WO2019041066A1 - 一种 fh3 真核表达载体的构建及其高表达细胞株的制备 - Google Patents

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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
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    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
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    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material

Definitions

  • the present invention relates to the construction of a eukaryotic expression vector and the use of the vector to prepare a stable expression cell line. Specifically, the present invention clones the FH3 full-length gene into a pEGFP-N1 eukaryotic expression vector carrying a fluorescent protein tag, and transfects the HAP-s cells with the constructed eukaryotic expression vector to establish a FH3 stably overexpressing HAP- s cell line.
  • LDL-C in humans is mainly in the cytosol, and metabolism is achieved by binding to LDLR.
  • the amount of LDL-C depends primarily on the circulation of the plasma low-density lipoprotein cholesterol receptor (LDLR).
  • LDLR plasma low-density lipoprotein cholesterol receptor
  • Human FH3 protein can directly increase the degradation of LDLR in the nucleus or lysosome, reduce the amount of LDLR, and thus increase the circulating amount of L DL-C.
  • the FH3 gene belongs to the proprotein convertase (PC) family and can directly increase the nucleus or lysosome
  • Degradation of LDLR reduces the amount of LDLR, thereby increasing the circulating amount of LDL-C; FH3 can also reduce the amount of LDLR into the cytosol, thereby indirectly increasing the plasma concentration of LDL-C, which can be used as a high cholesterol-related cardiovascular and cerebrovascular disease.
  • the therapeutic target requires a lot of research to achieve clinical transformation.
  • the lack of a vector for promoting FH3 gene expression and a cell line with high expression of FH3 in the prior art have hindered the progress of related research.
  • the present invention is based on the mRNA sequence of FH3 in GenBank, and is designed to include the entire upstream and downstream of the FH3 coding region.
  • the sequence of the upstream primer F1 is shown in the sequence listing SEQ NO.l, and the 5' end of F1 is introduced into the EcoR I digestion.
  • the sequence of the downstream primer R1 is shown in SEQ NO. 2, and the 5' of R1 is introduced into the Xma l cleavage site.
  • the FH3 fragment amplification primer F2 designed for RT-PCR identification after cell transfection is shown in the sequence listing SEQ NO. 3, and the R2 sequence is shown in the sequence listing SEQ NO. 4.
  • the present invention constructs a FH3 eukaryotic expression vector, which is prepared by the following steps: Total RNA of cells expressing FH3 Extraction, cloning of the FH3 coding region, construction of eukaryotic expression vectors.
  • the sample is the total RNA of the sample.
  • the PCR reaction procedure was: 95 ° C for 5 min; 95 ° C for 20 s, 60 ° C for 20 s, 72 ° C for 60 s, 30 cycles; 72 ° C for 5 min to end the reaction.
  • the product was subjected to agarose gel electrophoresis and purified by gelation to obtain a FH3 coding region DNA.
  • the pEGFP-N1 plasmid DNA and the purified FH3 coding region DNA were digested with EcoR I and Xma I, and the digested product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the target fragment was recovered and purified, and T4 DNA ligase was added at 4 ° C. Connect overnight.
  • the ligation product was transformed into competent E. coli Top 10. Pick a single clone in LB medium, shake culture, extract the plasmid for enzyme digestion, and cut the plasmid of the target band to the sequencing company.
  • the pEGFP-N1-FH3 eukaryotic expression vector obtained above is transferred into HAP-s cells to obtain a cell line stably expressing FH3, and the screening conditions and the stable cell lines are screened and identified as follows: 0017] Screening of 1 cell transfection and stable cell lines
  • Lipofectamine 2000 gently mix and incubate for 20 minutes at room temperature to allow complex formation
  • the HAP-s cell line stably expressing FH3 was collected, and the HAP-s cells transfected with untransfected HAP-s cells and pEGFP-Nl empty plasmid were used as controls to extract total RNA and protein of the cells.
  • the expression of FH3 was detected from the mRNA level.
  • the total RNA of the above obtained cells was reverse transcribed to obtain cDNA.
  • cDNA as a template and GAPDH as an internal reference
  • the expression level of FH3 was detected by fluorescent quantitative PCR using the F2 and R2.
