer lugar no presente documento.

Também são descritos no presente documento polinucleótidos que compreendem, ou alternativamente que consistem em, uma sequência que codifica os seguintes polipéptidos de deleção PCSK9c C-terminal: M1-Q692, Ml-L691, M1-E690, M1-Q689, M1-S688, M1-A687, Ml- Q686, Ml-A685, M1-L684, M1-H683, M1-R682, M1-S681, M1-R680, M1-C679, M1-C678, MI-1677, M1-A676, Ml- V675, M1-A674, M1-T673, Ml-V672, M1-A671, M1-G670, M1-E669, M1-S668, M1-T667, M1-S666, M1-G665, Ml- T664, M1-T663, M1-S662, M1-V661, M1-D660, Ml-R659, M1-S658, M1-R657, M1-V656, M1-V655, M1-C654, Ml-T653, M1-N652, M1-D651, M1-V650, M1-A649, M1-Y648, M1-A647, M1-G646, M1-L645, M1-V644, M1-H643, MI- 5642, M1-T641, Ml-G64 0, M1-P639, M1-L638, M1-A637, M1-S636, M1-C635, M1-G634, M1-T633, M1-L632, M1-T631, M1-W630, M1-G629, M1-E628, Ml-E 62 7, M1-C626, M1-A625, M1-V624, M1-T623, M1-V622, M1-Q621, M1-E620, Ml- Q619, M1-P618, M1-A617, M1-P616, MI-1615, Ml-G614, M1-FI613, M1-E612, M1-K611, M1-V610, M1-K609, Ml-C608, M1-E607, M1-L606, M1-G605, M1-P604, M1-A603, M1-H602, M1-C601, M1-C600, M1-S599, M1-A598, M1-H597, MI- 1596, Ml-S595, M1-A594, M1-E593, M1-R592, M1-H591, M1-G590, M1-V589, M1-C588, M1-Q587, M1-N586, Ml- P585, M1-Q584, M1-G583, Ml-R582, M1-P581, M1-R580, M1-L579, M1-V578, M1-P577, M1-P576, M1-K575, Ml- H574, M1-T573, M1-G572, M1-L571, M1-D570, Ml-E569, M1-V568, M1-E567, M1-W566, M1-H565, M1-S564, MI-5563, M1-C562, M1-G561, M1-T560, M1-L559, M1-V558, M1-H557, M1-G556, M1-Q555, M1-Q554, M1-H553, Ml- C552, M1-H551, Ml-V550, M1-R549, M1-T548, M1-G547, M1-M546, M1-S545, M1-A544, M1-E543, M1-A542, Ml- P541, M1-P540, M1-A539, M1-T538, Ml-H537, M1-V536, M1-S535, M1-C534, M1-N533, M1-A532, M1-Q531, Ml- P530, M1-L529, M1-L528, M1-C527, M1-C526, M1-R525, Ml-A52 4, MI-1523, M1-A522, M1-Y521, M1-V520, M1-G519, M1-E518, M1-G517, M1-G516, M1-F515, M1-A514, M1-N513, M1-H512, Ml-A511, M1-R510, M1-C509, M1-V508, M1-L507, M1-K506, M1-G505, M1-G504, M1-Q503, M1-A502, M1-E501, M1-M500, M1-R499, Ml-E498, M1-G497, Ml- R496, M1-R495, M1-K494, M1-G493, Ml-S492, M1-R491, M1-S490, M1-F489, M1-S488, M1-S487, M1-C486, Ml- S485, M1-L484, M1-L483, M1-E482, M1-E481, M1-D480, Ml-P479, M1-A478, M1-C477, M1-R476, M1-A475, M1-V474, M1-A473, M1-T472, M1-A471, M1-M470, M1-R469, M1-T468, M1-P467, Ml-G466, M1-S465, M1-H464, M1-A463, Ml- S462, M1-W461, Ml-V460, M1-T459, M1-R458, M1-C457, M1-F456, M1-L455, M1-Q454, M1-W453, M1-G452, Ml- A451, M1-G450, M1-H449, M1-T448, Ml-S447, M1-P446, M1-P445, M1-L444, M1-A443, M1-A442, M1-V441, M1-L440, M1-N439, M1-P438, M1-T437, M1-L436, M1-V435, Ml-R434, M1-Q433, M1-D432, M1-E431, M1-P430, M1-F429, Ml-W42 8, M1-A427, M1-E426, M1-N425, MI-1424, M1-V423, M1-D422, M1-K421, M1-A420, M1-S419, M1-F418, M1-FI417, MI-1416, Ml-L415, M1-R414, M1-Q413, M1-R412, M1-L411, M1-E410, M1-A409, M1-L408, M1-T407, M1-L406, Ml- E405, M1-P404, M1-E403, Ml-A402, MI-S401, MI-L400, M1-M399, M1-M398, M1-A397, M1-A396,

Ml -1395, M1-G394, M1-A393, M1-V392, M1-H391, M1-A390, Ml-A389, M1-A388, M1-Q387, M1-S386, M1-T385, M1-G384, M1-S383, Ml- Q382, M1-S381, M1-V380, M1-F379, M1-C378, M1-T377, Ml-S37 6, M1-C375, M1-D374, M1-S373, M1-S372, Ml- A371, Ml-G37 0, MI-1369, MI-1368, M1-D367, M1-E366, M1-G365, M1-P364, M1-A363, M1-F362, M1-L361, M1-D360, M1-V359, M1-C358, Ml-R357, M1-G356, M1-F355, M1-N354, M1-T353, M1-G352, M1-L351, M1-T350, M1-G349, Ml- L348, M1-T347, M1-V346, M1-P345, Ml-Q344, M1-D343, M1-Q342, M1-A341, M1-N340, M1-T339, M1-A338, Ml- G337, M1-V336, M1-T335, Ml-1334, M1-V333, M1-E332, Ml-P331, M1-A330, M1-S329, M1-A328, M1-P327, M1-S326, M1-Y325, M1-L324, M1-C323, M1-A322, M1-D321, M1-D320, M1-R319, Ml-F318, M1-N317, M1-G316, M1-A315, MI- ASH, M1-T313, M1-V312, M1-L311, M1-V310, M1-V309, M1-G308, M1-A307, M1-R306, Ml-A305, M1-L304, M1-R303, M1-Q302, M1-C301, M1-A300, M1-A299, M1-N298, M1-L297, M1-V296, M1-R295, M1-S294, M1-Y293, Ml-G292, Ml- G291, M1-A290, M1-L289, M1-P288, M1-L287, Ml-L286, M1-V285, M1-V284, M1-L283, M1-P282, M1-G281, M1-V280, M1-P279, M1-Q278, M1-V277, M1-L276, M1-Q275, M1-S274, Ml-K273, M1-R272, MI-1271, M1-F270, M1-E269, Ml- L268, Ml-G267, Ml-1266, M1-L265, M1-T264, M1-G263, M1-S262, M1-V261, M1-T260, M1-G259, M1-K258, M1-G257, M1-Q256, M1-C255, Ml-N254, M1-L253, M1-V252, M1-R251, M1-L250, M1-S249, M1-R248, M1-M247, M1-S246, Ml- A245, M1-G244, M1-K243, M1-A242, Ml-V241, M1-G240, M1-A239, M1-D238, M1-R237, M1-G236, M1-S235, M1-V234, M1-V233, M1-G232, M1-A231, M1-L230, M1-H229, Ml-T228, M1-G227, M1-H226, M1-S225, M1-D224, M1-C223, M1-K222, M1-S221, M1-A220, M1-Q219, M1-R218, M1-H217, M1-F216, Ml-R215, M1-T214, M1-G213, M1-D212, M1-E211, M1-E210, M1-P209, M1-V208, M1-N207, M1-E206, M1-F205, M1-D204, M1-T203, Ml-V202, M1-M201, M1-V200, M1-R199, M1-G198, M1-E197, MI-1196, M1-E195, M1-R194, M1-H193, M1-D192, M1-S191-, Ml- Q190, MI-1189, M1-S188, M1-T187, M1-D186, M1-L185, MI-L184, M1-YI83, M1-VI82, M1-E181, M I-Vl 80, M1-L179, M1-S178, M1-G177, Ml-G176, M1-D175, M1-P174, M1-P173, M1-Q172, M1-Y171, M1-E170, M1-D169, M1-A168, Ml- R167, MI-1166, MI-R165, MI-P164, MI-P163, MI-T162, Ml-1161, MI-R160, MI-E159, MI-L158, MI-N157, MI-W156, M1-P155, MI-1154, M1-S153, M1-Q152, M1-A151, Ml-F150, M1-VI49, MI-S148, M1-S147, M1-D146, M1-E145, Ml-E144, MI-1143, M1-YI42, M1-D141, MI-V140, M1-H139, M1-P138, M1-L137, M1-K136, M1-L135, MI-A134, M1-L133, M1-E132, Ml-L131, M1-L130, M1-D129, M1-G128, M1-S127, M1-M126, M1-K125, M1-V124, M1-L123, M1-F122, Ml- G121, MI-P120, M1-L119, Ml-L118, M1-G117, M1-FI116, MI-F115, M1-V114, M1-FI113, Ml-L112, Ml-1111, MI-K1 10, M1-T109, M1-L108, M1-L107, Ml-G106, M1-R105, M1-R104, Ml-Al 03, Ml-Al 02, M1-Q101, Ml-Al 00, M1-Q99, Ml- L98, MI-R97, M1-R96, M1-A95, M1-T94, Ml-R93, M1-E92, M1-S91, M1-Q90, M1-S89, M1-L88, M1-H87, Ml-T86, Ml- E85, M1-E84, M1-K83, M1-L82, M1-V81, M1-V80, Ml-V79, M1-Y78, M1-T77, M1-G76, M1-P75, M1-L74, M1-R73, Ml-W72, M1-P71, M1-D70, M1-K69, M1-A68, M1-C67, M1-R66, Ml-H65, M1-F64, M1-T63, M1-A62, M1-T61, M1-T60, Ml- G59, Ml-F158, M1-E57, M1-P56, M1-A55, M1-E54, M1-A53, M1-L52, Ml-G51, M1-D50, M1-E49, M1-E48, M1-S47, Ml- R46, M1-L45, Ml-A44, M1-L43, M1-V42, M1-L41, M1-E40, M1-E39, M1-Y38, Ml-D37, M1-G36, M1-D35, M1-E34, Ml- D33, M1-E32, M1-Q31, Ml-A30, M1-R29, M1-A28, M1-G27, M1-A26, M1-P25, M1-G24, Ml-L23, M1-L22, M1-L21, Ml- L20, M1-L19, M1-L18, M1-L17, Ml-L16, M1-L15, M1-P14, M1-L13, M1-P12, Ml-Wll, M1-W10, M1-S9, M1-R8, e/ou M1-R7 oda SEQ ID NO:5. Sequências polipeptídicas codificadas por estes polinucleótidos são também descritas no presente documento como SEQ ID NO :38. Além disso, polinucleótidos que codificam um polipéptido que é pelo menos tão longo como qualquer um dos polipéptidos mencionados anteriormente são descritos no presente documento. Estes polipéptidos de deleção PCSK9c C-terminal podem ser usados como epitopos imunogénicos e/ou antigénicos como descritos em qualquer lugar no presente documento.

0 Quadro I resume a informação que corresponde a cada "Gene No." descrita acima. A sequência nucleotidica identificada como "NT SEQ ID NO:X" foi montado a partir de sequências parcialmente homólogas ("sobrepostos") obtidas a partir do "clone de ADNc ID" identificado no Quadro I e, em alguns casos, a partir de clones de ADN relacionados adicionais. As sequências sobrepostas foram montadas numa sequência contígua individual de alta redundância (normalmente diversas sequências sobrepostas em cada posição de nucleótido), resultante numa sequência final identificada como SEQ ID NO:X. 0 ID de Clone de ADNc foi depositado na data e dado o correspondente número de depósito listado no "Depósito ATCC® n°:Z e Data." "Vetor" refere-se ao tipo de vetor contido noID de Clone de ADNc. "NT Total Seq. De Clone" refere-se ao número de nucleótidos total no clone contíguo identificado por "Gene No." 0 clone depositado pode conter a totalidade ou quase da sequência da SEQ ID NO:X. A posição de nucleótido da SEQ ID NO:X do codão de início putativo (metionina) é identificado como "5' NT de Codão de início de ORF." A sequência de aminoácido traduzida, começando com a metionina, é identificada como "AA da SEQ ID NO:Y" embora outras grelhas de leitura possam também ser facilmente traduzidas utilizando técnicas conhecidas de biologia molecular. Os polipéptidos produzidos por estas grelhas de leitura abertas alternativas são especificamente contempladas pela presente invenção. 0 número total de aminoácidos dentro da grelha de leitura aberta da SEQ ID NO:Y é identificado como "Total AA de ORF". A SEQ ID NO:X (onde X pode ser quaisquer da sequências polinucleotidicas revelada na lista de sequências) e a SEQ ID NO:Y traduzida (onde Y pode ser quaisquer das sequências polipeptidicas reveladas na lista de sequências) são suficientemente exatas e de outro modo adequadas para uma variedade de utilizações bem conhecidas na técnica e descritas adicionalmente no presente documento. Por exemplo, a SEQ ID NO:X é útil para projetar sondas de hibridização de ácido nucleico que detetarão sequências de ácido nucleico contidas na SEQ ID NO:X ou o ADNc contido no clone depositado. Estas sondas também hibridizarão a moléculas de ácido nucleico em amostras biológicas, deste modo possibilitando uma variedade de métodos de diagnóstico e forense da invenção. De forma similar, polipéptidos identificados a partir da SEQ ID NO:Y podem ser usados, por exemplo, para gerar anticorpos que se ligam especificamente a proteínas contendo os polipéptidos e a proteínas codificadas pelos clones de ADNc identificadas no Quadro I. Não obstante, as sequências de ADN geradas pelas reações de sequenciamento podem conter erros de sequenciamento. Os erros existem como nucleótidos mal identificados, ou como inserções ou deleções de nucleótidos na sequência de ADN gerada. Os nucleótidos inseridos ou eliminados erradamente podem causar deslocamentos nas grelhas de leitura da sequência de aminoácido predita.

Nestes casos, a sequência de aminoácido predito diverge da sequência real de aminoácido, mesmo que a sequência de ADN gerada possa ser mais do que 99,9% idêntica à sequência de ADN real (por exemplo, uma inserção de base ou deleção numa grelha de leitura aberta de mais de 1000 bases).

Consequentemente, para aquelas aplicações que requerem precisão na sequência nucleotidica ou a sequência de aminoácido, a presente invenção fornece não somente a sequência nucleotidica gerada identificada como SEQ ID NO:X e a sequência de aminoácido traduzida predita identificada como SEQ ID NO:Y, mas também uma amostra de ADN de plasmideo contendo um ADNc da invenção depositado com a ATCC®, como apresentado no Quadro I. A sequência nucleotidica de cada clone depositado pode facilmente ser determinada por meio de sequenciamento do clone depositado de acordo com métodos conhecidos. A sequência de aminoácido predita pode então ser verificada a partir de tais depósitos. Além disso, a sequência de aminoácido da proteína codificado por um particular clone pode também ser diretamente determinou por sequenciamento de péptido ou por expressar a proteína num célula hospedeira contendo adequada o ADNc depositado, recolher a proteína, e determinar sua sequência. A presente invenção também se refere aos genes que correspondem a SEQ ID NO:X, SEQ ID NO:Y, ou o clone depositado. O gene correspondente pode ser isolado de acordo com métodos conhecidos utilizando a informação da sequência revelada no presente documento. Tais métodos incluem a preparação de sondas ou iniciadores a partir da sequência divulgada e identificação ou amplificação do gene correspondente a partir de fontes apropriadas do material genómico.

No presente documento também são descritos homólogos de espécie, variantes alélicos, e/ou ortólogos. O perito na especialidade poderia, usando procedimentos bem conhecidos na técnica, obter a sequência polinucleotidica correspondente a genes de comprimento completo (incluindo, mas sem limitação, a região codificante de comprimento completo), variantes alélicos, variantes de splicing, ortólogos, e/ou homólogos de espécie de genes correspondentes a SEQ ID N°: X, SEQ ID N°: Y, ou a um clone depositado, com base na sequência das sequências divulgadas no presente documento ou dos clones depositados na ATCC®. Por exemplo, podem ser isolados e identificados variantes alélicos e/ou homólogos de espécie preparando sondas ou iniciadores adequados que correspondem às regiões 5 ' , 3' , ou internas das sequências proporcionadas no presente documento e rastrear uma fonte de ácido nucleico adequada em busca de variantes alélicos e/ou do homólogo desejado.

Os polipéptidos da invenção podem ser preparados de qualquer maneira adequada. Os ditos polipéptidos incluem polipéptidos isolados de origem natural, polipéptidos produzidos de maneira recombinante, polipéptidos produzidos de maneira sintética, ou polipéptidos produzidos por meio de uma combinação destes métodos. Os meios para preparar os ditos polipéptidos são bem entendidos na técnica.

Os polipéptidos podem estar em forma da proteína, ou podem ser uma parte de uma proteína maior, tal como uma proteína de fusão (veja-se mais adiante). Com frequência é vantajoso incluir uma sequência de aminoácido adicional que contém sequências secretoras ou líder, pró-sequências, sequências que ajudam à purificação, tais como múltiplos resíduos de histidina, ou uma sequência adicional para estabilidade durante a produção recombinante.

Os polipéptidos da presente invenção são proporcionados preferentemente em forma isolada, e preferentemente estão substancialmente purificados. Uma versão de um polipéptido produzida de maneira recombinante pode ser purificado substancialmente usando técnicas descritas no presente documento ou de outro modo conhecidas na técnica, tais como, por exemplo, o método numa só etapa descrito em Smith e Johnson, Gene 67:31-40 (1988) . Os polipéptidos da invenção também podem ser purificados a partir de fontes naturais, sintéticas ou recombinantes usando protocolos descritos no presente documento ou de outro modo conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, anticorpos da invenção provocados contra a forma de comprimento completo da proteína. A presente invenção proporciona um polinucleótido que compreende, ou como alternativa consiste em, a sequência identificada como SEQ ID N°: X, e/ou um ADNc proporcionado no N° de depósito ATCC® Z. A presente invenção também proporciona um polipéptido que compreende, ou como alternativa consiste em, a sequência identificada como SEQ ID N°: Y, e/ou um polipéptido codificado pelo ADNc proporcionado no N° de depósito ATCC® Z. A presente invenção também proporciona polinucleótidos que codificam um polipéptido que compreende, ou como alternativa consiste na sequência polipeptídica de SEQ ID N° : Y, e/ou uma sequência polipeptídica codificada pelo ADNc contido no N° de depósito ATCC® Z.

Preferentemente, a presente invenção se dirige a um polinucleótido que compreende, ou como alternativa consiste em, a sequência identificada como SEQ ID N° : X, e/ou um ADNc proporcionado no N° de depósito ATCC® Z. que é menor que, ou igual a, uma sequência polinucleót ídica que tem 5 mega pares de bases, 1 mega par de bases, 0,5 mega par de bases, 0,1 mega par de bases, 50.000 pares de bases, 20.000 pares de bases, ou 10.000 pares de bases de comprimento. A presente invenção abrange polinucleótidos com sequências complementares a aquelas dos polinucleótidos da presente invenção divulgados no presente documento. As ditas sequências podem ser complementares à sequência divulgada como SEQ ID N° : X, à sequência contida num depósito, e/ou à sequência de ácido nucleico que codifica a sequência divulgada como SEQ ID N°: Y. A presente invenção também abrange polinucleótidos capazes de hibridar, preferentemente em condições de restringência reduzida, mais preferentemente em condições restringentes, e o mais preferentemente em condições de alta restringência, com polinucleótidos divulgados no presente documento. Os exemplos de condições de restringência são mostrados no Quadro II a continuação: as condições altamente restringentes são aquelas que são pelo menos tão restringentes como, por exemplo, as condições A-F; as condições restringentes são pelo menos tão restringentes como, por exemplo, as condições G-L; e as condições de restringência reduzida são pelo menos tão restringentes como, por exemplo, as condições M-R.

Os exemplos adicionais de condições de restringência para hibridização de polinucleótidos são proporcionados, por exemplo, em Sambrook, J., E.F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, capítulos 9 e 11, e Current Protocols in Molecular Biology, 1995, F.M., Ausubel et ao., eds., John Wiley and Sons, Inc., secções 2,10 e 6,3-6,4.

Preferentemente, os ditos polinucleótidos hibridizantes têm pelo menos 70 % de identidade de sequência (mais preferentemente, pelo menos 80 % de identidade; e o mais preferentemente pelo menos 90 % ou 95 % de identidade) com o polinucleótido da presente invenção com o qual hibridizam, sendo determinada a identidade de sequência comparando as sequências dos polinucleótidos hibridizantes quando são alinhados para maximizar a sobreposição e a identidade ao mesmo tempo em que são minimizados as lacunas de sequência. A determinação da identidade conhece-se bem na técnica, e é discute mais especificamente em outras partes do presente documento. A invenção abrange a aplicação de metodologia da PCR às sequências polinucleotídicas da presente invenção, ao clone depositado na ATCC® e/ou ao ADNc que codifica os polipéptidos da presente invenção. As técnicas da PCR para a amplificação de ácidos nucleicos são descritas na Patente US N° 4.683.195 e em Saiki et al., Science, 239:487-491 (1988) . A PCR, por exemplo, pode incluir as seguintes etapas de desnaturalização do ácido nucleico molde (se for de cadeia dupla), hibridização do iniciador ao alvo, e polimerização. O ácido nucleico sondado ou usado como molde na reação de amplificação pode ser ADN genómico, ADNc, ARN, ou um APN. A PCR pode ser usada para amplificar sequências específicas a partir de ADN genómico, de uma sequência de ARN específica, e/ou de ADNc transcrito a partir de ARNm. As referências para o uso geral de técnicas PCR, incluindo parâmetros específicos do método, incluem Mullis et al. , Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 51:263, (1987), Ehrlich (ed), PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989; Ehrlich et al., Science, 252:1643-1650, (1991); e "PCR Protocols, A Guide to Methods and Applications", Eds., Innis et al., Academic Press, Nova Iorque, (1990) .

Variantes polinucleotídicas e polipeptídicas

No presente documento também são descritos variantes (por exemplo, variantes alélicos, ortólogos, etc.) da sequência polinucleotídica divulgada no presente documento na SEQ ID N° : X, na cadeia complementar, e/ou sequência de ADNc contidano clone depositado.

No presente documento também são descritos variantes da sequência polipeptídica, e/ou fragmentos do mesmo, divulgados na SEQ ID N°: Y, num polipéptido codificado pela sequência polinucleot ídica em SEQ ID N° : X, e/ou num polipéptido codificado por um ADNc no clone depositado.

Um "variante" refere-se a um polinucleotido ou polipéptido que difere do polinucleotido ou polipéptido da presente invenção, mas conservando as propriedades essenciais deste. Em geral, os variantes são em geral muito semelhantes e, em muitas regiões, idênticas ao polinucleotido ou polipéptido da presente invenção.

Portanto, no presente documento descreve-se uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende, ou como alternativa consiste em, um polinucleotido que tem uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma sequência nucleotídica que codifica um polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c que tem uma sequência de aminoácido tal como é mostrado na lista de sequências e descrita em SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 4 ou o ADNc contido no N° de depósito ATCC®: Z; (b) uma sequência nucleotídica que codifica um polipéptido maduro de PCSK9b ou PCSK9c que tem a sequência de aminoácido tal como é mostrado na lista de sequências e descrita em SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 4 ou o ADNc contido no N° de depósito ATCC®: Z; (c) uma sequência nucleotidica que codifica um fragmento biologicamente ativo do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c que tem uma sequência de aminoácido mostrada na lista de sequências e descrita em SEQ ID N°: 2 ou SEQ ED N°: 4 ou o ADNc contido no N° de depósito ATCC®: Z; (d) uma sequência nucleotidica que codifica um fragmento antigénico do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c que tem uma sequência de aminoácido mostrada na lista de sequências e descrita em SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N° : 4 ou o ADNc contido no N° de depósito ATCC®: Z; (e) uma sequência nucleotidica que codifica um polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c que compreende a sequência de aminoácido completa codificada por um plasmideo de ADNc humano contida em SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 4 ou o ADNc contido no N° de depósito ATCC®: Z; (f) uma sequência nucleotidica que codifica um polipéptido maduro de PCSK9b ou PCSK9c que tem uma sequência de aminoácido completa codificada por um plasmideo de ADNc humano contida em SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 4 ou o ADNc contido no N° de depósito ATCC®: Z; (g) uma sequência nucleotidica que codifica um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido maduro de PCSK9b ou PCSK9c que tem uma sequência de aminoácido completa codificada por um plasmideo de ADNc humano contida em SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 4 ou o ADNc contido no N° de depósito ATCC®: Z; (h) uma sequência nucleotidica que codifica um fragmento antigénico de um polipéptido maduro de PCSK9b ou PCSK9c que tem uma sequência de aminoácido completa codificada por um plasmideo de ADNc humano contida em SEQ ID N°: X ou o ADNc contido no N° de depósito ATCC®: Z; e (i) uma sequência nucleotidica complementar com quaisquer das sequências nucleotidicas em (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) , ou (h) , anteriores.

No presente documento são descritas sequências polinucleotidicas que compreendem, ou como alternativa consistem em, uma sequência polinucleotidica que é pelo menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 93,6 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, ou 99,9 % idêntica a, por exemplo, quaisquer das sequências nucleotidicas em (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) , ou (h) , anteriores. Além disso, no presente documento são descritas moléculas de ácido nucleico que compreendem, ou como alternativa, consistem num polinucleotido que hibridiza em condições restringentes, ou como alternativa, em condições de menor restringência, com um polinucleotido em (a), (b), (c) , (d), (e) , (f), (g) , ou (h) , anteriores. No presente documento também são descritos polinucleotidos que hibridizam com o complemento destas moléculas de ácido nucleico em condições restringentes de hibridização ou, como alternativa, em condições de menor restringência, ao igual que polipéptidos codificados por estes polinucleotidos.

Além disso, no presente documento descreve-se uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende, ou como alternativa, que consiste em, um polinucleotido que tem uma sequência nucleotidica selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) uma sequência nucleotidica que codifica um polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c que tem uma sequência de aminoácido tal como é mostrada na lista de sequências e descrita no Quadro I; (b) uma sequência nucleotidica que codifica um polipéptido maduro de PCSK9b ou PCSK9c que tem a sequência de aminoácido tal como é mostrado na lista de sequências e descrita no Quadro I; (c) uma sequência nucleotidica que codifica um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c que tem uma sequência de aminoácido tal como é mostrado na lista de sequências e descrita no Quadro I; (d) uma sequência nucleotidica que codifica um fragmento antigénico de um polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c que tem uma sequência de aminoácido tal como é mostrado na lista de sequências e descrita no Quadro I; (e) uma sequência nucleotidica que codifica um polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c que compreende a sequência de aminoácido completa codificada por um ADNc humano num plasmideo de ADNc contido no depósito da ATCC® e descrito no Quadro I; (f) uma sequência nucleotidica que codifica um polipéptido maduro de PCSK9b ou PCSK9c que tem uma sequência de aminoácido completa codificada por um ADNc humano num plasmideo de ADNc contido no depósito da ATCC® e descrito no Quadro I; (g) uma sequência nucleotidica que codifica um fragmento biologicamente ativo de um polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c que tem uma sequência de aminoácido completa codificada por um ADNc humano num plasmideo de ADNc contido no depósito da ATCC® e descrito no Quadro I; (h) uma sequência nucleotidica que codifica um fragmento antigénico de um polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c que tem uma sequência de aminoácido completa codificada por um ADNc humano num plasmideo de ADNc contido no depósito da ATCC® e descrito no Quadro I; e (i) uma sequência nucleotidica complementar com quaisquer das sequências nucleotidicas em (a) , (b) , (c) , (d) , (e) , (f) , (g) , ou (h) anteriores.

No presente documento são descritas moléculas de ácido nucleico que compreendem, ou como alternativa, consistem numa sequência nucleotidica que é pelo menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, ou 99,9 % idêntica a, por exemplo, quaisquer das sequências nucleotidicas em (a), (b) , (c) , (d), (e) , (f) , (g) , ou (h) , anteriores.

No presente documento são descritas sequências polipeptidicas que compreendem, ou como alternativa consistem em, uma sequência de aminoácido que é pelo menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 90.4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, ou 99,9 % idêntica a, os seguintes exemplos não limitantes, a sequência polipeptidica identificada como SEQ ID N° : Y, a sequência polipeptidica codificada por um ADNc proporcionado no clone depositado, e/ou fragmentos polipeptidicos de quaisquer dos polipéptidos proporcionados no presente documento. Além disso, no presente documento são descritas moléculas de ácido nucleico que compreendem, ou como alternativa, consistem num polinucleótido que hibridiza em condições restringentes, ou como alternativa, em condições de menor restringência, com um polinucleótido em (a), (b), (c), (d), (e) , (f) , (g) , ou (h) , anteriores. No presente documento também são descritos polinucleótidos que hibridizam com o complemento destas moléculas de ácido nucleico em condições restringentes de hibridização ou, como alternativa, em condições de menor restringência, ao igual que polipéptidos codificados por estes polinucleótidos.

Além disso, No presente documento são descritos polipéptidos que compreendem, ou como alternativa consistem em, uma sequência de aminoácido que é pelo menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99.4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, ou um 99,9 % idêntica a, por exemplo, a sequência polipeptidica mostrada em SEQ ID N° : Y, uma sequência polipeptidica codificada pela sequência nucleotidica em SEQ ID N°: X, uma sequência polipeptidica codificada pelo ADNc no plasmídeo de ADNc:Z, e/ou fragmentos polipeptidicos de quaisquer destes polipéptidos (por exemplo, aqueles fragmentos descritos no presente documento). No presente documento também são descritos polinucleótidos que hibridizam com o complemento das moléculas de ácido nucleico que codificam estes polipéptidos em condições de hibridização restringentes ou, como alternativa, em condições de menor restringência, ao igual que polipéptidos codificados por estes polinucleótidos.

Por um ácido nucleico que tem uma sequência nucleotídica pelo menos, por exemplo, 95 % "idêntica" a uma sequência nucleotídica de referência da presente invenção, entende-se que a sequência nucleotídica do ácido nucleico seja idêntica à sequência de referência exceto em que a sequência nucleotídica pode incluir até cinco mutações pontuais por cada 100 nucleótidos da sequência do nucleótido de referência que codifica ao polipéptido. Em outras palavras, para obter um ácido nucleico que tenha uma sequência nucleotídica pelo menos 95 % idêntica a uma sequência nucleotídica de referência, até 5 % dos nucleótidos na sequência de referência podem ser deletados ou substituídos com outro nucleótido, ou um número de nucleótidos de até 5 % dos nucleótidos totais na sequência de referência podem ser inseridos na sequência de referência. A sequência de busca pode ser uma sequência completa citada no Quadro I, a ORF (grelha de leitura aberta), ou qualquer fragmento especificado tal como descreve-se no presente documento.

Como aspeto particular, pode ser determinado se qualquer molécula de ácido nucleico ou polipéptido particular é pelo menos aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,1 %, 99,2 %, 99,3 %, 99,4 %, 99,5 %, 99,6 %, 99,7 %, 99,8 %, ou 99,9 % idêntica a uma sequência nucleotídica da presente invenção de maneira convencional usando programas informáticos conhecidos. Um método preferido para determinar a melhor coincidência geral entre uma sequência de busca (uma sequência da presente invenção) e uma sequência objeto, também citado como alinhamento de sequência global, pode ser determinado usando o programa informático CLUSTALW (Thompson, J.D., et al., Nucleic Acids

Research, 2(22):4673-4680, (1994)), que se baseia no algoritmo de Higgins, D.G., et al. , Computer Applications in the Biosciences (CABIOS), 8(2):189-191, (1992). Num alinhamento de sequências, as sequências de busca e objeto são ambas sequências de ADN. Pode ser comparadas uma sequência de ARN convertendo as U em T. No entanto, o algoritmo CLUSTALW converte automaticamente as U a T quando se comparam sequências de ARN com sequências de ADN. O resultado do dito alinhamento global de sequência é expresso em identidade percentual. Os parâmetros preferidos usados num alinhamento de sequências de ADN CLUSTALW para calcular a identidade percentual por meio de alinhamento por pares são: Matriz = IUB, k-tuple = 1, Número de diagonais máximas = 5, Penalização por lacuna = 3,

Penalização por lacuna aberta = 10, Penalização por extensão de lacuna = 0,1, Método de pontuação = Percentual, Tamanho de janela = 5 ou o comprimento da sequência nucleotidica objeto, a que seja mais curta. Para alinhamentos múltiplos, preferem-se os seguintes parâmetros de CLUSTALW: Penalização por abertura de lacuna = 10;

Parâmetro de extensão de lacuna = 0,05; Intervalo de penalização por separação de lacuna = 8; Penalização por separação de lacuna final = Desativado; % de identidade para atraso de alinhamento = 40 %; Resíduos específicos de lacunas: Desativado; Lacuna deste hidrófilo = Desativado; e ponderação de transição =0. Os parâmetros de alinhamento por pares e múltiplo anteriores proporcionados para CLUSTALW representam os parâmetros padrão proporcionados com o programa informático ALIGNX® (paquete de programas VECTOR NTI®, versão 6.0).

Pode ser aplicada uma correção manual aos resultados de identidade percentual em caso de que a sequência objeto seja mais curta que a sequência de busca devido a deleções 5' ou 3', não devido a deleções internas. Se somente é necessário a percentagem de identidade por pares, não é necessária a correção manual. No entanto, pode ser aplicada uma correção manual para determinar a identidade percentual global a partir de um alinhamento de polinucleótido global. Os cálculos de identidade percentual baseados em alinhamentos de polinucleótidos globais preferem-se com frequência já que refletem a identidade percentual entre as moléculas de polinucleótido de maneira global (isto é, incluindo qualquer saliente de polinucleótido, não somente as regiões sobrepostas), em oposição a somente polinucleótidos coincidentes locais. São necessárias correções manuais para as determinações de identidade percentual global já que o programa CLUSTALW não leva em consideração os truncamentos 5' e 3' da sequência objeto quando se calcula a identidade percentual. Para as sequências objeto truncadas nas extremidades 5' ou 3', em relação à sequência de busca, a identidade percentual se corrige calculando o número de bases da sequência de busca que estão em 5' e 3' da sequência objeto, que não estão emparelhadas/alinhadas, como o tanto por cento das bases totais da sequência de busca. É determinado se um nucleótido está emparelhado/alinhado por meio dos resultados do alinhamento de sequências de CLUSTALW. Esta percentagem é substraida posteriormente da identidade percentual, calculada por meio do programa CLUSTALW anterior usando os parâmetros especificados, para obter uma pontuação de identidade percentual final. Esta pontuação corrigida pode ser usada para os fins da presente invenção. Somente são calculadas as bases fora das bases 5' e 3' da sequência objeto, mostradas por meio do alinhamento de CLUSTALW, que não estão emparelhadas/alinhadas com a sequência de busca com o fim de ajustar manualmente a pontuação de identidade percentual.

Por exemplo, alinha-se uma sequência objeto de 90 bases com uma sequência de busca de 100 bases para determinar a identidade percentual. As deleções ocorrem na extremidade 5' da sequência objeto e portanto, o alinhamento CLUSTALW não mostra um emparelhamento/alinhamento das 10 primeiras bases na extremidade 5'. As 10 bases não emparelhadas representam 10 % da sequência (número de bases nas extremidades 5' ou 3' não emparelhadas/número total de bases na sequência de busca) pelo que é subtraído 10 % à pontuação de identidade percentual calculada pelo programa CLUSTALW. Se as 90 bases restantes estivessem perfeitamente emparelhadas, a identidade percentual final seria de 90 %. Em outro exemplo, compara-se uma sequência objeto de 90 bases com uma sequência de busca de 100 bases. Nesta ocasião, as deleções são deleções internas, pelo que não há bases em 5' ou 3' da sequência objeto que não estejam emparelhadas/alinhadas com a sequência de busca. Neste caso, a identidade percentual calculada pelo programa CLUSTALW não se corrige manualmente. Novamente, somente as bases em 5' e 3' da sequência objeto que não estão emparelhadas/alinhadas com a sequência de busca são corrigidas manualmente. Não são necessárias outras correções manuais para os fins da presente invenção.

Além do método anterior para alinhar duas ou mais sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas para chega a um valor de identidade percentual para as sequências alinhadas, em alguns casos pode ser desejável usar uma versão modificada do algoritmo CLUSTALW que leva em consideração características estruturais conhecidas das sequências que vão ser alinhadas, tais como, por exemplo, as denominações SWISS-PROT® para cada sequência. O resultado do dito algoritmo de CLUSTALW modificado pode proporcionar um valor mais preciso da identidade percentual para duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas. Proporciona-se suporte para a dita versão modificada de CLUSTALW com o algoritmo CLUSTALW e será apreciado facilmente por um perito na especialidade de bioinformática.

As variantes podem conter alterações em as regiões codificantes, regiões não codificantes, ou ambas. Preferem-se especialmente variantes polinucleotidicas que contêm alterações que produzem substituições, adições ou deleções silentes, mas não alteram as propriedades ou atividades do polipéptido codificado. Preferem-se variantes nucleotidicas produzidas por substituições silentes devido à degeneração do código genético. Além disso, também preferem-se variantes em que em que são substituídos, deletados ou adicionados 5-10, 1-5 ou 1-2 aminoácidos em qualquer combinação. Os variantes de polinucleotidos podem ser produzidos por uma variedade de razões, por exemplo, para otimizar a expressão para um determinado codão para um hospedeiro particular (mudanças de codões no ARNm para os preferidos por um hospedeiro bacteriano tal como E. coli ).

Oss variantes de origem natural são denominados "variantes alélicos" e referem-se a uma de várias formas alternativas de um gene que ocupa um locus dado num cromossoma de um organismo. (Genes II, Lewin, B., ed., John Wiley & Sons, Nova Iorque (1985)). Estes variantes alélicos podem variar a nível de polinucleotido e/ou de polipéptido. Como alternativa, podem ser produzidos variantes de origem não natural por meio de técnicas de mutagénese ou por meio de síntese direta.

Podem ser gerados variantes usando métodos conhecidos de engenharia de proteínas e tecnologia de ADN recombinante para melhorar ou alterar as caracteristicas dos polipéptidos da presente invenção. Por exemplo, podem ser deletados um ou mais aminoácidos da extremidade N-terminal ou da extremidade C-terminal da proteína sem perda substancial da função biológica. Os autores de Ron et al., J. Biol. Chem. 268:2984-2988 (1993), comunicaram proteínas de KGF variantes que tinham atividade de ligação a heparina inclusive depois de deletar 3, 8, ou 27 resíduos de aminoácidos amino-terminais. De maneira similar, 0 interferão gama mostrou uma atividade até dez vezes maior depois de deletar 8-10 resíduos de aminoácidos da extremidade carboxilo desta proteína (Dobeli et al., J. Biotechnology 7:199-216 (1988)).

Além disso, muitos testes demonstram que os variantes muitas vezes mantêm semelhante à atividade biológica da proteína que ocorre naturalmente. Por exemplo, Gayle et al (J. Biol Chem. 268 :. 22.105-22.111 (1993)) conduziram uma extensa análise mutacional da citocina IL-la. Eles usaram mutagénese aleatória para gerar mais de 3.500 mutantes IL-la individuais que tiveram, em média, 2,5 mudanças de aminoácidos por variante relação ao comprimento completo da molécula. Várias mutações em cada posição de aminoácido possível foram examinadas. Os pesquisadores descobriram que "a maior parte da molécula poderia ser alterada com pouco efeito [sobre a atividade de ligação ou biológica]". De facto, apenas 23 sequências de aminoácidos únicos, de mais do que 3500 sequências de nucleótidos examinadas, produziram uma proteína que diferia significativamente na atividade em relação à de tipo selvagem.

Além disso, inclusive se deletar um ou mais aminoácidos da extremidade N-terminal ou da extremidade C-terminal de um polipéptido da como resultado a modificação ou perda de uma ou mais funções biológicas, ainda podem ser mantidas outras atividades biológicas. Por exemplo, provavelmente será mantida a capacidade de uma variante de deleção para induzir e/ou se ligar a anticorpos que reconhecem à proteína quando sejam eliminados menos da maioria dos resíduos da proteína da extremidade N-terminal ou da extremidade C-terminal. Pode ser determinado facilmente se um polipéptido particular que carece de resíduos N- ou C-terminais de uma proteína mantém as ditas atividades imunogénicas por meio de métodos de rotina descritos no presente documento e de outro modo conhecidos na técnica.

Como alternativa, as ditas deleções da extremidade N-terminal ou C-terminal de um polipéptido da presente invenção podem, de facto, dar como resultado um aumento significativo numa ou mais das atividades biológicas do polipéptido (ou os polipéptidos). Por exemplo, a atividade biológica de muitos polipéptidos está governada pela presença de domínios reguladores num ou ambas as extremidades. Os ditos domínios reguladores inibem de maneira eficaz a atividade biológica dos ditos polipéptidos em lugar de um evento de ativação (por exemplo, ligação a um ligando ou recetor afim, fosforilação, precessamento proteolítico, etc.). Portanto, ao deletar o domínio regulador de um polipéptido, o polipéptido pode se tornar biologicamente ativo de maneira eficaz em ausência de um evento de ativação.

Portanto, no presente documento são descritos variantes polipeptídicos que mostram atividade biológica substancial. As ditas variantes incluem deleções, inserções, inversões, repetições e substituições selecionadas de acordo com regras gerais conhecidas na técnica para que tenham pouco efeito sobre a atividade. Por exemplo, proporciona-se uma orientação referente a como preparar substituições de aminoácidos fenotipicamente silentes em Bowie et al., Science 247:1306-1310 (1990), no que os autores indicam que existem duas estratégias principais para estudar a tolerância de uma sequência de aminoácido à mudança. A primeira estratégia explora a tolerância de substituições de aminoácidos por seleção natural durante o processo de evolução. Ao comparar sequências de aminoácidos em diferentes espécies, podem ser identificados aminoácidos conservados. É provável que estes resíduos de aminoácidos conservados sejam importantes para a função de proteínas. Pelo contrário, as posições de aminoácidos onde foram toleradas as substituições por meio de seleção natural indicam que estas posições não são críticas para a função de proteínas. Portanto, as posições que toleram a substituição de aminoácidos poderiam ser modificadas ao mesmo tempo em que se mantém a atividade biológica da proteína. A segunda estratégia usa engenharia genética para introduzir mudanças de aminoácidos em posições específicas de um gene clonado para identificar regiões criticas para a função de proteínas. Por exemplo, podem ser usadas mutagénese de local dirigido ou mutagénese de varrimento de alanina (introdução de mutações simples de alanina em cada resíduo da molécula. (Cunningham e Wells, Science 244:1081-1085 (1989)). Portanto, pode ser testada a atividade biológica das moléculas resultantes.

Tal como afirmam os autores, estas duas estratégias revelaram que as proteínas são elevadamente tolerantes a substituições de aminoácidos. Os autores indicam além disso quais mudanças de aminoácidos têm mais probabilidade de ser permissivas em determinadas posições de aminoácidos na proteína. Por exemplo, a maioria de resíduos de aminoácidos enterrados (na estrutura terciária da proteína) necessitam cadeias laterais não polares, enquanto que geralmente conservam-se poucas características de cadeias laterais superficiais.

No presente documento são descritos polipéptidos que têm um menor grau de identidade mas que têm suficiente semelhança como para efetuar uma ou mais das mesmas funções efetuadas pelo polipéptido da presente invenção. A semelhança é determinada por meio de substituição de aminoácidos conservados. As ditas substituições são aquelas que substituem um aminoácido dado num polipéptido por outro aminoácido de características semelhantes (por exemplo, propriedades químicas). De acordo com Cunningham et al anteriormente, é provável que as ditas substituições conservativas sejam fenotipicamente silentes. Encontra-se orientação adicional referente a quais mudanças de aminoácidos têm mais probabilidades de ser fenotipicamente silentes em Bowie et al., Science 247:1306-1310 (1990).

As substituições de aminoácidos conservativas toleradas implicam a substituição dos aminoácidos alifáticos ou hidrófobos Ala, Vai, Leu e Ile; substituição dos resíduos hidroxilo Ser e Thr; substituição dos resíduos ácidos Asp e Glu; substituição dos resíduos amida Asn e Gin; substituição dos resíduos básicos Lys, Arg, e His; substituição dos resíduos aromáticos Phe, Tyr, e Trp; e substituição dos aminoácidos de pequeno tamanho Ala, Ser, Thr, Met, e Gly. São proporcionadas substituições conservativas adicionais no Quadro III a continuação.

Aparte das utilizações descritas anteriormente, as ditas substituições de aminoácidos podem aumentar a estabilidade proteica ou peptídica. As substituições de aminoácidos podem conter, por exemplo, uma ou mais ligações não peptidicas (que substituem as ligações peptídicas) na sequência de proteína ou peptídica. As substituições podem incluir resíduos de aminoácidos distintos dos L-aminoácidos de origem natural, por exemplo, D-aminoácidos ou aminoácidos de origem não natural ou sintéticos, por exemplo, β ou γ aminoácidos.

Tanto a identidade como a semelhança podem ser calculadas facilmente fazendo referência às seguintes publicações: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Informatics Computer Analyse of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A.M., e Griffin, H.G., eds., Humana Press, Nueva Jersey, 1994; Sequence Analyse in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analyse Primer, Gribskov, M. e Devereux, Ji eds., M Stockton Press, Nova Iorque, 1991. A substituição de aminoácidos pode se basear na probabilidade de que uma substituição de aminoácidos dê como resultado a conservação da função. As ditas probabilidades são determinadas alinhando múltiplos genes com função relacionada e avaliando a penalização relativa de cada substituição com a função génica adequada. Com frequência as ditas probabilidades são descritas numa matriz e são utilizadas por alguns algoritmos (por exemplo, BLAST®, CLUSTALW, GAP®, etc.) no cálculo da semelhança percentual nos que a semelhança refere-se ao grau no qual um aminoácido pode substituir a outro aminoácido sem perda de função. Um exemplo da dita matriz é a matriz PAM250 ou BLOSUM62.

Aparte das substituições quimicamente conservativas canónicas citadas anteriormente, podem ser introduzidas substituições que não se classificam tipicamente como conservativas, mas que podem ser quimicamente conservativas em determinadas circunstancias. A análise de catálise enzimática para proteases, por exemplo, demonstrou que determinados aminoácidos no local ativo de algumas enzimas podem ter pKa elevadamente alterados devido ao microambiente único do local ativo. Os ditos pKa alterados podem permitir que alguns aminoácidos substituam a outros aminoácidos ao mesmo tempo em que se conservam a estrutura enzimática e a função. Os exemplos de aminoácidos conhecidos que têm resíduos de aminoácidos com pKa alterados são o resíduo Glu-35 de lisozima, o resíduo Ile-16 de quimiotripsina, o resíduo His-159 de papaína, etc. A conservação de função se refere à protonação anómala ou à desprotonação anómala dos ditos aminoácidos, em relação a sus pKa canónicos não alterados. A perturbação do pKa pode permitir a estes aminoácidos participar ativamente na catálise ácido-base geral devido ao ambiente de ionização único no local ativo da enzima. Portanto, a substituição de um aminoácido capaz de servir bem como um ácido geral ou como uma base geral no microambiente de um local ativo ou cavidade enzimática, como pode ser o caso, com a mesma capacidade ou similar que o aminoácido de tipo selvagem, poderia servir de maneira eficaz como uma substituição de aminoácido conservativa.

Aparte da substituição conservativa de aminoácidos, os variantes dos polipéptidos da presente invenção incluem, mas sem limitação, as seguintes: (i) substituições com um ou mais dos resíduos de aminoácidos não conservados, onde os resíduos de aminoácidos conservados podem estar ou não codificados pelo código genético, ou (ii) substituição com um ou mais resíduos de aminoácidos que têm um grupo substituinte, ou (iii) fusão do polipéptido maduro com outro composto, tal como um composto para aumentar a estabilidade e/ou solubilidade do polipéptido (por exemplo, polietilenoglicol), ou (iv) fusão do polipéptido com aminoácidos adicionais, tais como, por exemplo, um péptido de região de fusão de Fc de IgG, ou uma sequência líder ou secretora, ou uma sequência que facilita a purificação. Considera-se que os ditos polipéptidos variantes estão dentro do âmbito dos peritos na especialidade a partir dos ensinamentos no presente documento.

Por exemplo, as variantes de polipéptidos que contém substituições de aminoácidos de aminoácidos carregados com outros aminoácidos carregados ou neutros podem produzir proteínas com características melhoradas, tais como menor agregação. A agregação de formulações farmacêuticas reduz a atividade e aumenta a eliminação devido à atividade imunogénica dos agregados. (Pinckard et al., Clin. Exp. Immunol. 2:331-340 (1967); Robbins et al., Diabetes 36:838-845 (1987); Cleland et al., Crit. Rev. Therapeutic Drug Carrier Systems 10:307-377 (1993)).

Além disso, podem ser criados variantes de polipéptidos criados por meio da aplicação de metodologias evolução molecular ("embaralhamento de ADN") ao polinucleótido divulgado como SEQ ID N°: X, à sequência do clone remitido num depósito, e/ou ao ADNc que codifica o polipéptido divulgado como SEQ ID N°: Y. A dita tecnologia de embaralhamento de ADN é conhecida na técnica e descreve-se mais particularmente em outras partes do presente documento (por exemplo, WPC, Stemmer, PNAS, 91:10747, (1994)), e nos Exemplos proporcionados no presente documento).

No presente documento descreve-se um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da presente invenção que tem uma sequência de aminoácido que contém pelo menos uma substituição de aminoácidos, mas não mais de 50 substituições de aminoácidos, inclusive mais preferentemente, não mais de 40 substituições de aminoácidos, ainda mais preferentemente, não mais de 30 substituições de aminoácidos, e ainda mais preferentemente, não mais de 20 substituições de aminoácidos. Obviamente, em ordem de maior preferência, é elevadamente preferível que um péptido ou polipéptido tenha uma sequência de aminoácido que compreende a sequência de aminoácido da presente invenção, que contém pelo menos uma, mas não mais de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 ou 1 substituição de aminoácidos. Em particular, é preferível que o número de adições, substituições, e/ou deleções na sequência de aminoácido da presente invenção ou em fragmentos da mesma (por exemplo, a forma madura e/ou outros fragmentos descritos no presente documento), possa ser de 1-5, 5-10, 5-25, 5-50, 10-50 ou 50-150 substituições conservativas de aminoácidos. Fragmentos polinucleotidicos e polipeptidicos

No presente documento são descritos fragmentos polinucleotidicos dos polinucleotidos da invenção, além disso de polipéptidos codificados na mesma por os ditos polinucleotidos e/ou fragmentos.

Tal como se usa no presente documento, um "fragmento polinucleotídico" refere-se a um polinucleotido curto que tem uma sequência de ácido nucleico que: é uma porção da contida num clone depositado, ou que codifica o polipéptido codificado pelo ADNc num clone depositado; é uma porção de aquela mostrada em SEQ ID N°: X ou a cadeia complementar da mesma, ou é uma porção de uma sequência polinucleotidica que codifica o polipéptido de SEQ ID N° : Y. Os fragmentos de nucleótidos descritos no presente documento são preferentemente de pelo menos cerca de 15 nt, e mais preferentemente de pelo menos cerca de 20 nt, ainda mais preferentemente de pelo menos cerca de 30 nt, e inclusive mais preferentemente, pelo menos cerca de 40 nt, pelo menos cerca de 50 nt, pelo menos cerca de 75 nt, ou pelo menos cerca de 150 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 875 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 837 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 903 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 915 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 930 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 945 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 1000 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 1050 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 1100 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 1150 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 1200 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 1250 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 1300 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 1350 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 1400 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 1450 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 1500 nt de comprimento, ou pelo menos cerca de 1554 nt de comprimento. Um fragmento de "pelo menos 20 nt de comprimento", por exemplo, pretende incluir 20 ou mais bases contíguas a partir da sequência de ADNc contida num clone depositado ou a sequência nucleotídica mostrada na SEQ ID N° : X. Em este contexto, "cerca de" inclui o valor citado particularmente, um valor maior ou menor em vários nucleótidos (25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, ou 1), em qualquer extremidade, ou em ambas as extremidades. Estes fragmentos nucleotídicos têm utilizações que incluem, mas sem limitação, como sondas e iniciadores de diagnóstico, tal como se discute no presente documento. Obviamente, preferem-se fragmentos maiores (por exemplo, 50, 150, 500, 600, 837, 903, 1554, 2000 nucleótidos).

Além disso, os exemplos representativos dos fragmentos polinucleotídicos descritos no presente documento incluem, por exemplo, fragmentos que compreendem, ou como alternativa consistem em, uma sequência de um número de nucleótidos de cerca de 1-50, 51-100, 101-150, 151-200, 201-250, 251-300, 301-350, 351-400, 401-450, 451-500, 501-550, 551-600, 651-700, 701-750, 751-800, 800-850, 851-900, 901-950, 951-1000, 1001-1050, 1051-1100, 1101-1150, 1151-1200, 1201-1250, 1251-1300, 1301-1350, 1351-1400, 1401-1450, 1451-1500, 1501-1550, 1551-1600, 1601-1650, 1651-1700, 1701-1750, 1751-1800, 1801-1850, 1851-1900, 1901-1950, 1951-2000, ou 2001 até a extremidade de SEQ ID N°: X, ou da cadeia complementar da mesma, ou do ADNc contido num clone depositado. Neste contexto, "cerca de" inclui os intervalos citados particularmente, e intervalos maiores ou menores em vários nucleótidos (5, 4, 3, 2, ou 1), numa das extremidades ou em ambas as extremidades. Preferentemente, estes fragmentos codificam um polipéptido que tem atividade biológica. Mais preferentemente, estes polinucleotidos podem ser utilizados como sondas ou iniciadores, tal como se discute no presente documento. Também são descritos no presente documento polinucleotidos que hibridizam com estas moléculas de ácido nucleico em condições restringentes de hibridização ou em condições de menor restringência, ao igual que polipéptidos codificados por estes polinucleotidos.

Tal como é utilizado no presente documento, um "fragmento polipeptídico" refere-se a uma sequência de aminoácido que é uma porção de aquela contida na SEQ ID N°: Y ou codificada pelo ADNc contido num clone depositado. Os fragmentos proteicos (polipéptidos) podem ser "independentes" ou estar compreendidos num polipéptido maior do que o fragmento forma uma parte ou uma região, mais preferentemente como uma única região continua. Os exemplos representativos dos fragmentos polipeptidicos descritos no presente documento incluem, por exemplo, fragmentos que compreendem, ou como alternativa consistem em, desde cerca de o aminoácido número 1-20, 21-40, 41-60, 61-80, 81-100, 102-120, 121-140, 141-160, ou 161 até o final da região codificante. Além disso, os fragmentos polipeptidicos podem ser de cerca de 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 279, 301, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, ou 518 aminoácidos de comprimento. Neste contexto, "cerca de" inclui os intervalos ou valores citados particularmente, e intervalos ou valores maiores ou menores em vários aminoácidos (25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, oul), numa das extremidades ou em ambas as extremidades. Também são descritos no presente documento polinucleótidos que codificam estes polipéptidos.

Os fragmentos polipeptidicos preferidos incluem a proteína de comprimento completo. Os fragmentos polipeptidicos adicionais preferidos incluem a proteína de comprimento completo que tem uma serie contínua de resíduos eliminados das extremidades amino ou carboxilo, ou ambos. Por exemplo, pode ser deletados qualquer número de aminoácidos, no intervalo de 1-60, da extremidade amino do polipéptido de comprimento completo. De maneira similar, pode ser deletados qualquer número de aminoácidos, no intervalo de 1-30, da extremidade carboxilo da proteína de comprimento completo. Além disso, prefere-se qualquer combinação das deleções em amino e carboxilo terminal. De maneira similar, também se preferem os polinucleótidos que codificam estes fragmentos polipeptidicos.

Também se preferem fragmentos polipeptidicos e polinucleotídicos caracterizados por domínios estruturais ou funcionais, tais como fragmentos que compreendem alfa-hélice e regiões formadoras de alfa-hélice, beta-lâmina e regiões formadoras de beta-lâmina, giros e regiões formadoras de giros, espirais e regiões formadoras de espirais, regiões hidrófilas, regiões hidrófobas, regiões alfa anfipáticas, regiões beta anfipáticas, regiões flexíveis, regiões formadoras de superfície, regiões de ligação a substrato e regiões de elevado índice antigénico. Os fragmentos polipeptídicos de SEQ ID N° : Y que estão dentro de domínios conservados são contemplados especificamente no presente documento. Além disso, também são contemplados os polipéptidos que codificam estes domínios.

Outros fragmentos polipeptídicos preferidos são fragmentos biologicamente ativos. Os fragmentos biologicamente ativos são aqueles que mostram uma atividade similar, mas não necessariamente idêntica, a uma atividade do polipéptido da presente invenção. A atividade biológica dos fragmentos pode incluir uma atividade melhorada desejada, ou uma atividade não desejada diminuída. No presente documento também são descritos polinucleotidos que codificam estes fragmentos polipeptídicos.

Preferentemente, a atividade funcional mostrada por um polipéptido codificado por um fragmento polinucleotídico descrito no presente documento pode ser uma ou mais atividades biológicas associadas tipicamente com o polipéptido de comprimento completo da invenção. De maneira ilustrativa, estas atividades biológicas incluem a capacidade dos fragmentos para se ligar a pelo menos um dos mesmos anticorpos aos quais se liga a proteína de comprimento completo, a capacidade do fragmento para interagir com pelo menos uma das mesmas proteínas que se ligam à de comprimento completo, a capacidade dos fragmentos para provocar pelo menos uma das mesmas respostas imunes que a proteína de comprimento completo (isto é, fazer que o sistema imune crie anticorpos específicos para o mesmo epítopo, etc.), a capacidade dos fragmentos para se ligar a pelo menos um dos mesmos polinucleótidos que a proteína de comprimento completo, a capacidade dos fragmentos para se ligar a um recetor da proteína de comprimento completo, a capacidade dos fragmentos para se ligar a um ligando da proteína de comprimento completo, e a capacidade dos fragmentos para multimerizar com a proteína de comprimento completo. No entanto, o perito na especialidade apreciará que alguns fragmentos podem ter atividades biológicas que são desejáveis e diretamente fora de local da atividade biológica da proteína de comprimento completo. A atividade funcional dos polipéptidos da invenção, incluindo fragmentos, variantes, derivados, e análogos dos mesmos pode ser determinada por meio de numerosos métodos disponíveis para o perito na especialidade, alguns dos quais são descritos em outras partes do presente documento.

No presente documento são descritos polipéptidos que compreendem, ou como alternativa consistem em, um epítopo do polipéptido que tem uma sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: Y, ou num epítopo da sequência polipeptídica codificada por uma sequência polinucleotídica contida no N° de depósito ATCC®: Z codificado por um polinucleótido que hibridiza com o complemento da sequência de SEQ ID N°: X ou contido no N° de depósito ATCC®: Z em condições de hibridização restringentes ou em condições de hibridização de menor restringência tal como foram definidas anteriormente. No presente documento são descritas além disso sequências polinucleótidicas que codificam um epítopo de uma sequência polipeptídica da invenção (tal como, por exemplo, a sequência divulgada em SEQ ID N°: 1 ou em SEQ ID N°: 3), sequências polinucleótidicas da cadeia complementar de uma sequência polinucleotídica que codifica um epítopo da invenção, e sequências polinucleotidicas que hibridizam com a cadeia complementar em condições restringentes de hibridização ou em condições de hibridização de menor restringência, tal como foram definidas anteriormente. 0 termo "epítopos", tal como é utilizado no presente documento, refere-se a porções de um polipéptido que têm atividade antigénica ou imunogénica num animal, preferentemente um mamífero, e o mais preferentemente num ser humano. Numa forma de realização preferida, a presente invenção abrange um polipéptido que compreende um epítopo, assim como o polinucleótido que codifica este polipéptido. Um "epítopo imunogénico", tal como é utilizado no presente documento, se define como uma porção de uma proteína que provoca uma resposta de anticorpos num animal, tal como é determinado por meio de qualquer método conhecido na técnica, por exemplo, por meio dos métodos para gerar anticorpos descritos mais adiante. (Veja-se, por exemplo, Geysen et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:3998- 4002 (1983)) . A expressão "epítopo antigénico", tal como é utilizado no presente documento, se define como uma porção de uma proteína à qual pode se ligar imunoespecificamente um anticorpo a seu antigénio, tal como é determinado por meio de qualquer método bem conhecido na técnica, por exemplo, por meio do imunoensaio descrito no presente documento. A ligação imunoespecifica exclui à ligação não específica mas não exclui necessariamente à reatividade cruzada com outros antigénios. Os epítopos antigénicos não têm por quê ser necessariamente imunogénicos.

Os fragmentos que funcionam como epítopos podem ser produzidos por meio de qualquer meio convencional. (Veja-se, por exemplo, Houghten, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:5131-5135 (1985), descrito adicionalmente na Patente US N° 4,631,211) .

Os epítopos antigénicos contêm preferentemente uma sequência de pelo menos 4, pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, mais preferentemente pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 20, pelo menos 25, pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, e, o mais preferentemente, entre cerca de 15 até cerca de 30 aminoácidos. Os polipéptidos preferidos que compreendem epítopos imunogénicos ou antigénicos são de pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 resíduos de aminoácidos de comprimento, ou maiores. Os epítopos antigénicos preferidos não exclusivos adicionais incluem os epítopos antigénicos divulgados no presente documento, assim como porções dos mesmos. Os epítopos antigénicos são úteis, por exemplo, para provocar anticorpos, incluindo anticorpos monoclonais, que se ligam especificamente ao epítopo. Os epítopos antigénicos preferidos incluem os epítopos antigénicos divulgados no presente documento, assim como qualquer combinação de dois, três, quatro, cinco ou mais destes epítopos antigénicos. Os epítopos antigénicos podem ser utilizados como moléculas alvos em imunoensaios. (Veja-se, por exemplo, Wilson et al., Cell 37:767-778 (1984); Sutcliffe et al. , Science 219:660-666 (1983)) .

De maneira similar, podem ser utilizados epítopos imunogénicos, por exemplo, para induzir anticorpos de acordo com métodos bem conhecidos na técnica. (Veja-se, por exemplo, Sutcliffe et al. , anteriormente citado; Wilson et al. , anteriormente citado; Chow et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:910-914; e Bittle et al., J. Gene. Virol. 66:2347-2354 (1985). Os epítopos imunogénicos preferidos incluem os epítopos imunogénicos divulgados no presente documento, assim como qualquer combinação de dois, três, quatro, cinco ou mais destes epítopos imunogénicos. Os polipéptidos que compreendem um ou mais epítopos imunogénicos podem ser aprsentados para provocar uma resposta de anticorpos juntamente com uma proteína veículoa, tal como uma albumina, a um sistema animal (tal como um coelho ou ratinho) , ou, se o polipéptido é da comprimento suficiente (pelo menos cerca de 25 aminoácidos), o polipéptido pode ser apresentado sem um veículo. No entanto, os epítopos imunogénicos que compreendem tão poucos como 8 a 10 aminoácidos demonstraram ser suficientes para provocar anticorpos capazes de se ligar a, pelo menos, epítopos lineares num polipéptido desnaturalizado (por exemplo, numa transferência de Western).

Os polipéptidos portadores de epítopos da presente invenção podem ser utilizados para induzir anticorpos de acordo com métodos bem conhecidos na técnica incluindo, mas sem limitação, imunização in vivo, imunização in vitro, e métodos de presentação em fagos. Veja-se, por exemplo, Sutcliffe et al. , anteriormente citado; Wilson et al. , anteriormente citado, e Bittle et al., J. Gene. Virol., 66:2347-2354 (1985) . Se for utilizada imunização in vivo, os animais podem ser imunizados com péptido livre; no entanto, pode ser reforçado o titulo de anticorpo anti-péptido acoplando o péptido a um veículo macromolecular, tal como hemocianina de keyhole limpet (KLH) ou toxoide tetânico. Por exemplo, os péptidos que contêm resíduos de cisteína podem ser acoplado a um veículo usando um ligante, tal como éster de maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida (MBS), enquanto que outros péptidos podem ser acoplados a veículos que usam um agente ligante mais geral, tal como glutaraldeido. Os animais, tais como coelhos, ratos e ratinhos são imunizados com péptidos livres ou acoplados a veículo, por exemplo, por meio de injeção intraperitoneal e/ou intradérmica de emulsões que contêm cerca de 100 mg de péptido ou proteína veículo e adjuvante de Freund ou qualquer outro adjuvante conhecido por estimular uma resposta imune. Podem ser necessárias várias injeções de reforço, por exemplo, a intervalos de cerca de duas semanas, para proporcionar um título útil de anticorpo anti-péptido que possa ser detetado, por exemplo, por meio de um ensaio ELISA usando péptido livre adsorvido a uma superfície sólida. 0 título de anticorpos anti-péptido em soro de um animal imunizado pode ser aumentado por meio de seleção de anticorpos anti-péptido, por exemplo, por meio de adsorção ao péptido sobre um suporte sólido e eluindo os anticorpos selecionados de acordo com métodos bem conhecidos na técnica.

Como apreciará um perito na especialidade, e tal como se discute anteriormente, os polipéptidos da presente invenção que compreendem um epítopo imunogénico ou antigénico podem ser fusionado a outras sequências polipeptídicas. Por exemplo, os polipéptidos da presente invenção podem ser fusionados ao domínio constante de imunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM), ou a porções dos mesmos (CHI, CH2, CH3, ou qualquer combinação dos mesmos e porções dos mesmos) dando como resultado polipéptidos quiméricos. As ditas proteínas de fusão podem facilitar a purificação e podem aumentar a semivida in vivo. Isto foi demostrado para proteínas quiméricas que consistem nos dois primeiros domínios do polipéptido CD4 humano e vários domínios das regiões constantes das cadeias leves ou pesadas de imunoglobulinas de mamífero. Veja-se, por exemplo, o documento EP 394,827; Traunecker et al., Nature, 331:84-86 (1988) . Foi demostrada a administração potenciada de um antigénio através da barreira epitelial ao sistema imune para antigénios (por exemplo, insulina) conjugados a um parceiro de ligação a FcRn, tal como uma IgG ou fragmentos Fc (veja-se, por exemplo, as publicações PCT WO 96/22024 e WO 99/04813) . Descobriu-se que as proteínas de fusão a IgG que têm uma estrutura dimérica ligada com dissulfureto devido às ligações dissulfureto da porção de IgG são mais eficazes se ligando e neutralizando outras moléculas que somente polipéptidos monoméricos ou fragmentos dos mesmos. Veja-se, por exemplo, Fountoulakis et al. , J. Biochem., 270:3958-3964 (1995) . Também podem ser recombinados os ácidos nucleicos que codificam os epítopos anteriores com um gene de interesse, tal como um marcador epitópico (por exemplo, o marcador de hemaglutinina ("HA") ou o marcador flag) para ajudar na deteção e purificação do polipéptido expresado. Por exemplo, um sistema descrito por Janknecht et al. permite purificar facilmente proteínas de fusão não desnaturalizadas expresadas em linhas celulares humanas (Janknecth et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:8972-897). Neste sistema, o gene de interesse é subclonado num plasmídeo recombinante de vaccinia de tal forma que a grelha de leitura aberta do gene fusiona-se traducionalmente com um marcador amino-terminal que consiste em seis resíduos de histidina. O marcador serve como domínio de ligação a matriz para a proteína de fusão. Os extratos de células infetadas com o virus vaccinia recombinante são carregados em colunas de Ni2+, ácido nitriloacético-agatose e as proteínas marcadas com histidina podem ser eluidos seletivamente com tampões que contêm imidazol.

Podem ser geradas proteínas de fusão adicionais por meio das técnicas de embaralhamento génico, de embaralhamento de motivos, de embaralhamento de exões, e/ou de embaralhamento de codões (citados coletivamente como "embaralhamento de ADN"). O embaralhamento de ADN pode ser empregado para modular as atividades de polipéptidos da invenção, os ditos métodos podem ser utilizados para gerar polipéptidos com atividade alterada, assim como agonistas e antagonistas dos polipéptidos. Veja-se, em geral, as Patentes US com números 5.605.793, 5.811.238; 5.830.721; 5.834.252; e 5.837.458, e Patten et al. , Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33 (1997). Harayama, Trends Biotechnol. 16(2):76-82 (1998); Hansson, et al., J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999). e Lorenzo e Blasco, Biotechniques 24(2):308- 13 (1998). A alteração de polinucleótidos correspondentes a SEQ ID N° : X e os polipéptidos codificados por estes polinucleótidos pode ser conseguida por meio de embaralhamento de ADN. 0 embaralhamento de ADN implica a montagem de dois ou mais segmentos de ADN por meio de recombinação de homólogos ou de local especifico para gerar variação na sequência polinucleotidica. Os polinucleótidos da invenção, ou os polipéptidos codificados, podem ser alterados se submetendo a mutagénese aleatoriamente por meio de PCR propensa a erros, inserção aleatoriamente de nucleótidos ou outros métodos antes da recombinação. Um ou mais componentes, motivos, secções, partes, domínios, fragmentos, etc., de um polinucleótido que codifica um polipéptido da invenção podem ser combinados com um ou mais componentes, motivos, secções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma ou mais moléculas heterólogas. Anticorpos

No presente documento são descritos anticorpos e recetores de antigénios de células T (TCR) adicionais que se ligam imunoespecificamente a um polipéptido, fragmento polipeptídico, ou variante de SEQ ID N°: 2, e/ou um epítopo da presente invenção (determinado por meio de imunoensaios bem conhecidos na técnica para testar a ligação específica antigénio-anticorpo). Os anticorpos da invenção incluem, mas sem limitação, anticorpos policlonais, monoclonais, monovalentes, biespecíficos, heteroconjugados, multiespecíficos, humanos, humanizados ou quiméricos, anticorpos de cadeia única, fragmentos Fab, fragmentos F(ab'), fragmentos produzidos por uma biblioteca de expressão de Fab, anticorpos anti-idiotípicos (anti-Id) (incluindo, por exemplo, anticorpos anti-Id para anticorpos da invenção), e fragmentos de ligação a epítopo de quaisquer dos anteriores. 0 termo "anticorpo", tal como é utilizado no presente documento, refere-se a moléculas de imunoglobulina e a porções imunologicamente ativas de moléculas de imunoglobulina, isto é, moléculas que contêm um local de ligação a antigénio que se une imunoespecificamente a um antigénio. As moléculas de imunoglobulina da invenção podem ser de qualquer tipo (por exemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), classe (por exemplo, IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl e IgA2) ou subclasses de moléculas de imunoglobulina. Além disso, o termo "anticorpo" (Ac) ou "anticorpo monoclonal" (AcM) pretende incluir moléculas intactas, assim como fragmentos de anticorpo (tais como, por exemplo, fragmentos Fab e F(ab')2) que são capazes de se ligar especificamente a uma proteína. Os fragmentos Fab e F(ab')2 não possuem o fragmento Fc de anticorpo intacto, são deletados mais rapidamente da circulação do animal ou planta, e podem ter menos ligação não específica a tecido que um anticorpo intacto (Wahl et al., J. Nucl. Med., 24:316-325 (1983)).

