PT2029602E - Compostos de triazolopirazina uteis para o tratamento de doenãas degenerativas e inflamatërias - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "COMPOSTOS DE TRIAZOLOPIRAZINA ÚTEIS PARA O TRATAMENTO DE DOENÇAS DEGENERATIVAS E INFLAMATÓRIAS" A presente invenção refere-se a uma classe de compostos de triazolopirazina capazes de se ligar ao sitio activo de uma serina/treonina-cinase, cuja expressão está envolvida na via que resulta na degradação de matriz extracelular (ECM), degeneração de articulações e doenças envolvendo uma tal degradação e/ou inflamação.

As doenças envolvendo a degradação de matriz extracelular incluem, mas não se limitam a artrite psoriática, artrite juvenil, artrite precoce, artrite reactiva, osteoartrite, espondilite anquilosante, osteoporose, doenças musculoesqueléticas como tendinite e doença periodontal, metástase de cancro, doenças das vias respiratórias (COPD, asma), fibrose renal e hepática, doenças cardiovasculares como aterosclerose e insuficiência cardíaca, e doenças neurológicas como neuroinflamação e esclerose múltipla. As doenças envolvendo principalmente a degeneração de articulações incluem, mas não se limitam a, artrite psoriática, artrite juvenil, artrite precoce, artrite reactiva, osteoartrite e espondilite anquilosante. A artrite reumatóide (RA) é uma doença degenerativa crónica das articulações, caracterizada por inflamação e destruição das estruturas da articulação. Quando a doença não é controlada, ela conduz a uma incapacidade considerável e dor devido à perda de funcionalidade da articulação e até mesmo à morte prematura. Por conseguinte, o objectivo de uma terapia para a RA não é o de abrandar a doença mas o de 2 conseguir um enfraquecimento da mesma para parar a destruição de articulações Além da gravidade do efeito da doença, uma prevalência elevada de RA (~ 0,8% de adultos são afectados em todo o mundo) significa um impacto socioeconómico elevado. (Para revisões sobre RA, fazemos referência a Smolen e Steiner (2003); Lee e Weinblatt (2001); Choy e Panayi (2001); 0'Dell (2004) e Firestein (2003) ) .

Embora seja largamente aceite que a RA é uma doença autoimune, não existe consenso no que se refere aos mecanismos exactos que conduzem a 'fase de iniciação' da doença. O que se sabe é que os gatilho (s) inical(ais) medeiam, num hospedeiro com predisposição, uma cascata de eventos que levam à activação de vários tipos de células (células B, células T, macrófagos, fibroblastos, células endoteliais, células dendriticas e outras).

Simultaneamente, observa-se uma maior produção de várias citoquinas nas articulações e tecidos que circundam a articulação (por exemplo, TNF-α, IL-6, IL-1, IL-15, IL-18 e outros). Quando a doença progride, a activação celular e a cascata de produção de citoquinas torna-se auto-sustentada. Nesta fase precoce, a destruição de estruturas das articulações já é muito evidente. Trinta por cento dos doentes têm evidências radiográficas de erosão óssea na altura do diagnóstico e esta proporção aumenta para 60 por cento após dois anos. A análise histológica das articulações de doentes com RA indica claramente os mecanismos envolvidos nos processos degenerativos associados à RA. Esta análise mostra que o efector principal responsável pela degradação de articulações associada à RA é o pannus, onde o fibroblasto 3 sinovial, através da produção de várias enzimas proteoliticas, é o impulsionador principal de erosão da cartilagem e osso. Uma articulação contém classicamente dois ossos adjacentes que articulam numa camada de cartilagem circundada pelas membrana sinovial e cápsula da articulação. No doente com RA avançada, a sinóvia da articulação aumenta de tamanho para formar o pannus, devido à proliferação de fibroblastos sinoviais e à infiltração de células mononucleares como células T, células B, monócitos, macrófagos e neutrófilos. 0 pannus medeia a degradação da cartilagem adjacente, levando a um estreitamento do espaço da articulação, e tem o potencial de invadir osso e cartilagem adjacentes. Como os tecidos do osso e cartilagem são essencialmente constituídos de colagénio de tipo I ou II, respectivamente, as propriedades destrutivas e invasoras do pannus são mediadas pela secreção de proteases colagenoliticas, principalmente as metaloproteinases da matriz (MMPs). A erosão do osso debaixo e adjacente à cartilagem também faz parte do processo de RA e resulta principalmente da presença de osteoclastos na interface entre o osso e o pannus. Os osteoclastos são células multinucleares que, após adesão ao tecido ósseo, formam um compartimento fechado, no qual os osteoclastos segregam proteases (Catepsina K, MMP9) que degradam o tecido ósseo. A população de osteoclastos na articulação está anormalmente aumentada pela formação de osteoblastos a partir de células precursoras induzida pela secreção do activador do receptor do ligando de NFkB (RANKL) por SF e células T activadas. Vários tipos de colagénio têm um papel chave na definição da estabilidade da matriz extracelular (ECM). Os colagénio de tipo I e colagénio de tipo II, por exemplo, são os 4 componentes principais de osso e cartilagem, respectivamente. As proteínas de colagénio organizam-se tipicamente em estruturas multiméricas chamadas de fibrilas de colagénio. As fibrilas de colagénio nativas são muito resistentes à dissociação proteolítica. Apenas alguns tipos de proteínas de degradação de ECM foram descritos como tendo a capacidade para degradar colagénio nativo: MMPs e Catepsinas. Entre as Catepsinas, a catepsina K, a qual é activa principalmente em osteoclastos, é a melhor caracterizada. Entre as MMPs, sabe-se que as MMP1, MMP2, MMP8, MMP13 e MMP14 têm propriedades colagenolíticas. A correlação entre uma maior expressão de MMP1 pelos fibroblastos sinoviais (SF) e a progressão da doença artrítica está bem estabelecida e é premonitória de processos erosivos das articulações (Cunnane et al., 2001). Portanto, no contexto da RA, a MMP1 representa uma proteína de degradação de colagénio extremamente relevante. In vitro, o tratamento de SF cultivados com citoquinas relevantes na patologia da RA (por exemplo, TNF-α e ΙΙΛβ) aumentará a expressão de MMP1 por estas células (Andreakos et al., 2003). A monitorização dos níveis de MMP1 expressados pelos SF é uma leitura relevante no campo da RA já que é indicadora da activação de SF para um fenótipo erosivo que é responsável, in vivo, pela degradaçao de cartilagem. A inibição da expressão de MMP1 por SF representa uma abordagem terapêutica valiosa para o tratamento de RA. A actividade das proteínas de degradação de ECM também pode provocar ou correlacionar com a progressão de várias doenças diferentes de RA, por exemplo, outras doenças que envolvem a degradação das articulações. Estas doenças incluem, mas não se restringem a, artrite psoriática, 5 artrite juvenil, artrite precoce, artrite reactiva, osteoartrite e espondilite anquilosante. Outras doenças que podem ser tratáveis com os compostos identificados de acordo com a presente invenção e utilizando os alvos envolvidos na expressão de MMPs como aqui descritos são a osteoporose, doenças musculoesqueléticas como tendinite e doença periodontal (Gapski et al. , 2004) , metástase de cancro (Coussens et al. , 2002) i , doenças das vias respiratórias (COPD, asma) (Suzuki et al., 2004), pulmão, fibrose renal (Schanstra et al., 2002), fibrose hepática associada a hepatite C crónica (Reiff et al., 2005), doenças cardiovasculares como aterosclerose e insuficiência cardíaca (Creemers et al., 2001) e doenças neurológicas como neuroinflamação e esclerose múltipla (Rosenberg, 2002) . Os doentes que sofrem destas doenças podem beneficiar da estabilização da ECM (protegendo-a da degradação). A serina/treonina-cinase de 471 aminoácidos identificada como Proteína Cinase 5 Activada por Proteína Cinase Activada por Mitogénio (MAPKAPK5 ou PRAK) é expressada num grande painel de tecidos. A proteína contém o seu domínio catalítico na extremidade N-terminal, e um sinal de localização nuclear (NLS) e um sinal de exportação nuclear (NES) na sua extremidade C-terminal. A MAPKAPK5 endógena está predominantemente presente no citoplasma, mas a activação das células por stress ou citoquinas medeia a sua translocação para o núcleo (New et al., 2003). Este evento é dependente de fosforilação da MAPKAPK5. A Thrl82 é o sítio de fosforilação reguladora de MAPKAPK5. Apesar de a p38cx-cinase ser capaz de fosforilar a MAPKAPK5 num cenário de sobreexpressão, as experiências com MAPKAPK5 endógena não apoiam esta hipótese (Shi et al., 2003). Foram criados 6 ratos deficientes em MAPKAPK5 que são viáveis e férteis. 0 fenótipo destes ratos é muito diferente dos ratos deficientes em MAPKAPK2, uma cinase relacionada com a MAPKAPK5 que é regulada por p38cx (Shi et al., 2003) . Isto indica que a função de cada proteína é distinta e que nenhuma das cinases pode compensar a actividade da outra. No seu conjunto, as MAPKAPK5 e MAPKAPK2 representam alvos distintos com um papel não redundante. A MAPK6 (também chamada de ERK3) foi recentemente identificada como um substrato fisiologicamente relevante para MAPKAPK5, definindo uma nova via de transdução de sinal (Seternes et al., 2004) .