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the results of fluorescent quantitative PCR detection after screening cells by G418.
  • the present invention is based on the mRNA sequence of FH3 in GenBank, and is designed to include the entire upstream and downstream of the FH3 coding region.
  • the sequence of the upstream primer F1 is shown in the sequence listing SEQ NO.l, and the 5' end of F1 is introduced into the EcoR I digestion.
  • the sequence of the downstream primer R1 is shown in SEQ NO. 2, and the 5' of R1 is introduced into the Xma l cleavage site.
  • Peer design for fine The sequence of the FH3 fragment amplification primer F2 identified by RT-PCR after transfection is shown in SEQ NO. 3 of the Sequence Listing, and the sequence of R2 is shown in SEQ NO. 4 of the Sequence Listing.
  • Jurkat cells were harvested and total RNA was extracted using Trizol and reverse transcribed into cDNA. Take l l cDNA and add 1 ⁇ 1 to the upstream and downstream primers of FH3 coding region, 2xTaq PCR Master Mix2
  • the PCR reaction procedure was: 95 ° C for 5 min; 95 ° C for 20 s, 60 ° C for 20 s, 72 ° C for 60 s, 30 cycles; 72 ° C for 5 min to end the reaction.
  • the product was subjected to agarose gel electrophoresis and purified by cleavage to obtain a DNA of the FH3 coding region.
  • the pEGFP-N1 plasmid DNA and the purified FH3 coding region DNA were digested with EcoR I and Xma I, and the digested product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the target fragment was recovered and purified, and T4 DNA ligase was added at 4 ° C. Connect overnight.
  • the ligation product was transformed into competent E. coli Top 10.
  • the monoclonals were picked and placed in LB medium, shake cultured, and the plasmid was extracted for restriction enzyme digestion, and the plasmid of the target band was removed and sent to a sequencing company for sequencing.
  • the sequencing results also indicated that the recombinant plasmid contained the entire FH3 gene sequence.
  • the recombinant plasmid pEGFP-Nl-FH3 was extracted with Endo-Free Plasmid Mini Kit II in g/ml ampicillin for 16 h at 37 ° C, 300 rpm.
  • Lipofectamine 2000 gently mix and incubate for 20 minutes at room temperature to allow complex formation
  • the HAP-s cell line stably expressing FH3 was collected, and the HAP-s cells transfected with untransfected HAP-s cells and pEGFP-Nl empty plasmid were used as controls to extract total RNA and protein of the cells.
  • Detection of FH3 expression from mRNA level The total RNA of the above obtained cells was reverse transcribed to obtain cDNA, cDNA was used as a template, GAPDH was used as an internal reference, and the expression level of FH3 was detected by fluorescent quantitative PCR using primers F2 and R2. The results are shown in Fig. 1.
  • FH3 gene in HAP-s cells stably expressing FH3 is increased by more than 70-fold, while the expression of FH3 gene in HAP-s cells transfected with pEGFP-Nl empty plasmid is normal HAP-
  • the FH3 gene cDNA sequence provided by the present invention is successfully inserted into the pEGF P-N1 expression vector, and can specifically, stably, efficiently and stably promote the high expression of the FH3 gene.