Portanto, preferem-se estes fragmentos, assim como os produtos de uma biblioteca de expressão de FAB ou outra imunoglobulina. Além disso, os anticorpos da presente invenção incluem anticorpos quiméricos, de cadeia única, e humanizados.

Mais preferentemente, os anticorpos são fragmentos de anticorpo de ligação a antigénio humanos da presente invenção e incluem, mas sem limitação, Fab, Fab' e F(ab')2, Fd, Fv de cadeia única (scFv), anticorpos de cadeia única,

Fv ligados por dissulfureto (sdFv) e fragmentos que compreendem um domínio VL ou VH. Os fragmentos de anticorpo de ligação a antigénio, incluindo anticorpos de cadeia única, podem compreender somente a região ou regiões variáveis ou em combinação com a totalidade ou uma porção das seguintes: região dobradiça, domínios CHI, CH2 e CH3. Também se incluem na invenção fragmentos de ligação a antigénio que também compreendem qualquer combinação de região ou regiões variáveis com uma região dobradiça e domínios CHI, CH2 e CH3. Os anticorpos da invenção podem ser de qualquer origem animal, incluindo aves e mamíferos. Preferentemente, os anticorpos são humanos, murinos (por exemplo, ratinho e rato), de burro, de ovelha, de coelho, de cabra, de cobaia, de camelo, de cavalo ou de frango. Tal como é utilizado no presente documento, os anticorpos "humanos" incluem anticorpos que têm a sequência de aminoácidos de uma imunoglobulina humana e incluem anticorpos isolados de bibliotecas de imunoglobulinas humanas ou de animais transgénicos para uma ou mais imunoglobulinas humanas e que não expressam imunoglobulinas endógenas, tal como descreve-se mais adiante e por exemplo na Patente US N° 5.939.598 de Kucherlapati et al.

Os anticorpos da presente invenção podem ser monoespecíficos, biespecíficos, triespecíficos ou de maior multiespecificidade. Os anticorpos multiespecíficos podem ser específicos para diferentes epítopos de um polipéptido da presente invenção ou podem ser específicos tanto para um polipéptido da presente invenção como para um epítopo heterólogo, tal como um polipéptido heterólogo ou material de suporte sólido. Vejam-se, por exemplo, as publicações PCT WO 93/17715; WO 92/08802 WO 91/00360 WO 92/05793; Tutt, et al. , J. Immunol. 147:60-69 (1991) . As Patentes US com números 4.474.893, 4.714.681; 4.925.648; 5.573.920; 5,601,819; Kostelny et al., J. Immunol. 148:1547-1553 (1992).

Os anticorpos da presente invenção podem ser descritos ou especificados em quanto aos epítopos ou porções de um polipéptido da presente invenção ao qual reconhecem ou se ligam especificamente. Os epítopos ou porções polipeptídicas podem ser especificados tal como descreve-se no presente documento, por exemplo, por meio de posições N-terminais e C-terminais, por meio de tamanho em resíduos de aminoácidos contíguos, ou ser listados nos Quadros e Figuras. Os anticorpos que se ligam especificamente a qualquer epítopo ou polipéptido da presente invenção também podem ser excluídos. Portanto, a presente invenção inclui anticorpos que se ligam especificamente a polipéptidos da presente invenção, e permite a exclusão dos mesmos.

Os anticorpos da presente invenção também podem ser descritos ou especificados em quanto a sua reatividade cruzada. Os anticorpos que não se ligam a qualquer outro análogo, ortólogo ou homólogo de um polipéptido da presente invenção estão incluídos. Os anticorpos que se ligam a polipéptidos com pelo menos 95 %, pelo menos 90 %, pelo menos 85 %, pelo menos 80 %, pelo menos 75 %, pelo menos 70 %, pelo menos 65 %, pelo menos 60 %, pelo menos 55 %, e pelo menos 50 % de identidade (calculada usando métodos conhecidos na técnica e descritos no presente documento) a um polipéptido da presente invenção também se incluem na presente invenção. Em formas de realização específicas, os anticorpos da presente invenção reagem de maneira cruzada com homólogos murinos, de rato e/ou coelho de proteínas humanas e com os epítopos correspondentes dos mesmos. Os anticorpos que não se ligam a polipéptidos com menos de 95 %, menos de 90 %, menos de 85 %, menos de 80 %, menos de 75 %, menos de 70 %, menos de 65 %, menos de 60 %, menos de 55 %, e menos de 50 % de identidade (calculada usando métodos conhecidos na técnica e descritos no presente documento) a um polipéptido da presente invenção também se incluem na presente invenção. Numa forma de realização específica, a reatividade cruzada anteriormente descrita é com respeito a qualquer polipéptido antigénico ou imunogénico individual, ou combinações de 2, 3, 4, 5, ou mais dos polipéptidos antigénicos e/ou imunogénicos divulgados no presente documento. Na presente invenção se incluem além disso anticorpos que se ligam a polipéptidos codificados por polinucleótidos que hibridizam com um polinucleótido da presente invenção em condições restringentes de hibridização (tal como são descritos no presente documento). Os anticorpos da presente invenção também podem ser descritos ou especificados em quanto a sua afinidade de ligação a um polipéptido da invenção. As afinidades de ligação preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação ou Kd de menos de 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 X 10-3 M, 10-3 M, 5 X 10-4 M, 10-4 M, 5 X 10-5 M, 10-5 M, 5 X 10-6 Μ, 10-6M, 5 X 10-7 M, 107 M, 5 X 10-8 M, 10-8 M, 5 X 10-9 M, 10-9 M, 5 X 10-10 M, 10-10 M, 5 X 10-11 M, 10-11 M, 5 X 10-12 M, 10-12 M, 5 X 10-13 M, 10-13 M, 5 X 10-14 M, 10-14 M, 5 X 10-15 M, ou 10-15 M. A invenção também proporciona anticorpos que inibem de maneira competitiva a ligação de um anticorpo a um epitopo da invenção de acordo com é determinado por meio de qualquer método conhecido na técnica para determinar a ligação competitiva, por exemplo, o imunoensaio descrito no presente documento. Em formas de realização preferidas, o anticorpo inibe de maneira competitiva a ligação do epitopo em pelo menos 95 %, pelo menos 90 %, pelo menos 85 %, pelo menos 80 %, pelo menos 75 %, pelo menos 70 %, pelo menos 60 %, ou pelo menos 50 %.

Os anticorpos da presente invenção podem agir como agonistas ou antagonistas dos polipéptidos da presente invenção. Por exemplo, a presente invenção inclui anticorpos que interrompem as interações recetor/ligando com os polipéptidos da invenção bem parcialmente ou bem completamente. Preferentemente, os anticorpos da presente invenção se ligam a um epitopo antigénico divulgado no presente documento, ou a uma porção do mesmo. A invenção presenta tanto anticorpos específicos de recetor como anticorpos específicos de ligando. A invenção também presenta anticorpos específicos de recetor que não evitam a ligação a ligando mas que evitam a ativação do recetor. A ativação do recetor (isto é, sinalização) pode ser determinada por meio de técnicas descritas no presente documento ou conhecidas de outro modo na técnica. Por exemplo, a ativação de recetor pode ser determinada detetando a fosforilação (por exemplo, de tirosina ou de serina/treonina) do recetor ou su substrato por meio de imunoprecipitação seguida de análise de transferência de Western (por exemplo, tal como descreve-se anteriormente). Em formas de realização específicas, são proporcionados anticorpos que inibem a atividade de ligando ou a atividade de recetor em pelo menos 95 %, pelo menos 90 %, pelo menos 85 %, pelo menos 80 %, pelo menos 75 %, pelo menos 70 %, pelo menos 60 %, ou pelo menos 50 % da atividade em ausência do anticorpo. A invenção também presenta anticorpos específicos de recetor que evitam tanto a ligação do ligando como a ativação do recetor assim como anticorpos que reconhecem ao complexo ligando-recetor, e, preferentemente, não reconhecem especificamente ao recetor não ligado ou ao ligando não ligado. Do mesmo modo, se incluem na invenção anticorpos neutralizantes que se ligam ao ligando e evitam a ligação do ligando ao recetor, assim como anticorpos que se ligam ao ligando, evitando deste modo a ativação do recetor, mas que não evitam que o ligando se ligue ao recetor. Incluem-se além disso na invenção anticorpos que ativam ao recetor. Estes anticorpos podem agir como agonistas do recetor, isto é, potenciam ou ativam todas ou um subconjunto das atividades biológicas da ativação do recetor mediada por ligando, por exemplo, induzindo a dimerização do recetor. Os anticorpos podem ser especificados como agonistas, antagonistas ou agonistas inversos para as atividades biológicas que compreendem as atividades biológicas específicas dos péptidos da invenção divulgados no presente documento. Os agonistas de anticorpos anteriores podem ser preparados usando métodos conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, a publicação PCT WO 96/40281; a Patente US N° 5, 811, 097; Deng et al. , Blood 92(6):1981-1988 (1998); Chen et al. , Cancer Res. 58(16):3668-3678 (1998); Harrop et al. , J. Immunol. 161(4):1786-1794 (1998); Zhu et al., Cancer Res. 58(15):3209-3214 (1998); Yoon et al. , J. Immunol. 160(7):3170-3179 (1998); Prat et al., J. Cell. Sci. Ill (Pt2) : 237-247 (1998); Pitard et al. , J. Immunol. Methods 205(2):177-190 (1997); Liautard et al. , Cytokine 9(4):233-241 (1997); Carlson et al., J. Biol. Chem. 272(17):11295-11301 (1997); Taryman et al., Neuron 14(4):755-762 (1995); Muller et al., Structure 6(9):1153-1167 (1998); Bartunek et al., Cytokine 8(1):14-20 (1996).

Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados, por exemplo, mas sem limitação, para purificar, detetar, e ser dirigidos aos polipéptidos da presente invenção, incluindo métodos de diagnóstico e terapêuticos in vitro e in vivo. Por exemplo, os anticorpos são úteis em imunoensaios para medir gualitativamente e guantitativamente os níveis dos polipéptidos da presente invenção em amostras biológicas. Veja-se, por exemplo, Harlow et al. , Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988).

Tal como se discute em mais detalhe a continuação, os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados sozinhos ou em combinação com outras composições. Os anticorpos podem além disso ser fusionados a um polipéptido heterólogo na extremidade N- ou C-terminal ou ser conjugados guimicamente (incluindo conjugações covalentes e não covalentes) a polipéptidos ou outras composições. Por exemplo, os anticorpos da presente invenção podem ser fusionados ou conjugados recombinantemente a moléculas úteis como marcadores em ensaios de deteção e como moléculas efetoras, tais como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionucleótidos ou toxinas. Veja-se, por exemplo, as publicações PCT WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; a Patente US N° 5.314.995; e o documento EP 396.387.

Os anticorpos da invenção incluem derivados gue são modificados, isto é, por meio da ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo, de tal forma que a ligação covalente não evita que o anticorpo gere uma resposta antiidotipica. Por exemplo, mas não como limitação, os derivados de anticorpos incluem anticorpos que foram modificados, por exemplo, por meio de glicosilação, acetilação, pegilação, fosforilação, amidação, derivatização por meio de grupos protetores/bloqueantes conhecidos, clivagem proteolitica, ligação a um ligando celular ou outra proteína, etc. Pode ser levados a quaisquer de numerosas modificações químicas por meio de técnicas conhecidas, incluindo, mas sem limitação, clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica de tunicamicina, etc. Além disso, o derivado pode conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

Os anticorpos da presente invenção podem ser gerados por meio de qualquer método adequado conhecido na técnica.

Os anticorpos da presente invenção podem compreender anticorpos policlonais. Os métodos para preparar anticorpos policlonais são conhecidos para o perito na especialidade (Harlow, et al. , Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988); e Current Protocols, Capítulo 2) . Num método preferido, se prepara uma preparação da proteína PCSK9b ou PCSK9c e se purifica para deixá-la substancialmente livre de contaminantes naturais. A dita preparação é introduzida então num animal para produzir antissoros policlonais de maior atividade específica. Por exemplo, pode ser administrado um polipéptido da invenção a vários animais hospedadores incluindo, mas sem limitação, coelhos, ratinhos, ratos, etc. para induzir a produção de soros que contêm anticorpos policlonais específicos para o antigénio. A administração dos polipéptidos da presente invenção pode exigir uma ou mais injeções de um agente de imunização e, se for desejado, um adjuvante. Podem ser utilizados vários adjuvantes para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira, e incluem, mas sem limitação, adjuvante de Freund (completo ou incompleto), géis minerais, tais como hidróxido de alumínio, sustâncias tensioativas, tais como lisolecitina, poliois plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas, hemocianina de lapa californiana, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis, tais como BCG (Bacille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Os ditos adjuvantes também conhecem-se bem na técnica. Para os fins da invenção, um "agente imunizante" pode ser definido como um polipéptido da invenção, incluindo fragmentos, variantes, e/ou derivados dos mesmos, além de fusões com os polipéptidos heterólogos e outras formas dos polipéptidos descritos no presente documento.

Tipicamente, o agente imunizante e/ou o adjuvante será injetado ao mamífero por meio de múltiplas injeções subcutâneas ou intraperitoneais, embora também podem ser administrado intramuscularmente, e/ou por via IV. 0 agente imunizante pode incluir polipéptidos da presente invenção ou uma proteína de fusão ou variantes das mesmas. Dependendo da natureza dos polipéptidos (isto é, hidrofobicidade percentual, hidrofilidade percentual, estabilidade, carga neta, ponto isoelétrico, etc.), pode ser útil conjugar o agente imunizante a uma proteína que se sabe que é imunogénica no mamífero que se está a imunizar. A dita conjugação inclui bem conjugação derivatizando grupos funcionais químicos ativos tanto ao polipéptido da presente invenção e a proteína imunogénica, de tal modo que se forma uma ligação covalente, ou por meio de metodologia baseada em proteínas de fusão, ou outros métodos conhecidos pelo perito na especialidade. Os exemplos das ditas proteínas imunogénicas incluem, mas sem limitação, hemocianina de keyhole limpet, albumina de soro, tiroglobulina bovina e inibidor de tripsina de soja. Podem ser utilizados vários adjuvantes para aumentar a resposta imunológica, dependendo da espécie hospedeira, incluindo, mas sem limitação adjuvante de Freund (completo e incompleto), géis minerais, tais como hidróxido de alumínio, sustâncias tensioativas, tais como lisolecitina, poliois plurónicos, polianiões, péptidos, emulsões oleosas, hemocianina de keyhole limpet, dinitrofenol, e adjuvantes humanos potencialmente úteis, tais como BCG (Bacille Calmette-Guerin) e Corynebacterium parvum. Os exemplos adicionais de adjuvantes que podem ser utilizados incluem o adjuvante MPL-TDM (lípido A de monofosforilo, dicorinomicolato de trealose sintético). 0 protocolo de imunização pode ser selecionado por um perito na especialidade sem experimentação desnecessária.

Os anticorpos da presente invenção podem compreender anticorpos monoclonais. Os anticorpos monoclonais podem ser preparados usando métodos de hibridoma, tais como aqueles descritos por Kohler e Milstein, Nature, 256:495 (1975) e a Patente US N° 4.376.110, por Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988), por Hammerling, et al. , Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas (Elsevier, N.E., págs. 563-681 (1981); Kohler et al. , Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kohler et al. , Eur. J. Immunol. 6:292 (1976), ou outros métodos conhecidos pelo perito na especialidade. Outros exemplos de métodos que podem ser utilizados para produzir anticorpos monoclonais incluem, mas sem limitação, a técnica de hibridoma de linfócitos B (Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4:72; Cole et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80:2026-2030), e a técnica de hibridoma de VEB (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., págs. 77-96). Os ditos anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulina, incluindo IgG, IgM, IgE, IgA, IgD e qualquer subclasse dos mesmos. 0 hibridoma que produz o AcM desta invenção pode ser cultivado in vitro ou in vivo. A produção de títulos elevados de AcM in vivo converte a este no método de produção preferido.

Num método de hibridoma, imuniza-se tipicamente a um ratinho, um ratinho humanizado, um ratinho com um sistema imune humano ou outro animal hospedeiro adequado com um agente imunizante para provocar linfócitos que produzam ou sejam capazes de produzir anticorpos que se ligarão especificamente ao agente imunizante. Como alternativa, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. 0 agente imunizante incluirá tipicamente polipéptidos da presente invenção ou uma proteína de fusão dos mesmos. Preferentemente, o agente imunizante consiste num polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c ou, mais preferentemente, numa célula que expressa polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c. As ditas células podem ser cultivadas em qualquer meio de cultivo tissular adequado; no entanto, é preferível cultivar as células em meio Eagle modificado de Earle suplementado com soro bovino fetal a 10 % (inativado a cerca de 56 °C) , e suplementar com cerca de 10 g/1 de aminoácidos não essenciais, cerca de 1,000 U/ml de penicilina, e cerca de 100 pg/ml de estreptomicina. Em geral, são utilizados linfócitos de sangue periférico ("PBL") se forem desejadas células de origem humana, ou são utilizados células de baço ou de nódulo linfático se forem desejadas fontes de mamífero não humano. Então são fusionados os linfócitos com uma linha celular imortalizada usando um agente de fusão adequado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986), págs. 59-103). As linhas celulares imortalizadas normalmente são células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de origem de roedor, bovino e humano. Geralmente, são utilizadas linhas celulares de mieloma de rato ou de ratinho. As células de hibridoma podem ser cultivadas num meio de cultivo adequado que contém preferentemente uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células não fusionadas imortalizadas. Por exemplo, se as células parentais não possuem da enzima hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultivo para os hibridomas incluirá tipicamente hipoxantina, aminopterina, e timidina ("meio HAT"), evitando estas substâncias o crescimento das células deficientes em HGPRT.

As linhas celulares imortalizadas preferidas são aquelas que se fusionem eficazmente, que suportem níveis de expressão elevados de anticorpo pelas células produtoras de anticorpo selecionadas, e que sejam sensíveis a um meio, tal como meio HAT. As linhas celulares imortalizadas preferidas são linhas de mieloma murino que podem ser obtidas, por exemplo, através do Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California e a American Type Culture Collection, Manassas, Virginia. A mais preferida é a linha celular parental de mieloma (SP20) proporcionada pela ATCC®. Tal como é inferido ao longo da memória descritiva, também foram descritas linhas de mieloma humano e de heteromieloma de ratinho-humano para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984); Brodeur et al. , Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., Nova Iorque, (1987) págs. 51-63) . O meio de cultura no qua são cultivadas as células de hibridoma pode ser testado em busca da presença de anticorpos monoclonais dirigidos contra os polipéptidos da presente invenção. Preferentemente, a especificidade de ligação dos anticorpos monoclonais produzidos pelas células de hibridoma é determinado por meio de imunoprecipitação ou por meio de um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzimas (ELISA). As ditas técnicas conhecem-se na técnica e por os peritos na especialidade. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal pode ser determinado, por exemplo, por meio do análise de Scatchard de Munson e Pollart, Anal. Biochem., 107:220 (1980).

Depois de identificar as células de hibridoma desejadas, os clones podem ser subclonados por meio de procedimentos de diluição limitante e ser feitos crescer por meio de métodos convencionais (Goding, anteriormente citado, e/ou de acordo com Wands et al., (Gastroenterology 80:225-232 (1981)). Os meios de cultura adequados para este fim incluem, por exemplo, meio Eagle modificado de Dulbecco e RPMI-1640. Como alternativa, as células de hibridoma podem ser cultivadas in vivo como ascitis num mamífero.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones podem ser isolados ou purificados a partir do meio de cultura ou fluido de ascite por meio de procedimentos de purificação de imunoglobulinas convencionais, tais como, por exemplo, proteína A-sefarose, cromatografia de hidroxilapatita, cromatografia de exclusão em gel, eletroforese em gel, diálise, ou cromatografia de afinidade. O perito na especialidade reconhecerá que existem uma diversidade de métodos para a produção de anticorpos monoclonais e, portanto, a invenção não se limita somente a sua produção em hibridomas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por meio de métodos de ADN recombinante, tais como os descritos na Patente US N° 4.816.567. Neste contexto, a expressão "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo derivado de um somente clone eucariota, fago, ou procariota. O ADN que codifica os anticorpos monoclonais da invenção pode ser isolado e sequenciado facilmente usando procedimentos convencionais (por exemplo, por meio da utilização de sondas de oligonucleótido que podem se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias leves e pesadas de anticorpos murinos, ou das ditas cadeias de fontes humanas, humanizadas ou outras). As células de hibridoma da invenção servem como fonte preferida do dito ADN. Uma vez isolado, o ADN pode ser introduzido em vetores de expressão, que depois se transformam em células hospedeiras, tais como células COS de macaco, células de ovário de hámster chinês (CHO), ou células de mieloma que de outro modo não produzem proteína de imunoglobulina, para obter a síntese dos anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. Também pode ser modificado o ADN, por exemplo, substituindo a sequência codificante para domínios constantes de cadeia pesada e leve humana em lugar das sequências murinas homólogas (Patente US N° 4.816.567; Morrison et al. , anteriormente citado) ou ligando covalentemente a sequência codificante de imunoglobulina à totalidade ou parte da sequência codificante de um polipéptido não de imunoglobulina. 0 dito polipéptido não de imunoglobulina pode ser substituído pelos domínios constantes de um anticorpo da invenção, ou pode ser substituído pelos domínios variáveis de um local de combinação com antigénio de um anticorpo da invenção para criar um anticorpo bivalente quimérico.

Os anticorpos podem ser anticorpos monovalentes. Conhecem-se bem na técnica métodos para preparar anticorpos monovalentes. Por exemplo, um método implica a expressão recombinante de cadeia leve e cadeia pesada modificada de imunoglobulina. A cadeia pesada é truncada geralmente em qualquer posição na região Fc para evitar a reticulação da cadeia pesada. Como alternativa, substituem-se os resíduos de cisteina relevantes com outro resíduo de aminoácido ou eliminam-se para evitar a reticulação.

Também são adequados os métodos in vitro para preparar anticorpos monovalentes. A digestão de anticorpos para produzir fragmentos dos mesmos, em particular, fragmentos

Fab, pode ser lavada a cabo usando técnicas rotineiras conhecidas na técnica.

Podem ser preparados anticorpos monoclonais usando uma grande variedade de técnicas conhecidas na técnica, incluindo a utilização de tecnologias de hibridoma, recombinantes, e de apresentação em fagos, ou uma combinação das mesmas. Por exemplo, podem ser produzidos anticorpos monoclonais usando técnicas de hibridoma, incluindo aquelas conhecidas na técnica e ensinadas, por exemplo, em Harlow et ai., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988); Hammerling, et al., em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.E., 1981). A expressão "anticorpo monoclonal", tal como é utilizado no presente documento, não se limita a anticorpos produzidos por meio de tecnologia de hibridoma. A expressão "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo que se deriva de um único clone, incluindo qualquer clone eucariota, procariota ou de fago, e não ao método por meio do que é produzido.

Os métodos para produzir e selecionar anticorpos específicos usando tecnologia de hibridoma são rotineiros e conhecem-se bem na técnica e são discutidos em detalhe nos Exemplos descritos no presente documento. Num exemplo não limitante, os ratinhos podem ser imunizados com um polipéptido da invenção ou com uma célula que expressa o dito péptido. Uma vez que se deteta uma resposta imune, por exemplo, detetam-se anticorpos específicos para o antigénio no soro de ratinho, o baço de ratinho é recolhido e são isolados os esplenócitos. Depois fusionam-se os esplenócitos por meio de técnicas bem conhecidas a qualquer célula de mieloma, por exemplo, células da linha celular SP20 disponível através da ATCC®. Os hibridomas são selecionados e clonados por meio de diluição limitante. Depois são testados os clones de hibridoma por meio de métodos conhecidos na técnica para células que secretam anticorpos capazes de se ligar a um polipéptido da invenção. 0 fluido de ascite, que geralmente contém elevados níveis de anticorpos, pode ser gerado imunizando ratinhos com clones de hibridoma positivos.

Por conseguinte, a presente invenção proporciona métodos para gerar anticorpos monoclonais assim como anticorpos produzidos por meio do método que compreende cultivar uma célula de hibridoma que secreta um anticorpo da invenção, no que, preferentemente, é gerado o hibridoma fusionando esplenócitos isolados de um ratinho imunizado com um antigénio da invenção com células de mieloma e depois selecionar os hibridomas resultantes da fusão de clones de hibridoma que secretam um anticorpo capaz de se ligar ao polipéptido da invenção.

Podem ser gerados fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos específicos por meio de técnicas conhecidas. Por exemplo, podem ser produzidos fragmentos Fab e F(ab')2 da invenção por meio de clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, usando enzimas, tais como papaina (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2) · Os fragmentos F(ab')2 contêm a região variável, a região constante de cadeia leve e o domínio CHI da cadeia pesada.

Por exemplo, os anticorpos da presente invenção também podem ser gerados utilizando diversos métodos de apresentação em fagos conhecidos na técnica. Nos métodos de apresentação em fagos, os domínios de anticorpo funcionais são mostrados sobre a superfície de partículas de fago que portam as sequências polinucleotídicas que os codificam. Em particular, o dito fago pode ser usado para mostrar domínios de ligação a antigénios expressados a partir de um repertório ou biblioteca combinatória de anticorpos (por exemplo, humana ou murina). Os fagos que expressam um domínio de ligação a antigénio que se liga ao antigénio de interesse podem ser selecionados ou identificados com antigénio, por exemplo, usando antigénio marcado ou antigénio ligado ou capturado sobre uma superfície sólida ou uma pérola. Os fagos usados nestes métodos são tipicamente fagos filamentosos que incluem domínios de ligação fd e M13 expressados a partir de fago com domínios de anticorpo Fab, Fv ou Fv estabilizado com dissulfureto fusionados recombinantemente à proteína de gene III ou de gene VIII de fago. Os exemplos de métodos de apresentação em fagos que podem ser utilizados para produzir os anticorpos da presente invenção incluem aqueles divulgados em Brinkman et al. , J. Immunol. Methods 182:41-50 (1995); Ames et al., J. Immunol. Methods 184:177-186 (1995); Kettleborough et al. , Eur. J. Immunol. 24:952-958 (1994) . Persic et al., Gene 187 9-18 (1997); Burton et al., Advances in Immunology 57:191-280 (1994); o pedido PCT N° : PCT/GB91/01134; as publicações PCT WO 90/02809; WO 91/10737; WO 92/01047; WO 92/18619; WO 93/11236; WO 95/15982; WO 95/20401; e as Patentes US N° 5.698.426; 5.223.409; 5.403.484; 5.580.717; 5.427.908; 5.750.753; 5.821.047; 5.571.698; 5.427.908; 5.516.637; 5.780.225; 5.658.727; 5.733.743 e 5.969.108.

Tal como descreve-se nas referências anteriores, depois da seleção do fago, podem ser isoladas as regiões codificantes de anticorpo do fago e usadas para gerar anticorpos completos, incluindo anticorpos humanos, ou qualquer outro fragmento de ligação a antigénio desejado, e ser expressadas em qualquer hospedeiro desejado, incluindo células de mamífero, células de inseto, células vegetais, leveduras, e bactéria, por exemplo, tal como descreve-se detalhadamente mais adiante. Por exemplo, as técnicas para produzir recombinantemente fragmentos Fab, Fab' e F(ab')2 também podem ser utilizadas usando métodos conhecidos na técnica, tais como aqueles divulgados na publicação PCT WO 92/22324; Mullinax et al., BioTechniques 12(6):864-869 (1992); e Sawai et al., AJRI 34:26-34 (1995); e Better et al., Science 240:1041-1043 (1988). Os exemplos de técnicas que podem ser utilizados para produzir Fv e anticorpos de cadeia única incluem aquelas descritas nas Patentes US 4.946.778 e 5.258.498; Huston et al., Methods in Enzymology 203:46-88 (1991); Shu et al., PNAS 90:7995-7999 (1993); e Skerra et al., Science 240:1038-1040 (1988).

Para algumas utilizações, incluindo a utilização in vivo de anticorpos em seres humanos e em ensaios de deteção in vitro, pode ser preferível usar anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Um anticorpo quimérico é uma molécula na qual as diferentes porções do anticorpo são derivadas de diferentes espécies animais, tais como anticorpos que têm uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino e uma região constante de imunoglobulina humana. Conhecem-se na técnica métodos para produzir anticorpos quiméricos. Veja-se, por exemplo, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al. , (1989) J. Immunol. Methods 125:191-202; Cabilly et al., Taniguchi et al., documento EP 171496; Morrison et al., documento EP 173494; Neuberger et al. , documento WO 8601533; Robinson et al. , documento WO 8702671; Boulianne et al., Nature 312:643 (1984); Neuberger et al. , Nature 314:268 (1985); Patentes US com números 5.807.715; 4.816.567; e 4.816.397. Os anticorpos humanizados são moléculas de anticorpo de espécies não humanas que se ligam ao antigénio desejado que tem uma ou mais regiões determinantes da complementaridade (CDR) da espécie não humana e regiões marco conservadas de uma molécula de imunoglobulina humana. Com frequência, os resíduos estruturais nas regiões marco conservadas serão substituídos com o resíduo correspondente do anticorpo dador de CDR para alterar, preferentemente melhorar, a ligação a antigénio. Estas substituições estruturais são identificadas por meio de métodos bem conhecidos na técnica, por exemplo, por meio de modelagem das interações da CDR e resíduos estruturais para identificar resíduos estruturais importantes para a ligação a antigénio e comparação de sequência para identificar resíduos estruturais frequentes em posições concretas. (Veja-se, por exemplo, Queen et al., a Patente US N° 5,585,089; Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)). Os anticorpos podem ser humanizados utilizando uma diversidade de técnicas conhecidas na técnica incluindo, por exemplo, enxerto de CDR (documento EP 239,400; publicação PCT WO 91/09967; Patentes US com números 5.225.539, 5.530.101; e 5.585.089), chapado ou revestimento (documentos EP 592.106; EP 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka et al. , Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska. et al., PNAS 91:969-973 (1994)), e embaralhamento de cadeia (Patente US N° 5.565.332) . Em geral, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos neste a partir de uma fonte que não é humana. Estes resíduos de aminoácidos não humanos são citados com frequência como resíduos "importados", que se tomam normalmente de um domínio variável "dador". A humanização pode ser levada a cabo essencialmente seguindo os métodos de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986) . Reichmann et al. , Nature, 332:323-327 (1988) . Verhoeyen et al. , Science, 239:1534-1536 (1988), por meio da substituição de CDR de roedor ou sequências de CDR pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Por conseguinte, os ditos anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (Patente US N° 4.816.567), nos que substancialmente menos de um domínio variável humano foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos que alguns resíduos de CDR e possivelmente alguns resíduos de FR estão substituídos a partir de locais análogos em anticorpos de roedores.

Em geral, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todas de pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos que todos ou substancialmente todas as regiões CDR se correspondem com aqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência consenso de imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado também compreenderá de maneira ótima pelo menos uma porção da região constante de imunoglobulina (Fc), tipicamente aquelas de uma imunoglobulina humana (Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986) . Riechmann et al. , Nature 332:323-329 (1988)1 e Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). São particularmente desejáveis os anticorpos completamente humanos para o tratamento de pacientes humanos. Os anticorpos humanos podem ser produzidos por uma diversidade de métodos conhecidos na técnica, incluindo métodos de apresentação em fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticorpo derivadas de sequências de imunoglobulinas humanas. Vejam-se também as Patentes US com números 4.444.887 e 4.716.111, e as publicações PCT WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735, e WO 91/10741. As técnicas de Cole et al., e Boerder et al., também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al. , Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Riss, (1985); e Boerner et al. , J. Immunol., 147(1):86-95, (1991)).

Também podem ser produzidos anticorpos humanos usando ratinhos transgénicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que podem expressar genes de imunoglobulina humana. Por exemplo, podem ser introduzidos os complexos génicos de cadeia pesada e leve de imunoglobulina humana aleatoriamente ou por meio de recombinação de homólogos em células estaminais embrionárias de ratinho. Como alternativa, a região variável humana, a região constante e a região de diversidade podem ser introduzidas em células estaminais embrionárias de ratinho além dos genes de cadeia pesada e leve humanos. Os genes de cadeia leve e pesada de imunoglobulina de ratinho podem ser tornados não funcionais por separado ou simultaneamente por meio da introdução de locus de imunoglobulina humana por meio de recombinação de homólogos. Em particular, a eliminação homozigótica das regiões JH evita a produção de anticorpos endógenos. As células estaminais embrionárias modificadas são expandidas e microinjetadas em blastocistos para produzir ratinhos quiméricos. Depois se criam os ratinhos quiméricos para que produzam descendência homozigótica que exprease anticorpos humanos. Os ratinhos transgénicos são imunizados de maneira normal com um antigénio selecionado, por exemplo, a totalidade ou parte de um polipéptido da invenção. Podem ser obtidos anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio a partir dos ratinhos transgénicos imunizados usando tecnologia de hibridoma convencional. Os transgenes de imunoglobulina humana portados pelos ratinhos transgénicos são reorganizados durante a diferenciação de linfócitos B, e posteriormente são submetidos a mudanza de classe e mutação somática. Portanto, usando a dita técnica, é possível produzir anticorpos terapeuticamente úteis de IgG, IgA, IgM e IgE. Para uma revisão desta tecnologia para produzir anticorpos humanos, veja-se Lonberg e Huszar, Int. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995). Para uma discussão detalhada desta tecnologia para produzir anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produzir os ditos anticorpos, veja-se, por exemplo, as publicações PCT WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; WO 96/33735; a Patente Europeia N°: 0 598 877; as Patentes US com números 5.413.923, 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; e 5.939.598.

Além disso, pode ser contratadas empresas tais como Genpharm (San Jose, CA) e Medarex, Inc. (Princeton, NJ) para que proporcionem anticorpos humanos dirigidos contra um antigénio selecionado usando uma tecnologia similar à descrita anteriormente.

De maneira similar, podem ser produzidos anticorpos humanos introduzindo locus de imunoglobulina humanos em animais transgénicos, por exemplo, ratinhos nos que os genes endógenos de imunoglobulina foram inativados parcial ou completamente. Após a exposição, observa-se s produção de anticorpo humano, que se assemelha estreitamente à vista em seres humanos a todos os aspetos, incluindo o embaralhamento de genes, montagem, e a criação de um repertório de anticorpos. Esta estratégia descreve-se, por exemplo, nas Patentes US N° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.106, e nas seguintes publicações científicas: Marks et ai., Biotechnol., 10:779— 783 (1992). Lonberg et ai., Nature 368:856-859 (1994); Fishwild et ai., Nature Biotechnol., 14:845-51 (1996). Neuberger, Nature Biotechnol.., 14:826 (1996); Lonberg e Huszer, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995) .

Podem ser gerados anticorpos completamente humanos que reconhecem a um epítopo selecionado usando uma técnica citada como "seleção guiada". Nesta abordagem, é utilizado um anticorpo monoclonal não humano, por exemplo, um anticorpo de ratinho para guiar a seleção de um anticorpo completamente humano que reconheça ao mesmo epítopo. (Jespers et al., Bio/Technology 12:899-903 (1988)).

Além disso, os anticorpos para os polipéptidos da invenção podem, por sua vez, ser utilizados para gerar anticorpos anti-idiotipo que "imitam" a polipéptidos da invenção usando técnicas bem conhecidas para os peritos na especialidade. (Veja-se, por exemplo, Greenspan e Bona, FASEB J. 7(5):437-444; (1989) e Nissinoff, J. Immunol. 147(8):2429-2438 (1991)). Por exemplo, podem ser utilizados anticorpos que se ligam a e inibem competitivamente a multimerização e/ou a ligação de um polipéptido da invenção a um ligando para gerar anti-idiotipos que "imitam" ao domínio de multimerização e/ou de ligação do polipéptido e, por conseguinte, se ligam a e neutralizam o polipéptido e/ou su ligando. Os ditos anti-idiotipos ou fragmentos Fab neutralizantes dos ditos anti-idiotipos podem ser utilizados em regímenes terapêuticos para neutralizar ligandos polipeptídicos. Por exemplo, os ditos anticorpos anti-idiotipo podem ser utilizados para se ligar a um polipéptido da invenção e/ou para se ligar a sus ligandos/recetores, e deste modo bloquear su atividade biológica.

Podem ser produzidos os ditos anticorpos anti-idiotípicos capazes de se ligar ao polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c num procedimento em duas etapas. 0 dito método faz utilização do facto de que os anticorpos são antigénios por si mesmo, e portanto, é possível obter um anticorpo que se ligue a um segundo anticorpo. De acordo com este método, são utilizados anticorpos específicos de proteína para imunizar a um animal, preferentemente a um ratinho. Os esplenócitos do dito animal são utilizados então para produzir células de hibridoma, e são rastreadas as células de hibridoma para identificar clones que produzem um anticorpo cuja capacidade para se ligar ao anticorpo específico de proteína possa ser bloqueada pelo polipéptido. Os ditos anticorpos compreendem anticorpos anti-idiotipicos para o anticorpo especifico de proteína e podem ser utilizados para imunizar a um animal para induzir a formação de anticorpos específicos de proteína adicionais.

Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos biespecíficos. Os anticorpos biespecíficos são monoclonais, preferentemente anticorpos humanos ou humanizados, que têm especificidades de ligação para pelo menos dois antigénios diferentes, na presente invenção, uma das especificidades de ligação pode ser dirigido contra um polipéptido da presente invenção, e a outra pode ser para qualquer outro antigénio, e preferentemente para uma proteína, recetor, subunidade de recetor da superfície celular, um antigénio específico de tecido, uma proteína derivada de vírus, uma proteína de envoltório codificada por um vírus, uma proteína derivada de bactéria, ou uma proteína de superfície bacteriana, etc.

Conhecem-se na técnica métodos para produzir anticorpos biespecíficos. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecíficos está baseada na expressão conjunta de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas têm diferentes especificidades (Milstein e Cuello, Nature, 305:537-539 (1983). Devido à distribuição aleatoriamente das cadeias leves e pesadas de imunoglobulina, estes hibridomas (quadromas) reproduzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpo diferentes, das quais somente uma tem a estrutura biespecifica correta. A purificação da molécula correta consegue-se normalmente por meio de etapas de cromatografia de afinidade. Divulgam-se procedimentos semelhantes no documento WO 93/08829, publicado em 13 de maio de 1993, e em Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-3659 (1991).

Os domínios variáveis de anticorpo com as especificidades de ligação desejadas (locais de combinação anticorpo-antigénio) podem ser fusionados a sequências de domínio constante de imunoglobulina. A fusão é preferentemente com um domínio constante de cadeia pesada de imunoglobulina, que compreende pelo menos parte das regiões dobradiça, CH2 e CH3. Prefere-se ter presente a primeira região constante de cadeia pesada (CHI) que contém o local necessário para a ligação da cadeia leve em pelo menos uma das fusões. Os ADN que codificam as fusões de cadeia pesada de imunoglobulina e, se for desejado, a cadeia leve de imunoglobulina, são inseridas em vetores de expressão separados, e são transformadas de maneira conjunta num organismo hospedeiro adequado. Para detalhes adicionais acerca da geração de anticorpos biespecificos veja-se, por exemplo, Suresh et al., Meth. In Enzym., 121:210 (1986) .

Também são contemplados na presente invenção anticorpos heteroconjugados. Os anticorpos heteroconjugados estão compostos de dois anticorpos ligados covalentemente. Foi proporsto os ditos anticorpos para, por exemplo, dirigir células do sistema imune a células não desejadas (Patente US N° 4.676.980), e para o tratamento de infeção por VIH (documentos WO 91/00360, WO 92/20373, e EP03089) . Contempla*se que os anticorpos possam ser preparados in vitro usando métodos conhecidos na química de proteínas sintéticas, incluindo aqueles que implicam agentes reticulantes. Por exemplo, podem ser construídas imunotoxinas usando uma reação de permuta de dissulfureto ou formando uma ligação tioéster. Os exemplos de reagentes adequados para este fim incluem iminotioato e metil-4-mercaptobutirimidato e aqueles divulgados, por exemplo, na Patente US N° 4.676.980.

Polinucleótidos que codificam anticorpos A invenção proporciona além disso polinucleótidos que compreendem uma sequência nucleotídica que codifica um anticorpo da invenção e fragmentos dos mesmos. A invenção também abrange polinucleótidos que hibridizam em condições de hibridização restringentes ou de menor restringência, por exemplo, tal como define-se anteriormente, a polinucleótidos que codificam um anticorpo, preferentemente, que se ligam especificamente a um polipéptido da invenção, preferentemente, preferentemente a um anticorpo que se liga a um polipéptido que tem as sequências de aminoácidos de SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 4.

Podem ser obtidos os polinucleótidos e ser determinadar a sequência nucleotidica dos polinucleótidos por meio de qualquer método conhecido na técnica. Por exemplo, se a sequência nucleotidica do anticorpo for conhecida, pode ser montado um polinucleótido que codifica ao anticorpo a partir de oligonucleótidos quimicamente sintetizados (por exemplo, tal como descreve-se em Kutmeier et al., BioTechniques 17:242 (1994)), que, em resumo, implicam a síntese de oligonucleótidos sobrepostas que contêm porções da sequência que codifica ao anticorpo, a hibridização e o ligamento de aqueles oligonucleótidos, e depois a amplificação dos oligonucleótidos ligados por meio da PCR.

Como alternativa, pode ser gerado um polinucleótido que codifica a um anticorpo a partir de ácido nucleico de uma fonte adequada. Se não há disponível um clone que contém um ácido nucleico que codifica um anticorpo particular, mas a sequência da molécula de anticorpo é conhecida, pode ser sintetizado quimicamente ou ser obtido um ácido nucleico que codifica a imunoglobulina a partir de uma fonte adequada (por exemplo, uma biblioteca de ADNc, ou uma biblioteca de ADNc gerada a partir de, ou um ácido nucleico, preferentemente poli A + ARN isolado de, qualquer tecido ou células que expressam ao anticorpo, tais como células de hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo da invenção) por meio de amplificação PCR usando iniciadores sintéticos hibridizáveis às extremidades 3' e 5' da sequência ou por meio de clonagem usando uma sonda oligonucleotídica específica para a sequência génica particular a ser identificada, por exemplo, um clone de ADNc a partir de uma biblioteca de ADNc que codifica ao anticorpo. Os ácidos nucleicos amplificados gerados por meio da PCR podem ser clonados então em vetores de clonagem replicáveis usando qualquer método bem conhecido na técnica.

Uma vez que foi determinada a sequência nucleotidica e a correspondente sequência de aminoácido, a sequência nucleotidica do anticorpo pode ser manipulada usando métodos bem conhecidos na técnica para a manipulação se sequências nucleotidicas, por exemplo, técnicas de ADN recombinante, mutagénese de local dirigido, PCR, etc. (vejam-se, por exemplo, as técnicas descritas em Sambrook et al. , 1990, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY e Ausubel et al., eds., 1998, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY) , para gerar anticorpos que têm uma sequência de aminoácido diferente, por exemplo, para criar substituições, deleções, e/ou inserções de aminoácidos. A sequência de aminoácido dos domínios variáveis da cadeia leve e/ou pesada pode ser inspecionada para identificar as sequências das regiões determinantes da complementaridade (CDR) por meio de métodos que se conhecem bem na técnica, por exemplo, por meio de comparação com sequências de aminoácidos conhecidas de outras regiões variáveis de cadeia pesada e leve para determinar as regiões de hipervariabilidade de sequência. Podem ser inseridas uma ou mais das CDR nas regiões marco conservadas usando técnicas de ADN recombinante rotineiras, por exemplo, em regiões marco conservadas humanas para humanizar um anticorpo não humano, tal como descreve-se anteriormente. As regiões marco conservadas podem ser regiões marco conservadas de origem natural ou consenso, e preferentemente regiões marco conservadas humanas (veja-se, por exemplo, Chothia et al. , J. Mol. Biol. 278: 457-479 (1998) para um lista de regiões marco conservadas humanas). Preferentemente, o polinucleótido gerado por meio da combinação das regiões marco conservadas e as CDR codifica um anticorpo que se liga especificamente ao polipéptido da invenção. Preferentemente, tal como se discute anteriormente, podem ser efetuadas uma ou mais substituições de aminoácidos nas regiões marco conservadas, e, preferentemente, as substituições de aminoácidos melhoram a ligação do anticorpo a seu antigénio. Adicionalmente, os ditos métodos podem ser utilizados para produzir substituições ou deleções de aminoácidos de um ou mais resíduos de cisteína da região variável que participam numa ligação dissulfureto intracadeia para gerar moléculas de anticorpo que não possuem de um ou mais ligações dissulfureto intracadeia. Outras alterações no polinucleótido estão abrangidas pela presente invenção e estão dentro das capacidades da técnica.

Além disso, podem ser utilizados as técnicas desenvolvidas para a produção de "anticorpos quiméricos" (Morrison et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. 81:851-855 (1984) . Neuberger et ai., Nature 312:604-608 (1984); Takeda et ai., Nature 314:452-454 (1985)) splicing de genes a partir de uma molécula de anticorpo de ratinho com a especificidade de antigénio adequada juntamente com genes de uma molécula de anticorpo humana com a atividade biológica adequada. Tal como descreve-se anteriormente, um anticorpo quimérico é uma molécula na qual as diferentes porções derivam-se de diferentes espécies animais, tais como aquelas que têm uma região variável derivada de um AcM murino e uma região constante de imunoglobulina humana, por exemplo, anticorpos humanizados.

Como alternativa, podem ser adaptadas as técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (Patente US N° 4.946.778; Bird, Science 242:423- 42 (1988); Huston et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:5879-5883 (1988); e Ward et ai., Nature 334:544-54 (1989)) para produzir anticorpos de cadeia única. Os anticorpos de cadeia única formam-se ligando fragmentos de cadeia pesada e leve da região Fv por meio de uma ponte de aminoácido, dando como resultado um polipéptido de cadeia única. Também podem ser utilizadas técnicas para a montagem de fragmentos de Fv funcionais em E. coli (Skerra et al., Science 242:10381041 (1988)) .

Mais preferentemente, pode ser obtido um clone que codifica um anticorpo da presente invenção de acordo com o método descrito na secção de Exemplos no presente documento. Métodos para produzir anticorpos

Os anticorpos da invenção podem ser produzidos por meio de qualquer método conhecido na técnica para a síntese de anticorpos, em particular, por meio de síntese química ou preferentemente, por meio de técnicas de expressão recombinante. A expressão recombinante de um anticorpo da invenção, ou um fragmento, derivado ou análogo do mesmo (por exemplo, uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo da invenção ou um anticorpo de cadeia única da invenção), requer da construção de um vetor de expressão que contém um polinucleótido que codifica ao anticorpo. Uma vez que foi obtido um polinucleótido que codifica uma molécula de anticorpo ou uma cadeia pesada ou leve de um anticorpo, ou uma porção das mesmas (preferentemente que contém o domínio variável da cadeia pesada ou leve), da invenção, pode ser produzidos o vetor par ala produção da molécula de anticorpo por meio de tecnologia de ADN recombinante usando técnicas bem conhecidas na técnica. Portanto, no presente documento são descritos métodos para preparar uma proteína expressando um polinucleótido que contém uma sequência nucleotídica que codifica um anticorpo. Podem ser utilizados métodos que conhecem-se bem pelos peritos na especialidade para construir vetores de expressão que contêm sequências codificantes de anticorpo e sinais de controlo transcricional e traducional adequadas. Estes métodos incluem, por exemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas, e recombinação genética in vivo. A invenção, portanto, proporciona vetores replicáveis que compreendem uma sequência nucleotídica que codifica uma molécula de anticorpo da invenção, ou uma cadeia pesada ou leve da mesma, ou um domínio variável de cadeia pesada ou leve, ligado operativamente a um promotor. Os ditos vetores podem incluir a sequência nucleotídica que codifica a região constante da molécula de anticorpo (veja-se, por exemplo, a publicação PCT WO 86/05807; a publicação PCT WO 89/01036; e a Patente US N° 5,122,464) e o domínio variável do anticorpo pode ser clonado no dito vetor par ala expressão da cadeia pesada ou leve completa. O vetor de expressão é transferido a uma célula hospedeira por meio de técnicas convencionais e as células transfetadas são cultivadas por meio de técnicas convencionais para produzir um anticorpo da invenção. Portanto, a invenção inclui células hospedeiras que contêm um polinucleótido que codifica um anticorpo da invenção, ou uma cadeia pesada ou leve da mesma, ou um anticorpo de cadeia única da invenção, ligado operativamente a um promotor heterólogo. Preferentemente, na expressão de anticorpos de cadeia doble, podem ser expressos conjuntamente vetores que codificam tanto as cadeias tanto pesadas como leves na célula hospedeira para a expressão da molécula de imunoglobulina completa, tal como se detalha a continuação.

Podem ser utilizados uma diversidade de sistemas de hospedeiro-vetor de expressão para expressar as moléculas de anticorpo da invenção. Os ditos sistemas de hospedeiro de expressão representam veículos por meio dos quais podem ser produzidos e posteriormente purificar as sequências de interesse, mas também representam células que podem, ao ser transformadas ou transfetadas com as sequências codificantes nucleotídicas adequadas, expressar uma molécula de anticorpo da invenção in situ. Estas incluem, mas sem limitação, microorganismos, tais como bactéria (por exemplo, E. coli, B. subtilis) transformadas com vetores de ADN de bacteriófago recombinante, ADN de plasmídeo ou ADN de cósmido que contêm sequências codificantes de anticorpos; leveduras (por exemplo, Saccharomyces, Pichia) transformadas com vetores de expressão em leveduras recombinantes que contém sequências codificantes de anticorpos; sistemas de células de inseto infetadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, baculovírus) que contêm sequências codificantes de anticorpos; sistemas de células vegetais infetadas com vetores de expressão de vírus recombinantes (por exemplo, vírus do mosaico da couve-flor, CaMV; virs do mosaico do tabaco, TMV) ou transformadas com vetores de expressão de plasmídeos recombinantes (por exemplo, plasmídeo Ti) que contém sequências codificantes de anticorpos; ou sistemas de células de mamífero (por exemplo, células COS, CHO, BHK, 293, 3T3) que portam construções de expressão recombinante que contém promotores derivados do genoma de células de mamífero (por exemplo, promotor de metalotienina) ou de vírus de mamífero (por exemplo, o promotor tardio de adenovirus; o promotor de 7,5 K do vírus vaccinia). Preferentemente, são utilizados células bacterianas, tais como Escherichia coli, e mais preferentemente, células eucariotas, especialmente para a expressão de moléculas de anticorpo recombinantes completas, para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante. Por exemplo, as células de mamífero, tais como células de ovário de hámster chinês (CHO), juntamente com um vetor, tal como o elemento promotor génico precoce intermédio de citomegalovírus humano, é um sistema de expressão eficaz para os anticorpos (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)).

Em sistemas bacterianos, podem ser selecionados vantajosamente uma série de vetores de expressão dependendo da utilização prevista para a molécula de anticorpo que está ser expressa. Por exemplo, quando uma grande quantidade da dita proteína é para ser produzida para a geração de composições farmacêuticas de uma molécula de anticorpo, podem ser desejáveis vetores que dirigem a expressão de elevados níveis de produtos de proteína de fusão que se purificam facilmente. Os ditos vetores incluem, mas sem limitação, ao vetor de expressão em E. coli pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2:1791 (1983)), no qual a sequência codificante de anticorpo pode ser ligada individualmente no vetor em marco com a região codificante lac Z, de tal forma que é produzida uma proteína de fusão; vetores pIN (Inouye e Inouye, Nucleic Acids Res. 13:3101-3109 (1985). Van Heeke e Schuster, J. Biol. Chem. 24:5503-5509 (1989)); e semelhantes. Também podem ser utilizados vetores pGEX para expressar polipéptidos exógenos como proteínas de fusão com glutatião S-transferase (GST). Em geral, as ditas proteínas de fusão são solúveis e podem ser purificadas facilmente a partir de células lisadas por meio de adsorção e ligação a pérolas de matriz de glutatião-agarose seguido de eluição em presença de glutatião livre. Os vetores pGEX são projetados para incluir locais de clivagem de trombina ou de protase de factor Xa de tal forma que o produto génico alvo clonado possa liberarse do resíduo de GST.

Num sistema de inseto, é utilizado vírus da polihedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vetor para expressar genes exógenos. O vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência codificante de anticorpo pode ser clonada individualmente em regiões não essenciais (por exemplo, o gene de polihedrina) do vírus e ser posta sob o controlo de um promotor de AcNPV (por exemplo, o promotor de polihedrina).

Em células hospedeiras de mamíferos, podem ser utilizados uma série de sistemas de expressão baseados em vírus. Nos casos onde é utilizado adenovirus como vetor de expressão, a sequência codificante do anticorpo de interesse pode ser ligada a um complexo de controlo da transcrição/tradução de adenovirus, por exemplo, o promotor tardio e a sequência líder tripartida. Este gene quimérico pode ser inserido então no genoma de adenovirus por meio de recombinação in vitro ou in vivo. A inserção numa região não essencial do genoma virai (por exemplo, a região EI ou E3) dará como resultado um vírus recombinante que é viável e capaz de expressar a molécula de anticorpo em hospedeiros infetados (por exemplo, veja-se Logan e Shenk, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:355-359 (1984)). Também podem ser necessários sinais específicos de iniciação para a tradução eficaz de sequências codificantes de anticorpo insertadas. Estas sinais incluem o codão de iniciação ATG as sequências adjacentes. Além disso, o codão de iniciação tem que estar em fase com a grelha de leitura da sequência codificante desejada para assegurar a tradução da inserção completa. Estes sinais de controlo traducional exões e os codões de iniciação podem ser de uma diversidade de origens, tanto naturais como sintéticas. A eficácia da expressão pode ser potenciada por meio da inclusão de elementos potenciadores da transcrição adequados, terminadores da transcrição, etc (veja-se Bittner et al. , Methods in Enzymol. 153:51-544 (1987)) .

Além disso, pode ser selecionada uma estirpe de célula hospedeira que modula a expressão das sequências insertadas, ou que modifica e processa o produto génico do modo especifico desejado. As ditas modificações (por exemplo, glicosilação) e processamentos (por exemplo, clivagem) de produtos proteicos podem ser importantes para a função da proteína. As diferentes células hospedeiras têm características e mecanismos específicos para o processamento pós-traducional e a modificação de proteínas e produtos génicos. Podem ser selecionados linhas celulares ou sistemas de hospedeiros adequados para assegurar a correta modificação e o processamento da proteína exógena expressada. Para este fim, podem ser utilizados células hospedeiras eucariotas que processam a maquinaria celular para o processamento do transcrito primário, a glicosilação, e a fosforilação adequada do produto génico. As ditas células hospedeiras de mamífero incluem, mas sem limitação células CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, WI38, e em particular linhas celulares de cancro de mama, tais como, por exemplo, BT483, Hs578T, HTB2, BT20 e T47D, e linhas celulares de glândula mamaria normal, tais como, por exemplo, CRL7030 e Hs578Bst.

Para a produção a longo prazo e alto rendimento de proteínas recombinantes, prefere-se a expressão estável. Por exemplo, podem ser projetadas linhas celulares que expressam de maneira estável a molécula de anticorpo. Em lugar de usar vetores de expressão que contêm origens de replicação virais, podem ser transformadas as células hospedeiras com ADN controlado por elementos de controlo da expressão adequados (por exemplo, sequências promotoras, potenciadoras, terminadores da transcrição, locais de poliadenilação, etc.), e um marcador de seleção. Depois da introdução do ADN exógeno, podem ser feitas crescer as células modificadas durante 1-2 dias num meio enriquecido, e depois mudar a um meio de seleção. 0 marcador de seleção no plasmídeo recombinante converte resistência à seleção e permite que as células integrem o plasmídeo de maneira estável em seus cromossomas e que cresçam para formar focos que por sua vez podem ser clonados e expandidos em linhas celulares. Este método pode ser utilizado vantajosamente para modificar linhas celulares que expressam a molécula de anticorpo. As ditas linhas celulares modificadas podem ser particularmente úteis na rastreio e avaliação de compostos que interagem direta ou indiretamente com a molécula de anticorpo.

Pode ser utilizada uma série de sistemas de seleção, incluindo, mas sem limitação, os genes de timidina quinase do virus do herpes simples (Wigler et al., Cell 11:223 (1977)), hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (Szybalska e Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 48:202 (1992) ), e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al.,

Cell 22:817 (1980)) em células tk-, hgprt- ou aprt-, respetivamente. Do mesmo modo, pode ser usada a resistência a antimetabolitos como base para a seleção dos seguintes genes: dhfr, que converte resistência a metotrexato (Wigler et al., Natl. Acad. Sei. USA 77:357 (1980); O'Hare et al. ,

Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:1527 (1981)); gpt, que converte resistência ao ácido micofenólico (Mulligan e Berg, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:2072 (1981)); neo, que converte resistência ao aminoglucósido G-418, Clinicai Pharmacy 12:488-505; Wu e Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991);

Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993) . Mulligan, Science 260:926-932 (1993); e Morgan e

Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993) . Mayo de 1993, TIBTECH 11 (5) :155-215) ; e hygro, que converte resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Podem ser aplicados de maneira rotineira métodos conhecidos comummente na técnica da tecnologia de ADN recombinante para selecionar o clone recombinante desejado, e os ditos métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al. , (eds.), Current Protocols in Molecular Biology,

John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); e nos Capítulos 12 e 13, Dracopoli et al. (eds), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150:1 (1981) .

Os níveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados por meio de amplificação do vetor (para uma revisão, veja-se Bebbington e Hentschel, The use of vetors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3. (Academic Press, Nova Iorque, 1987)) . Quando um marcador no sistema de vetor que expressa anticorpo é amplificável, um aumento no nível de inibidor presente na cultura da célula hospedeira aumentará o número de cópias do gene marcador. Já que a região amplificada se associa ao gene do anticorpo, também aumentará a produção do anticorpo (Crouse et al., Mol. Cell. Biol. 3:257 (1983)). A célula hospedeira pode ser transfetada conjuntamente com dois vetores de expressão da invenção, codificando o primeiro vetor um polipéptido derivado de cadeia pesada e o segundo codificando um polipéptido derivado de cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores de seleção idênticos que permitem a expressão idêntica de polipéptidos de cadeia pesada e cadeia leve. Como alternativa, pode ser usado um único vetor que codifica, e é capaz de expressar, polipéptidos tanto de cadeia pesada como de cadeia leve. Nas ditas situações, a cadeia leve deve ser posta antes da cadeia pesada para evitar um excesso tóxico de cadeia pesada livre (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); Kohler, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2197 (1980)). As sequências codificantes para as cadeias pesada e leve podem compreender ADNc ou ADN genómico.

Uma vez que uma molécula de anticorpo se ha produzido por um animal, sintetizado quimicamente ou expressado recombinantemente, pode ser purificado por meio de qualquer método conhecido na técnica para a purificação de uma molécula de imunoglobulina, por exemplo, por meio de cromatografia (por exemplo, permuta iónica, afinidade, particularmente por afinidade do antigénio pela proteína A, e cromatografia em coluna de exclusão por tamanho), centrifugação, solubilidade diferencial, ou por meio de qualquer outra técnica convencional para a purificação de proteínas. Além disso, os anticorpos da presente invenção ou os fragmentos dos mesmos podem ser fusionados a sequências polipeptídicas heterólogas descritas no presente documento ou de outro modo conhecidas na técnica, para facilitar a purificação. A presente invenção abrange anticorpos fusionados recombinantemente ou conjugados quimicamente (incluindo conjugações tanto covalentes como não covalentes) a um polipéptido (ou porção do mesmo, preferentemente a pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 aminoácidos do polipéptido) da presente invenção para gerar proteínas de fusão. A fusão não tem por quê ser necessariamente direta, mas que pode ocorrer por meio de sequências ligantes. Os anticorpos podem ser específicos para antigénios distintos de polipéptidos (ou porção dos mesmos, preferentemente a pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 aminoácidos do polipéptido) da presente invenção. Por exemplo, podem ser utilizados anticorpos para dirigir os polipéptidos da presente invenção a tipos celulares particulares, bem in vitro ou in vivo, fusionando ou conjugando os polipéptidos da presente invenção a anticorpos específicos para recetores da superfície celular particulares. Também podem ser utilizados anticorpos fusionados ou conjugados aos polipéptidos da presente invenção em imunoensaios e métodos de purificação in vitro usando métodos conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Harbor et al., anteriormente citado, e a publicação PCT WO 93/21232; o documento EP 439,095; Naramura et al., Immunol. Lett. 39:91-99 (1994). Patente US 5,474,981; Gillies et al. , PNAS 89:1428-1432 (1992); Fell et al. , J. Immunol. 146:2446-2452 (1991) . A presente invenção inclui além disso composições que compreendem os polipéptidos da presente invenção fusionados ou conjugados a domínios de anticorpo distintos das regiões variáveis. Por exemplo, os polipéptidos da presente invenção podem ser fusionados ou conjugados a uma região Fc de anticorpo, ou a uma porção da mesma. A porção de anticorpo fusionada a um polipéptido da presente invenção pode compreender a região constante, a região dobradiça, o domínio CHI, o domínio CH2, e o domínio CH3 ou qualquer combinação de domínios completos ou porções dos mesmos. Também podem ser fusionados os polipéptidos às porções de anticorpos anteriores para formar multímeros. Por exemplo, as porções Fc fusionadas aos polipéptidos da presente invenção podem formar dímeros por meio de formação de ligações dissulfureto entre as porções Fc. Podem ser produzidas formas multiméricas maiores fusionando os polipéptidos a porções de IgA e IgM. Conhecem-se na técnica métodos para fusionar ou conjugar os polipéptidos da presente invenção a porções de anticorpos. Veja-se, por exemplo, as Patentes US com números 5,336,603, 5,622,929; 5,359,046; 5,349,053; 5,447,851; 5,112,946; o documento EP 307,434; o documento EP 367,166; as publicações PCT WO 96/04388; WO 91/06570, Ashkenazi et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:10535-10539 (1991); Zheng et al., J. Immunol. 154:5590-5600 (1995). e Vil et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:11337-11341(1992).

Tal como foi discutido anteriormente, os polipéptidos que correspondem a um polipéptido, fragmento polipeptídico, ou variante de SEQ ID N° : 2 ou SEQ ID N° : 4 podem ser fusionados ou conjugados às porções de anticorpos anteriores para aumentar a semivida in vivo dos polipéptidos ou para su utilização em imunoensaios usando métodos conhecidos na técnica. Além disso, os polipéptidos que correspondem a SEQ ID N°: 2 ou a SEQ ID N°: 4 podem ser fusionados ou conjugados às porções de anticorpo anteriores para facilitar a purificação. Outro exemplo comunicado descreve proteínas quiméricas que consistem nos dois primeiros domínios do polipéptido CD4 humano e vários domínios das regiões constantes das cadeias leves ou pesadas de imunoglobulinas de mamífero. (Documento EP 394,827; Traunecker et al. , Nature 331:84-86 (1988). Os polipéptidos da presente invenção fusionados ou conjugados a um anticorpo que tem estruturas diméricas ligadas por meio de dissulfureto (devido à IgG) também podem ser mais eficazes na ligação e neutralização de outras moléculas, que a proteína monomérica secretada ou que somente o fragmento de proteína. (Fountoulakis et al. , J. Biochem. 2 7 0:3958-3964 (1995)) . Em muitos casos, a parte Fc numa proteína de fusão é benéfica para terapêutica e diagnóstico, e portanto pode dar como resultado, por exemplo, propriedades farmacocinéticas melhoradas. (Documento EP A 232,262). Como alternativa, pode ser desejado deletar a parte Fc depois de que a proteína de fusão tenha sido expressada, detetada e purificada. Por exemplo, a porção Fc pode impedir a terapêutica e o diagnóstico se a proteína de fusão for utilizada como antigénio para imunizações. No desenvolvimento de fármacos, por exemplo, as proteínas humanas, tais como hIL-5, foram fusionadas a porções Fc com o propósito de desenvolver ensaios de rastreio de alto rendimento para identificar antagonistas de hIL-5. (Veja-se, Bennett et al., J.

Molecular Recognition 8:52-58 (1995); Johanson et al., J.

Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995).

Além disso, os anticorpos ou fragmentos dos mesmos da presente invenção podem ser fusionados a sequências marcadoras, tais como um péptido, para facilitar a purificação. Preferentemente, a sequência de aminoácidos marcadora é um péptido de hexa-histidina, tal como o marcador proporcionado num vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259

Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre outros, muitos dos quais estão disponíveis comercialmente. Tal como descreve-se em Gentz et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, a hexa-histidina proporciona uma purificação conveniente da proteína de fusão. Outros marcadores peptídicos úteis para a purificação incluem, mas sem limitação, o marcador "HA", que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina da gripe (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) e o marcador "flag". A presente invenção abrange além disso anticorpos ou fragmentos dos mesmos conjugados a um agente de diagnóstico ou terapêutico. Os anticorpos podem ser utilizados diagnosticamente para, por exemplo, controlar o desenvolvimento ou progressão de um tumor como parte de um procedimento de ensaio clinico para, por exemplo, determinar a eficácia de um regime de tratamento dado. A deteção pode ser facilitada acoplando o anticorpo a uma substância detetável. Os exemplos de substâncias detetáveis incluem várias enzimas, grupos prostéticos, materiais fluorescentes, materiais luminescentes, materiais bioluminescentes, materiais radioativos, metais emissores de positrões usando diversas tomografias de emissão de positrões, e iões metálicos paramagnéticos não radioativos. A substância detetável pode ser acoplada ou conjugada diretamente ou indiretamente ao anticorpo (ou porção do mesmo), por meio de um intermediário (tal como, por exemplo, um ligante conhecido na técnica) usando técnicas conhecidas na técnica. Veja-se, por exemplo, a Patente US N° 4.741.900 para iões metálicos que podem ser conjugados a anticorpos para sua utilização como agentes de diagnóstico de acordo com a presente invenção. Os exemplos de enzimas adequadas incluem peroxidase de rábano picante, fosfatase alcalina, beta-galactosidase, ou acetilcolinesterase; os exemplos de complexos de grupo prostético adequado incluem estreptavidina/biotina e avidina/biotina; os exemplos de materiais fluorescentes adequados incluem umbeliferona, fluoresceina, isotiocianato de fluoresceina, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceina, cloreto de dansilo ou ficoeritrina; um exemplo de material luminescente inclui luminol; os exemplos de materiais bioluminescentes incluem luciferase, luciferina, e aecuorina; e os exemplos de material radioativo adequado incluem 125I, 131I, 112In ou "Tc.

Além disso, um anticorpo ou fragmento do mesmo pode ser conjugado a um resíduo terapêutico, tal como uma citotoxina, por exemplo, um agente citostático ou citocida, um agente terapêutico ou um ião de metal radioativo, por exemplo, emissores alfa, tais como, por exemplo, 213Bi. Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que seja prejudicial para as células. Os exemplos incluem paclitaxel, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenipósido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona, glucocorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, e puromicina e análogos ou homólogos dos mesmos. Os agentes terapêuticos incluem, mas sem limitação, antimetabolitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil decarbazina), agentes alquilantes (por exemplo, mecloretamina, tiotepa, clorambucilo, melfalan, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platino (II) (DDP), cisplatino), antraciclinas (por exemplo, daunorrubicina (anteriormente daunomicina) e doxorrubicina) , antibióticos (por exemplo, dactinomicina (anteriormente actinomicina) , bleomicina, mitramicina, e antramicina (AMC)), e agentes anti-mitóticos (por exemplo, vincristina e vinblastina).

Os conjugados da invenção podem ser utilizados para modificar uma resposta biológica dada, o agente terapêutico ou resíduo de fármaco não deve ser entendido como limitado a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, o resíduo de fármaco pode ser uma proteína ou polipéptido que posee uma atividade biológica desejada. As ditas proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina, tal como abrina, ricina A, exotoxina de pseodomonas, ou toxina diftérica; uma proteína, tal como fator de necrose tumoral, interferão-a, interferão-β, fator de crescimento nervoso, fator de crescimento derivado de plaquetas, ativador do plasminógeno tissular, um agente apoptótico, por exemplo, TNF alfa, TNF-beta, AIM I (Veja-se, a Publicação Internacional N° WO 97/33899), AIM II (Veja-se, a Publicação Internacional N° WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et al., Int. Immunol., 6:1567-1574 (1994)), VEGI (veja-se, a Publicação Internacional N° WO 99/23105), um agente trombótico ou um agente anti-trombótico, por exemplo, angiostatina ou endostatina; ou, modificadores da resposta biológica, tais como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 ("IL-1"), interleucina-2 ("IL-2"), interleucina-6 ("IL-6"), fator estimulador das colónias de macrófagos e granulócitos ("GM-CSF"), fator estimulador das colónias de granulócitos ("G-CSF"), ou outros fatores de crescimento.