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os NSAIDS (fármacos anti-inflamatórios não esteróides) são utilizados para reduzir a dor associada à RA e melhorar a qualidade de vida dos doentes. No entanto, estes fármacos não colocarão um travão na destruição de articulação associada à RA.

Constatou-se que os corticosteróides diminuem a progressão de RA como detectado radiograficamente e são utilizados a doses baixas para tratar parte dos doentes com RA (30 até 60%). No entanto, efeitos secundários graves estão associados à utilização prolongada de corticosteróides (adelgaçamento da pele, osteoporose, cataratas, hipertensão, hiperlipidemia).

Os DMARD sintéticos (Fármacos Anti-Reumáticos Modificadores de Doença) (por exemplo, metotrexato, leflunomida, sulfassalazina) combatem principalmente a componente imunoinflamatória da RA. Como uma desvantagem principal, 7 estes fármacos têm apenas uma eficácia limitada (a destruição da articulação é apenas abrandada mas não bloqueada pelos DMARDs pelo que a progressão da doença continua a longo prazo) . A ausência de eficácia é indicada pelo facto de, em média, apenas 30% dos doentes alcançarem uma classificação ACR40 após 24 meses de tratamento com metotrexato. Isto significa que, de acordo com o American College of Rheumatology, apenas 30% dos doentes alcançam um melhoramento de 50% dos seus sintomas (0'Dell et al., 1996). Além disso, o mecanismo de acção exacto dos DMARDs é frequentemente pouco claro.

Os DMARD biológicos (Infliximab, Etanercept, Adalimumab, Rituximab, CTLA4-Ig) são proteínas terapêuticas que inactivam citoquinas (por exemplo, TNF-α) ou células (por exemplo, células T ou células B) que têm um papel importante na f isiopatologia da RA (Kremer et al., 2003; Edwards et al., 2004). Embora a terapêutica de associação com bloqueadores de TNF-α (Infliximab, Etanercept, Adalimumab) e metotrexato seja o tratamento mais eficaz contra a RA presentemente disponível, é surpreendente que até mesmo esta terapêutica consiga apenas um melhoramento de 50% (ACR40) nos sintomas da doença em 50-60% dos doentes após 12 meses de terapêutica (St Clair et al., 2004). Existem alguns avisos sobre eventos adversos em fármacos anti-TNF-α, lançando uma luz sobre os efeitos secundários associados a este tipo de fármacos. Foram descritos um maior risco de infecções (tuberculose), eventos hematológicos e distúrbios desmielinizantes para os bloqueadores de TNP-α (ver também Gomez-Reino et al., 2003). Além dos efeitos secundários graves, os bloqueadores de TNF-α também partilham das desvantagens gerais da classe biológica de agentes terapêuticos, as quais são a via de administração desagradável (injecções frequentes acompanhadas de reacções no sitio de infusão) e o custo de produção elevado. Agentes novas em fase final de desenvolvimento visam moléculas co-estimuladoras de células T e células B. Antecipa-se que a eficácia destes agentes seja semelhante à dos bloqueadores de TNF-oí. 0 facto de uma diversidade de terapêuticas de abordagem selectiva terem eficácias semelhantes, mas limitadas, sugere que existe uma multiplicidade de factores patogénicos para a RA. Isto também é indicador de uma deficiência na nossa compreensão dos eventos patogénicos relevantes para a RA.

As terapêuticas correntes para a RA não são satisfatórias devido à sua eficácia limitada (não existe nenhuma terapêutica adequada para 30% dos doentes). Isto apela a estratégias adicionais para se conseguir remissão. A remissão é necessária uma vez a doença residual acarreta o risco de deterioração progressiva das articulações e, desse modo, incapacidade progressiva. A inibição da componente imunoinflamatória da doença de RA, a qual representa o alvo principal de fármacos presentemente utilizados para tratamento de RA, não resulta num bloqueio da degradação da articulação, a marca principal da doença. A US 2005/0009832 descreve imidazolo[1,2-a]pirazina-8-il-aminas substituídas como moduladores de proteína-cinases, incluindo MAPKAPK5. A WO02/056888 descreve inibidores de MAPKAPK5 como moduladores de TNF capazes de regular a expressão de determinadas citoquinas. Nenhuma destas referências do estado anterior da técnica descreve qualquer composto no âmbito da classe de compostos aqui descritos a seguir. 9

SUMÁRIO DA INVENÇÃO A presente invenção baseia-se na descoberta de que a MAPKAPK5 actua na via que resulta na expressão de MMP1, e que os inibidores da actividade MAPKAPK5, como os compostos da presente invenção, são úteis para o tratamento de doenças envolvendo a expressão anormalmente elevada de actividade MMP.

Os compostos da presente invenção podem ser geralmente descritos como [1.2.4]triazolo[1,5-a]pirazina-8-il-aminas substituídas na posição 5 com um grupo arilo e heteroarilo, e na posição 8 com um grupo arilamino ou heteroarilamino.

Mais particularmente, a presente invenção refere-se a compostos possuindo propriedades inibidoras de metaloproteinases da matriz numa célula de mamífero, de acordo com a fórmula III:

(III) em que R1 é H, ou alquilo substituído ou não substituído; e cada um de R8 e R9 é independentemente seleccionado de cicloalquilo substituído ou não substituído, heterocicloalquilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, heteroarilo substituído ou 10 não substituído; ou um seu sal, solvato ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável, e estereoisómeros, variantes isotópicas e tautómeros daqueles.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é seleccionado de ciclopentilo substituído ou não substituído, ciclo-hexilo, fenilo substituído ou não substituído, piridilo substituído ou não substituído, pirimidina substituída ou não substituída, e pirazina substituída ou não substituída, pirrole substituído ou não substituído, pirazole substituído ou não substituído e imidazole substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R1 é H, Me, Et, i-Pr ou CF3.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R1 é H.

Outro aspecto da presente invenção refere-se a compostos de acordo com a fórmula IVa, IVb, IVc ou IVd

IVa , |Vb , IVc ou !Vd e em que L é uma liqação, -CO-, -O (CH2)mi-, -CON(H) (CH2)mi-, ou -NHCO-; o subscrito ml é seleccionado de 1-4; o anel P é heterocicloalquilo substituído ou não substituído; o 11 subscrito n é seleccionado de 1-4; cada R8a é independentemente seleccionado de hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído, alcoxilo, ciano, carbamoílo, CHO e halo; e R9 é independentemente seleccionado de arilo substituído ou não substituído e heteroarilo; ou um seu sal, solvato ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável; e estereoisómeros, variantes isotópicas e tautómeros daqueles.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas ΙΙΙ-IVd, R9 é arilo substituído ou não substituído. Noutra forma de realização, R9 é fenilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas ΙΙΙ-IVd, R9 é heteroarilo substituído ou não substituído. Noutra forma de realização, R9 é piridilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas ΙΙΙ-IVd, R9 é seleccionado de fenilo, indolilo, isoindolilo, pirrolilo, furanilo, tienilo, pirazolilo, oxazolilo, e tiazolilo substituído ou não substituído.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona composições farmacêuticas compreendendo um composto de triazolopirazina da invenção e um veículo, excipiente ou diluente farmacêutico. Neste aspecto da invenção, a composição farmacêutica pode compreender um ou mais dos compostos aqui descritos. Além disso, os compostos da presente invenção úteis nas composições farmacêuticas e métodos de tratamento aqui descritos, são todos farmaceuticamente aceitáveis como preparados e utilizados. 12

Outro aspecto desta invenção refere-se à utilização do presente composto num método terapêutico, numa composição farmacêutica e no fabrico dessa composição, útil para o tratamento de doenças envolvendo inflamação, degradação de colagénio e, em particular, doenças caracteristicas de actividade anormal de metaloproteases da matriz (MMPI) e/ou Proteina Cinase 5 Activada por Proteína Cinase Activada por Mitogénio (MAPKAPK5), das quais a artrite reumatóide (RA) é uma doença particular. Esta invenção também se refere a processos de preparação dos actuais compostos.

Outros objectos e vantagens tornar-se-ão evidentes para o especialista na técnica tendo em consideração a descrição detalhada seguinte, a qual procede por referência aos seguintes desenhos ilustrativos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1. Este diagrama mostra as diferenças histológicas surpreendentes entre uma articulação saudável e a de um doente com RA.

Figura 2. Este gráfico mostra a expressão aumentada de MMP 1 em fibroblastos sinoviais desencadeada por citoquinas envolvidas na patologia da artrite reumatóide.

Figura 3. Este gráfico mostra a inibição dependente da dose da expressão induzida por "activador baseado em TNF-α" de MMPI pelos SF por um composto anti-inflamatório conhecido.

