WO2019037134A1 - 一种 huata 真核表达载体的构建及其高表达细胞株的制备 - Google Patents

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毛吉炎
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    • C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
    • C12N5/16—Animal cells

Definitions

  • the present invention relates to the construction of a eukaryotic expression vector and the use of the vector to prepare a stable expression cell line. Specifically, the HUATA full-length gene was cloned into a fluorescent protein-tagged pEGFP-N1 eukaryotic expression vector, and the constructed eukaryotic expression vector was used to transfect Hela cells to establish a HUATA stably overexpressing Hela cell line.
  • HUATA is a new protein with galectin family that is isolated from rat embryonic kidney tissue. It is widely distributed in human islet cells, lungs, liver, tonsils and various immune cells, not only in the nucleus. It is also distributed in the cytoplasm and even in the extracellular matrix.
  • HUATA plays an important role in chemotaxis of eosinophils, cell adhesion, differentiation, apoptosis, cell aggregation, inflammatory response and tumor metastasis, and can be used for immunotherapy of tumors.
  • the clinical transformation is achieved, but the lack of a plasmid that specifically promotes the expression of the HUATA gene and a cell line with a high expression of the HU ATA gene in the prior art have hindered the progress of the related research.
  • the present invention is based on the mRNA sequence of HUATA in GenBank, and is designed to include the upstream and downstream primers of the entire HUATA coding region.
  • the sequence of the upstream primer F1 is shown in the sequence listing SEQ NO.l, and the 5' end of F1 is introduced into the EcoR I restriction site.
  • the sequence of the downstream primer R1 is shown in SEQ NO. 2, and the 5' of R1 is introduced into the Xma l cleavage site.
  • the homologous design of the HUATA fragment amplification primer F2 identified by RT-PCR after cell transfection is shown in the sequence listing SEQ NO. 3, and the R2 sequence is shown in the sequence listing SEQ NO. 4.
  • the present invention constructs a HUATA eukaryotic expression vector, which is prepared by the following steps: extraction of total RNA from cells expressing HUATA, cloning of HUATA coding region, and construction of eukaryotic expression vector. [0006] 1 Extraction and reverse transcription of total RNA from cells expressing HUATA:
  • the sample is the total RNA of the sample.
  • the plasmid pEGFP-N1 plasmid DNA and the purified HUTA coding region DNA were digested with EcoR I and Xma l, and the digested product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the target fragment was recovered and purified, and T4 DNA ligase was added at 4 ° C. Connect overnight.
  • the ligation product was transformed into competent E. coli Top 10. The monoclonals were picked and shaken in an LB medium, and the plasmid was extracted for restriction enzyme digestion, and the plasmid of the desired band was sent to a sequencing company for sequencing.
  • the pEGFP-Nl-HUATA eukaryotic expression vector obtained above is transferred into HeLa cells to obtain a cell line stably expressing HUATA, and the screening and identification methods of the transfection conditions and the stable cell strain are as follows: [0017] 1 cell transfection and stable cell line screening
  • the G418 concentration was lowered to 40 (Vg/ml to maintain the screening.
  • a selection medium containing 40 Vg/ml G418, positive clones were isolated and expanded, and a HeLa cell strain stably expressing HUATA was obtained.
  • the Hela cell line stably expressing HUATA was collected, and Hela cells transfected with untransfected Hela cells and pEGFP-Nl empty plasmid were used as a control to extract total RNA and protein of the above cells.
  • Detection of HUATA expression from mRNA level Reverse transcription of the total cellular RNA obtained above to obtain cDNA, using cDNA as a template and GAPDH as an internal reference, and detecting the expression level of HUATA by fluorescent quantitative PCR by using F2 and R2 Effect
  • Figure 1 is a schematic diagram showing the results of fluorescent quantitative PCR detection after screening cells by G418.
  • the upstream and downstream primers including the entire HUATA coding region are designed, and the sequence of the upstream primer F1 is shown in the sequence listing SEQ NO.l, and the 5' end of F1 is introduced into the EcoR I restriction site.