Os anticorpos também podem se ligar a suportes sólidos, que são particularmente úteis para imunoensaios ou purificação do antigénio alvo. Os ditos suportes sólidos incluem, mas sem limitação, vidro, celulose, poliacrilamida, náilon, poliestireno, cloreto de polivinilo ou polipropileno.

Conhecem-se bem as técnicas para conjugar o dito resíduo terapêutico a anticorpos, veja-se, por exemplo, Arnon et al., "Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), págs. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al., "Antibodies For Drug Delivery", em Controlled Drug Delivery (2a Ed.), Robinson et al. (eds.), págs. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review", em Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), págs. 475-506 (1985); "Analysis, Results, And

Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy", em Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), págs. 303-16 (Academic Press 1985), e Thorpe et al., "The

Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates", Immunol. Rev. 62:119-58(1982).

Como alternativa, pode ser conjugado um anticorpo a um segundo anticorpo para formar um heteroconjugado de anticorpo tal como descreve Segai na Patente US N° 4.676.980.

Um anticorpo, com ou sem um resíduo terapêutico conjugado a este, administrado somente ou em combinação com fatores citotóxicos e/ou citocinas, pode ser usado como agente terapêutico. A presente invenção também abrange a criação de anticorpos sintéticos dirigidos contra os polipéptidos da presente invenção. Um exemplo de anticorpos sintéticos descreve-se em Radrizzani, M., et al. , Medicina, (Aires), 59(6):753-8, (1999)). Recientemente, se ha descrito uma nova classe de anticorpos sintéticos e são cittados como polímeros impressos molecularmente (MIP) (Semorex, Inc.). Os anticorpos, péptidos, e enzimas são utilizados com frequência como elementos de reconhecimento molecular em sensores químicos e biológicos. No entanto, sua falta de estabilidade e de mecanismos de transdução do sinal limita sua utilização como dispositivos de deteção. Os polímeros impreasos molecularmente (MIP) são capazes de imitar a função de recetores biológicos mas com menos restrições de estabilidade. Os ditos polímeros proporcionam elevada sensibilidade e seletividade ao mesmo tempo em que se mantêm uma excelente estabilidade térmica e mecânica. Os MIP têm a capacidade de se ligar a moléculas pequenas e de se dirigir a moléculas, tais como orgânicas e proteínas com igual ou maior potência que a dos anticorpos naturais.

Estes "super" MIP têm afinidades maiores por seu alvo e portanto requerem menores concentrações para uma ligação eficaz .

Durante a síntese, os MIP são impressos para que tenham um tamanho, forma, carga e grupos funcionais complementares da alvo selecionada usando a molécula alvo em si (tal como um polipéptido, anticorpo, etc.), ou uma substância que tenha uma estrutura muito similar, como sua "impressão" ou "molde". Os MIP podem ser derivatizados com os mesmos reagentes proporcionados para anticorpos. Por exemplo, os "super" MIP fluorescentes podem ser recobertos sobre pérolas ou poços para sua utilização em separações ou ensaios elevadamente sensíveis, ou para utilização em rastreio de proteínas de alto rendimento.

Além disso, os MIP baseados na estrutura de polipéptidos da presente invenção podem ser úteis na rastreio de compostos que se ligam aos polipéptidos da invenção. 0 dito MIP faria o papel de um "recetor" sintético imitando a arquitetura nativa do polipéptido. De facto, a capacidade de um MIP para hacer o papel de um recetor sintético já foi demostrado para o recetor de estrógeno (Ye, L., Yu, E., Mosbach, K, Analyst., 126(6):760-5, (2001); Dickert, F, L., Hayden, O., Halikias, K, P, Analyst., 126(6):766-71, (2001)). Um recetor sintético pode ser imitado por completo (por exemplo, em forma de proteína completa), ou imitado como uma série de péptidos curtos que correspondem à proteína (Rachkov, A., Minoura, N, Biochim, Biophys, Acta., 1544(1-2):255-66, (2001)). O dito MIP de recetor sintético pode ser empregado em qualquer um ou mais dos métodos de rastreio descritos em outras partes do presente documento.

Também foi demostrado que os MIP são úteis para "detetar" a presença de su molécula imitada (Cheng, Z., Wang, E., Yang, X, Biosens, Bioelectron., 16(3):179-85, (2001); Jenkins, A, L., Yin, R., Jensen, J. L, Analyst., 126(6):798-802, (2001); Jenkins, A, L., Yin, R., Jensen, J.

L, Analyst., 126(6):798-802, (2001)). Por exemplo, um MIP projetado usando um polipéptido da presente invenção pode ser usado em ensaios projetados para identificar, e potencialmente quantificar, os níveis do dito polipéptido numa mostra. O dito MIP pode ser usado como substituto para qualquer componente descrito nos ensaios, ou kits, proporcionados no presente documento (por exemplo, ELISA, etc.).

Pode ser empregado uma série de métodos para criar MIP para um recetor, ligando, polipéptido, péptido ou molécula orgânica específica. São descritos vários métodos preferidos por Esteban et al. em J. Anal, Chem., 370(7) :795-802, (2001) . Conhecem-se na técnica métodos adicionais, tais como, por exemplo, através de Hart, B, R., Shea, K, J. J. Am. Chem, Soc., 123(9):2072-3, (2001); e

Quaglia, M., Chenon, K., Hall, A, J., De, Lorenzi, E., Sellergren, B, J. Am. Chem, Soc., 123(10) :2146-54, (2001) .

Utilizações para anticorpos dirigidos contra polipéptidos da invenção

Os anticorpos da presente invenção têm várias utilidades. Por exemplo, os ditos anticorpos podem ser utilizados em ensaios de diagnóstico para detetar a presença ou quantificação dos polipéptidos da invenção numa mostra. O dito ensaio diagnóstico pode estar composto de pelo menos duas etapas. A primeira, submeter à mostra com o anticorpo, na qual a mostra é um tecido (por exemplo, humano, animal, etc.), fluido biológico (por exemplo, sangue, urina, esputo, sémen, fluido amniótico, saliva, etc.), extrato biológico (por exemplo, tecido ou homogeneizado celular, etc.), uma microplaca de proteína (por exemplo, veja-se Arenkov P, et al. , Anal Biochem., 278(2):123-131 (2000)), ou uma coluna de cromatografia, etc. e uma segunda etapa que implica a quantificação de anticorpo ligado ao substrato. Como alternativa, o método pode implicar além disso uma primeira etapa de unir o anticorpo, já seja covalentemente, electrostaticamente ou reversivelmente a um suporte sólido, e uma segunda etapa de expor ao anticorpo ligado à mostra, tal como define-se anteriormente e em outras partes do presente documento.

Conhecem-se na técnica diversas técnicas de ensaio diagnóstico, tais como ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduíche diretos ou indiretos e ensaios de imunoprecipitação levados a cabo em fases bem homogéneas ou heterogéneas (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., (1987), págs. 147-158). Os anticorpos usados nos ensaios de diagnóstico podem estar marcados com um resíduo detetável. 0 resíduo detetável deve ser capaz de produzir, de forma direta ou indireta, um sinal detetável. Por exemplo, o resíduo detetável pode ser um radioisótopo, tal como 2H, 14C, 32P, ou 125I, um composto fluorescente ou quimioluminescente, tal como isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ou luciferina, ou uma enzima, tal como fosfatase alcalina, beta-galactosidase, proteína fluorescente verde ou peroxidase de rábano picante. Pode ser empregado qualquer método conhecido na técnica para conjugar o anticorpo ao resíduo detetável, incluindo aqueles métodos descritos por Hunter et al. , Nature, 144:945 (1962); Dafvid et al., Biochem., 13:1014 (1974); Pain et al., J. Immunol. Metho., 40:219(1981); e Nygren, J. Histochem. And Cytochem., 30:407 (1982) .

Os anticorpos dirigidos contra os polipéptidos da presente invenção são úteis para a purificação por afinidade dos ditos polipéptidos a partir de cultura de células recombinantes ou fontes naturais. Neste processo, os anticorpos contra um polipéptido particular são imobilizados sobre um suporte adequado, tal como uma resina SEPHADEX® ou papel de filtro, usando métodos bem conhecidos na técnica. Depois é posto em contacto ao anticorpo imobilizado com uma amostra que contém os polipéptidos que a ser purificados, e a seguir lava-se o suporte com um solvente adequado que retire substancialmente todo o material da mostra a exceção dos polipéptidos desejados, que estão ligados ao anticorpo imobilizado. Finalmente, se lava o suporte com outro solvente adequado que liberará ao polipéptido desejado do anticorpo.

Imunofenotipagem

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados para imunofenotipar linhas celulares e mostras biológicas. 0 produto de tradução do gene da presente invenção pode ser útil como marcador especifico de células, ou mais especificamente, como um marcador celular que é expresso diferencialmente em vários estados de diferenciação e/ou maduração de tipos celulares particulares. Os anticorpos monoclonais dirigidos contra um epitopo especifico, ou uma combinação de epítopos, permitirão o rastreio de populações celulares que expressam o marcador. Podem ser utilizados várias técnicas que usam anticorpos monoclonais para rastrear populações celulares que expressam o marcador ou os marcadores, e incluem separação magnética usando pérolas magnéticas revestidas de anticorpo, "paneo" com anticorpo ligado a uma matriz sólida (isto é, placa), e citometria de fluxo (veja-se, por exemplo, Patente US 5,985,660; e Morrison et al., Cell, 96:737-49 (1999)).

Estas técnicas permitem o rastreio de populações particulares de células, como as que podem ser encontrados com neoplasias hematológicas (isto é, doença residual minima (MRD) em pacientes com leucemia aguda) e células "não próprias" em transplantes para evitar a doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD). Como alternativa, estas técnicas permitem o rastreio de células estaminais e progenitoras hematopoiéticas capazes de serem submetidas a proliferação e/ou diferenciação, tais como aquelas que podem ser encontradas no sangue do cordão umbilical humano.

Ensaios de ligação de anticorpo

Os anticorpos da invenção podem ser testados para ligação imunoespecifica por meio de qualquer método conhecido na técnica. Os imunoensaios que podem ser utilizados incluem, mas sem limitação, os sistemas de ensaio competitivo e não competitivo usando técnicas, tais como transferência de Western, radioimunoensaios, ELISA (ensaio imunosorvente associado a enzimas), imunoensaios em "sanduíche", ensaios de imunoprecipitação, reações de precipitação, reações de precipitação de difusão em gel, ensaios de imunodifusão, ensaios de aglutinamento, ensaios de fixação complementar, ensaios imunoradiométricos, imunoensaios de fluorescência, imunoensaios de proteína A, por nomear somente alguns. Os ditos ensaios são rotineiros e conhecem-se bem na técnica (veja-se, por exemplo, Ausubel et ai, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque). Os imunoensaios exemplares são descritos brevemente mais adiante (mas não pretenden ser limitantes).

Os protocolos de imunoprecipitação compreendem geralmente lisar uma população de células num tampão de lise, tal como tampão RIPA (NP-40 ao 1 % ou Triton X-100, desoxicolato de sódio ao 1 %, SDS ao 0,1 %, NaCl 0,15 M, fosfato de sódio 0,01 mM a pH 7,2, Trasysol ao 1 %) suplementado com fosfatase de proteína e/ou inibidores de proteases (por exemplo, EDTA, PMSF, aprotinina, vanadato de sódio), adicionar o anticorpo de interesse ao lisado de células, incubar durante um período de tempo (por exemplo, 1-4 horas) a 4 °C, adicionar pérolas de sefarose de proteína A e/ou proteína G ao lisado de células, incubar durante cerca de uma hora ou mais a 4 °C, lavar as pérolas em tampão de lise e ressuspender as pérolas em SDS/tampão de mostra. A capacidade do anticorpo de interesse para imunoprecipitar um antigénio particular pode ser determinado por meio de, por exemplo, análise por transferência de Western. Um perito na especialidade conhecerá os parâmetros que podem ser modificados para aumentar a ligação do anticorpo a um antigénio e diminuir o fundo (por exemplo, enxaguando previamente o lisado celular com pérolas de sefarose). Para uma discussão adicional referente a protocolos de imunoprecipitação veja-se, por exemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque no apartado 10,16,1.

Os análise de transferência de Western compreendem geralmente preparar mostras de proteínas, eletroforese das mostras de proteína num gel de poliacrilamida (por exemplo, SDS-PAGE ao 8 %-20 % dependendo do massa molecular do antigénio), transferir a mostra de proteína desde o gel de poliacrilamida a uma membrana, tal como nitrocelulose, PVDF ou náilon, bloquear a membrana em solução de bloqueio (por exemplo, PBS com BSA a 3 % ou leite magro), lavar a membrana em tampão de lavagem (por exemplo, PBS-Tween 20), bloquear a membrana com anticorpo primário (o anticorpo de interesse) diluído em tampão de bloqueio, lavar a membrana em tampão de lavagem, bloquear a membrana com um anticorpo secundário (que reconhece o anticorpo primário, por exemplo, um anticorpo anti-humano) conjugado a um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase de rábano picante ou fosfatase alcalina) ou a uma molécula radioativa (por exemplo, 32P ou 125I) diluída em tampão de bloqueio, lavar a membrana em tampão de lavagem, e detetar a presença do antigénio. Um perito na especialidade saberá que parâmetros podem ser modificados para aumentar a sinal detetada e para reduzir o ruido de fundo. Para uma discussão adicional referente aos protocolos de transferência de Western veja-se, por exemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque no apartado 10,8.1.

Os ELISA compreendem preparar o antigénio, revestir o poço de uma placa de microtitulação de 96 poços com o antigénio, adicionar o anticorpo de interesse conjugado a um composto detetável, tal como um substrato enzimático (por exemplo, peroxidase de rábano picante ou fosfatase alcalina) ao poço e incubar durante um período de tempo, e detetar a presença do antigénio. Nos ELISA, o anticorpo de interesse não tem por quê ser conjugado a um composto detetável; no entanto, pode ser adicionado ao poço um segundo anticorpo (que reconhece ao anticorpo de interesse) conjugado a um composto detetável. Além disso, em vez de revestir o poço com o antigénio, o poço pode ser revestido com o anticorpo. Neste caso, pode ser adicionado um segundo anticorpo conjugado a um composto detetável depois da adição do antigénio de interesse ao poço revestido. Um perito na especialidade saberá quais parâmetros podem ser modificados para aumentar a sinal detetada assim como outras variações dos ELISA conhecidas na técnica. Para uma discussão adicional referente aos ELISA veja-se, por exemplo, Ausubel et al, eds, 1994, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, John Wiley & Sons, Inc., Nova Iorque no apartado 11.2.1. A afinidade de ligação de um anticorpo a um antigénio e a velocidade de dissociação de uma interação anticorpo-antigénio pode ser determinado por meio de ensaios de ligação competitiva. Um exemplo de um ensaio de ligação competitiva é um radioimunoensaio que compreende a incubação de antigénio marcado (por exemplo, 3H ou 125I) com o anticorpo de interesse em presença de quantidades em aumento de antigénio não marcado, e a deteção do anticorpo ligado ao antigénio marcado. A afinidade do anticorpo de interesse por um antigénio particular e as velocidades de dissociação de ligação podem ser determinadas a partir dos dados por meio de análise de representação de Scartchard. Também pode ser determinada a ligação com um segundo anticorpo usando radioimunoensaios. Neste caso, o antigénio incuba-se com anticorpo de interesse conjugado a um composto marcado (por exemplo, 3H ou 125I) em presença de quantidades em aumento de um segundo anticorpo não marcado. Utilizações terapêuticas de anticorpos

Além disso, no presente documento são descritas terapêuticas baseadas em anticorpos que implicam administrar anticorpos da invenção a um animal, preferentemente um paciente mamífero, e o mais preferentemente ser humano, para tratar uma ou mais das doenças, distúrbios, ou condições patológicas divulgadas. Os compostos terapêuticos incluem, mas sem limitação, anticorpos da invenção (incluindo fragmentos, análogos e derivados dos mesmos, tal como são descritos no presente documento) e ácidos nucleicos que codificam anticorpos da invenção (incluindo fragmentos, análogos e derivados dos mesmos e anticorpos anti-idiotípicos tal como são descritos no presente documento). Os anticorpos da invenção podem ser utilizados para tratar, inibir ou prevenir doenças, distúrbios ou condições patológicas associados à expressão e/ou atividade aberrante de um polipéptido da invenção, incluindo, mas sem limitação, uma quaisquer ou mais das doenças, distúrbios, ou condições patológicas descritas no presente documento. 0 tratamento e/ou prevenção de doenças, distúrbios, ou condições patológicas associados com a expressão e/ou atividade aberrante de um polipéptido da invenção inclui, mas sem limitação, aliviar sintomas associados com esas doenças, distúrbios ou condições patológicas. Os anticorpos da invenção podem proporcionarse em composições farmaceuticamente aceitáveis tal como é conhecido na técnica ou tal como descreve-se no presente documento.

Um resumo das formas em que os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados terapeuticamente inclui unir polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção localmente ou sistemicamente no organismo ou por meio de citotoxicidade direta do anticorpo, por exemplo, mediada por complemento (CDC) ou por células efetoras (ADCC). Algumas destas estratégias são descritos em mais detalhe a seguir. Providos com os ensinamentos proporcionados no presente documento, um perito na especialidade saberá como usar os anticorpos da presente invenção com fins de diagnóstico, de controlo ou terapêuticos sem experimentação desnecessária.

Os anticorpos desta invenção podem ser utilizados vantajosamente em combinação com outros anticorpos monoclonais ou quiméricos, ou com linfocinas ou fatores de crescimento hematopoiéticos (tais como, por exemplo, IL-2, IL-3 e IL-7), por exemplo, que servem para aumentar o número ou a atividade de células efetoras que interagem com os anticorpos.

Os anticorpos da invenção podem ser administrados sós ou em combinação com outros tipos de tratamentos (por exemplo, terapêutica de radiação, quimioterapia, terapêutica hormonal, imunoterapia ou agentes antitumorais) . Em geral, prefere-se a administração de produtos de um origem de espécies ou reatividade de espécies (no caso de anticorpos) que seja a mesma espécie que a do paciente. Portanto, preferentemente, administram-se anticorpos humanos, fragmentos, derivados, análogos, ou ácidos nucleicos a um paciente humano para terapêutica ou profilaxia.

Prefere-se usar anticorpos de alta afinidade e/ou inibição potente in vivo e/ou neutralizantes contra polipéptidos ou polinucleótidos da presente invenção, fragmentos ou regiões dos mesmos, tanto para imunoensaios dirigidos a e a terapêutica de distúrbios relacionados com polinucleótidos ou polipéptidos, incluindo fragmentos dos mesmos, da presente invenção. Os ditos anticorpos, fragmentos, ou regiões terão preferentemente uma afinidade pelos polinucleótidos ou polipéptidos da invenção, incluindo fragmentos dos mesmos. As afinidades de ligação preferidas incluem aguelas com uma constante de dissociação ou Kd de menos de 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 X 10-3 M, 10-3 M, 5 X 10-4 M, 10-4 M, 5 X 10-5 M, 10-5 M, 5 X 10-6 M, 10-6 M, 5 X 10-7 M, 10-7 M, 5 X 10-8 M, 10-8 M, 5 X 10-9 M, 10-9 M, 5 X 10-10 M, 10-10 M, 5 X 10-11 M, 10-11 M, 5 X 10-12 M, 10-12 M, 5 X 10-13 M, 10-13 M, 5 X 10-14 M, 10-14 M, 5 X 10-15 M, e 10-15 M.

Os anticorpos dirigidos contra polipéptidos da presente invenção são úteis para inibir reações alérgicas em animais. Por exemplo, ao administrar uma dose terapeuticamente aceitável de um anticorpo, ou anticorpos, da presente invenção, ou um coguetel dos presentes anticorpos, ou em combinação com outros anticorpos de diversas fontes, o animal pode não provocar uma resposta alérgica a antigénios.

Do mesmo modo, pode ser prevista a clonagem do gene gue codifica um anticorpo dirigido contra um polipéptido da presente invenção, tendo o dito polipéptido o potencial de provocar uma resposta alérgica e/ou imune num organismo, e transformar o organismo com o dito gene de anticorpo de tal forma gue é expresso (por exemplo, de maneira constitutiva, de maneira induzivel, etc.) no organismo. Portanto, o organismo se tornará resistente de maneira eficaz a uma resposta alérgica gue seja o resultado da ingestão ou a presença do dito polipéptido reagente imunogénico/alergénico. Além disso, a dita utilização dos anticorpos da presente invenção pode ter uma utilidade particular para prevenir e/ou melhorar doenças e/ou distúrbios autoimunes, já gue as ditas condições patológicas são tipicamente o resultado de anticorpos gue se dirigem a proteínas endógenas. Por exemplo, no caso onde o polipéptido da presente invenção é responsável de modular a resposta imune a autoantigénios, a transformação do organismo e/ou do indivíduo com uma construção gue compreende quaisquer dos promotores divulgados no presente documento ou conhecidos de outro modo na técnica, além de um polinucleótido que codifica o anticorpo dirigido contra o polipéptido da presente invenção poderia inibir de maneira eficaz a provocação de uma resposta imune do sistema imune do organismo contra os autoantigénios. Em outras partes do presente documento são proporcionados descrições detalhadas de aplicações terapêuticas e/ou de terapêutica génica da presente invenção.

Como alternativa, os anticorpos da presente invenção poderiam ser produzidos numa planta (por exemplo, clonando o gene do anticorpo dirigido contra um polipéptido da presente invenção, e transformar uma planta com um vetor adequado que compreende o dito gene para a expressão constitutiva do anticorpo na planta), e posteriormente um animal ingerir a planta, proporcionando deste modo imunidade temporária ao animal para o antigénio especifico contra o qual se dirige o anticorpo (vejam-se, por exemplo, as Patentes US N° 5.914.123 e 6.034.298).

Os anticorpos da presente invenção, preferentemente anticorpos policlonais, mais preferentemente anticorpos monoclonais, e o mais preferentemente anticorpos de cadeia única, podem ser utilizados como um meio para inibir a expressão génica de um gene ou genes particulares, num ser humano, mamífero, e/ou outro organismo. Veja-se, por exemplo, a Publicação Internacional N° WO 00/05391, publicada em 03/02/2000, de Dow Agrosciences LLC. Se conoce na técnica a aplicação dos ditos métodos para os anticorpos da presente invenção, e descreve-se mais particularmente em outras partes do presente documento.

Os anticorpos da presente invenção podem ser úteis para multimerizar os polipéptidos da presente invenção. Por exemplo, determinadas proteínas podem conver atividade biológica potenciada quando estão presentes em estado multimérico (isto é, a dita atividade potenciada pode ser devido à concentração eficaz aumentada das ditas proteínas, por meio da que mais proteína está disponível numa localização localizada).

Terapêutica génica baseada em anticorpos

Os ácidos nucleicos que compreendem sequências que codificam anticorpos ou derivados funcionais dos mesmos podem ser administrado para tratar, inibir ou prevenir uma doença ou distúrbio associado com a expressão e/ou atividade aberrante de um polipéptido da invenção, por meio de terapêutica génica. A terapêutica génica refere-se à terapêutica efetuada por meio da administração a um indivíduo de um ácido nucleico expressado ou expressável. Os ácidos nucleicos produzem sua proteína codificada que media um efeito terapêutico.

Pode ser usado quaisquer dos métodos de terapêutica génica disponíveis na técnica. Os métodos exemplares são descritos mais adiante.

Para uma revisão geral dos métodos de terapêutica génica, veja-se Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu e Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993). Mulligan, Science 260:926-932 (1993); e Morgan e Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993). Mayo, TIBTECH 11(5):155-215 (1993). Os métodos conhecidos comummente na técnica da tecnologia de ADN recombinante que podem ser utilizados são descritos em Ausubel et al. , (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); e Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990).

Num aspeto preferido, o composto compreende sequências de ácido nucleico que codificam um anticorpo, formando parte as ditas sequências de ácido nucleico de vetores de expressão que expressam o anticorpo ou fragmentos ou proteínas quiméricas ou cadeias leves ou pesadas dos mesmos num hospedeiro adequado. Em particular, as ditas sequências de ácido nucleico têm promotores ligados operativamente à região codificante do anticorpo, sendo o dito promotor induzivel ou constitutivo, e, opcionalmente, especifico de tecido. Em particular, podem ser utilizadas sequências de ácido nucleico em que as sequências codificantes de anticorpo e qualquer outra sequência desejada estão flanqueadas por regiões que promovem a recombinação homóloga num local desejado no genoma, proporcionando deste modo a expressão intracromossómica dos ácidos nucleicos que codificam o anticorpo (Roller e Smithies, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al. , Nature 342:435-438 (1989) . A molécula de anticorpo expressada pode ser um anticorpo de cadeia única; como alternativa, as sequências de ácido nucleico podem incluir sequências que codificam as cadeias tanto pesadas como leves, ou fragmentos das mesmas, do anticorpo. A administração dos ácidos nucleicos a um paciente pode ser bem direta, em cujo caso é esposto diretamente ao paciente ao ácido nucleico ou aos vetores portadores de ácido nucleico, ou indireta, em cujo caso, primeiramente transformam-se as células com os ácidos nucleicos in vitro, e depois transplantam-se ao paciente. Estas duas estratégias conhecem-se, respetivamente, como terapêutica génica in vivo ou ex vivo.

As sequências de ácido nucleico podem ser administradas diretamente in vivo, onde é expresso para produzir o produto codificado. Isto pode ser conseguido por meio de quaisquer de diversos métodos conhecidos na técnica, por exemplo, construindo-os como parte de um vetor de expressão de ácido nucleico adequado e administrando-o de tal forma que se torne intracelular, por exemplo, por meio de infeção usando vetores retrovirais defeituosos ou atenuados ou outros vetores virais (veja-se a Patente US N° 4,980,286), ou por meio de injeção direta de ADN desnudo, ou por meio do utilização de bombardeio com microparticulas (por exemplo, uma pistola génica; Biolística, Dupont), ou revestindo com lípidos ou recetores de superfície celular ou agentes de transfeção, encapsulação em lipossomas, micropartícuias, ou microcápsulas, ou administrando-os ligados a um péptido que se sabe que entra ao núcleo, administrando-o ligado a um ligando submetido a endocitose mediada por recetor (veja-se, por exemplo, Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)) (que pode ser usado para se dirigir a tipos celulares alvo que expressam especificamente os recetores), etc. Podem ser formados complexos ácido nucleico-ligando nos quais o ligando compreende um péptido virai fusogénico para alterar os endossomas, permitindo que o ácido nucleico evite a degradação lisossómica. 0 ácido nucleico pode dirigir in vivo para a captação e expressão específica de células, dirigindo um recetor específico (vejam-se, por exemplo, as Publicações PCT WO 92/06180; WO 92/22635; WO 92/20316; WO 93/14188, WO 93/20221) . Como alternativa, o ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado ao ADN da célula hospedeira para sua expressão por meio de recombinação de homólogos (Roller e Smithies, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).

Especificamente, podem ser utilizados vetores virais que contêm sequências de ácidos nucleicos que codificam um anticorpo da invenção. Por exemplo, pode ser usado um vetor retroviral (veja-se Miller et al. , Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993)). Estes vetores retrovirais contêm os componentes necessários para o empacotamento correto do genoma virai e sua integração no ADN da célula hospedeira. As sequências de ácido nucleico que codificam ao anticorpo que vão ser usados em terapêutica génica são clonadas num ou mais vetores, o que facilita a administração do gene a um paciente. Podem ser encontrados mais detalhes sobre os vetores retrovirais em Boesen et al. , Biotherapy 6:291-302 (1994), que descreve a utilização de um vetor retroviral para administrar o gene mdrl a células estaminais hematopoiéticas para hacer às células estaminais mais resistentes à quimioterapia. Outras referências que ilustram a utilização de vetores retrovirais em terapêutica génica são: Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994). Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons e Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993); e Grossman e Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devei. 3:110-114 (1993).

Os adenovirus são outros vetores virais que podem ser utilizados em terapêutica génica. Os adenovirus são veículos especialmente atrativos para administrar genes ao epitélio respiratório. Os adenovirus infetam de maneira natural os epitélio respiratórios onde causam uma doença leve. Outros alvos para sistemas de administração baseados em adenovirus são o fígado, o sistema nervoso central, células endoteliais e músculo. Os adenovirus têm a vantagem de ser capazes de infetar a células que não estão em divisão. Kozarsky e Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993) apresentam uma revisão de terapêutica génica baseada em adenovirus. Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) demostraram a utilização de vetores de adenovirus para transferir genes aos epitelos respiratórios de monos rhesus. Outros casos da utilização de adenovirus em terapêutica génica podem ser encontrados em Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991); Rosenfeld et al., Cell 68:143- 155 (1992); Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993); publicação PCT W094/12649; e Wang, et al. , Gene Therapy 2:775-783 (1995) . Preferentemente, são utilizados vetores de adenovirus.

Também foram adenoassociados foram propostos vírus adeno-associados (VAA) para utilização em terapêutica génica (Walsh et al. , Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993). Patente US N° 5.436.146).

Outra estratégia para a terapêutica génica implica transferir um gene a células em cultura tissular por meio de métodos tais como eletroporação, lipofeção, transfeção mediada por fosfato de cálcio, ou infeção virai. Geralmente, o método de transferência inclui a transferência de um marcador de seleção às células. Depois as células em seleção são postas para isolar a aquelas células que captaram e estão expressando o gene transferido. Então administram-se essas células a um paciente.

Neste caso, o ácido nucleico é introduzido numa célula antes da administração in vivo da célula recombinante resultante. A dita introdução pode ser levada a cabo por meio de qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas sem limitação, transfeção, electroporação, microinjeção, infeção com um vetor virai ou de bacteriófago que contém as sequências de ácido nucleico, fusão celular, transferência génica mediada por cromossomas, transferência génica mediada por microcélulas, fusão de esferoplastos, etc. Conhecem-se na técnica numerosas técnicas para a introdução de genes exógenos em células (veja-se, por exemplo, Loeffler e Behr, Meth. Enzymol. 217:599-618 (1993) . Cohen et al., Meth. Enzymol. 217:618-644 (1993) . Cline, Pharmac. Ther. 29:69-92m (1985) e podem ser utilizados, desde que não se alterem as funções de desenvolvimento e fisiológicas necessárias das células recetoras. A técnica deve proporcionar a transferência estável do ácido nucleico à célula, de tal forma que o ácido nucleico possa ser expresso pela célula e preferentemente seja herdável e expressável por sua descendência celular.

As células recombinantes resultantes podem ser administradas a um paciente por meio de diversos métodos conhecidos na técnica. As células sanguíneas recombinantes (por exemplo, células estaminais hematopoiéticas ou progenitoras) administram-se preferentemente por via intravenosa. A quantidade de células prevista para sua utilização depende do efeito desejado, do estado do paciente, etc., e pode ser determinado por um perito na especialidade.

As células em que pode ser introduzido um ácido nucleico com fins de terapêutica génica abrangem qualquer tipo celular disponível desejado, e inclui, mas sem limitação, células epiteliais, células endoteliais queratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatócitos; células sanguíneas, tais como células T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariócitos, granulócitos; diversas células estaminais ou progenitoras, em particular células estaminais ou progenitoras hematopoiéticas, por exemplo, obtidas da medula óssea, do sangue do cordão umbilical, de sangue periférico, de fígado fetal, etc.

Preferentemente, a célula usada para terapêutica génica é autóloga para o paciente.

Nos casos onde são utilizadas células recombinantes em terapêutica génica, as sequências de ácido nucleico que codificam um anticorpo são introduzidas nas células de tal forma que podem ser expressas pelas células ou sua descendência, e depois administram-se as células recombinantes in vivo para o efeito terapêutico. Especificamente, podem ser utilizadas células estaminais ou progenitoras. Pode ser usada potencialmente qualquer célula estaminal e/ou progenitora que possa ser isolada e mantida in vitro (veja-se, por exemplo, a publicação PCT WO 94/08598; Stemple e Anderson, Cell 71:973-985 (1992); Rheinwald, Meth. Cell Bio. 21A:229 (1980); e Pittelkow e Scott, Mayo Clinic Proc. 61:771 (1986)). O ácido nucleico a ser introduzido com fins de terapêutica génica pode compreender um promotor induzível ligado operativamente à região codificante, de tal forma que possa ser controlada a expressão do ácido nucleico controlando a presença ou ausência do indutor da transcrição adequado.

Demostração da atividade terapêutica ou profilática

Os compostos ou composições farmacêuticas da invenção são testadas preferentemente in vitro, e depois in vivo para a atividade terapêutica ou profilática desejada, antes de utilização em seres humanos. Por exemplo, os ensaios in vitro para demostrar a utilidade terapêutica ou profilática de um composto ou composição farmacêutica incluem o efeito de um composto numa linha celular ou numa amostra de tecido do paciente. 0 efeito do composto ou composição na linha celular e/ou mostra de tecido pode ser determinado utilizando técnicas conhecidas para os peritos na especialidade, incluindo, mas sem limitação, ensaios de formação de roseta e ensaios de lise celular. De acordo com a invenção, os ensaios in vitro que podem ser utilizados para determinar se a administração de um composto especifico está indicada incluem ensaios de cultura celular in vitro nos quais cultiva-se uma amostra de tecido de um paciente e é exposto ou de outro modo administrado um composto e observa-se o efeito do dito composto na mostra de tecido.

Administração terapêutica/profilática e composições

Os métodos de tratamento, inibição e profilaxia por meio de administração a um indivíduo de uma quantidade eficaz de um composto ou composição farmacêutica da invenção, preferentemente um anticorpo da invenção, são descritos no presente documento. Num aspeto preferido, o composto está substancialmente purificado (por exemplo, substancialmente livre de substâncias que limitam seu efeito ou produzem efeitos secundários não desejados). 0 indivíduo é preferentemente um animal, incluindo, mas sem limitação, animais tais como vacas, cerdos, cavalos, galinhas, gatos, cães, etc., e é preferentemente um mamífero, e o mais preferentemente um ser humano.

As formulações e métodos de administração que podem ser utilizados quando o composto compreende um ácido nucleico ou uma imunoglobulina foram descritos anteriormente; as formulações e as rotas de administração adicionais adequadas podem ser selecionadas entre aquelas descritas a seguir no presente documento.

Conhecem-se diversos sistemas de administração e podem ser utilizados para administrar um composto da invenção, por exemplo, encapsulação em lipossomas, micropartícuias, microcápsulas, células recombinantes capazes de expressar o composto, endocitose mediada por recetor (veja-se, por exemplo, Wu e Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)), construção de um ácido nucleico como parte de um vetor retroviral ou de outro tipo, etc. Os métodos de introdução incluem, mas sem limitação, as rotas intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutânea, intranasal, epidural, e oral. Os compostos ou composições podem ser administrados por meio de qualquer rota conveniente, por exemplo, por meio de infusão ou injeção em bolo, por meio de absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutáneos (por exemplo, mucosa oral, rectal e mucosa intestinal, etc.) e pode ser administrado juntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistémica ou local. Além disso, pode ser desejável introduzir os compostos ou composições farmacêuticas da invenção no sistema nervoso central por meio de qualquer rota adequada, incluindo injeção intraventricular e intratecal; a injeção intraventricular pode ser facilitada por um cateter intraventricular, por exemplo, ligado a um depósito, tal como um depósito Ommaya. Também pode ser usada a administração pulmonar, por exemplo, por meio da utilização de um inalador ou um nebulizador, e formulação com um agente aerossolizante.

Numa forma de realização específica, pode ser desejável administrar os compostos ou composições farmacêuticas da invenção por via local à zona que necessite tratamento; isto pode ser conseguido por meio de, por exemplo, mas não como limitação, infusão local durante a cirurgia, aplicação tópica, por exemplo, de maneira conjunta com um apósito para feridas depois da cirurgia, por meio de injeção, por meio de um cateter, por meio de um supositório, ou por meio de um implante, sendo o dito implante de um material poroso, não poroso ou gelationoso, incluindo membranas, tais como membranas sialásticas, ou fibras. Preferentemente, quando se administra uma proteína, incluindo um anticorpo da invenção, se tem que ter cuidado de usar materiais nos que não se absorba a proteína.

Em outra forma de realização, o composto ou composição pode ser administrado numa vesícula, em particular um lipossoma (veja-se Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et ai., em Liposomes in the Therapy of infetious Disease and Cancer, Lopez-Berestein e Fidler (eds.), Liss, Nova Iorque, págs. 353365 (1989); Lopez-Berestein, ibidem, páginas 317-327; veja-se de maneira geral o mesmo).

Em outra forma de realização mais, o composto ou composição pode ser administrado num sistema de libertação controlada. Numa forma de realização, se pode usar uma bomba (veja-se Langer, anteriormente citado; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et ai., Surgery 88:507 (1980); Saudek et ai., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)). Em outra forma de realização, podem ser utilizados materiais poliméricos (veja-se Medicai Applications of Controlled Release, Langer e Wise (eds.), CRC Press., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen e Ball (eds.), Wiley, Nova Iorque (1984); Ranger e Peppas, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 (1983); veja-se também Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al. , Ann. Neurol. 25:351 (1989); Howard et al. , J. Neurosurg. 71:105 (1989)). Em outra forma de realização mais, se pode colocar um sistema de libertação controlada em proximidade com o alvo terapêutico, isto é, o cérebro, requerendo desta maneira somente uma fração da dose sistémica (veja-se, por exemplo, Goodson, em Medicai Applications of Controlled Release, anteriormente citado, vol. 2, págs. 115-138 (1984)).

Outros sistemas de libertação controlada são discutidos na revisão de Langer (Science 249:1527-1533 (1990)).

Nos casos onde o composto da invenção é um ácido nucleico que codifica uma proteína, o ácido nucleico pode ser administrado in vivo para promover a expressão de su proteína codificada, construindo-o como parte de um vetor de expressão de ácido nucleico adequado e administrando-o de tal forma que se torne intracelular, por exemplo, por meio da utilização de um vetor retroviral (veja-se a Patente US N° : 4.980.286), ou por meio de injeção direta, ou por meio da utilização de bombardeio com micropartícuias (por exemplo, uma pistola génica; Biolistica, Dupont), ou revestindo com lípidos ou recetores de superfície celular ou agentes de transfeção, ou administrando-o ligado a um péptido similar a uma caixa homeostática que se sabe que entra no núcleo (veja-se, por exemplo, Joliot et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:1864-1868 (1991)), etc. Como alternativa, um ácido nucleico pode ser introduzido intracelularmente e incorporado ao ADN da célula hospedeira para sua expressão, por meio de recombinação de homólogos. A presente invenção também proporciona composições farmacêuticas. As ditas composições compreendem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto, e um veículo farmaceuticamente aceitável. Numa forma de realização específica, a expressão "farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agencia reguladora do Governo Federal ou de um estado ou lista na Farmacopeia de

Estados Unidos ou outra farmacopeia reconhecida geralmente para utilização em animais, e mais particularmente em seres humanos. 0 termo "veiculo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente, ou veiculo com o que se administra o agente terapêutico. Os ditos veículos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluídos aqueles cuja origem é petróleo, animal, vegetal ou origem sintética, tais como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes. A água é um veículo preferido quando a composição farmacêutica se administra por via intravenosa. Também podem ser utilizados soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Os excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, creta, sílica gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite magro desidratado, glicerol, propileno, glicois, água, etanol e semelhantes. A composição, se for desejado, também pode conter quantidades menores de agentes humectantes ou emulsionantes, ou agentes tamponadores do pH. Estas composições podem adotar a forma de soluções, suspensões, emulsão, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação sustentada e semelhantes. A composição pode ser formulada em forma de supositório, com aglutinantes e veículos tradicionais, tais como triglicéridos. As formulações orais podem incluir veículos convencionais, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, etc. Os exemplos adequados de veículos farmacêuticos são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" de E.W. Martin. As ditas composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto, preferentemente em forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada de veículo para proporcionar a forma para sua administração adequada ao paciente. A formulação deve ser ajustada ao modo de administração.

Preferentemente, a composição formula-se de acordo com procedimentos rotineiros em forma de composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotónico estéril. Nos casos necessários, a composição também pode incluir um agente solubilizante e um anestésico local, tal como lignocaina para aliviar a dor no local de injeção. Em geral, os ingredientes administram-se por separado ou misturados juntamente numa forma farmacêutica unitária, por exemplo, em forma de um pó liofilizado ou de concentrado sem água numa embalagem hermeticamente fechado, tal como uma ampola ou uma bolsinha que indica a quantidade de agente ativo. Nos casos onde a composição administra-se por meio de infusão, pode ser administrado numa garrafa para infusão que contém água ou solução salina de grau farmacêutico. Quando a composição administra-se por meio de injeção, pode ser proporcionada uma ampola de água estéril para injeção ou soro salino de tal forma que os ingredientes possam ser misturados antes da administração.

Os compostos da invenção podem ser formulados como formas neutras ou salinas. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem aquelws formadas com aniões, tais como aquelas derivadas de ácido clorídrico, fosfórico, acético, oxálico, tartárico, etc., e aquelas formadas com catiões, tais como aquelas derivadas de hidróxido de sódio, potássio, amónio, cálcio, férrico, isopropilamina, trietilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína, etc. A quantidade do composto da invenção que será eficaz no tratamento, inibição e prevenção de uma doença ou distúrbio associado com a expressão e/ou atividade aberrante de um polipéptido da invenção pode ser determinado por meio de técnicas clínicas convencionais.

Além disso, podem ser utilizados opcionalmente ensaios in vitro para ajudar a identificar os intervalos de dosagem ótimos. A dose precisa a ser usada na formulação também dependerá da rota de administração, e da gravidade da doença ou distúrbio, e deve ser decido de acordo com o critério do médico e das circunstâncias de cada paciente. As doses eficazes podem ser extrapoladas a partir de curvas de resposta à dose derivadas de sistemas de ensaio in vitro ou de modelos animais.

Para anticorpos, a dose administrada a um paciente é tipicamente de 0,1 mg/kg a 100 mg/kg de peso corporal do paciente. Preferentemente, a dose administrada a um paciente é tipicamente de entre 0,1 mg/kg e 20 mg/kg de peso corporal do paciente, mais preferentemente de 1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal do paciente. Em geral, os anticorpos humanos têm uma semivida maior no corpo humano que os anticorpos de outras espécies devido à resposta imune aos polipéptidos exógenos. Portanto, com frequência é possível uma administração menor de anticorpos humanos e uma administração menos frequente. Além disso, a dosagem e a frequência de administração dos anticorpos da invenção podem ser reduzidas potenciando a captação e a penetração em tecido (por exemplo, no cérebro) dos anticorpos por meio de modificações, tais como, por exemplo, lipidação. A invenção também proporciona um paquete ou kit farmacêutico que compreende um ou mais embalagens preenchidos com um ou mais dos ingredientes das composições farmacêuticas da invenção. Pode ter um aviso associado opcionalmente à dita embalagem da maneira prescrita por uma organismo governamental que regule o fabrico, utilização ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, que reflita a aprovação pelo organismo para o fabrico, utilização ou venda para administração a seres humanos.

Diagnóstico e obtenção de imagens com anticorpos

Podem ser utilizados anticorpos marcados e derivados e análogos dos mesmos que se ligam especificamente a um polipéptido de interesse com fins de diagnóstico para detetar, diagnosticar, ou controlar doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas associados com a expressão e/ou atividade aberrante de um polipéptido da invenção. A invenção proporciona a deteção da expressão aberrante de um polipéptido de interesse, que compreende (a) testar a expressão do polipéptido de interesse em células ou fluido corporal de um indivíduo usando um ou mais anticorpos específicos para o polipéptido de interesse; e (b) comparar o nível de expressão génica com um nível de expressão génica padrão, por meio do que um aumento ou diminuição no nível de expressão génica do polipéptido testado em comparação com o nível de expressão padrão é indicativo de expressão aberrante. A invenção proporciona um ensaio diagnóstico para diagnosticar um distúrbio, que compreende (a) testar a expressão do polipéptido de interesse em células ou fluido corporal de um indivíduo usando um ou mais anticorpos específicos para o polipéptido de interesse; e (b) comparar o nível de expressão génica com um nível de expressão génica padrão, por meio do que um aumento ou diminuição no nível de expressão génica do polipéptido testado em comparação com o nível de expressão padrão é indicativo de um distúrbio particular. Em referência ao cancro, a presença de uma quantidade relativamente alta de transcrito em tecido submetido a biópsia de um indivíduo pode indicar uma predisposição para o desenvolvimento da doença, ou pode proporcionar um meio para detetar a doença antes da aparição de sintomas clínicos reais. Um diagnóstico mais definitivo deste tipo pode permitir aos profissionais da saúde utulizar medidas preventivas ou um tratamento agressivo antes, evitando deste modo o desenvolvimento ou uma progressão maior do cancro.

Os anticorpos da invenção podem ser utilizados para testar níveis proteicos numa amostra biológica usando métodos imunohistológicos clássicos conhecidos para os peritos na especialidade (por exemplo, veja-se Jalkanen, et al. , J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985). Jalkanen, et al. , J. Cell Biol. 105:3087-3096 (1987)). Outros métodos baseados em anticorpos úteis para detetar a expressão génica de proteínas incluem imunoensaios, tais como o ensaio imunoabsorvente acoplado a enzimas (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA). Os marcadores para ensaios de anticorpos adequados conhecem-se na técnica e incluem marcadores enzimáticos, tais como, glicose oxidase; radioisótopos, tais como iodo (125I, 121I, carbono (14C) , enxofre (35S) , tritio (3H) , índio (112In) , e tecnécio ("Tc) ; marcadores luminescentes, tais como luminol; e marcadores fluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina, e biotina.

Um aspeto da invenção é a deteção e o diagnóstico de uma doença ou distúrbio associado com a expressão aberrante de um polipéptido de interesse num animal, preferentemente um mamífero e mais preferentemente um ser humano. Numa forma de realização, o diagnóstico compreende: (a) administrar (por exemplo, por via parenteral, subcutânea, ou intraperitoneal) a um indivíduo uma quantidade eficaz de uma molécula marcada que se liga especificamente ao polipéptido de interesse; (b) esperar durante um intervalo de tempo depois da administração para permitir que a molécula marcada se concentre preferentemente em locais no indivíduo onde é expresso o polipéptido (e para que se elimine a molécula não unida até o nível de fundo); (c) determinar o nível de fundo; e (d) detetar a molécula marcada no indivíduo, de tal forma que a deteção da molécula marcada acima do nível de fundo indique que o indivíduo tem uma doença ou distúrbio concreto associado com a expressão aberrante do polipéptido de interesse. O nível de fundo pode ser determinado por meio de diversos métodos que incluem comparar a quantidade de molécula marcada detetada com um valor padrão determinado previamente para um sistema particular.

Se entenderá na técnica que o tamanho do indivíduo e o sistema de obtenção de imagens determinará a quantidade de resíduo para obtenção de imagens necessária para produzir imagens de diagnóstico. No caso de um resíduo de radioisótopo, para um indivíduo humano, a quantidade de radioatividade injetada estará normalmente no intervalo de cerca de 5 a 20 milicuries de 99mTc. O anticorpo marcado ou o fragmento de anticorpo se acumulará então preferentemente na localização de células que contêm a proteína específica. A obtenção de imagens de tumor in vivo descreve-se em S.W. Burchiel et al. , "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Capítulo 13 em Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel e B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982).

Dependendo de várias variáveis, incluindo o tipo de marcador usado e do modo de administração, o intervalo de tempo depois da administração para permitir que a molécula marcada se concentre preferentemente em locais no indivíduo e para que a molécula não ligada seja eliminada até o nível de fundo é de 6 a 48 horas ou de 6 a 24 horas ou de 6 a 12 horas. Em outra forma de realização, o intervalo de tempo depois da administração é de 5 a 20 dias ou de 5 a 10 dias.

Numa forma de realização, o controlo da doença ou o distúrbio é levado a cabo repetindo o método para diagnosticar a doença ou distúrbio, por exemplo, um mês depois do diagnóstico inicial, seis meses depois do diagnóstico inicial, um ano depois do diagnóstico inicial, etc. A presença da molécula marcada pode ser detetada no paciente usando métodos conhecidos na técnica para o rastreio in vivo. Estes métodos dependem do tipo de marcador usado. Os peritos na especialidade serão capazes de determinar o método adequado para detetar um marcador determinado. Os métodos e dispositivos que podem ser utilizados nos métodos de diagnóstico da invenção incluem, mas sem limitação, tomografia computadorizada (TC), scâner de corpo completo, tal como tomografia de emissão de positrões (PET), obtenção de imagens por ressonância magnética (MRI), e sonografia.

Numa forma de realização especifica, a molécula é marcada com um radioisótopo e detetada no paciente usando um instrumento cirúrgico sensível à radiação (Thurston et al. , Patente US N° 5.441.050) . Em outra forma de realização, a molécula é marcada com um composto fluorescente e deteta-se no paciente usando um instrumento de rastreio que deteta fluorescência. Em outra forma de realização, a molécula é marcada com um metal emissor de positrões e deteta-se no paciente usando tomografia de emissão de positrões. Em outra forma de realização mais, a molécula é marcada com um marcador paramagnético e deteta-se num paciente usando obtenção de imagens por ressonância magnética (MRI).

Kits A presente invenção proporciona kits que podem ser utilizados nos métodos anteriores. Numa forma de realização, um kit compreende um anticorpo da invenção, preferentemente um anticorpo purificado, numa ou mais embalagens. Numa forma de realização específica, os kits da presente invenção contêm um polipéptido substancialmente isolado que compreende um epítopo que é especificamente imunorreativo com um anticorpo incluído no kit. Preferentemente, os kits da presente invenção compreendem além disso um anticorpo de controlo que não reage com o polipéptido de interesse. Em outra forma de realização específica, os kits da presente invenção contêm um meio para detetar a ligação de um anticorpo a um polipéptido de interesse (por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado a um substrato detetável, tal como um composto fluorescente, um substrato enzimático, um composto radioativo ou um composto luminescente, ou um segundo anticorpo que reconhece ao primeiro anticorpo pode ser conjugado a um substrato detetável).

Em outra forma de realização especifica da presente invenção, o kit é um kit diagnóstico para utilização na rastreio de soro que contém anticorpos específicos contra polinucleótidos e polipéptidos proliferativos e/ou cancerosos. 0 dito kit pode conter um anticorpo de controlo que não reage com o polipéptido de interesse. 0 dito kit pode incluir um antigénio polipeptídico substancialmente isolado que compreende um epítopo que é especificamente imunorreativo com pelo menos um anticorpo anti-antigénio polipeptídico. Além disso, o dito kit inclui meios para detetar a ligação do dito anticorpo ao antigénio (por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado a um composto fluorescente, tal como fluoresceína ou rodamina que podem ser detetado por meio de citometria de fluxo). Em formas de realização específicas, o kit pode incluir um antigénio polipeptídico produzido recombinantemente ou quimicamente sintetizado. 0 antigénio polipeptídico do kit também pode se ligar a um suporte sólido.

Numa forma de realização mais específica, os meios de deteção do kit anteriormente descrito incluem um suporte sólido ao qual se liga o dito antigénio polipeptídico. 0 dito kit também pode incluir um anticorpo anti-humano marcado com indicador não ligado. Nesta forma de realização, a ligação do anticorpo ao antigénio polipeptídico pode ser detetada por meio da ligação do o dito anticorpo marcado com indicador.

Numa forma de realização adicional, a invenção inclui um kit diagnóstico para utilização no rastreio de soro que contém antigénios do polipéptido da invenção. 0 kit diagnóstico inclui um anticorpo substancialmente isolado especificamente imunorreativo com antigénios polipeptidicos ou polinucleotidicos, e meios para detetar a ligação do antigénio polinucleotidico ou polipeptidico ao anticorpo. Numa forma de realização, o anticorpo está ligado a um suporte sólido. Numa forma de realização especifica, o anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal. Os meios de deteção do kit podem incluir um segundo anticorpo monoclonal marcado. Como alternativa, ou além disso, os meios de deteção podem incluir um antigénio marcado competitivo.

Numa configuração diagnóstica, é feito reagir ao soro de ensaio com um reagente de fase sólida que tem um antigénio ligado à superfície obtido por meio dos métodos descritos no presente documento. Depois da ligação com anticorpo de antigénio específico ao reagente e de deletar os componentes do soro não ligados por meio de lavagem, é feito reagir ao reagente com anticorpo anti-humano marcado com indicador para que se uma o indicador ao reagente em proporção à quantidade de anticorpo anti-antigénio ligado sobre o suporte sólido. 0 reagente lava-se de novo para deletar o anticorpo marcado não ligado, e é determinado a quantidade de indicador associado com o reagente. Tipicamente, o indicador é uma enzima que se deteta incubando a fase sólida em presença de um substrato fluorométrico, luminescente ou colorimétrico adequado (Sigma St. Louis, MO). 0 reagente de superfície sólida no ensaio anterior se prepara por meio de técnicas conhecidas para ligar material proteico a material de suporte sólido, tal como pérolas poliméricas, tiras reativas, placas de 96 poços ou material de filtro. Estes métodos de ligação incluem geralmente a adsorção não específica da proteína ao suporte ou a ligação covalente da proteína, tipicamente por meio de um grupo amino livre, a um grupo quimicamente reagente sobre o suporte sólido, tal como um grupo carboxilo, hidroxilo, ou aldeído ativado. Como alternativa, podem ser utilizados placas revestidas com estreptavidina conjuntamente com antigénios biotinilados.

Portanto, a invenção proporciona um sistema ou kit de ensaio para levar a cabo este método diagnóstico. 0 kit inclui geralmente um suporte com antigénios recombinantes ligados à superfície, e um anticorpo anti-humano marcado com indicador para detetar o anticorpo anti-antigénio ligado à superfície.

Proteínas de fusão

Qualquer polipéptido da presente invenção pode ser usado para gerar proteínas de fusão. Por exemplo, o polipéptido da presente invenção, quando fusiona-se a uma segunda proteína, pode ser usado como marcador antigénico. Podem ser utilizados anticorpos provocados contra o polipéptido da presente invenção para detetar indiretamente a segunda proteína ligando-a ao polipéptido. Além disso, devido a que determinadas proteínas se dirigem a localizações celulares baseadas no tráfego de sinais, os polipéptidos da presente invenção podem ser utilizados como moléculas de direcionamiento uma vez fusionados a outras proteínas.

Os exemplos de domínios que podem ser fusionados a polipéptidos da presente invenção incluem não somente sequências de sinal heterólogas, mas também outras regiões funcionais heterólogas. A fusão não tem por quê ser necessariamente direta, mas que pode suceder por meio de sequências ligantes.

Além disso, também podem ser projetadas proteínas de fusão para melhorar as caracteristicas do polipéptido da presente invenção. Por exemplo, pode ser adicionada uma região de aminoácidos adicionais, particularmente aminoácidos carregados, à extremidade N-terminal do polipéptido para melhorar a estabilidade e a persistência durante a purificação da célula hospedeira ou posterior manipulação e armazenamento. Podem ser adicionados resíduos peptídicos ao polipéptido para facilitar a purificação. As ditas regiões podem ser deletadas antes da preparação final do polipéptido. De maneira similar, podem ser introduzidos locais de clivagem peptídica em meio dos ditos resíduos peptídicos, que podem ser submetidos adicionalmente a atividade de protease para deletar os ditos péptidos da proteína da presente invenção. A adição de resíduos peptídicos, incluindo locais de clivagem peptídicos, para facilitar a manipulação de polipéptidos é é uma técnica familiar e rotineira na técnica.

Além disso, os polipéptidos da presente invenção, incluindo fragmentos, e especificamente epítopos, podem ser combinados com partes do domínio constante de imunoglobulinas (IgA, IgE, IgG, IgM) ou porções dos mesmos (CHI, CH2, CH3, e qualquer combinação dos mesmos, incluindo tanto domínios completos como porções dos mesmos), dando como resultado polipéptidos quiméricos. Estas proteínas de fusão facilitam a purificação e mostram uma semivida in vivo aumentada. Um exemplo comunicado descreve proteínas quiméricas que consistem nos dois primeiros domínios do polipéptido CD4 humano e vários domínios das regiões constantes das cadeias leves ou pesadas de imunoglobulinas de mamífero. (Documento EP A 394,827; Traunecker et al., Nature 331:84-86 (1988)). As proteínas de fusão que têm estruturas diméricas ligadas por meio de dissulfuretos (devido à IgG) também podem ser mais eficazes na ligação e neutralização de outras moléculas que a proteína monomérica secretada ou que somente o fragmento de proteína. (Fountoulakis et al., J. Biochem. 270:3958-3964 (1995)).

De maneira similar, o documento EP-A 0 464 533 (homólogo canadiano 2.045.869) divulga proteínas de fusão que compreendem diversas porções da região constante de moléculas de imunoglobulina juntamente com outra proteína humana ou parte da mesma. Em muitos casos, a parte Fc numa proteína de fusão é benéfica para terapêutica e diagnóstico, e portanto pode dar como resultado, por exemplo, propriedades farmacocinéticas melhoradas. (Documento EP-A 0 232 262) . Como alternativa, pode ser desejado deletar a parte Fc depois de que a proteína de fusão tenha sido expressada, detetada e purificada. Por exemplo, a porção Fc pode impedir a terapêutica e o diagnóstico se a proteína de fusão for utilizada como antigénio para imunizações. No desenvolvimento de fármacos, por exemplo, as proteínas humanas, tais como hIL-5, foram fusionadas a porções Fc com o propósito de desenvolver ensaios de rastreio de alto rendimento para identificar antagonistas de hIL-5. (Veja-se, D. Bennett et al., J. Molecular Recognition 8:52-58 (1995); K. Johanson et al. , J. Biol. Chem. 270:9459-9471 (1995)).

Além disso, os polipéptidos da presente invenção podem ser fusionados a sequências marcadoras (também citadas como "marcadores"). Devido à disponibilidade de anticorpos específicos para os ditos "marcadores", a purificação do polipéptido fusionado da invenção e/ou sua identificação é facilitada significativamente já que não são necessários anticorpos específicos para os polipéptidos da invenção. A dita purificação pode ser em forma de uma purificação de afinidade por meio da qual está presente um anticorpo anti-marcador ou outro tipo de matriz de afinidade (por exemplo, anticorpo anti-marcador ligado à matriz de uma coluna de fluxo passante) que se liga ao marcador epitópico. Em formas de realização preferidas, a sequência de aminoácidos marcadora é um péptido de hexa-histidina, tal como o marcador proporcionado num vetor pQE (QIAGEN, Inc., 9259 Eton Avenue, Chatsworth, CA, 91311), entre outros, muitos dos quais estão disponíveis comercialmente. Tal como descreve-se em Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:821-824 (1989), por exemplo, a hexa-histidina proporciona uma purificação conveniente da proteína de fusão. Outro marcador peptídico útil para a purificação, o marcador "HA", corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina da gripe. (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) . 0 perito na especialidade reconhecerá a existência de outros "marcadores" que possam ser substituídos facilmente pelos marcadores citados anteriormente para a purificação e/ou identificação de polipéptidos da presente invenção (Jones C., et al., J Chromatogr A. 707(1):3-22 (1995)). Por exemplo, o marcador c-myc e os anticorpos 8F9, 3C7, 6E10, G4m B7 e 9E10 para esta (Evan et al., Molecular and Cellular Biology 5:3610-3616 (1985)); o marcador de glucoproteína D (gD) do vírus do Herpes simplex e su anticorpo (Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990), o péptido FLAG®, isto é, a sequência de octapéptido DYKDDDDK (SEQ ID N°: 56), (Hopp et al., Biotech. 6:1204-1210 (1988). o péptido do epítopo KT3 (Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)); o péptido do epítopo de a-tubulina (Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15136-15166, (1991)); o marcador peptídico da proteína 10 do gene T7 (Lut z-Freyermuth et al., Proc. Natl. Sei. USA, 87:6363-6397 (1990)), o epítopo de FITC (Zymed, Inc.), o epítopo de GFP (Zymed, Inc.), e o epítopo de rodamina (Zymed, Inc.). A presente invenção também abrange a ligação de até nove codões que codificam uma série repetida de até nove aminoácidos de arginina à região codificante de um polinucleótido da presente invenção. A invenção também abrange derivatizar quimicamente um polipéptido da presente invenção com uma série repetida de até nove aminoácidos de arginina. O dito marcador, quando se liga a um polipéptido, foi demonstrado recentemente que serve como passagem universal, permitindo que os compostos acessem ao interior de células sem derivatização ou manipulação adicional (Wender, P., et al., dados não publicados).

As fusões proteicas que implicam polipéptidos da presente invenção, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos, podem ser utilizados para os seguintes exemplos não limitantes, localização subcelular de proteínas, determinação de interações proteína-proteína por meio de imunoprecipitação, purificação de proteínas por meio de cromatografia de afinidade, caracterização funcional e/ou estrutural de proteínas. A presente invenção também abrange a aplicação de anticorpos específicos de hapteno para quaisquer das utilizações citados anteriormente para proteínas de fusão de epítopo. Por exemplo, os polipéptidos da presente invenção poderiam ser derivatizados quimicamente para se ligar a moléculas de hapteno (por exemplo, DNP, (Zymed, Inc.)). Devido à disponibilidade de anticorpos monoclonais específicos para os ditos haptenos, a proteína poderia ser purificada facilmente usando imunoprecipitação, por exemplo.

Os polipéptidos da presente invenção, incluindo fragmentos e/ou variantes dos mesmos, além disso de anticorpos dirigidos contra os ditos polipéptidos, fragmentos, e/ou variantes podem ser fusionado a um número quaisquer de toxinas conhecidas e ainda por determinar, tais como ricina, saporina (Mashiba H, et al. , Ann. N. E. Acad. Sei. 1999; 886:233-5), ou toxina HC (Tonukari NJ, et al. , Plant Cell. 2000 Fev; 12 (2) :237-248), por exemplo. As ditas fusões podem ser utilizados para administrar as toxinas a tecidos desejados para os que existe um ligando ou uma proteína capaz de se ligar aos polipéptidos da invenção. A invenção abrange a fusão de anticorpos dirigidos contra polipéptidos da presente invenção, incluindo variantes e fragmentos dos mesmos, para as ditas toxinas para administrar a toxina a localizações específicas numa célula, a tecidos específicos e/ou espécies específicas. Os ditos anticorpos bifuncionais conhecem-se na técnica, embora uma revisão que descreva fusões vantajosas adicionais, incluindo citações para métodos de produção, podem ser encontrados em P.J. Hudson, Curr. Opp. In. Imm. 11:548-557, (1999). Neste contexto, o termo "toxina" pode ser ampliado para incluir qualquer proteína heteróloga, uma molécula pequena, radionucleótidos, fármacos citotóxicos, lipossomas, moléculas de adesão, glucoproteínas, ligandos, ligandos específicos de célula ou tecido, enzimas, agentes bioativos, modificadores da resposta biológica, agentes antifúngicos, hormonas, esteroides, vitaminas, péptidos, análogos peptídicos, agentes anti-alergénicos, agentes antituberculares, agentes antivíricos, antibióticos, agentes anti-protozoos, quelatos, partículas radioativas, iões radioativos, agentes de contraste de raios X, anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais e material genético, à vista da presente divulgação, um perito na especialidade poderia determinar se qualquer "toxina" particular poderia ser usado nos compostos da presente invenção. Os exemplos de "toxinas" adequadas citados anteriormente são somente exemplares e não se pretende que limitem as "toxinas" que podem ser utilizados na presente invenção.

Portanto, quaisquer destas fusões anteriores podem ser projetadas usando os polinucleótidos ou os polipéptidos da presente invenção.

Vetores, células hospedeiras e produção de proteínas A presente invenção também refere-se a vetores que contêm os polinucleótidos da presente invenção, células hospedeiras, e a produção de proteínas por meio de técnicas recombinantes. 0 vetor pode ser, por exemplo, um vetor de fago, plasmídeo, viral, ou retroviral. Os vetores retrovirais podem ser competentes para replicação ou defeituosos para replicação. No último caso, a propagação virai sucederá geralmente unicamente em células hospedeiras complementares .

Os polinucleótidos podem se ligar a um vetor que contém um marcador de seleção para a propagação num hospedeiro. Em geral, é introduzido um vetor plasmídico num precipitado, tal como um precipitado de fosfato de cálcio, ou num complexo com um lípido carregado. Se o vetor é um vírus, pode ser embalado in vitro usando uma linha celular embaladora adequada e depois ser transduzida a células hospedeiras. A inserção de polinucleótido deve se ligar operativamente a um promotor adequado, tal como o promotor PL de fago lambda, os promotores lac, trp, phoA e tac de E. coli, os promotores precoces e tardios de SV40 e os promotores de LTR retrovirais, por nomear somente alguns. Os peritos na especialidade conhecerão outros promotores adequados. As construções de expressão conterão além disso locais para o inicio e a terminação da transcrição e, na região transcrita, um local de ligação a ribossomas para a tradução. A porção codificante dos transcritos expressados pelas construções incluirão preferentemente um codão de iniciação da tradução ao começo e um codão de terminação (UAA, UGA ou UAG) posicionada adequadamente na extremidade do polipéptido que a ser traduzido.

Tal como foi indicado, os vetores de expressão incluirão preferentemente pelo menos um marcador de seleção. Os ditos marcadores incluem genes de resistência a dihidrofolato redutase, G418 ou neomicina para a cultura de células eucariotas e de resistência a tetraciclina, kanamicina ou ampicilina para cultivar em E. coli e outras bactérias. Os exemplos representativos de hospedeiros adequados incluem, mas sem limitação, células bacterianas, tais como células de E. coli, Streptomyces e de Salmonella typhimurium; células fúngicas, tais como células de levedura (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae ou Pichia pastoris (N° de registro ATCC® 201178)); células de inseto, tais como células S2 de Drosophila e células Sf9 de Spodoptera; células animais, tais como células CHO, COS, 293, e de melanoma de Bowes; e células vegetais. Os meios e condições de cultura adequados para as células hospedeiras anteriormente descritas conhecem-se na técnica.

Entre os vetores preferidos para utilização em bactéria incluem pQE70, pQE60 e pQE9, disponíveis através de QIAGEN, Inc.; vetores PBLUESCRIPT®, vetores Phagescript, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A, disponíveis através de Stratagene Cloning Systems, Inc.; e ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 disponíveis através de Pharmacia Biotech, Inc. Entre os vetores de eucariotas preferidos estão pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG disponíveis através de Stratagene; e pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL disponíveis através de Pharmacia. Os vetores de expressão preferidos para utilização em sistemas de levedura incluem, mas sem limitação, pYES2, pYDl, pTEFl/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalph, pPIC9, pPIC3,5, pHIL-D2, pHIL-Sl, pPIC3,5K, pPIC9K, e PA0815 (todos disponíveis através de Invitrogen, Carlsbad, CA) . Outros vetores adequados serão facilmente evidentes para o perito na especialidade. A introdução da construção na célula hospedeira pode ser efetuada por meio de transfeção de fosfato de cálcio, transfeção mediada por DEAE-dextrano, transfeção mediada por lípido catiónico, eletroporação, transdução, infeção, ou outros métodos. Os ditos métodos são descritos em muitos manuais de laboratório convencionais, tais como Davis et al., Basic Methods In Molecular Biology (1986) . Contempla-se especificamente que os polipéptidos da presente invenção possam de facto ser expressos por uma célula hospedeira que não possui de um vetor recombinante.

Um polipéptido desta invenção pode ser recuperado e purificado a partir de culturas de células recombinantes por meio de métodos bem conhecidos, incluindo precipitação com sulfato de amónio ou etanol, extração de ácido, cromatografia de permuta aniónico ou catiónico, cromatografia em fosfocelulose, cromatografia de interação hidrófoba, cromatografia de afinidade, cromatografia de hidroxilapatita e cromatografia de lectina. 0 mais preferentemente, se utiliza cromatografia liquida de alto rendimento ("HPLC") para a purificação.

Os polipéptidos da presente invenção, e preferentemente a forma secretada, também pode ser recuperado desde: produtos purificados a partir de fontes naturais, incluindo fluidos corporais, tecidos e células, já seja isoladas diretamente ou cultivadas; produtos de procedimentos sintéticos químicos; e produtos produzidos por meio de técnicas recombinantes a partir de um hospedeiro procariota ou eucariota, incluindo, por exemplo, células bacterianas, leveduras, de plantas superiores, de inseto, e de mamífero. Dependendo do hospedeiro usado num procedimento de produção recombinante, os polipéptidos da presente invenção podem estar glicosilados ou não glicosilados. Além disso, os polipéptidos da invenção também podem incluir um resíduo de metionina inicial modificado, em alguns casos como resultado de processos mediados pelo hospedeiro. Portanto, sabe-se bem na técnica que a metionina N-terminal codificada pelo codão de iniciação da tradução retira-se com alta eficácia de qualquer proteína depois da tradução em todas as células eucariotas. Enquanto que a metionina N-terminal na maioria de proteínas elimina-se também de maneira eficaz na maioria de procariotas, para algumas proteínas, este processo de retirada procariótico é ineficaz, dependendo da natureza do aminoácido ao que a metionina N-terminal liga-se covalentemente.

Numa forma de realização, é utilizada a levedura Pichia pastoris para expressar o polipéptido da presente invenção num sistema eucariota. Pichia pastoris é uma levedura metilotrópica que pode metabolizar o metanol como única fonte de carbono. Uma etapa principal na rota de metabolização do metanol é a oxidação do metanol a formaldeido usando O2. Esta reação está catalisada pela enzima álcool oxidase. Para metabolizar o metanol como sua única fonte de carbono, a Pichia pastoris tem que gerar altos níveis de álcool oxidase devido, em parte, à afinidade relativamente baixa de álcool oxidase pelo O2. Em consequência, num meio de crescimento que depende do metanol como principal fonte de carbono, a região promotora de um dos dois genes de álcool oxidase (A0X1) é elevadamente ativa. Em presença de metanol, a álcool oxidase produzida a partir do gene A0X1 compreende até cerca de um 30 % da proteína total solúvel em Pichia pastoris. Veja-se, Ellis, S.B., et al., Mol. Cell. Biol. 5:1111-21 (1985) . Koutz, P.J, et al. , Yeast 5:167-77 (1989); Tschopp, J.F., et al. , Nucl. Acids Res. 15:3859-76 (1987) . Portanto, uma sequência codificante heteróloga, tais como, por exemplo, um polipéptido da presente invenção, bajo a regulação transcricional da totalidade ou parte da sequência reguladora de AOX1 é expresso a níveis excecionalmente altos na levedura Pichia em presença de metanol.