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Abstract

提供了一种构建真核表达载体以及利用该载体制备稳定表达细胞株的方法，该方法为将FH3全长基因克隆至带有荧光蛋白标签的pEGFP-N1真核表达载体中，并用构建的真核表达载体转染HAP-s细胞，建立FH3稳定过表达的HAP-s细胞系。

Description

一种 FIB真核表达载体的构建及其高表达细胞株的制备
技术领域
[0001] 本发明涉及一种真核表达载体的构建及其利用该载体制备稳定表达细胞株。 具 体而言， 本发明将 FH3全长基因克隆至带有荧光蛋白标签的 pEGFP-Nl真核表达 载体中， 并用构建的真核表达载体转染 HAP-s细胞， 建立 FH3稳定过表达的 HAP- s细胞系。
背景技术
[0002] 人体内 LDL-C主要是在细胞溶质中， 通过与 LDLR的结合来完成代谢。 LDL-C 的多少则主要取决于血浆低密度脂蛋白胆固醇受体 （LDLR) 的循环。 人 FH3蛋 白可以直接增加细胞核或者溶酶体内 LDLR的降解， 减少 LDLR的量， 从而增加 L DL-C的循环量。
技术问题
[0003] FH3基因属于前蛋白转化酶 (PC)家族， 可以直接增加细胞核或者溶酶体内
LDLR的降解， 减少 LDLR的量， 从而增加 LDL-C的循环量； FH3亦可以减少进 入细胞溶质内 LDLR的量， 从而间接增加 LDL-C的血浆浓度， 可作为高胆固醇 相关的心脑血管疾病的治疗靶点， 需做大量研究方可实现临床转化， 但现有技 术中缺乏促进 FH3基因表达的载体和 FH3高表达的细胞系， 对相关研究的进展造 成了一定的阻碍。
问题的解决方案
技术解决方案
[0004] 本发明根据 GenBank中 FH3的 mRNA序列， 设计包括整个 FH3编码区的上、 下游 弓 I物， 上游引物 F1的序列见序列表 SEQ NO.l , F1的 5'端引入 EcoR I酶切位点， 下游引物 R1的序列见 SEQ N0. 2, R1的 5'引入 Xma l酶切位点。 同吋设计用于细 胞转染后 RT-PCR鉴定的 FH3片段扩增引物 F2其序列见序列表 SEQ NO. 3， R2序 列见序列表 SEQ NO. 4。
[0005] 本发明构建了 FH3真核表达载体， 通过以下步骤制备： 表达 FH3的细胞总 RNA 的提取、 FH3编码区的克隆、 真核表达载体的构建。
[0006] ①表达 FH3的细胞总 RNA的提取与逆转录：
[0007] a) 收集 Jurkat细胞加入 lml Trizol裂解液， 室温下静置 5min。
[0008] b) 加入 250 μΐ三氯甲烷， 充分混匀， 室温放置 5 min， 12000 g离心 10 min， 取 上清。
[0009] c) 加入 500 μΐ异丙醇混匀， 室温静置 10 min， 12000 g离心 10 min。
[0010] d) 弃上清， imi ml 75%的乙醇 （DEPC水配制） 漂洗， 7500 rpm离心 5 min。
[0011] e) 吸取 75%的乙醇， 于超净台晾干， 直到 EP管底部的 RNA变透明， 加入 30μ1
RNase-free ddH20, 所得即为样本总 RNA。
[0012] f) 应用 PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒， 将上一步得到的 总 RNA进行反转录反应， 在 200μ1反应管中加入总 RNA 1μ1、 5xPrimeScript RT
Master Mix (Perfect Real Time) 2μ1、 RNase Free dH20 7 μΐ , 混匀后 37°C反应 60 min将 RNA逆转录为 cDNA。
[0013] ② FH3真核表达载体的构建
[0014] 取 1 μΐ cDNA， 加入上述 FH3编码区上下游引物各 1μ1， 2xTaq PCR Master
Mix2 ΙΟμΙ, 用 ddH20补足 20μ1。 PCR反应程序为： 95°C 5 min; 95°C 20 s， 60°C 20 s, 72°C 60 s, 30个循环； 72°C 5min结束反应。 将产物进行琼脂糖凝胶电泳并 切胶回收纯化， 得到 FH3编码区 DNA。