Figura 4. Este gel mostra a redução, ao nível da proteína, da expressão de MAPKAPK5 em SF por infecção das células com vírus Ad-siRNA que visa selectivamente a MAPKAPK5. 13

Figura 5. Este gráfico mostra a redução de níveis induzidos por ‘ complexo activador' da expressão de MMP1 por SF por um vírus Ad-siRNA que visa selectivamente a MAPKAPK5.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Definições

Quando se descrevem os compostos, as composições farmacêuticas contendo tais compostos e os métodos de utilização de tais compostos e composições, os seguintes termos têm os significados seguintes a menos que indicado em contrário. "Alcoxilo" significa alquil-O-. 0 alcoxilo ilustrativo inclui metoxilo, etoxilo, n-propoxilo, i-propoxilo, n-butoxilo e heptoxilo. Os grupos alcoxilo preferidos são alcoxilo inferior. "Alquilo" significa hidrocarboneto alifático de cadeia linear ou ramificada possuindo 1 até cerca de 20 átomos de carbono. O alquilo preferido tem 1 até cerca de 12 átomos de carbono. Mais preferido é alquilo inferior. Ramificado significa que um ou mais grupos alquilo inferior como metilo, etilo ou propilo estão ligados a uma cadeia alquilo linear. "Alquilamino" significa alquil-NH-. O alquilamino preferido é alquil (Ci-Cõ)-amino. O alquilamino ilustrativo inclui metilamino e etilamino. 14 "Amino-alcanoilo inferior" significa NH2-R-CO-, em que R é alquileno inferior. Os grupos preferidos incluem aminoetanoilo e aminoacetilo. "Carbamoilo-alquilo inferior" significa o radical NH2CO-alquil inferior-. Os grupos preferidos incluem carbamoiletilo e carbamoilmetilo. "Éster de alquilo inferior de carbociclo" significa um éster de alquilo inferior de um radical carboxilo, grupo -C00-. "Compostos da presente invenção", e expressões equivalentes, destinam-se a abranger os compostos de Fórmula (III) como descritos atrás, expressão essa que inclui os pró-fármacos, os sais farmaceuticamente aceitáveis, e os solvatos, por exemplo, hidratos, onde o contexto assim o permita. Analogamente, a referência a intermediários, quer eles sejam reivindicados ou não, destina-se a abranger os seus sais, e solvatos, onde o contexto assim o permitir. "Expressão" significa expressão endógena. "Halo" ou "halogéneo" significa fluoro, cloro, bromo ou iodo. "Hidrogénio" significa, no contexto de um substituinte, que está presente -H na posição do composto e também inclui o seu isótopo, deutério. 15 "Alcanoílo inferior amino" significa um grupo amino com um grupo funcional orgânico R-CO-, em que R representa um grupo alquilo inferior. "Alquilo inferior" significa 1 até cerca de 6 átomos de carbono numa cadeia alquilo linear que pode ser linear ou ramificada. "Alcoxilo inferior" significa 1 até cerca de 6 átomos de carbono numa cadeia alquilo linear que pode ser linear ou ramificada, e que está ligada por um átomo de oxigénio. "Sulfonamida de alquilo inferior" refere-se um alquilamida inferior de sulfonamida da fórmula -SC>2NR*R*, em que R* é hidrogénio ou alquilo inferior, e pelo menos um R* é alquilo inferior. "Profilaxia" significa uma medida tomada para a prevenção de uma doença. "Solvato" significa uma associação física de um composto útil nesta invenção com uma ou mais moléculas de solvente. Esta associação física incluiu ligações de hidrogénio. Em determinados casos, o solvato poderá ser isolado, por exemplo quando estão incorporadas uma ou mais moléculas de solvente na matriz cristalina do sólido cristalino. "Solvato" abrange tanto solvatos em solução e isoláveis. Os compostos da invenção podem ser preparados, por exemplo, na forma cristalina e podem estar solvatados ou hidratados. Os solvatos adequados incluem solvatos farmaceuticamente aceitáveis, tais como hidratos, e incluem ainda solvatos estequiométricos e não estequiométricos. Os solventes convencionais incluem água, etanol, ácido acético e 16 semelhantes, por conseguinte, os solvatos representativos incluem hidratos, etanolatos e metanolatos. "Substituído" significa que um átomo ou grupo de átomos na molécula está substituído por outro átomo ou grupo. "Sulfonamida" refere-se a um grupo de compostos contendo o grupo quimico - SO2NH2. "Quantidade terapeuticamente eficaz" significa aquela quantidade de um fármaco ou agente farmacêutico que viabilizará a resposta biológica ou médica de um indivíduo que está a ser procurada por um médico ou outro clínico. A "quantidade terapeuticamente eficaz" pode variar dependendo do composto, da doença e sua gravidade, e da idade, peso, etc., do indivíduo a ser tratado. Em particular, no que respeita ao tratamento de uma condição patológica caracterizada por degradação da matriz extracelular, o termo "quantidade eficaz para inibir a metaloprotease da matriz" significa a quantidade eficaz de um composto da presente invenção que produzirá uma diminuição biologicamente significativa na produção de MMP-1 nos tecidos do indivíduo afectados pela doença pelo que a degradação da matriz extracelular é significativamente reduzida. Um composto possuindo propriedades inibidoras de metaloprotease da matriz ou um "composto inibidor de metaloprotease da matriz" significa um composto da presente invenção que ao ser fornecido a uma célula em quantidades eficazes é capaz de provocar uma diminuição biologicamente significativa na produção de MMP-1 nessas células. "Arilo" refere-se a um grupo hidrocarboneto aromático monovalente obtido pela remoção de um átomo de hidrogénio 17 de um único átomo de carbono de um sistema de anel aromático parental. Os grupos arilo típicos incluem, mas não se restringem a, grupos derivados de aceantrileno, acenaftileno, acefenantrileno, antraceno, azuleno, benzeno, criseno, coroneno, fluoranteno, fluoreno, hexaceno, hexafeno, hexaleno, as-indaceno, s-indaceno, indano, indeno, naftaleno, octaceno, octafeno, octaleno, ovaleno, penta-2,4-dieno, pentaceno, pentaleno, pentafeno, perileno, fenaleno, fenantreno, piceno, pleiadeno, pireno, pirantreno, rubiceno, trifenileno, trinaftaleno e semelhantes. Em particular, um grupo arilo compreende de 6 até 14 átomos de carbono. "Arilo substituído" inclui aqueles grupos aqui recitados na definição de "substituído", e refere-se em particular a um grupo arilo que pode estar opcionalmente substituído com I ou mais substituintes, por exemplo de 1 até 5 substituintes, em particular 1 até 3 substituintes, seleccionados do grupo consistindo de acilo, acilamino, aciloxilo, alcenilo, alcenilo substituído, alcoxilo, alcoxilo substituído, alcoxicarbonilo, alquilo, alquilo substituído, alcinilo, alcinilo substituído, amino, amino substituído, aminocarbonilo, aminocarbonilamino, aminocarboniloxilo, arilo, ariloxilo, azido, carboxilo, ciano, cicloalquilo, cicloalquilo substituído, halogéneo, hidroxilo, nitro, tioalcoxilo, tioalcoxilo substituído, tioariloxilo, tiol, alquil-S(0)-, aril-S(O)-, alquil-S(0) 2_ e aril-S(0)2-· "Bicicloarilo" refere-se a um grupo hidrocarboneto aromático monovalente obtido pela remoção de um átomo de hidrogénio de um único átomo de carbono de um sistema bicíclico aromático parental. Os grupos bicicloarilo 18 típicos incluem, mas não se restringem a, grupos derivados de indano, indeno, naftaleno, tetra-hidronaftaleno e semelhantes. Em particular, um grupo arilo compreende de 8 até 11 átomos de carbono. "Biciclo-heteroarilo" refere-se a um grupo bicíclico heteroaromático monovalente obtido pela remoção de um átomo de hidrogénio de um único átomo de um sistema bicíclico heteroaromático parental. Os grupos bicilo-heteroarilo típicos incluem, mas não se restringem a, grupos derivados de benzofurano, benzimidazole, benzindazole, benzodioxano, cromeno, cromano, cinolina, ftalazina, indole, indolina, indolizina, isobenzofurano, isocromeno, isoindole, isoindolina, isoquinolina, benzotiazole, benzoxazole, naftiridina, benzoxadiazole, pteridina, purina, benzopirano, benzopirazina, piridopirimidina, quinazolina, quinolina, quinolizina, quinoxalina, benzomorfeno, tetra-hidroisoquinolina, tetra-hidroquinolina e semelhantes. Preferencialmente, o grupo biciclo-heteroarilo é biciclo-heteroarilo de 9-11 membros, sendo particularmente preferido o heteroarilo de 5-10 membros. Os grupos biciclo-heteroarilo particulares são aqueles derivados de benzotiofeno, benzofurano, benzotiazole, indole, quinolina, isoquinolina, benzimidazole, benzoxazole e benzodioxano. "Carbamoílo" refere-se ao radical -C(0)N(R42)2 em que cada grupo R e independentemente hidrogénio, alquilo, cicloalquilo ou arilo, como aqui definido, o qual pode estar opcionalmente substituído como aqui definido. Numa forma de realização específica, o termo ''carbamoílo" refere-se a -C(0)-NH2. 19 "Cicloalquilo" refere-se a grupos hidrocarbilo cíclicos possuindo de 3 até cerca de 10 átomos de carbono e possuindo um único anel cíclico ou múltiplos anéis condensados, incluindo sistemas de anéis fundidos e em ponte, os quais podem estar opcionalmente substituídos com 1 até 3 grupos alquilo. Tais grupos cicloalquilo incluem, a título de exemplo, estruturas de um único anel como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclooctilo, 1-metilciclopropilo, 2-metilciclopentilo, 2-metilciclooctilo, e semelhantes, e estruturas de múltiplos anéis como adamantanilo, e semelhantes. "Cicloalquilo substituído" inclui aqueles grupos aqui enumerados na definição de "substituído" e refere-se, em particular, a um grupo cicloalquilo possuindo 1 ou mais substituintes, por exemplo de 1 até 5 substituintes, e em particular de 1 até 3 substituintes, seleccionados do grupo consistindo de acilo, acilamino, aciloxilo, alcoxilo, alcoxilo substituído, alcoxicarbonilo, alcoxicarbonilamino, amino, amino substituído, aminocarbonilo, aminocarbonilamino, aminocarboniloxilo, arilo, ariloxilo, azido, carboxilo, ciano, cicloalquilo, cicloalquilo substituído, halogéneo, hidroxilo, ceto, nitro, tioalcoxilo, tioalcoxilo substituído, tioariloxilo, tioceto, tiol, alquil-S(0) -, aril-S(0)-, alquil- -S(0)2- e aril-S(0)2-· "Substituído" refere-se a um grupo no qual um ou mais átomos de hidrogénio estão, cada um, independentemente substituídos por substituinte(s) iguais ou diferentes. Os substituintes típicos incluem, mas não se restringem a, -X, -R46, -O”, =0, -OR46, -SR46, -S”, =S, -NR46R47, =NR46, -CX3, -CF3, -CN, -OCN, -SCN, -NO, -N02, =N2, -N3, -S(0)20“, 20 -S(0)2OH, -S(0)2R46, -OS (02) CT, -OS (O) 2R46, -P(0)(0')2, -C (O) R46, -C(S)R46, -OP(O) (OR46) (OR47) -P (O) (OR46) (0“) , -C (O) OR46, -C(0)NR46R47, -C(0)0-, -C(S)OR46, -nr48c (0)NR46R47, -NR48C(S)NR46R47, -NR49C(NR48)NR46R47 e -C (NR48)NR46R47, em que cada X é independentemente um halogéneo; cada R46, R47, R48 e R49 são independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, alquilo substituído, arilalquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, alquilo substituído, ciclo-heteroalquilo, ciclo-heteroalquilo substituído, heteroalquilo, heteroalquilo substituído, heteroarilo, heteroarilo substituído, heteroarilalquilo, heteroarilalquilo substituído, -NR50R51, -C(O)Rs0 ou -S(0)2R5° ou opcionalmente R50 e R51 em conjunto com o átomo ao qual estão ambos ligados formam um anel ciclo-heteroalquilo ou ciclo-heteroalquilo substituído; e R50 e R51 são independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, alquilo substituído, arilalquilo, alquilo substituído, cicloalquilo, alquilo substituído, ciclo-heteroalquilo, ciclo-heteroalquilo substituído, heteroalquilo, heteroalquilo substituído, heteroarilo, heteroarilo substituído, heteroarilalquilo ou heteroarilalquilo substituído.