Num exemplo, é utilizado o vetor plasmídico pPIC9K para expressar ADN que codifica um polipéptido da invenção, tal como é exposto no presente documento, num sistema de levedura de Pichia essencialmente tal como descreve-se em "Pichia Protocols: Methods in Molecular Biology" D.R.

Higgins e J. Cregg, eds. The Humana Press, Totowa, NJ, 1998. Este vetor de expressão permite a expressão e secreção de uma proteína da invenção por virtude do forte promotor AOX1 ligado ao péptido de sinal secretório de fosfatase alcalina (PHO) de Pichia pastoris (isto é, o líder) localizado a montante de um local de clonagem múltiplo.

Podem ser utilizados outros muitos vetores de levedura em lugar de pPIC9K, tais como, pYES2, pYDl, pTEFl/Zeo, pYES2/GS, pPICZ, pGAPZ, pGAPZalpha, pPIC9, pPIC3,5, pHIL-D2, pHIL-Sl, pPIC3,5K, e PA0815, como apreciará facilmente um perito na especialidade, desde que a construção de expressão proposta proporcione sinais localizadas de maneira adequada para a transcrição, tradução, secreção (se for desejado), e semelhantes, incluindo um AUG em marco, de acordo com seja necessário.

Em outra forma de realização, pode ser conseguido um alto nível de expressão de uma sequência codificante heteróloga, tais como, por exemplo, um polipéptido da presente invenção, clonando o polinucleótido heterólogo da invenção num vetor de expressão, tal como, por exemplo, pGAPZ ou pGAPZalpha, e cultivar a cultura de levedura em ausência de metanol.

Além de abranger células hospedeiras que contêm as construções de vetor discutidas no presente documento, a invenção também abrange células hospedeiras primarias, secundarias, e imortalizadas de origem de vertebrado, particularmente de origem de mamífero, que foram projetados para deletar ou substituir material genético endógeno (por exemplo, a sequência codificante), e/ou para incluir material genético (por exemplo, sequências polinucleotídicas heterólogas) que se associa operativamente aos polinucleótidos da invenção, e que ativa, altera e/ou amplifica os polinucleótidos endógenos. Por exemplo, podem ser utilizadas técnicas conhecidas na técnica para associar operativamente regiões de controlo heterólogas (por exemplo, promotor e/ou potenciador) e sequências polinucleotídicas endógenas por meio de recombinação de homólogos, dando como resultado a formação de uma nova unidade de transcrição (veja-se, por exemplo, a Patente US N° 5.641.670, publicada em 24 de junho de 1997; a Patente US N° 5.733.761, publicada em 31 de março de 1998; a Publicação Internacional N° WO 96/29411, publicada em 26 de setembro de 1996; a Publicação Internacional N° WO 94/12650, publicada em 4 de agosto de 1994; Roller et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86:8932-8935 (1989); e Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).

Além disso, os polipéptidos da invenção podem ser sintetizados quimicamente usando técnicas conhecidas na técnica (por exemplo, veja-se Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman & Co., N.E., e Hunkapiller et al., Nature, 310:105-111 (1984)). Por exemplo, um polipéptido correspondente a um fragmento de uma sequência polipeptidica da invenção pode ser sintetizado por meio da utilização de um sintetizador peptidico. Além disso, se for desejado, podem ser introduzidos aminoácidos não clássicos ou análogos químicos de aminoácidos como uma substituição ou adição na sequência polipeptídica. Os aminoácidos não clássicos incluem, mas sem limitação, os isómeros D dos aminoácidos comuns, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido α-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, Abu, ácido 2-aminobutírico, g-Abu, e-Ahx, ácido 6-aminohexanoico, Aib, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminopropiónico, ornitina, norleucina, norvalina, hidroxiprolina, sarcosina, citrulina, homozitrulina, ácido cisteico, t-butilglicina, t-butilalanina, fenilglicina, ciclohexilalanina, b-alanina, fluoro-aminoácidos, aminoácidos projetados, tais como aminoácidos de b-metilo, aminoácidos de Ca-metilo, aminoácidos de Na-metilo, e análogos de aminoácidos em geral. Além disso, o aminoácido pode ser D (dextrógiro) ou L (levógiro). A invenção abrange polipéptidos que são modificados de maneira diferencial durante ou depois da tradução, por exemplo, por meio de glucosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por meio de grupos protetores/bloqueantes conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a uma molécula de anticorpo ou outro ligando celular, etc. Pode levarse a quaisquer de numerosas modificações químicas por meio de técnicas conhecidas, incluindo, mas sem limitação, a clivagem química específica por meio de brometo de cianógeno, tripsina, quimotripsina, papaína, protease V8, NaBH4; acetilação, formilação, oxidação, reduzção; síntese metabólica em presença de tunicamicina; etc.

As modificações postraducionais abrangidas pela invenção incluem, por exemplo, por exemplo, cadeias de carbohidrato ligadas a N ou ligadas 0, processamento de extremidades N-terminais ou C-terminais), ligação de resíduos químicos à estrutura de aminoácido, modificações químicas de cadeias de hidratos de carbono ligadas a N ou ligadas a 0, e adição e eliminação de um resíduo de metionina N-terminal como resultado da expressão celular de hospedeiro procariota. Os polipéptidos também podem ser modificados com um marcador detetável, tal como um marcador enzimático, fluorescente, isotópico ou de afinidade para permitir a deteção e isolamento da proteína, a adição de fragmentos peptídicos marcados epitopicamente (por exemplo, FLAG®, HA, GST, tiorredoxina, a proteína de ligação a maltosa, etc.), ligação de marcadores de afinidade, tais como biotina e/ou estreptavidina, a ligação covalente de resíduos químicos à estrutura de aminoácido, processamento N- ou C- terminal dos extremidades polipeptídicos (por exemplo, processamento proteolítico), eliminação do resíduo de metionina N-terminal, etc. A invenção também proporciona derivados modificados quimicamente dos polipéptidos da invenção que podem proporcionar vantagens adicionais, tais como solubilidade, estabilidade e tempo de circulação aumentados do polipéptido, ou imunogenicidade diminuída (veja-se a Patente US N° 4.179.337). Os resíduos químicos para derivatização podem ser selecionados entre polímeros solúveis em água, tais como polietilenoglicol, copolímeros de etilenoglicol/propilenoglicol, carboximetilcelulose, dextrano, álcool polivinílico e semelhantes. Os polipéptidos podem ser modificados em posições aleatoriamente dentro da molécula, ou em posições predeterminadas dentro da molécula e pode incluir uma, dois, três ou mais resíduos químicos ligados. A invenção abrange além disso a derivatização química dos polipéptidos da presente invenção, preferentemente nos casos onde o agente químico é um resíduo polimérico hidrófilo. Os polímeros hidrófilos exemplares, incluindo derivados, podem ser aqueles que incluem polímeros nos que as unidades repetidas contêm um ou mais resíduos hidroxilo (polímeros de polihidroxilo) , incluindo, por exemplo, poli (álcool vinílico); polímeros nos que as unidades repetitivas contêm um ou mais grupos amino (polímeros de poliamina), incluindo, por exemplo, péptidos, polipéptidos, proteínas e lipoproteínas, tais como albumina e lipoproteinas naturais; polímeros nos que as unidades repetitivas contêm um ou mais grupos carboxilo (polímeros de policarboxilo), incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose, ácido alginico e sais dos misos, tais como alginato de cálcio e de sódio, glicoseminoglucanos e sais dos mesmos, incluindo sais de ácido hialurónico, derivados fosforilados e sulfonados de hidratos de carbono, material genético, tais como interleucina 2 e interferão, e oligómeros de fosforotioato; e polímeros nos quais as unidades repetidas contêm um ou mais resíduos de sacáridos (polímeros de polissacáridos) , incluindo, por exemplo, hidratos de carbono. 0 massa molecular dos polímeros hidrófilos pode variar, e é geralmente de cerca de 50 a cerca de 5.000.000, sendo preferido os polímeros que têm um massa molecular de cerca de 100 a cerca de 50.000. Os polímeros podem ser ramificados ou não ramificados. Os polímeros mais preferidos têm um massa molecular de cerca de 150 a cerca de 10.000, sendo ainda mais preferidos os pesos moleculares de 200 a cerca de 8.000.

Para o polietilenglicol, o massa molecular preferido é de entre cerca de 1 kDa e cerca de 100 kDa (o termo "cerca de" indica que nas preparações de polietilenoglicol, algumas moléculas pesarão mais, outras menos, que o massa molecular indicado) por facilidade na manipulação e fabrico. Podem ser utilizados outros tamanhos, dependendo do perfil terapêutico desejado (por exemplo, a duração da libertação sustentada desejada, os efeitos, em caso de tÊ-los na atividade biológica, a facilidade de manipulação, o grau ou ausência de antigenicidade e outros efeitos conhecidos do polietilenoglicol para uma proteína terapêutica ou análogo).

Os polímeros preferidos adicionais que podem ser utilizados para derivatizar polipéptidos da invenção incluem, por exemplo, poli (etilenoglicol) (PEG), poli (vinilpirrolidina) , polioxómeros, polissorbato e poli (álcool vinílico), sendo preferido particularmente os polímeros de PEG. Entre os polímeros de PEG preferidos estão os polímeros de PEG que têm um massa molecular de entre cerca de 100 até cerca de 10.000. Mais preferentemente, os polímeros de PEG têm um massa molecular de desde cerca de 200 até cerca de 8.000, sendo ainda mais preferidos PEG 2.000, PEG 5.000 e PEG 8.000, que têm pesos moleculares de 2.000, 5.000 e 8.000, respetivamente. Outros polímeros hidrófilos adequados, além disso de aqueles exemplificados anteriormente, serão facilmente evidentes para um perito na especialidade com base na presente divulgação. Em geral, os polímeros usados podem incluir polímeros que podem se ligar aos polipéptidos da invenção por meio de reações de alquilação ou acilação.

As moléculas de polietilenoglicol (ou outros resíduos químicos) devem se ligar à proteína tendo em consideração os efeitos dos domínios funcionais ou antigénicos da proteína. Existe uma série de métodos de ligação disponíveis para os peritos na especialidade, por exemplo, documento EP 0 401 384 (acoplamento de PEG a G-CSF) , veja-se também Malik et al. , Exp. Hematol. 20:1028-1035 (1992) (que comunica a pegilação de GM-CSF usando cloreto de tresilo). Por exemplo, pode se ligar covalentemente polietilenoglicol por meio de resíduos de aminoácidos por meio de um grupo reagente, tais como, um grupo amino ou carboxilo livre. Os grupos reagentes são aqueles aos que pode se ligar uma molécula ativada de polietilenoglicol. Os resíduos de aminoácidos que têm um grupo amino livre podem incluir resíduos de lisina e os resíduos de aminoácidos N-terminais; aqueles que têm um grupo carboxilo livre podem incluir resíduos de ácido aspártico, resíduos de ácido glutámico e o resíduo de aminoácido C-terminal. Também podem ser utilizados grupos sulfidrilo como grupo reagente para unir as moléculas de polietilenoglicol. Para fins terapêuticos prefere-se a ligação num grupo amino, tal como a ligação na extremidade N-terminal ou grupo de lisina.

Podem ser desejados especificamente proteínas modificadas quimicamente na extremidade N-terminal. Usando polietilenoglicol como uma ilustração da presente composição, pode ser selecionado entre uma diversidade de moléculas de polietilenoglicol (por massa molecular, ramificação, etc.), a proporção de moléculas de polietilenoglicol a moléculas de proteína (polipéptido) na mistura de reação, o tipo de reação de pegilação a efetuar, e o método para obter a proteína pegilada em N-terminal selecionada. O método para obter a preparação pegilada em N-terminal (isto é, separar este resíduo de outros resíduos monopegilados em caso necessário) pode ser por meio de purificação do material pegilado em N-terminal entre uma população de moléculas de proteína pegiladas. A modificação seletiva de proteínas modificadas quimicamente na extremidade N-terminal pode ser conseguida por meio de alquilação redutora que rastreia a reatividade diferencial de diferentes tipos de grupos amino primários (lisina contra a extremidade N-terminal) disponíveis para derivatização numa proteína particular. Nas condições de reação adequadas, consegue-se substancialmente a derivatização seletiva da proteína na extremidade N-terminal com um polímero que contém um grupo carbonilo.

Do mesmo modo que com os diversos polímeros ilustrados anteriormente, contempla-se que os resíduos poliméricos possam conter grupos funcionais além disso, por exemplo, de aqueles implicados tipicamente na ligação dos resíduos poliméricos aos polipéptidos da presente invenção. As ditas funcionalidades incluem, por exemplo, grupos carboxilo amina, hidroxi e tiol. Estes grupos funcionais nos resíduos poliméricos podem ser feitos reagir adicionalmente, se for desejado, com materiais que são geralmente reagentes com os ditos grupos funcionais e que podem assistir para se dirigir a tecidos específicos no organismo incluindo, por exemplo, tecido doente. Os materiais exemplares que podem ser feitos reagir com os grupos funcionais adicionais incluem, por exemplo, proteínas, incluindo anticorpos, hidratos de carbono, péptidos, glucopéptidos, glucolípidos, lectinas, e nucleósidos.

Além disso de resíduos de polímeros hidrófilos, o agente químico usado para derivatizar os polipéptidos da presente invenção podem ser um resíduo de sacárido. Os sacáridos exemplares que podem ser derivados incluem, por exemplo, monossacáridos ou álcoois de açúcar, tais como eritrose, treose, ribose, arabinose, xilose, lixose, frutose, sorbitol, manitol e sedoheptulose, sendo os monossacáridos preferidos frutose, manose, xilose, arabinose, manitol e sorbitol; e dissacáridos, tais como lactose, sacarose, maltosa e celobiose. Outros sacáridos incluem, por exemplo, inositol e grupos de cabeça de gangliósido. Outros sacáridos adequados, além disso de aqueles exemplificados anteriormente, serão facilmente evidentes para um perito na especialidade com base na presente divulgação. Em geral, os sacáridos que podem ser fusionados para derivatização incluem sacáridos que podem se ligar aos polipéptidos da invenção por meio de reações de alquilação ou acilação.

Além disso, a invenção também abrange a derivatização dos polipéptidos da presente invenção, por exemplo, com agentes estabilizantes de lípidos (incluindo catiónicos, aniónicos, polimerizados, carregados, sintéticos, saturados, insaturados e qualquer combinação dos anteriores, etc.). A invenção abrange a derivatização dos polipéptidos da presente invenção, por exemplo, com compostos que podem cumplir uma função estabilizante (por exemplo, para aumentar a semivida em solução dos polipéptidos, para tornar mais solúveis em água aos polipéptidos, para aumentar o carácter hidrófilo ou hidrófobo dos polipéptidos, etc.). Os polímeros úteis como materiais estabilizantes podem ser de origem natural, semissintético (natural modificado) ou sintético. Os polímeros naturais exemplares incluem polissacáridos de origem natural, tais como, por exemplo, arabinanos, fructanos, fucanos, galactanos, galacturonanos, glucanos, mananos, xilanos (tais como, por exemplo, inulina), levano, fucoidano, carragenano, galactocarolose, ácido péctico, pectinas, incluindo amilose, pululano, glucógeno, amilopectina, celulose, dextrano, dextrina, dextrose, glicose, poliglicose, polidextrose, pustulano, quitina, agarose, queratina, condroitina, dermatano, ácido hialurónico, ácido algínico, goma xantana, amido e vários outros homopolímeros ou heteropolímeros naturais, tais como aqueles que contêm uma ou mais das seguintes aldoses, cetoses, ácidos ou aminos: eritrose, treose, ribose, arabinose, xilose, lixose, alose, altrose, glicose, dextrose, manose, gulosa, idosa, galactose, talosa, eritrulose, ribulose, xilulose, psicose, frutose, sorbose, tagatose, manitol, sorbitol, lactose, sacarose, trehalose, maltosa, celobiose, glicina, serina, treonina, cisteina, tirosina, asparagina, glutamina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina, arginina, histidina, ácido glucurónico, ácido glucónico, ácido glucárico, ácido galactourónico, ácido manurónico, glicosemina, galactosemina, e ácido neuraminico, e derivados de origem natural dos mesmos. Por conseguinte, os polímeros adequados incluem, por exemplo, proteínas, tais como albumina, polialginatos, e polímeros de polilactida-coglicólido. Os polímeros semissintéticos exemplares incluem carboximetilcelulose, hidroximetilcelulose, hidroxipropil metilcelulose, metilcelulose, e metoxicelulose. Os polímeros sintéticos exemplares incluem polifosfacenos, hidroxiapatitas, polímeros de fluoroapatita, polietilenos (tais como, por exemplo, polietilenoglicol (incluindo, por exemplo, a classe de compostos citada como PLURONIC®, disponível comercialmente através de BASF, Parsippany, N.J.), polioxietileno, e tereftalato de polietileno), polipropilenos (tais como, por exemplo, propilenoglicol), poliuretanos (tais como, por exemplo, álcool polivinílico (PVA), cloreto de polivinilo e polivinilpirrolidona), poliamidas, incluindo náilon, poliestireno, ácidos poliláticos, polímeros de hidrocarbonetos fluorados, polímeros de carbono fluorados (tais como, por exemplo, politetrafluoroetileno) , acrilato, metacrilato, e polimetilmetacrilato, e derivados dos mesmos. Os métodos para a preparação de polipéptidos derivatizados da invenção que utilizam polímeros como compostos estabilizantes serão facilmente evidentes para um perito na especialidade, à vista da presente divulgação, quando se acopla informação conhecida na técnica, tal como aquela descrita e citada em Unger, Patente US N° 5.205.290.

Além disso, a invenção abrange modificações adicionais dos polipéptidos da presente invenção. As ditas modificações adicionais conhecem-se na técnica, e são proporcionados especificamente, além disso de métodos de derivatização, etc., na Patente US N° 6.028.066.

Os polipéptidos da invenção podem estar em monómeros ou multimeros (isto é, dimeros, trimeros, tetrâmeros e multimeros superiores). Por conseguinte, a presente invenção refere-se a monómeros e a multimeros dos polipéptidos da invenção, a sua preparação, e a composições (preferentemente, agentes terapêuticos) que os contêm. Em formas de realização especificas, os polipéptidos da invenção são monómeros, dimeros, trimeros ou tetrâmeros. Em formas de realização adicionais, os multimeros da invenção são pelo menos dimeros, pelo menos trimeros ou pelo menos tetrâmeros.

Os multimeros abarcados pela invenção podem ser homómeros e heterómeros. Tal como é utilizado no presente documento, o termo homómero refere-se a um multimero que contém somente polipéptidos correspondentes à sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: Y ou codificado pelo ADNc contido num clone depositado (incluindo fragmentos, variantes, variantes de splicing, e proteínas de fusão, correspondentes a estes polipéptidos tal como descreve-se no presente documento). Estes homómeros podem conter polipéptidos que têm sequências de aminoácidos idênticas ou diferentes. Numa forma de realização específica, um homómero da invenção é um multimero que contém somente polipéptidos que têm uma sequência idêntica de aminoácidos. Em outra forma de realização especifica, um homómero da invenção é um multimero que contém polipéptidos que têm diferentes sequências de aminoácidos. Em formas de realização especificas, o multimero da invenção é um homodímero (por exemplo, que contém polipéptidos que têm sequências de aminoácidos idênticas ou diferentes) ou um homotrímero (por exemplo, que contém polipéptidos que têm sequências de aminoácidos idênticas e/ou diferentes). Em formas de realização adicionais, o multímero homomérico é pelo menos um homodímero, pelo menos um homotrímero, ou pelo menos um homotetrâmero.

Tal como é utilizado no presente documento, o termo heterómero refere-se a um multímero que contém um ou mais polipéptidos heterólogos (isto é, polipéptidos de diferentes proteínas) além disso dos polipéptidos da invenção. Numa forma de realização específica, o multímero da invenção é um heterodímero, um heterotrímero ou um heterotetrâmero. Em formas de realização adicionais, o multímero heteromérico da invenção é pelo menos um heterodímero, pelo menos um heterotrímero ou pelo menos um heterotetrâmero.

Os multímeros da invenção podem ser o resultado de associações hidrófobas, hidrófilas, iónicas e/ou covalentes e/ou podem se ligar indiretamente, por meio de por exemplo, formação de lipossomas. Portanto, numa forma de realização, os multímeros da invenção, tais como, por exemplo, homodímeros ou homotrímeros, formam-se quando os polipéptidos da invenção são postos em contacto entre si em solução. Em outra forma de realização, os heteromultímeros da invenção, tais como, por exemplo, heterotrímeros ou heterotetrâmeros, formam-se quando os polipéptidos da invenção entram em contacto com anticorpos para os polipéptidos da invenção (incluindo anticorpos para a sequência polipeptídica heteróloga numa proteína de fusão da invenção) em solução. Em outras formas de realização, os multímeros da invenção formam-se por meio de associações covalentes com e/ou entre os polipéptidos da invenção. As ditas associações covalentes podem implicar um ou mais resíduos de aminoácidos contidos na sequência polipeptídica (por exemplo, aquela recitada na lista de sequências, ou contida no polipéptido codificado por um clone depositado). Num caso, as associações covalentes são reticulação entre resíduos de cisteína localizados nas sequências polipeptídicas que interagem no polipéptido nativo (isto é, de origem natural). Em outro caso, as associações covalentes são a consequência da manipulação química ou recombinante. Como alternativa, as ditas associações covalentes podem implicar um ou mais resíduos de aminoácidos contidos na sequência polipeptídica heteróloga numa proteína de fusão da invenção.

Num exemplo, as associações covalentes são entre a sequência heteróloga contida numa proteína de fusão da invenção (veja-se, por exemplo, a Patente US N° 5.478.925) . Num exemplo específico, as associações covalentes são entre a sequência heteróloga contida numa proteína de fusão de Fc da invenção (tal como descreve-se no presente documento). Em outro exemplo específico, as associações covalentes de proteínas de fusão da invenção são entre sequências polipeptídicas heterólogas de outra proteína que é capaz de formar multimeros associados covalentemente, tais como, por exemplo, osteoprotegerina (veja-se, por exemplo, a Publicação Internacional N° WO 98/49305). Em outra forma de realização, ligam-se dois ou mais polipéptidos da invenção por meio de ligantes peptídicos. Os exemplos incluem aqueles ligantes peptídicos descritos na Patente US N° 5.073.627. Podem ser produzidos proteínas que compreendem múltiplos polipéptidos da invenção separados por ligantes peptídicos usando tecnologia de ADN recombinante convencional.

Outro método para preparar polipéptidos multiméricos da invenção implica a utilização de polipéptidos da invenção fusionados a uma sequência polipeptídica de zíper de leucina ou de zíper de isoleucina. Os domínios de zíper de leucina e de zíper de isoleucina são polipéptidos que promovem a multimerização das proteínas em que estão. As zíperes de leucina foram identificados originalmente em várias proteínas de ligação a ADN (Landschulz et al., Science 240:1759, (1988)), e desde então foram encontrados numa diversidade de proteínas diferentes. Entre os zíperes de leucina conhecidos estão os péptidos de origem natural e os derivados dos mesmos que dimerizam ou trimerizam. Os exemplos de domínios de zíper de leucina adequados para produzir proteínas multiméricas solúveis da invenção são aqueles descritos no pedido PCT WO 94/10308. As proteínas de fusão recombinantes que compreendem um polipéptido da invenção fusionado a uma sequência polipeptídica que dimeriza ou trimeriza em solução são expressos em células hospedeiras adequadas, e a proteína de fusão multimérica solúvel resultante se recupera do sobrenadante de cultura usando técnicas conhecidas na técnica.

Os polipéptidos triméricos da invenção podem oferecer a vantagem de atividade biológica potenciada. Os resíduos de zíper de leucina e os resíduos de isoleucina preferidos são aqueles que formam preferentemente trímeros. Um exemplo é um zíper de leucina derivado de proteína tensioativa pulmonar D (SPD) , tal como descreve-se em Hoppe et al. , (FEBS Letters 344:191, (1994)) e no pedido de Patente US com N° de Série 08/446,922. Podem ser utilizados outros péptidos derivados de proteínas triméricas de origem natural na preparação de polipéptidos triméricos da invenção.

Em outro exemplo, as proteínas da invenção se associam por meio de interações entre a sequência polipeptídica FLAG® contida em proteínas de fusão da invenção que contêm sequência polipeptídica FLAG®. Numa forma de realização adicional, as proteínas de associação da invenção se associam por meio de interações entre a sequência polipeptídica heteróloga contida nas proteínas de fusão de FLAG® da invenção e anticorpo anti-FLAG®.

Os multímeros da invenção podem ser gerados usando técnicas químicas conhecidas na técnica. Por exemplo, os polipéptidos que se deseja que estejam contidos nos multímeros da invenção podem ser reticulados quimicamente usando moléculas ligantes e técnicas de otimização do comprimento da molécula ligante conhecidas na técnica (veja-se, por exemplo, a Patente US N° 5.478.925) Adicionalmente, os multímeros da invenção podem ser gerados usando técnicas conhecidas na técnica para formar uma ou mais reticulações intermoleculares entre os resíduos de cisteína localizados na sequência dos polipéptidos que se deseja que estejam contidos no multímero (veja-se, por exemplo, a Patente US N° 5.478.925) Além disso, os polipéptidos da invenção podem ser modificados rotineiramente por meio da adição de cisteína ou biotina ao extremidade C-terminal ou N-terminal do polipéptido e podem ser aplicadas técnicas conhecidas na técnica para gerar multímeros que contêm um ou mais destes polipéptidos modificados (veja-se, por exemplo, a Patente US N° 5.478.925) Adicionalmente, podem ser aplicadas técnicas conhecidas na técnica para gerar lipossomas que contêm os componentes polipeptídicos que se deseja que estejam contidos no multímero da invenção (veja-se, por exemplo, a Patente US N° 5.478.925)

Como alternativa, os multímeros da invenção podem ser gerados usando técnicas de engenharia genética conhecidas na técnica. Numa forma de realização, os polipéptidos contidos nos multímeros da invenção se produzem de maneira recombinante usando tecnologia de proteínas de fusão descrita no presente documento ou conhecida de outro modo na técnica (veja-se, por exemplo, a Patente US N° 5.478.925) Numa forma de realização especifica, os polinucleótidos que codificam um homodímero da invenção são gerados ligando uma sequência polinucleotídica que codifica um polipéptido da invenção com uma sequência que codifica um polipéptido ligante e depois adicionalmente a um polinucleótido sintético que codifica o produto traduzido do polipéptido na orientação inversa desde a extremidade C-terminal até a extremidade N-terminal (não possuindo a sequência líder) (veja-se, por exemplo, a Patente US N° 5.478.925) Em outra forma de realização, aplicam-se técnicas recombinantes descritas no presente documento ou conhecidas de outro modo na técnica para gerar polipéptidos recombinantes da invenção que contêm um domínio transmembrana (ou hidrófobo ou de péptido de sinal) e que pode ser incorporado por meio de técnicas de reconstituição de membrana em lipossomas (veja-se, por exemplo, a Patente US N° 5.478.925)

Além disso, a inserção de polinucleótido da presente invenção poderia se ligar operativamente a promotores e fatores de transcrição "artificiais" ou quiméricos. Especificamente, o promotor artificial pode compreender, ou como alternativa consistir em, qualquer combinação de elementos de sequência de ADN que aja em cis que sejam reconhecidos por fatores de transcrição que ajam em trans. Preferentemente, os elementos de sequência de ADN que agem em cis e os fatores de transcrição que agem em trans são operables em mamíferos. Além disso, os fatores de transcrição que agem em trans dos ditos promotores "artificiais" também podem ser "artificiais" ou quiméricos em seu próprio projeto e podem agir como ativadores ou repressores para o dito promotor "artificial".

Utilizações dos polinucleótidos

Cada um dos polinucleótidos identificados no presente documento podem ser utilizados de muitas formas como reagentes. A seguinte descrição deve ser considerada ilustrativa e utiliza técnicas conhecidas.

Os polinucleótidos da presente invenção são úteis para a identificação de cromossomas. Existe uma necessidade crescente para identificar novos marcadores cromossómicos, já que atualmente existem poucos reagentes disponíveis para marcação de cromossomas, com base nos dados reais de sequência (polimorfismos de repetição). Cada polinucleótido da presente invenção pode ser usado como marcador de cromossomas .

Em resumo, podem ser mapeadas sequências para cromossomas preparando iniciadores de PCR (preferentemente de 15-25 pb) a partir das sequências mostradas em SEQ ID N°: X. Os iniciadores podem ser selecionados usando análise informático de tal forma que os iniciadores não abrangem mais de um exão predito no ADN genómico. Estes iniciadores são utilizados posteriormente para o rastreio PCR de híbridos celulares somáticos que contêm cromossomas humanos individuais. Somente aqueles híbridos que contêm o gene humano correspondente a SEQ ID N°: X produzirão um fragmento amplificado.

De maneira similar, os híbridos somáticos proporcionam um método rápido para mapear pela PCR os polinucleótidos para cromossomas particulares. Podem ser asignados três ou mais clones ao dia usando um somente ciclador térmico. Além disso, pode ser conseguida a sublocalização dos polinucleótidos com painéis de fragmentos cromossómicos específicos. Outras estratégias de mapeamento de genes que podem ser utilizados incluem hibridização in situ, explorando previamente com cromossomas marcados classificados por fluxo, e pré-selecionando por meio de hibridização para construir bibliotecas de ADNc específicas de cromossoma. A localização cromossómica precisa dos polinucleótidos também pode ser conseguido usando hibridização in situ de fluorescência (FISH) ou uma dispersão cromossómica de metafase. Esta técnica usa polinucleótidos tão curtos como de 500 ou 600 bases; no entanto, preferem-se polinucleótidos de 2,000-4,000 pb. Para uma revisão desta técnica, veja-se Verma et ai., "Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques" Pergamon Press, Nova Iorque (1988) .

Para o mapeamento de cromossomas, os polinucleótidos podem ser utilizados individualmente (para marcar um somente cromossoma ou um somente local em ese cromossoma) ou em painéis (para marcar múltiplos locais e/ou múltiplos cromossomas). Os polinucleótidos preferidos correspondem às regiões não codificantes dos ADNc já que as sequências codificantes é mais provável que estejam conservadas dentro das famílias de genes, aumentando deste modo as possibilidades de hibridização cruzada durante o mapeamento de cromossomas.

Uma vez que se ha mapeado um polinucleót ido numa localização cromossómica precisa, a posição física do polinucleótido pode ser usado em análise de ligação. A análise de ligação estabelece a herança conjunta entre uma localização cromossómica e a apresentação de uma doença particular. Os dados de mapeamento de doenças se concen a técnica. Assumindo uma resolução de mapeamento de 1 megabase e um gene por cada 20 kb, um ADNc localizado de maneira precisa numa região cromossómica associada à doença será um de 50-500 genes causantes potenciais.

Portanto, uma vez que foi estabelecida a herança conjunta, podem ser examinadas as diferenças no polinucleótido e o gene correspondente entre organismos afetados e não afetados. Primeiramente, são examinadas as alterações estruturais visíveis nos cromossomas, tais como deleções e traslocações, em dispersões cromossómicas ou por meio da PCR. Se não existissem alterações estruturais, seria determinado a presença de mutações pontuais. As mutações observadas em alguns ou todos os organismos afetados, mas não nos organismos normais, indicam que a mutação pode causar a doença. No entanto, a sequenciamento completa do polipéptido e do gene correspondente a partir de vários organismos normais é necessária para distinguir a mutação de um polimorfismo. Se for identificado um novo polimorfismo, este polipéptido polimórfico pode ser usado para análise de ligação adicional.

Além disso, a expressão aumentada ou diminuída do gene nos organismos afetados em comparação com os organismos não afetados pode ser avaliada usando polinucleótidos da presente invenção. Quaisquer destas alterações (expressão alterada, reorganização cromossómica, ou mutação) podem ser utilizadas como marcador de diagnóstico ou pronóstico.

Portanto, a invenção também proporciona um método de diagnóstico útil durante o diagnóstico de uma doença, que implica medir o nível de expressão de polinucleótidos da presente invenção em células ou fluido corporal de um organismo e comparar o nível de expressão génica medida com um nível padrão de nível de expressão de polinucleótidos, por meio do qual um aumento ou uma diminuição no nível de expressão génica em comparação com o padrão é indicativo de um distúrbio.

Ao "medir o nível de expressão de um polinucleótido da presente invenção" se pretende medir ou estimar qualitativamente ou quantitativamente o nível do polipéptido da presente invenção ou o nível de ARNm que codifica o polipéptido numa primeira amostra biológica bem diretamente (por exemplo, determinando ou estimando o nível absoluto de proteína (ou o nível de ARNm) ou de maneira relativa (por exemplo, comparando com o nível de polipéptido ou o nível de ARNm numa segunda amostra biológica). Preferentemente, o nível de polipéptido ou o nível de ARNm na primeira amostra biológica é medida ou estimada e compara-se com um nível de polipéptido ou nível de ARN padrão, tomando o padrão a partir de uma segunda amostra biológica obtida de um indivíduo que não tem o distúrbio ou sendo determinada calculando a média dos níveis a partir de uma população de organismos que não têm o distúrbio. Como se apreciará na técnica, uma vez que se conoce um nível padrão de polipéptido ou de ARNm, pode ser usado repetidamente como padrão para comparação.

Por "amostra biológica" entende-se qualquer amostra biológica obtida de um organismo, fluidos corporais, linha celular, cultura tissular, ou outra fonte que contenha o polipéptido da presente invenção ou ARNm. Tal como foi indicado, as amostras biológicas incluem fluidos corporais (tais como os seguintes exemplos não limitantes, esputo, fluido amniótico, urina, saliva, leite materno, secreções, fluido intersticial, sangue, soro, fluido espinal, etc.) que contém o polipéptido da presente invenção, e outras fontes de tecido que se encontre que expressam o polipéptido da presente invenção. Os métodos para obter biopsias de tecido e fluidos corporais de organismos conhecem-se bem na técnica. Nos casos nos que a amostra biológica vai incluir ARNm, a fonte preferida é uma biopsia de tecido.

Os métodos proporcionados anteriormente podem ser aplicados preferentemente num método diagnóstico e/ou kits nos que os polinucleótidos e/ou os polipéptidos se ligam a um suporte sólido. Num método exemplar, o suporte pode ser uma "microplaca génica" ou uma "microplaca biológica" tal como descreve-se nas Patentes US 5.837.832, 5.874.219, e 5.856.174. Além disso, a dita microplaca génica com polinucleótidos da presente invenção ligados pode ser usada para identificar polimorfismos entre as sequências polinucleótidicas, com polinucleótidos isolados de um indivíduo de ensaio. 0 conhecimento dos ditos polimorfismos (isto é, sua localização, assim como sua existência) será benéfico para identificar locus de doenças para muitos distúrbios, incluindo doenças e condições patológicas proliferativas. 0 dito método descreve-se nas Patentes US 5.858.659 e 5.856.104. A presente invenção abrange polinucleótidos da presente invenção que são sintetizados quimicamente, ou que são reproduzidos como ácidos peptidonucleicos (APN), ou de acordo com outros métodos conhecidos na técnica. a utilização de APN serviria como forma preferida se os polinucleótidos fosse incorporados a um suporte sólido, ou a uma microplaca génica. Para os fins da presente invenção, um ácido peptidonucleico (APN) é um tipo de poliamida de análogo de ADN e as unidades monoméricas para adenina, guanina, timina e citosina estão disponíveis comercialmente (Perceptive Biosystems). Determinados componentes do ADN, tais como fósforo, óxidos de fósforo ou derivados de desoxirribose não estão presentes nos APN. Tal como é divulgado por P.E. Nielsen, M. Egholm, R. H. Berg e 0. Buchardt, Science 254, 1497 (1991); e M. Egholm, 0. Buchardt, L. Christensen, C. Behrens, S. M. Freier, D. A. Driver, R. H. Berg, S. K. Kim, B. Norden, e P. E. Nielsen, Nature 365, 666 (1993), os APN se ligam específica e estreitamente a cadeias de ADN complementares e não são degradados por nucleases. De facto, o APN se liga mais fortemente ao ADN que o ADN em si. Isto se deve provavelmente a que não há repulsão eletrostática entre as duas cadeias, e também a qual a estrutura de poliamida é mais flexível. Devido a isto, os dúplex de APN/ADN se ligam num intervalo mais amplo de condições de restringência que os dúplex de ADN/ADN, tornando mais fácil levar a cabo hibridização multiplexada. Podem ser utilizadas sondas mais pequenas que com o ADN devido às características de ligação mais fortes dos híbridos de APN:ADN. Além disso, é mais provável que possam ser determinados desemparelhamentos de uma única base com a hibridização APN/ADN devido a que um somente desemparelhamento num 15-mero de APN/ADN diminui a temperatura de fusão (Tm) em 8-20 °C, frente a 4-16 °C para o 15-mero do dúplex de ADN/ADN. Do mesmo modo, a ausência de grupos carregados no APN significa que a hibridização pode ser realizada a forças iónicas baixas e reduz a possível interferência pelo sal durante a análise.

Além do anterior, pode ser usado um polinucleótido para controlar a expressão génica por meio da formação de tripla hélice ou por meio de ADN ou ARN antisense. As técnicas antisense são discutidos, por exemplo, em Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991); "Oligodeoxynucleotides as

Antisense Inibitors of Gene Expression", CRC Press, Boca Raton, FL (1988) . A formação de tripla hélice se discute em, por exemplo, Lee et al., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science 241: 456 (1988); e Dervan et al., Science 251: 1360 (1991). Ambos métodos baseiam-se na ligação do polinucleótido a um ADN ou ARN complementar. Para estas técnicas, os polinucleótidos preferidos são normalmente oligonucleótidos de 20 a 40 bases de comprimento e complementares bem com a região do gene implicado na transcrição (triple hélice, veja-se Lee et al., Nucl. Acids Res. 6:3073 (1979); Cooney et al., Science 241:456 (1988); e Dervan et al. , Science 251:1360 (1991)) ou com o ARNm em si (antisense, Okano, J. Neurochem. 56:560 (1991); "Oligodeoxynucleotides as Antisense Inibitors of Gene Expression", CRC Press, Boca Raton, FL (1988)) . A formação de triple hélice da como resultado de maneira ótima uma interrupção da transcrição de ARN a partir de ADN, enquanto que a hibridização com ARN antisense bloqueia a tradução de uma molécula de ARNm em polipéptido. Ambas técnicas são eficazes em sistemas de modelo, e a informação divulgada no presente documento pode ser usado para projetar polinucleótidos antisense ou de tripla hélice num esforço para tratar ou prevenir doenças. A presente invenção abrange a adição de um sinal de localização nuclear, ligada operativamente à extremidade 5', à extremidade 3', ou a qualquer localização nesta, de quaisquer dos oligonucleótidos, oligonucleótidos antisense, oligonucleótidos de triple hélice, ribozimas, oligonucleótidos de APN e/ou polinucleótidos da presente invenção. Veja-se, por exemplo, G. Cutrona, et al. , Nat. Biotech., 18:300-303, (2000).

Os polinucleótidos da presente invenção também são úteis em terapêutica génica. Um objetivo da terapêutica génica é inserir um gene normal num organismo que tem um gene defeituoso, num esforço para corrigir o defeito genético. Os polinucleótidos divulgados na presente invenção oferecem um meio para dirigir os ditos defeitos genéticos de uma maneira muito precisa. Outro objetivo é inserir um novo gene que não estivesse presente no genoma do hospedeiro, produzindo deste modo uma nova caracteristica na célula hospedeira. Num exemplo, as sequências polinucleotidicas da presente invenção podem ser utilizados para construir oligonucleótidos quiméricos de ARN/ADN que correspondem às ditas sequências, projetados especificamente para induzir mecanismos de reparação de desemparelhamentos num organismo após a injeção sistémica, por exemplo (Bartlett, R.J., et al., Nat. Biotech, 18:615-622 (2000)) . Os ditos oligonucleótidos de ARN/ADN podem ser projetados para corrigir defeitos genéticos em determinadas estirpes hospedeiras, e/ou para introduzir fenótipos desejados no hospedeiro (por exemplo, introdução de um polimorfismo especifico num gene endógeno correspondente a um polinucleotido da presente invenção que possa melhorar e/ou prevenir um sintoma de doença e/ou distúrbio, etc.). Como alternativa, a sequência polinucleotidica da presente invenção pode ser usads para construir oligonucleótidos de cadeia duplas correspondentes à dita sequência, projetados especificamente para corrigir defeitos genéticos em determinadas estirpes hospedeiras, e/ou para introduzir fenótipos desejados no hospedeiro (por exemplo, introdução de um polimorfismo especifico num gene endógeno correspondente a um polinucleotido da presente invenção que possa melhorar e/ou prevenir um sintoma de doença e/ou distúrbio, etc.). Os ditos utilizações de oligonucleótidos de cadeia duplas conhecem-se na técnica e estão abarcados pela presente invenção (veja-se o documento EP10077121).

Os polinucleótidos também são úteis para identificar organismos a partir de amostras biológicas diminutas. O Exército de Estados Unidos, por exemplo, está considerando a utilização de polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição (RFLP) para a identificação de seu pessoal. Nesta técnica, o ADN genómico de um indivíduo é digerido com uma ou mais enzimas de restrição, e se sonda numa transferência de Southern para dar bandas únicas para identificar ao pessoal. Este método não sofre as limitações das "placas de identificação" que podem ser perdidas, trocadas ou roubadas, torando a identificação positiva seja difícil. Os polinucleótidos da presente invenção podem ser utilizados como marcadores de ADN adicionais para RFLP.

Os polinucleótidos da presente invenção também podem ser utilizados como uma alternativa à RFLP, determinando a sequência de ADN real base a base de porções selecionadas do genoma de um organismo. Estas sequências podem ser utilizadas para preparar iniciadores de PCR para amplificar e isolar o dito ADN selecionado, que posteriormente pode ser sequenciado. Usando esta técnica, os organismos podem ser identificados já que cada organismo terá um único conjunto de sequências de ADN. Uma vez que foi estabelecida uma base de dados de ID única para um organismo, a identificação positiva desse organismo, esteja vivo ou morto, pode ser realizada a partir de amostras de tecido extremamente pequenas. De maneira similar, os polinucleótidos da presente invenção podem ser utilizados como marcadores de polimorfismos, além disso de para a identificação de células e/ou tecidos transformados ou não transformados.

Também existe a necessidade de reagentes capazes de identificar a fonte de um tecido particular. A dita necessidade surge, por exemplo, quando se presenta tecido de origem desconhecido. Os reagentes adequados podem compreender, por exemplo, sondas ou iniciadores de ADN específicos para tecidos particulares preparados a partir das sequências da presente invenção. Os painéis dos ditos reagentes podem identificar o tecido por espécie e/ou por tipo de órgão. De uma maneira similar, estes reagentes podem ser utilizados para rastrear a contaminação de culturas tissulares. Além disso, tal como foi mencionado anteriormente, os ditos reagentes podem ser utilizados para rastrear e/ou identificar células e/ou tecidos transformados ou não transformados.

Como mínimo, os polinucleótidos da presente invenção podem ser utilizados como marcadores de massa molecular em genes de Southern, como sondas de diagnóstico para a presença de um ARNm específico num tipo celular particular, como sonda para "descartar" sequências conhecidas no processo de descobrimento de novos polinucleótidos, para selecionar e elaborar oligómeros para a ligação a uma "microplaca génica" ou outro suporte, para provocar anticorpos anti-ADN usando técnicas de imunização de ADN, e como antigénio para produzir uma resposta imune.

Utilizações dos polipéptidos

Cada um dos polipéptidos identificados no presente documento podem ser utilizados de numerosas formas. A seguinte descrição deve ser considerada ilustrativa e utiliza técnicas conhecidas.

Um polipéptido da presente invenção pode ser usado para testar níveis proteicos numa amostra biológica usando técnicas baseadas em anticorpos. Por exemplo, pode ser estudada a expressão de proteínas em tecidos com métodos imunohistológicos clássicos. (Jalkanen, M., et al. , J. Cell. Biol. 101:976-985 (1985) . Jalkanen, M., et al. , J. Cell. Biol. 105:3087-3096 (1987)). Outros métodos baseados em anticorpos úteis para detetar a expressão génica de proteínas incluem imunoensaios, tais como o ensaio imunoabsorvente acoplado a enzimas (ELISA) e o radioimunoensaio (RIA). Os marcadores para ensaios de anticorpos adequados conhecem-se na técnica e incluem marcadores enzimáticos, tais como, glicose oxidase, e radioisótopos, tais como iodo (125I, 121I), carbono (14C) , enxofre (35S) , tritio (3H) , índio (112In) , e tecnécio (99mTc), e marcadores fluorescentes, tais como fluoresceína e rodamina, e biotina.

Além de para testar os níveis proteicos numa amostra biológica, as proteínas também podem ser detetadas por meio de obtenção de imagens in vivo. Os marcadores de anticorpos para a obtenção de imagens in vivo de proteínas incluem aqueles detetáveis por meio de raios X, RMN ou ESR. Para a raios X, os marcadores adequados incluem radioisótopos, tais como bário ou césio, que emitem radiação detetável mas que não são manifestamente prejudiciais para o indivíduo. Os marcadores adequados para RMN e ESR incluem aqueles com um spin característico detetável, tais como deutério, que pode ser incorporado no anticorpo marcando nutrientes para o hibridoma relevante.

Um anticorpo ou fragmento de anticorpo específico de proteína que foi marcado com um resíduo para obtenção de imagens detetável adequado, tal como um radioisótopo (por exemplo, 131I, 112In, 99mTc) f uma substância opaca às radiações, ou um material detetável por meio de ressonância magnética nuclear, é introduzido (por exemplo, por via parenteral, subcutânea, ou intraperitoneal) no mamífero. Será entendido na técnica que o tamanho do indivíduo e o sistema de obtenção de imagens determinará a quantidade de resíduo para obtenção de imagens necessária para produzir imagens de diagnóstico. No caso de um resíduo de radioisótopo, para um indivíduo humano, a quantidade de radioatividade injetada estará normalmente no intervalo de cerca de 5 a 20 milicuries de 99mTc. O anticorpo marcado ou o fragmento de anticorpo se acumulará então preferentemente na localização de células que contêm a proteína específica. A obtenção de imagens de tumor in vivo descreve-se em S.W. Burchiel et al. , "Immunopharmacokinetics of Radiolabeled Antibodies and Their Fragments." (Capítulo 13 em Tumor Imaging: The Radiochemical Detection of Cancer, S.W. Burchiel e B. A. Rhodes, eds., Masson Publishing Inc. (1982)).

Portanto, a invenção proporciona um método diagnóstico para um distúrbio que implica (a) testar a expressão de um polipéptido da presente invenção em células ou fluido corporal de um indivíduo; e (b) comparar o nível de expressão génica com um nível de expressão génica padrão, por meio do que um aumento ou diminuição no nível de expressão génica do polipéptido testado em comparação com o nível de expressão padrão é indicativo de um distúrbio. Em referência ao cancro, a presença de uma quantidade relativamente alta de transcrito em tecido submetido a biópsia de um indivíduo pode indicar uma predisposição para o desenvolvimento da doença, ou pode proporcionar um meio para detetar a doença antes da aparição de sintomas clínicos reais. Um diagnóstico mais definitivo deste tipo pode permitir aos profissionais da saúde utilizar medidas preventivas ou um tratamento agressivo antes, evitando deste modo o desenvolvimento ou uma progressão maior do cancro.

Além disso, os polipéptidos da invenção podem ser utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar uma doença. Por exemplo, pode ser administrado aos pacientes um polipéptido da presente invenção num esforço para substituir níveis ausentes ou diminuídos do polipéptido (por exemplo, insulina), para complementar níveis ausentes ou diminuídos de um polipéptido diferente (por exemplo, hemoglobina S para hemoglobina B, SOD, catalase, proteínas de reparação de ADN), para inibir a atividade de um polipéptido (por exemplo, um oncogene ou supressor tumoral), para ativar a atividade de um polipéptido (por exemplo, ligando a um recetor), para reduzir a atividade de um recetor ligado a membrana competindo com este por ligando livre (por exemplo, recetores de TNF solúveis usados na redução da inflamação), ou provocando uma resposta desejada (por exemplo, inibição do crescimento de vasos sanguíneos, potenciação da resposta imune a células ou tecidos proliferativos) .

De maneira similar, também podem ser utilizados anticorpos dirigidos a um polipéptido da presente invenção para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar uma doença. Por exemplo, a administração de um anticorpo dirigido a um polipéptido da presente invenção pode ligar e reduzir a sobreprodução do polipéptido. De maneira similar, a administração de um anticorpo pode ativar ao polipéptido, tal como por meio da ligação a um polipéptido ligado a uma membrana (recetor).

Como mínimo, os polipéptidos da presente invenção podem ser utilizados como marcadores de massa molecular em géis de SDS-PAGE ou em colunas de filtração em gel de crivo molecular usando métodos bem conhecidos para os peritos na especialidade. Também podem ser utilizados os polipéptidos para provocar anticorpos, que por sua vez podem ser utilizados para medir a expressão proteica para uma célula recombinante, como modo para avaliar a transformação da célula hospedeira. Além disso, os polipéptidos da presente invenção podem ser utilizados para testar as seguintes atividades biológicas. Métodos de terapêutica génica

No presente documento são descritos além disso métodos de terapêutica génica para tratar ou prevenir distúrbios, doenças e condições patológicas. Os métodos de terapêutica génica referem-se à introdução de sequências de ácido nucleico (ADN, ARN e ADN ou ARN antisense) num animal para conseguir a expressão de um polipéptido da presente invenção. Este método requer que um polinucleótido que codifica um polipéptido da invenção que esteja ligado operativamente a um promotor e a qualquer outro elemento genético necessário para a expressão do polipéptido pelo tecido alvo. As ditas técnicas de terapêutica e administração génica conhecem-se na técnica, veja-se, por exemplo, o documento WO 90/11092;

Portanto, por exemplo, podem ser modificados por engenharia genética ex vivo as células de um paciente com um polinucleótido (ADN ou ARN) que compreende um promotor ligado operativamente a um polinucleótido da invenção, as células modificadas sendo proporcionadas a um paciente a ser tratado com o polipéptido. Os ditos métodos conhecem-se bem na técnica. Por exemplo, veja-se Belldegrun et al., J. Natl. Cancer Inst., 85:207-216 (1993). Ferrantini et al., Cancer Research, 53:107-1112 (1993). Ferrantini et al., J. Immunology 153: 4604-4615 (1994); Kaido, T., et al. , Int. J. Cancer 60: 221-229 (1995); Ogura et al., Cancer Research 50: 5102-5106 (1990); Santodonato, et al. , Human Gene Therapy 7:1-10 (1996); Santodonato, et al., Gene Therapy 4:1246-1255 (1997); e Zhang, et al., Cancer Gene Therapy 3: 31-38 (1996)) . As células que são modificados podem ser células arteriais. As células arteriais podem ser reintroduzidas no paciente por meio de injeção direta à artéria, aos tecidos circundantes à artéria, ou por meio de injeção por cateter.

Tal como discute-se em mais detalhe a seguir, as construções polinucleótidicas podem ser administradas por meio de qualquer método que administre materiais injetáveis às células de um animal, tal como, injeção no espaço intersticial dos tecidos (coração, músculo, pele, pulmão, fígado, e semelhantes) . As construções polinucleótidicas podem ser administradas num veículo líquido ou aquoso farmaceuticamente aceitável. O polinucleótido da invenção pode ser administrado como um polinucleótido nu. A expressão polinucleótido, ADN ou ARN "nu" refere-se a sequências que estão livres de qualquer veículo de administração que aja para assistir, promover ou facilitar a entrada à célula, incluindo sequências virais, partículas virais, formulações de lipossomas, lipofectina ou agentes precipitantes e semelhantes. No entanto, os polinucleótidos da invenção também podem ser administrado em formulações de lipossomas e as formulações de lipofectina podem ser preparados por meio de métodos bem conhecidos para os peritos na especialidade. Os ditos métodos são descritos, por exemplo, nas Patentes US N° 5.593.972, 5.589.466, e 5.580.859.

As construções de vetor polinucleotídico da invenção usadas no método de terapêutica génica são preferentemente construções que não se integrarão no genoma do hospedeiro nem conterão sequências que permitam a replicação. Os vetores adequados incluem pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXTl e pSG disponíveis através de Stratagene; pSVK3, pBPV, pMSG e pSVL disponíveis através de Pharmacia; e pEFl/V5, pcDNA3,l, e pRc/CMV2 disponíveis através de Invitrogen. Outros vetores adequados serão facilmente evidentes para o perito na especialidade.

Pode ser usado qualquer promotor forte conhecido para os peritos na especialidade para dirigir a expressão das sequências polinucleotídicas da invenção. Os promotores adequados incluem promotores adenovirais, tais como o promotor tardio principal adenoviral; ou promotores heterólogos, tais como o promotor de citomegalovírus (CMV); o promotor de vírus sincicial respiratório (RSV); promotores induzíveis, tais como o promotor MMT, o promotor de metalotienina; promotores de choque térmico; o promotor de albumina; o promotor de ApoAI; promotores de globina humanos; promotores de timidina quinase virai, tais como o promotor de timidina quinase de Herpes simplex; LTR retrovirais; o promotor de b-actina; e promotores de hormona de crescimento humana. O promotor também pode ser o promotor nativo para os polinucleótidos da invenção.

Ao contrário de outras técnicas de terapêutica génica, uma vantagem principal de introduzir sequências de ácido nucleico nuas em células alvo é a natureza transitória da síntese de polinucleótidos nas células. Os estudos demonstraram que podem ser introduzidas sequências não replicantes de ADN em células para proporcionar a produção do polipéptido desejado durante períodos de até seis meses. A construção polinucleotídica da invenção pode ser administrado ao espaço intersticial de tecidos no animal, incluindo tecido de músculo, pele, cérebro, pulmão, fígado, baço, medula óssea, timo, coração, linfa, sangue, osso, cartilagem, pâncreas, rim, vesícula biliar, estômago, intestino, testículos, ovário, útero, recto, sistema nervoso, olho, glândula e conjuntivo. 0 espaço intersticial dos tecidos compreende a matriz intercelular fluida de mucopolissacárido entre as fibras reticulares de tecidos de órgãos, fibras elásticas nas paredes de vasos ou câmaras, fibras de colagénio ou tecidos fibrosos, ou a mesma matriz no tecido conjuntivo que envolve as células musculares ou nas lacunas do osso. É de maneira similar o espaço ocupado pelo plasma da circulação e o fluido linfático dos canais linfáticos. A administração ao espaço intersticial do tecido muscular prefere-se pelos motivos discutidos a seguir. Podem ser administrados convenientemente por meio de injeção aos tecidos que compreendem estas células. Administram-se preferentemente a e sõa expressos em células persistentes não em divisão que estão diferenciadas, embora possa ser conseguida a administração e a expressão em células não diferenciadas ou diferenciadas de maneira menos completa, tais como, por exemplo, células estaminais de fibroblastos sanguíneos ou da pele. As células musculares in vivo são particularmente competentes em sua capacidade para captar e expressar polinucleotidos.

Para a injeção de sequência de ácido nucleico nu, uma quantidade de dosagem eficaz de ADN ou ARN se encontrará no intervalo de desde cerca de 0,05 mg/kg de peso corporal até cerca de 50 mg/kg de peso corporal. Preferentemente, a dosagem será de desde cerca de 0,005 mg/kg até cerca de 20 mg/kg e mais preferentemente de desde cerca de 0,05 mg/kg até cerca de 5 mg/kg. Obviamente, como apreciará o perito habitual na especialidade, esta dosagem variará de acordo com o local tissular de injeção. A dosagem adequada e eficaz da sequência de ácido nucleico pode ser determinado facilmente pelos peritos na especialidade e dependerá da condição patológica que esteja a tratar e da rota de administração. A rota de administração preferida é a rota parenteral de injeção no espaço intersticial dos tecidos. No entanto, também podem ser utilizados outras rotas parenterais, tais como, inalação de uma formulação de aerossol, particularmente para a administração aos pulmões ou tecidos bronquiais, à garganta ou às membranas mucosas do nariz. Além disso, as construções de ADN nu podem ser administradas às artérias durante a angioplastia por meio do cateter usado no procedimento.

Os polinucleótidos nus administram-se por meio de qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas sem limitação, injeção direta com agulha no local de administração, injeção intravenosa, administração tópica, infusão por cateter, e as denominadas "pistolas génicas". Estes métodos de administração conhecem-se na técnica.

As construções também podem ser administradas com veículos de administração, tais como sequências virais, partículas virais, formulações de lipossomas, lipofectina, agentes precipitantes, etc. Os ditos métodos de administração conhecem-se na técnica.

As construções polinucleotidicas da invenção podem ser complexadas numa preparação de lipossomas. As preparações lipossómicas para utilização na presente invenção incluem preparações catiónicas (carregadas positivamente), aniónicas (carregadas negativamente) e neutras. No entanto, preferem-se particularmente os lipossomas catiónicos devido a que pode ser formado um complexo estreito de carga entre o lipossoma catiónico e o ácido nucleico polianiónico. Se ha demostrado que os lipossomas catiónicos mediam a administração intracelular de ADN de plasmideo (Feigner et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA , 84:7413-7416 (1987)); ARNm (Malone et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA , 86:6077-6081 (1989)); e fatores de transcrição purificados (Debs et al., J. Biol. Chem., 2 65:10189-10192 (1990)), em forma funcional.

Hay lipossomas catiónicos facilmente disponíveis. Por exemplo, os lipossomas de N[1-(2,3-dioleiloxi)propil]-N,N,N-trimetilamonio (DOTMA) são particularmente úteis e estão disponíveis com o nome comercial LIPOFECTIN®, de GIBCO BRL, Grand Island, N.E. (Veja-se, também Feigner et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA , 84:7413-7416 (1987)). Outros lipossomas comercialmente disponíveis incluem transfectace (DDAB/DOPE) e DOTAP/DOPE (Boehringer).

Podem ser preparados outros lipossomas catiónicos a partir de materiais facilmente disponíveis usando técnicas bem conhecidas na técnica. Veja-se, por exemplo, a Publicação PCT N°: WO 90/11092 para uma descrição da síntese de lipossomas de DOTAP (1,2-bis(oleiloxi)-3-(trimetilamonio)propano). A preparação de lipossomas de DOTMA explica-se na bibliografia, veja-se, por exemplo, Feigner et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 84:7413-7417. Podem ser utilizados métodos semelhantes para preparar lipossomas a partir de outros materiais lipídicos catiónicos.

De maneira similar, existem lipossomas aniónicos e neutros facilmente disponíveis, tais como através de Avanti Polar Lipids (Birmingham, Ala.), ou podem ser preparados facilmente usando materiais facilmente disponíveis. Os ditos materiais incluem fosfatidilo, colina, colesterol, fosfatidil etanolamina, dioleoilfosfatidil colina (DOPC), dioleoilfosfatidil glicerol (DOPG), dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE), entre outros. Estes materiais também podem ser misturados com os materiais de partida de DOTMA e DOTAP em proporções adequadas. Os métodos para preparar lipossomas usando estes materiais conhecem-se bem na técnica.

Por exemplo, podem ser utilizados a dioleoilfosfatidil colina (DOPC), o dioleoilfosfatidil glicerol (DOPG), e a dioleoilfosfatidil etanolamina (DOPE) comerciais em várias combinações para produzir lipossomas convencionais, com ou sem a adição de colesterol. Portanto, por exemplo, podem ser preparados vesículas de DOPG/DOPC secando 50 mg de cada um de DOPG e DOPC em corrente de azoto gasoso num frasco de sonicação. Submete-se a amostra a uma bomba de vácuo durante a noite e hidrata-se no dia seguinte com água desionizada. Depois submete-se a sonicação a amostra durante 2 horas em frasco fechado, usando um sonicador de Heat Systems modelo 350 equipado com uma sonda de copo invertido (de tipo banho) no ajuste máximo enquanto que se circula o banho a 15 °C. Como alternativa, podem ser preparadas vesículas com carga negativa sem sonicação para produzir vesículas multilamelares ou por meio de extrusão através de membranas nucleopore para produzir vesículas unilamelares de tamanho discreto. Conhecem-se outros métodos e estão disponíveis para os peritos na especialidade.

Os lipossomas podem compreender vesículas multilamelares (MLV), vesículas unilamelares pequenas (SUV), ou vesículas unilamelares grandes (LUV), sendo preferido as SUV. Os diversos complexos de lipossoma-ácido nucleico são preparados usando métodos bem conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, Straubinger et ai., Methods of Immunology, 101:512-527 (1983). Por exemplo, podem ser preparados MLV que contêm ácido nucleico depositando uma fina camada de fosfolípido nas paredes de um tubo de vidro e posteriormente hidratando-a com uma solução do material a ser encapsulado. As SUV são preparadas por meio da sonicação estendida das MLV para produzir uma população homogénea de lipossomas unilamelares. 0 material a ser capturado é adicionado a uma suspensão de MLV preformadas e depois submete-se a sonicação. Quando são utilizados lipossomas em contacto com lípidos catiónicos, a película lipídica seca é ressuspensa numa solução adequada, tal como água estéril ou uma solução tamponadora isotónica, tal como Tris/NaCl 10 mM, submetida a sonicação, e depois são misturados os lipossomas preformados diretamente com o ADN. O lipossoma e o ADN formam um complexo muito estável devido à ligação dos lipossomas carregados positivamente ao ADN catiónico. As SUV têm utilização com pequenos fragmentos de ácido nucleico. As LUV são preparadas por meio de uma série de métodos bem conhecidos na técnica. Os métodos usados de maneira comum incluem quelação com Ca2+ - EDTA (Papahadjopoulos et al., Biochim. Biophys. Acta, 394:483 (1975); Wilson et al., Cell, 17:77 (1979)); injeção de éter (Deamer et al., Biochim. Biophys. Acta, 443:629 (1976);

Ostro et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 76:836 (1977) ; Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:3348 (1979) ); diálise em detergente (Enoch et al., Proc. Natl.

Acad. Sei. USA, 76:145 (1979)); e evaporação de fase reversa (REV) (Fraley et al. , J. Biol. Chem., 255:10431 (1980) ; Szoka et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 75:145 (1978) ; Schaefer-Ridder et al., Science, 215:166 (1982)).

Em geral, a relação de ADN a lipossomas será desde cerca de 10:1 até cerca de 1:10. Preferentemente, a relação será desde cerca de 5:1 até cerca de 1:5. Mais preferentemente, a relação será de cerca de 3:1 a cerca de 1:3. Ainda mais preferentemente, a relação será de 1:1. A Patente US N° : 5.676.954 comunica a injeção de material genético em complexo com veículos lipossómicos catiónicos em ratinhos. As Patentes US com números 4.897.355, 4.946.787, 5.049.386, 5.459.127, 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055, e a publicação internacional N°: WO 94/9469 proporcionam lípidos catiónicos para utilização na transfeção de ADN a células e mamíferos. As Patentes US com números 5.589.466, 5.693.622, 5.580.859, 5.703.055, e a publicação internacional N° : WO 94/9469 proporcionam métodos para administrar complexos ADN-lípido catiónico a mamíferos.

As células podem ser modificadas por engenharia genética, ex vivo ou in vivo, usando partículas retrovirais que contêm ARN que compreende uma sequência que codifica polipéptidos da invenção. Os retrovirus a partir dos quais podem ser derivados os vetores plasmídicos retrovirais incluem, mas sem limitação, vírus da leucemia murina de Moloney, vírus da necrose do baço, vírus do sarcoma de Rous, vírus do sarcoma de Harvey, vírus da leucose aviária, vírus da leucemia do macaco gibão, vírus da imunodeficiência humana, vírus do sarcoma mieloproliferativo e vírus do tumor mamário. O vetor plasmidico retroviral ' 'e utilizado para transduzir linhas celulares empacotadoras para formar linhas celulares produtoras. Os exemplos de células empacotadoras que podem ser transfectada incluem, mas sem limitação, as linhas celulares PE501, PA317, R-2, R-AM, PA12, T19-14X, VT-19-17-H2, RCRE, RCRIP, GP+E-86, GP+envAml2, e DAN tal como são descritos em Miller, Human Gene Therapy, 1:5-14 (1990) . O vetor pode transduzir às células empacotadoras por meio de qualquer meio conhecido na técnica. Os ditos meios incluem, mas sem limitação, eletroporação, a utilização de lipossomas, e precipitação de CaP04. Numa alternativa, o vetor plasmidico retroviral pode ser encapsulado num lipossoma, ou ser acoplado a um lípido, e depois ser administrado a um hospedeiro. A linha celular produtora gera partículas de vetor retroviral infeciosas que incluem o polinucleótido que codifica os polipéptidos da invenção. As ditas partículas de vetor retroviral podem ser utilizados então para transduzir células eucariotas, in vitro ou in vivo. As células eucariotas transduxidas expressarão polipéptidos da invenção.

As células podem ser projetadas, ex vivo ou in vivo, com polinucleótidos da invenção contidos num vetor de adenovirus. 0 adenovirus pode ser manipulado de tal forma que codifique e expresse polipéptidos da invenção, e ao mesmo tempo esteja inativado em quanto a sua capacidade para se replicar num ciclo vital virai litico normal. A expressão de adenovirus é conseguida sem integração do ADN viral no cromossoma da célula hospedeira, aliviando deste modo as preocupações acerca da mutagénese insercional. Além disso, foram usados adenovirus como vacinas entéricas vivas durante muitos anos com um perfil de segurança excelente (Schwartz et al., Am. Rev. Respir. Dis., 109:233-238 (1974)). Finalmente, a transferência génica mediada por adenovirus foi demonstrada numa série de casos, incluindo a transferência de alfa-l-antitripsina e CFTR aos pulmões de ratos do algodão (Rosenfeld et al. , Science, 252:431-434 (1991). Rosenfeld et al. , Cell, 68:143-155 (1992)). Além disso, os estudos extensivos para intentar estabelecer os adenovirus como um agente causante do cancro humano foram uniformemente negativos (Green et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 76:6606 (1979)).

Os vetores adenovirais adequados úteis na presente invenção são descritos, por exemplo, em Kozarsky e Wilson, Curr. Opin. Genet. Devei., 3:499-503 (1993). Rosenfeld et al. , Cell, 68:143-155 (1992) . Engelhardt et al. , Human Genet. Ther., 4:759-769 (1993). Yang et al., Nature Genet., 7:362-369 (1994). Wilson et al. , Nature, 365:691-692 (1993); e a Patente US N° : 5.652.224. Por exemplo, o vetor de adenovirus Ad2 é útil e pode ser feito crescer em células 293 humanas. Estas células contêm a região EI de adenovirus e expressam constitutivamente Ela e Elb, o qual complementa aos adenovirus defeituosos proporcionando os produtos dos genes eliminados do vetor. Além disso de Ad2, outras variedades de adenovirus (por exemplo, Ad3, Ad5, e Ad7) também são úteis na presente invenção.

Preferentemente, os adenovirus usados na presente invenção são deficientes para replicação. Os adenovirus deficientes em replicação necessitam a ajuda de um vírus auxiliar e/ou uma linha celular embaladora para formar partículas infeciosas. 0 vírus resultante é capaz de infetar células e pode expressar um polinucleótido de interesse que está ligado operativamente a um promotor, mas não pode ser replicado na maioria das células. Os adenovirus deficientes em replicação podem ser deletados num ou mais ou numa porção dos seguintes genes: Ela, Elb, E3, E4, E2a, ou LI até L5.

As células podem ser modificadas por engenharia genética, ex vivo ou in vivo, usando vírus adeno-associado (AAV) . Os AAV são vírus defeituosos de origem natural que necessitam de vírus auxiliares para produzir partículas infeciosas (Muzyczka, Curr. Topics in Microbiol. Immunol., 158:97 (1992)) . Também é um dos poucos vírus que pode integrar seu ADN em células que não estão em divisão. Os vetores que contêm tão poucos como 300 pares de bases de AAV podem ser embalados e podem ser integrados, mas o espaço para ADN exógeno está limitado a cerca de 4,5 kb. Os métodos para produzir e usar os ditos AAV são conhecidos na técnica. Veja-se, por exemplo, as Patentes US com números 5.139.941, 5.173.414, 5.354.678, 5.436.146, 5.474.935, 5.478.745, e 5.589.377.

Por exemplo, um vetor AAV adequado para utilização na presente invenção incluirá todas as sequências necessárias para a replicação de ADN, sua encapsidação, e sua integração na célula hospedeira. A construção polinucleotídica que contém os polinucleótidos da invenção é inserida no vetor AAV usando métodos de clonagem padrão, tais como aqueles encontrados em Sambrook et al. , Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989). 0 vetor AAV recombinante é tranfetado então em células empacotadoras que estão infetadas com um vírus auxiliar, usando qualquer técnica padrão, incluindo lipofeção, eletroporação, precipitação com fosfato de cálcio, etc. Os vírus auxiliares adequados incluem adenovirus, citomegalovírus, vírus de vaccinia ou vírus do herpes. Uma vez que as células empacotadoras são transfetas e infetadas, produzirão partículas virais de AAV infeciosas que conterão a construção polinucleotidica da invenção. Estas partículas virais são utilizadas então para transduzir células eucariotas, já seja ex vivo ou in vivo. As células transduzidas conterão a construção polinucleotidica integrada em seu genoma, e expressarão o produto génico desejado.