[0015] 用 EcoR I和 Xma I双酶切 pEGFP-Nl质粒 DNA及纯化的 FH3编码区 DNA， 将酶切 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 回收并纯化目的片段， 加入 T4 DNA ligase， 4°C连接 过夜。 连接产物转化到感受态大肠杆菌 Top 10中。 挑取单克隆置于 LB培养基中 振荡培养， 提取质粒进行酶切鉴定， 并将切下目的条带的质粒送测序公司进行
[0016] 本发明通过将上述得到的 pEGFP-Nl-FH3真核表达载体转入 HAP-s细胞中， 得 到稳定表达 FH3的细胞株， 转染条件及稳定细胞株的筛选和鉴定方法如下： [0017] ①细胞转染及稳转细胞系的筛选
[0018] a) 在转染前撤除培养基中的抗生素， 将处于对数生长期的 HAP-s细胞接种至 6 孔板中培养 24h， 待细胞长至 80% -90%融合吋进行转染。 [0019] b) 采用脂质体法转染， 使用前轻轻混合 Lipofectamine 2000， 取 8ul试剂用 400ul 无血清培养基稀释， 轻轻混匀后在室温下孵育 5分钟。
[0020] c) 孵育 5分钟后， 取 pEGFP-Nl空质粒和 pEGFP-Nl-FH3各 20ug， 分别与稀释的
Lipofectamine 2000, 轻轻混合， 在室温下孵育 20分钟， 以便允许复合物的形成
[0021] d) 将质粒 -Lipofectamine 2000复合物加入到每一个包含 HAP-s细胞和培养基的 孔中。 通过轻轻地前后摇动培养板混合。
[0022] e) 37°C， C02培养箱孵育 4小吋改换含 10%胎牛血清的 DMEM培养基。
[0023] f) 转染 48h后在 10%胎牛血清的 DMEM培养基中加入 80(Vg/ml的 G418进行培养
， 2周后将 G418浓度降低为 40(Vg/ml维持筛选。 用含 40(Vg/ml G418的选择培养液 培养 4周后， 分离阳性克隆并扩大培养， 得到稳定表达 FH3的 HAP-s细胞株。
[0024] ②稳转细胞系中 FH3的表达鉴定
[0025] 收集稳定表达 FH3的 HAP-s细胞株、 同吋以未转染 HAP-s细胞、 pEGFP-Nl空质 粒转染的 HAP-s细胞为对照， 提取上述细胞的总 RNA及蛋白质。 从 mRNA水平检 测 FH3的表达： 将上述得到的细胞总 RNA反转录得到 cDNA， 以 cDNA为模板， 以 GAPDH为内参， 通过弓 I物 F2和 R2进行荧光定量 PCR检测 FH3的表达水平。 发明的有益效果
对附图的简要说明
附图说明
[0026] 图 1为 G418筛选细胞后荧光定量 PCR检测结果示意图。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0027] 下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0028] 实施例一 FH3基因引物的设计
[0029] 本发明根据 GenBank中 FH3的 mRNA序列， 设计包括整个 FH3编码区的上、 下游 弓 I物， 上游引物 F1的序列见序列表 SEQ NO.l , F1的 5'端引入 EcoR I酶切位点， 下游引物 R1的序列见 SEQ N0. 2, R1的 5'引入 Xma l酶切位点。 同吋设计用于细 胞转染后 RT-PCR鉴定的 FH3片段扩增引物 F2其序列见序列表 SEQ NO. 3， R2序 列见序列表 SEQ NO. 4。
[0030] 实施例二 FH3真核表达载体的构建
[0031] 收集 Jurkat细胞， 使用 Trizol提取总 RNA， 并逆转录为 cDNA。 取 l l cDNA, 加入 FH3编码区上下游引物各 1μ1， 2xTaq PCR Master Mix2
ΙΟμΙ, 用 ddH20补足 20μ1。 PCR反应程序为： 95°C 5 min; 95°C 20 s， 60°C 20 s， 72°C 60 s , 30个循环； 72°C 5min结束反应。 将产物进行琼脂糖凝胶电泳并切 胶回收纯化， 得到 FH3编码区 DNA。