  • the sequence of the downstream primer R1 is shown in SEQ NO. 2, and the 5' of R1 is introduced into the Xma l cleavage site.
  • Simultaneous design The sequence of the HUATA fragment amplification primer F2 identified by RT-PCR after cell transfection is shown in SEQ NO. 3 of the sequence listing, and the sequence of R2 is shown in SEQ NO. 4 of the sequence listing.
  • Jurkat cells were harvested and total RNA was extracted using Trizol and reverse transcribed into cDNA. Take l l cDNA, add 1 ⁇ 1 of the upstream and downstream primers of HUATA coding region, 2xTaq PCR Master Mix2 ⁇ , and make up 20 ⁇ 1 with ddH20.
  • the PCR reaction procedure was: 95 ° C for 5 min; 95 ° C for 20 s, 60 ° C for 20 s, 72 ° C for 60 s, 30 cycles; 72 ° C for 5 min to end the reaction.
  • the product was subjected to agarose gel electrophoresis and purified by gelation to obtain SJ HUATA coding region DNA.
  • the pEGFP-N1 plasmid DNA and the purified HUATA coding region DNA were digested with EcoR I and Xma l, and the digested product was subjected to agarose gel electrophoresis, and the target fragment was recovered and purified, and T4 DNA ligase was added at 4 ° C. Connect overnight.
  • the ligation product was transformed into competent E. coli Top 10. The monoclonals were picked and shaken in an LB medium, and the plasmid was extracted for restriction enzyme digestion, and the plasmid of the desired band was sent to a sequencing company for sequencing. The sequencing results also indicated that the recombinant plasmid contained the complete HUATA gene sequence.
  • the recombinant plasmid pEGFP-Nl-HUATA was extracted with Endo-Free Plasmid Mini Kit II in g/ml ampicillin for 16 h at 37 ° C, 300 rpm.
  • the Hela cell line stably expressing HUATA was collected, and Hela cells transfected with untransfected Hela cells and pEGFP-Nl empty plasmid were used as a control to extract total RNA and protein of the above cells.