Exemplos de arilos substituídos representativos incluem os seguintes

Nestas fórmulas um de R52 e R53 pode ser hidrogénio e pelo menos um de R52 e R53 é, cada um, independentemente 21 seleccionado de alquilo, alcenilo, alcinilo, ciclo-heteroalquilo, alcanoílo, alcoxilo, ariloxilo, heteroariloxilo, alquilamino, arilamino, heteroarilamino, NR54COR55, NR54SOR55, NR54S02R57, COOalquilo, COOarilo, CONR54R55, CONR54OR55, NR54R55, S02NR54R55, S-al quilo, S-alquilo, SOalquilo, S02alquilo, Sarilo, SOarilo, S02arilo; ou R52 e R53 podem ser unidos para formar um anel cíclico (saturado ou insaturado) de 5 até 8 átomos, contendo opcionalmente um ou mais heteroátomos seleccionados do grupo N, 0 ou S. R , R e R sao mdependentemente hidrogénio, alquilo, alcenilo, alcinilo, perfluoroalquilo, cicloalquilo, ciclo-heteroalquilo, arilo, arilo substituído, heteroarilo, substituído ou heteroalquilo ou semelhantes. "Hetero" quando utilizado para descrever um composto ou um grupo presente num composto significa que um ou mais átomos de carbono no composto ou grupo foram substituídos por um heteroátomo de azoto, oxigénio ou enxofre. Hetero pode ser aplicado a qualquer um dos grupos hidrocarbilo descritos acima como alquilo, por exemplo, heteroalquilo, cicloalquilo, por exemplo, ciclo-heteroalquilo, arilo, por exemplo, heteroarilo, cicloalcenilo, ciclo-heteroalcenilo, e semelhantes possuindo de 1 até 5, e especialmente de 1 até 3 heteroátomos. "Heteroarilo" refere-se a um grupo heteroaromático monovalente obtido pela remoção de um átomo de hidrogénio de um único átomo de um sistema de anel heteroaromático parental. Os grupos heteroarilo típicos incluem, mas não se restringem a, grupos derivados de acridina, arsindole, carbazole, β-carbolina, cromano, cromeno, cinolina, furano, imidazole, indazole, indole, indolina, indolizina, 22 isobenzofurano, isocromeno, isoindole, isoindolina, isoquinolina, isotiazole, isoxazole, naftiridina, oxadiazole, oxazole, pirimidina, fenantridina, fenantrolina, fenazina, ftalazina, pteridina, purina, pirano, pirazina, pirazole, piridazina, piridina, pirimidina, pirrole, pirrolizina, quinazolina, quinolina, quinolizina, quinoxalina, tetrazole, tiadiazole, tiazole, tiofeno, triazole, xanteno e semelhantes. Preferencialmente, o grupo heteroarilo é um heteroarilo de 5-15 membros, sendo particularmente preferido um heteroarilo de 5-10 membros. Os grupos heteroarilo particulares são aqueles derivados de tiofeno, pirrole, benzotiofeno, benzofurano, índole, piridina, quinolina, imidazole, oxazole e pirazina.

Exemplos de representativos heteroarilos incluem os seguintes:

em que cada Y é seleccionado de carbonilo, N, NR58, O e S; e R58 é independentemente hidrogénio, alquilo, cicloalquilo, ciclo-heteroalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalquilo ou semelhantes. 23

Como aqui utilizado, o termo "ciclo-heteroalquilo" refere-se a um anel heterocíclico não aromático estável e anéis fundidos contendo um ou mais heteroátomos independentemente seleccionados de N, 0 e S. Um sistema de anéis heterociclicos fundidos pode incluir anéis carbocíclicos e precisa de incluir apenas um anel heterociclico. Exemplos de anéis heterociclicos incluem, mas não se restringem a, piperazinilo, homopiperazinilo, piperidinilo e morfolinilo, e são mostrados nos seguintes exemplos ilustrativos:

em que cada X é seleccionado de CR582, NR58, 0 e S; e cada Y é seleccionado de NR58, 0 e S; e R58 é independentemente hidrogénio, alquilo, cicloalquilo, ciclo-heteroalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalquilo ou semelhantes. Estas anéis ciclo-heteroalquilo podem estar opcionalmente substituídos com um ou mais grupos seleccionados do grupo consistindo de acilo, acilamino, aciloxilo, alcoxilo, alcoxilo substituído, alcoxicarbonilo, alcoxicarbonilamino, amino, amino substituído, aminocarbonilo, aminocarbonilamino, aminocarboniloxilo, arilo, ariloxilo, azido, carboxilo, ciano, cicloalquilo, cicloalquilo substituído, halogéneo, hidroxilo, ceto, nitro, tioalcoxilo, tioalcoxilo substituído, tioariloxilo, 24 tioceto, tiol, alquil-S(0)aril-S(O)-, alquil-S (0)2- e aril-S(0)2~. Os grupos de substituição incluem carbonilo ou tiocarbonilo os quais proporcionam, por exemplo, derivados de lactama e ureia.

Exemplos de ciclo-heteroalcenilos representativos incluem os seguintes:

em que cada X é seleccionado de CR582 , NR58, 0 e S; e cada Y é seleccionado de carbonilo, N, NR58, 0 e S; e R58 é independentemente hidrogénio, alquilo, cicloalquilo, ciclo-heteroalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalquilo ou semelhantes.

Exemplos de arilo possuindo heteroátomos contendo substituição representativos incluem os seguintes:

em que cada X é seleccionado de C-R582 , NR58, 0 e S; e cada Y é seleccionado de carbonilo, NR58, 0 e S; e R58 é independentemente hidrogénio, alquilo, cicloalquilo, ciclo- 25 heteroalquilo, arilo, heteroarilo, heteroalquilo ou semelhantes.