[0032] 用 EcoR I和 Xma I双酶切 pEGFP-Nl质粒 DNA及纯化的 FH3编码区 DNA， 将酶切 产物进行琼脂糖凝胶电泳， 回收并纯化目的片段， 加入 T4 DNA ligase， 4°C连接 过夜。 连接产物转化到感受态大肠杆菌 Top 10中。 挑取单克隆置于 LB培养基中 振荡培养， 提取质粒进行酶切鉴定， 并将切下目的条带的质粒送测序公司进行 测序。 测序结果同样表明该重组质粒含有完整的 FH3基因序列。
[0033] 将测序正确的菌接种到 15 ml LB培养基 （含 100
g/ml氨苄青霉素） 中， 37°C， 300 rpm培养 16 h， 用 Endo-Free Plasmid Mini Kit II 进行抽提重组质粒 pEGFP-Nl-FH3。
[0034] 实施例三 细胞转染及稳转细胞系的筛选
[0035] a) 在转染前撤除培养基中的抗生素， 将处于对数生长期的 HAP-s细胞接种至 6 孔板中培养 24h， 待细胞长至 80%-90%融合吋进行转染。
[0036] b) 采用脂质体法转染， 使用前轻轻混合 Lipofectamine 2000， 取 8ul试剂用 400ul 无血清培养基稀释， 轻轻混匀后在室温下孵育 5分钟。
[0037] c) 孵育 5分钟后， 取 pEGFP-Nl空质粒和 pEGFP-Nl-FH3各 20ug， 分别与稀释的
Lipofectamine 2000, 轻轻混合， 在室温下孵育 20分钟， 以便允许复合物的形成
[0038] d) 将质粒 -Lipofectamine 2000复合物加入到每一个包含 HAP-s细胞和培养基的 孔中。 通过轻轻地前后摇动培养板混合。
[0039] e) 37°C， C02培养箱孵育 4小吋改换含 10%胎牛血清的 DMEM培养基。
[0040] f) 转染 48h后在 10%胎牛血清的 DMEM培养基中加入 80(Vg/ml的 G418进行培养 ， 2周后将 G418浓度降低为 40(Vg/ml维持筛选。 用含 40(Vg/ml G418的选择培养液 培养 4周后， 分离阳性克隆并扩大培养， 得到稳定表达 FH3的 HAP-s细胞株。
[0041] 实施例四 稳转细胞系中 FH3的表达鉴定
[0042] 收集稳定表达 FH3的 HAP-s细胞株、 同吋以未转染 HAP-s细胞、 pEGFP-Nl空质 粒转染的 HAP-s细胞为对照， 提取上述细胞的总 RNA及蛋白质。 从 mRNA水平检 测 FH3的表达： 将上述得到的细胞总 RNA反转录得到 cDNA， 以 cDNA为模板， 以 GAPDH为内参， 通过引物 F2和 R2进行荧光定量 PCR检测 FH3的表达水平， 结 果如图 1所示， 可以看到， 稳定表达 FH3的 HAP-s细胞株的 FH3基因表达量有 70倍 以上的升高， 而 pEGFP-Nl空质粒转染的 HAP-s细胞 FH3基因表达量与正常 HAP-s 细胞相比基本没有变化， 说明本发明提供的 FH3基因 cDNA序列成功插入至 pEGF P-N1表达载体中， 能特异、 持续、 高效、 稳定地促进 FH3基因高表达。

Claims

权利要求书
[权利要求 1] 一种 FH3基因的特异性弓 I物对， 其序列为 SEQ ID NO.1和 SEQ ID
N0.2。
[权利要求 2] FH3真核表达载体制备方法， 其通过如下步骤制备， 表达 FH3的细胞 总 RNA的提取、 FH3编码区的克隆、 真核表达载体的构建。
[权利要求 3] 根据权利要求 2所述的 FH3真核表达载体制备方法， 其特征在于， 所 述的表达 FH3的细胞总 RNA的提取、 FH3编码区的克隆、 真核表达 载体的构建， 具体方法如下：
①表达 FH3的细胞总 RNA的提取与逆转录
a) 收集 Jurkat细胞加入 lml Trizol裂解液， 室温下静置 5min。
b) 加入 250 μΐ三氯甲烷， 充分混匀， 室温放置 5 min， 12000 g离心 10 min， 取上清。
c) 加入 500 μΐ异丙醇混匀， 室温静置 10 min， 12000 g离心 10 min。 d) 弃上清， imi ml 75%的乙醇 （DEPC水配制） 漂洗， 7500 rpmi¾ 、5 min°
e) 吸取 75%的乙醇， 于超净台晾干， 直到 EP管底部的 RNA变透明， 加入 30μ1 RNase-free ddH20， 所得即为样本总 RNA。