  • the expression of HUATA was detected from the mRNA level.
  • the total RNA obtained from the above was reverse transcribed to obtain cDNA.
  • cDNA as a template and GAPDH as an internal reference
  • the expression level of HUATA was detected by fluorescent quantitative PCR using the F2 and R2. As shown in Fig.

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Abstract

提供了一种真核表达载体的构建及其利用该载体制备稳定表达细胞株的方法。具体而言，将HUATA全长基因克隆至带有荧光蛋白标签的pEGFP-N1真核表达载体中，并用构建的真核表达载体转染Hela细胞，建立HUATA稳定过表达的Hela细胞系。

Description

一种 HUATA真核表达载体的构建及其高表达细胞株的制备
技术领域
[0001] 本发明涉及一种真核表达载体的构建及其利用该载体制备稳定表达细胞株。 具 体而言， 本发明将 HUATA全长基因克隆至带有荧光蛋白标签的 pEGFP-Nl真核 表达载体中， 并用构建的真核表达载体转染 Hela细胞， 建立 HUATA稳定过表达 的 Hela细胞系。
背景技术
[0002] HUATA是从鼠胚肾组织中分离出来一种新的具有半乳糖凝集素家族特征的蛋 白质， 广泛分布于人体胰岛细胞、 肺脏、 肝脏、 扁桃体和多种免疫细胞中， 不 仅分布于细胞核，也分布于细胞质乃至细胞外基质。
技术问题
[0003] HUATA在趋化嗜酸性粒细胞、 介导细胞黏附、 分化、 凋亡、 细胞聚集、 炎症 反应及肿瘤转移等多方面发挥重要作用， 可用于肿瘤的免疫治疗， 需做大量研 究方可实现临床转化， 但现有技术中缺乏特异提升 HUATA基因表达的质粒和 HU ATA基因高表达的细胞系， 对相关研究的进展造成了一定的阻碍。
问题的解决方案
技术解决方案
[0004] 本发明根据 GenBank中 HUATA的 mRNA序列， 设计包括整个 HUATA编码区的 上、 下游引物， 上游引物 F1的序列见序列表 SEQ NO.l , F1的 5'端引入 EcoR I酶 切位点， 下游引物 R1的序列见 SEQ N0. 2, R1的 5'引入 Xma l酶切位点。 同吋设 计用于细胞转染后 RT-PCR鉴定的 HUATA片段扩增引物 F2其序列见序列表 SEQ NO. 3， R2序列见序列表 SEQ NO. 4。
[0005] 本发明构建了 HUATA真核表达载体， 通过以下步骤制备： 表达 HUATA的细胞 总 RNA的提取、 HUATA编码区的克隆、 真核表达载体的构建。 [0006] ①表达 HUATA的细胞总 RNA的提取与逆转录：
[0007] a) 收集 Jurkat细胞加入 lml Trizol裂解液， 室温下静置 5min。
[0008] b) 加入 250 μΐ三氯甲烷， 充分混匀， 室温放置 5 min， 12000 g离心 10 min， 取 上清。
[0009] c) 加入 500 μΐ异丙醇混匀， 室温静置 10 min， 12000 g离心 10 min。
[0010] d) 弃上清， imi ml 75%的乙醇 （DEPC水配制） 漂洗， 7500 rpm离心 5 min。
[0011] e) 吸取 75%的乙醇， 于超净台晾干， 直到 EP管底部的 RNA变透明， 加入 30μ1
RNase-free ddH20, 所得即为样本总 RNA。
[0012] f) 应用 PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒， 将上一步得到的 总 RNA进行反转录反应， 在 200μ1反应管中加入总 RNA 1μ1、 5xPrimeScript RT
Master Mix (Perfect Real Time) 2μ1、 RNase Free dH20 7 μΐ , 混匀后 37°C反应 60 min将 RNA逆转录为 cDNA。
[0013] ② HUATA真核表达载体的构建