Outro método de terapêutica génica implica associar operativamente regiões de controlo heterólogas e sequências polinucleotidicas endógenas (por exemplo, que codificam a sequência polipeptidica de interesse) por meio de recombinação de homólogos (veja-se, por exemplo, a Patente US N° 5.641.670, publicada e, 24 de junho de 1997; a Publicação Internacional N° WO 96/29411, publicada em 26 de setembro de 1996; a Publicação Internacional N° WO 94/12650, publicada em 4 de agosto de 1994; Roller et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86:8932-8935 (1989); e Zijlstra et al. , Nature, 342:435-438 (1989) . Este método implica a ativação de um gene que está presente nas células alvo, mas que normalmente não é expresso nas células, ou é expresso a um nível menor do desejado.

As construções polinucleotidicas são preparadas usando técnicas padrão conhecidas na técnica, contendo o promotor com sequências de direcionamento que flanqueiam ao promotor. Os promotores adequados são descritos no presente documento. A sequência de direcionamento é o suficientemente complementar com uma sequência endógena como para permitir a recombinação de homólogos da sequência de direcionamento do promotor com a sequência endógena. A sequência de direcionamento estará o suficientemente próxima à extremidade 5' da sequência polinucleotidica endógena desejada de tal forma que o promotor estará ligado operativamente à sequência homóloga após a recombinação de homólogos.

As sequências promotoras e de direcionamento podem ser amplificadas usando a PCR. Preferentemente, o promotor amplificado contém distintos locais de restrição enzimática nas extremidades 5' e 3'. Preferentemente, a extremidade 3' da primeira sequência de direcionamento contém o mesmo local de enzima de restrição que a extremidade 5' do promotor amplificado e a extremidade 5' da segunda sequência de direcionamento contém o mesmo local de restrição que a extremidade 3' do promotor amplificado. 0 promotor amplificado e as sequências de direcionamento são digeridas e ligadas juntamente. A construção de promotor-sequência de direcionamento se administra às células, bem como um polinucleotido nu, ou conjuntamente com agentes que facilitam a transfeção, tais como lipossomas, sequências virais, partículas virais, vírus completos, lipofeção, agentes precipitantes, etc., descritos em maior detalhe anteriormente. A sequência de direcionamento de promotor P pode ser administrado por meio de qualquer método, incluindo injeção direta com agulha, injeção intravenosa, administração tópica, infusão por cateter, aceleradores de partículas, etc. Os métodos são descritos em mais detalhe a seguir. A construção de promotor-sequência de direcionamento se capta pelas células. A recombinação de homólogos entre a construção e a sequência endógena tem lugar de tal forma que uma sequência endógena se situa sob o controlo do promotor. 0 promotor dirige então a expressão da sequência endógena.

Os polinucleótidos que codificam polipéptidos da presente invenção podem ser administrados conjuntamente com outros polinucleótidos que codificam proteínas angiogénicas. As proteínas angiogénicas incluem, mas sem limitação, fatores de crescimento de fibroblastos ácidos ou básicos, VEGF-1, VEGF-2 (VEGF-C), VEGF-3 (VEGF-B), fator de crescimento epidérmico alfa e beta, fator de crescimento de células endoteliais derivado de plaquetas, fator de crescimento derivado de plaquetas, fator de necrose tumoral alfa, fator de crescimento de hepatócitos, fator de crescimento insulínico, fator estimulante de colónias, fator estimulante de colónias de macrófagos, fator estimulante de colónias de granulócitos/macrófagos, e sintase de óxido nítrico.

Preferentemente, o polinucleótido que codifica um polipéptido da invenção contém uma sequência de sinal secretora que facilita a secreção da proteína. Tipicamente, a sequência de sinal se situa na região codificante do polinucleótido que se va a expressar em direção à extremidade 5' da região codificante. A sequência de sinal pode ser homóloga ou heteróloga para o polinucleótido de interesse e pode ser homóloga ou heteróloga para as células a ser transfetada. Adicionalmente, a sequência de sinal pode ser sintetizado quimicamente usando métodos conhecidos na técnica.

Pode ser usado qualquer modo de administração de quaisquer das construções de polinucleótidos anteriormente descritas desde que o modo de como resultado a expressão de uma ou mais moléculas numa quantidade suficiente para proporcionar um efeito terapêutico. Isto inclui injeção direta com agulha, injeção sistémica, infusão por cateter, injetores biolisticos, aceleradores de partículas (isto é, "pistolas génicas"), depósitos de esponja de espuma de gel, outros materiais de depósito comercialmente disponíveis, bombas osmóticas (por exemplo, minibombas ALZA®), formulações farmacêuticas sólidas orais ou em supositório (comprimido ou pílula), e aplicações por decantação ou tópicas durante a cirurgia. Por exemplo, a injeção direta de plasmídeo nu precipitado por fosfato de cálcio em fígado de rato e baço de rato ou um plasmídeo revestido com proteína na veia porta deu como resultado a expressão génica do gene exógeno nos fígados de rato. (Kaneda et al., Science, 243:375 (1989)).

Um método preferido de administração local é por meio de injeção direta. Preferentemente, uma molécula recombinante da presente invenção complejada com um veículo de administração se administra por meio de injeção direta ou localmente na área das artérias. A administração de uma composição localmente na área das artérias refere-se a injetar a composição a centímetros e preferentemente milímetros das artérias.

Outro método de administração local é por em contacto uma construção polinucleotidica da presente invenção em ou alrededor de uma ferida cirúrgica. Por exemplo, um paciente pode ser submetido a terapêutica e a construção polinucleotidica pode ser revestido sobre a superfície de tecido dentro da ferida ou pode ser enxertada a construção em zonas de tecido dentro da ferida.

As composições terapêuticas úteis na administração sistémica incluem moléculas recombinantes da presente invenção em complexo com um veículo de administração dirigida da presente invenção. Os veículos de administração adequados para utilização com administração sistémica compreendem lipossomas que compreendem ligandos para dirigir o veículo a um tecido particular.

Os métodos preferidos de administração sistémica incluem injeção intravenosa, administração de aerossol, oral e percutânea (tópica). As injeções intravenosas podem ser efetuadas usando métodos convencionais na técnica. A administração de aerossol também pode ser efetuados usando métodos convencionais na técnica (veja-se, por exemplo,

Stribling et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA , 189:11277-11281 (1992)) . A administração oral pode ser efetuada complexando uma construção polinucleotídica da presente invenção com um veículo capaz de suportar a degradação por meio de enzimas digestivas no intestino do animal. Os exemplos dos ditos veículos, incluem cápsulas plásticas ou comprimidos, tais como aqueles conhecidos na técnica. A administração tópica pode ser efetuada misturando uma construção polinucleotídica da presente invenção com um reagente lipófilo (por exemplo, DMSO) que é capaz de atravesar a pele. A determinação de uma quantidade eficaz de substância para sua administração pode depender de uma série de fatores que incluem, por exemplo, a estrutura química e a atividade biológica da substância, a idade e o peso do animal, a condição patológica específica que requeira tratamento e sua gravidade, e a via de administração. A frequência dos tratamentos depende de uma série de fatores, tais como a quantidade de construções polinucleotídicas administradas por dose, assim como a saúde e o histórico do indivíduo. A quantidade precisa, o número de dose, e a pauta das doses serão determinados pelo médico ou veterinário tratante. As composições da presente invenção podem ser administradas a qualquer animal, preferentemente a mamíferos e pássaros. Os mamíferos preferidos incluem seres humanos, cães, gatos, ratinhos, ratos, coelhos, ovelhas, gado, cavalos e cerdos, sendo preferido particularmente os seres humanos.

Atividades biológicas

Os polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou os agonistas ou antagonistas descritos no presente documento podem ser utilizados em ensaios para testar uma ou mais atividades biológicas. Se estes polinucleótidos e polipéptidos mostrarem atividade num ensaio particular, é provável que estas moléculas possam estar implicadas nas doenças associadas com a atividade biológica. Portanto, os polinucleótidos ou polipéptidos, ou os agonistas ou antagonistas podem ser utilizados para tratar a doença associada.

Atividade imune

Os polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou os agonistas ou antagonistas descritos no presente documento podem ser úteis para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas do sistema imune, ativando ou inibindo a proliferação, diferenciação, ou mobilização (quimiotaxia) das células imunes. As células imunes se desenvolvem por meio de um processo denominado hematopoiese, produzindo células mieloides (plaquetas, glóbulos vermelhos sanguíneos, neutrófilos, e macrófagos) e linfoides (linfócitos B e T) a partir de células estaminais pluripotentes. A etiologia destas doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas imunes pode ser genética, somática, tal como cancro ou algumas doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas autoimunes, adquirida (por exemplo, por meio de quimioterapia ou toxinas), ou infeciosa. Além disso, os polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou os agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento podem ser utilizados como marcador ou detetor de uma doença ou distúrbio do sistema imune particular.

Os polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou os agonistas ou antagonistas, tal como são descritos no presente documento podem ser úteis para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas de células hematopoiéticas. Os polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou os agonistas ou antagonistas, tal como são descritos no presente documento, podem ser utilizados para aumentar a diferenciação e a proliferação de células hematopoiéticas, incluindo as células estaminais pluripotentes, num esforço para tratar ou prevenir essas doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas associadas com uma diminuição em determinados (ou muitos) tipos de células hematopoiéticas. Os exemplos de sindromes de deficiência imunológica incluem, mas sem limitação: doenças, distúrbios e/ou condições patológicas de proteínas sanguíneas (por exemplo, agamaglobulinemia, disgamaglobulinemia), ataxia, telangiectasia, imunodeficiência variável comum, síndrome de Digeorge, infeção por VIH, infeção por HTLV-BLV, síndrome de deficiência de adesão de leucócitos, linfopenia, disfunção bactericida de fagócitos, imunodeficiência combinada severa (SCID) , distúrbio de Wiskott-Aldrich, anemia, trombocitopenia, ou hemoglobulinuria.

Além disso, os polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou os agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento também poderiam ser usados para modular a atividade hemostática (detenção das hemorragias) ou a formação trombolitica (formação de coágulos). Por exemplo, ao aumentar a atividade hemostática ou trombolitica, os polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou os agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento poderiam ser usados para prevenir doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas da coagulação da sangue (por exemplo, afibrinogenemia, deficiências de fatores, trombose arterial, trombose venosa, etc.)/· doenças, distúrbios e/ou condições patológicas das plaquetas da sangue (por exemplo, trombocitopenia), ou feridas resultantes de um traumatismo, cirurgia, ou outras causas. Como alternativa, os polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento que podem diminuir a atividade hemostática ou trombolitica podem ser utilizados para inibir ou dissolver a formação de coágulos. Os polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou os agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento também podem ser úteis para a deteção, pronóstico, tratamento, e/ou prevenção dos ataques ao coração (infarto), ictus, formação de cicatrizes, fibrinólise, sangramento incontrolado, coagulação incontrolada, fixação de complemento incontrolada e/ou inflamação.

Os polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou os agonistas ou antagonistas, tal como são descritos no presente documento podem ser úteis também para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar doenças distúrbios, e/ou condições patológicas autoimunes. Muitas doenças, distúrbios e/ou condições patológicas autoimunes são o resultado do reconhecimento inadequado do material próprio como estranho pelas células imunes. Este reconhecimento inadequado da como resultado uma resposta imune que da lugar à destruição do tecido do hospedeiro. Portanto, a administração de polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou dos agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento que inibem uma resposta imune, particularmente a proliferação, diferenciação, ou quimiotaxia de células T, pode ser uma terapêutica eficaz para prevenir doenças, distúrbios e/ou condições patológicas autoimunes.

Os exemplos de doenças, distúrbios e/ou condições patológicas autoimunes que podem ser tratados, prevenidos e/ou diagnosticados ou ser detetados por meio da presente invenção incluem, mas sem limitação: doença de Addison, anemia hemolitica, sindrome antifosfolipidos, artrite reumatoide, dermatite, encefalomielite alérgica, glomerulonefrite, sindrome de Goodpasture, doença de Graves, esclerose múltiplo, miastenia grave, neurite, oftalmia, penfigoide bulloso, pénfigo, poliendocrinopatias, púrpura, doença de Reiter, síndrome do homem rígido, tiroidite autoimune, lúpus eritematoso sistémico, inflamação pulmonar autoimune, síndrome de Guillain-Barre, diabetes mellitus insulinodependente, e doença ocular inflamatória autoimune.

De maneira similar, as reações e condições patológicas alérgicas, tais como asma (particularmente asma alérgica) ou outros problemas respiratórios também podem ser tratados, prevenidos e/ou diagnosticados por meio dos polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento. Além disso, estas moléculas podem ser utilizadas para tratar a anafilaxia, a hipersensibilidade a uma molécula antigénica, ou a incompatibilidade de grupo sanguíneo.

Os polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou os agonistas ou antagonistas, tal como são descritos no presente documento podem ser utilizados também para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar o rejeição de órgãos ou a doença de enxerto contra hospedeiro (GVHD). A rejeição de órgãos por meio da destruição por parte das células imunes do hospedeiro do tecido transplantado por meio de uma resposta imune. De maneira similar, também existe uma resposta imune na GVHD, mas, neste caso, as células imunes exógenas transplantadas destroem os tecidos do hospedeiro. A administração de polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou dos agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento que inibem uma resposta imune, particularmente a proliferação, diferenciação, ou quimiotaxia de células T, pode ser uma terapêutica eficaz para prevenir o rejeição de órgãos ou a GVHD.

De maneira similar, os polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou os agonistas ou antagonistas, tal como são descritos no presente documento podem ser utilizados também para modular a inflamação. Por exemplo, o polipéptido ou polinucleótido ou os agonistas ou antagonistas podem inibir a proliferação e a diferenciação de células implicadas numa resposta inflamatória. Estas moléculas podem ser utilizadas para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar condições patológicas inflamatórias, condições patológicas tanto crónicas como agudas, incluindo prostatite crónica, prostatite granulomatosa e malacoplaquia, inflamação associada à infeção (por exemplo, choque séptico, septicemia, ou sindrome de resposta inflamatória sistémica (SIRS)), lesão por isquemia-reperfusão, letalidade por endotoxinas, artrite, rejeição hiperagudo mediado por complemento, nefrite, lesão pulmonar induzida por citocinas ou quimiocinas, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, ou que sejam o resultado da sobreprodução de citocinas (por exemplo, TNF ou IL-1). Distúrbios hiperproliferativos

Os polinucleótidos ou polipéptidos da invenção, ou os agonistas ou antagonistas descritos no presente documento podem ser utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar doenças, distúrbios e/ou condições patológicas hiperproliferativas, incluindo neoplasias. Os polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou os agonistas ou antagonistas, tal como são descritos no presente documento, podem inibir a proliferação do distúrbio por meio de interações diretas ou indiretas. Como alternativa, os polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou os agonistas ou antagonistas, tal como são descritos no presente documento, podem proliferar outras células que podem inibir o distúrbio hiperproliferativo.

Por exemplo, ao aumentar a resposta imune, particularmente ao aumentar as qualidades antigénicas do distúrbio hiperproliferativo ou proliferando, diferenciando ou mobilizando células T, as doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas hiperproliferativas podem ser tratados, prevenidos e/ou diagnosticados. Esta resposta imune pode ser aumentada bem potenciando na resposta imune existente, ou iniciando uma nova resposta imune. Como alternativa, a diminuição de uma resposta imune também pode ser um método para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas hiperproliferativas, tal como um agente quimioterápico.

Os exemplos de doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas hiperproliferativas que podem ser tratados, prevenidos e/ou diagnosticados por meio dos polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento incluem, mas sem limitação, neoplasias localizadas no colon, abdómen, osso, mama, sistema digestivo, figado, pâncreas, peritónio, glândulas endócrinas (adrenais, paratiroides, pituitária, testículos, ovário, timo, tiroides), olho, cabeça e pescoço, nervos (centrais e periféricos), sistema linfático, pélvis, pele, tecido mole, baço, tórax, e aparelho urogenital.

De maneira similar, outras doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas hiperproliferativas também podem ser tratados, prevenidos e/ou diagnosticados por meio dos polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção, ou agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento. Os exemplos das ditas doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas hiperproliferativas incluem, mas sem limitação: hipergamaglobulinemia, doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas linfoproliferativas, paraproteinemias, púrpura, sarcoidose, síndrome de Sezary, macroglobulinemia de Waldenstrom, doença de Gaucher, histiocitose, e qualquer outra doença hiperproliferativa, aparte de uma neoplasia, localizada num sistema de órgãos lista anteriormente.

Preferentemente, os polinucleótidos da presente invenção são usados para inibir a divisão celular aberrante, por meio de terapêutica génica usando a presente invenção, e/ou fusões de proteínas ou fragmentos das mesmas.

Portanto, as doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas proliferativas celulares podem ser tratados ou prevenidos insertando numa célula que prolifera de maneira anormal um polinucleótido da presente invenção, na qual o dito polinucleótido reprime a dita expressão.

Além disso, no presente documento descreve-se um método para tratar ou prevenir doenças, distúrbios e/ou condições patológicas proliferativas celulares, compreendendo o método a administração de uma ou mais cópias ativas de genes da presente invenção a uma célula ou células que proliferam de maneira anormal. Preferentemente, o polinucleótido da presente invenção é uma construção de ADN que compreende um vetor de expressão recombinante eficaz na expressão de uma sequência de ADN que codifica os ditos polinucleótidos. Preferentemente, a construção de ADN que codifica os polinucleótidos da presente invenção é insertida em células a serem tratadas usando um retrovirus, ou mais preferentemente um vetor adenoviral (veja-se G J. Nabel, et al., PNAS 1999/96; 324-326): 0 mais preferentemente, o vetor virai é defeituoso e não transformará às células que não estejam em proliferação, somente às células em proliferação. Preferentemente, os polinucleótidos da presente invenção insertados em células em proliferação bem sós, ou em combinação com ou fusionados a outros polinucleótidos, podem ser modulados então por meio de um estímulo externo (isto é, administração de uma molécula pequena magnética específica, um agente químico ou fármaco, etc.), que age sobre o promotor aguas arribas dos ditos polinucleótidos para induzir a expressão do produto proteico codificado. Como tal, o efeito terapêutico beneficioso do método descrito pode ser modulado expressamente (isto é, para aumentar, diminuir, ou inibir a expressão da presente invenção) com base nos ditos estímulos externos.

Os polinucleótidos da presente invenção podem ser úteis para reprimir a expressão de genes ou antigénios oncogénicos. Por "reprimir a expressão dos genes oncogénicos" entende-se a supressão da transcrição do gene, a degradação do transcrito génico (ARN pré-mensageiro), a inibição do splicing, a destruição do ARN mensageiro, a prevenção das modificações pós-traducionais da proteína, a destruição da proteína, ou a inibição da função normal da proteína.

Para a administração local a células que proliferam anormalmente, os polinucleótidos da presente invenção podem ser administrados por meio de qualquer método conhecido para os peritos na especialidade, incluindo, mas sem limitação, transfeção, eletroporação, microinjeção de células, ou em veículos, tais como lipossomas, lipofectina, ou como polinucleótidos nus, ou qualquer outro método descrito ao longo da memória descritiva. 0 polinucleótido da presente invenção pode ser administrado por meio de sistemas de administração génica conhecidos, tais como, mas sem limitação, vetores retrovirais (Gilboa, J. Virology 44:845 (1982); Hocke, Nature 320:275 (1986); Wilson, et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 85:3014), sistema de vírus vaccinia (Chakrabarty et al., Mol. Cell Biol. 5:3403 (1985) ou outros sistemas eficazes de administração de ADN (Yates et al. , Nature 313:812 (1985)) conhecidos para os peritos na especialidade. Estas referências são somente ilustrativas. Para administrar especificamente ou transfetar células que estão proliferando anormalmente e não em células que não estejam em divisão, é preferível utilizar um sistema de administração de retrovirus ou adenoviral (tal como descreve-se na técnica e em outras partes do presente documento) conhecidos para os peritos na especialidade. Já que é necessária a replicação do ADN do hospedeiro para que o ADN retroviral se integre, o retrovirus será incapaz de se replicar por si mesmo devido à ausência de genes de retrovirus necessários para seu ciclo celular. A utilização do dito sistema de administração retroviral para os polinucleótidos da presente invenção dirigirá às ditas construções génicas a células que estejam proliferando anormalmente e não a células normais que não estejam em divisão.

Os polinucleótidos da presente invenção podem ser administrados diretamente a locais de distúrbio/doença proliferativa celular em órgãos internos, cavidades corporais e semelhantes por meio da utilização de dispositivos de obtenção de imagens usados para guiar uma agulha de injeção diretamente no local de doença. Os polinucleótidos da presente invenção também podem ser administrados a locais de doença no momento da intervenção cirúrgica.

Por "doença proliferativa celular" entende-se qualquer doença ou distúrbio humano ou animal, afetando a qualquer um ou a qualquer combinação de órgãos, cavidades ou partes do corpo, que está caracterizada pela proliferação anormal local simples ou múltiplo de células, grupos de células ou tecidos, já seja benigno ou maligno.

Pode ser administrado qualquer quantidade dos polinucleótidos da presente invenção desde que tenha efeito inibidor biológico na proliferação das células tratadas. Além disso, é possível administrar mais de um dos polinucleótidos da presente invenção no mesmo local. Por "inibir biologicamente" entende-se a inibição parcial ou total do crescimento assim como a diminuição na velocidade de proliferação ou crescimento das células. A dose biologicamente inibidora pode ser determinado avaliando os efeitos dos polinucleótidos da presente invenção em células malignas ou que proliferam anormalmente crescidas em cultura de tecidos, crescimento tumoral em animais e culturas celulares, ou qualquer outro método conhecido para um perito habitual na especialidade.

Além disso, no presente documento são descritos terapias baseadas em anticorpos que implicam a administração de anticorpos anti-polipéptidos e anti-polinucleótidos a um paciente mamífero, preferentemente seres humanos, para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar uma ou mais das doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas descritas. Os métodos para produzir anticorpos monoclonais e policlonais anti-polipéptidos e anti-polinucleótidos são descritos em detalhe em outras partes do presente documento. Os ditos anticorpos podem ser produzidos em composições farmaceuticamente aceitáveis, tal como é conhecido na técnica ou tal como descreve-se no presente documento.

Um resumo das formas em que os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados terapeuticamente inclui unir polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção localmente ou sistemicamente no organismo ou por meio de citotoxicidade direta do anticorpo, por exemplo, mediada por complemento (CDC) ou por células efetoras (ADCC). Algumas destas estratégias são descritos em mais detalhe a seguir. Providos com os ensinamentos proporcionadas no presente documento, um perito na especialidade saberá como usar os anticorpos da presente invenção com fins de diagnóstico, de controlo ou terapêuticos sem experimentação desnecessária.

Em particular, os anticorpos, fragmentos e derivados da presente invenção são úteis para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar a um indivíduo que tem ou está desenvolvendo doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas da diferenciação e/ou proliferação celular tal como são descritos no presente documento. 0 dito tratamento compreende administrar uma sola ou múltiplas doses do anticorpo, ou um fragmento, derivado, ou conjugado do mesmo .

Os anticorpos desta invenção podem ser utilizados vantajosamente em combinação com outros anticorpos monoclonais ou quiméricos, ou com linfocinas ou fatores de crescimento hematopoiéticos, por exemplo, que servem para aumentar o número ou a atividade de células efetoras que interagem com os anticorpos.

Prefere-se usar anticorpos de alta afinidade e/ou inibição potente in vivo e/ou neutralizantes contra polipéptidos ou polinucleótidos da presente invenção, fragmentos ou regiões dos mesmos, tanto para imunoensaios dirigidos a e terapêutica de doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas relacionadas com polinucleótidos ou polipéptidos, incluindo fragmentos dos mesmos, da presente invenção. Os ditos anticorpos, fragmentos, ou regiões terão preferentemente uma afinidade pelos polinucleótidos ou polipéptidos, incluindo fragmentos dos mesmos. As afinidades de ligação preferidas incluem aquelas com uma constante de dissociação Kd menor de 5X10-6M, 10-6M, 5X10-7M, 10-7M, 5X10-8M, 10-8M, 5X10-9M, 10-9M, 5X10-10M, 10-10M, 5X10-11M, 10-11M, 5X10-12M, 10-12M, 5X10-13M, 10-13M, 5X10-14M, 10-14M, 5X10-15M, e 10-15M.

Além disso, os polipéptidos da presente invenção podem ser úteis para inibir a angiogénese de células ou tecidos proliferativos, bem solos, ou como proteína de fusão, ou em combinação com outros polipéptidos direta ou indiretamente, tal como descreve-se em outras partes do presente documento. Numa forma de realização mais preferida, o dito efeito anti-angiogénese pode ser conseguido indiretamente, por exemplo, por meio da inibição de células hematopoiéticas específicas de tumor, tais como macrófagos associados a tumor (veja-se Joseph IB, et ai., J Natl Cancer Inst, 90(21):1648-53 (1998)). Os anticorpos dirigidos a polipéptidos ou polinucleótidos da presente invenção também podem dar como resultado a inibição da angiogénese diretamente ou indiretamente (veja-se Witte L, et al., Cancer Metastase Rev. 17(2):155-61 (1998)).

Os polipéptidos, incluindo fusões de proteínas, da presente invenção, ou fragmentos dos mesmos podem ser úteis para inibir a células ou tecidos proliferativos por meio da indução da apoptose. Os ditos polipéptidos podem agir bem diretamente, ou indiretamente para induzir a apoptose de células e tecidos proliferativos, por exemplo, na ativação de um recetor de domínio de morte, tal como recetor 1 de fator de necrose tumoral (TNF), CD95 (Fas/APO-1), proteína mediada por apoptose relacionada com recetor de TNF (TRAMP) e recetor 1 e 2 de ligando indutor da apoptose relacionado com TNF (TRAIL) (veja-se Schulze-Osthof f K, et al. , Eur J Biochem 254(3):439-59 (1998)). Além disso, em outra forma de realização preferida da presente invenção, os ditos polipéptidos podem induzir a apoptose por meio de outros mecanismos, tais como a ativação de outras proteínas que ativarão a apoptose, ou por meio da estimulação da expressão das ditas proteínas, bem solas ou em combinação com fármacos ou adjuvantes de molécula pequena, tais como apoptonina, galectinas, tiorredoxinas, proteínas anti-inflamatórias (veja-se, por exemplo, Mutat. Res. 400(1-2):447-55 (1998), Med Hypotheses . 50 (5) :423-33 (1998), Chem. Biol. Interact. Apr 24;111-112:23-34 (1998), J Mol Med.76 ( 6) :402-12 (1998), Int. J. Tissue React. 20(1):3-15 (1998)).

Os polipéptidos, incluindo fusões de proteínas, ou fragmentos das mesmas, da presente invenção são úteis para inibir a metástase de células ou tecidos metastásicos. A inibição pode suceder como resultado direto de administrar polipéptidos, ou anticorpos dirigidos aos ditos polipéptidos tal como descreve-se em outras partes do presente documento, ou indiretamente, tal como ativando a expressão de proteínas que se sabe que inibem a metástase, por exemplo, alfa 4 integrinas, (Veja-se, por exemplo, Curr

Top Microbiol Immunol 1998;231:125-41). Os ditos efeitos terapêuticos da presente invenção podem ser conseguido sós, ou em combinação com fármacos ou adjuvantes de molécula pequena.

No presente documento descreve-se além disso um método para administrar composições que contêm os polipéptidos da invenção (por exemplo, composições que contêm polipéptidos ou anticorpos de polipéptidos associados com polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas, ou profármacos) a células alvo que expressam o polipéptido da presente invenção. Os polipéptidos ou anticorpos de polipéptidos da invenção podem ser associados a polipéptidos heterólogos, ácidos nucleicos heterólogos, toxinas, ou profármacos por meio de interações hidrófobas, hidrófilas, iónicas e/ou covalentes.

Os polipéptidos, fusões de proteínas, ou fragmentos das mesmas, da presente invenção são úteis para potenciar a imunogenicidade e/ou antigenicidade das células ou tecidos proliferativos, bem diretamente, tal como ocorreria se os polipéptidos da presente invenção "vacinassem" a resposta imune para que responda a antigénios e imunogénios proliferativos, ou indiretamente, tal como ativando a expressão de proteínas que se sabe que potenciam a resposta imune (por exemplo, quimiocinas), para os ditos antigénios e imunogénios.

Distúrbios cardiovasculares

Os polinucleótidos ou polipéptidos da invenção, ou os agonistas ou antagonistas, tal como são descritos no presente documento podem ser utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar doenças, distúrbios e/ou condições patológicas cardiovasculares, incluindo doença das artérias periféricas, tal como isquemia nas extremidades.

As doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas cardiovasculares incluem anomalias cardiovasculares, tais como fístula arterio-arterial, fístula arteriovenosa, malformações arteriovenosas cerebrais, defeitos cardíacos congénicos, atresia pulmonar, e síndrome de Scimitar. Os defeitos cardíacos congénitos incluem coartação aórtica, coração triatriado, anomalias dos vasos coronários, coração com ventrículos entrecruzados, dextrocardia, ductus arterioso permeável, anomalia de Ebstein, complexo de Eisenmenger, síndrome do coração esquerdo hipoplásico, levocardia, tetralogia de Fallot, transposição dos grandes vasos, ventrículo direito de dupla saída, atresia tricúspide, tronco arterioso persistente, e defeitos septais do coração, tal como defeito septal aortopulmonar, defeitos do colchão endocárdica, síndrome de Lutembacher, trilogia de Fallot, defeitos septais ventriculares cardíacos.

As doenças, distúrbios e/ou condições patológicas cardiovasculares também incluem doenças cardíacas, tais como arritmias, doença coronária carcinoide, alto gasto cardíaco, sob gasto cardíaco, tamponamento cardíaco, endocardite (incluindo bacteriana) , aneurisma coronário, paragem cardíaca, insuficiência cardíaca congestiva, cardiomiopatia congestiva, dispneia paroxística, edema cardíaco, hipertrofia cardíaca, cardiomiopatia congestiva, hipertrofia ventricular esquerda, hipertrofia ventricular direita, rotura cardíaca pós-infarto, rotura do septo ventricular, doenças das válvulas cardíacas, doenças miocárdicas, isquemia miocárdica, efusão pericárdica, pericardite (incluindo constritiva e tuberculosa), neumopericárdio, síndrome pós-pericardiotomia, doença cardíaca pulmonar, doença cardíaca reumática, disfunção ventricular, hiperemia, complicações cardiovasculares do gravidez, síndrome de Scimitar, sífilis cardiovascular e tuberculose cardiovascular.

As arritmias incluem arritmia sinusal, fibrilação auricular, taquicardia auricular, bradicardia, extrassistole, síndrome de Adams-Stokes, bloqueio de rama,, bloqueio sinoauricular, síndrome do QT largo, parassístole, síndrome de Lown-Ganong-Levine, síndrome de pré-excitação de tipo Mahaim, síndrome de Wolff-Parkinson-White, síndrome do seno enfermo, taquicardias e fibrilação ventricular. As taquicardias incluem taquicardia paroxística, taquicardia supraventricular, ritmo idioventricular acelerado, taquicardia intranodal auriculoventricular, taquicardia auricular ectópica, taquicardia ectópica da ligação, taquicardia por reentrada nodal sinusal, taquicardia sinusal, Torsades de Pointes, e taquicardia ventricular. A doença das válvulas cardíacas inclui insuficiência da válvula aórtica, estenose da válvula aórtica, sopro cardíaco, prolapso da válvula aórtica, prolapso da válvula mitral, prolapso da válvula tricúspide, insuficiência da válvula mitral, estenose da válvula mitral, atresia pulmonar, insuficiência da válvula pulmonar, estenose da válvula pulmonar, atresia tricúspide, insuficiência da válvula tricúspide, e estenose da válvula tricúspide.

As doenças miocárdicas incluem cardiomiopatia alcoólica, cardiomiopatia congestiva, cardiomiopatia hipertrófica, estenose subvalvular aórtica, estenose subvalvular pulmonar, cardiomiopatia restritiva, cardiomiopatia de Chagas, fibroelastose endocárdica, fibrose endomiocárdica, síndrome de Kearns, lesão por reperfusão miocárdica e miocardite.

As isquemias miocárdicas incluem doenças coronárias, tais como angina de pecho, aneurisma coronário, arterioesclerose coronária, trombose coronária, vasoespasmo coronário, infarto de miocárdio e aturdimento miocárdico.

As doenças cardiovasculares também incluem doenças vasculares, tais como aneurismas, angiodisplasia, angiomatosis, angiomatose bacilar, doença de Hippel-Lindau, síndrome de Klippel-Trenaunay-Weber, síndrome de Sturge-Weber, edema angioneurótico, doenças aórticas, arterite de

Takayasu, aortite, síndrome de Leriche, doenças oclusivas arteriais, arterite, enarterite, poliarterite nodosa, doenças, distúrbios e/ou condições patológicas cerebrovasculares, angiopatias diabéticas, retinopatia diabética, embolismos, trombose, eritromegalia, hemorroides, doença veno-oclusiva hepática, hipertensão, hipotensão, isquemia, doenças vasculares periféricas, flebite, doença veno-oclusiva pulmonar, doença de Raynaud, síndrome de CREST, oclusão da veia retinal, síndrome de Scimitar, síndrome da veia cava superior, telangiectasia, ataxia-telangectasia, telangectasia hemorrágica hereditária, varicocele, veias varicosas, úlcera varicosa, vasculite, e insuficiência venosa.

Os aneurismas incluem aneurismas por diseção, falsos aneurismas, aneurismas infetados, aneurismas rotos, aneurismas aórticos, aneurismas cerebrais, aneurismas coronários, aneurismas cardíacos, e aneurismas ilíacos.

As doenças oclusivas arteriais incluem arteriosclerose, claudicação intermitente, estenose carotidea, displasias fibromusculares, oclusão vascular mesentérica, doença de Moyamoya, obstrução da artéria renal, oclusão da artéria retiniana, e tromboangite obliterante.

As doenças, distúrbios e/ou condições patológicas cerebrovasculares incluem doenças da artéria carótida, angiopatia amiloide cerebral, aneurisma cerebral, anoxia cerebral, arteriosclerose cerebral, malformação arteriovenosa cerebral, doenças da artéria cerebral, embolismo e trombose cerebral, trombose da artéria carótida, trombose do seio, síndrome de Wallenberg, hemorragia cerebral, hematoma epidural, hematoma subdural, hemorragia subaracnoídea, infarto cerebral, isquemia cerebral (incluindo transitória), síndrome do roubo da subclavia, leucomalácia periventricular, cefaleia vascular, cefaleia em salvas, enxaqueca, e insuficiência vertebrobasilar .

Os embolismos incluem embolismos aéreos, embolismos de fluido amniótico, embolismos por colesterol, sindrome dos dedos dos pés azuis, embolismos por gorduras, embolismos pulmonares, e tromboembolismos. As tromboses incluem trombose coronária, trombose da veia hepática, oclusão da veia retinal, trombose da artéria carótida, trombose do seno, sindrome de Wallenberg, e tromboflebitis. A isquemia inclui isquemia cerebral, colite isquémica, sindromes compartimentais, sindrome do compartimento anterior, isquemia miocárdica, lesiones por reperfusão, e isquemia periférica das extremidades. As vasculites incluem aortite, arterite, sindrome de Behcet, sindrome de Churg-Strauss, sindrome do nódulo linfático mucocutáneo, tromboangite obliterante, vasculite por hipersensibilidade, púrpura de Schoenlein-Henoch, vasculite cutânea alérgica e granulomatose de Wegener.

Os polinucleótidos ou polipéptidos da invenção, ou agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento, são especialmente eficazes para o tratamento da isquemia das extremidades e a doença coronária critica.

Os polipéptidos podem ser administrados usando qualquer método conhecido na técnica, incluindo, mas sem limitação, injeção direta com agulha no local de administração, injeção intravenosa, administração tópica, infusão por cateter, injetores biolisticos, aceleradores de partículas, depósitos de esponja de espuma de gel, outros materiais de depósito comercialmente disponíveis, bombas osmóticas, formulações farmacêuticas sólidas orais ou em supositório, aplicações por decantação ou tópicas durante a cirurgia, administração de aerossol. Os ditos métodos são conhecidos na técnica. Os polipéptidos da invenção podem ser administrado como parte de uma terapêutica, como descreve-se em mais detalhe mais adiante. Os métodos para administrar polinucleótidos da invenção são descritos em mais detalhe no presente documento.

Doenças neurológicas

As doenças, distúrbios e/ou condições patológicas do sistema nervoso que podem ser tratados, prevenidos e/ou diagnosticados com as composições da invenção (por exemplo, polipéptidos, polinucleótidos, e/ou agonistas ou antagonistas) , incluem, mas sem limitação, lesões do sistema nervoso, e doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas que dão como resultado uma desconexão de axões, uma diminuição ou degradação de neurônios ou desmielinização. As lesões do sistema nervoso que podem ser tratados, prevenidos e/ou diagnosticados num paciente (incluindo pacientes humanos e de mamífero não humano) de acordo com a invenção incluem, mas sem limitação, as seguintes lesões do sistema nervoso central (incluindo a medula espinal e o cérebro) ou periférico: (1) lesões isquémicas, em que uma carência de oxigénio numa porção do sistema nervoso da como resultado uma lesão ou a morte neuronal, incluindo infarto ou isquemia cerebral, ou infarto ou isquemia da medula espinal; (2) lesões traumáticas, incluindo lesões causadas por uma lesão física ou associadas com a cirurgia, por exemplo, lesões que seccionam uma porção do sistema nervoso, ou lesões por compressão; (3) lesões neoplásicas, em que uma porção do sistema nervoso é destruída ou lesionada pelo tecido neoplásico que é uma neoplasia associada ao sistema nervoso ou uma neoplasia derivada de tecido não nervoso; (4) lesões infeciosas, em que uma porção do sistema nervoso se destrói ou lesiona como resultado de uma infeção, por exemplo, por um abscesso ou associadas com a infeção por vírus da imunodeficiência humana, Herpes Zoster, ou vírus do herpes simples ou com a doença de Lyme, tuberculose, sífilis; (5) lesões degenerativas, em que uma porção do sistema nervoso é destruída ou lesionada como resultado de um processo degenerativo, incluindo, mas sem limitação, a degeneração associada à doença de Parkinson, doença de Alzheimer, coreia de Huntington, ou esclerose lateral amiotrófica (ELA); (6) lesões associadas com doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas nutricionais, em que uma porção do sistema nervoso é destruída ou lesionada por um distúrbio nutricional ou um distúrbio metabólico, incluindo, mas sem limitação, deficiência de vitamina B12, deficiência de ácido fólico, doença de Wenicke, ambliopia por tabaco-álcool, doença de Marchiafava-Bignami (degeneração primária do corpo caloso), e degeneração cerebelar alcoólica; (7) lesões neurológicas associadas a doenças sistémicas, incluindo, mas sem limitação, diabetes (neuropatia diabética, parálise de Bell), lúpus sistémico eritematoso, carcinoma, ou sarcoidose; (8) lesões causadas por substâncias tóxicas, incluindo álcool, chumbo, ou neurotoxinas particulares; e (9) lesões desmielinizadas em que uma porção do sistema nervoso central é destruída ou lesionada por uma doença desmielinizante, incluindo, mas sem limitação, esclerose múltiplo, mielopatia associada a o vírus da imunodeficiência humana, mielopatias transversais de várias etiologias, leucoencefalopatia multifocal progressiva, e mielinólise central pontina.

Numa forma de realização preferida, os polipéptidos e polinucleótidos da invenção, ou os agonistas ou antagonistas descritos no presente documento são utilizados para proteger às células neuronais dos efeitos prejudiciais da hipoxia cerebral. De acordo com esta forma de realização, as composições da invenção são utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar a lesão celular neural associada à hipoxia cerebral. Num aspeto desta forma de realização, os polipéptidos e polinucleótidos da invenção, ou os agonistas ou antagonistas descritos no presente documento são utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar a lesão celular neural associada à isquemia cerebral. Em outro aspeto desta forma de realização, os polipéptidos e polinucleótidos da invenção, ou os agonistas ou antagonistas descritos no presente documento são utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar a lesão celular neural associada ao infarto cerebral. Em outro aspeto desta forma de realização, os polipéptidos e polinucleótidos da invenção, ou os agonistas ou antagonistas descritos no presente documento são utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar ou prevenir a lesão celular neural associada ao ictus. Num aspeto adicional desta forma de realização, os polipéptidos e polinucleótidos da invenção, ou os agonistas ou antagonistas descritos no presente documento são utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar a lesão celular neural associada a um ataque cardíaco.

As composições da invenção que são úteis para tratar ou prevenir um distúrbio do sistema nervoso central podem ser selecionadas ensaiando a atividade biológica para promover a sobrevivência ou diferenciação das neurônios. Por exemplo, mas não como limitação, as composições da invenção que provocam quaisquer dos seguintes efeitos podem ser úteis de acordo com a invenção: (1) tempo de sobrevivência aumentado de neurônios em cultura; (2) brotação aumentada de neurônios em cultura ou in vivo·, (3) produção aumentada de uma molécula associada a uma neurônio em cultura ou in vivo, por exemplo, colina acetiltransferase de ou acetilcolinesterase com respeito às neurônios motoras; ou (4) sintomas diminuídos de disfunção neuronal in vivo. Os ditos efeitos podem ser medidos por meio de qualquer método conhecido na técnica. Em limitações preferidas não limitantes, a sobrevivência aumentada de neurônios pode ser medida de maneira rotineira usando um método exposto no presente documento ou conhecido de outro modo na técnica, tais como, por exemplo, o método exposto em Arakawa et ai., (J. Neurosci. 10:3507-3515 (1990)); a brotação aumentada de neurônios pode ser detetada por meio de métodos conhecidos na técnica, tais como, por exemplo, os métodos expostos em Pestronk et al. , (Exp. Neurol. 70:65-82 (1980)) ou Brown et al. (Ann. Rev. Neurosci. 4:17-42 (1981)); a produção aumentada de moléculas associadas a neurônios pode ser medida por meio de bioensaio, ensaio enzimático, ligação de anticorpos, ensaio de transferência de Northern, etc., usando técnicas conhecidas na técnica e dependendo da molécula a ser medida; e a disfunção de neurônios motoras pode ser medida avaliando a manifestação física de um distúrbio das neurônios motoras, por exemplo, debilidade, velocidade de condução dos neurônios motores, ou incapacidade funcional.

Em formas de realização específicas, as doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas dos neurônios motores que podem ser tratados, prevenidos e/ou diagnosticados de acordo com a invenção incluem, mas sem limitação, doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas, tais como infarto, infeção, exposição a toxinas, trauma, dano cirúrgico, doenças degenerativas ou neoplasias que possam afetar os neurônios motores, assim como outros componentes do sistema nervoso, assim como doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas que afetam seletivamente os neurônios, tais como esclerose lateral amiotrófica, e incluindo, mas sem limitação, atrofia muscular espinal progressiva, parálise bulbar progressiva, esclerose lateral primaria, atrofia muscular infantil e juvenil, parálise bulbar progressiva da infância (síndrome de Fazio-Londe), poliomelite e síndrome pós-pólio, e neuropatia motossensorial hereditária (doença de Charcot-Marie-Tooth).

Doenças infeciosas

Um polipéptido ou polinucleótido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista tal como descreve-se no presente documento pode ser usado para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar agentes infeciosos. Por exemplo, ao aumentar a resposta imune, particularmente ao aumentar a proliferação e diferenciação de linfócitos B e/ou T, podem ser tratados, prevenidos e/ou diagnosticados as doenças infeciosas. A resposta imune pode ser aumentada bem potenciando na resposta imune existente, ou iniciando uma nova resposta imune. Como alternativa, um polipéptido ou polinucleótido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista tal como descreve-se no presente documento pode também inibir diretamente ao agente infecioso, sem provocar necessariamente uma resposta imune.

Os vírus são um exemplo de um agente infecioso que pode causar doença ou sintomas que podem ser tratados, prevenidos e/ou diagnosticados por meio de um polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista tal como descreve-se no presente documento. Os exemplos de vírus incluem, mas não estão limitados aos seguintes vírus e famílias de vírus de ADN e ARN: arbovirus, adenoviridae, arenaviridae, arterivirus, birnaviridae, bunyaviridae, caliciviridae, circoviridae, coronaviridae, dengue, EBV, HIV, flaviviridae, hepadnaviridae (Hepatitis), herpesviridae (tais como, citomegalovírus, Herpes Simplex, Herpes Zoster, monomegavírus (por exemplo, paramyxoviridae, morbillivírus, rhabdoviridae) , orthomyxoviridae (por exemplo, gripe A, gripe B, e parainfluenza), Papiloma vírus, Papovaviridae, Parvoviridae, Picornaviridae, Poxviridae (tais como viruela or vaccinia), reoviridae (por exemplo, Rotavirus), retroviridae (HTLV-I, HTLV-II, lentivírus), e togaviridae (por exemplo, rubivírus). os vírus que estão dentro destas famílias podem causar uma diversidade de doenças ou sintomas incluindo, mas sem limitação: artrite, bronquiolite, vírus sincicial respiratório, encefalite, infeções oculares (por exemplo, conjuntivite, queratite), síndrome da fatiga crónica, hepatitis (A, B, C, E, ativa crónica, delta), encefalite B japonesa, junin, chikungunya, fiebre do vale do Rift, febre amarela, meningite, infeções oportunistas (por exemplo, SIDA), pneumonia, linfoma de Burkitt, varicela, febre hemorrágica, sarampo, papeiras, parainfluenza, raiva, o resfriado comum, pólio, leucemia, rubéola, doenças de transmissão sexual, doenças cutâneas (por exemplo, sarcoma de Kaposi, verrugas), e viremia. Os polinucleótidos ou polipéptidos da invenção, ou agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento, podem ser utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar quaisquer destes sintomas ou doenças. Em formas de realização especificas, polinucleótidos, os polipéptidos da invenção, ou os agonistas ou antagonistas, tal como são descritos no presente documento são utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar: a meningite, dengue, EBV, e/ou a hepatite (por exemplo, hepatite B) . Numa forma de realização especifica adicional, os polinucleótidos ou polipéptidos da invenção, ou agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento, são utilizados para tratar aos pacientes que não respondem a uma ou mais vacinas para a hepatite comercialmente disponíveis. Numa forma de realização específica adicional, os polinucleótidos ou polipéptidos da invenção, ou agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento, são utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar o SIDA.

De maneira similar, os agentes bacterianos ou fúngicos que podem causar doença ou sintomas e que podem ser tratados, prevenidos e/ou diagnosticados por meio de um polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista tal como descreve-se no presente documento incluem, mas sem limitação, incluem, mas sem limitação, as seguintes bactéria e famílias bacterianas Gram-negativas e Gram-positivas e fungos: Actinomycetais (por exemplo, Corynebacterium, Mycobacterium, Norcardia),

Cryptococcus neoformans, aspergilose, Bacillaceae (por exemplo, Anthrax, Clostridium), Bacteroidaceae, blastomicosis, Bordetella, Borrelia (por exemplo, Borrelia burgdorferi) , brucelose, candidlase, Campylobacter, coccidioidomicose, criptococose, dermatocicose, E. coli (e.g., E. coli enterotoxigénica e E. coli enterohemorrágica), Enterobacteriaceae (Klebsiella, Salmonella (por exemplo, Salmonella typhi, e Salmonella paratyphi) , Serratia, Yersinia) , Erysipelothrix, Helicobacter, legionelose, leptospirose, Listeria, Mycoplasmatais, Mycobacterium leprae, Vibrio cholerae, Neisseriaceae (por exemplo, Acinetobacter, gonorrea, meningococemia), Meisseria meningitidis, infeções por Pasteurellacea (por exemplo, Actinobacillus, Heamophilus (por exemplo, Heamophilus influenza de tipo B) , Pasteurella), Pseudomonas, Pickettsiaceae, Chlamydiaceae, sífilis, Shigella spp., estafilocócicas, meningocócicas, neumocócicas e estreptocócicas (por exemplo, Streptococcus pneumoniae e Streptococcus de grupo B) . Estas famílias bacterianas ou fúngicas podem causar as seguintes doenças ou sintomas, incluindo, mas sem limitação: bacteriemia, endocardite, infeções oculares (conjuntivite, tuberculose, uveite), gingivite, infeções oportunistas (por exemplo, infeções relacionadas com o SIDA), paroniquia, infeções relacionadas com prótese, doença de Reiter, infeções do trato respiratório, tais como pertussis ou empiema, septicemia, doença de Lyme, doença por arranhão de gato, disenteria, febre paratifoidea, intoxicação alimentaria, tifo, pneumonia, gonorreia, meningite (por exemplo, meningite de tipos A e B) , clamídia, sífilis, difteria, lepra, paratuberculose, tuberculose, lúpus, botulismo, gangrena, tétano, impetigo, febre reumática, escarlatina, doenças de transmissão sexual, doenças cutâneas (por exemplo, celulite, dermatocicose), toxemia, infeções do trato urinário, infeções de feridas. Os polinucleótidos ou polipéptidos da invenção, ou agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento, podem ser utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar quaisquer destes sintomas ou doenças. Em formas de realização especificas, os polinucleótidos ou polipéptidos da invenção, ou os agonistas ou antagonistas, tal como são descritos no presente documento são utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar: tétanos, difteria, botulismo, e/ou meningite de tipo B.

Além disso, os agentes parasíticos que causam doença ou sintomas que podem ser tratados, prevenidos e/ou diagnosticados por meio de um polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista tal como descreve-se no presente documento incluem, mas sem limitação, as seguintes famílias ou classes: amebíase, babesiose, coccidiose, criptosporidiose, dientamoebiase, durina, ectoparasítica, giardíase, helmintíase, leishmaniose, teileríase, toxoplasmose, tripanosomíase, e tricomonas e esporozoos (por exemplo, Plasmodium virax, Plasmodium falciparium, Plasmodium malariae e Plasmodium ovale) . Estes parasitas podem causar uma diversidade de doenças ou sintomas incluindo, mas sem limitação: sarna, trombiculíase, infeções oculares, doença intestinal (por exemplo, disenteria, giardíase), doença hepática, doença pulmonar, infeções oportunistas (por exemplo, relacionadas com o SIDA), malaria, complicações do gravidez e toxoplasmose. Os polinucleótidos ou polipéptidos da invenção, ou agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento, podem ser utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar quaisquer destes sintomas ou doenças. Em formas de realização especificas, os polinucleótidos ou polipéptidos da invenção, ou os agonistas ou antagonistas, tal como são descritos no presente documento são utilizados para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar a malaria.

Preferentemente, o tratamento ou prevenção usando um polipéptido ou polinucleótido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista tal como descreve-se no presente documento poderia ser por meio da administração de uma quantidade eficaz de um polipéptido ao paciente, ou retirando células do paciente, administrando às células um polinucleótido da presente invenção, e devolvendo as células modificadas por engenharia genética ao paciente (terapêutica ex vivo) . Além disso, o polipéptido ou polinucleótido da presente invenção pode ser usado como antigénio numa vacina para provocar uma resposta imune contra uma doença infeciosa.

Regeneração

Um polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista tal como descreve-se no presente documento pode ser usado para diferenciar, proliferar e atrair células, dando lugar à regeneração de tecidos. (Veja-se, Science 276:59-87 (1997)). A regeneração de tecidos pode ser usado para reparar, substituir ou proteger ao tecido danificado por danos congénitos, traumatismos (feridas, queimaduras, incisões ou úlceras), a idade, doença (por exemplo, osteoporose, artrose, doença periodontal, insuficiência hepática), cirurgia, incluindo cirurgia plástica cosmética, fibrose, lesão por reperfusão, ou dano sistémico por citocinas.

Os tecidos que podem ser regenerados usando a presente invenção incluem tecidos de órgãos (por exemplo, pâncreas, fígado, intestino, rim, pele, endotélio), músculo (liso, esquelético ou cardíaco), vasculatura (incluindo vascular e linfática), nervoso, hematopoiético e esquelético (osso, cartilagem, tendão, e ligamento). Preferentemente, a regeneração sucede sem cicatrização ou com cicatrização diminuída. A regeneração também pode incluir angiogénese.

Além disso, um polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista tal como descreve-se no presente documento pode aumentar a regeneração de tecidos difíceis de curar. Por exemplo, a regeneração aumentada de tendões/ligamentos acelerará o tempo de recuperação depois do dano. Um polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista, tal como descreve-se no presente documento também poderia ser usado profilaticamente num esforço para evitar danos. As doenças específicas que poderiam ser tratadas, prevenidas, e/ou diagnosticadas incluem tendinite, síndrome do túnel carpiano, e outros defeitos dos ligamentos ou tendões. Um exemplo adicional de regeneração de tecidos de feridas que não saram incluem as úlceras por pressão, as úlceras associadas à insuficiência vascular, feridas cirúrgicas e traumáticas.

De maneira similar, o tecido nervoso e cerebral também poderia ser regenerados usando um polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista tal como descreve-se no presente documento para proliferar e diferenciar células nerviosas. As doenças que podem ser tratadas, prevenidas, e/ou diagnosticadas usando este método incluem doenças do sistema nervoso central e periférico, neuropatias, ou doenças, distúrbios e/ou condições patológicas mecânicas e traumáticas (por exemplo, distúrbios da medula espinal, trauma encefálico, doença cerebrovascular, e ictus). Especificamente, as doenças associadas a lesões dos nervos periféricos, neuropatia periférica (por exemplo, como resultado da quimioterapia ou outras terapias médicas), neuropatias localizadas, e doenças do sistema nervoso central (por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica, e síndrome de Shy-Drager) , poderiam ser tratadas, prevenidas, e/ou diagnosticadas usando o polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou o agonista ou antagonista descrito no presente documento.

Atividade de ligação

Um polipéptido da presente invenção pode ser usado para rastrear moléculas que se ligam ao polipéptido ou moléculas às que se liga o polipéptido. A ligação do polipéptido e a molécula pode ativar (agonismo), aumentar, inibir (antagonismo), ou diminuir a atividade do polipéptido ou da molécula unida. Os exemplos das ditas moléculas incluem anticorpos, oligonucleótidos, proteínas (por exemplo, recetores), ou moléculas pequenas.

Preferentemente, a molécula está estreitamente relacionada com o ligando natural do polipéptido, por exemplo, um fragmento do ligando, ou um substrato natural, um ligando, um mimético estrutural ou funcional. (Veja-se, Coligan et al., Current Protocols in Immunology 1(2):Capítulo 5 (1991).) De maneira similar, a molécula pode estar estreitamente relacionada com o recetor natural ao que se liga o polipéptido ou pelo menos, um fragmento do recetor capaz de se ligar ao polipéptido (por exemplo, o local ativo). Em qualquer caso, a molécula pode ser projetada racionalmente usando técnicas conhecidas.

Preferentemente, o rastreio destas moléculas implica produzir células adequadas que expressam o polipéptido, bem como proteína secretada ou sobre a membrana celular. As células preferidas incluem células de mamíferos, leveduras, Drosophila, ou E. coli. As células que expressam o polipéptido (ou a membrana celular que contém o polipéptido expressado) são postas em contacto com um composto de ensaio que contém potencialmente a molécula para observar a ligação, estimulação, ou inibição da atividade do polipéptido ou da molécula. 0 ensaio pode simplesmente testar a ligação de um composto candidato ao polipéptido, no qual a ligação se deteta por meio de um marcador, ou num ensaio que implica a competição com um competidor marcado. Além disso, o ensaio pode testar se o composto candidato da como resultado uma sinal gerada pela ligação ao polipéptido.

Como alternativa, o ensaio pode ser levado a cabo usando preparações sem células, polipéptido/molécula fixada a um suporte sólido, bibliotecas químicas, ou misturas de produtos naturais. 0 ensaio também pode compreender unicamente as etapas de misturar um composto candidato com uma solução que contém um polipéptido, medir a atividade ou ligação do polipéptido/molécula, e comparar a atividade ou ligação do polipéptido/molécula com um padrão.

Preferentemente, um ensaio ELISA pode medir o nível de polipéptido ou atividade numa amostra (por exemplo, amostra biológica) usando um anticorpo monoclonal ou policlonal. 0 anticorpo pode medir o nível de polipéptido ou a atividade bem por meio de ligação, direta ou indiretamente, ao polipéptido ou por meio de competição com o polipéptido por um substrato.

Adicionalmente, o recetor ao que se liga um polipéptido da invenção pode ser identificado por meio de numerosos métodos conhecidos para os peritos na especialidade, por exemplo, panning de ligando e classificação FACS® (Coligan, et al. , Current Protocols in Immun., 1(2), Capítulo 5, (1991)). Por exemplo, utiliza-se clonagem de expressão na que o ARN poliadenilado prepara-se a partir de uma célula que responde aos polipéptidos, por exemplo, células NIH3T3 que se sabe que contêm múltiplos recetores para as proteínas da família de FGF, e células SC-3, e uma biblioteca de ADNc criada a partir deste ARN dividem-se em grupos e são utilizados para transfetar células COS ou outras células que não respondem aos polipéptidos. As células transfectadas que são feitas crescer em porta-objetos de vidro são expostos ao polipéptido da presente invenção, depois de que tenham sido marcados. Os polipéptidos podem ser marcados por meio de uma diversidade de meios, incluindo iodação ou inclusão de um local de reconhecimento para uma proteína quinase específica de local.

Depois da fixação e incubação, os porta-objetos são submetidos a análise autorradiográfico. Os grupos positivos são identificados e são preparados subgrupos e são retransfectados usando um processo de subagrupação e re-rastreio, produzindo eventualmente um somente clone que codifica o recetor putativo.

Como estratégia alternativa para a identificação de recetores, os polipéptidos marcados podem se ligar por fotoafinidade com preparações de membrana celular ou extratos que expressam a molécula de recetor. 0 material reticulado é resolvido por meio de análise PAGE e é exposto a um filme de raios X. 0 complexo marcado que contém os recetores dos polipéptidos pode ser cortado, resolvido em fragmentos peptidicos, e subsmetidos a microsequenciamento de proteínas. A sequência de aminoácidos obtida a partir da microsequenciamento poderia ser usado para projetar um conjunto de sondas oligonucleotídicas degeneradas para rastrear uma biblioteca de ADNc para identificar os genes que codificam aos recetores putativos.

Além disso, as técnicas de embaralhamento génico, de embaralhamento de motivos, de embaralhamento de exões, e/ou de embaralhamento de codões (citadas coletivamente como "embaralhamento de ADN") podem ser utilizados para modular as atividades dos polipéptidos da invenção, gerando deste modo de uma maneira eficaz agonistas e antagonistas dos polipéptidos da invenção. Vejam-se de maneira geral, as Patentes US com números 5,605,793, 5,811,238, 5,830,721, 5, 834,252, e 5, 837,458, e Patten, P. A., et al. , Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33 (1997) . Harayama, S. Trends Biotechnol. 16(2):76-82 (1998); Hansson, L. O., et al., J. Mol. Biol. 287:265-76 (1999) . e Lorenzo, Μ. M. e Blasco, R. Biotechniques 24(2) :308-13 (1998) . A alteração de polinucleótidos e dos polipéptidos correspondentes da invenção podem ser conseguidos por meio de embaralhamento de ADN. 0 embaralhamento de ADN implica a montagem de dois ou mais segmentos de ADN numa sequência polinucleotídica desejada da molécula da invenção por meio de recombinação de homólogos ou de local específico. Os polinucleotidos e os polipéptidos correspondentes da invenção também podem ser alterados submetendo a mutagénese aleatoriamente por meio de PCR propensa a erros, inserção aleatoriamente de nucleótidos ou outros métodos antes da recombinação. Além disso, um ou mais componentes, motivos, secções, partes, domínios, fragmentos, etc., dos polipéptidos da invenção podem ser recombinados com um ou mais componentes, motivos, secções, partes, domínios, fragmentos, etc. de uma ou mais moléculas heterólogas. Em formas de realização preferidas, as moléculas heterólogas são membros de uma família. Em formas de realização preferidas adicionais, a molécula heteróloga é um fator de crescimento, tal como, por exemplo, fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), fator de crescimento insulínico (IGF-I), fator de crescimento transformante (TGF)-alfa, fator de crescimento epidérmico (EGF), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), TGF-beta, proteína morfogenética de osso (BMP)-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, ativinas A e B, decapentaplégico (dpp), 60 A, OP-2, dorsalina, fatores de diferenciação do crescimento (GDF), nodal, MIS, inibina-alfa, TGF-betal, TGF-beta2, TGF-beta3, TGF-beta5, e fator neurotrófico derivado glial (GDNF).

Outros fragmentos preferidos são fragmentos biologicamente ativos dos polipéptidos da invenção. Os fragmentos biologicamente ativos são aqueles que mostram uma atividade similar, mas não necessariamente idêntica, a uma atividade do polipéptido. A atividade biológica dos fragmentos pode incluir uma atividade melhorada desejada, ou uma atividade não desejada diminuída.

Adicionalmente, no presente documento descreve-se um método para rastrear compostos para identificar aqueles que modulam a ação do polipéptido da presente invenção. Um exemplo do dito ensaio compreende combinar uma célula de fibroblasto de mamífero, o polipéptido da presente invenção, o composto a ser rastreado e 3[H] timidina em condições de cultura celular onde o fibroblasto poderia proliferar normalmente. Pode ser levado a cabo um ensaio de controlo em ausência do composto a ser rastreado e se compara com a quantidade de proliferação de fibroblastos em presença do composto para determinar se o composto estimula a proliferação determinando a captação de 3 [H] timidina em cada caso. A quantidade de proliferação celular de fibroblastos é medida por meio de cromatografia de cintilação líquida que mede a incorporação de 3 [H] timidina. Os compostos tanto agonistas como antagonistas podem ser identificados por meio deste procedimento.

Em outro método, incuba-se uma célula de mamífero ou uma preparação de membrana que expressa um recetor para um polipéptido da presente invenção com um polipéptido marcado da presente invenção em presença do composto. A capacidade do composto para potenciar ou bloquear esta interação poderia então ser medida. Como alternativa, mede-se a resposta de um segundo sistema de mensageiro depois da interação de um composto a ser rastreado e o recetor e mede-se a capacidade do composto para se ligar ao recetor e provocar uma segunda resposta de mensageiro para determinar se o composto é um agonista ou antagonista potencial. Os ditos sistemas de segundo mensageiro incluem, mas sem limitação, guanilato ciclase de AMPc, canais de iões ou hidrólise de fosfoinositida.

Todos estes ensaios anteriores podem ser utilizados como marcadores de diagnóstico ou pronósticos. As moléculas descobertas usando estes ensaios podem ser utilizadas para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar doenças ou para provocar um resultado particular num paciente (por exemplo, crescimento de vasos sanguíneos) ativando ou inibindo o polipéptido/molécula. Além disso, os ensaios podem descobrir agentes que podem inibir ou potenciar a produção dos polipéptidos da invenção a partir de células ou tecidos adequadamente manipulados. Portanto, no presente documento descreve-se um método para identificar compostos que se ligam aos polipéptidos da invenção que compreende as etapas de: (a) incubar um composto de ligação candidato com o polipéptido; e (b) determinar se ocorreu a ligação. Além disso, no presente documento descreve-se um método para identificar agonistas/antagonistas que compreende as etapas de: (a) incubar um composto candidato com o polipéptido, (b) testar uma atividade biológica, e (c) determinar se foi alterada uma atividade biológica do polipéptido.

Do mesmo modo, poderiam ser identificadas moléculas que se ligam a polipéptidos da invenção de maneira experimental usando as regiões de beta-lâmina contidas na sequência polipeptídica da proteína. Por conseguinte, no presente documento são descritos os polinucleótidos que codificam polipéptidos que compreendem ou como alternativa consistem em, a sequência de aminoácido de cada região de beta-lâmina numa sequência polipeptídica divulgada. Adicionalmente, no presente documento são descritos polipéptidos que compreendem, ou como alternativa consistem em, a sequência de aminoácido de cada uma das regiões de beta lâmina numa das sequências polipéptídicas da invenção. Adicionalmente, no presente documento são descritos polipéptidos que compreendem, ou como alternativa consistem em, qualquer combinação ou todas as regiões de beta lâmina numa das sequências polipéptídicas da invenção.

Rastreio de fármacos

Além disso contempla-se a utilização dos polipéptidos da presente invenção, ou dos polinucleótidos que codificam estes polipéptidos, para rastrear moléculas que modificam as atividades dos polipéptidos da presente invenção. 0 dito método poderia incluir por em contacto o polipéptido da presente invenção com um composto selecionado que se suspeita que tem atividade antagonista ou agonista, e testar a atividade destes polipéptidos depois da ligação.

Esta invenção é particularmente útil para rastrear compostos terapêuticos usando os polipéptidos da presente invenção, ou fragmentos de ligação dos mesmos, em quaisquer de uma diversidade de técnicas de rastreio de fármacos. 0 polipéptido ou fragmento usado no dito ensaio pode ser fixado a um suporte sólido, expressado sobre uma superfície celular, estar livre em solução, ou localizado intracelularmente. Um método de rastreio de fármacos utiliza células hospedeiras eucariotas ou procariotas que se transformam de maneira estável com ácidos nucleicos recombinantes que expressam o polipéptido ou fragmento. Os fármacos são rastreados contra as ditas células transformadas em ensaios de ligação competitiva. Pode ser medida, por exemplo, a formulação de complexos entre o agente que está a ser testado e um polipéptido da presente invenção.

Portanto, no presente documento são descritos métodos para rastrear agentes que afetam a atividades mediadas pelos polipéptidos da presente invenção. Estes métodos compreendem por em contacto o dito agente com um polipéptido da presente invenção ou um fragmento do mesmo e testar a presença de um complexo entre o agente e o polipéptido ou um fragmento do mesmo, por meio de métodos bem conhecidos na técnica. No dito ensaio de ligação competitiva, os agentes a serem rastreados estão tipicamente marcados. Após a incubação, o agente livre separa-se do presente em forma ligada, e a quantidade de marcador livre ou não complexado é uma medida da capacidade de um agente particular para se ligar aos polipéptidos da presente invenção.

Outra técnica para rastreio de fármacos proporciona rastreio de alto rendimento de compostos que têm afinidade de ligação adequada para os polipéptidos da presente invenção, e descreve-se em grande detalhe no Pedido de Patente Europeia 84/03564, publicada em 13 de setembro de 1984. Dito brevemente, são sintetizados grandes quantidades de diferentes compostos de ensaio peptídicos pequenos sobre um substrato sólido, tais como pontas de plástico ou alguma outra superfície. Os compostos de ensaio peptídicos são feitos reagir com polipéptidos da presente invenção e são lavados. Os polipéptidos ligados depois detetam-se por meio de métodos bem conhecidos na técnica. Os polipéptidos purificados são recobertos diretamente sobre placas para utilização nas técnicas de rastreio de fármacos anteriormente mencionadas. Além disso, podem ser utilizados anticorpos não neutralizantes para capturar o péptido e imobiliza-lo sobre o suporte sólido.

Também se contempla no presente documento a utilização de ensaios competitivos de rastreio de fármacos nos quais os anticorpos neutralizantes capazes de se ligar a polipéptidos da invenção competem especificamente com um composto de ensaio pela ligação aos polipéptidos ou fragmentos dos mesmos. Deste modo, são utilizados os anticorpos para detetar a presença de qualquer péptido que comparta um ou mais epítopos antigénicos com um polipéptido da invenção.

Os polipéptidos de PCSK9b ou PCSK9c humanos da presente invenção, ou os fragmentos ou oligopéptidos imunogénicos dos mesmos podem ser utilizados para rastrear fármacos ou compostos terapêuticos numa diversidade de técnicas de rastreio de fármacos. O fragmento usado no dito ensaio de rastreio pode estar livre em solução, fixado a um suporte sólido, portado sobre uma superfície celular, ou estar localizado intracelularmente. Pode ser medida a redução ou a abolição da atividade de formação de compostos de ligação entre a proteína de canal de iões e o agente que está sendo testado. Portanto, no presente documento descreve-se um método para rastrear ou testar uma diversidade de compostos para sua afinidade de ligação especifica com um polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c desta invenção, ou um fragmento peptidico ligável descrito no presente documento, que compreende proporcionar uma diversidade de compostos, combinar o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c, ou um fragmento peptidico ligável, com cada um de uma diversidade de compostos durante um tempo suficiente como para permitir a ligação em condições adequadas e detetar a ligação do polipéptido ou péptido de PCSK9b ou PCSK9c a cada um da diversidade de compostos de ensaio, identificando deste modo os compostos que se ligam especificamente ao polipéptido ou péptido de PCSK9b ou PCSK9c.

Os métodos para identificar compostos que modulam a atividade dos novos polipéptidos e/ou péptidos de PCSK9b ou PCSK9c são descritos no presente documento e compreendem combinar um composto ou fármaco potencial ou candidato modulador da atividade biológica de calpaína com um polipéptido ou péptido de PCSK9b ou PCSK9c, por exemplo, a sequência de aminoácidos de PCSK9b ou PCSK9c tal como é exposto em SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N°: 4, e medir um efeito do composto ou fármaco candidato modulador sobre a atividade biológica do polipéptido ou péptido de PCSK9b ou PCSK9c. Os ditos efeitos mensuráveis incluem, por exemplo, a interação de ligação física; a capacidade para clivar um substrato de calpaína adequado; efeitos numa linha celular nativa e clonada que expressa PCSK9b ou PCSK9c; e efeitos de moduladores ou outras medidas fisiológicas mediadas por calpaína.

Outro método para identificar compostos que modulam a atividade biológica dos novos polipéptidos de PCSK9b ou PCSK9c da presente invenção compreende combinar um composto ou fármaco potencial ou candidato a modulador de uma atividade biológica de calpaína com uma linha celular hospedeira que expressa o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c e medir um efeito do composto ou fármaco candidato a modulador na atividade biológica do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c. A célula hospedeira também pode ser capaz de ser induzido para expressar o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c, por exemplo, por meio de expressão induzivel. Também podem ser medidos os efeitos fisiológicos de um candidato a modulador dado no polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c. Portanto, os ensaios celulares para moduladores de calpaina particulares podem ser bem a medição direta ou quantificação da atividade biológica física do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c, ou podem ser a medida ou quantificação de um efeito fisiológico. Os ditos métodos utilizam preferentemente um polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c tal como são descritos no presente documento, ou um polipéptido recombinante de PCSK9b ou PCSK9c sobreexpressado em células hospedeiras adequadas que contêm um vetor de expressão tal como descreve-se no presente documento, no que o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c é expresso, sobreexpressa, ou sofre expressão regulada positivamente.