Alguém possuindo perícia corrente na técnica de síntese orgânica reconhecerá que o número máximo de heteroátomos num anel heterocíclico estável, quimicamente exequível, quer seja aromático ou não aromático, é determinado pelo tamanho do anel, o grau de insaturação e a valência dos heteroátomos. Em geral, um anel heterocíclico pode ter um até quatro heteroátomos desde que o anel heteroaromático seja quimicamente exequível e estável. "Farmaceuticamente aceitável" significa aprovado por uma agência regulamentadora do governo Federal ou de um estado ou listado na Farmacopeia dos E.U.A. ou em outra farmacopeia geralmente reconhecida para utilização em animais, e mais particularmente em humanos. "Sal farmaceuticamente aceitável" refere-se aos sais de adição de ácido inorgânico e orgânico, não tóxicos, e aos sais de adição de base, de compostos da presente invenção, em particular eles são farmaceuticamente aceitáveis e possuem a actividade farmacológica desejada do composto parental. Estes sais podem ser preparados in situ durante o isolamento e purificação finais de compostos úteis na presente invenção. Tais sais incluem: (1) sais de adição de ácido, preparados com ácidos inorgânicos como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e semelhantes; ou preparados com ácidos orgânicos como ácido acético, ácido propiónico, ácido hexanóico, ácido ciclopentanopropiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido láctico, ácido malónico, ácido succínico, ácido málico, ácido maleico, ácido 26 fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzóico, ácido 3-(4-hidroxibenzoil)benzóico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido 1,2-etano-disulfónico, ácido 2-hidroxietanossulfónico, ácido benzenossulfónico, ácido 4-clorobenzenossulfónico, ácido 2-naftalenossulfónico, ácido 4-toluenossulfónico, ácido canforsulfónico, ácido 4-metilbiciclo[2.2.2]-oct-2-eno-l-carboxílico, ácido gluco-heptónico, ácido 3-fenilpropiónico, ácido trimetilacético, ácido terc-butilacético, ácido laurilsulfúrico, ácido glucónico, ácido glutâmico, ácido hidroxinaftóico, ácido salicílico, ácido esteárico, ácido mucónico e semelhantes; ou (2) sais preparados quando um protão ácido presente no composto parental é substituído por um ião de metal, por exemplo, um ião de metal alcalino, um ião de metal alcalino-terroso ou um ião de alumínio; ou coordena com uma base orgânica tal como etanolamina, dietanolamina, trietanolamina, N-metilglucamina e semelhantes. Os sais incluem ainda, apenas a título de exemplo, sódio, potássio, cálcio, magnésio, amónio, tetraalquilamónio e semelhantes; e quando o composto contém uma funcionalidade básica, sais de ácidos orgânicos ou inorgânicos não tóxicos, como cloridrato, bromidrato, tartrato, mesilato, acetato, maleato, oxalato e semelhantes. 0 termo "catião farmaceuticamente aceitável" refere-se a um contra-ião catiónico aceitável, não tóxico de um grupo funcional ácido. Tais catiões são exemplificados por catiões de sódio, potássio, cálcio, magnésio, amónio, tetraalquilamónio e semelhantes. "Veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual é administrado um composto da invenção. 27 "Prevenir" ou "prevenção" refere-se a uma redução no risco de adquirir uma doença ou distúrbio (isto é, fazer com que pelo menos um dos sintomas clínicos da doença não se desenvolva num indivíduo que possa ser exposto ou tenha uma predisposição para a doença mas que ainda não a sentiu ou que ainda não apresentou sintomas da doença). "Pró-fármacos," refere-se a compostos, incluindo derivados dos compostos da invenção, os quais têm grupos dissociáveis e que se transformam por solvólise ou nas condições fisiológicas em compostos da invenção que são farmaceuticamente activos in vivo. Tais exemplos incluem, mas não se restringem a, derivados de éster de colina e semelhantes, ésteres de N-alquilmorfolina e semelhantes. "Indivíduo" inclui humanos. Os termos "humano," "doente" e "indivíduo" são aqui utilizados alternadamente. "Tratar" ou "tratamento" de qualquer doença ou distúrbio refere-se, numa forma de realização, ao melhoramento da doença ou distúrbio (isto é, paragem ou redução do desenvolvimento da doença ou pelo menos de um dos seus sintomas clínicos). Noutra forma de realização "tratar" ou "tratamento" refere-se ao melhoramento de pelo menos um parâmetro físico, que pode não ser discernível para o indivíduo. Ainda noutra forma de realização, "tratar" ou "tratamento" refere-se à modulação da doença ou distúrbio, quer fisicamente, (por exemplo, estabilização de um sintoma discernível), quer fisiologicamente, (por exemplo, estabilização de um parâmetro físico) ou ambos. Ainda noutra forma de realização, "tratar" ou "tratamento" refere-se um atraso no aparecimento da doença ou distúrbio. 28

Outros derivados dos compostos desta invenção têm actividade tanto na sua forma de ácido como nas suas formas de derivado de ácido, mas na forma sensível de ácido oferece frequentemente vantagens de solubilidade, compatibilidade com o tecido, ou libertação retardada no organismo do mamífero (ver, Bundgard, H., Design of Prodrugs, p. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985). Os pró-fármacos incluem os derivados de ácido bem conhecidos dos praticantes da técnica, como, por exemplo, ésteres preparados por reacção do ácido parental com um álcool apropriado, ou amidas preparadas por reacção do composto ácido parental com uma amina substituída ou não substituída, ou anidridos de ácido, ou anidridos mistos. Os ésteres, amidas e anidridos alifáticos ou aromáticos simples de grupos ácidos ligados aos compostos desta invenção são pró-fármacos preferidos. Nalguns casos é desejável preparar pró-fármacos de tipo éster duplo tais como ésteres de (aciloxi)alquilo ou ésteres de ((alcoxicarbonil)oxi)alquilo . São preferidos os ésteres de alquilo Ci até Cg, alcenilo C2-Cg, arilo, arilo substituído C7-C12 e arilalquilo C7-C12 dos compostos da invenção.

Como aqui utilizado, o termo "variante isotópica" refere-se a um composto que contém proporções não naturais de isótopos em um ou mais dos átomos que constituem esse composto. Por exemplo, uma "variante isotópica" de um composto pode conter um ou mais isótopos não radioactivos como, por exemplo, deutério (2H ou D), carbono-13 (13C), azoto-15 (15N) ou semelhantes. Entender-se-á que, num composto em que é feita essa substituição isotópica, os seguintes átomos, quando presentes, podem variar, pelo que por exemplo, qualquer hidrogénio pode ser 2H/D, qualquer carbono pode ser 13C ou qualquer azoto pode ser 15N, e que a 29 presença e localização de tais átomos podem ser determinadas dentro da pericia na técnica. De igual modo, a invenção pode incluir a preparação de variantes isotópicas com isótopos radioactivos, no caso em que, por exemplo, os compostos resultantes podem ser utilizados para estudos de distribuição de fármaco e/ou substrato no tecido. Os isótopos radioactivos trítio, isto é, 3H, e carbono-14, isto é, 14C, são particularmente úteis para este fim tendo em consideração a sua facilidade de incorporação e meios de detecção disponíveis. Além disso, podem ser preparados compostos que estão substituídos com isótopos emissores de positrões, como 31C, 18F, 150 e 13N, e que seriam úteis em estudos de Tomografia de Emissão de Positrões (PET) para examinar a ocupação do receptor do substrato.

Todas as variantes isotópicas dos compostos aqui proporcionadas, radioactivas ou não, estão abrangidas no âmbito da invenção.

Entender-se-á também que os compostos que têm a mesma fórmula molecular mas que diferem na natureza ou sequência de ligação dos seus átomos ou no arranjo dos seus átomos no espaço são chamados "isómeros". Os isómeros que diferem no arranjo dos seus átomos no espaço são chamados "estereoisómeros".

Os estereoisómeros que não são imagens no espelho um do outro são chamados "diastereómeros" e aqueles que são imagens no espelho não sobreponíveis um do outro são chamados "enantiómeros". Por exemplo, quando um composto tem um centro de assimetria, ele está ligado a quatro grupos diferentes, sendo possível um par de enantiómeros. Um enantiómero pode ser caracterizado pela configuração 30 absoluta do seu centro assimétrico e é descrito pelas regras de sequência R e S de Cahn e Prelog, ou pelo modo como a molécula roda o plano da luz polarizada e é designado como dextro-rotatório ou levo-rotatório (isto é, como isómeros (+) ou (-) respectivamente). Um composto quiral pode existir como um enantiómero individual ou como uma mistura destes. Uma mistura contendo proporções iguais dos enantiómeros é chamada uma "mistura racémica". "Tautómeros" refere-se a compostos que são formas intermutáveis de uma estrutura particular de um composto, e que podem variar por deslocamento de átomos de hidrogénio e electrões. Assim, duas estruturas podem estar em equilíbrio através do movimento de electrões π e de um átomo (geralmente H). Por exemplo, enóis e cetonas são tautómeros porque são rapidamente interconvertidos por tratamento com ácido ou base. Outro exemplo de tautomerismo são as formas aci- e nitro de fenilnitrometano, que são igualmente formadas por tratamento com ácido ou base.

As formas tautoméricas podem ser relevantes para se obter a reactividade química e actividade biológica óptimas de um composto de interesse.

Os compostos desta invenção podem possuir um ou mais centros de assimetria; portanto, tais compostos podem ser produzidos como estereoisómeros individuais (R) ou (S) ou como misturas destes. A menos que indicado em contrário, a descrição ou indicação de um composto particular na especificação e reivindicações destina-se a incluir tanto os enantiómeros individuais como as misturas, racémicas ou outras, destes. Os métodos para determinação da 31 estereoquímica e para separação dos estereoisómeros são bem conhecidos na técnica.

OS COMPOSTOS A presente invenção baseia-se na descoberta de que a MAPKAPK5 actua na via que resulta na expressão de MMP1, e que os inibidores de actividade da MAPKAPK5, como os compostos da presente invenção, são úteis para o tratamento de doenças envolvendo a expressão anormalmente elevada de actividade MMP.