[0014] 取 1 μΐ cDNA， 加入上述 HUATA编码区上下游引物各 1μ1， 2xTaq PCR Master Mix2 ΙΟμΙ, 用 ddH20补足 20μ1。 PCR反应程序为： 95°C 5 min; 95°C 20 s， 60°C 20 s, 72°C 60 s, 30个循环； 72°C 5min结束反应。 将产物进行琼脂糖凝胶电泳并 切胶回收纯化， 得到 HUATA编码区 DNA。
[0015] 用 EcoR I和 Xma l双酶切 pEGFP-Nl质粒 DNA及纯化的 HUATA编码区 DNA， 将 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳， 回收并纯化目的片段， 加入 T4 DNA ligase， 4°C 连接过夜。 连接产物转化到感受态大肠杆菌 Top 10中。 挑取单克隆置于 LB培养 基中振荡培养， 提取质粒进行酶切鉴定， 并将切下目的条带的质粒送测序公司 进行测序。
[0016] 本发明通过将上述得到的 pEGFP-Nl-HUATA真核表达载体转入 Hela细胞中， 得 到稳定表达 HUATA的细胞株， 转染条件及稳定细胞株的筛选和鉴定方法如下： [0017] ①细胞转染及稳转细胞系的筛选
[0018] a) 在转染前撤除培养基中的抗生素， 将处于对数生长期的 Hela细胞接种至 6孔 板中培养 24h， 待细胞长至 80% -90%融合吋进行转染。
[0019] b) 采用脂质体法转染， 使用前轻轻混合 Lipofectamine 2000， 取 8ul试剂用 400ul 无血清培养基稀释， 轻轻混匀后在室温下孵育 5分钟。
[0020] c) 孵育 5分钟后， 取 pEGFP-Nl空质粒和 pEGFP-Nl-HUATA各 20ug， 分别与稀 释的 LipOfeCtamine 2000， 轻轻混合， 在室温下孵育 20分钟， 以便允许复合物的 形成。
[0021] d) 将质粒 -Lipofectamine 2000复合物加入到每一个包含 Hela细胞和培养基的孔 中。 通过轻轻地前后摇动培养板混合。
[0022] e) 37°C， C02培养箱孵育 4小吋改换含 10%胎牛血清的 DMEM培养基。
[0023] f) 转染 48h后在 10%胎牛血清的 DMEM培养基中加入 80(Vg/ml的 G418进行培养
， 2周后将 G418浓度降低为 40(Vg/ml维持筛选。 用含 40(Vg/ml G418的选择培养液 培养 4周后， 分离阳性克隆并扩大培养， 得到稳定表达 HUATA的 Hela细胞株。
[0024] ②稳转细胞系中 HUATA的表达鉴定
[0025] 收集稳定表达 HUATA的 Hela细胞株、 同吋以未转染 Hela细胞、 pEGFP-Nl空质 粒转染的 Hela细胞为对照， 提取上述细胞的总 RNA及蛋白质。 从 mRNA水平检测 HUATA的表达： 将上述得到的细胞总 RNA反转录得到 cDNA， 以 cDNA为模板， 以 GAPDH为内参， 通过弓 I物 F2和 R2进行荧光定量 PCR检测 HUATA的表达水平 发明的有益效果
对附图的简要说明
附图说明
[0026] 图 1为 G418筛选细胞后荧光定量 PCR检测结果示意图。
实施该发明的最佳实施例
本发明的最佳实施方式
[0027] 下面结合附图与具体实施例对本发明做进一步的说明。
[0028] 实施例一 HUATA基因引物的设计
[0029] 本发明根据 GenBank中 HUATA的 mRNA序列， 设计包括整个 HUATA编码区的 上、 下游引物， 上游引物 F1的序列见序列表 SEQ NO.l , F1的 5'端引入 EcoR I酶 切位点， 下游引物 R1的序列见 SEQ N0. 2, R1的 5'引入 Xma l酶切位点。 同吋设 计用于细胞转染后 RT-PCR鉴定的 HUATA片段扩增引物 F2其序列见序列表 SEQ NO. 3， R2序列见序列表 SEQ NO. 4。
[0030] 实施例二 HUATA真核表达载体的构建
[0031] 收集 Jurkat细胞， 使用 Trizol提取总 RNA， 并逆转录为 cDNA。 取 l l cDNA, 加入 HUATA编码区上下游引物各 1μ1， 2xTaq PCR Master Mix2 ΙΟμΙ, 用 ddH20 补足 20μ1。 PCR反应程序为： 95°C 5 min; 95°C 20 s， 60°C 20 s， 72°C 60 s， 30 个循环； 72°C 5min结束反应。 将产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化， 得 SJ HUATA编码区 DNA。