f) 应用 PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒， 将上一 步得到的总 RNA进行反转录反应， 在 200μ1反应管中加入总 RNA Ιμΐ 、 5xPrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) 2μ1、 RNase Free dH20 7 μ1， 混匀后 37°C反应 60 min将 RNA逆转录为 cDNA。
② FH3真核表达载体的构建
取 1 μΐ cDNA, 加入上述 FH3编码区上下游引物各 1μ1， 2xTaq PCR Master Mix2 ΙΟμΙ, 用 ddH20补足 20μ1。 PCR反应程序为： 95°C 5 min ； 95°C 20 s， 60°C 20 s， 72°C 60 s， 30个循环； 72°C 5min结束反应。 将产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化， 得到 FH3编码区 DNA 用 EcoR I和 Xma I双酶切 pEGFP-Nl质粒 DNA及纯化的 FH3编码区 DNA ， 将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳， 回收并纯化目的片段， 加入 T4 DNA ligase, 4°C连接过夜。 连接产物转化到感受态大肠杆菌 Top 10中
。 挑取单克隆置于 LB培养基中振荡培养， 提取质粒进行酶切鉴定， 并将切下目的条带的质粒送测序公司进行测序。
将测序正确的菌接种到 15 ml LB培养基 （含 lOO g/ml氨苄青霉素） 中 ， 37°C， 300 rpm培养 16 h， 用 Endo-Free Plasmid Mini Kit II进行抽提 重组质粒 pEGFP-Nl-FH3。
[权利要求 4] 根据权利要求 3所述的一种稳定转染细胞株的方法， 具体包括以下步 骤：
①细胞转染及稳转细胞系的筛选
a) 在转染前撤除培养基中的抗生素， 将处于对数生长期的 HAP-s细 胞接种至 6孔板中培养 24h， 待细胞长至 80% -90%融合吋进行转染。 b) 采用脂质体法转染， 使用前轻轻混合 LipofeCtamine 2000， 取 8ul试 剂用 400ul无血清培养基稀释， 轻轻混匀后在室温下孵育 5分钟。 c) 孵育 5分钟后， 取 pEGFP-Nl空质粒和 pEGFP-Nl-FH3各 20ug， 分别 与稀释的 Lipofectamine 2000， 轻轻混合， 在室温下孵育 20分钟， 以便 允许复合物的形成。
d) 将质粒 -Lipofectamine 2000复合物加入到每一个包含 HAP-s细胞和 培养基的孔中。 通过轻轻地前后摇动培养板混合。
e) 37°C， C02培养箱孵育 4小吋改换含 10%胎牛血清的 DMEM培养基 f) 转染 48h后在 10%胎牛血清的 DMEM培养基中加入 80(Vg/ml的 G418 进行培养， 2周后将 G418浓度降低为 40(Vg/ml维持筛选。 用含 400μ§/ ml G418的选择培养液培养 4周后， 分离阳性克隆并扩大培养， 得到稳 定表达 FH3的 HAP-s细胞株。
②稳转细胞系中 FH3的表达鉴定
收集稳定表达 FH3的 HAP-s细胞株、 同吋以未转染 HAP-s细胞、 pEGF P-N1空质粒转染的 HAP-s细胞为对照， 提取上述细胞的总 RNA及蛋白 质。 从 mRNA水平检测 FH3的表达： 将上述得到的细胞总 RNA反转录 得到 cDNA， 以 cDNA为模板， 以 GAPDH为内参， 通过引物 F2和 R2进 行荧光定量 PCR检测 FH3的表达水平。
[权利要求 5] —种稳定表达 FH3的 HAP-s细胞株， 其由权利要求 3或 4制备得到。
[权利要求 6] 权利要求 1的引物在制备检测人 FH3基因试剂盒中的应用。
[权利要求 7] 权利要求 2-3任意一项所述的载体或权利要求 6的细胞株在制备人 FH3 蛋白中的应用。
PCT/CN2017/099188 2017-08-26 2017-08-26 一种 fh3 真核表达载体的构建及其高表达细胞株的制备 WO2019041066A1 (zh)

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