Além disso, no presente documento descreve-se um método para rastrear um composto que é capaz de modular a atividade biológica de um polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c, compreendendo o método proporcionar uma célula hospedeira que contém um vetor de expressão que porta uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c, ou uma porção peptídica funcional dos mesmos (por exemplo, SEQ ID N°: 2 ou SEQ ID N° : 4); determinar a atividade biológica do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c expressado em ausência de um composto modulador; por em contacto a célula com o composto modulador e determinar a atividade biológica do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c expressado em presença do composto modulador. No dito método, uma diferencia entre a atividade do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c em presença do composto modulador e em ausência do composto modulador indica um efeito modulador do composto.

Essencialmente, qualquer composto químico pode ser empregado como um modulador ou ligando potencial nos ensaios descritos no presente documento. Os compostos testados como moduladores de calpaína podem ser qualquer composto químico pequeno, ou entidade biológica (por exemplo, proteína, açúcar, ácido nucleico, lípido). Os compostos de ensaio serão tipicamente moléculas químicas e péptidos pequenos. Em geral, os compostos usados como moduladores potenciais podem ser dissolvidos em soluções aquosas ou orgânicas (por exemplo, baseadas em DMSO). Os ensaios são projetados para rastrear grandes bibliotecas de químicos automatizando as etapas de ensaio e proporcionando compostos de qualquer fonte conveniente. Os ensaios são executados tipicamente em paralelo, por exemplo, em formatos de microtitulação em placas de microtitulação em ensaios robotizados. Existem muitos provedores de compostos químicos, incluindo Sigma (St. Louis, MO), Aldrich (St. Louis, MO), Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Fluka Chemika-Biochemica Analytika (Buchs, Suiza), por exemplo. Do mesmo modo, podem ser sintetizados compostos por meio de métodos conhecidos na técnica.

As metodologias de rastreio de alto rendimento estão particularmente previstas para a deteção de moduladores dos novos polinucleótidos e polipéptidos de PCSK9b ou PCSK9c descritos no presente documento. Os ditos métodos de rastreio de alto rendimento implicam tipicamente proporcionar uma biblioteca química ou peptídica combinatória que contém um grande número de compostos terapêuticos potenciais (por exemplo, ligandos ou compostos moduladores). As ditas bibliotecas químicas combinatórias ou bibliotecas de ligandos são rastreadas então em um ou mais ensaios para identificar a aqueles membros da biblioteca (por exemplo, espécies ou subclasses químicas particulares) que mostram uma atividade caracteristica desejada. Os compostos identificados deste modo podem servir como compostos líder convencionais, ou podem ser utilizados por si mesmos como agentes terapêuticos potenciais ou reais.

Uma biblioteca química combinatória é uma coleção de diversos compostos químicos gerados bem por meio de síntese química ou bem por meio de síntese biológica, combinando uma série de blocos de construção químicos (isto é, reagentes, tais como aminoácidos) . Como exemplo, uma biblioteca combinatória linear, por exemplo, uma biblioteca polipeptídica ou peptídica, forma-se combinando um conjunto de blocos de construção químicos de cada uma das formas possíveis para um comprimento de composto dado (isto é, o número de aminoácidos num composto polipeptídico ou peptídico). Podem ser sintetizados milhões de compostos químicos por meio da dita mistura combinatória de blocos de construção químicos. A preparação e rastreio de bibliotecas químicas combinatórias conhece-se bem pelos peritos na especialidade pertinente. As bibliotecas combinatórias incluem, sem limitação, bibliotecas peptídicas (por exemplo, Patente US N° 5,010,175; Furka, 1991, Int. J. Pept. Prot. Res. , 37:487-493; e Houghton et al., 1991, Nature, 354:84-88). Também podem ser utilizados outras químicas para gerar bibliotecas de diversidade química. Os exemplos não limitantes de químicas de biblioteca de diversidade química incluem, péptidos (publicação PCT N° WO 91/019735), péptidos codificados (publicação PCT N° WO 93/20242), bio-oligómeros aleatoriamente (publicação PCT N° WO 92/00091), benzodiacepinas (Patente US N° 5.288.514), diversómeros, tais como hidantoínas, benzodiacepinas e dipéptidos (Hobbs et al. , 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90:6909-6913), polipéptidos vinílogos (Hagihara et al., 1992, J. Amer. Chem. Soc., 114:6568), peptidomiméticos não peptídicos com estrutura de glicose (Hirschmann et al., 1992, J. Amer. Chem. Soc., 114:9217-9218), síntese orgânica análoga de bibliotecas de compostos pequenos (Chen et al. , 1994, J. Amer. Chem. Soc., 116:2661), oligocarbamatos (Cho et al., 1993, Science, 261:1303), e/ou peptidil fosfonatos (Campbell et al., 1994, J. Org. Chem., 59:658), bibliotecas de ácidos nucleicos (veja-se Ausubel, Berger e Sambrook, todos citados anteriormente), bibliotecas de ácidos peptidonucleicos (Patente US N° 5.539.083), bibliotecas de anticorpos (por exemplo, Vaughn et al., 1996, Nature Biotechnology, 14(3):309-314) e o documento PCT/US96/10287), bibliotecas de hidratos de carbono (por exemplo, Liang et al. , 1996, Science, 274-1520-1522) e a Patente US N° 5.593.853), bibliotecas de moléculas orgânicas pequenas (por exemplo, benzodiacepinas, Baum C&EM, 18 de janeiro de 1993, página 33; e a Patente US N° 5.288.514; isoprenoides, a Patente US N° 5.569.588; tiazolidinonas e metatiazanonas, a Patente US N° 5.549.974; pirrolidinas, as Patentes US com números 5.525.735 e 5.519.134, compostos morfolino, a Patente US N° 5.506.337; e semelhantes).

Os dispositivos para a preparação de bibliotecas combinatórias estão disponíveis comercialmente (por exemplo, 357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville KY; Symphony, Rainin, Woburn, MA; 433A Applied Biosystems, Foster City, CA; 9050 Plus, Millipore, Bedford, MA) . Além disso, existe um grande número de bibliotecas combinatórias comercialmente disponíveis (por exemplo, ComGenex, Princeton, NJ; Asinex, Moscú, Rusia; Tripos, Inc., St. Louis, MO; ChemStar, Ltd., Moscú, Rusia; 3D Pharmaceuticals, Exton, PA; Martek Biosciences, Columbia, MD, e semelhantes).

No presente documento são descritos ensaios in vitro baseados em fase sólida num formato de alto rendimento, onde a célula ou tecido que expressa um canal de iões se liga a um substrato de fase sólida. Nos ditos ensaios de alto rendimento, é possível rastrear até vários centenas de moduladores ou ligandos diferentes num único dia. Em particular, pode ser usado cada poço de uma placa de microtitulação para levar a cabo um ensaio individual contra um modulador potencial selecionado ou, vao ser observados os efeitos da concentração ou do tempo de incubação, cada 5-10 poços podem testar um somente modulador. Portanto, uma única placa de microtitulação convencional pode testar cerca de 96 moduladores. Se forem utilizadas placas de 1536 poços, uma única placa pode testar facilmente entre cerca de 100 até cerca de 1500 compostos diferentes. É possível testar várias placas diferentes ao dia; portanto, por exemplo, são possíveis ensaios de rastreio de até cerca de 6.000-20.000 compostos diferentes usando os sistemas integrados descritos.

No presente documento são descritos ensaios de rastreio e de deteção de moléculas pequenas (por exemplo, fármacos) que implicam a deteção ou identificação de moléculas pequenas que podem se ligar a uma proteína dada, isto é, um polipéptido ou péptido de PCSK9b ou PCSK9c. Preferem-se particularmente ensaios adequados para metodologias de rastreio de alto rendimento.

Nos ditos ensaios de deteção, identificação ou rastreio baseados na ligação, não se requer tipicamente um ensaio funcional. Tudo o que é necessário é uma proteína alvo, preferentemente substancialmente purificada, e uma biblioteca ou painel de compostos (por exemplo, ligandos, fármacos, moléculas pequenas) ou de entidades biológicas que vão ser rastreados e testados para a ligação à alvo proteica. Preferentemente, a maioria das moléculas que se ligam à proteína alvo modularão a atividade de algum modo, devido à ligação preferencial de maior afinidade a áreas funcionais ou locais sobre a proteína.

Um exemplo do dito ensaio é o ensaio de permuta térmico baseado em fluorescência (3-Dimensional Pharmaceuticals, Inc., 3DP, Exton, PA) e descrito nas Patentes US N° 6.020.141 e 6.036.920 de Pantoliano et al.; veja-se também, J. Zimmerman, 2000, Gene. Eng. News, 20(8)) . O ensaio permite a deteção de moléculas pequenas (por exemplo, fármacos, ligandos) que se ligam a polipéptido de canal iónico expressado e preferentemente purificado com base em determinações de afinidade de ligação analisando curvas de desdobramento térmico de complexos de proteina-fármaco ou ligando. Os fármacos ou moléculas de ligação determinados por meio desta técnica podem ser testados além disso, se for desejado, por meio de métodos, tais como aqueles descritos no presente documento, para determinar se as moléculas afetam ou modulam a função ou atividade da proteína alvo.

Para purificar um polipéptido ou péptido de PCSK9b ou PCSK9c para medir uma ligação biológica ou uma atividade de ligação de ligando, a fonte pode ser um lisado de células completas que pode ser preparado por meio de sucessivos ciclos de congelamento-descongelamento (por exemplo, de um a três) em presença de inibidores da protease padrão. O polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c pode ser purificado parcialmente ou totalmente por meio de métodos de purificação de proteínas padrão, por exemplo, cromatografia de afinidade usando anticorpos específicos descritos mais adiante, ou por meio de ligandos específicos para um marcador epitópico projetado na molécula de polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c recombinante, também tal como descreve-se no presente documento. Então pode ser medida a atividade de ligação tal como foi descrita.

Preferem-se os compostos que se identificam de acordo com os métodos proporcionados no presente documento, e que modulam ou regulam a atividade biológica ou a fisiologia dos polipéptidos de PCSK9b ou PCSK9c de acordo com a presente invenção. Contempla-se que os ditos compostos moduladores possam ser usados em métodos de tratamento e terapêuticos para tratar uma condição patológica que está mediada pelos novos polipéptidos de PCSK9b ou PCSK9c administrando a um indivíduo que necessite o dito tratamento uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto identificado por meio dos métodos descritos no presente documento.

Além disso, no presente documento são descritos métodos para tratar a um indivíduo que necessite o dito tratamento para uma doença, distúrbio ou condição patológica que está mediada pelos polipéptidos de PCSK9b ou PCSK9c, que compreendem administrar ao indivíduo uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto modulador de PCSK9b ou PCSK9c identificado por meio de um método proporcionado no presente documento. (Antagonistas) antisense e ribozimas

Os antagonistas descritos no presente documento podem ser ácidos nucleicos que correspondem às sequências contidas em SEQ ID N° : X, ou a cadeia complementar dos mesmos, e/ou sequências nucleotidicas contidas num clone depositado. A sequência antisense pode ser gerada internamente pelo organismo, ou, pode ser administrada por separado a sequência antisense (veja-se, por exemplo, O'Connor, Neurochem., 56:560 (1991). Oligodeoxynucleotides as Antisense Inibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988). Pode ser usada tecnologia antisense para controlar a expressão génica por meio de ADN ou ARN antisense, ou por meio da formação de tripla hélice. As técnicas antisense são discutidas, por exemplo, em Okano, Neurochem., 56:560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inibitors of Gene Expression, CRC Press, Boca Raton, FL (1988) . A formação de tripla hélice discute-se em, por exemplo, Lee et ai., Nucleic Acids Research, 6:3073 (1979); Cooney et ai., Science, 241:456 (1988); e Dervan et ai., Science, 251:1300 (1991) . Os métodos baseiam-se na ligação de um polinucleótido a um ADN ou ARN complementar.

Por exemplo, foi descrito anteriormente a utilização de construções de ARN antisense de c-myc e c-myb para inibir o crescimento da línea celular de leucemia não linfocítica HL-60 e outras linhas celulares. (Wickstrom et ai. (1988); Anfossi et ai. (1989)). Estas experiências foram levadas a cabo in vitro incubando células com o oligorribonucleótido. no documento WO 91/15580 se descreve um procedimento similar para utilização in vivo. Em resumo, é produzido do modo seguinte um par de oligonucleótidos para um ARN antisense dado: Se flanquea uma sequência complementar a as primeiras 15 bases do grelha de leitura aberta por um sitio de EcoRl no extremo 5' e n sitio de HindIII no extremo 3'. A seguir, o par de oligonucleótidos é aquecido a 90 °C durante um minuto e depois é hibridado em tampão de ligamento 2X (TRIS HC1 20 mM pH 7,5, MgC12 10 mM, ditiotreitol 10 mM (DTT) e ATP 0,2 mM) e depois ligam-se ao sitio de EcoRl/Hind III do vetor retroviral PMV7 (documento WO 91/15580).

Por exemplo, a porção 5' codificante de um polinucleótido que codifica o polipéptido maduro da presente invenção pode ser usado como um oligonucleótido de ARN antisense de desde aproximadamente 10 a 40 pares de bases de longitud. Se disena um oligonucleótido de ADN para que seja complementar a uma região do gene implicado na transcrição, evitando deste modo a transcrição e a produção do recetor. O oligonucleótido de ARN antisense híbrida com o ARNm in vivo e bloqueia a tradução da molécula de ARNm no polipéptido recetor. O ácido nucleico antisense da invenção pode ser produzido intracelularmente por meio de transcrição a partir de uma sequência exógena. Por exemplo, é transcritoe um vetor ou uma porção do mesmo, produzindo um ácido nucleico antisense (ARN) da invenção. O dito vetor conterá uma sequência que codifica o ácido nucleico antisense da invenção. 0 dito vetor pode permanecer epissómico ou ser integrado cromossomicamente, desde que possa ser transcrito para produzir em ARN antisense desejado. Os ditos vetores podem ser cosntruidos por meio de métodos de tecnologia de ADN recombinante padrão na técnica. Os vetores podem ser plasmidicos, virais, ou outros conhecidos na técnica, usados para a replicação e expressão em células de vertebrado. A expressão da sequência que codifica um polipéptido da invenção, ou fragmentos das mesmas, pode ser por meio de qualquer promotor conhecido na técnica que aja em células de vertebrados, preferentemente de ser humano. Os ditos promotores podem ser induziveis ou constitutivos. Os ditos promotores incluem, mas sem limitação, a região promotora precoce de SV40 (Bernoist e Chambon, Nature, 29:304-310 (1981), o promotor contido na repetição terminal larga 3' do virus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al. , Cell, 22:787-797 (1980), o promotor de timidina de herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. EE.UU., 78:1441-1445 (1981), as sequências reguladoras do gene de metalotioneína (Brinster et al., Nature, 296:39-42 (1982)), etc.

Os ácidos nucleicos antisense da invenção compreendem uma sequência complementaria a pelo menos uma porção de um transcrito de ARN de um gene de interesse. No entanto, a complementaridade absoluta, embora seja preferida, não é necessária. Uma sequência "complementar a pelo menos uma porção de um ARN" citada no presente documento, significa uma sequência que tem suficiente complementaridade como para ser capaz de hibridizar com o ARN, formando um dúplex estável; no caso dos ácidos nucleicos antisense de cadeia dupla da invenção, pode ser testado portanto uma única cadeia do ADN de cadeia dupla, ou pode ser testado a formação de tripla cadeia. A capacidade para hibridizar dependerá tanto do grau de complementaridade como do comprimento do ácido nucleico antisense. Geralmente, quanto mais longo seja o ácido nucleico hibridizante, poderá conter mais desemparelhamentos de bases com uma sequência de ARN da invenção e ainda assim formar um dúplex estável (ou uma tripla cadeia conforme seja o caso) . Um perito na especialidade pode determinar um grau tolerável de desemparelhamento usando procedimentos padrão para determinar o ponto de fusão do complexo hibridizado.

Os oligonucleótidos que são complementares com a extremidade 5' da mensagem, por exemplo, a sequência 5' não traduzida até e incluindo o codão de iniciação AUG, devem funcionar de uma maneira o mais eficaz na inibição da tradução. No entanto, as sequências complementares às sequências 3' não traduzidas dos ARNm demonstraram ser eficazes para inibir também a tradução dos ARNm. Vejam-se de maneira geral, Wagner, R., Nature, 372:333-335 (1994). Portanto, podem ser usados oligonucleótidos complementares às regiões 5' ou 3' não traduzidas e não codificantes de uma sequência polinucleotidica da invenção numa estratégia antisense para inibir a tradução de ARNm endógeno. Os oligonucleótidos complementares com a região 5 ' não traduzida do ARNm devem incluir o complemento do codão de inicio AUG. Os oligonucleótidos complementares a regiões codificantes de ARNm são inibidores menos eficazes da tradução mas podem ser usados de acordo com a invenção. Já estejam projetados para hibridar com a região 5', 3' ou codificante do ARNm, os ácidos nucleicos antisense devem ser de pelo menos seis nucleótidos de comprimento, e são preferentemente oligonucleótidos que variam entre 6 e 50 nucleótidos de comprimento. Em aspetos específicos, o oligonucleótido é de pelo menos 10 nucleótidos, pelo menos 17 nucleótidos, pelo menos 25 nucleótidos pelo menos 50 nucleótidos.

Os oligonucleótidos antisense podem ser de cadeia única ou dupla. Os ARN de cadeia dupla podem ser projetados com base nos ensinamento de Paddison et al., Proc. Nat. Acad. Sei., 99:1443-1448 (2002) . e nas Publicações

Internacionais N° WO 01/29058, e WO 99/32619.

No presente documento contemplam-se especificamente reagentes de ARNpi. Os ditos reagentes são úteis para inibir a expressão dos polinucleótidos da presente invenção e podem ter eficácia terapêutica. Conhecem-se vários métodos na técnica para o tratamento terapêutico de distúrbios por meio da administração de reagentes de ARNpi. Um dos ditos métodos descreve-se por Tiscornia et ao (PNAS, 100(4):1844-1848 (2003)); W00409769, apresentado em 18 de julho de 2003; e Reich SJ et al., Mol Vis. 2003 30 de maio; 9:210-6.

Os polinucleót idos da invenção podem ser ADN, ARN ou misturas quiméricas ou derivados ou versões modificadas dos mesmos, de cadeia únicas ou de cadeia dupla. O oligonucleótido pode ser modificado no resíduo da base, resíduo do açúcar, ou estrutura de fosfato, por exemplo, para melhorar a estabilidade da molécula, a hibridização, etc. O oligonucleótido pode incluir outros grupos ligados, tais como péptidos (por exemplo, para dirigir recetores da célula hospedadora in vivo), ou agentes que facilitam o transporte através da membrana celular (veja-se, por exemplo, Letsinger et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. OU.S.A. 86:6553-6556 (1989). Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sei., 84:648-652 (1987). Publicação PCT N° : W088/09810, publicada em 15 de diciembre de 1988) ou a barreira hematoencefálica (veja-se, por exemplo, Publicação PCT N° : WO89/10134, publicada em 25 de abril de 1988), agentes de clivagem ativados por hibridização, (Veja-se, por exemplo, Krol et al. , BioTechniques, 6:958-976 (1988)) ou agentes intercalantes, (Veja-se, por exemplo, Zon, Pharm. Res. , 5:539-549 (1988)). Para este fim, o oligonucleót ido pode ser conjugado a outra molécula, por exemplo, um péptido, um agente reticulante ativado por hibridização, um agente de transporte, um agente de clivagem ativado por hibridização, etc. 0 oligonucleótido antisense pode compreender pelo menos um resíduo de base modificada que é selecionado a partir do grupo que inclui, mas sem limitação, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-iodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopentiladenina, 1-metilguanina, 1-metil-inosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, metiléster do ácido uracil-5-oxiacético, ácido uracil-5-oxiacético (v) , 5-metil-2-tiouracilo, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil) uracilo, (acp3)w, e 2,6-diaminopurina. 0 oligonucleótido antisense também pode compreender pelo menos um resíduo de açúcar modificado selecionado a partir do grupo que inclui, mas sem limitação, arabinose, 2-fluoroarabinose, xilulose, e hexose. 0 oligonucleótido antisense pode compreender pelo menos uma estrutura de fosfato modificada selecionada a partir do grupo que inclui, mas sem limitação, um fosforotioato, um fosforoditioato, um fosforamidotioato, um fosforamidato, um fosfordiamidato, um metilfosfonato, um fosfotriéster de alquilo, e um formacetal ou análogo do mesmo. 0 oligonucleótido pode ser um oligonucleótido a-anomérico. Um oligonucleótido α-anomérico forma híbridos de cadeia dupla específicos com ARN complementar em que, ao contrario que as unidades b habituais, as cadeias se situam em paralelo entre si (Gautier et ai., Nucl. Acids Res., 15:6625-6641 (1987)). 0 oligonucleótido é um 2-0-metilribonucleótido (Inoue et al., Nucl. Acids Res., 15:6131-6148 (1987)), ou um análogo de ARN-ADN quimérico (Inoue et al., FEBS Lett. 215:327-330 (1987)).

Os polinucleótidos da invenção podem ser sintetizados por meio de métodos padrão conhecidos na técnica, por exemplo, por meio da utilização de sintetizadores de ADN automatizados (tais como os comercialmente disponíveis através de Biosearch, Applied Biosystems, etc.). A modo de exemplo, os oligonucleótidos de fosforotioato podem ser sintetizado por meio do método de Stein et al. (Nucl. Acids Res., 16:3209 (1988)), os oligonucleótidos de metilfosfonato podem ser preparados por meio da utilização de soportes poliméricos de vidro de poro controlado (Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 85:7448-7451 (1988)), etc.

Embora podem ser usados os oligonucleótidos antisense complementares à sequência da região codificante da invenção, preferem-se aqueles complementares à região não traduzida transcrita.

Os antagonistas potenciais tal como descrevem-se no presente documento também incluem ARN catalítico, ou uma ribozima (veja-se, por exemplo, a Publicação Internacional PCT WO 90/11364, publicada em 4 de outubro de 1990; Sarver et al, Science, 247:1222-1225 (1990) . Embora possam ser usadas ribozimas que clivam o ARNm em sequências de reconhecimento de sitio especifico para destruir os ARNm correspondentes aos polinucleótidos da invenção, prefere-se a utilização de ribozimas cabeça de martelo. As ribozimas cabeça de martelo clivam aos ARNm em localizações ditadas por regiões flanqueantes que formam pares de bases complementarias com o ARNm alvo. O único requisito é que o ARNm alvo tenha a seguinte sequência de duas bases: 5'-UG-3'. A construção e produção de ribozimas cabeça de martelo é bem conhecida na técnica e descreve-se em mais detalhe em Haseloff e Gerlach, Nature, 334:585-591 (1988) . Existem numerosos locais de clivagem de ribozimas cabeça de martelo potenciais em cada sequência nucleotidica divulgada no listado de sequências. Preferentemente, a ribozima é projetada por engenharia genética de tal forma que o local de reconhecimento de clivagem se localiza próximo à extremidade 5 ' do ARNm correspondente aos polinucleótidos da invenção; isto é, para aumentar a eficácia e minimizar a acumulação intracelular de transcritos de ARNm não funcionais.

Como na estratégia antisense, as ribozimas descritas no presente documento podem estar compostas de oligonucleótidos modificados (por exemplo, ara uma estabilidade, direcionamento, etc. melhorados) e devem ser administrados a células que expressam os polinucleótidos da invenção in vivo. As construções de ADN que codificam a ribozima podem ser introduzidas na célula do mesmo modo descrito anteriormente para a introdução de ADN codificante antisense. Um método preferido de administração implica usar uma construção de ADN que "codifica" a ribozima sob o controlo de um promotor constitutivo forte, tais como, por exemplo, o promotor de pol III ou pol II, de tal forma que as células transfectadas produzirão quantidades suficientes da ribozima para destruir mensagens endógenos e inibir a tradução. Já que as ribozimas, a diferencia das moléculas antisense, são catalíticas, se requer uma concentração intracelular menor para ter eficácia.

Os compostos antagonistas/agonistas podem ser utilizados para inibir os efeitos do crescimento celular e a proliferação dos polipéptidos da presente invenção em células e tecidos neoplásicos, isto é, estimulação da angiogénese de tumores, e, portanto, atrasar ou prevenir o crescimento e a proliferação celular anormal, por exemplo, na formação ou crescimento de tumores. 0 antagonista/agonista também pode ser utilizado para evitar doenças hipervasculares, e evitar a proliferação de células lenticulares epiteliais depois da cirurgia de cataratas extracapsular. A prevenção da atividade mitogénica dos polipéptidos da presente invenção também pode ser desejável em casos tais como a restenose depois da angioplastia com balão. 0 antagonista/agonista também pode ser usado para prevenir o crescimento de tecido de cicatrização durante a curao de feridas. 0 antagonista/agonista também pode ser usado para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar as doenças descritas no presente documento.

Portanto, no presente documento descreve-se um método para tratar ou prevenir doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas, incluindo, mas sem limitação, as doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas listadas ao longo da presente memória descritiva, associadas à sobreexpressão de um polinucleótido da presente invenção administrando a um paciente (a) uma molécula antisense dirigida ao polinucleótido da presente invenção, e/ou (b) uma ribozima dirigida ao polinucleótido da presente invenção.

Associações bióticas

Um polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista, tal como se descreve no presente documento pode aumentar a capacidade do organismo, de forma direta ou indireta, para iniciar e/ou manter associações bióticas com otros organismos. As ditas associações podem ser simbióticas, não simbióticas, endossimbióticas, macrossimbióticas, e/ou de natureza microssimbiótica. Em geral, um polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista tal como descreve-se no presente documento pode aumentar a capacidade do organismo para formar associações bióticas com qualquer membro dos reinos, filo, famílias, classes, géneros ou espécies bacterianas, de líquenes, de micorrizas, cianobacterianas, de dinoflagelados, e/ou de algas. 0 mecanismo por meio do qual um polinucleót ido ou polipéptido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista, tal como se descreve no presente documento pode aumentar a capacidade do organismo hospedeiro, de forma direta ou indireta, para iniciar e/ou manter associações bióticas é variável, embora possa incluir modular a osmolaridade até níveis desejados para o simbionte, modular o pH até níveis desejados para o simbionte, modular a secreção de ácidos orgânicos, modular a secreção de proteínas específicas, compostos fenólicos, nutrientes, ou a expressão aumentada de uma proteína necessária para as interações dos organismos hospedeiro-bióticos (por exemplo, um recetor, ligando, etc.). Conhecem-se mecanismos adicionais na técnica (veja-se, por exemplo, "Microbial Signalling and Communication", eds., R. England, G. Hobbs, N. Bainton, e D. McL. Roberts, Cambridge University Press, Cambridge, (1999)).

Como alternativa, um polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou urn agonista ou antagonista tal como se descreve no presente documento pode diminuir a capacidade do organismo hospedeiro para formar associações bióticas com outro organismo, de forma direta ou indireta. 0 mecanismo por meio do qual um polinucleót ido ou polipéptido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista, tal como se descreve no presente documento pode diminuir a capacidade do organismo hospedeiro, de forma direta ou indireta, para iniciar e/ou manter associações bióticas com outro organismo é variável, embora pode incluir modular a osmolalidade a níveis não desejados, modular o pH a níveis não desejados, modular a secreção de ácidos orgânicos, modular a secreção de proteínas específicas, compostos fenólicos, nutrientes, ou a expressão diminuída de uma proteína necessária para as interações dos organismos hospedeiro-bióticos (por exemplo, um recetor, ligando, etc.). Conhecem-se mecanismos adicionais na técnica e estão abrangidos pela invenção (veja-se, por exemplo, "Microbial Signalling and Communication", eds., R. England, G. Hobbs, N. Bainton, e D. McL. Roberts, Cambridge University Press, Cambridge, (1999)). A capacidade do hospedeiro para manter associações bióticas com um agente patogênico particular tem implicações significativas para a saúde geral e forma física do hospedeiro. Por exemplo, os hospedeiros humanos têm simbiose com bactérias entéricas em seus tratos gastrointestinais, particularmente no intestino delgado e grosso. De facto, as contagens bacterianos nas fezes do colon distal com frequência se aproximam a 1012 por mililitro de fezes. Os exemplos de flora intestinal no trato gastrointestinal são membros das enterobactérias, bacteriodes, além de estreptococos α-hemolíticos, E. coli, bifidobactéria, cocos anaeróbios, eubactéria, costridia, lactobacilos, e leveduras. As ditas bactérias, entre outras coisas, ajudam ao hospedeiro a assimilar nutrientes degradando alimentos que não são degradados tipicamente pelo sistema digestivo do hospedeiro, particularmente no intestino do hospedeiro. Portanto, aumentar a capacidade do hospedeiro para manter a dita associação biótica pode ajudar a garantir a nutrição adequada do hospedeiro.

As aberrações na população entérica bacteriana de mamíferos, particularmente seres humanos, foi associada aos seguintes distúrbios: diarreia, íleos, doença inflamatória crónica, obstrução intestinal, diverticulos duodenais, doença dos cálculos biliares, e malnutrição. Um polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista, tal como se descreve no presente documento são úteis para tratar, detetar, diagnosticar, pronosticar, e/ou melhorar, de forma direta ou indireta, quaisquer das doenças e/ou distúrbios anteriormente mencionados associados com a população de flora entérica aberrante. A composição da flora intestinal, por exemplo, baseia-se numa diversidade de fatores, que incluem, mas sem limitação, a idade, raça, a dieta, malnutrição, acidez gástrica, excreção de sais biliares, motilidade intestinal, e mecanismos imunes. Como resultado, os polinucleótidos e polipéptidos, incluindo agonistas, antagonistas e fragmentos dos mesmos, podem modular a capacidade de um hospedeiro para formar associações bióticas afetando, direta ou indiretamente, a pelo menos um ou mais de estos fatores.

Embora a flora intestinal predominante compreende organismos anaeróbios, uma percentagem subjacente representa aeróbios (por exemplo, E. coli. Isto é significativo já que os ditos aeróbios se convertem rapidamente nos organismos predominantes nas infeções intraabdominais, chagando a ser oportunistas de maneira eficaz no início da patogénese da infeção. Como resultado, há uma necessidade intrínseca de controlar populações aeróbias, particularmente para indivíduos imunocomprometidos.

Preferentemente, os polinucleótidos e polipéptidos, incluindo agonistas, antagonistas e fragmentos dos mesmos, são úteis para inibir as associações bióticas com organismos simbiontes entéricos específicos num esforço para controlar a população dos ditos organismos.

As associações bióticas sucedem não somente no trato gastrointestinal, mas também sobre e no tegumento. Em oposição à flora gastrointestinal, a flora cutânea está composta praticamente a partes iguais entre organismos aeróbios e anaeróbios. Os exemplos de flora cutânea são membros dos cocos Gram-positivos (por exemplo, S. aureus, estafilococos negativos a coagulase, micrococos, M. sedentarius), bacilos gram positivos (por exemplo, especies de Corynebacterium, C. minutissimum, espécies de Brevibacterium, espécies de Propoionibacterium, P.acnes), bacilos Gram-negativos (por exemplo, espécies de Acinebacter) , e fungos (Pityrosporum orbiculare) . 0 número relativamente baixo de flora associada ao tegumento baseia-se na incapacidade de muitos organismos para se aderir à pele. Os organismos citados anteriormente adquiriram esta capacidade única. Portanto, os polinucleótidos e polipéptidos da presente invenção podem ter usos que incluem modular a população da flora cutânea, de forma direta ou indireta.

As aberrações na flora cutânea são associadas a um número significativo de doenças e/ou distúrbios, que incluem, mas sem limitação, os seguintes: impetigo, ectima, dactulite distal bullosa, pústulas, foliculite, abscessos cutâneos, queratólise picada, tricomicose axillaris, complexo de dermatoficose, olor axilar, eritrasma, odor de pés similar ao queijo, acne, Pitiriase versicolor, dermatite seborreica, e foliculite por fitoesporas, por nomear apenas alguns. Um polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista, tal como se descreve no presente documento são úteis para tratar, detetar, diagnosticar, prognosticar, e/ou melhorar, de forma direta ou indireta, quaisquer das doenças e/ou distúrbios anteriormente mencionados associados à população de flora cutânea aberrante.

As associações bióticas adicionais, incluindo doenças e distúrbios associados com o crescimento aberrante das ditas associações, conhecem-se na técnica e estão abrangidas por a invenção. Veja-se, por exemplo, "Infectious Disease", segunda edição, Eds., S.L., Gorbach, J.G., Bartlett, e N.R., Blacklow, W.B., Saunders Company, Filadélfia, (1998)) .

Feromonas

Em outra forma de realização, um polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou urn agonista ou antagonista, tal como se descreve no presente documento pode aumentar a capacidade de um organismo para sintetizar e/ou libertar uma feromona. A dita feromona pode, por exemplo, alterar o comportamento e/ou metabolismo de um organismo.

Um polinucleótido ou polipéptido da presente invenção e/ou um agonista ou antagonista, tal como se descreve no presente documento pode modular a biossíntese e/ou libertação de feromonas, a capacidade do organismo para responder a as feromonas (por exemplo, condutualmente, e/ou metabolicamente), e/ou a capacidade do organismo para detetar feromonas. Preferentemente, quaisquer das feromonas, e/ou agentes voláteis libertados pelo organismo, ou induzidos por um polinucleótido ou polipéptido da invenção e/ou um agonista ou antagonista tal como se descreve no presente documento têm efeitos condutuais no organismo.

Outras atividades 0 polipéptido da presente invenção, como resultado da capacidade para estimular o crescimento de células endoteliais vasculares, pode ser usaod no tratamento para estimular a revascularização de tecidos isquémicos devido a varias patologias, tais como trombose, arteriosclerose, e outras condições patológicas cardiovasculares. Estes polipéptidos podem ser utilizados também para estimular a angiogénese e a regeneração de extremidades, conforme foi discutido anteriormente. 0 polipéptido também pode ser utilizado para tratar feridas devido a lesões, queimaduras, reparação pós-operatória de tecidos, e úlceras já que são mitogénicos para varias células de diferentes origens, tais como fibroblastos e células do músculo esquelético, e portanto, facilitam a reparação ou a substituição do tecido danificado ou enfermo. 0 polinucleótido da presente invenção também pode ser usado para estimular o crescimento neuronal e para tratar, prevenir, e/ou diagnosticar o dano neuronal que sucede em determinados distúrbios neuronais ou condições patológicas neurodegenerativas, tais como a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, e o complexo relacionado com o SIDA. 0 polipéptido da invenção pode ter a capacidade de estimular o crescimento de condrócitos, portanto, pode ser usado para potenciar a regeneração óssea e periodontal e ajudar em os transplantes de tecido ou enxertos ósseos.

Os polipéptidos da presente invenção podem ser utilizados para estimular o crescimento e a diferenciação das células hematopoiéticas e das células de medula óssea quando usam-se em combinação com outras citocinas. 0 polipéptido da invenção também pode ser usado para manter os órgãos antes do transplante ou para suportar a cultura celular de tecidos primários. 0 polipéptido da presente invenção também pode ser usado para induzir a diferenciação de tecido de origem mesodérmico nos embriões precoces. 0 polipéptido ou os polinucleótidos da presente invenção e/ou os agonistas ou antagonistas descritos no presente documento também podem aumentar ou diminuir a diferenciação ou proliferação de células estaminais embrionárias, além disso de, tal como foi discutido anteriormente, de linhagem hematopoiético. 0 polipéptido ou os polinucleótidos da presente invenção e/ou os agonistas ou antagonistas descritos no presente documento também podem ser usados para modular caracteristicas de mamíferos, tais como altura corporal, peso, color do pelo, color de olhos, pele, percentagem de tecido adiposo, pigmentação, tamanho, e forma (por exemplo, cirurgia cosmética). De maneira similar, os polipéptidos ou polinucleótidos da presente invenção e/ou os agonistas ou antagonistas tal como é descrito no presente documento podem ser usados para modular o metabolismo de mamíferos que afeta ao catabolismo, anabolismo, processamento, utilização e armazenamento da energia.

Os polipéptidos ou polinucleótidos da presente invenção e/ou os agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento podem ser usados para alterar o estado mental ou físico influenciando os biorritmos, os ritmos circadianos, a depressão (incluindo doenças, distúrbios, e/ou condições patológicas depressivas), tendência à violência, tolerância à dor, capacidades reprodutivas (preferentemente por meio de atividade similar à de ativina ou inibina), níveis hormonais ou endócrinos, apetite, libido, memória, estresse, ou outras qualidades cognitivas.

Os polipéptidos ou polinucleótidos da presente invenção e/ou os agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento também podem ser usados para preparar a indivíduos para viagens fora da Terra, ambientes de baixa gravidade, exposição prolongada a níveis de radiação extraterrestres, níveis baixos de oxigénio, redução da atividade metabólica, exposição a agente patogênicos extraterrestres, etc. 0 dito utilização pode ser administrado bem antes de um evento extraterrestre, durante um evento extraterrestre, ou ambos. Além disso, a dita utilização pode dar como resultado uma série de permutas beneficiosos no recetor, tais como, por exemplo, qualquer um dos seguintes efeitos não limitantes: um nível aumentado de células hematopoiéticas, particularmente glóbulos vermelhos do sangue que poderia ajudar ao recetor a suportar níveis baixos de oxigénio; um nível aumentado de linfócitos B, linfócitos T, células apresentadoras de antigénios, e/ou macrófagos, que poderiam ajudar ao recetor a suportar a exposição a agente patogênicos extraterrestres, por exemplo; uma inibição temporal (isto é, reversível) da produção de células hematopoiéticas que poderia ajudar ao recetor a suportar a exposição a níveis de radiação extraterrestre; aumento e/ou estabilidade da massa óssea, que poderia ajudar ao recetor a suportar ambientes de baixa gravidade; e/ou um metabolismo diminuído que poderia facilitar de maneira eficaz a capacidade dos recetores para prolongar sua viagem extraterrestre por meio de qualquer um dos seguintes meios não limitantes: (i) ajudar ao recetor diminuindo suas necessidades energéticas diárias basais; (ii) diminuir de maneira eficaz o nível de estresse oxidativo e/ou metabólico no recetor (isto é, para permitir ao recetor suportar os níveis de radiação extraterrestre aumentados diminuindo o nível de dano interno oxidativo/metabólico adquirido durante os requisitos de energia basais normais; e/ou (iii) permitir que o recetor subsista a uma temperatura metabólica menor (isto é, ambiente criogénico e/ou subcriogénico).

Os polipéptidos ou polinucleótidos da presente invenção e/ou os agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento também podem ser usados para aumentar a eficácia de uma composição farmacêutica, de forma direta ou indireta. A dita utilização pode ser administrada em conjunção simultânea com o dito agente farmacêutico, ou de maneira separada por meio da mesma rota de administração ou uma diferente (por exemplo, intravenosa para o polinucleótido ou polipéptido da presente invenção, e oral para o agente farmacêutico, entre outras descritas no presente documento).

Os polipéptidos ou polinucleótidos da presente invenção e/ou os agonistas ou antagonistas tal como são descritos no presente documento também podem ser usados como aditivo ou conservante alimentar, tal como para aumentar ou diminuir as capacidades de armazenamento, conteúdo de gorduras, lípidos, proteína, hidratos de carbono, vitaminas, minerais, cofatores ou outros componentes nutricionais.

Também prefere-se um método para o tratamento de um indivíduo que necessita um nível aumentado de atividade de uma proteína, compreendendo o dito método administrar ao dito indivíduo uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade de um polipéptido isolado, polinucleótido, ou anticorpo da invenção reivindicada eficaz para aumentar o nível da dita atividade de proteína em o dito indivíduo.

Tendo descrito a invenção de maneira geral, a mesma será entendido mais facilmente com referência aos seguintes exemplos, que se proporcionam a modo de ilustração não pretendem ser limitantes. A cópia física da sequência A lista adjunto ao presente documento, além de seu correspondente formato legível por computador, são incorporados ao presente documento por referência em sua totalidade.

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EXEMPLOS

EXEMPLO 1 - MÉTODO DE CLONAGEM DO NOVO POLINUCLEÓTIDO DE PCSK9b HUMANO DA PRESENTE INVENÇÃO

Usando a sequência AK124635.1, projetou-se um oligo 80-mero sense com biotina na extremidade 5' com a seguinte sequência: 5'bGGCGCTTTCACCAGTGGCTGGGATGTGCTCTGTAGTTTCTGTGTGTTAACTAT AAGGTTGACTTTATGCTCATTCCCTCC—3' (SEQ ID P: 7)

Adicionou-se um microlitro (200 picogramas) do oligo biotinilado a seis microlitros (seis microgramas) de uma biblioteca de ADNc de cérebro circular fechada de cadeia simples antissense e sete microlitros de formamida a 100 % num tubo de PCR de 0,2 ml. A mistura aqueceu-se num ciclador térmico a 95 °C durante 2 minutos. Adicionaram-se catorze microlitros de tampão de hibridação 2X (formamida a 50 %, NaCl 1,5 M, NaP04 0, 04 M pH 7,2, EDTA 5 mM, SDS a 0,2 %) à mistura aquecida de sonda/biblioteca de ADNc e aquece-se a 42 °C durante 24 horas. Isolaram-se os híbridos entre o oligo biotinilado e o ADNc circular diluindo a mistura de hibridação até 228 microlitros numa solução que contém NaCl 1 M, Tris-HCl 10 mM pH7,5, EDTA 1 mM, pH 8,0 e adicionaram-se 125 microlitros de pérolas magnéticas de estreptavidina. Esta solução incubou-se a 42 °C durante 60 minutos misturando cada 5 minutos para ressuspender as pérolas. As pérolas foram separadas da solução com um imã e lavaram-se três vezes em 200 microlitros de SSPE 0,1 X, SDS a 0,1 % a 45 °C.

Os ADNc de cadeia simples libertaram-se do complexo de oligo biotinilado/pérola magnética de estreptavidina adicionando 50 microlitros de NaOH 0,1 Me incubando a temperatura ambiente durante 10 minutos. Adicionaram-se seis microlitros de acetato de sódio 3 M junto com 20 microgramas de glicogénio e a solução precipitou-se com etanol com 120 microlitros de etanol a 100 %. O ADN ressuspendeu-se em 12 microlitros de TE (Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 1 mM pH 8,0). O ADNc de cadeia simples converteu-se em cadeia dupla num ciclador térmico misturando 5 microlitros do ADN capturado com 1,5 microlitros de iniciador de reparação de sense génico especifico 10 micromolar com a seguinte sequência: 5'- CTAGGCCTCCCTTTCCTTGT -3' (SEQ ID N° : 13), e 1,5 microlitros de tampão de PCR 10X. A mistura aqueceu-se a 95 °C durante 20 segundos, depois arrefeceu-se gradualmente até 59 °C. Neste momento adicionaram-se 15 microlitros de uma mistura de reparação, que tinha sido pré-aquecido a 70 °C, (a mistura de reparação contém 0,5 microlitros de dNTP 10 mM (2,5 mM cada um), 1,5 microlitros de tampão de PCR 10X, 12,75 microlitros de água, e 0,25 microlitros ou 1,25 U de polimerase Taq) . Aqueceu-se de novo gradualmente a temperatura até 73 °C e incubou-se durante 23 minutos. O ADN reparado precipitou-se com etanol e ressuspendeu-se em 10 microlitros de TE. Eletroporaram-se dois microlitros em células DH12S de E. coli e as colónias resultantes exploraram-se por meio da PCR, usando um par de iniciadores projetado a partir da sequência AK124635,1, para identificar os ADNc adequados.

Oligos usados para identificar o ADNc por meio de PCR:

Exploraram-se 95 colónias, e um clone de ADNc deu positivo por meio da PCR. Obteve-se a sequência de comprimento total. A sequência nucleotidica de comprimento total e o polipéptido codificado para PCSK9b mostram-se nas Figuras 1A-C. A análise desta sequência indicou que era uma variante de proproteina convertase subtilisina/kexina de tipo 9 (PCSK9) .

EXEMPLO 2 - MÉTODO DE CLONAGEM DO NOVO POLINUCLEÓTIDO DE PCSK9c HUMANO DA PRESENTE INVENÇÃO

Utilizou-se um método praticamente idêntico ao método descrito no Exemplo 1 para clonar a variante PCSK9c com as exceções seguintes. A partir da sequência NM_174936,2, projetou-se um oligo 80-mero antissense com biotina na extremidade 5' com a seguinte sequência: 5'bTGGCAGGCGGCGTTGAGGACGCGGCTGTACCCACCCGCCAGGGGCAGCAGCA CCACCAGTGGCCCCACAGGCTGGACCA -3' (SEQ ID P: 14). e hibridou-se com uma biblioteca de ADNc sense de cérebro/testiculo circular fechada covalentemente de cadeia simples tal como foi descrito anteriormente. Depois da libertação do complexo oligo biotinilado/pérola magnética de estreptavidina, o ADNc precipitou-se tal como foi descrito anteriormente. 0 ADNc de cadeia simples converteu-se em cadeia dupla tal como foi descrito anteriormente exceto que foi usado o seguinte iniciador de reparação antissense especifico de gene: 5'- GAGTAGAGGCAGGCATCGTC -3' (SEQ ID N°: 17). 0 rastreio de colónias para identificar os ADNc adequados levou-se a cabo com os seguintes iniciadores para PCR:

Exploraram-se 95 colónias, e um clone de ADNc deu positivo por meio da PCR. Obteve-se a sequência de comprimento total do ADNc. Também se encontrou que este clone representa uma variante de proproteína convertase subtilisina/kexina de tipo 9 (PCSK9) . A sequência nucleotidica de comprimento total e o polipéptido codificado para PCSK9c mostram-se nas Figuras 1A-D. EXEMPLO 3 - MÉTODO PARA DETERMINAR O PERFIL DE EXPRESSÃO DOS NOVOS POLIPÉPTIDOS DE PCSK9B E PCSK9C DA PRESENTE INVENÇÃO USANDO FONTES TISSULARES E CELULARES DE ARNm

EXPANDIDAS 0 ARN total dos tecidos isolou-se usando o protocolo TRIZOL® (Invitrogen) e quantificou-se determinando sua absorvância a 260 nm. Efetuou-se uma determinação das bandas 18s e 28s de ARN ribossomal por meio de eletroforese em gel desnaturalizante para determinar a integridade do ARN. A sequência específica que se mediria alinhou-se com genes relacionados encontrados em GENBANK® para regiões de identidade de divergência de sequência significativa para maximizar a especificidade do iniciador e a sonda. Os iniciadores e as sondas específicos de genes projetaram-se usando o software ABI primer express para amplificar amplicões pequenos (150 pares de bases ou menos) para maximizar a probabilidade de que os iniciadores funcionem com uma eficácia de 100 %. Todas as sequências de iniciador/sonda buscaram-se contra bases de dados públicas de GenBank para assegurar a especificidade do alvo. As sequências de iniciador e sonda projetaram-se para hibridar com regiões partilhadas tanto por PCSK9b como por PCSK9c, além de com PCSK9 de tipo selvagem. Os iniciadores e as sondas foram obtidos de ABI.

Para PCSK9b e PCSK9c, as sequências de iniciador e sonda foram as seguintes:

Iniciador direto 5'-CCTGCGCGTGCTCAACT-3' (SEQ ID N° : 10)

Iniciador indireto 5'-CCGAATAAACTCCAGGCCTATG-3' (SEQ ID N°: 11)

Sonda TAQMAN® 5'-CCGCTAACCGTGCCCTTCCCTTG-3' (SEQ ID N°: 12)

Contaminação de ADN

Para determinar o nível de ADN genómico contaminante no ARN, o ARN dividiu-se em 2 alíquotas e tratou-se metade com DNase livre de RNase (Invitrogen). As amostras tratadas e não tratadas com DNase submeteram-se a reações de transcrição inversa com (RT + ) e sem (RT-) a presença de transcriptase inversa. Levaram-se a cabo ensaios TAQMAN® com iniciadores específicos de genes (veja-se acima) e avaliou-se a contribuição do ADN genómico ao sinal detetado comparando os ciclos limites obtidos com o ARN tratado com RT+/RT- não-DNase com os do ARN tratado com RT+/RT- DNase. A quantidade de sinal contribuída pelo ADN genómico no ARN RT- tratado com DNase tem que ser menor de 10 % do obtido com o ARN RT+ tratado com DNase. Em caso contrário, o ARN não se usou nos experimentos reais.

Reação de transcrição inversa e deteção de sequência

Hibridaram-se 100 ng de ARN total tratado com DNase a 2.5 mM do respetivo iniciador indireto específico de gene na presença de 5,5 mM de cloreto de magnésio aquecendo a amostra a 72 °C durante 2 min e depois arrefecendo a 55 °C durante 30 min. Adicionaram-se 1,25 U/μΙ de transcriptase inversa MuLv e 500 mM de cada dNTP à reação e incubou-se o tubo a 37 °C durante 30 min. Depois aqueceu-se a amostra a 90 °C durante 5 min para desnaturalizar a enzima. A deteção quantitativa de sequência levou-se a cabo num ABI PRISM® 7700 adicionando à reação retrotranscrita 2.5 mM de iniciadores diretos e inversos, 2,0 mM da sonda TAQMAN®, 500 mM de cada dNTP, tampão e 5 U de AMPLITAQ GOLD®. A reação PCR manteve-se então a 94 °C durante 12 min, seguido de 40 ciclos de 94 °C durante 15 s e 60 °C durante 30 s.

Manipulação de dados O ciclo limite (Ct) do tecido de menor expressão (o valor maior de Ct) usou-se como valor basal de expressão e todos os demais tecidos expressaram-se como a abundância relativa para este tecido calculando a diferença em valor de Ct entre o valor basal e os demais tecidos e usando-o como exponente em 2(ACt) O perfil de expressão expandido dos polipéptidos de PCSK9b e PCSK9c proporciona-se na Figura 6, e descreve-se em outras partes do presente documento. 0 Quadro IV identifica os tecidos analisados.

EXEMPLO 4 - MÉTODO PARA CARATERIZAR OS POLIPÉPTIDOS DE

PCSK9B O PCSK9C DA PRESENTE INVENÇÃO A análise de expressão de polipéptidos e polinucleótidos de PCSK9b e PCSK9c usando tanto PCR quantitativa como Western blots, além do efeito de PCSK9b e PCSK9c na captação de LDL pelo LDLR, avaliou-se de acordo com os métodos indicados geralmente no presente documento. Em resumo:

Materiais e métodos

Clonagem génica. A variante b de PCSK9 clonou-se a partir de uma biblioteca de ADNc de cérebro humano, e a variante c clonou-se a partir de uma biblioteca de ADNc de cérebro/testículo. Cada produto variante inseriu-se em dois vetores de expressão CD3 MYCHIS e pEF-DESTSl marcados com His e V5 ou epítopos Myc na extremidade C-terminal (N° 3114 para variante b de PCSK9-pCD3 MYCHIS, 3115 para variante c de PCSK9-pEF-DESTSl, N° 3116 para variante c de PCSK9-pCD3 MYCHIS, 3117 para variante c de PCSK9-pEF-DESTSl). PCSK9 de tipo selvagem e o mutante D374 de PCSK9 clonaram-se por meio de inserção de produto da PCR num vetor pcDNA3.

Cultura celular. Todas as linhas celulares, incluindo

HepG2, células de ovário de hámster chinês (CHO), e HEK293, derivaram-se a partir da American Type Cell Culture (Manassas, VA) . As células tanto HepG2 como HEK293 foram crescidas em meio DMEM (Invitrogen Gibco, Carlsbad, CA) suplementado com soro fetal bovino inativado por calor a 10 % (FBS, Gibco), piruvato de sódio 1 mM (Gibco), Glutamax 2 mM (Gibco), sulfato de estreptomicina 100 mg/ml e 100 U/ml de penicilina (Gibco). As células CHO foram crescidas com o meio F12 com Glutamax (Gibco) suplementado com soro fetal bovino a 10 %.

Ensaio de captação de Dil-LDL. Foram cultivadas em placas 15.000 células por poço na placa de 96 poços revestida em poli D lisina com o meio de crescimento com FBS a 10 % e foram crescidas a 37 °C num incubador durante a noite. No dia dois, o meio alterou-se a meio de crescimento de soro deficiente em lipoproteína a 5 % (LPDS) suplementado com mevalonato de sódio 50 μΜ, e 100 ng/ml de um inibidor de HMG CoA redutase. No dia três, adicionaram-se alíquotas de LDL marcadas fluorescentemente (Dil-LDL) (fonte: Biomedical Technologies, Stoughton, MA) ao meio a uma concentração de 10 pg/ml e continuou-se incubando durante duas horas mais. Adicionou-se formaldeído às células a uma concentração de 4 % junto com corante Hoechst a 10 pg/ml. Depois de 20 minutos de incubação a temperatura ambiente, lavaram-se as células com PBS três vezes e a leitura feita num dispositivo LJL Biosystems (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) para o conteúdo de ADN a um comprimento de onda de excitação de 360 nm, e um comprimento de onda de emissão de 460 nm. As células lisaram-se então por meio de NaOH (0,001 N) e SDS (0,001 %) . A captação de Dil-LDL mediu-se em LJL a um comprimento de onda de excitação de 540 nm, e um comprimento de onda de emissão de 580 nm. Os dados de captação de Dil-LDL foram normalizados ao conteúdo de ADN tomando a relação da leitura de Dil-LDL com a leitura do corante de Hoechst.

Quantificação de ARNm. 0 isolamento do ARN total das células levou-se a cabo por meio do dispositivo 6100 Nucleotide Acid PrepStation (ABI, Foster City, CA). As células lisaram-se por meio da solução de lise de ácido nucleico (ABI) seguindo as instruções do fabricante. As células Usadas foram carregadas no instrumento para a extração de ARN com base no protocolo sugerido pelo fabricante. A quantidade de ARN mediu-se por meio do dispositivo SPECTRAMAX® Plus (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) . RT-PCR quantitativa: o ADNc foi preparado usando os reagentes de síntese de ADNc iScript (Biorad, Hercules, e CA) seguindo as instruções do fabricante. A PCR quantitativa levou-se a cabo usando iTaq SYBR® Green Supermix com reagentes ROX (Bio-Rad) num sistema de deteção de sequências ABI PRISM® 7900HT. As sequências de iniciador para os ensaios foram: PCSK9 de tipo selvagem, direto TGTCTTTGCCCAGAGCATCC (SEQ ID N° : 30), indireto TATTCATCCGCCCGGTACC (SEQ ID N° : 31); variante b, direto AGATGTCATCAATGAGGCCT (SEQ ID N°: 32), indireto AGCTGCCAACCTGCAAAAAC (SEQ ID N° : 33); variante b/c, direto CTCTGAGGTTGTGACTCGTGTGA (SEQ ID N°: 34), indireto AGCGTTCTCCACTCCACAAGA (SEQ ID N° : 35); LDLR, direto GAGAATGATCTGCAGCACCCA (SEQ ID N°: 36), indireto TGCTGATGACGGTGTCATAGG (SEQ ID N° : 37). Os níveis de expressão génica foram normalizados ao ARNm de GADPH.

Análise por Western blot. As células foram cultivadas em placas em DMEM suplementado com FBS a 10 % em placas de 6 poços. No dia dois, transfetaram-se 4 pg/poço de ADN de plasmídeo por meio de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) seguindo as sugestões do fabricante. Depois de 24 h, alterou-se o meio a meio DMEM com LPDS a 5 %, mevalonato de sódio 50 μΜ, e 100 ng/ml de BMS-423526. Depois de 24 h adicionais, retirou-se o meio e lisaram-se as células com o tampão que continha Triton X-100 a 0,1 %, NaCl 150 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 7,4) mais coquetel inibidor de protease completo (Roche). A concentração de proteína foi ensaiada com o ensaio de proteínas BioRad (BioRad). 10 pg de proteínas de lisado ou 15 μΐ de um total de 2 ml de meio acondicionado foram carregados em géis de Tris-HCl a 4-15 % (Invitrogen). Depois da transferência de proteínas, as membranas foram incubadas com anticorpo primário anti-hPCSK9 ou com anticorpo primário anti-LDLR, seguido de IgG anti-ratinho marcada com IRdye 800 para PCSK9 ou IgG anti-coelho marcada com IRdye 680 para LDLR. As bandas de proteínas detetaram-se posteriormente usando o sistema de obtenção de imagens infravermelhas ODYSSEY® (Li-Cor, Lincoln, NE) de acordo com as instruções do fabricante. Resultados

Sobre-expressão de variantes de PCSK9 em células. As variantes b e c de PCSK9 transfetaram-se em células HEK e CHO assim como em células HepG2. Ambas variantes expressaram-se nestas células com níveis de ARNm comparáveis aos de PCSK9 de tipo selvagem (de comprimento total) e com o mutante de ganho de função D374Y-PCSK9 (Fig. 7A) . Como era de esperar, os níveis de ARNm de LDLR não foram afetados pela expressão dos ARNm de PCSK9 nestas células (Fig. 7B) , o que é coerente com estudos anteriores usando variantes conhecidas e mutantes de PCSK9 (Maxwell K. N., Breslow J. L., Proc. Nat. Amer. Sei., 101:7100-7105 (2004) . Benjannet S., et al., J. Bio. Chem. 279:48865-48875 (2004)). Os resultados de Western blot usando anticorpo de PCSK9 demonstraram que tanto a variante b como a variante c também foram expressas como proteína nas células transfetadas. A variante b foi expressa como uma proteína de aproximadamente 33 kDa e a variante c foi expressa como uma proteína de aproximadamente 57 kDa (Fig. 8A). Os pesos moleculares aparentes das proteínas variantes, julgados por meio de mobilidade em SDS-PAGE, corresponderam-se com sua massa molecular predita a partir da análise de sequências. Em comparação com a proteína PCSK9 de tipo selvagem, os níveis de expressão de proteínas das duas variantes foram menores embora facilmente detetáveis por meio de anticorpos.

No meio acondicionado da cultura celular, a expressão de proteína tanto de PCSK9-b como -c observou-se por meio de Western blot (Fig. 8B) , o que indica que estas duas variantes podem ser segregadas pelas células.

As variantes de PCSK9 mostram atividade funcional no ensaio de captação de Dil-LDL. A captação de Dil-LDL é um ensaio funcional padronizado para o recetor de LDLR, enquanto que a atividade de PCSK9 reduz a de LDLR. Portanto, a captação de Dil-LDL por células pode ser usada como um ensaio funcional para a atividade de PCSK9. A expressão transitória de variante c de PCSK9 diminuiu a captação de Dil-LDL em células HepG2, em comparação com o controlo de vetor, o que indica que a variante c é competente para expressar atividade funcional de PCSK9 em LDLR (Fig. 9A) . Neste ensaio, a variante c mostrou maior atividade que PCSK9 de tipo selvagem. A variante b mostrou maior atividade que PCSK9 de tipo selvagem, mas foi menor que a variante PCSK9b. Com base na dedução de sequência e nos pesos moleculares observados nos Western blots, a variante PCSK9c parece formar uma proteína PCSK9 praticamente completa (em comparação com a de tipo selvagem), enquanto que a variante PCSK9c carece de parte do domínio C-terminal, o que é coerente com os achados do ensaio de atividade.

De maneira coerente ao ensaio de captação de Dil-LDL, a expressão da variante c de PCSK9 diminuiu o nível de proteína LDLR nas células CHO ensaiadas por meio de Western blot, enquanto que a expressão da variante b pareceu não afetar ao nível de proteína LDLR nestas condições (Fig. 9B) .

Conclusões

As duas variantes de PCSK9, b e c, foram examinadas numa série de experiências para detetar a expressão e função. Estas duas variantes diferem de PCSK9 de tipo selvagem na ausência do péptido de sinal e do prodomínio assim como em 22 aminoácidos na extremidade N-terminal do domínio catalítico. Na variante b, também está ausente uma porção do domínio C-terminal.

Ambas variantes expressaram-se a nível de ARNm em células HepG2 basais (suprimidas com esterol), estando o ARNm aproximadamente a 1 % do nível de ARNm de PCSK9 na presença de meio que contém soro fetal bovino a 10 % (dados não mostrados) . Sabe-se que o meio que contém soro fetal bovino (FBS) a 10 % suprime genes sensíveis a esterol, incluindo PCSK9. No entanto, em condições que incluem soro deficiente em lipoproteínas a 5 % (LPDS) no meio, que se sabe que induz genes sensíveis a esterol, incluindo PCSK9, o ARNm da variante PCSK9c estava elevadamente induzido, alcançando os níveis aproximadamente 10 % do nível de ARNm de PCSK9 de tipo selvagem (dados não mostrados). A expressão transitória das duas variantes usando vetores de expressão plasmídicos padrão em linhas celulares de mamífero teve como resultado que a variante PCSK9b estivesse expressa como uma proteína de 33 kDa, e que a variante PCSK9c se expressasse como uma proteína de 57 kDa. Ambas proteínas variantes de PCSK9 foram detetáveis em meio acondicionado assim como em lisados celulares, o que indica que ambas podem ser segregadas a partir de células. Com base no ensaio de captação de Dil-LDL e nos dados da Western blot, a expressão transitória da variante c diminuiu os níveis de LDLR em células, enquanto que a variante b mostrou efeitos mais leves.

Estes dados sugerem que as novas variantes de PCSK9, especialmente a variante c, não somente se expressam, mas que são funcionalmente competentes e mostram atividade de

PCSK9 interagindo com o LDLR e diminuindo os níveis de LDLR, a principal função identificada para PCSK9 de tipo selvagem até o momento. Os dados apoiam um papel biológico para as novas variantes na modulação do LDLR e sugerem que são úteis em biotecnologia e em aplicações de investigação que implicam a expressão, função, e rastreio de PCSK9. EXEMPLO 5 - MÉTODO PARA MEDIR A ATIVIDADE DE PROTEÍNAS DOS POLIPÉPTIDOS DE PCSK9B OU PCSK9C DA PRESENTE INVENÇÃO

Podem ser utilizados uma série de ensaios conhecidos na técnica para demostrar a atividade de proteinase dos polipéptidos de PCSK9b e PCSK9c da presente invenção. Especificamente, pode ser utilizado o método exposto de maneira geral em Naureckiene et al. (Arch. Biochem. Biophys., 420:55-67 (2003)). Em resumo:

Expressão de PCSK9b e PCSK9c

Podem ser transformadas células de Escherichia coli BL21 (DE3) com prNl(ASP;AC@Q453)/6xHis. Os transformantes são crescidos em meio LB (suplementado com 100 pg/ml de carbenicilina) a 30 °C até uma DCboo de 0,6. A expressão se induz com IPTG 0,1 mM e a cultura é crescida durante 3,5 h adicionais. As células são colhidas por meio de centrifugação durante 30 min a 14.000g, e são armazenadas a -80 °C.

Purificação de PCSK9b e PCSK9c

Podem ser levados a cabo os procedimentos a 4 °C.

Ressuspendem-se as células de 2 1 de cultura em 25 ml de tampão de lise (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; NaCl 150 mM; glicerol a 10 %; e NDSB 1 M) na presença ou ausência de um coquetel inibidor de proteinase livre de EDTA (Roche). Depois da lise celular por meio de sonicação, os resíduos celulares são retirados por meio de centrifugação (30 min, 14.000 g) . O sobrenadante que contém proteínas solúveis é carregado numa coluna de agarose pré-equilibrada com 1 ml de ácido Ni-nitrilotriacético (NTA) (Qiagen). A coluna é lavada com 20 ml de tampão de lise que contém imidazol 20 mM para eliminar as proteínas contaminantes fracamente unidas. A proteína purificada é eluída com 5 ml de tampão de lise que contém imidazol 200 mM. A proteína eluída é dialisada durante a noite contra 1 1 de tampão A: Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, e glicerol a 10 %. A proteína dialisada é carregada numa coluna de 1 ml MONO Q® (Amersham Biosciences) equilibrada com o mesmo tampão. A coluna é lavada com 10 ml do mesmo tampão e as proteínas são eluídas com 12 ml de gradiente de NaCl (0,05-1,0 M) no mesmo tampão. Colhem-se frações de um mililitro e analisa-se sua pureza por meio de SDS-PAGE. As frações que contêm proteína purificada são agrupadas e dialisadas contra 1000 ml de tampão de armazenamento (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, NaCl 50 mM, e glicerol a 10 %), são aliquotados, e são armazenados a-80 °C. Paralelamente, é levada a cabo uma purificação a partir de células transformadas com vetor pET21a vácuo para gerar material para sua utilização como controlo negativo em ensaios enzimáticos.

Ensaio de atividade de proteinase

Os substratos fluorogénicos específicos de subtilisina, furina, e TTP podem ser comprados através de Bachem. Os substratos de proteinase sob medida podem ser sintetizados por New Englan Peptide, Inc. As sequências dos substratos peptídicos são as seguintes:

A atividade proteolítica pode ser ensaiada a 37 °C usando substrato 100 μΜ e enzima 0,12 μΜ em diversos tampões, incluindo Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 a pH 11, CaCl2 de 1 mM a 20 mM, e TX-100 a 0,5 % a 37 °C. A proteína derivada de uma transformação com vetor vácuo é incluída como controlo negativo para a atividade enzimática. As medidas fluorométricas contínuas e de ponto final podem ser levados a cabo num espetrofotómetro (Àex=350 nm, Àem=450 nm) .

EXEMPLO 6 - MÉTODO DE RASTREIO DE COMPOSTOS QUE INTERAGEM COM O POLIPÉPTIDO DE PCSK9B OU PCSK9C

Os seguintes ensaios projetaram-se para identificar compostos que se ligam ao polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c, que se ligam a outras proteínas celulares que interagem com o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c, e para compostos que interferem com a interação do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c com outras proteínas celulares.

Os ditos compostos podem incluir, mas sem limitação, outras proteínas celulares. Especificamente, os ditos compostos podem incluir, mas sem limitação, péptidos, tais como, por exemplo, péptidos solúveis, incluindo, mas sem limitação péptidos de fusão com cauda de Ig, que compreendem porções extracelulares de recetores transmembrana de polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c, e membros de bibliotecas peptídicas aleatórias (veja-se, por exemplo, Lam, K. S. et al. , 1991, Nature 354:82-84; Houghton, R. et al., 1991, Nature 354:84-86), feitos de aminoácidos de configuração D e/ou L, fosfopéptidos (incluindo, mas sem limitação, membros de bibliotecas de fosfopéptidos aleatórios ou parcialmente degenerados; veja-se, por exemplo, Songyang, Z., et al. , 1993, Cell 72:767-778), anticorpos (incluindo, mas sem limitação, anticorpos policlonais, monoclonais, humanizados anti-idiotípicos, quiméricos ou de cadeia simples, e fragmentos de biblioteca de expressão FAb, F(ab')2 e FAb, e fragmentos de união a epítopo dos mesmos), e moléculas pequenas orgânicas ou inorgânicas.

Os compostos identificados por meio de ensaios tais como aqueles descritos no presente documento podem ser úteis, por exemplo, para deduzir a função biológica do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c, e para melhorar os sintomas da progressão tumoral, por exemplo. Nos casos, por exemplo, nos quais um estado ou distúrbio de progressão tumoral seja o resultado de um nível geral menor de expressão de PCSK9b ou PCSK9c, de polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c, e/ou de atividade de polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c numa célula implicada no estado ou distúrbio de progressão tumoral, os compostos que interagem com o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c podem incluir aqueles que acentuam ou amplificam a atividade do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c unido. Os ditos compostos podem provocar um aumento efetivo no nível de atividade do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c, melhorando deste modo os sintomas do distúrbio ou estado de progressão tumoral. Nos casos nos quais as mutações no polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c causam a produção de polipéptidos de PCSK9b ou PCSK9c aberrantes que têm um efeito prejudicial que da lugar à progressão tumoral, podem ser identificados compostos que se ligam ao polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c que inibem a atividade do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c unido. Os ensaios para ensaiar a efetividade dos ditos compostos são conhecidos na técnica e são discutidos em outras partes do presente documento.