Os compostos da presente invenção podem ser geralmente descritos como [1.2.4]triazolo[1,5-a]pirazina-8-il-aminas substituídas no grupo na posição 5 e na posição 8. A presente invenção refere-se a compostos de acordo com a fórmula III:

(111) em que R1 é H, ou alquilo substituído ou não substituído; e cada um de R8 e R9 é independentemente seleccionado de cicloalquilo substituído ou não substituído, heterocicloalquilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, heteroarilo substituído ou não substituído; ou um seu sal, solvato ou pró-fármaco 32 farmaceuticamente aceitável; e estereoisómeros, variantes isotópicas e tautómeros daqueles.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é seleccionado de ciclopentilo substituído ou não substituído, ciclo-hexilo, fenilo substituído ou não substituído, piridilo substituído ou não substituído, pirimidina substituída ou não substituída, e pirazina substituída ou não substituída, pirrole substituído ou não substituído, pirazole substituído ou não substituído e imidazole substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R1 é H, Me, Et, i-Pr ou CF3.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R1 é H.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é seleccionado de cicloalquilo substituído ou não substituído.

Noutra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é seleccionado de ciclo-hexilo ou ciclopentilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é seleccionado de heterocicloalquilo substituído ou não substituído.

Noutra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é seleccionado de piperidinilo, 33 morfolinilo ou pirrolidinilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é seleccionado de fenilo, piridilo ou pirimidina substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é seleccionado de fenilo substituído, piridilo substituído e pirimidina substituída; e a substituição é -L-R , e em que L é seleccionado de uma ligação, alquileno, heteroalquileno, -0-, -N(R8e)-, -C0-, -C02-, -S0-, -S02-, -CON (R8e) -, -S02N (R8e) -, -N (R8e) CO—, -N(R8e)S02-, -N(R8e)CON(R8e)-, N(R8e)S02 N(R8e)-; e R e seleccionado de alquilo substituído ou não substituído, cicloalquilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, heterocicloalquilo substituído ou não substituído, heteroarilo substituído ou não substituído, amino substituído ou não substituído, aralquilo substituído ou não substituído, heteroarilalquilo substituído ou não substituído e aminoalquilo substituído ou não substituído; e R8e é seleccionado de H, alquilo substituído ou não substituído e cicloalquilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é 34

8d ~ em que L e R sao como descritos no paragrafo precedente; o subscrito n é seleccionado de 1-4; e cada R8a é independentemente seleccionado de hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído, alcoxilo, ciano e halo.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e o subscrito n é 1 e R8a é Me, Et, Pr, iso-Pr, Cl, F, CN, OMe ou CF3. Noutra forma de realização, R8a está em posição 2-(orto relativamente a -L). Ainda noutra forma de realização, R8a é 2-C1, 2-F, 2-Me ou 2-CF3.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e L é uma ligação, -0-, -C0-, -C0N(R8e)-, ou -N(R8e)C0-; Q J , R e seleccionado de alquilo substituído ou não substituído, cicloalquilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, heterocicloalquilo substituído ou não substituído, heteroarilo substituído ou não substituído, aralquilo substituído ou não substituído, heteroarilalquilo substituído ou não substituído e aminoalquilo substituído ou não substituído; e R8e é seleccionado de H, alquilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e L é uma ligação, -0-, -C0-, -C0N(R8e)- ou -N(R8e)C0-; e 35 8d R e seleccionado de H, alquilaminoetilo, dialquilaminoetilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilalquilo e heteroarilalquilo.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e L é uma ligação, -0-, -C0-, -C0N(R8e)- ou -N(R8e)C0-; e R e seleccionado de metilaminoetilo, etilaminoetilo, dimetilaminoetilo, dietilaminoetilo, pirrolidinilo substituído ou não substituído, benzilo e piridilmetilo.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e L é uma ligação, -C0-, S02, -(CH2)mi-, -0(CH2)ml-, -NH (CH2) mi~ r -CON(H) (CH2)mi- ou - S02NH (CH2) mi-; o subscrito ml e seleccionado de 1-4; e R e

-N P J e em que o anel P é heterocicloalquilo substituído ou não substituído. Noutra forma de realização, L é uma ligação, -C0-, -0(CH2)mi-, -CON(H) (CH2) mi— ou - NHC0-;

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima; L é uma ligação; e o anel P é heterocicloalquilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima; L é uma ligação; e o anel P é piperidina substituída ou não substituída, 36 piperazina substituída ou não substituída, e piperidina substituída ou não substituída, morfolina.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima; L é CO; e o anel P é heterocicloalquilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima; L é CO; e o anel P é piperidina substituída ou não substituída, piperazina substituída ou não substituída, e piperidina substituída ou não substituída, morfolina.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima; L é -(CH2)mi-, -0 (CH2)mi- ou -NH (CH2) mi-; o subscrito ml é seleccionado de 1-4; e o anel P é heterocicloalquilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima; L é -(CH2)mi-, -0 (CH2)mi- ou -NH (CH2) mi-; o subscrito ml é 2 ou 3; e o anel P é piperidina substituída ou não substituída, piperazina substituída ou não substituída, e piperidina substituída ou não substituída, morfolina.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima; L é -CON(H) (CH2)miou -NHCO(GH2)mi-; o subscrito ml é seleccionado de 1-4; e o anel P é heterocicloalquilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima; L é -CON(H) (CH2)mi-; 37 o subscrito ml é 2 ou 3; e ο anel P é piperidina substituída ou não substituída, piperazina substituída ou não substituída, e piperidina substituída ou não substituída, morfolina.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, o composto é de acordo com a fórmula IVa, IVb, IVc ou IVd: <Rn. C?)

IVa <Rn tf <> J /J R9 IVb («n NVV z / X ) 0? ,vS R9 R9 IVc ou IVd (R-λ, Nv ..0 e em que L e o anel P são como descritos acima; o subscrito n, é seleccionado de 1-4; cada R8a é independentemente seleccionado de hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído, alcoxilo, ciano e halo; e R9 é independentemente seleccionado de arilo e heteroarilo substituído ou não substituído; ou um seu sal, solvato ou pró-fármaco farmaceuticamente aceitável: e estereoisómeros, variantes isotópicas e tautómeros daqueles.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas IVa-IVd, L é uma ligação.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas IVa-IVd, L é metileno, etileno, propileno e butileno. 38

Numa forma de realizaçao, no que se refere aos compostos de fórmulas IVa-IVd, L é -C0-.

Um composto de acordo com a Reivindicação 9, em que L é -C0-.

Um composto de acordo com a Reivindicação 9, em que L é -NHCO- ou -CONH-.

Um composto de acordo com a Reivindicação 9, em que L é -CON(H) -CH2-CH2- ou -N(H) -CO-CH2-CH2-.

Um composto de acordo com a Reivindicação 9, em que L é -OCH2-CH2- ou -NHCH2-CH2-.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas IVa-IVd, L é -SO2.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas IVa-IVd, L é -CON (H) -CH2-CH2- ou - S02NH-CH2-CH2-.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas IVa-IVd, L é -OCH2-CH2- ou -NHCH2-CH2-.

Numa forma de realização preferida L é uma ligação.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas IVa-IVd, o anel P é piperidina, morfolina ou piperazina substituída ou não substituída.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas IVa-IVd, L e o anel P são como descritos acima; o subscrito n é 4 e cada R8a é H. 39

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas IVa-IVd, L e o anel P são como descritos acima; o subscrito n é 1 e R8a é Me, Et, Pr, iso-Pr, Cl, F, CN, OMe ou CF3. Noutra forma de realização, R8a está em posição 2-(orto relativamente a -L). Ainda noutra forma de realização, R8a é 2-C1, 2-F, 2-Me ou 2-CF3.

Numa outra forma de realizaçao, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é

e em que o anel P é heterocicloalquilo substituído ou não substituído; o subscrito n é seleccionado de 1-4 e cada R8a é independentemente seleccionado de hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído, alcoxilo, ciano e halo.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e o anel P é piperidina, morfolina ou piperazina substituída ou não substituída.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e o subscrito n é 4 e cada R8a é H.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e o subscrito n é 1 e R8a é Me, Et, Pr, iso-Pr, Cl, F, CN, OMe ou CF3. Noutra forma de realização, R8a está em posição 2-(orto 40 relativamente a N-anel P) . Ainda noutra forma de realização, R8a é 2-C1, 2-F, 2-Me ou 2-CF3.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é

e em que o subscrito n é seleccionado de 1-4; cada R8a é independentemente seleccionado de hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído, alcoxilo, ciano e halo; R8b é hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído; R8c é hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído e o subscrito x é seleccionado de 1-8.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é 41

e em que o subscrito n é seleccionado de 1-4; cada R8a é independentemente seleccionado de hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído, alcoxilo, ciano e halo; R8b é hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído; R8c é hidrogénio ou Me.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é

e em que o subscrito n é seleccionado de 1-4; cada R8a é independentemente seleccionado de hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído, alcoxilo, ciano e halo. no que se refere aos

Numa outra forma de realizaçao, compostos de fórmula III, R8 é 42 (R8a)n

(R83)n

(R8a)n

(R8a)n

/R8b N e em que o subscrito n é seleccionado de 1-4; cada R8a é independentemente seleccionado de hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído, alcoxilo, ciano e halo; e R e hidrogénio, alquilo substituído ou nao substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e o subscrito n é 4 e cada R8a é H.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e o subscrito n é 1 e R8a é Me, Et, Pr, iso-Pr, Cl, F, CN, OMe ou CF3. Noutra forma de realização, R8a está em posição 2-(orto relativamente N-anel P). Ainda noutra forma de realização, R8a é 2-C1, 2-F, 2-Me ou 2-CF3.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e R8b é H.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e R8b é alquilo substituído ou não substituído. 43

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e R8b é cicloalquilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e R8b é Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CH2CF3, CF3, CH2CONH2, ciclopropilo ou ciclopropilmetilo.