[0032] 用 EcoR I和 Xma l双酶切 pEGFP-Nl质粒 DNA及纯化的 HUATA编码区 DNA， 将 酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳， 回收并纯化目的片段， 加入 T4 DNA ligase， 4°C 连接过夜。 连接产物转化到感受态大肠杆菌 Top 10中。 挑取单克隆置于 LB培养 基中振荡培养， 提取质粒进行酶切鉴定， 并将切下目的条带的质粒送测序公司 进行测序。 测序结果同样表明该重组质粒含有完整的 HUATA基因序列。
[0033] 将测序正确的菌接种到 15 ml LB培养基 （含 100
g/ml氨苄青霉素） 中， 37°C， 300 rpm培养 16 h， 用 Endo-Free Plasmid Mini Kit II 进行抽提重组质粒 pEGFP-Nl-HUATA。
[0034] 实施例三 细胞转染及稳转细胞系的筛选
[0035] a) 在转染前撤除培养基中的抗生素， 将处于对数生长期的 Hela细胞接种至 6孔 板中培养 24h， 待细胞长至 80%-90%融合吋进行转染。
[0036] b) 采用脂质体法转染， 使用前轻轻混合 Lipofectamine 2000， 取 8ul试剂用 400ul 无血清培养基稀释， 轻轻混匀后在室温下孵育 5分钟。
[0037] c) 孵育 5分钟后， 取 pEGFP-Nl空质粒和 pEGFP-Nl-HUATA各 20ug， 分别与稀 释的 LipOfeCtamine 2000， 轻轻混合， 在室温下孵育 20分钟， 以便允许复合物的 形成。
[0038] d) 将质粒 -Lipofectamine 2000复合物加入到每一个包含 Hela细胞和培养基的孔 中。 通过轻轻地前后摇动培养板混合。
[0039] e) 37°C， C02培养箱孵育 4小吋改换含 10%胎牛血清的 DMEM培养基。
[0040] f) 转染 48h后在 10%胎牛血清的 DMEM培养基中加入 80(Vg/ml的 G418进行培养 ， 2周后将 G418浓度降低为 40(Vg/ml维持筛选。 用含 40(Vg/ml G418的选择培养液 培养 4周后， 分离阳性克隆并扩大培养， 得到稳定表达 HUATA的 Hela细胞株。
[0041] 实施例四 稳转细胞系中 HUATA的表达鉴定
[0042] 收集稳定表达 HUATA的 Hela细胞株、 同吋以未转染 Hela细胞、 pEGFP-Nl空质 粒转染的 Hela细胞为对照， 提取上述细胞的总 RNA及蛋白质。 从 mRNA水平检测 HUATA的表达： 将上述得到的细胞总 RNA反转录得到 cDNA， 以 cDNA为模板， 以 GAPDH为内参， 通过弓 I物 F2和 R2进行荧光定量 PCR检测 HUATA的表达水平 ， 结果如图 1所示， 可以看到， 稳定表达 HUATA的 Hela细胞株的 HUATA基因表 达量有 200倍以上的升高， 而 pEGFP-Nl空质粒转染的 Hela细胞 HUATA基因表达 量与正常 Hela细胞相比基本没有变化， 说明本发明提供的 HUATA基因 cDNA序 列成功插入至 pEGFP-Nl表达载体中， 能特异、 持续、 高效、 稳定地促进 HUAT A基因高表达。

Claims

权利要求书
[权利要求 1] 一种 HUATA基因的特异性引物对， 其序列为 SEQ ID N0.1和 SEQ
ID N0.2。
[权利要求 2] HUATA真核表达载体制备方法， 其通过如下步骤制备， 表达 HUATA 的细胞总 RNA的提取、 HUATA编码区的克隆、 真核表达载体的构建
[权利要求 3] 根据权利要求 2所述的 HUATA真核表达载体制备方法， 其特征在于， 所述的表达 HUATA的细胞总 RNA的提取、 HUATA编码区的克隆、 真核表达载体的构建， 具体方法如下：
①表达 HUATA的细胞总 RNA的提取与逆转录
a) 收集 Jurkat细胞加入 lml Trizol裂解液， 室温下静置 5min。
b) 加入 250 μΐ三氯甲烷， 充分混匀， 室温放置 5 min， 12000 g离心 10 min， 取上清。