EXEMPLO 7 - MÉTODO PARA IDENTIFICAR COMPOSTOS QUE INTERFEREM COM A INTERAÇÃO DE POLIPÉPTIDO DE PCSK9B OU PCSK9C/PRODUTO CELULAR 0 polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c da invenção pode, in vivo, interagir com uma ou mais macromoléculas celulares ou extracelulares, tais como proteínas. As ditas macromoléculas incluem, mas sem limitação, polipéptidos, particularmente ligandos de PCSK9, e aqueles produtos identificados por meio dos métodos de rastreio descritos em outras partes do presente documento. Para os fins desta discussão, as ditas macromoléculas celulares e extracelulares são citadas no presente documento como "parceiros de união". Para os fins da presente invenção, "parceiro de união" também pode abranger polipéptidos, compostos de molécula pequena, polissacáridos, lípidos, e qualquer outra molécula ou tipo de molécula citado no presente documento. Os compostos que alteram as ditas interações podem ser úteis para regular a atividade do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c, especialmente do polipéptido mutante de PCSK9b ou PCSK9c. Os ditos compostos podem incluir, mas sem limitação, moléculas, tais como anticorpos, péptidos, e similares descritos em outras partes do presente documento. 0 princípio básico dos sistemas de ensaio usados para identificar compostos que interferem com as interações entre o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c e seu parceiro ou parceiros de união celulares ou extracelulares implica preparar uma mistura de reação que contém o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c, e o parceiro de união em condições e durante um tempo suficiente como para permitir que os dois produtos interajam e se liguem, formando deste modo um complexo. Para ensaiar a atividade inibidora de um composto, prepara-se a mistura de reação na presença e ausência do composto de ensaio. 0 composto de ensaio pode ser incluído inicialmente na mistura de reação, ou pode ser adicionado num momento posterior à adição do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c e seu parceiro de união celular ou extracelular. As misturas de reação de controlo são incubadas com o composto de ensaio ou com um placebo. Então se deteta a formação de qualquer complexo entre o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c e o parceiro de união celular ou extracelular. A formação de um complexo na reação de controlo, mas não na mistura de reação que contém o composto de ensaio, indica que o composto interfere com a interação do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c e o parceiro de união interativo. Adicionalmente, a formação de complexo nas misturas de reação que contêm o composto de ensaio e polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c normal também pode ser comparada com a formação de complexo nas misturas de reação que contêm o composto de ensaio e polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c mutante. Esta comparação pode ser importante naqueles casos nos quais é desejável identificar compostos que alteram as interações de polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c mutante, mas não normal. 0 ensaio para compostos que interferem com a interação do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c e parceiros de união pode ser levado a cabo num formato heterogéneo ou homogéneo. Os ensaios heterogéneos implicam fixar bem o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c ou o parceiro de união sobre uma fase sólida e detetar complexos fixados sobre a fase sólida ao final da reação. Em ensaios homogéneos, a reação completa é levada a cabo numa fase liquida. Em qualquer estratégia, pode ser variada a ordem de adição de reagentes para obter informação diferente sobre os compostos que estão a ser ensaiados. Por exemplo, os compostos de ensaio que interferem com a interação entre o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c e os parceiros de união, por exemplo, por meio de competição, podem ser identificados levando a cabo a reação na presença da substância de ensaio; isto é, adicionando a substância de ensaio à mistura de reação antes de ou de maneira simultânea com o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c e o parceiro de união interativo celular ou extracelular. Como alternativa, os compostos de ensaio que alteram os complexos preformados, por exemplo, compostos com constantes de união maiores que deslocam um dos componentes do complexo, podem ser ensaiados adicionando o composto de ensaio à mistura de reação depois de que tenham sido formados os complexos. Os diversos formatos são descritos brevemente a seguir.

Num sistema de ensaio heterogéneo, fixa-se bem o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c ou o parceiro de união interativo celular ou extracelular sobre uma superfície sólida, enquanto que a espécie não fixada se marca, de forma direta ou indireta. Na prática, são usadas de maneira conveniente placas de microtitulação. As espécies fixadas podem ser imobilizadas por meio de uniões não covalentes ou covalentes. A união não covalente pode ser conseguida simplesmente revestindo a superfície sólida com uma solução do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c ou parceiro de união e secando. Como alternativa, pode ser usado um anticorpo imobilizado específico para a espécie a ser fixada para fixar a espécie à superfície sólida. As superfícies podem ser preparadas previamente e armazenadas.

Para levar a cabo o ensaio, o parceiro das espécies imobilizadas é exposto à superfície revestida com ou sem o composto de ensaio. Depois de que esteja completa a reação, são retirados os componentes não reagidos (por exemplo, por meio de lavagem) e permanecerá qualquer complexo formado imobilizado sobre a superfície sólida. A deteção de complexos fixados sobre a superfície sólida pode ser conseguida de uma diversidade de formas. Nos casos onde a espécie não imobilizada está marcada previamente, a deteção do marcador imobilizado sobre a superfície indica que se formaram complexos. Nos casos onde a espécie não imobilizada não está marcada previamente, pode ser usado um marcador indireto para detetar complexos fixados sobre a superfície, por exemplo, usando um anticorpo marcado específico para a espécie não imobilizada inicialmente (o anticorpo, por sua vez, pode estar marcado diretamente ou marcado indiretamente com um anticorpo anti-Ig marcado). Dependendo da ordem de adição dos componentes de reação, podem ser detetados os compostos de ensaio que inibem a formação de complexos ou que alteram os complexos preformados.

Como alternativa, a reação pode ser levada a cabo numa fase líquida na presença ou ausência do composto de ensaio, os produtos de reação podem ser separados dos componentes que não reagiram, e os complexos podem ser detetados, por exemplo, usando um anticorpo imobilizado específico para um dos componentes de união para fixar qualquer complexo formado em solução, e um anticorpo marcado específico para o outro parceiro para detetar complexos fixados. De novo, dependendo da ordem de adição de reagentes à fase líquida, podem ser identificados os compostos de ensaio que inibem os complexos ou que alteram os complexos preformados.

Como alternativa, pode ser usado um ensaio homogéneo. Nesta estratégia, prepara-se um complexo preformado do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c e do produto de parceiro de união interativo celular ou extracelular no qual o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c ou seus parceiros de união estão marcados, mas a sinal gerado pelo marcador se inativa devido à formação de complexo (veja-se, por exemplo, Patente US N° 4.109.496 de Rubenstein que utiliza esta estratégia para imunoensaios). A adição de uma substância de ensaio que compete com e desloca uma das espécies do complexo preformado dará como resultado a geração de um sinal acima do fundo. Deste modo, podem ser identificadas substâncias de ensaio que alteram a interação de polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c - parceiro de união celular ou extracelular.

Numa forma de realização particular, o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c pode ser preparado para sua imobilização usando técnicas de ADN recombinante conhecidas na técnica. Por exemplo, a região codificante do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c pode ser fusionada a um gene de glutatião-S-transferase (GST) usando um vetor de fusão, tal como pGEX-5X-1, de tal maneira que sua atividade de união se mantém no produto de fusão resultante. O produto interativo celular ou extracelular pode ser purificado e usado para provocar um anticorpo monoclonal usando métodos praticados de maneira rotineira na técnica e descritos anteriormente. Este anticorpo pode ser marcado com o isótopo radioativo 1251, por exemplo, por meio de métodos praticados rotineiramente na técnica. Num ensaio heterogéneo, por exemplo, o produto de fusão de GST-polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c pode ser fixado a pérolas de glutatião-agarose. 0 produto de parceiro de união interativo celular ou extracelular pode ser adicionado então na presença ou ausência do composto de ensaio de tal forma que permite que suceda a interação e a união. Ao final do período de reação, o material não unido pode ser eliminado por lavagem, e o anticorpo monoclonal marcado pode ser adicionado ao sistema e deixar que se ligue aos componentes complexados. Pode ser detetada a interação entre o polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c e o parceiro de união interativo celular ou extracelular medindo a quantidade de radioatividade que permanece associada às pérolas de glutatião-agarose. Uma inibição satisfatória da interação pelo composto de ensaio dará como resultado uma diminuição na radioatividade medida.

Como alternativa, podem ser misturados juntamente o produto de fusão de GST-polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c e o produto parceiro de união interativo celular ou extracelular em líquido em ausência das pérolas de glutatião-agarose sólidas. 0 composto de ensaio pode ser adicionado bem durante ou depois dos parceiros de união e deixa-los interagir. Esta mistura pode ser adicionada então às pérolas de glutatião-agarose e eliminado por lavagem o material não unido. De novo, o alcance da inibição da interação do parceiro de união pode ser detetado adicionando o anticorpo marcado e medindo a radioatividade associada às pérolas.

Podem ser utilizadas estas mesmas técnicas usando fragmentos peptidicos que correspondem aos domínios de união do produto polipeptídico de PCSK9b ou PCSK9c e o parceiro de união interativo celular ou extracelular (em caso de que o parceiro de união seja um produto), em lugar de um ou ambos produtos de comprimento total.

Pode ser usado qualquer método praticado de maneira rotineira na técnica para identificar e isolar o local de união da proteína. Estes métodos incluem, mas sem limitação, mutagénese de um dos genes que codificam um dos produtos e explorar a disrupção da união num ensaio de imunoprecipitação conjunta. Podem ser selecionadas mutações compensadoras no gene que codifica a segunda espécie no complexo. A análise de sequência dos genes que codificam os produtos respetivos revelará as mutações que correspondam à região do produto implicada na união interativa. Como alternativa, pode ser fixado um produto a uma superfície sólida usando métodos descritos anteriormente nesta seção, e deixado interagir com e ligado a seu parceiro de união marcado, que foi tratado com uma enzima proteolítica, tal como tripsina. Depois de lavar, um péptido curto marcado que compreende o domínio de união pode permanecer associado ao material sólido, que pode ser isolado e identificado por meio de sequenciamento de aminoácidos. Do mesmo modo, uma vez tenha sido obtido o gene que codifica o parceiro de união celular ou extracelular, podem ser projetados segmentos génicos curtos para expressar fragmentos peptídicos do produto, que depois podem ser ensaiados para atividade de união e purificados ou sintetizados.

EXEMPLO 8 - ISOLAMENTO DE UM CLONE ESPECÍFICO DA AMOSTRA DEPOSITADA 0 material depositado na amostra à qual se atribui o número de depósito da ATCC® citado no Quadro I para qualquer dado clone de ADNc pode conter também um ou mais plasmídeos adicionais, compreendendo, cada um, um clone de ADNc diferente do deste dado clone. Portanto, os depósitos que partilham o mesmo número de depósito da ATCC® contêm pelo menos um plasmídeo para cada clone de ADNc identificado no Quadro I. Tipicamente, cada amostra de depósito da ATCC® citada no Quadro I compreende uma mistura de quantidades aproximadamente iguais (em peso) de aproximadamente 1-10 ADN de plasmídeo, contendo, cada um, um clone de ADNc diferente e/ou um clone parcial de ADNc; mas a dita amostra de depósito pode incluir plasmídeos para mais ou menos de 2 clones de ADNc.

Podem ser usadas duas estratégias para isolar um clone particular a partir da amostra depositada de ADN de plasmídeo citada para este clone no Quadro I. Em primeiro lugar, isola-se um plasmídeo diretamente explorando os clones que usam uma sonda polinucleotidica correspondente a SEQ ID N°: 1.

Em particular, sintetiza-se um polinucleotido específico com 30-40 nucleótidos usando um sintetizador de ADN de Applied Biosystems de acordo com a sequência comunicada. O oligonucleótido é marcado, por exemplo, com 32P —(-ATP usando polinucleotido cinase T4 e purifica-se de acordo com métodos de rotina, (por exemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY (1982)). A mistura de plasmídeo é transformada num hospedeiro adequado, tal como se indica anteriormente (tal como XL-1 Blue (Stratagene)) usando técnicas conhecidas para os peritos na especialidade, tais como aquelas proporcionadas pelo fornecedor do vetor ou em publicações relacionadas ou patentes citadas anteriormente. Os transformantes são cultivados em placas de agar a 1,5 % (que contêm o agente de seleção adequado, por exemplo, ampicilona) até uma densidade de aproximadamente 150 transformantes (colónias) por placa. Estas placas são rastreadas usando membranas de náilon de acordo com métodos de rotina para rastreio de colónias bacterianas (por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Edição, (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, páginas 1,93 a 1,104), ou outras técnicas conhecidas para os peritos na especialidade .

Como alternativa, sintetizam-se dois iniciadores de 17-20 nucleótidos derivados de ambas extremidades de SEQ ID N° : 1 ou SEQ ID N° : 3 (isto é, dentro da região de SEQ ID N° : 1 ou SEQ ID N° : 3 unido por meio de 5' NT e 3' NT do clone definido no Quadro I) e usam-se para amplificar o ADNc desejado usando o plasmídeo de ADNc depositado como molde. A reação em cadeia da polimerase é levada a cabo em condições rotineiras, por exemplo, em 25 μΐ de mistura de reação com 0,5 pg do molde de ADNc anterior. Uma mistura de reação conveniente é 1,5-5 ml de MgCl2, gelatina a 0,01 % (p/v), 20 μΜ de cada um de dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 25 pmol de cada iniciador e 0,25 unidades de polimerase Taq. São levados a cabo trinta e cinco ciclos de PCR (desnaturalização a 94 °C durante 1 min; hibridação a 55 °C durante 1 min; elongação a 72 °C durante 1 min) com um ciclador térmico automatizado Cetus de Perkin-Elmer. O produto amplificado analisa-se por meio de eletroforese em gel de agarose e corta-se e purifica-se a banda de ADN com a massa molecular esperada. O produto da PCR é verificado para que seja da sequência selecionada subclonando e sequenciando o produto de ADN.

Os polinucleótidos da presente invenção, o polinucleótido que codifica o polipéptido da presente invenção, ou o polipéptido codificado pelo clone depositado pode representar versões parciais ou incompletas da região codificante completa (isto é, em gene de comprimento total). São conhecidos vários métodos na técnica para a identificação das porções 5' ou 3' não codificantes e/ou codificantes de um gene que podem não estar presentes no clone depositado. Os métodos seguintes são exemplares e não devem ser entendidos como limitativos do âmbito da invenção. Estes métodos incluem, mas sem limitação, sondagem em filtro, enriquecimento de clones usando sondas especificas, e protocolos similares ou idênticos a protocolos "RACE" 5' e 3' que são bem conhecidos na técnica. Por exemplo, há disponível um método similar a RACE 5' para gerar a extremidade 5' ausente de um transcrito de comprimento total desejado. (Fromont-Racine et al., Nucleic Acids Res. 21(7):1683-1684 (1993)).

Em resumo, liga-se um oligonucleótido de ARN especifico às extremidades 5' de uma população de ARN que contém presumivelmente transcritos de ARN de genes de comprimento total. Usa-se um conjunto de iniciador que contém um iniciador especifico para o oligonucleótido de ARN ligado e um iniciador especifico para uma sequência conhecida do gene de interesse para amplificar por meio da PCR a porção 5' do gene de comprimento total desejado. Este produto amplificado pode então ser sequenciado e usado para gerar o gene de comprimento total.

Este método anterior começa com o ARN total isolado da fonte desejada, embora pode ser usada poli-A + ARN. A preparação de ARN pode ser tratada então com fosfatase em caso necessário para eliminar os grupos fosfato 5' no ARN degradado ou danificado que possa interferir com a etapa posterior de ARN ligase. Então deve ser inativada a fosfatase e tratar-se o ARN com pirofosfatase ácida do tabaco para eliminar a estrutura de tampa presente nas extremidades 5' dos ARN mensageiros. Esta reação deixa um grupo fosfato 5' na extremidade 5' do ARN ao qual foi excisada a tampa, que depois pode ser ligada a um oligonucleótido de ARN usando ARN ligase T4.

Esta preparação de ARN modificado usa-se como molde para a síntese da primeira cadeia de ADNc usando um oligonucleótido específico de gene. A reação de síntese da primeira cadeia usa-se como molde para a amplificação pela PCR da extremidade 5' desejado usando um iniciador especifico para o oligonucleótido de ARN ligado e um iniciador específico para a sequência conhecida do gene de interesse. Então se sequencia o produto resultante e analisa-se para confirmar que a sequência da extremidade 5' pertence ao gene desejado. Além disso, pode ser vantajoso otimizar o protocolo RACE para aumentar a probabilidade de isolar sequências 5' ou 3' codificantes ou não codificantes. São conhecidos na técnica vários métodos para otimizar um protocolo RACE, embora possa ser encontrada uma descrição pormenorizada que resume estes métodos em B.C. Schaefer, Anal. Biochem., 227:255-273, (1995) .

Um método alternativo para levar a cabo RACE 5' ou 3' para a identificação de sequências codificantes ou não codificantes proporciona-se por Frohman, M.A., et al., Proc. Nat'1. Acad. Sei. USA, 85:8998-9002 (1988) . Em resumo, pode ser reconstruído um clone de ADNc que carece da extremidade 5 ' ou 3' para que inclua os pares de bases ausentes que se estendem ao codão de início ou detenção traducional, respetivamente. Em alguns casos, os ADNc carecem do começo da tradução, para esta finalidade. A seguir descreve-se brevemente uma modificação deste procedimento original RACE 5'. Os ARN poli A+ ou totais retrotranscritos com SUPERSCRIPT® II (Gibco/BRL) ou um iniciador complementar ou antissense específico para a sequência de ADNc. O iniciador é retirado da reação com um concentrador MICROCON® (Amicon). Posteriormente adiciona-se a cauda à primeira cadeia de ADNc com dATP e desoxinucleótido transferase terminal (Gibco/BRL). Portanto, produz-se uma sequência de ancoragem que é necessária para a amplificação por meio da PCR. A segunda cadeia sintetiza-se a partir da cauda de dA em tampão de PCR, ADN polimerase Taq (Perkin-Elmer Cetus), um iniciador de oligo-dT que contém três locais de restrição adjacentes (XhoIJ, Sail e Ciai) na extremidade 5' e um iniciador que contém somente estes locais de restrição. Este ADNc de cadeia dupla é amplificado por meio da PCR durante 40 ciclos com os mesmos iniciadores assim como um iniciador antissense específico de ADNc aninhado. Os produtos da PCR são separados por tamanhos num gel de brometo de etídio-agarose e é retirada a região do gel que contém produtos de ADNc do tamanho predito de ADN que codifica a proteína ausente. 0 ADNc purifica-se a partir da agarose com o kit Magic PCR Prep (Promega), é digerido por restrição com Xhol ou Sail, e liga-se a um plasmídeo, tal como PBLUESCRIPT® SKII (Stratagene) nos locais de Xhol e EcoRV. Este ADN é transformado em bactérias e os clones do plasmídeo são sequenciados para identificar as inserções codificantes de proteína corretas. As extremidades 5' corretas são confirmadas comparando esta sequência com o homólogo identificado de maneira putativa e sobrepostas com o clone de ADNc parcial. Usam-se métodos similares conhecidos na técnica e/ou kits comerciais para amplificar e recuperar as extremidades 3'. Há vários kits com controlo de qualidade disponíveis para sua compra. São fornecidos reagentes e métodos similares aos anteriores em forma de kit através de Gibco/BRL para RACE tanto 5' como 3' para a recuperação de genes de comprimento total. Há um segundo kit disponível através de Clontech que é uma modificação de uma técnica relacionada, SLIC (ligamento de cadeia simples a ADNc de cadeia simples), desenvolvido por Dumas et al., Nucleic Acids Res., 19:5227-32(1991) . As principais diferenças de procedimento são que o ARN se hidrolisa de maneira alcalina depois da transcrição inversa e usa-se ARN ligase para unir iniciador de ancoragem que contém um local de restrição à primeira cadeia de ADNc. Isto obvia a necessidade da reação de adição de cauda de dA, o que tem como resultado uma série de poliT que é difícil de sequenciar.

Uma alternativa à geração de ADNc 5' ou 3' a partir de ARN é a utilização de ADN de cadeia dupla de biblioteca de ADNc. Sintetiza-se uma cadeia assimétrica de ADNc antissense amplificada por meio da PCR com um iniciador antissense específico de ADNc e um iniciador fixado a plasmídeo. Estes iniciadores são retirados e é levada a cabo uma reação PCR simétrica com um iniciador antissense específico de ADNc aninhado e o iniciador fixado a plasmídeo.

Protocolo de ARN ligase para gerar as sequências 5' ou 3' terminais para obter genes de comprimento total

Uma vez que tenha sido identificado um gene de interesse, há disponíveis vários métodos para a identificação das porções 5' ou 3' do gene que podem não estar presentes no plasmídeo de ADNc original. Estes métodos incluem, mas sem limitação, sondagem em filtro, enriquecimento de clones usando sondas e protocolos específicos similares e idênticos a RACE 5' e 3'. Embora o gene de comprimento total possa estar presente na biblioteca e possa ser identificado por meio de sondagem, um método útil para gerar a extremidade 5' ou 3' é usar a informação de sequência existente do ADNc original para gerar a informação ausente. Há disponível um método similar a RACE 5' para gerar a extremidade 5' ausente de um gene de comprimento total desejado. (Este método foi publicado por Fromont-Racine et al., Nucleic Acids Res., 21(7): 1683-1684 (1993)). Em resumo, liga-se um oligonucleótido de ARN específico às extremidades 5' de uma população presumivelmente de 30 ARN que contém o transcrito de ARN de comprimento total e usa-se um conjunto de iniciadores que contém um iniciador específico para o oligonucleótido de ARN ligado e um iniciador específico para uma sequência conhecida do gene de interesse para amplificar por meio da PCR a porção 5' do gene de comprimento total desejado que posteriormente pode ser sequenciado e usado para gerar o gene de comprimento total. Este método começa com o ARN total isolado da fonte desejada, pode ser usado ARN de poli A mas não é um requisito prévio para este procedimento. A preparação de ARN pode ser tratada então com fosfatase em caso necessário para eliminar os grupos fosfato 5' no ARN degradado ou danificado que possa interferir com a etapa posterior de ARN ligase. Em caso de usar a fosfatase esta se inativa e trata-se o ARN com pirofosfatase ácida de tabaco para eliminar a estrutura de tampa presente nas extremidades 5' dos ARN mensageiros. Esta reação deixa um grupo fosfato 5' na extremidade 5' do ARN ao qual foi excisada a tampa, que depois pode ser ligada a um oligonucleótido de ARN usando ARN ligase T4. Esta preparação de ARN modificado pode ser usada como molde para a síntese da primeira cadeia de ADNc usando um oligonucleótido específico de gene. A reação de síntese da primeira cadeia pode então ser usada como molde para a amplificação pela PCR da extremidade 5' desejado usando um iniciador específico para o oligonucleótido de ARN ligado e um iniciador específico para a sequência conhecida do gene relacionado com a apoptose de interesse. Então se sequencia o produto resultante e analisa-se para confirmar que a sequência da extremidade 5' pertence ao gene relevante relacionado com a apoptose.

EXEMPLO 9 - EXPRESSÃO BACTERIANA DE UM POLIPÉPTIDO

Um polinucleótido que codifica um polipéptido da presente invenção é amplificado usando iniciadores oligonucleotídicos da PCR correspondentes às extremidades 5' e 3' da sequência de ADN, tal como se descreve no presente documento, para sintetizar fragmentos de inserção. Os iniciadores usados para amplificar a inserção de ADNc deve conter preferentemente locais de restrição, tais como BamHI e Xbal, e a extremidade 5' dos iniciadores para clonar o produto amplificado no vetor de expressão. Por exemplo, BamHI e Xbal correspondem aos locais de enzima de restrição no vetor de expressão bacteriana pQE-9. (Qiagen, Inc., Chatsworth, CA). Este vetor plasmídico codifica resistência a antibióticos (Ampr), uma origem de replicação bacteriana (ori) , um promotor/operador regulável por IPTG (P/0), um local de união a ribossomas (RBS), um marcador de 6 histidinas (6-His), e locais de clonagem de enzima de restrição. 0 vetor pQE-9 é digerido com BanHI e Xbal e o fragmento amplificado liga-se no vetor pQE-9 que mantém a grelha de leitura iniciada no RBS bacteriano. A mistura de ligamento usa-se então para transformar a estirpe M15/rep4 de E. coli (Qiagen, Inc.) que contém múltiplas cópias do plasmideo pREP4, que expressa o repressor de lacl e também confere resistência a kanamicina (Kanr). Os transformantes são identificados por sua capacidade para crescer em placas LB e são selecionadas as colónias resistentes a ampicilina/kanamicina. 0 ADN de plasmideo é isolado e confirmado por meio de análise de restrição.

Os clones que contêm as construções desejadas são crescidos durante a noite (0/N) em cultura liquida em meio LB suplementado tanto como Amp (100 pg/ml) e Kan (25 pg/ml). A cultura O/N usa-se para inocular uma grande cultura a uma proporção de 1:100 a 1:250. As células são crescidas até uma densidade óptica a 600 (D.O.600) de entre 0,4 e 0,6. Depois adiciona-se IPTG (isopropil-B-D-tiogalactopiranósido) a uma concentração final de 1 mM. O IPTG induz por meio da inativação do repressor lacl, eliminando o P/O dando lugar a expressão génica aumentada.

As células são crescidas durante 3 a 4 horas adicionais. Depois colhem-se as células por meio de centrifugação (20 min a 6000Xg) . O sedimento de células é solubilizado no agente caotrópico guanidina HC1 6 molar agitando durante 3-4 horas a 4 °C. Os resíduos celulares são retirados por meio de centrifugação, e o sobrenadante que contém o polipéptido é carregado numa coluna de resina de afinidade de níquel-nitrilo-ácido triacético ("Ni-NTA") (disponível através de QIAGEN, Inc., anteriormente citado). As proteínas com um marcador 6 x His ligam-se à resina de Ni-NTA com alta afinidade e podem ser purificadas num procedimento simples numa só etapa (para detalhes veja-se: The QIAexpressionist (1995) QIAGEN, Inc., anteriormente citado).

Em resumo, o sobrenadante é carregado na coluna em guanidina-HCl 6 M, pH 8, primeiramente é lavada a coluna com 10 volumes de guanidina-HCl 6M, pH 8, depois é lavada com 10 volumes de guanidina-HCl 6 M, pH 6, e finalmente é eluído o polipéptido com guanidina-HCl 6 M, pH 5.

A proteína purificada é renaturalizada depois dialisando contra tampão de solução salina tamponada com fosfato (PBS) ou Na-acetato 50 mM, pH 6 mais NaCl 200 mM. Como alternativa, a proteína pode voltar a se dobrar satisfatoriamente enquanto está imobilizada na coluna de Ni-NTA. As condições recomendadas são as seguintes: renaturalização usando um gradiente linear de ureia 6 M-l M em NaCl 500 mM, glicerol a 20 %, Tris/HCl 20 mM pH 7,4, que continha inibidores de proteases. A renaturalização deve ser levada a cabo durante um período de 1,5 horas ou mais. Depois da renaturalização as proteínas são eluídas por meio da adição de imidazol 250 mM. O imidazol é retirado por meio de uma etapa final de diálise contra PBS ou tampão de acetato de sódio 50 mM pH 6 mais 200 mM de NaCl. A proteína purificada é armazenada a 4 °C ou congelada a -80 °C. EXEMPLO 10 - PURIFICAÇÃO DE UM POLIPÉPTIDO A PARTIR DE UM CORPO DE INCLUSÃO O seguinte método alternativo pode ser usado para purificar um polipéptido expresso em E. coli quando está presente em forma de corpos de inclusão. A menos que se especifique o contrário, todas as etapas seguintes são levadas a cabo a 4-10 °C.

Após terminar a fase de produção da fermentação de E. coli, a cultura celular é arrefecida a 4-10 °C e as células são colhidas por meio de centrifugação contínua a 15.000 rpm (Heraeus Sepatech). Com base no rendimento de proteína esperado por unidade de peso de pasta celular e na quantidade de proteína purificada necessária, é suspensa uma quantidade adequada de pasta celular, em peso, numa solução de tampão que contém Tris 100 mM, EDTA 50 mM, pH 7,4. As células são dispersadas a uma suspensão homogénea usando um misturador de alto cisalhamento.

Depois as células são Usadas passando a solução através de um microfluidizador (Microfluidics, Corp. ou APV Gaulin, Inc.) duas vezes a 19,3-41,36 MPa. 0 homogeneizado é misturado então com solução de NaCl até uma concentração final de NaCl d 0,5 M, seguido de centrifugação a 7000 xg durante 15 min. O precipitado resultante é lavado de novo usando NaCl 0,5 M, Tris 100 mM, EDTA 50 mM, pH 7,4.

Os corpos de inclusão resultantes lavados são solubilizados com cloridrato de guanidinio (GuHCL) 1,5 M durante 2-4 horas. Depois de centrifugar a 7000 xg durante 15 min, é retirado o precipitado e incuba-se o sobrenadante que contém polipéptido a 4 °C durante a noite para permitir a extração adicional de GuHCl.

Depois de centrifugar a alta velocidade (30.000 xg) para eliminar as partículas insolúveis, a proteína solubilizada em GuHCl volta a dobrar-se misturando rapidamente o extrato de GuHCl com 20 volumes de tampão que contém sódio 50 mM, pH 4,5, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM por meio de agitação vigorosa. A solução de proteína diluída e dobrada de novo é mantida a 4 °C sem misturar durante 12 horas antes das etapas de purificação adicionais.

Para clarificar a solução de polipéptido que voltou a se dobrar, utiliza-se uma unidade de filtração tangencial preparada previamente equipada com um filtro de membrana de 0,16 pm com uma área superficial adequada (por exemplo, Filtron), equilibrada com acetato de sódio 40 mM, pH 6,0. A amostra filtrada é carregada sobre uma resina de permuta catiónica (por exemplo, POROS® HS-50, Perceptive Biosystems). A coluna é lavada com acetato de sódio 40 mM, pH 6,0 e é eluída com NaCl 250 mM, 500 mM, 1000 mM, e 1500 mM no mesmo tampão, passo a passo. Controla-se de maneira contínua a absorvância a 280 nm do efluente. São colhidas as frações e são analisadas por meio de SDS-PAGE.

As frações que contêm o polipéptido são agrupadas e são misturadas com 4 volumes de água. A amostra diluída é carregada então num conjunto preparado previamente de colunas em tandem de resinas de permuta aniónica fortes (POROS® HQ-50, Perceptive Biosystems) e aniónica fracas (POROS® CM-20, Perceptive Biosystems). As colunas são equilibradas com acetato de sódio 40 mM, pH 6,0. Ambas colunas são lavadas com acetato de sódio 40 mM, pH 6,0, NaCl 200 mM. A coluna CM-20 é eluída usando um gradiente linear de 10 volumes de coluna que variam desde NaCl 0,2 M, acetato de sódio 50 mM, pH 6,0 até NaCl 1,0 M, acetato de sódio 50 mM, pH 6,5. As frações são colhidas com controlo constante a A280 do efluente. Então são agrupadas as frações que contêm o polipéptido (determinado, por exemplo, por meio de SDS-PAGE a 16 %).

O polipéptido resultante deve mostrar uma pureza de mais de 95 % depois das etapas anteriores de dobragem e purificação. Não deveriam ser observadas bandas de contaminante importantes no gel de SDS-PAGE a 16 % corado com azul de Coomasie quando se carregam 5 pg de proteína. A proteína purificada também pode ser ensaiada para contaminação por endotoxina/LPS, e o conteúdo de LPS é tipicamente menor de 0,1 ng/ml de acordo com ensaios LAL. EXEMPLO 11 - CLONAGEM E EXPRESSÃO DE UM POLIPÉPTIDO NUM SISTEMA DE EXPRESSÃO DE BACULOVIRUS

Neste exemplo, usa-se o vetor transportador plasmídico pAc373 para insertar um polinucleótido num baculovírus para que expresse um polipéptido. Um vetor de expressão de baculovírus típico contém o promotor forte de polihedrina do vírus da polihedrose nuclear de Autographa californica (AcMNPV) seguido de locais de restrição convenientes, que podem incluir, por exemplo, BamHI, Xba I e Asp718. Com frequência usa-se o local de poliadenilação do vírus de símio 40 ("SV40") para uma poliadenilação eficaz. Para uma seleção fácil do vírus recombinante, o plasmídeo contém o gene de beta-galactosidade de E. coll sob o controlo de um promotor fraco de Drosophila na mesma orientação, seguido do sinal de poliadenilação do gene de polihedrina. Os genes inseridos estão flanqueados a ambos lados por sequências virais para a recombinação de homólogos mediada por células com ADN virai de tipo selvagem para gerar um vírus viável que expressa o polinucleótido clonado.

Podem ser usados muitos outros vetores de baculovírus em lugar do vetor anterior, tais como pVL941 e pAcIMl, como apreciará facilmente um perito na especialidade, sempre que a construção proporcione sinais localizados de maneira adequada para a transcrição, tradução, secreção e similares, incluindo um péptido de sinal e um AUG em grelha conforme for necessário. Os ditos vetores são descritos, por exemplo, em Luckow et al., Virology 170:31-39 (1989) .

Um polinucleótido que codifica um polipéptido da presente invenção é amplificado usando iniciadores oligonucleotídicos da PCR correspondentes às extremidades 5' e 3' da sequência de ADN, tal como se descreve no presente documento, para sintetizar fragmentos de inserção. Os iniciadores usados para amplificar a inserção de ADNc devem conter preferentemente locais de restrição na extremidade 5' dos iniciadores para clonar o produto amplificado no vetor de expressão. Especificamente, a sequência de ADNc contida no clone depositado, incluindo o codão de iniciação AUG e a sequência líder associada naturalmente identificada em outras partes do presente documento (se for aplicável), é amplificado usando o protocolo PCR descrito no presente documento. Se for usada a sequência de sinal de origem natural para produzir a proteína, o vetor usado não necessita um segundo péptido de sinal. Como alternativa, o vetor pode ser modificado para incluir uma sequência líder de baculovírus, usando os métodos padrão descritos em Summers et al. , "A Manual of Methods for Baculovírus Vetors and Insect Cell Culture

Procedures" Texas Agricultural Experimental Station Bulletin N° 1555 (1987) . 0 fragmento amplificado isola-se de um gel de agarose a 1 % usando um kit comercialmente disponível (GENECLEAN®, BIO 101 Inc., A Jolla, Ca.) . Depois o fragmento é digerido com enzimas de restrição adequadas e purifica-se de novo num gel de agarose a 1 %. O plasmídeo é digerido com as enzimas de restrição correspondentes e opcionalmente pode ser desfosforilado usando fosfatase intestinal de novilho, usando procedimentos de rotina conhecidos na técnica. Depois isola-se o ADN a partir de um gel de agarose a 1 % usando um kit comercialmente disponível (GENECLEAN®, BIO 101 Inc., A Jolla, Ca.). O fragmento e o plasmídeo desfosforilado ligam-se juntamente com ADN ligase T4. Transformam-se células de E. coli HB101 ou outros hospedadores adequados de E. coli tais como XL-1 Blue (Stratagene Cloning Systems, A Jolla, CA) com a mistura de ligamento e são dispersadas em placas de cultura. As bactérias que contêm o plasmídeo são identificadas digerindo o ADN de colónias individuais e analisando o produto de digestão por meio de eletroforese em gel. A sequência do fragmento clonado é confirmada por meio de sequenciamento de ADN.

Cotransformam-se cinco pg de um plasmídeo que contém o polinucleótido com 1,0 pg de um ADN de baculovírus linearizado comercialmente disponível ("BACULOGOLD® baculovírus DNA", Pharmingen, San Diego, CA), usando o método de lipofeção descrito por Feigner et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 84:7413-7417 (1987). Mistura-se um pg de ADN de vírus BACULOGOLD® e 5 pg do plasmídeo num poço estéril de uma placa de microtitulação que contém 50 pl de meio de Grace sem soro (Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD). Posteriormente, são adicionados 10 pl de LIPOFECTIN® mais 90 pl de meio de Grace, são misturados e são incubados durante 15 minutos a temperatura ambiente. Depois adiciona-se gota a gota a mistura de transcrição a células de inseto Sf9 (ATCC® CRL 1711) semeadas numa placa de cultura tissular de 35 mm com 1 ml de meio de Grace sem soro. Depois incuba-se a placa durante 5 horas a 27 °C. Então retira-se a solução de transfeção da placa e adiciona-se 1 ml de meio para inseto de Grace suplementado com soro fetal de novilho a 10 %. Então continua-se cultivando a 27 °C durante quatro dias.

Depois de quatro dias o sobrenadante é colhido e um ensaio em placa é levado a cabo, tal como se descreve por Summers e Smith, anteriormente citado. Usa-se um gel de agarose com "Blue Gal" (Life Technologies Inc., Gaithersburg) para permitir uma fácil identificação e isolamento dos clones que expressam gal, que produzem placas com coloração azul. (Também pode ser encontrada uma descrição pormenorizada de "um ensaio de placa" deste tipo na guia do utilizador para cultura de células de inseto distribuído por Life Technologies Inc., Gaithersburg, páginas 9-10) . Depois da incubação adequada, as placas coradas de azul são colhidas com a ponta de uma micropipeta (por exemplo, Eppendorf). Depois o agar que contém os vírus recombinantes é ressuspenso num tubo de microcentrifugação que contém 200 μΐ de meio de Grace e usa-se a suspensão que contém o baculovírus recombinante para infetar células Sf9 semeadas em placas de 35 mm. Quatro dias depois os sobrenadantes são colhidos destas placas de cultura e depois são armazenados a 4 °C.

Para verificar a expressão do polipéptido, são crescidas as células Sf9 em meio de Grace suplementado com FBS a 10 % inativado por calor. As células são infetadas com o baculovírus recombinante que contém o polinucleótido a uma multiplicidade de infeção ("MOI") de aproximadamente 2. Se proteínas radiomarcadas forem desejadas, o meio é retirado 6 horas depois e é substituído com meio SF900 II menos metionina e cisteína (disponível através de Life Technologies Inc., Rockville, MD) . Depois de 42 horas, são adicionados 5 pCi de 35S-metionina e 5 pCi de 35S-cisteína (disponíveis através de Amersham). As células são incubadas adicionalmente durante 16 horas e depois são colhidas por meio de centrifugação. As proteínas no sobrenadante assim como as proteínas intracelulares são analisadas por meio de SDS-PAGE seguida de autorradiografia (em caso de que estejam radiomarcadas). A microsequenciamento da sequência de aminoácidos da extremidade amino da proteína purificada pode ser usada para determinar a sequência amino terminal da proteína produzida.

EXEMPLO 12 - EXPRESSÃO DE UM POLIPÉPTIDO EM CÉLULAS DE MAMÍFERO 0 polipéptido da presente invenção pode ser expresso numa célula de mamífero. Um vetor de expressão de mamífero típico contém um elemento promotor, que medeia o início da transcrição de ARNm, uma sequência codificante de proteína, e sinais necessários para a terminação da transcrição e a poliadenilação do transcrito. Os elementos adicionais incluem potenciadores, sequências Kozak e sequências intervenientes flanqueadas por locais de dador e aceitador para o splicing de ARN. Consegue-se uma transcrição elevadamente eficaz com os promotores precoces e tardios de SV40, as repetições longas terminais (LTR) de retrovirus, por exemplo, RSV, HTLVI, HIVI e o promotor precoce de citomegalovirus (CMV). No entanto, também podem ser usados elementos celulares (por exemplo, o promotor de actina humano).

Os vetores de expressão adequados para sua utilização na prática da presente invenção incluem, por exemplo, vetores tais como pSVL e pMSG (Pharmacia, Uppsala, Suécia), pRSVcat (ATCC® 37152), pSV2dhfr (ATCC® 37146), pBC12MI (ATCC® 67109), pCMVSport 2,0, e pCMVSport 3,0. As células de mamífero que podem ser usadas incluem células Hela, 293, H9 e Jurkat humanas, células NIH3T3 e C127 de ratinho, células COS 1, Cos 7 e CV1, células QC1-3 de codorna, células L de ratinho e células de ovário de hámster chinês (CHO).

Como alternativa, o polipéptido pode ser expresso em linhas celulares estáveis que contêm o polinucleótido integrado num cromossoma. A co-transformação com um marcador de seleção, tal como dhfr, gpt, neomicina, higromicina permite a identificação e o isolamento das células transformadas. 0 gene transformado também pode ser amplificado para expressar grandes quantidades de proteína codificada. 0 marcador de DHFR (dihidrofolato redutase) é útil para desenvolver linhas celulares que portam várias centenas ou vários milhares de cópias do gene de interesse. (Veja-se, por exemplo, Alt, F. W., et al., J. Biol. Chem. 253:1357-1370 (1978) . Hamlin, J. L. e Ma, C., Biochem. et Biophys.

Acta, 1097:107-143 (1990) . Page, M. J. e Sydenham, Μ. A.,

Biotechnology 9:64-68 (1991).) Otro marcador de seleção útil é a enzima glutamina sintase (GS) (Murphy et al. , Biochem J. 227:277-279 (1991); Bebbington et al.,

Bio/Technology 10:169-175 (1992). Usando estes marcadores, as células de mamífero são crescidas em meio de seleção e são selecionadas as células com a resistência mais alta. Estas linhas celulares contêm o gene ou genes amplificados integrados num cromossoma. Com frequência são usadas células de ovário de hámster chinês (CHO) e NSO para a produção de proteínas.

Um polinucleótido da presente invenção é amplificado de acordo com o protocolo descrito no presente documento. Se for usada a sequência de sinal de origem natural para produzir a proteína, o vetor não necessita um segundo péptido de sinal. Como alternativa, se não se usa a sequência de sinal de origem natural, o vetor pode ser modificado para que inclua uma sequência de sinal heteróloga. (Veja-se, por exemplo, o documento WO 96/34891). 0 fragmento amplificado isola-se de um gel de agarose a 1 % usando um kit comercialmente disponível (GENECLEAN®, BIO 101 Inc., A Jolla, Ca.). Depois o fragmento é digerido com enzimas de restrição adequadas e purifica-se de novo num gel de agarose a 1 %.

Depois o fragmento amplificado é digerido com a mesma enzima de restrição e purifica-se num gel de agarose a 1 %. Depois ligam-se o fragmento isolado e o vetor desfosforilado com ADN ligase T4. Depois transformam-se células de E. coli HB101 ou XL-1 Blue e identificam-se as bactérias que contêm o fragmento inserido no plasmídeo pC6 usando, por exemplo, análise de enzimas de restrição.

Usam-se para a transformação células de ovário de hámster chinês que carecem de gene de DHFR ativo. Transformam-se conjuntamente cinco pg de um plasmídeo de expressão com 0,5 pg do plasmídeo pSVneo usando LIPOFECTIN® (Feigner et al. , anteriormente citado) . O plasmídeo pSV2-neo contém um marcador de seleção dominante, o gene neo de Tn5 que codifica uma enzima que confere resistência a um grupo de antibióticos, incluindo G418. As células são semeadas em MEM menos alfa suplementado com G418 a 1 mg/ml. Depois de 2 dias, as células são tripsinizadas e semeadas em placas de clonagem de hibridoma (Greiner, Alemanha) em MEM menos alfa suplementado com 10, 25, ou 50 ng/ml de metotrexato mais 1 mg/ml de G418. Depois de aproximadamente 10-14 dias os clones individuais são tripsinizados e semeados em placas de petri de 6 poços ou em balões de 10 ml usando diferentes concentrações de metotrexato (50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM). Os clones que crescem às maiores concentrações de metotrexato são transferidos posteriormente a novas placas de 6 poços que contêm concentrações ainda maiores de metotrexato (1 pM, 2 pM, 5 pM, 10 mM, 20 mM) . Repete-se o mesmo procedimento até que sejam obtidos clones que crescem a uma concentração de 100 - 200 μΜ. A expressão do produto génico desejado analisa-se, por exemplo, por meio de SDS-PAGE e Western blot ou por meio de análise de HPLC de fase reversa.

EXEMPLO 13 - MÉTODO PARA CREAR MUTANTES DE ELIMINAÇÃO N- E C-TERMINAL CORRESPONDENTES A POLIPÉPTIDOS DE PCSK9, PCSK9B OU PCSK9C DA PRESENTE INVENÇÃO

Tal como se descreve em outras partes do presente documento, podem ser criados mutantes de eliminação N- e C-terminal, além de qualquer combinação de eliminações N- e C-terminais das mesmas, correspondentes ao polipéptido de PCSK9, PCSK9b ou PCSK9c da presente invenção. Há disponível uma série de métodos para os peritos na especialidade para criar os ditos mutantes. Os ditos métodos podem incluir uma combinação de metodologias de amplificação por meio da PCR e clonagem génica. Embora um perito na especialidade da biologia molecular, por meio da utilização dos ensinamentos proporcionados ou citados no presente documento, e/ou de outro modo conhecidos na técnica como métodos padrão, poderia criar facilmente cada mutante de eliminação dos polipéptidos da presente invenção, os métodos exemplares são descritos mais adiante.

Em resumo, usando o clone de ADNc isolado que codifica a sequência de comprimento total do polipéptido de PCSK9b ou PCSK9c (tal como se descreve no presente documento, por exemplo), podem ser projetados iniciadores adequados de aproximadamente 15-25 nucleótidos derivados das posições 5' e 3' desejadas de SEQ ID N°: 1 ou de SEQ ID N°: 3 ou de SEQ ID N°: 38 para amplificar por meio da PCR, e posteriormente clonar, o mutante de eliminação N- e/ou C-terminal previsto. Os ditos iniciadores podem compreender, por exemplo, um codão de iniciação e de terminação para o iniciador 5' e 3', respetivamente. Os ditos iniciadores também podem conter locais de restrição para facilitar a clonagem do mutante de eliminação depois da amplificação.

Além disso, os iniciadores podem compreender sequências adicionais, tais como, por exemplo, sequências de marcador flag, sequências kozac, ou outras sequências discutidas e/ou citadas no presente documento.

Por exemplo, no caso do mutante de eliminação de Li 6 a R315 N-terminal de PCSK9b, poderiam ser usados os seguintes iniciadores para amplificar um fragmento de ADNc correspondente a este mutante

de eliminação:

Por exemplo, no caso do mutante de eliminação de Ml a P284 C-terminal de PCSK9b, poderiam ser usados os seguintes iniciadores para amplificar um fragmento de ADNc correspondente a este mutante de eliminação:

Por exemplo, no caso do mutante de eliminação de Li 6 a Q523 N-terminal de PCSK9c, poderiam ser usados os seguintes iniciadores para amplificar um fragmento de ADNc correspondente a este mutante de eliminação:

Por exemplo, no caso do mutante de eliminação de Ml a A306 C-terminal de PCSK9c, poderiam ser usados os seguintes iniciadores para amplificar um fragmento de ADNc correspondente a este mutante de eliminação:

Por exemplo, no caso do mutante de eliminação de Li 6 a Q692 N-terminal de PCSK9, poderiam ser usados os seguintes iniciadores para amplificar um fragmento de ADNc correspondente a este mutante de eliminação:

As condições de amplificação por meio da PCR representativas são proporcionadas a seguir, embora o perito na especialidade apreciará que podem ser necessárias outras condições para uma amplificação eficaz. Pode ser preparada uma mistura de reação PCR de 100 μΐ usando 10 ng do ADN molde (clone de ADNc de PCSK9b ou PCSK9c) , 4dNTPs 200 μΜ, iniciadores luM, 0,25U de ADN polimerase Tag (PE), e tampão de ADN polimerase Taq padrão. As condições de ciciado PCR típicas são as seguintes: 20-25 ciclos: 45 s, 93 graus 2 min, 50 graus 2 min, 72 graus 1 ciclo: 10 min, 72 graus

Depois da etapa final de extensão da PCR, podem ser adicionados 5 U de fragmento Klenow e incubados durante 15 min a 30 graus.

Após a digestão do fragmento com as enzimas de restrição Notl e Sail, o fragmento pode ser clonado num vetor de expressão e/ou clonagem adequado que foi digerido de maneira similar (por exemplo, pSportl, entre outros) . O perito na especialidade apreciará que poderiam ser substituídos igualmente outros plasmídeos, e pode ser desejável em determinadas circunstâncias. O fragmento digerido e o vetor ligam-se posteriormente usando uma ADN ligase, e depois se usam para transformar células de E.coli competentes usando métodos proporcionados no presente documento e/ou de outro modo conhecidos na técnica.

A sequência de iniciador 5' para amplificar qualquer mutante de eliminação N-terminal pode ser determinada por meio de referência à seguinte fórmula: (S+(X *3)) a ((S+(X * 3))+25), na que 'S' é igual à posição de nucleótido do codão inicial de iniciação de PCSK9b (SEQ ID N° : 1) ou PCSK9c (SEQ ID N° : 3) ou PCSK9 (SEQ ID N° : 38), e 'X' é igual ao aminoácido mais N-terminal do mutante de eliminação N-terminal previsto. O primeiro termo proporcionará a posição de nucleótido 5' de início do iniciador 5', enquanto que o segundo termo proporcionará a posição do nucleótido da extremidade 3' do iniciador 5' correspondente a uma cadeia sense de SEQ ID N°: 1 ou SEQ ID N°: 3 ou SEQ ID N°: 38. Uma vez que tenham sido determinadas as posições de nucleótido correspondentes do iniciador, pode ser criada a sequência nucleotidica final por meio da adição de sequências de local de restrição aplicáveis à extremidade 5' da sequência, por exemplo. Tal como se cita no presente documento, pode ser desejada a adição de outras sequências ao iniciador 5' em determinadas circunstâncias (por exemplo, sequências kozac, etc.).

A sequência de iniciador 3' para amplificar qualquer mutante de eliminação N-terminal pode ser determinada por meio de referência à seguinte fórmula: (S+(X *3)) a ( (S + (X * 3))-25), na que 'S' é igual à posição de nucleótido do codão inicial de iniciação de PCSK9b (SEQ ID N° : 1) ou PCSK9c (SEQ ID N° : 3) ou PCSK9 (SEQ ID N° : 38), e 'X' é igual ao aminoácido mais C-terminal do mutante de

eliminação N-terminal previsto. 0 primeiro termo proporcionará a posição de nucleótido 5' de inicio do iniciador 3', enquanto que o segundo termo proporcionará a posição de nucleótido da extremidade 3' do iniciador 3' correspondente à cadeia antissense de SEQ ID N° : 1 ou SEQ ID N° : 3 ou SEQ ID N° : 38. Uma vez que tenham sido determinadas as posições de nucleótido correspondentes do iniciador, pode ser criada a sequência nucleotidica final por meio da adição de sequências de local de restrição aplicáveis à extremidade 5' da sequência, por exemplo. Tal como se cita no presente documento, pode ser desejada a adição de outras sequências ao iniciador 3' em determinadas circunstâncias (por exemplo, sequências de codão de detenção, etc.). 0 perito na especialidade apreciará que podem ser necessárias modificações das posições nucleotidicas anteriores para otimizar a amplificação por meio da PCR.

Podem ser usadas as mesmas fórmulas generais proporcionadas anteriormente para identificar as sequências de iniciador 5' e 4' para amplificar qualquer mutante de eliminação C-terminal dos polipéptidos da presente invenção. Além disso, podem ser usadas as mesmas fórmulas generais proporcionadas anteriormente para identificar as sequências de iniciador 5' e 4' para amplificar qualquer combinação de mutante de eliminação N-terminal e C-terminal dos polipéptidos da presente invenção. 0 perito na especialidade apreciará que podem ser necessárias modificações das posições nucleotídicas anteriores para otimizar a amplificação por meio da PCR.

EXEMPLO 14 - PROTEÍNAS DE FUSÃO

Os polipéptidos da presente invenção estão fusionados preferentemente a outras proteínas. Estas proteínas de fusão podem ser usadas para uma diversidade de aplicações. Por exemplo, a fusão dos presentes polipéptidos a marcador His, marcador HA, proteína A, domínios de IgG, e proteína de união a maltosa facilita a purificação. (tal como se descreve no presente documento; veja-se também o documento EP A 394,827; Traunecker, et ai., Nature 331:84-86 (1988)). De maneira similar, a fusão a IgG-1, IgG-3, e albumina aumenta o tempo de semivida in vivo. Os sinais de localização nuclear fusionados aos polipéptidos da presente invenção podem dirigir a proteína a uma localização subcelular específica, enquanto que os heterodímeros ou homodímeros covalentes podem aumentar ou diminuir a atividade de uma proteína de fusão. As proteínas de fusão também podem criar moléculas quiméricas que têm mais de uma função. Finalmente, as proteínas de fusão podem aumentar a solubilidade e/ou a estabilidade da proteína fusionada em comparação com a proteína não fusionada. Todos os tipos de proteínas de fusão descritos anteriormente podem ser produzidos modificando o seguinte protocolo, que descreve a fusão de um polipéptido a uma molécula de IgG.

Em resumo, a porção Fc humana da molécula de IgG pode ser amplificada por meio da PCR usando iniciadores que abrangem as extremidades 5' e 3' da sequência descrita a seguir. Estes iniciadores também devem ter locais de enzima de restrição convenientes que facilitarão a clonagem num vetor de expressão, preferentemente um vetor de expressão em mamífero. Note-se que o polinucleótido se clona sem um codão de parada, de outro modo não se produziria uma proteína de fusão. A sequência de sinal de origem natural pode ser usada para produzir a proteína (se for aplicável) . Como alternativa, se não se usa a sequência de sinal de origem natural, o vetor pode ser modificado para que inclua uma sequência de sinal heteróloga. (Veja-se, por exemplo, o documento WO 96/34891 e/ou a Patente US N° 6.066.781, citadas anteriormente).

Região Fc de IgG humana

GGGATCCGGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGC

ACCTGAATTCGAGGGTGCACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC

ACCCTCATGATCTCCCGGACTCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTAAGCC

ACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATA

ATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACGGTGTGGTCA

GCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCA

AGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAACCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCA

AAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGC

TGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCAAGCGA

CATCGCCGTGGAGTGGGAGAGGAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCAC

GCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTG

GACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAG

GCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAG TGCGACGGCCGCGACTCTAGAGGAT (SEQ ID N°: 21)

EXEMPLO 15 - PRODUÇÃO DE UM ANTICORPO A PARTIR DE UM

POLIPÉPTIDO

Os anticorpos da presente invenção podem ser preparados por meio de uma diversidade de métodos. (Veja-se, Current Protocols, Capitulo 2) . Como exemplo dos ditos métodos, as células que expressam um polipéptido da presente invenção são administrados a um animal para induzir a produção de soros que contêm anticorpos policlonais. Num método preferido, prepara-se uma preparação da proteína e purifica-se para deixa-la substancialmente livre de contaminantes naturais. A dita preparação é introduzida então num animal para produzir antissoros policlonais de maior atividade específica.

No método mais preferido, os anticorpos da presente invenção são anticorpos monoclonais (ou fragmentos de união a proteínas dos mesmos). Os ditos anticorpos monoclonais podem ser preparadas usando tecnologia de hibridoma. (Kõhler et al., Nature 256:495 (1975); Roller et al., Eur. J. Immunol. 6:511 (1976); Kõhler et al., Eur. J. Immunol. 6:292 (1976); Hammerling et al. , em: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.E., págs. 563-681 (1981)) . Em geral, os ditos procedimentos implicam imunizar a um animal (preferentemente um ratinho) com polipéptido ou, mais preferentemente, com uma célula que expressa polipéptido. As ditas células podem ser cultivadas em qualquer meio de cultura tissular adequado; no entanto, é preferível cultivar as células em meio Eagle modificado de Earle suplementado com soro bovino fetal a 10 % (inativado a aproximadamente 56 °C) , e suplementar-se com aproximadamente 10 g/1 de aminoácidos não essenciais, aproximadamente 1.000 U/ml de penicilina, e aproximadamente 100 pg/ml de estreptomicina.

Os esplenócitos dos ditos ratinhos são estraídos e fusionados com uma linha celular de mieloma adequada. Pode ser utilizada qualquer linha celular de mieloma adequada; no entanto, é preferível utilizar a linha celular parental de mieloma (SP20), disponível através da ATCC®. Depois da fusão, as células de hibridoma resultantes são mantidas de maneira seletiva em meio HAT, e depois são clonadas por meio de diluição limitativa tal como se descreve por Wands et al. (Gastroenterology 80:225-232 (1981)). As células de hibridoma obtidas por meio da dita seleção são ensaiadas posteriormente para identificar clones que segregam anticorpos capazes de ligarem-se ao polipéptido.

Como alternativa, podem ser produzidos anticorpos adicionais capazes de ligarem-se ao polipéptido num procedimento em duas etapas usando anticorpos anti-idiotípicos. 0 dito método utiliza o facto de que os anticorpos são antigénios por si mesmos, e portanto, é possível obter um anticorpo que se liga a um segundo anticorpo. De acordo com este método, usam-se anticorpos específicos de proteína para imunizar a um animal, preferentemente a um ratinho. Os esplenócitos do dito animal usam-se então para produzir células de hibridoma, e as células de hibridoma são rastreadas para identificar clones que produzem um anticorpo cuja capacidade para ligar-se ao anticorpo específico de proteína possa ser bloqueada pelo polipéptido. Os ditos anticorpos compreendem anticorpos anti-idiotípicos para o anticorpo específico de proteína e podem ser usadas para imunizar a um animal para induzir a formação de anticorpos específicos de proteína adicionais.

Será apreciado que podem ser usados fragmentos Fab e F(ab')2 e outros fragmentos dos anticorpos da presente invenção de acordo com os métodos divulgados no presente documento. Os ditos fragmentos são produzidos tipicamente por meio de excisão proteolítica, usando enzimas, tais como papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F(ab')2) · Como alternativa, os fragmentos de união a proteínas podem ser produzidos por meio da aplicação de tecnologia de ADN recombinante ou por meio de química sintética.

Para a utilização in vivo de anticorpos em seres humanos, pode ser preferível usar anticorpos monoclonais quiméricos "humanizados". Os ditos anticorpos podem ser produzidos usando construções genéticas derivadas de células de hibridoma que produzem os anticorpos monoclonais descritos anteriormente. São conhecidos na técnica métodos para produzir anticorpos quiméricos. (Veja-se, para uma revisão, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Cabilly et al. , a Patente US N° 4.816.567; Taniguchi et al., o documento EP 171496; Morrison et al., o documento EP 173494; Neuberger et al., o documento WO 8601533; Robinson et al., o documento WO 8702671; Boulianne et al., Nature 312:643 (1984); Neuberger et al., Nature 314:268 (1985)).

Além disso, em outro método preferido, os anticorpos dirigidos contra os polipéptidos da presente invenção podem ser produzidos em plantas. Divulgam-se métodos específicos nas Patentes US N° 5.959.177 e 6.080.560. Os métodos não somente descrevem métodos para expressar anticorpos, mas também os meios para montar proteínas multiméricas exógenas em plantas (isto é, anticorpos, etc.), e a posterior secreção dos ditos anticorpos pela planta.

EXEMPLO 16 - REGULAÇÃO DA EXPRESSÃO DE PROTEÍNAS POR MEIO DE AGREGAÇÃO CONTROLADA NO RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO

Tal como se descreve mais particularmente no presente documento, as proteínas regulam diversos processos celulares em organismos superiores, gue variam desde alterações metabólicas rápidas até o crescimento e diferenciação. A produção aumentada de proteínas específicas poderia ser usada para evitar determinadas doenças e/ou patologias. Portanto, a capacidade para modular a expressão de proteínas específicas num organismo proporcionará benefícios significativos.

Desenvolveram-se até o momento numerosos métodos para a introdução de genes exógenos, bem sob o controlo de um promotor induzível, constitutivamente ativo ou endógeno, em organismos. São particularmente interessantes os promotores induziveis (veja-se, M. Gossen, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA., 89:5547 (1992); E. Wang, et al. , Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 91:8180 (1994), D. N°, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 93:3346 (1996); e V.M. Rivera, et al. , Nature Med, 2:1028 (1996); além de exemplos adicionais divulgados em outras partes do presente documento). Num exemplo, o gene para eritropoietina (Epo) foi transferido a ratinhos e primatas sob o controlo para sua expressão de um indutor de molécula pequena (por exemplo, tetraciclina ou rapamicina) (veja-se, D. Bohl, et al. , Blood, 92:1512, (1998) ; K.G. Rendahl, et al., Nat. Biotech, 16:757, (1998); V.M. Rivera, et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96:8657 (1999) ; e X.Ye et al. , Science, 283:88 (1999). Embora os ditos sistemas permitam a indução eficaz do gene de interesse no organismo após a adição do agente indutor (isto é, tetraciclina, rapamicina, etc.), os níveis de expressão tendem a alcançar um pico às 24 horas e voltam aos níveis de fundo depois de 4 a 14 dias. Portanto, a expressão transitória controlada é virtualmente impossível usando estes sistemas, embora poderia ser desejável seu controlo.

Descobriu-se recentemente um método para controlar os níveis de expressão génica de um transgene (isto é, inclui transformantes estáveis e transitórios) (V.M. Rivera., et al., Science, 287:826-830 (2000)). Este método não controla a expressão génica a nível do ARNm como os sistemas anteriormente mencionados. Ao invés disso, o sistema controla o nível de proteína em forma ativa segregada. Na ausência do agente indutor, a proteína agrega-se no RE e não se secreta. No entanto, a adição do agente indutor tem como resultado a desagregação da proteína e a posterior secreção do RE. O dito sistema permite uma secreção basal baixa, a secreção rápida de alto nível na presença do agente indutor, e o fim rápido da secreção após a retirada do agente indutor. De facto, a secreção de proteínas alcançou um nível máximo aos 30 minutos da indução, e um fim rápido da secreção à hora de retirar o agente indutor. O método também é aplicável para controlar o nível de produção para proteínas de membrana.

Apresentam-se métodos pormenorizados em V.M. Rivera., et al., Science, 287:826-830, (2000)), em resumo:

Criam-se construções de proteína de fusão usando sequências polinucleotídicas da presente invenção com uma ou mais cópias (preferentemente pelo menos 2, 3, 4, ou mais) de um domínio de agregação condicional (CAD), um domínio que interage consigo mesmo de uma maneira reversível por ligando (isto é, na presença de um agente indutor) usando métodos de biologia molecular conhecidos na técnica e discutidos em outras partes do presente documento. O domínio CAD pode ser o domínio mutante isolado da proteína FKBP12 (Phe36 a Met) humana (tal como se divulga em V.M. Rivera., et al.r Science, 287:826-830, (2000), ou como alternativa outras proteínas que têm domínios com propriedades de autoagregação reversíveis por ligando similares. Como princípio de projeto, o vetor de proteína de fusão poderia conter uma sequência de excisão de furina unida operativamente entre os polinucleotidos da presente invenção e os domínios CAD. O dito local de excisão poderia permitir a excisão proteolítica dos domínios CAD do polipéptido da presente invenção depois da secreção desde o RE e após a entrada no trans-Golgi (J.B. Denault, et al., FEBS Lett., 379:113, (1996)). Como alternativa, o perito na especialidade reconhecerá que poderia ser substituída qualquer sequência de excisão proteolítica pela sequência de furina sempre que a sequência substituída seja excisável bem de maneira endógena (por exemplo, a sequência de furina) ou de maneira exógena (por exemplo, depois da secreção, depois da purificação, depois da produção, etc.). A sequência preferida de cada caraterística da construção de proteína de fusão, na direção de 5' a 3' estando cada caraterística unida operativamente à seguinte, seria um promotor, sequência de sinal, "X" número de domínios (CAD)x, a sequência de furina (ou outra sequência proteolítica), e a sequência codificante do polipéptido da presente invenção. 0 perito apreciará que o promotor e a sequência de sinal, independentes entre si, podem ser bem o promotor endógeno ou a sequência de sinal de um polipéptido da presente invenção, ou como alternativa, poderiam ser uma sequência de sinal e um promotor heterólogos.

Os métodos específicos descritos no presente documento para controlar os níveis de secreção de proteínas por meio de agregação controlada no RE não pretendem ser limitativos e devem ser aplicáveis geralmente a qualquer dos polinucleótidos e polipéptidos da presente invenção, incluindo variantes, homólogos, ortólogos, e fragmentos destes.

EXEMPLO 17 - ALTERAÇÃO DOS LOCAIS DE GLUCOSILAÇÃO DE PROTEÍNAS PARA POTENCIAR CARATERÍSTICAS DOS POLIPÉPTIDOS DA INVENÇÃO

Muitas superfícies celulares eucariotas e proteínas são processadas postraducionalmente para incorporar hidratos de carbono unidos a N ou unidos a 0 (Kornfeld e Kornfeld (1985) Annu. Rev. Biochem. 54:631-64; Rademacher et al., (1988) Annu. Rev. Biochem. 57:785-838). Acredita-se que a glicosilação de proteínas cumpre uma diversidade de funções que incluem: aumento da dobragem de proteínas, inibição da agregação de proteínas, regulação do tráfico intracelular a organelos, aumento da resistência à proteólise, modulação da antigenicidade de proteínas, e mediação da adesão intercelular (Fieldler e Simons (1995) Cell, 81:309-312; Helenius (1994) Mol. Biol. Of the Cell 5:253-265; Olden et al., (1978) Cell, 13:461-473; Caton et al. , (1982) Cell, 37:417-427; Alexamnder e Elder (1984), Science, 22 6:132 8-1330; e Flack et al., (1994), J. Biol. Chem., 269:14015-14020). Em organismos superiores, a natureza e o âmbito da glicosilação pode afetar de maneira notável à semivida em circulação e à biodisponibilidade das proteínas por meio de mecanismos que implicam a captação e eliminação mediada por recetor (Ashwell e Morrell, (1974),

Adv. Enzymol., 41:99-128; Ashwell e Harford (1982), Ann. Rev. Biochem., 51:531-54) . Foram identificados sistemas de recetor que se acredita que desempenhem um papel importante na eliminação de proteínas séricas por meio do reconhecimento de diversas estruturas de hidratos de carbono nas glucoproteínas (Stockert (1995), Physiol. Rev., 75:591-609; Kery et al., (1992), Arch. Biochem. Biophys., 298:49-55). Portanto, as estratégias de produção que têm como resultado a união incompleta de resíduos de ácido siálico terminais poderiam proporcionar um meio para reduzir a biodisponibilidade e semivida das glucoproteínas. Pelo contrário, as estratégias de expressão que têm como resultado uma saturação dos locais de união de ácido siálico terminal podem prolongar a biodisponibilidade e semivida das proteínas.

No desenvolvimento de glucoproteínas recombinantes para sua utilização como produtos farmacêuticos, por exemplo, especulou-se que a farmacodinâmica das proteínas recombinantes pode ser modulada por meio da adição ou eliminação de locais de glicosilação da estrutura primária de uma glucoproteína (Berman e lasky (1985a) Trends in Biotechnol., 3:51-53). No entanto, os estudos comunicaram que a eliminação de locais de glicosilação unidos a N com frequência altera o transporte intracelular e tem como resultado a acumulação intracelular de variantes de local de glicosilação (Machamer e Rose (1988), J. Biol Chem., 263:5955-5960; Gallagher et al., (1992), J. Virology., 66:7136-7145; Collier et al., (1993), Biochem., 32:7818-7823; Claffey et al., (1995) Biochemica et Biophysica Acta, 1246:1-9; Dube et al., (1988), J. Biol. Chem. 263:17516- 17521). Embora as variantes de locais de glicosilação de proteínas possam ser expressas intracelularmente, foi demonstrado que é difícil recuperar quantidades úteis de meio de cultura celular acondicionado para crescimento.

Além disso, não está claro até que ponto o local de glicosilação numa espécie será reconhecido pela maquinaria de glicosilação de outra espécie. Devido à importância da glicosilação no metabolismo de proteínas, particularmente na secreção e/ou expressão da proteína, se um sinal de glicosilação for reconhecido isso pode determinar profundamente a capacidade de uma proteína para ser expressa, de maneira endógena ou recombinantemente, em outro organismo (isto é, expressando uma proteína humana em E.coli, leveduras, ou organismos virais; ou uma proteína de E. coli, de levedura ou virai em humanos, etc.). Portanto, pode ser desejável adicionar, eliminar, ou modificar um local de glicosilação, e possivelmente adicionar um local de glicosilação de uma espécie a uma proteína de outra espécie para melhorar as caraterísticas funcionais, de bioprocesso de purificação, e/ou estruturais da proteína (por exemplo, um polipéptido da presente invenção).

Pode ser utilizada uma série de métodos para identificar a localização dos locais de glicosilação numa proteína. Um método preferido é passar a proteína traduzida pelo software PROSITE (Swiss Institute of Bioinformatics). Uma vez identificados, os locais podem ser eliminados de maneira sistemática, ou alterados, a nível de ADN usando metodologia de mutagénese conhecida na técnica e disponível para o perito na especialidade, preferentemente, usando mutagénese dirigida por meio da PCR (Veja-se Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY (1982)). De maneira similar, os locais de glicosilação podem ser adicionados, ou modificados a nível de ADN usando métodos similares, preferentemente métodos PCR (Veja-se, Maniatis, anteriormente citado). Os resultados de modificar os locais de glicosilação para uma proteína particular (por exemplo, solubilidade, potencial de secreção, atividade, agregação, resistência à proteólise, etc.) poderiam ser analisados então usando métodos conhecidos na técnica. 0 perito na especialidade reconhecerá a existência de outros algoritmos informáticos capazes de prever a localização dos locais de glicosilação numa proteína. Por exemplo, o software Motif (grupo de programas Genetics Computer Group) proporciona também esta função.

EXEMPLO 18 - MÉTODO PARA POTENCIAR A ATIVIDADE BIOLÓGICA/caraterísticas funcionais da invenção por meio de

EVOLUÇÃO MOLECULAR

Embora muitas das proteínas mais biologicamente ativas conhecidas sejam elevadamente eficazes para sua função específica num organismo, com frequência possuem caraterísticas que as tornam não desejadas para aplicações transgénicas, terapêuticas, e/ou industriais. Entre estas caraterísticas, uma semivida fisiológica curta é o problema mais importante, e está presente bem ao nível da proteína, ou ao nível do ARNm da proteína. A capacidade para estender a semivida, por exemplo, seria particularmente importante para a utilização de uma proteína em terapêutica génica, produção de animais transgénicos, o bioprocesso de produção e a purificação da proteína, e a utilização da proteína como modulador químico, entre outros. Portanto, existe uma necessidade de identificar novas variantes de proteínas isoladas que possuem caraterísticas que potenciam sua aplicação como agente terapêutico para tratar doenças de origem animal, além da aplicabilidade das proteínas a aplicações industriais e farmacêuticas comuns.

Portanto, um aspeto da presente invenção refere-se à capacidade para potenciar caraterísticas especificas da invenção por meio de evolução molecular dirigida. 0 dito potenciamento pode, num exemplo não limitativo, beneficiar a utilidade da invenção como componente essencial num kit, os atributos físicos da invenção, tais como sua solubilidade, estrutura, ou otimização de codões, a atividade biológica específica da invenção, incluindo qualquer atividade enzimática associada, a cinética enzimática da proteína, a Ki, Kcat, Km, Vmax, Kd da proteína, a atividade proteína-proteína, a atividade de união proteína-ADN, a atividade antagonista/inibidora (incluindo interação direta ou indireta), a atividade agonista (incluindo interação direta ou indireta), a antigenicidade da proteína (por exemplo, onde poderia ser desejável bem aumentar ou bem diminuir o potencial antigénico da proteína), a imunogenicidade da proteína, a capacidade da proteína para formar dimeros, trimeros, ou multímeros bem consigo mesma ou com outras proteínas, a eficácia antigénica da invenção, incluindo sua utilização posterior como tratamento preventivo para doenças ou patologias, ou como um efetor para ser dirigido a genes doentes. Além disso, a capacidade para potenciar caraterísticas específicas de uma proteína também pode ser aplicável a alterar a atividade caraterizada de uma enzima a uma atividade completamente inconexa com sua atividade inicialmente caraterizada. Outras melhoras desejáveis da invenção seriam específicas para cada proteína individual, tal como se conhece bem na técnica. A evolução dirigida está composta de várias etapas. A primeira etapa é estabelecer uma biblioteca de variantes para o gene ou proteína de interesse. A etapa mais importante é portanto selecionar aquelas variantes que acarretam a atividade que se quer identificar. 0 projeto do rastreio é essencial já que este rastreio deve ser o suficientemente seletivo como para eliminar variantes não úteis, mas não tão restringente como para eliminar todas as variantes. A última etapa é portanto repetir as etapas anteriores usando a melhor variante do rastreio prévio. Cada ciclo sucessivo pode portanto ser ajustado conforme for necessário, tal como aumentando a restringência da seleção, por exemplo.