Numa forma de realização particular, no que se refere aos compostos de fórmula III, R8 é como descrito acima e R8b é i-Pr.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas IVa-IVd, R8a é independentemente seleccionado de hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído, alcoxilo, ciano, carbamoílo, CHO e halo. Numa forma de realização, R8a é H, Me, F ou Cl. Numa forma de realização preferida R8a é H.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas IVa-IVd, o composto é de acordo com a fórmula Va, Vb, Vc, Vd, Ve ou Vf:

Va , Vb Vc 44

e em que R9 é como descrito para a fórmula III e R8b é hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realizaçao, no que se refere aos compostos de fórmulas Va-Vf, R8b é H.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas Va-Vf, R8b é alquilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas Va-Vf, R8b é cicloalquilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas Va-Vf, R8b é Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CH2CF3, CF3, CH2CONH2, ciclopropilo ou ciclopropilmetilo.

Numa forma de realização particular, no que se refere aos compostos de fórmulas Va-Vf, R e i-Pr.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas ΙΙΙ-Vf, R9 é arilo substituído ou não substituído. 45

Noutra forma de realizaçao, R9 é fenilo substituído ou nao substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas ΙΙΙ-Vf, R9 é heteroarilo substituído ou não substituído. Noutra forma de realização, R9 é piridilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas ΙΙΙ-Vf, R9 é seleccionado de fenilo, indolilo, isoinolilo, pirrolilo, furanilo, tienilo, pirazolilo, oxazolilo e tiazolilo substituído ou não substituído.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas ΙΙΙ-Vf, R9 é

e cada um de A1, A2 e A3 é independentemente seleccionado de S, 0, N, NR9a e CR9a; cada um de R9a é independentemente H ou alquilo substituído ou não substituído; e R9b é C0NH2, CONHMe ou CN.

Noutra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas ΙΙΙ-Vf, R9 é 46

Noutra forma de realizaçao, no que se refere aos compostos de fórmulas ΙΙΙ-Vf, R9 é

Noutra forma de realizaçao, no que se refere aos compostos de fórmulas ΙΙΙ-Vf, R9 é

e em que o subscrito m é seleccionado de 1-4 e cada R9d é independentemente H, alquilo substituído ou não substituído ou halo. 47

Noutra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas ΙΙΙ-Vf, R9 é

e em que o subscrito m é seleccionado de 1-4 e cada R9d é independentemente H, alquilo substituído ou não substituído ou halo.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas ΙΙΙ-Vf, R9 é

e em que o subscrito m é seleccionado de 1-3 e cada R9d é independentemente H, alquilo substituído ou não substituído ou halo.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas ΙΙΙ-Vf, R9 é como descrito acima; e cada R9d é H. 48

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas ΙΙΙ-Vf, R9 é como descrito acima; m é 1 ou 2 e cada R9d é independentemente Me, Cl ou F.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, o composto é de acordo com a fórmula Via, VIb, VIc, VId, VIe ou Vlf:

e R8b é hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos

Rh compostos de formulas VIa-VIf, R e H.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas VIa-VIf, R8b é cicloalquilo. 49

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas VIa-VIf, R8b é ciclopropilo.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas VIa-VIf, R8b é alquilo substituído ou não substituído.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas VIa-VIf, R8b é Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CF3, CH2CF3, CH2CONH2 ou ciclopropilmetilo.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, o composto é de acordo com a fórmula Vila, Vllb, VIIc, VIIc, Vlld, VIIe ou Vllf:

50 e R8b é hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído.

Numa outra forma de realizaçao, no que se refere aos compostos de fórmulas VlIa-VIId, R8b é H.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas VlIa-VIIf, R8b é cicloalquilo.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas VlIa-VIIf, R8b é ciclopropilo.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas VlIa-VIIf, R8b é alquilo substituído ou não substituído.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas VlIa-VIIf, R8b é Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CF3, CH2CF3, CH2CONH2 ou ciclopropilmetilo.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, o composto é de acordo com a fórmula VlIIa, VlIIb, VIIIc, VlIId, VHIe ou VlIIf:

Vlllb

VIIIc 51

e R8b é hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas VlIIa-VIIIf, R8b é H.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas VlIIa-VIIIf, R8b é cicloalquilo.

Numa outra forma de realizaçao, no que se refere aos compostos de fórmulas VlIIa-VIIIf, R8b é ciclopropilo.

Numa outra forma de realizaçao, no que se refere aos compostos de fórmulas VlIIa-VIIIf, R e alquilo substituído ou não substituído.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas VlIIa-VIIIf, R8b é Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CF3, CH2CF3, CH2CONH2 ou ciclopropilmetilo.

Numa forma de realizaçao, no que se refere aos compostos de fórmula III, o composto é de acordo com a fórmula IXa, IXb, IXc, IXd, IXe ou IXf: 52

Rh ~ e R e hidrogénio, alquilo substituído ou nao substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído.

Numa outra forma de realizaçao, no que se refere aos

Rh compostos de formulas IXa-IXf, R e H.

Numa outra forma de compostos de fórmulas realização, no que se refere IXa-IXf, R8b é cicloalquilo. aos

Numa outra forma de realizaçao, no que se refere aos

Rh compostos de formulas IXa-IXf, R e ciclopropilo. 53

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas IXa-IXf, R8b é alquilo substituído ou não substituído.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas IXa-IXf, R8b é Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CF3, CH2CF3, CH2CONH2 ou ciclopropilmetilo.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, o composto é de acordo com a fórmula Xa, Xb, Xc, Xd, Xe ou Xf

ο κ e R e hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído. 54

Numa outra forma de realizaçao, no que se refere aos compostos de fórmulas Xa-Xf, R8b é H.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas Xa-Xf, R8b é cicloalquilo.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas Xa-Xf, R8b é ciclopropilo.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas Xa-Xf, R8b é alquilo substituído ou não substituído.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas Xa-Xf, R8b é Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CF3, CH2CF3, CH2CONH2 ou ciclopropilmetilo.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, o composto é de acordo com a fórmula Xla, Xlb, XIc, Xld, Xle ou Xlf:

55

e R8b é hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído; e R9e é hidrogénio, Me ou CN.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas Xla-XIf, R9e é H.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas Xla-XIf, R9e é Me.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas Xla-XIf, R9e é CN.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas Xla-XIf, R e H.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas Xla-XIf, R8b é cicloalquilo.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmulas Xla-XIf, R8b é ciclopropilo. 56

Numa outra forma de realizaçao, no que se refere aos ο κ compostos de formulas Xla-XIf, R e alquilo substituído ou não substituído.

Numa outra forma de realização, no que se refere aos ou compostos de formulas Xla-XIf, R e Me, Et, Pr, ι-Pr, t-Bu, i-Bu, CF3, CH2CF3, CH2CONH2 ou ciclopropilmetilo.

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, o composto é de acordo com a fórmula Xlla, Xllb, XIIc ou XIId:

Numa forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, o composto é de acordo com a fórmula XlIIa, XlIIb, XIIIc ou XIIId:

XII la XI11 b XIIIc ou XI lld 57

Numa forma de realização, no que se refere fórmula III, o composto é de acordo com XlVb, XIVc ou XlVd 57 aos compostos de a fórmula XlVa,

XlVd

Numa forma de realização, no que se refere fórmula III, o composto é de acordo com a ou XVc: aos compostos de fórmula XVa, XVb

58 e R8b é H, Me, i-Pr, t-Bu, CH2CONH2, ciclopropilmetilo ou CH2CF3.

Numa forma de realização particular, no que se refere aos compostos de fórmulas XVa-XVc, L é uma ligação. Noutra forma de realização particular, L é -0-CH2-CH2-.

Numa forma de realização particular, no que se refere aos compostos de fórmulas XVa-XVc, o anel P é

Me ou o

Numa forma de realizaçao mais particular, no que se refere aos compostos de fórmulas XVa-XVc, o anel P é ,Me ou

Noutra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, o composto é seleccionado do Quadro 1.

Noutra forma de realização, no que se refere aos compostos de fórmula III, o composto é seleccionado do Quadro 2.