c) 加入 500 μΐ异丙醇混匀， 室温静置 10 min， 12000 g离心 10 min。 d) 弃上清， imi ml 75%的乙醇 （DEPC水配制） 漂洗， 7500 rpmi¾ 、5 min°
e) 吸取 75%的乙醇， 于超净台晾干， 直到 EP管底部的 RNA变透明， 加入 30μ1 RNase-free ddH20， 所得即为样本总 RNA。
f) 应用 PrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time)试剂盒， 将上一 步得到的总 RNA进行反转录反应， 在 200μ1反应管中加入总 RNA Ιμΐ 、 5xPrimeScript RT Master Mix (Perfect Real Time) 2μ1、 RNase Free dH20 7 μ1， 混匀后 37°C反应 60 min将 RNA逆转录为 cDNA。
② HUATA真核表达载体的构建
取 l l cDNA, 加入上述 HUATA编码区上下游引物各 1μ1， 2xTaq PCR Master Mix2 ΙΟμΙ, 用 ddH20补足 20μ1。 PCR反应程序为： 95°C 5 min; 95。C 20 s， 60。C 20 s， 72°C 60 s， 30个循环; 72°C 5min结束反 应。 将产物进行琼脂糖凝胶电泳并切胶回收纯化， 得到 HUATA编码 区 DNA。 用 EcoR I和 Xma
I双酶切 pEGFP-N 1质粒 DNA及纯化的 HUATA编码区 DNA， 将酶切产 物进行琼脂糖凝胶电泳， 回收并纯化目的片段， 加入 T4 DNA ligase ， 4°C连接过夜。 连接产物转化到感受态大肠杆菌 Top 10中。 挑取单 克隆置于 LB培养基中振荡培养， 提取质粒进行酶切鉴定， 并将切下 目的条带的质粒送测序公司进行测序。
将测序正确的菌接种到 15 ml LB培养基 （含 lOO g/ml氨苄青霉素） 中 ， 37°C， 300 rpm培养 16 h， 用 Endo-Free Plasmid Mini Kit II进行抽提 重组质粒 pEGFP-Nl-HUATA。
[权利要求 4] 根据权利要求 3所述的一种稳定转染细胞株的方法， 具体包括以下步 骤：
①细胞转染及稳转细胞系的筛选
a) 在转染前撤除培养基中的抗生素， 将处于对数生长期的 Hela细胞 接种至 6孔板中培养 24h， 待细胞长至 80% -90%融合吋进行转染。 b) 采用脂质体法转染， 使用前轻轻混合 LipofeCtamine 2000， 取 8ul试 剂用 400ul无血清培养基稀释， 轻轻混匀后在室温下孵育 5分钟。 c) 孵育 5分钟后， 取 pEGFP-Nl空质粒和 pEGFP-Nl-HUATA各 20ug， 分别与稀释的 Lipofectamine 2000， 轻轻混合， 在室温下孵育 20分钟， 以便允许复合物的形成。
d) 将质粒 -Lipofectamine 2000复合物加入到每一个包含 Hela细胞和培 养基的孔中。 通过轻轻地前后摇动培养板混合。
e) 37°C， C02培养箱孵育 4小吋改换含 10%胎牛血清的 DMEM培养基 f) 转染 48h后在 10%胎牛血清的 DMEM培养基中加入 80(Vg/ml的 G418 进行培养， 2周后将 G418浓度降低为 40(Vg/ml维持筛选。 用含 400μ§/ ml G418的选择培养液培养 4周后， 分离阳性克隆并扩大培养， 得到稳 定表达 HUATA的 Hela细胞株。
②稳转细胞系中 HUATA的表达鉴定 收集稳定表达 HUATA的 Hela细胞株、 同吋以未转染 Hela细胞、 pEGF P-N1空质粒转染的 Hela细胞为对照， 提取上述细胞的总 RNA及蛋白 质。 从 mRNA水平检测 HUATA的表达： 将上述得到的细胞总 RNA反 转录得到 cDNA， 以 cDNA为模板， 以 GAPDH为内参， 通过引物 F2和 R2进行荧光定量 PCR检测 HUATA的表达水平。
[权利要求 5] —种稳定表达 HUATA的 Hela细胞株， 其由权利要求 3或 4制备得到。
[权利要求 6] 权利要求 1的引物在制备检测人 HUATA基因试剂盒中的应用。
[权利要求 7] 权利要求 2-3任意一项所述的载体或权利要求 6的细胞株在制备人 HUA
TA蛋白中的
应用。
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