Ao longo dos anos uma série de métodos foi desenvolvida para introduzir mutações em macromoléculas.

Alguns de estes métodos incluem mutagénese ao azar, PCR propensa a errores, mutagénese química, mutagénese de local dirigido, e outros métodos bem conhecidos na técnica (para uma lista exaustiva dos métodos atuais de mutagénese, veja-se Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring, NY (1982)). Tipicamente, os ditos métodos foram usados, por exemplo, como ferramentas para identificar as regiões funcionais principais de uma proteína ou a função de domínios específicos de uma proteína (no caso de uma proteína multi-domínio). No entanto, os ditos métodos foram aplicados mais recentemente para a identificação de variantes de macromoléculas com caraterísticas específicas ou potenciadas. A mutagénese aleatória tem sido o método mais amplamente reconhecido até o momento. Tipicamente, isto foi levado a cabo bem por meio da utilização de PCR "propensa a erros" (tal como se descreve em Moore, J., et al., Nature Biotechnology 14:458, (1996), ou por meio da aplicação de oligonucleótidos sintéticos aleatorizados correspondentes a regiões de interesse específicas (tal como se descreve por Derbyshire, K.M. et al., Gene, 46:145-152, (1986), e Hill, DE, et al., Methods Enzymol., 55:559-568, (1987) . Ambas estratégias têm limitações no nível de mutagénese que pode ser obtido. No entanto, qualquer estratégia permite ao investigador controlar de maneira eficaz a taxa de mutagénese. Isto é particularmente importante levando em consideração o facto de que as mutações beneficiosas para a atividade da proteína são bastante raras. De facto, usando um nível de mutagénese demasiado alto pode contra-atacar ou inibir o beneficio desejado de uma mutação útil.

Embora ambos métodos anteriormente mencionados sejam eficazes para criar grupos aleatorizados de variantes de macromoléculas, descobriu-se recentemente um terceiro método, denominado "reordenamento de ADN", ou "PCR sexual" (WPC, Stemmer, PNAS, 91:10747, (1994)). 0 reordenamento de ADN também foi citado como "evolução molecular dirigida", "reordenamento de exões", "evolução enzimática dirigida", "evolução in vitro", e "evolução artificial". Os ditos termos de referência são conhecidos na técnica. Este método novo preferido aparentemente supera as limitações dos métodos anteriores contanto que não somente propague traços positivos, mas que elimina simultaneamente traços negativos na progénie resultante. O reordenamento de ADN cumpre esta tarefa combinando os princípios da recombinação in vitro, com o método da PCR "propensa a erros". De facto, começa-se com um grupo digerido aleatório de pequenos fragmentos de um gene, criado por meio de digestão com DNase I, e depois se introduzem os ditos fragmentos aleatórios numa reação de montagem de PCR "propensa a erros". Durante a reação da PCR, os fragmentos de ADN de tamanho aleatório não somente hibridam com sua cadeia afim, mas que também podem hibridar com outros fragmentos de ADN correspondentes a diferentes regiões do polinucleótido de interesse, regiões que não estão tipicamente acessíveis por meio de hibridação do polinucleótido completo. Além disso, já que a reação de montagem por meio da PCR utiliza condições de reação de PCR "propensa a erros", introduzem-se mutações aleatória durante a etapa de síntese de ADN da reação da PCR para todos os fragmentos, diversificando adicionalmente os locais potenciais de hibridação durante a etapa de hibridação da reação.

Podem ser utilizados uma diversidade de condições de reação para levar a cabo a reação de reordenamento de ADN. No entanto, as condições de reação especificas para o reordenamento de ADN são proporcionadas, por exemplo, em PNAS, 91:10747, (1994). Em resumo:

Prepara-se o substrato de ADN para ser submetido à reação de reordenamento de ADN. A preparação pode ser em forma simplesmente de purificação do ADN de material celular contaminante, agentes químicos, tampões, iniciadores oligonucleotídicos, desoxinucleótidos, ARN, etc., e pode acarretar na utilização de kits de purificação de ADN, tais como aqueles proporcionados por Qiagen, Inc., ou por Promega, Corp., por exemplo.

Uma vez que o substrato de ADN tenha sido purificado, pode ser submetido a digestão por meio de DNase I. Serão digeridos aproximadamente 2-4 pg do substrato ou substratos de ADN com 0,0015 unidades de DNase I (Sigma) por μΐ em 100 μΐ de Tris-HCl 50 mM, pH 7,4/MgCl2 lmM durante 10-20 min a temperatura ambiente. Os fragmentos resultantes de 10-50 pb poderiam ser purificados passando-os por meio de eletroforese através de um gel de agarose de sob ponto de fusão a 2 % sobre papel de permuta iónica DE81 (Whatmann) ou poderia ser purificado usando concentradores MICROCON® (Amicon) do valor de corte de massa molecular adequado, ou poderiam ser usados colunas de purificação de oligonucleotidos (Qiagen), além de outros métodos conhecidos na técnica. Em caso de usar papel de permuta iónica DE81, os fragmentos de 10-50 pb poderiam ser eluídos do dito papel usando NaCl 1M, seguido de precipitação em etanol.

Os fragmentos purificados resultantes poderiam ser submetidos então a uma reação de montagem por meio da PCR por meio de ressuspensão numa mistura PCR que contém: 2 mM de cada dNTP, MgCl2 2,2 mM, KC1 50 mM, Tris*HCL 10 mM, pH 9,0, e Triton X-100 a 0,1 %, a uma concentração final de fragmento de 10-30 ng/μΐ. Não são adicionados iniciadores neste ponto. Poderia ser usada ADN polimerase Taq (Promega) a 2,5 unidades por 100 μΐ de mistura de reação. Usa-se um programa para a PCR de 94 °C durante 60 s; 94 °C durante 30 s, 50-55 °C durante 30 s, e 72 °C durante 30 s usando 30-45 ciclos, seguido de 72 °C durante 5 min usando um termociclador PTC-150 de MJ RESEARCH® (Cambridge, MA).

Depois de completar a reação de montagem, poderia ser introduzida uma diluição a 1:40 do produto sem iniciador resultante numa mistura de PCR (usando a mesma mistura de tampão usada para a reação de montagem) que contém 0,8 pm de cada iniciador e submetendo a esta mistura a 15 ciclos de PCR (usando 94 °C durante 30 s, 50 °C durante 30 s, e 72 °C durante 30 s) . Os iniciadores citados poderiam ser iniciadores correspondentes às sequências de ácido nucleico do polinucleótido ou polinucleótidos utilizados na reação de reordenamento. Os ditos iniciadores podem consistir em pares de bases de ácido nucleico modificadas usando métodos conhecidos na técnica e citados em outras partes do presente documento, ou podem conter sequências adicionais (isto é, para adicionar locais de restrição, mutar pares de bases específicos, etc.). O produto reordenador, ensamblado e amplificado resultante pode ser purificado usando métodos bem conhecidos na técnica (por exemplo kits de purificação de PCR de Qiagen) e depois clonar-se a seguir usando enzimas de restrição adequadas.

Embora tenha sido publicada uma série de variações de reordenamento de ADN até o momento, as ditas variações serão óbvias para o perito na especialidade. O método de reordenamento de ADN também pode ser ajustado ao nível desejado de mutagénese usando os métodos descritos por Zhao, et al., (Nucl Acid Res., 25(6):1307-1308, (1997).

Tal como foi descrito anteriormente, uma vez que foi criado o grupo aleatorizado, pode ser submetido a um rastreio específico para identificar a variante que possui a caraterística ou as caraterísticas desejadas. Uma vez que tenha sido identificada a variante, pode ser usado o ADN correspondente à variante como substrato de ADN para iniciar outro ciclo de reordenamento de ADN. Este ciclo de reordenamento, seleção da variante de interesse otimizada, e depois reordenar de novo, pode ser repetido até que se crie a última variante. Os exemplos de rastreios de modelo aplicados para identificar variantes criadas usando tecnologia de reordenamento de ADN podem ser encontrados nas seguintes publicações: J. C., Moore, et al., J. Mol. Biol., 272:336-347, (1997), F.R., Cross, et al., Mol. Cell. Biol., 18:2923-2931, (1998), e A. Crameri., et al., Nat. Biotech., 15:436-438, (1997). 0 reordenamento de ADN tem várias vantagens. Primeiramente, utiliza mutações beneficiosas. Quando se combina com rastreio, o reordenamento de ADN permite o descobrimento das melhores combinações mutacionais e não assume que a melhor combinação contenha todas as mutações numa população. Em segundo lugar, a recombinação sucede simultaneamente com mutagénese pontual. Um efeito de forçar a que a ADN polimerase sintetize genes de comprimento total a partir do grupo de ADN de fragmentos pequenos é a taxa de mutagénese de fundo. Em combinação com um método de seleção restringente, evolucionou-se a atividade enzimática até um aumento de 16000 vezes contra a forma de tipo selvagem da enzima. Em essência, a mutagénese de fundo originou a variabilidade genética sobre a qual atuou a recombinação para potenciar a atividade.

Uma terceira caraterística da recombinação é que pode ser usada para eliminar mutações prejudiciais. Como já foi discutido anteriormente, durante o processo de aleatorização, para cada mutação beneficiosa pode haver pelo menos uma ou mais mutações neutras ou inibidoras. As ditas mutações podem ser eliminadas incluindo na reação de montagem um excesso dos fragmentos de tamanho aleatório de tipo selvagem, além dos fragmentos de tamanho aleatório do mutante selecionado a partir da seleção anterior. Durante a seleção seguinte, algumas das variantes mais ativas do polinucleótido/polipéptido/enzima deveriam ter perdido as mutações inibidoras.

Finalmente, a recombinação permite o processamento em paralelo. Isto representa uma vantagem significativa já que há provavelmente múltiplas caraterísticas que poderiam tornar mais desejável a uma proteína (por exemplo, solubilidade, atividade, etc.) . Já que cada vez é mais difícil rastrear mais de um traço desejável à vez, outros métodos de evolução molecular tendem a ser inibidores. No entanto, usando recombinação, poderia ser possível combinar os fragmentos aleatorizados das melhores variantes representativas para os diversos traços, e depois selecionar múltiplas propriedades de uma vez. 0 reordenamento de ADN também pode ser aplicado aos polinucleótidos e polipéptidos da presente invenção para diminuir sua imunogenicidade num hospedeiro especificado. Por exemplo, uma variante particular dos polinucleótidos ou polipéptidos da presente invenção pode ser criada e isolada usando tecnologia de reordenamento de ADN. A dita variante pode ter todas as caraterísticas desejadas, embora possa ser elevadamente imunogénica num hospedeiro devido a sua nova estrutura intrínseca. Especificamente, a caraterística desejada pode fazer com que o polipéptido tenha uma estrutura não nativa que não possa ser reconhecida já como molécula "própria", mas como "exógena", e portanto ativar uma resposta imune do hospedeiro dirigida contra a nova variante. A dita limitação pode ser superada, por exemplo, incluindo uma copia da sequência génica para um ortólogo xenobiótico da proteína nativa na sequência génica do novo gene variante num ou mais ciclos de reordenamento de ADN. Por conseguinte, a relação molar dos ADN do ortólogo e da nova variante pode ser variada. Idealmente, a variante híbrida resultante identificada poderia conter pelo menos parte da sequência codificante que permitiu que a proteína xenobiótica escapasse do sistema imune do hospedeiro, e além disso, a sequência codificante da nova variante original que proporcionou as caraterísticas desejadas.

Do mesmo modo, no presente documento descreve-se a aplicação de tecnologia de reordenamento de ADN à evolução de polinucleótidos e polipéptidos da invenção, na qual um ou mais ciclos de reordenamento de ADN incluem, além do ADN molde do gene, oligonucleótidos que codificam sequências alélicas, sequências de codões otimizadas, sequências variantes conhecidas, sequências de polimorfismos de polinucleótidos conhecidas, sequências de ortólogos conhecidas, sequências de homólogos conhecidas, sequências de homólogos adicionais, sequências de não homólogos adicionais, sequências procedentes de outra espécie, e qualquer número e combinação dos anteriores.

Além dos métodos descritos anteriormente, há uma série de métodos relacionados que também podem ser aplicáveis, ou desejáveis em determinados casos. Entre estes, são representativos os métodos descritos nos pedidos PCT WO 98/31700, e WO 98/32845. Além disso, também podem ser aplicados métodos relacionados às sequências polinucleótídicas da presente invenção para evolucionar a invenção para criar variantes idênticas para sua utilização em terapêutica génica, projeto de proteínas, evolução de células completas que contêm a variante, ou na evolução de vias enzimáticas completas que contêm polinucleótidos da presente invenção, tal como se descreve nos pedidos PCT WO 98/13485, WO 98/13487, WO 98/27230, WO 98/31837, e Crameri, A., et al., Nat. Biotech., 15:436-438, (1997), respetivamente.

Os métodos adicionais para aplicar tecnologia de "reordenamento de ADN" aos polinucleótidos e polipéptidos da presente invenção, incluindo suas aplicações propostas, podem ser encontrados na Patente US N° 5.605.793; o pedido PCT N° WO 95/22625; o pedido PCT N° WO 97/20078; o pedido PCT N° WO 97/35966; e o pedido PCT N° WO 98/42832; o pedido PCT N° WO 00/09727 proporciona especificamente métodos para aplicar reordenamento de ADN à identificação de culturas seletivas para herbicida que poderiam ser aplicadas aos polinucleótidos e polipéptidos da presente invenção; além disso, o pedido PCT N° WO 00/12680 proporciona métodos e composições para gerar, modificar, adaptar, e otimizar sequências polinucleotídicas que conferem propriedades fenotípicas detetáveis em espécies de plantas.

EXEMPLO 19 - MÉTODO PARA DETERMINAR ALTERAÇÕES NUM GENE QUE CORRESPONDE A UM POLINUCLEÓTIDO

Isola-se o ARN de famílias inteiras ou de pacientes individuais que apresentam um fenótipo de interesse (tal como uma doença) . Então ADNc é gerado a partir destas amostras de ARN usando protocolos conhecidos na técnica. (Veja-se, Sambrook). Depois usa-se o ADNc como molde para a PCR utilizando iniciadores que rodeiam às regiões de interesse em SEQ ID N°: 1. As condições da PCR sugeridas consistem em 35 ciclos a 95 °C durante 30 segundos; 60-120 segundos a 52-58 °C; e 60-120 segundos a 70 °C, usando soluções de tampão descritas em Sidransky et ai., Science 252:706 (1991) .

Depois são sequenciados os produtos da PCR usando iniciadores marcados em sua extremidade 5' com polinucleótido cinase T4, utilizando polimerase SequiTherm. (Epicentre Technologies). Os limites de intrão-exão dos exões selecionados também se determinam e os produtos genómicos da PCR são analisados para confirmar os resultados. Os produtos da PCR que se suspeita que portem mutações são clonados e sequenciados posteriormente para validez dos resultados do sequenciamento direto.

Os produtos da PCR são clonados em vetores com cauda de T tal como se descreve em Holton et al., Nucleic Acids Research, 19:1156 (1991) e são sequenciados com polimerase T7 (United States Biochemical). Os indivíduos afetados são identificados por mutações não presentes em indivíduos não afetados.

Também se observam os reordenamentos genómicos como método para determinar alterações num gene que corresponde a um polinucleótido. Os clones genómicos isolados de acordo com os métodos descritos no presente documento são submetidos a tradução de pequenos cortes com digoxigenina desoxiuridina 5'-trifosfato (Boehringer Manheim), e é levada a cabo FISH tal como se descreve em Johnson et al., Methods Cell Biol. 35:73-99 (1991). A hibridação com a sonda marcada é levada a cabo usando um grande excesso de ADN de cot-1 humano para a hibridação específica ao correspondente locus genómico.

Os cromossomas são contra-corados com 4,6-diamino-2-fenilidol e iodeto de propídio, produzindo uma combinação de bandas C e R. Obtêm-se imagens alinhadas para um mapeamento preciso usando um conjunto de filtros de banda tripla (Chroma Technology, Brattleboro, VT) em combinação com um dispositivo de câmara acoplado a uma carga arrefecida (Photometries, Tucson, AZ) e filtros de comprimento de onda de excitação variável. (Johnson et al., Genet. Anal. Tech. Appl., 8:75 (1991)). A colheita de imagens, a análise e as medições de comprimento fracionai cromossómica são levadas a cabo usando o sistema de programa gráfico ISEE®. (Inovision Corporation, Durham, NC) . As alterações cromossómicas da região genómica hibridada por meio da sonda são identificadas como inserções, deleções, e translocações. Estas alterações usam-se como marcador diagnóstico para uma doença associada.

EXEMPLO 20 - MÉTODO PARA DETETAR NÍVEIS ANORMAIS DE UM POLIPÉPTIDO NUMA AMOSTRA BIOLÓGICA

Um polipéptido da presente invenção pode ser detetado numa amostra biológica, e se for detetado um nível aumentado ou diminuído do polipéptido, este polipéptido é um marcador para um fenótipo particular. Os métodos de deteção são numerosos, e portanto, entende-se que um perito na especialidade pode modificar o seguinte ensaio para ser ajustado a suas necessidades particulares.

Por exemplo, usam-se ELISA sandwich de anticorpos para detetar polipéptidos numa amostra, preferentemente uma amostra biológica. Revestem-se os poços de uma placa de microtitulação com anticorpos específicos, a uma concentração de 0,2 a 10 pg/ml. Os anticorpos são monoclonais ou policlonais e são produzidos por meio do método descrito em outras partes do presente documento. Os poços são bloqueados de tal forma que se reduz a união não especifica do polipéptido ao poço.

Os poços revestidos são incubadas então durante > de 2 horas a TA com uma amostra que contém o polipéptido. Preferentemente, devem ser usadas diluições em série da amostra para validar os resultados. Depois as placas são lavadas três vezes com água destilada desionizada para eliminar o polipéptido não unido. A seguir, são adicionados 50 μΐ de conjugado anticorpo especifico-fosfatase alcalina, a uma concentração de 25-400 ng, e incuba-se durante 2 horas a temperatura ambiente. As placas são lavadas de novo três vezes com água destilada desionizada para eliminar o conjugado não unido. São adicionados 75 μΐ de solução de substrato de 4-metilumbeliferil fosfato (MUP) ou p-nitrofenil fosfato (NPP) a cada poço e incuba-se durante 1 hora a temperatura ambiente. Mede-se a reação com um leitor de placas de microtitulação. Elabora-se uma curva padrão usando diluições em série de uma amostra de controlo, e representa-se a concentração de polipéptido no eixo X (escala logarítmica) e a fluorescência ou a absorvância no eixo E (escala linear). A concentração do polipéptido na amostra interpola-se usando a curva padrão EXEMPLO 21 - MÉTODO PARA ISOLAR FRAGMENTOS DE ANTICORPO DIRIGIDOS CONTRA PCSK9b O PCSK9c A PARTIR DE UMA BIBLIOTECA DE scFv

Os genes V de origem natural isolados de PBL humanos são construídos numa biblioteca de fragmentos de anticorpo que contêm reatividades contra PCSK9b ou PCSK9c aos quais o dador pode ou não ter estado exposto (veja-se, por exemplo, a Patente US 5.885.793).

Resgate da biblioteca. Constrói-se uma biblioteca de scFv a partir do ARN de PBL tal como se descreve na Publicação PCT WO 92/01047. Para resgatar o fago que amostra fragmentos de anticorpo, usam-se aproximadamente 109 E. coli que portam o fagémido para inocular 50 ml de 2xTY que contém glucose a 1 % e 100 pg/ml de ampicilina (2xTY-AMP-GLU) e são crescidos até uma D.O. de 0,8 com agitação. Usam-se cinco ml desta cultura para inocular 50 ml de 2xTY-AMP-GLU, são adicionados 2 x 108 TU colaborador de gene 3 delta (gene III M13 delta, veja-se a Publicação PCT WO 92/01047) e incuba-se a cultura a 37 °C durante 45 minutos sem agitação e depois a 37 °C durante 45 minutos com agitação. A cultura é centrifugada a 4000 r.p.m. durante 10 min e depois o precipitado é ressuspenso em 2 litros de 2xTY que contém 100 pg/ml de ampicilina e 50 pg/ml de kanamicina e crescido durante a noite. Os fagos são preparados tal como se descreve na publicação PCT WO 92/01047.

O gene III M13 delta prepara-se do modo seguinte: O fago colaborador de gene III M13 delta não codifica proteína de gene III, portanto o fago (ou fagémido) que mostra fragmentos de anticorpo tem uma maior avidez pela união ao antigénio. As partículas infeciosas de gene III M13 delta preparam-se crescendo o fago colaborador em células que portam um derivado de pUC19 que fornece a proteína do gene III durante a morfogénese do fago. A cultura incuba-se durante 1 hora a 37 °C sem agitação e depois durante uma hora adicional a 37 °C com agitação. As células são precipitadas por centrifugação (IEC-Centra 8,400 r.p.m. durante 10 min), ressuspendem-se em 300 ml de caldo 2xTY que contém 100 pg de ampicilina/ml e 25 pg de kanamicina/ml (2xTY-AMP-KAN) e são crescidas durante a noite, com agitação a 37 °C. As partículas de fago são purificadas e concentradas a partir do meio de cultura por meio de duas precipitações com PEG (Sambrook et al., 1990), ressuspendem-se em 2 ml de PBS e são feitas passar através de um filtro de 0,45 pm (Minisart NML; Sartorius) para dar uma concentração de aproximadamente 1013 unidades transdutoras/ml (clones resistentes a ampicilina).

Panning da biblioteca. Revestem-se Immunotubes (Nunc) durante a noite em PBS com 4 ml de 100 pg/ml ou 10 pg/ml de um polipéptido da presente invenção. Os tubos são blogueados com Marvel-PBS a 2 % durante 2 horas a 37 °C e depois são lavados 3 vezes em PBS. Aplicam-se aproximadamente 1013 TU de fago ao tubo e incuba-se durante 30 minutos a temperatura ambiente virando para cima e para baixo e depois deixa-se repousar durante 1,5 horas adicionais. Os tubos são lavados 10 vezes com PBS, Tween-20 a 0,1 % e 10 vezes com PBS. Os fagos são eluídos adicionando 1 ml de trietilamina 100 mM e girando por inversão durante 15 minutos, após os guais se neutralizam imediatamente com 0,5 ml de Tris-HCl 1,0 M, pH 7,4. Depois usam-se os fagos para infetar 10 ml de TGI de E. coli de comprimento meios incubando os fagos eluídos com bactérias durante 30 minutos a 37 °C. Depois as E. coli são semeadas em placas TYE gue contêm glucose a 1 % e 100 pg/ml de ampicilina. A biblioteca bacteriana resultante se resgata depois com fago colaborador de gene 3 delta tal como foi descrito anteriormente para preparar fagos para uma ronda posterior de seleção. Este processo repete-se então até um total de 4 rondas de purificação de afinidade com lavado do tubo aumentado até 20 vezes com PBS, Tween-20 a 0,1 % e 20 vezes com PBS para as rondas 3 e 4.

Caraterização de fagos de união. Os fagos eluídos das rondas 3a e 4a de seleção usam-se para infetar E. coli HB 2151 e são produzidos scFv solúveis (Marks, et al., 1991) a partir de colónias individuais para ensaio. Os ELISA são levados a cabo com placas de microtitulação revestidas com 10 pg/ml do polipéptido da presente invenção em bicarbonato 50 mM, pH 9,6. Os clones positivos no ELISA caraterizam-se adicionalmente por meio de colheita de digitais por PCR (veja-se, por exemplo, a publicação PCT WO 92/01047) e depois por meio de sequenciamento. Estes clones positivos a ELISA podem ser caraterizados adicionalmente também por meio de técnicas conhecidas na especialidade, tais como, por exemplo, mapeamento de epítopos, afinidade de união, transdução de sinal de recetor, capacidade para bloquear ou inibir de maneira competitiva a união anticorpo/antigénio, e atividade agonista ou antagonista competitiva.

Além disso, em outro método preferido, os anticorpos dirigidos contra os polipéptidos da presente invenção podem ser produzidos em plantas. Divulgam-se métodos específicos nas Patentes US N° 5.959.177 e 6.080.560. Os métodos não somente descrevem métodos para expressar anticorpos, mas também os meios para montar proteínas multiméricas exógenas em plantas (isto é, anticorpos, etc.), e a posterior secreção dos ditos anticorpos pela planta.

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Bristol-Myers Squibb Company <120> POLINUCLEÓTIDOS QUE CODIFICAM NOVOS VARIANTES DE PCSK9

<130> 10836 PCT <150> US 60/818.234 <151> 30-06-2006 <160> 40 <170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 3175 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (250) .. (1194) <4 0 0> 1 gatgacttgg gtccttcttg gcagtagcat tgccagctga tggccfc tgga cagttacctg 60 ccctctctag gcctcccttt ccttgtctat gaaatacatt atagaatagg atgtagtgtg 120 tgaggatttt ttggaggt ea aacgagtgaa tatat ttaag gcgcctccac cagtgcctgg 180 gatgtgetct gtagtttctg tgtgttaact ataaggttga ctttatgctc attccctcct 240 ctcccacaa atg teg cct tgg aaa gac gga ggc age ctg gtg gag gtg tat 291

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Ala Ser Ala Pro Glu Val lie Thr Val Gly Ala Thr Asn Ala Gin Asp 160 165 170 cag ccg gtg acc ctg ggg act ttg ggg acc aac ttt ggc ege tgt gtg 819

Gin Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val 175 180 ' 185 190 gac etc ttt gcc cca ggg gag gac ate att ggt gcc tcc age gac tgc 867

Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp lie lie Gly Ala Ser Ser Asp Cys 195 200 205 age acc tgc ttt gtg tea cag agt ggg aca tea cag gcc get gee cac 915

Ser Thr Cys Phe Val Ser Gin Ser Gly Thr Ser Gin Ala Ala Ala His 210 215 220 gtg get ggc att gca gcc atg atg ctg tet gcc gag ccg gag etc acc 963

Val Ala Gly lie Ala Ala Met Met Leu Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr 225 230 235 ctg gcc gag ttg agg cag aga ctg ate cac ttc tet gcc aaa gat gte 1011

Leu Ala Glu Leu Arg Gin Arg Leu lie His Phe Ser Ala Lys Asp Val 240 245 250 ate aat gag gcc tgg ttc cet gag gac cag egg gta ctg .acc ccc aac 1059 lie Asn Glu Ala Trp phe Pro Glu Asp Gin Arg Val Leu Thr Pro Asn 255 260 265 270 ctg gtg gcc gcc ctg ccc ccc age acc cat ggg gca ggc cct ttt tgc 1107

Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr His Gly Ala Gly Pro Phe Cys 275 280 285 agg ttg gca get gtt ttg cag gac tgt gtg gte age aca etc ggg gcc 1155

Arg Leu Ala Ala val Leu Gin Asp Cys Val Val Ser Thr Leu Gly Ala 290 295 300 tac aeg gat ggc cac age cat ege ccg ctg ege ccc aga tgaggagctg 1204

Tyr Thr Asp Gly His Ser His Arg Pro Leu Arg Pro Arg 305 310 315 ctgagctgct ccagtttctc caggagtggg aagcggcggg gcgagcgcat ggaggcccaa 1264 gggggeaage tggtctgccg ggcccacaac gcttttgggg gtgagggtgt ctacgccatt 1324 gccaggtgct gcctgctace ccaggccaac tgcagcgtcc acacagctcc accagctgag 1384 gccagcatgg ggacccgtgt ccactgccac caacagggcc acgtccteae aggctgcagc 1444 tcccactggg aggtggagga ccttggcaec cacaagccgc ctgtgctgag gccacgaggt 1504 cagcccaacc agtgcgtggg ccacagggag gccagcatcc acgcttcceg ccgccatgcc 1564 ccaggtctgg aatgcaaagt caaggagcat ggaatcccgg cccctcagga gcaggtgacc 1624 gtggcctgcg aggagggctg gaccctgact ggctgcagtg ccctccctgg gacctcccac 1684 gtcctggggg cctecgccgt agacaacacg tgtgtagtca ggagccggga cgtcagcact 1744 acaggcagca ccogcgaaga ggccgtgaca gccgttgcca tctgctgccg gagccggcac 1804 ctggcgcagg cctcccagga gctccagtga cagccccatc ccaggatggg tgtctgggga 1864 gggtcaaggg ctggggctga getttaaaat ggttccgact tgtccctctc tcagccctcc 1924 atggcctggc acgaggggat ggggatgctt ccgcctttcc ggggctgctg gcctggccct 1984 tgagtggggc agcctecttg cctggaactc actcactctg ggtgcctcct ccccaggtgg 2044 aggtgccagg aagctccctc cctcactgtg gggcatttca ccattcaaac aggtegaget 2104 gtgctcgggt gctgccagct gctcccaatg tgccgatgtc cgtgggcaga atgactttta 2164 ttgegetett gttccgtgce aggeattcaa tcetcaggtc tccaccaagg aggeaggatt 2224 ettceeatgg ataggggagg gggcggtagg ggetgcaggg acaaacafccg ttggggggtg 2284 agtgtgaaag gtgctgatgg ccctcatctc cagctaactg tggagaagee cctgggggct 2544 ccctgattaa tggaggetta gctttctgga tggeatetag ccagaggctg gagacaggtg 2404 tgcccctggt ggteacaggc tgtgcettgg tttcctgagc cacctttact ctgctctatg 2464 ccaggctgtg ctagcaacac ccaaaggCgg ccCgcgggga gccatcacct aggactgact 2524 cggcagtgtg cagtggtgea tgcactgtct cagceaaccc gctccactac ccggcagggt 2584 acacattcgc accceeactt cacagaggaa gaaacctgga accagagggg gcgtgcctgc 2644 c&agctcaca cagcaggaac tgagccagaa aegcagattg ggctggctct gaageeaage 2704 ctcttcttac ttcacccggc tgggctcctc atttttacgg gtaacagtga ggctgggaag 2764 gggaacacag accaggaagc tcggtgagtg atggcagaac gatgcctgca ggcatggaac 2824 tttttccgtt atcacccagg cctgattcac tggcctggcg gagatgette taaggcatgg 2884 tcgggggaga gggccaacaa ctgtecetcc ttgagcacca gccccaccca agcaagcaga 2944 catttatctt ttgggtctgt cctctctgtt gcctttctac egccaaettt tctagacctg 3004 ttttgctttt gt.aaet.tgaa gatatttatt ctgggttttg tagcattttt attaatatgg 3064 tgacttttta aaataaaaac aaacaaacgt tgtcctaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3124 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3175

<210> 2 <211> 315 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Ser Pro Trp Lys Asp Gly Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu IS 10 15

Asp Thr Ser lie Gin Ser Asp His Arp Glu lie Glu Gly Arg Val Met 20 2S 30

Val Thr Asp Phe Glu Asn Val Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His 35 40 45

Arg Gin Ala Ser Lys Cys Asp Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val 50 55 60

Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser 65 70 75 80

Leu Arg Val Leu Asn Cys Gin Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu 85 90 95 lie Gly Leu Glu Phe lie Arg Lys Ser Gin Leu Val Gin Pro Val Gly 100 105 110

Pro Leu Val Val Leu Leu Pro Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu 115 120 125

Asn Ala Ala Cys Gin Arg Leu Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr 130 135 140

Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser 145 150 155 160

Ala Pro Glu Val lie Thr Vai Gly Ala Thr Ãsn Ala Gin Asp Gin Pro 165 170 175 \ i val Thr Leu Gly Thr Leu Gly Thr Asn Phe Gly Arg Cyc Val Asp Leu 180 185 190

Phe Ala Pro Gly Glu Asp lie He Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr 195 200 205

Cys Phe Val Ser Gin Ser Gly Thr Ser Gin Ala Ala Ala His Val Ala 210 215 220

Gly lie Ala Ala Met Met Leu Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala 225 230 235 240

Glu Leu Arg Gin Arg Leu lie His Phe Ser Ala Lys Asp Val lie Asn 245 250 255

Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp Gin Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val 260 265 270

Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr His Gly Ala Gly Pro Phe Cys Arg Leu 275 280 285

Ala Ala Val Leu Gin Asp Cys Val Val Ser Thr Leu Gly Ala Tyr Thr 290 295 300

Asp Gly His Ser His Arg Pro Leu Arg Pro Arg 305 310 315

<210> 3 <211> 3756 <212> ADN <213> Homo sapiens <22 0>

<221> CDS <222> (881) .. (2449) <400> 3 tgctagcagc aacctgcctg aagtcttcct ttggcctggc tgagagtttc tgagaectge 60 gctggagcgg aggtgcttcc ttccttgctt eetttcttcc tctcteeett ctccacccag 120 caggctggac ctgeetggca tctgtgagct ctccctaett tetcctatac cctaaccttt 180 gtcctgcatg ggcgactccc ccagtgagtc tcttgcagct t ttaccccag tgcctgcttc 240 ttggagaatc caaactgatc cagttaggga tgataaagtg tagggtaggc gctcggtgac 300 tgttttctct gaggttgtga ctcgtgtgag gcagaagcag tccccgtgag ccctcctggt 360 atcttgtgga gtggagaacg cttggacctg gagccaggag gcccagacat acatcctgtc 420 egagctgcag cttcctgtct ctaaaatgag ccggccagcg caggtggcca gacatcactg 480 ttattctcct ttgagtcttt aaatcttgtt gtctttcttg cagactcggt gagctgtgaa 540 aggctataat aggggcttta ttttacactt tgatactatt ttttgaacat tcatattatt 600 gttagatatt gatattcata tgaaggagca ggatgacttg ggtccttctt ggcagtagca 660 ctgccagctg atggccctgg acagttaccc gccctctcta ggcctccctt tccttgtcta 720 tgaaatacat tatagaatag gatgtagtgt gtgaggattt tttggaggtt aaacgagtga 780 atatatttaa ggcgctttca ccagtgcctg ggatgtgctc tgtagtttct gtgtgttaac 840 tataaggttg actttatgct eattccctec tctcccacaa acg teg cct tgg aaa 895

Met Ser Pro Trp L.ys 1 5 gac gga ggc age Ctg gtg gag gtg tat etc eta gac ace age ata cag 943

Asp Gly Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser lie Gin 10 15 20 agt gac cac egg gaa ate gag ggc agg gtc atg gtc acc gac ttc gag 991

Ser Asp His Arg Glu He Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu 25 30 35 aat gtg ccc gag gag gac ggg acc ege ttc cac aga cag gcc age aag 1039

Asn Val Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gin Ala Ser Lys

40 45 SO tgt gac agt cat ggc acc cac ctg gca ggg gtg gtc age ggc egg gat 1087

Cys Asp Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp 55 60 65 gcc ggc gtg gcc aag ggt gcc age atg ege age ctg ege gtg etc aac 1135

Ala Gly Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn 70 75 80 85 tgc caa ggg aag ggc acg gtt age ggc acc etc ata ggc ctg gag ttt 1183

Cys Gin Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu lie Gly Leu Glu Phe 90 95 .100 ' Ί att egg aaa age cag ctg gtc cag cct gtg ggg cca ctg gtg gtg ctg 1231 lie Arg Lys Ser Gin Leu Val Gin Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu 105 110 115 ctg ccc ctg geg ggt ggg tac age ege gtc etc aac gcc gcc tgc cag 1279

Leu Pro Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg val Leu Asn Ala Ala Cys Gin 120 125 130 cgc ctg gcg agg get ggg gtc gtg ccg gtc acc get gee ggc aac ttc 1327

Arg Leu Ala Arg Ala Gly val val Leu val Thr Ala Ala Gly Asn Phe 133 140 145 egg gac gat gee tgc etc tac tee cca gee tea get ccc gag gtc ate 1375

Arg Asp Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val lie 150 155 160 165 aea gtt ggg gee acc aat gee cag gac cag ceg gtg acc ctg ggg act 1423

Thr val Gly Ala Thr Asn Ala Gin Asp Gin Pro Val Thr Leu Gly Thr 170 175 180 ttg ggg acc aac ttt ggc ege tgt gtg gãc etc ttt gee cca ggg gag 1471

Leu Gly Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp fceu Phe Ala Pro Gly Glu 185 190 195 gac ate att ggt gee tee age gac tgc age acc tgc ttt gtg tea eag 1519

Asp lie He Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gin 200 205 210 agt ggg aea tea cag get get gee cac gtg get ggc att gca gee atg 1567

Ser Gly Thr ser Gin Ala Ala Ala His val Ala Gly rie Ala Ala Met 215 220 225 atg ctg tet gee gag ccg gag etc acc ctg gee gag ttg agg eag aga 1615

Met Leu Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gin Arg 230 235 240 245 ctg ate cac ttc tet gee aaa gat gte ate aat gag gee tgg ttc cct 1663

Leu lie His Phe Ser Ala Lys Asp Val He Asn Glu Ala Trp Phe Pro 250 255 260 gag gac cag egg gta ctg acc ccc aac ctg gtg gee gee ctg cec ccc 1711

Glu Asp Gin Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro 265 270 275 age acc cat ggg gca ggt tgg cag ctg ttt tgc agg act gtg tgg tea 1759

Ser Thr His Gly Ala Gly Trp Gin Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser 280 285 290 gca cac teg ggg cct aea egg atg gee aea gee ate gee ege tgc gee 1807

Ala His Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala He Ala Arg Cys Ala 295 300 305 cca gat gag gag ctg ctg age tgc tee agt ttc tee agg agt ggg eag 1855

Pro Asp Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys 310 315 320 325 egg egg ggc gag ege atg gag gee caa ggg ggc aag ctg gtc tgc egg 1903

Arg Arg Gly Glu Arg Met Glu Ala Gin Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg 330 335 340 gee cac aac get ttt ggg ggt gag ggt gtc tec gee att gee agg tgc 1951

Ala His Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Àla lie Ala Arg Cys 345 350 ’· ' 355 tgc ctg eta ccc eag gee aae tgc age gte eac aca get cca cca get 1999

Cys Leu Leu Pro Gin Ala Asn Cys ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala 360 365 370 gag gee age atg ggg ace egt gte cac tgc cac caa eag ggc cac gte 2-047

Glu Ala Ser Het Gly Thr Arg Val His Cys His Gin Gin Gly His Val 375 380 385 etc aca ggc tgc age tee cac tgg gag gtg gag gac ett ggc ace cac 2095

Leu Thr Gly Cys Ser Ser His Trp Glu val Glu Asp Leu Gly Thr His 390 395 ' 400 405 aag ccg cct gtg ctg agg cca ega ggt eag ccc aae eag tgc gtg ggc 2143

Lys Pro Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gin Pro Asn Gin Cys Val Gly 410 415 420 cac agg gag gee age ate cac get tee tgc tgc cat gee cca ggt ctg 2191

His Arg Glu Ala Ser lie His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu 425 430 435 gaa tgc aaa gte aag gag cat gga ate ccg gee cct eag gag eag gtg 2239

Glu Cys Lys Val Lys-Glu His Gly lie Pro Ala Pro Gin Glu Gin Val 440 445 450 acc gtg gee tgc gag gag ggc tgg acc ctg act ggc tgc agt gee etc 2287

Thr Val Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu 455 460 465 cct ggg acc tee cac gte ctg ggg gee tac gee gta gac aae aeg tgt 2335

Pro Gly Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys 470 475 480 485 gta gte agg age egg gac gte age act aca ggc age acc age gaa ggg 2383

Val Val Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly 490 495 500 gee gtg aca gee gtt gee ate tgc tgc egg age egg cac ctg geg eag 2431

Ala val Thr Ala VaL Ala lie Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gin 505 510 515 gee tee eag gag etc eag tgacagcccc atcccaggat gggtgtctgg 2479

Ala Ser Gin Glu Leu Gin 520 ggagggtcaa gggctggggc tgagctttaa aatggttccg aettgteect ctctcagccc 2539 tccatggcct ggcacgaggg gatggggatg cttccgcctt tccggggctg ctggcctggc 2599 ccttgagtgg ggcagcctcc ttgcctggaa ctcactcact ctgggtgcct cctccccagg 2659 tggaggtgee aggaagetcc ctceeceact gtggggcatc tcaccattca aacaggtcga 2719 gctgtgetcg ggtgctgcca gctgctccca atgtgccgat gtccgcgggc agaatgaett 2779 ttattgaget cttgttccgt gccaggcatt caatcctcag gtctccacca aggaggeagg 2839 attettccca tggatagggg agggggcggt aggggctgca gggacaaaca tcgttggggg 2899 gtgagegtga aaggtgccga tggccctcat ctccagctaa ctgtggagao gcccctgggg 2959 gctccctgat taatggaggc ttagctttct ggatggcate tagccagagg ctggagacag 3019 gtgcgcccct ggtggtcaca ggctgcgcct tggtttcctg agccaccttt actctgctct 3079 atgccaggct gCgctagcaa cacccaaagg tggcctgcgg ggagccatca cctaggaceg 3139 actcggcagt gtgcagtggt gcatgcactg tctcagccaa cccgctccac tacccggcag 3199 ggtecacatt cgcaccccta ettcacagag gaagaaacct ggaaccagag ggggcgtgcc 3259 tgccaagctc acacagcagg aactgagcca gaaacgcaga ttgggctggc tctgaagcca 3319 agcctcttct tacttcaccc ggctgggctc ctcattttta cgggtaacag tgaggctggg 3379 aaggggaaca cagaccagga agctcggtga gtgatggcag aacgatgcct gcaggcatgg 3439 aactttttcc gttatcaccc aggcccgatt. cactggcctg gcggagaCgc ttetaaggea 3499 tggtcggggg agagggccaa caactgtccc teettgagea ccagccccac ccaagcaagc' 3559 agacatttat cttttgggtc tgtcctctct gttgcctttt tacagccaac ttttctagac 3619 ctgttttgct tttgtaactt gaagatattt attctgggtt ttgtageatt tttattaata 3679

I tggtgaettt ttaaaataaa aaeaaaeaaa cgttgtccta aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3739 aaaaaaaaaa aaaaaaa 3756

<210> 4 <211> 523 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Met Ser Pro Trp Lys Asp Gly Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu 15 10 15

Asp Thr Ser lie Gin Ser Asp His Arg Glu lie Glu Gly Arg Val Met 20 25 30

Val Thr Asp Phe Glu Asn Val Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His 35 40 45

Arg Gin Ala Ser Lys Cys Asp'Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val 50 55 60

Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser 65 70 75 80

Leu Arg Val Leu Asn Cys Gin Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu 85 90 95 lie Gly Leu Glu Phe lie Arg Lys Ser Gin Leu Val Gin Pro Val Gly 100 105 110

Pro Leu Val Val Leu Leu Pro Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu 115 120 125

Asn Ala Ala Cys Gin Arg Leu Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr 130 135 140

Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser 145 150 155 160

Ala Pro Glu Val He Thr Val Gly Ala Thr Asn Ala Gin Asp Gin Pro 165 170 175

Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu 180 185 190

Phe Ala Pro Gly Glu Asp lie lie Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr 195 200 205

Cys Phe Val Ser Gin Ser Gly Thr Ser Gin Ala Ala Ala His Val Ala 210 21$ 220

Gly He Ala Ala Met Met Leu Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala 22S 230 235 240

Glu Leu Arg Gin Arg Leu lie His Phe Ser Ala Lys Asp Val He Asn 245 250 255

Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp Gin Arg Val Leu Thr Pro Asn Leu val 260 265 270

Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr His Gly Ala Gly Trp Gin Leu Phe Cys 275 280 285

Arg Thr Val Trp Ser Ala His Ser Gly Pro Thr Arg Met Ala Thr Ala 290 295 300 lie Ala Arg Cys Ala Pro Asp Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe 305 310 315 320

Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg Gly Glu Arg Met. Glu Ala Gin Gly Gly 325 330 335

Lys Leu Val Cys Arg Ala His Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr 340 345 350

Ala tie Ala Arg Cys Cys Leu Leu Pro Gin Ala Asn Cys Ser Val His 355 360 365

Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His 370 375 380

Gin Gin Gly His Val Leu Thr Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu 385 390 395 400

Asp Leu Gly Thr His Lys Pro Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gin Pro 405 410 415

Asn Gin Cys Val Gly His Arg Glu Ala Ser lie His Ala Ser Cys Cys 420 425 430

His Ala Pro Gly Leu Glu Cys Lys Val Lys Glu His Gly lie Pro Ala 435 440 445

Pro Gin Glu Gin Val Thr Val Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr Leu Thr 450 455 460

Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala 465 470 47 S 480

Val Asp Asn Thr Cys Val Val Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly 485 490 495

Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val Thr Ala Val Ala He Cys Cys Arg Ser 500 505 510

Arg His Leu Ala Gin Ala Ser Gin. Glu Leu Gin 515 520

<210> 5 <211> 692 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Met Qly Thr Val Ser Ser Arg Arg Ser Trp Trp Pro Leu Pro Leu Leu 15 10 15

Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Gly Pro Ala Gly Ala Arg Ala Gin Glu 20 25 30

Asp Glu Asp Gly Asp Tyr Glu Glu Leu Val Leu Ala Leu Arg Ser Glu 35 40 45

Glu Asp Gly Leu Ala Glu Ala Pro Glu His Gly Thr Thr Ala Thr Phe 50 55 60

His Arg Cys Ala Lys Asp Pro Trp Arg Leu Pro Gly Thr Tyr Val Val 65 70 75 80

Val Leu Lys Glu Glu Thr His Leu Ser Gin Ser Glu Arg Thr Ala Arg 85 90 95

Arg Leu Gin Ala Gin Ala Ala Arg Arg Gly Tyr Leu Thr Lys lie Leu 100 105 110

His Val Phe His Gly Leu Leu Pro Gly Phe Leu Val Lys Met Ser Gly 115 120 125

Asp Leu Leu Glu Leu Ala Leu Lys Leu Pro Hie Val Asp Tyr lie Glu 130 135 140

Glu Asp Ser Ser Val Phe Ala Gin Ser lie Pro Trp Asn Leu Glu Arg 145 150 155 160

He Thr Pro Pro Arg Tyr Arg Ala Asp Glu Tyr Gin Pro Pro Asp Gly 165 170 175

Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu Asp Thr Ser He Gin Ser Asp 180 185 190

His Arg Glu lie Glu Gly Arg Val Met Val Thr Asp Phe Glu Asn Val 195 200 205

Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His Arg Gin Ala Ser Lys Cys Asp 210 215 220

Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly 225 230 235 240

Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser Leu Arg Val Leu Asn Cys Gin 245 250 255

Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu lie Gly Leu Glu Phe lie Arg 260 265 270

Lys Ser Gin Leu Val Gin Pro Val Gly Pro Leu Val Val Leu Leu Pro 275 280 285

Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu Asn Ala Ala Cys Gin Arg Leu 290 295 300

Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp 305 310 315 320

Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser Ala Pro Glu Val lie Thr Val 325 330 335

Gly Ala Thr Asn Ala Gin Asp Gin Pro Val Thr Leu Gly Thr Leu Gly 340 345 3S0

Thr Asn Phe Gly Arg Cys Val Asp Leu Phe Ala Pro Gly Glu Asp lie 355 .360 365 lie Gly Ala Ser Ser Asp Cys Ser Thr Cys Phe Val Ser Gin Ser Gly 370 375 380

Thr Ser Gin Ala Ala Ala His Val Ala Gly lie Ala Ala Met Met Leu 385 390 395 400 i

Ser Ala Glu Pro Glu Leu Thr Leu Ala Glu Leu Arg Gin Arg Leu lie 405 ' 410 415

His Phe Ser Ala Lys Asp Val He Asn Glu Ala Trp Phe Pro Glu Asp 420 425 430

Gin Arg Vai Leu Thr Prò Asn Leu Val Ala Ala Leu Pro Pro Ser Thr 435 440 445

His Gly Ala Gly Trp Gin Leu Phe Cys Arg Thr Val Trp Ser Ala His 450 455 460

Ser Gly Pro Thr Arg Dec Ala Thr Ala Val Ala Arg Cys Ala Pro Asp 46S 470 475 480

Glu Glu Leu Leu Ser Cys Ser Ser Phe Ser Arg Ser Gly Lys Arg Arg 485 490 495 ·, r' *.

Gly Glu Arg Met Glu Ala Gin Gly Gly Lys Leu Val Cys Arg Ala His 500 505 510

Asn Ala Phe Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ala lie Ala Arg Cys Cys Leu

515 520 52S

Leu Pro Gin Ala Asn Cys Ser Val His Thr Ala Pro Pro Ala Glu Ala' 530 535 540

Ser Met Gly Thr Arg Val His Cys His Gin Gin Gly His Val Leu Thr 545 550 555 560

Gly Cys Ser Ser His Trp Glu Val Glu Asp Leu Gly Thr His Lys Pro 565 570 575

Pro Val Leu Arg Pro Arg Gly Gin Pro Asn Gin Cys Val Gly His Arg 580 585 590

Glu Ala Ser He His Ala Ser Cys Cys His Ala Pro Gly Leu Glu Cys S95 600 605

Lys Val Lys Glu His Gly lie Pro Ala Pro Gin Glu Gin Val Thr Val 610 615 620

Ala Cys Glu Glu Gly Trp Thr. Leu Thr Gly Cys Ser Ala Leu Pro Gly 625 630 635 640

Thr Ser His Val Leu Gly Ala Tyr Ala Val Asp Asn Thr Cys Val Val 645 650 ' * 655

Arg Ser Arg Asp Val Ser Thr Thr Gly Ser Thr Ser Glu Gly Ala Val 660 665 670

Thr Ala Val Ala lie Cys Cys Arg Ser Arg His Leu Ala Gin Ala Ser 675 680 685

Gin Glu Leu Gin 690

<210> 6 <211> 196 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6

Met Ser Pro Trp Lys Asp Gly Gly Ser Leu Val Glu Val Tyr Leu Leu 15 10 15

Asp Thr Ser lie Gin Ser Asp His Arg Glu lie Glu Gly Arg Val Met 20 25 30

Val Thr Asp Phe Glu Asn Val Pro Glu Glu Asp Gly Thr Arg Phe His 35 40 45

Arg Gin Ala Ser Lys Cys Asp Ser His Gly Thr His Leu Ala Gly Val 50 55 60

Val Ser Gly Arg Asp Ala Gly Val Ala Lys Gly Ala Ser Met Arg Ser 65 70 75 80

Leu Arg Val Leu Asn Cys Gin Gly Lys Gly Thr Val Ser Gly Thr Leu 85 90 95

He Gly Leu Glu Phe lie Arg Lys Ser Gin Leu Val Gin Pro Val Gly 100 105 110

Pro Leu Val Val Leu Leu Pro Leu Ala Gly Gly Tyr Ser Arg Val Leu 115 120 125

Asn Ala Ala Cys Gin Arg Leu Ala Arg Ala Gly Val Val Leu Val Thr 130 13S 140

Ala Ala Gly Asn Phe Arg Asp Asp Ala Cys Leu Tyr Ser Pro Ala Ser 145 150 155 160

Ala Pro Glu Gly Arg Thr Ser Leu Val Pro Pro Ala Thr Ala Ala Pro 165 170 175

Ala Leu Cys His Arg Val Gly His His Arg Leu Leu Pro Thr Trp Leu 180 1B5 190

Ala Leu Gin Pro 195

<210> 7 <211> 80 <212> ADN <213> Homo sapiens <4Ο0> 7 ggegctttca ceagtggetg ggat^gtgctc tgtagtttct gtgtgttaac tataaggttg 60 actttatgcr cattcootcc 60

<210> 8 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 8 ctaggcctcc ctttccttgt 20

<210> 9 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 9 ttccaaggtg acatttgtgg 20

<210> 10 <211> 17 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 10 cetgcgcgtg ctcaact 17

<210> 11 <211> 22 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 11 ccgaataaac tccaggccta tg 22

<210> 12 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 12 ccgctaaccg tgcccttccc ttg 23

<210> 13 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 13 ctaggcctcc ctttccttgt 20

<210> 14 <211> 79 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 14 tggcaggcgg cgttgaggac gcggctgtac ccaccegcca ggggcagcag caccaccagt 60 ggccccacag gctggacca 79

<210> 15 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 15 gcctggagtt tattcggaaa 20

<210> 16 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 16 gagtagaggc aggcatcgtc 20

<210> 17 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <4 0 0> 17 gagtagaggc aggcatcgtc 20 <210> 18 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Polipéptido sintetizado. <4 0 0> 18

Phe Ala Gin Ser He Pro Lys 1 5 <210> 19 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Polipéptido sintetizado. <4 0 0> 19

Asp Ser Leu Vai Phe Ala Lys 1 5 <210> 20 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <22 0> <223> Polipéptido sintetizado. <400> 20

Phe Ala Asn Ala lie Pro Lys 1 5

<210> 21 <211> 733 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 21 gggaeccgga gcccaaatct tctgacaaaa ctcacacatg cccaecgtgo ccagcacctg 60 aattcgaggg tgcaccgtca gfcetteetct tccccccaaa acccaaggac acectcatga 120 tctcccggac tcctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt aagccacgaa gaccctgagg 180 tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 240 aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 300 ggctgaatgg caaggagtac aagtgeaagg fcctccaacaa agccctccca acccccatcg 360 agaaaaccat ctccaaagcc aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc 420 catcccggga tgagctgacc aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct 480 atccaagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aaccacaaga 540 ccacgcctcc cgtgctggac tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg 600 acaagagcag gtggcagcag gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc 660 acaaccacta cacgcagaag agcctctccc tgtctccggg taaatgagtg cgacggccgc 720 gactctagag gat 733

<210> 22 <211> 39 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 22 gcagcagcgg ccgcctagac accagcatac agagtgacc 39

<210> 23 <211> 37 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 23 gcagcagtcg actctggggc gcagcgggcg atggctg 37

<210> 24 <211> 39 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 24 gcagcagcgg ccgcatgtcg ccttggaaag acggaggca 39

<210> 25 <211> 37 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 25 gcagcagtcg acagggcctg ccccatgggt gctgggg 37

<210> 26 <211> 39 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 26 gcagcagcgg ccgcctagac accagcatac agagtgacc 39

<210> 27 <211> 25 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 27 ctggagctcc tgggaggcct gcgcc 25

<210> 28 <211> 39 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 28 gcagcagcgg ccgcatgtcg ccttggaaag acggaggca 39

<210> 29 <211> 37 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 29 gcagcagtcg acggcgatgg ctgtggccat ccgtgta 37

<210> 30 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 30 tgtctttgcc cagagcatcc 20

<210> 31 <211> 19 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 31 tattcatccg cccggtacc 19

<210> 32 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 32 agatgtcatc aatgaggcct 20

<210> 33 <211> 20 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 33 agctgccaac ctgcaaaaac 20

<210> 34 <211> 23 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 34 ctctgaggtt gtgactcgtg tga 23

<210> 35 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 35 agcgttctcc actccacaag a 21

<210> 36 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 36 gagaatgatc tgcagcaccc a 21

<210> 37 <211> 21 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 37 tgctgatgac ggtgtcatag g 21 <210> 38

<211> 3636 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 38 cagcgacgtc gaggcgctca tggttgcagg cgggcgccgc cgttcagttc agggtctgag 60 cctggaggag tgagccaggc agtgagactg gctcgggcgg gccgggacgc gtcgttgcag 120 cageggctec eagctcccag ecaggattee gegcgcccct tcacgcgccc tgctcctgaa 180 cttcagctcc tgcacagtcc tccccaccgc aaggctcaag gcgccgccgg cgtggaccgc 240 gcacggcctc taggtctcct cgccaggaca gcaacctctc ccccggccct catgggcacc 300 gtcagetcca ggeggtcctg gcggecgctg Ccactgctgc tgctgctgct gctgctcctg 360 ggtcccgcgg gcgcccgtgc gcaggaggac .gaggacggcg accacgagga gccggtgcta 420 gccttgcgtt ccgaggagga cggcceggcc gaagcacecg agcacggaac cacagccacc 480 ttccaccgct gcgccaagga tccgtggagg ttgcctggca cctacgtggt ggtgctgaag 540 gaggagaccc acctctcgca gtcagagcgc actgcccgcc gcctgcaggc ccaggctgcc 600 cgccggggat acctcaccaa gatcctgcat gtcttccatg gccttcttcc tggcttcctg 660 gtgaagatga gtggcgacct gctggagccg gccctgaagt tgccccacgt ogactacatc 720 gaggaggact cctctgtctt cgcccagagc atcccgtgga acctggagcg gattacccct 780 ccecggtacc gggcggatga ataccagccc cccgecggag gcagcctggt ggaggtgtat 840 ctcctagace ccagcataca gag^gaccac cgggaaatcg agggcagggt cacggcaacc *00 gactccgaga atgtgcccga ggaggacggg acccgcctcc acagacaggc cagcaagtgt 960 gacagtcatg gcacceaect ggeaggggtg gteagcggec gggatgccgg cgtggccaag 1020 ggtgccagca tgcgcagcct gcgcgtgctc aactgccaag ggaagggcac ggttagcggc 1080 accctcatag gcccggagtt cattcggaaa agccagctgg fcccagcctgt ggggccactg 1140 gtggtgctgc tgccccfcggc gggtgggtac agccgcgtcc tcaacgccgc ctgccagcgc 1200 ctggcgaggg ctggggccgt gctggtcacc gctgccggca acttccggga cgatgcctgc 1260 ctetactccc cagcctcagc fceccgaggtc atcacagttg gggccaccaa tgcccaagac 1320 cagccggtga ccctggggac tttggggacc aactttggcc gctgcgCgga cctctttgcc 1380 ccaggggagg acatcattgg tgcctccagc gactgcagca cctgctttgt gtcacagagt ' 1440 gggacatcac aggctgctgc ccacgtggct ggcattgcag ccatgatgct gtctgccgag 1500 ccggagctca ccctggccga gttgaggcag agactgatcc acttctctgc caaagatgtc 1560 atcaatgagg cctggttccc tgaggaccag cgggtactga cccccaacct ggtggccgcc 1620 ctgcccccca gcacccatgg ggcaggttgg cagctgtttC gcaggactgt atggtcagca 1680 cactcggggc ctacacggat ggccacagcc gtcgccegcc gcgccccaga Cgaggagctg 1740 ctgagctgct ccagtttctc caggagtggg aagcggcggg gcgagcgcac ggaggcccaa 1S00 99999caa9C tggtctgccg ggcccacaac gcttttgggg gtgagggtgt ctacgccatt 1860 gccaggtgct gcctgctacc ccaggccaac tgcagcgtcc acacagctcc accagctgag 1920 gccagcatgg ggacccgtgt eeactgccac caacagggcc acgtcctcac aggctgcagc 1980 tcccactggg aggtggagga ccttggcacc cacaagccgc ctgtgctgag gccacgaggt 2040 cagcecaaec agtgcgtggg eeacagggag gccagcatcc acgcttectg ctgccatgcc 2100 ccaggtctgg aatgcaaagt caaggagcat ggaatcccgg cccctcagga gcaggtgacc 2160 gtggcctgcg aggagggctg gaccctgact ggctgcagtg ccctccctgg gacctcccac 2220 gtcctggggg cctacgccgt agacaacacg tgtgtagtca ggagccggga cgtcagcact 2280 acaggcagca ccagcgaagg ggccgtgaca gccgttgcca tctgctgccg gagccggcac 2340 ctggcgcagg cctcccagga gctecagtga cagccccatc ccaggatggg tgtctgggga 2400 gggtcaaggg ctggggctga gctttaaaat ggttccgact tgtccctctc tcagccctcc 2460 atggeetggc acgaggggat ggggatgctt ccgcctttcc ggggctgctg geetggccet 2520 .tgagtggggc agcctccttg cctggaactc actcactctg ggtgcetcet ccccaggtgg 2580 aggtgccagg aagcfcccctc cctcactgtg gggcatttca ccattcaaac aggtcgagct 2640 gtgctcgggC gcCgccagct gctcccaatg tgccgatgtc cgtgggcaga atgactttta 2700 ttgagctctt gttccgtgcc aggcattcaa tcctcaggtc tccaccaagg aggcaggatt 2760 cttcccatgg ataggggagg gggeggtagg ggctgcaggg acaaacatcg ttggggggtg 2820 agCgtgaaag gtgctgatgg ccctcatctc cagctaactg tggagaagcc cctgggggct 2880 ccctgattaa tggaggctta gctttctgga tggcatctag ccagaggctg gagacaggtg 2940 cgcccctggt ggtcacaggc tgtgccttgg tttcctgagc cacctttact; ctgctctatg 3000 ccaggctgtg ctagcaacac ccaaaggtgg cctgcgggga gccatcacct aggactgact 3060 cggcagtgtg cagtggtgce Cgcactgtct cagccaaccc gctccactac ccggcagggt 3120 acacattcgc acccctactt cacagaggaa gaaacctgga accagagggg gcgtgcctgc 3180 caagctcaca cagcaggaac tgagceagaa acgcagattg ggctggctct gaagccaagc 3240 ctcttcttac ttcacccggc Cgggcccctc atttttacgg gtaaeagtga ggctgggaag 3300 gggaacacag accaggaagc tcggtgagtg atggcagaac gatgcctgca ggcatggaac 3360 tttttccgtt atcacccágg cctgattcac tggcctggcg gagatgcttc taaggcatgg 3420 tcgggggaga gggccaacaa ctgtccctcc ttgagcacca gcccdaccca agcaagcaga 3480 catttatctt ttgggtctgt cctctctgtt gccttctCac agccaacttt tctagacctg 3540 ttttgctttt gtaacttgaa gatatctatc ctgggctttg tagcattttt ettaatatgg 3600 tgacttttta aaataaaaac aaacaaacgt tgtccc 3636 <210> 39

<211> 39 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 39 gcagcagcgg ccgcctgctg ctgctgctgc tgctgctcc 39

<210> 40 <211> 37 <212> ADN <213> Homo sapiens <400> 40 gcagcagtcg acctggagct cctgggaggc ctgcgcc 37

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

Esta lista de documentos referidos pelo autor do presente pedido de patente foi elaborada apenas para informação do leitor. Não é parte integrante do documento de patente europeia. Não obstante o cuidado na sua elaboração, o IEP não assume qualquer responsabilidade por eventuais erros ou omissões.

Documentos de patente referidos na descrição • US 4683195 A [0189] • US 4631211 A [0235] • EP 394827 A [0239] [0306] [0390] [0762] • WO 9622024 A [0239] • WO 9904813 A [0239] • US 5605793 A [0240] [0576] [0804] • US 5811238 A [0240] [0576] • US 5830721 A [0240] [0576] • US 5834252 A [0240] [0576] • US 5837458 A [0240] [0576] • US 5939598 A, Kucherlapati [0242] [0274] • WO 9317715 A [0243] • WO 9208802 A [0243] • WO 9100360 A [0243] [0282] • WO 9205793 A [0243] • US 4474893 A [0243] • US 4714681 A [0243] • US 4925648 A [0243] • US 5573920 A [0243] • US 5601819 A [0243] • WO 9640281 A [0248] • US 5811097 A [0248] • WO 9208495 A [0250] • WO 9114438 A [0250] • WO 8912624 A [0250] • US 5314995 A [0250] • EP 396387 A [0250] • US 4376110 A [0255] • US 4816567 A [0262] [0271] [0771] • GB 9101134 W [0269] • WO 9002809 A [0269] • WO 9110737 A [0269] • WO 9201047 A [0269] [0274] [0816] [0819] • WO 9218619 A [0269] • WO 9311236 A [0269] • WO 9515982 A [0269] • WO 9520401 A [0269] • US 5698426 A [0269] • US 5223409 A [0269] • US 5403484 A [0269] • US 5580717 A [0269] • US 5427908 A [0269] • US 5750753 A [0269] • US 5821047 A [0269] • US 5571698 A [0269] • US 5516637 A [0269] • US 5780225 A [0269] • US 5658727 A [0269] • US 5733743 A [0269] • US 5969108 A [0269] • WO 9222324 A [0270] • US 4946778 A [0270] [0289] • US 5258498 A [0270] • EP 171496 A, Cabilly et al., Taniguchi [0271] [0771] • EP 173494 A, Morrison [0271] [0771] • WO 8601533 A, Neuberger [0271] [0771] • WO 8702671 A, Robinson [0271] [0771] • US 5807715 A [0271] • US 4816397 A [0271] • US 5585089 A, Queen [0271] • EP 239400 A [0271] • WO 9109967 A [0271] • US 5225539 A [0271] • US 5530101 A [0271] • EP 592106 A [0271] • EP 519596 A [0271] • US 5565332 A [0271] . 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Lisboa, 3 de Agosto de 2015

Claims (12)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Uma molécula de ácido nucleico isolada que compreende um polinucleótido tendo uma sequência nucleotídica selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) um polinucleótido que codifica a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO:2; (b) a sequência de ADNc de PCSK9-b incluída no Depósito ATCC® n°: PTA-7622, que codifica a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO:2; (c) um polinucleótido que codifica a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO:4; (d) a sequência de ADNc de PCSK9-C incluída no Depósito ATCC® n°: PTA-7622, que codifica a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO:4; e (e) a sequência complementar completa de (a), (b) , (c) ou (d) .
2. 2. Um vetor recombinante que compreende a molécula de ácido nucleico isolada de acordo com a reivindicação 1.
3. 3. Uma célula hospedeira recombinante isolada que compreende as sequências de vetor de acordo com a reivindicação 2.
4. 4. Um polipéptido isolado que compreende uma sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste em: (a) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO:2; e (b) um polipéptido que compreende a sequência de aminoácido apresentada na SEQ ID NO:4.
5. 5. Um anticorpo isolado que se liga especificamente ao polipéptido isolado da SEQ ID N0:2 ou SEQ ID N0:4.
6. 6. Uma célula hospedeira recombinante que expressa o polipéptido isolado de acordo com a reivindicação 4.
7. 7. Um método de produção de um polipéptido isolado que compreende: (a) cultivar a célula hospedeira recombinante de acordo com a reivindicação 6 sob condições tal que o dito polipéptido é expresso; e (b) recuperar o dito polipéptido.
8. 8. 0 polipéptido de acordo com a reivindicação 4 para utilização em prevenção, tratamento, ou melhora de uma condição médica.
9. 9. Um método de diagnóstico de uma condição patológica ou uma suscetibilidade a uma condição patológica num indivíduo que compreende: (a) determinar numa amostra biológica do indivíduo a presença ou ausência de uma mutação no polinucleótido de acordo com a reivindicação 1; e (b) diagnosticar uma condição patológica ou uma suscetibilidade a uma condição patológica com base na presença ou ausência da dita mutação.
10. 10. Um método de diagnóstico de uma condição patológica ou uma suscetibilidade a uma condição patológica num indivíduo que compreende: (a) determinar numa amostra biológica do indivíduo a presença ou quantidade de expressão do polipéptido de acordo com a reivindicação 4 numa amostra; e (b) diagnosticar uma condição patológica ou uma suscetibilidade a uma condição patológica com base na presença ou quantidade de expressão do polipéptido.
11. 11. 0 polipéptido de acordo com a reivindicação 4 para a utilização de acordo com a reivindicação 8 em que a condição médica é selecionada a partir do grupo que consiste em: distúrbio cardiovascular; hipercolesterolemia; hipercolesterolemia autossómica dominante; distúrbios associados a função de recetor de LDL aberrante; distúrbios associados a apolipoproteína B; distúrbios associados a hipercolesterolemia autossómica recessiva; distúrbios associados a colesterol elevado; distúrbios associados a LDL elevado; distúrbios associados a taxa de depuração reduzida de LDL no fígado; distúrbios associados a produção de apoB de LDL elevado; hipercolesterolemia familiar; distúrbios de metabolismo de lípido; LDL elevado; deposições de colesterol; xantomas nos tendões; ateroma; arteriosclerose prematura; doença cardíaca coronária; apolipoproteína B defeituosa familiar; hipersensibilidade a estatina; distúrbios associados a degradação acelerada de LDLR; distúrbios de diferenciação neural; um distúrbio metabólico; um distúrbio metabólico selecionado a partir do grupo que consiste em: dislipidemia; dislipidemia diabética; dislipidemia mista; hipercolesteremia; hipertrigliceridemia; diabetes melitus do tipo II; diabetes do tipo I; resistência à insulina; hiperlipidemia; obesidade; e anorexia nervosa.
12. 12. 0 método de acordo com a reivindicação 9 ou 10 em que a condição patológica é selecionada a partir do grupo que consiste em: distúrbio cardiovascular; hipercolesterolemia; hipercolesterolemia autossómica dominante; distúrbios associados a função de recetor de LDL aberrante; distúrbios associados a apolipoproteína B; distúrbios associados a hipercolesterolemia autossómica recessiva; distúrbios associados a colesterol elevado; distúrbios associados a LDL elevado; distúrbios associados a taxa de depuração reduzida de LDL no fígado; distúrbios associados a produção de apoB de LDL elevado; hipercolesterolemia familiar; distúrbios de metabolismo de lípido; LDL elevado; deposições de colesterol; xantomas nos tendões; ateroma; arteriosclerose prematura; doença cardíaca coronária; apolipoproteína B defeituosa familiar; hipersensibilidade a estatina; distúrbios associados a degradação acelerada de LDLR; distúrbios de diferenciação neural; um distúrbio metabólico; um distúrbio metabólico selecionado a partir do grupo que consiste em: dislipidemia; dislipidemia diabética; dislipidemia mista; hipercolesteremia; hipertrigliceridemia; diabetes melitus do tipo II; diabetes do tipo I; resistência à insulina; hiperlipidemia; obesidade; e anorexia nervosa. Lisboa, 3 de Agosto de 2015