Em determinados pró-fármacos e fórmulas acima, da invenção, dissociáveis e aspectos, o presente pedido também divulga derivados dos compostos de acordo com as Os pró-fármacos são derivados dos compostos os quais têm grupos metabolicamente que se convertem, por solvólise ou em 59 condições fisiológicas, nos compostos da invenção, os quais são farmaceuticamente activos, in vivo. Um pró-fármaco pode ser inactivo quando administrado a um indivíduo mas é convertido in vivo num composto activo da invenção. "Pró-fármacos farmaceuticamente aceitáveis" como aqui utilizado refere-se àqueles pró-fármacos dos compostos úteis na presente invenção, os quais são, no âmbito de uma opinião médica sólida, adequados para serem utilizados em contacto com os tecidos de doentes sem toxicidade, irritação, resposta alérgica inadequadas em proporção com a razão benefício/risco, e eficazes para a utilização pretendida dos compostos da invenção. 0 termo "pró-fármaco" significa um composto que é transformado in vivo para produzir um composto eficaz útil na presente invenção ou um seu sal, hidrato ou solvato farmaceuticamente aceitável. A transformação pode ocorrer por vários mecanismos, como através de hidrólise no sangue. Os compostos portadores de grupos metabolicamente dissociáveis têm a vantagem de poderem exibir uma melhor biodisponibilidade em consequência de uma melhor solubilidade e/ou taxa de absorção concedidas ao composto parental em virtude da presença do grupo metabolicamente dissociável, assim, estes compostos actuam como pró-fármacos. Uma discussão extensa é proporcionada em Design of Prodrugs, H. Bundgaard, ed., Elsevier (1985); Methods in Enzymology; K. Widder et al, Ed., Academic Press, 42, 309-396 (1985); A Textbook of Drug Design and Development, Krogsgaard-Larsen e H. Bandaged, ed., Capítulo 5; "Design and Applications of Prodrugs" 113-191 (1991); Advanced Drug Delivery Reviews, H. Bundgard, 8, 1-38, (1992); J. Pharm. Sei., 77,285 (1988); Chem. Pharm. Buli., N. Nakeya et al, 32, 692 (1984); Pro-drugs as Novel Delivery Systems, T. Higuchi e V. Stella, 14 A.C.S. Symposium Series, and Bioreversible Carriers in Drug 60

Design, E.B. Roche, ed., American Pharmaceutical Association e Pergamon Press, 1987, os quais são aqui incorporados por referência. Tais exemplos incluem, mas não se restringem a, derivados de éster de colina e semelhantes, ésteres de N-alquilmorfolina e semelhantes.

Outros derivados dos compostos desta invenção têm actividade nas suas formas de ácido e de derivado de ácido, mas a forma sensível de ácido oferece frequentemente vantagens de solubilidade, compatibilidade com tecido ou libertação retardada no organismo do mamífero (ver, Bundgard, H., Design of Prodrugs, p. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam 1985). Os pró-fármacos incluem os derivados de ácido bem conhecidos dos praticantes da técnica, como, por exemplo, os ésteres preparados por reacção do ácido parental com um álcool adequado ou as amidas preparadas por reacção do composto ácido parental com uma amina substituída ou não substituída, ou anidridos ácidos ou anidridos mistos. Os ésteres, amidas e anidridos alifáticos ou aromáticos simples derivados de grupops ácidos presentes nos compostos desta invenção são pró-fármacos preferidos. Nalguns casos é desejável preparar pró-fármacos do tipo ésteres duplos como ésteres de (aciloxi)alquilo ou ésteres de ((alcoxicarbonil)oxi)alquilo. São preferidos os ésteres de alquilo Ci até Cs, alcenilo C2-C8, arilo, arilo substituído C7-C12 e arilalquilo C7-C12 dos compostos da invenção.

COMPOSIÇÕES FARMACÊUTICAS

Quando utilizados como fármacos, os compostos desta invenção são tipicamente administrados na forma de uma composição farmacêutica. Tais composições podem ser 61 preparadas de um modo bem conhecido na técnica farmacêutica e compreendem pelo menos um composto activo.

Duma maneira geral, os compostos desta invenção são administrados numa quantidade farmaceuticamente eficaz. A quantidade de composto na realidade administrada será tipicamente determinada por um médico, à luz das circunstâncias relevantes, incluindo a condição a ser tratada, a via de administração escolhida, o composto efectivamente utilizado, a idade, peso e resposta do doente individual, a gravidade dos sintomas do doente e semelhantes.

As composições farmacêuticas desta invenção podem ser administradas por uma diversidade de vias incluindo oral, rectal, transdérmica, subcutânea, intravenosa, intramuscular e intranasal. Dependendo da via de administração pretendida, os compostos desta invenção são preferencialmente formulados como composições injectáveis ou orais ou como unguentos, como loções ou como adesivos todos para administração transdérmica.

As composições para administração oral podem tomar a forma de soluções ou suspensões liquidas a granel, ou pós a granel. No entanto, mais geralmente, as composições são apresentadas em formas de dosagem unitária para facilitar o doseamento exacto. 0 termo "formas de dosagem unitária" refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para indivíduos humanos e outros mamíferos, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de material activo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com um excipiente farmacêutico adequado. As formas de dosagem 62 unitária típicas incluem ampolas ou seringas pré-cheias, pré-medidas das composições líquidas ou pílulas, comprimidos, cápsulas ou semelhantes no caso de composições sólidas. Nestas composições, o composto ácido furanossulfónico é geralmente um componente menor (de cerca de 0,1 até cerca de 50% em massa ou preferencialmente de cerca de 1 até cerca de 40% em massa) sendo o restante vários veículos ou portadores e auxiliares de processamento úteis para preparar a forma de dosagem pretendida.

As formas líquidas adequadas para administração oral podem incluir um veículo aquoso ou não aquoso adequado com tampões, agentes de suspensão e dispersantes, corantes, aromas e semelhantes. As formas sólidas podem incluir, por exemplo, qualquer um dos ingredientes seguintes, ou compostos de uma natureza semelhante: um aglutinante como celulose microcristalina, goma de tragacanta ou gelatina; um excipiente como amido ou lactose, um desintegrante como ácido algínico, Primogel ou amido de milho; um lubrificante como estearato de magnésio; um deslizante como dióxido de silício coloidal; um edulcorante como sacarose ou sacarina; ou um aromatizante como hortelã-pimenta, salicilato de metilo ou aroma de laranja.

As composições injectáveis baseiam-se tipicamente em soro fisiológico estéril injectável ou soro fisiológico tamponado com fosfato ou outros portadores injectáveis conhecidos na técnica. Como atrás, o composto activo nestas composições é tipicamente um componente menor, sendo frequentemente de cerca de 0,05 até 10% em massa como o remanescente o veículo injectável e semelhantes. 63

As composições transdérmicas são tipicamente formuladas como uma pomada ou creme tópico contendo o(s) ingrediente(s) activo(s), duma maneira geral numa guantidade gue vai de cerca de 0,01 até cerca de 20% em massa, preferencialmente de cerca de 0,1 até cerca de 20% em massa, preferencialmente de cerca de 0,1 até cerca de 10% em massa, e mais preferencialmente de cerca de 0,5 até cerca de 15% em massa. Quando formulados como uma pomada, os ingredientes activos serão tipicamente combinados com uma base parafínica ou miscível com água para pomadas. Alternativamente, os ingredientes activos podem ser formulados num creme com, por exemplo uma base de óleo-em-água para creme. Tais formulações transdérmicas são bem conhecidas na técnica e incluem, duma maneira geral, ingredientes adicionais para melhorar a penetração dérmica ou estabilidade dos ingredientes activos ou da formulação. Todas essas formulações e ingredientes transdérmicos estão incluídos no âmbito desta invenção.

Os compostos desta invenção também podem ser administrados por um dispositivo transdérmico. Assim sendo, a administração transdérmica pode ser efectuada utilizando um adesivo de tipo reservatório ou de tipo membrana porosa, ou de uma diversidade de matrizes sólidas.

Os componentes descritos acima para composições administráveis por via oral, injectáveis ou administráveis por via tópica são apenas representativos. Outros materiais e técnicas de processamento e semelhantes são explicitados na Parte 8 de Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, 1985, Mack Publishing Company, Easton, Pennsilvania, o qual é aqui incorporado por referência. 64

Os compostos desta invenção também podem ser administrados em formas de libertação prolongada ou a partir de sistemas de administração farmacológicos de libertação prolongada. Uma descrição de materiais de libertação prolongada representativos pode ser encontrada em Remington's Pharmaceutical Sciences.

Os seguintes exemplos de formulação ilustram composições farmacêuticas representativas desta invenção. No entanto, a presente invenção não se restringe às seguintes composições farmacêuticas.

Formulação 1 - Comprimidos

Um composto da invenção é misturado como um pó seco com um aglutinante de gelatina seca numa proporção em massa aproximada de 1:2. É adicionada uma quantidade pequena de estearato de magnésio como um lubrificante. A mistura é transformada em comprimidos com 240-270 mg (80-90 mg de composto amida activo por comprimido) numa prensa de comprimidos.

Formulação 2 - Cápsulas

Um composto da invenção é misturado como um pó seco com um diluente de amido numa proporção em massa aproximada de 1:1. A mistura é empacotada em cápsulas de 250 mg (125 mg de composto amida activo por cápsula).

Formulação 3 - Liquido

Um composto da invenção (125 mg), sacarose (1,75 g) e goma de xantana (4 mg) são misturados, feitos passar através de 65 um peneiro de malha N° 10 U.S., e em seguida misturados com uma solução previamente preparada de celulose microcristalina e carboximetilcelulose sódica (11:89, 50 mg) em água. Benzoato de sódio (10 mg), aroma e corante são diluídos com água e adicionados sob agitação. Em seguida é adicionada água suficiente para produzir um volume total de 5 mL.

Formulação 4 - Comprimidos

Um composto da invenção é misturado como um pó seco com um aglutinante de gelatina seca numa proporção em massa aproximada de 1:2. É adicionada uma quantidade pequena de estearato de magnésio como um lubrificante. A mistura é transformada em comprimidos com 450-900 mg (150-300 mg de composto amida activo) numa prensa de comprimidos.

Formulação 5 - Injecção

Um composto da invenção é dissolvido ou suspenso num meio aquoso injectável de soro fisiológico estéril tamponado até uma concentração de aproximadamente 5 mg/mL.

Formulação 6 - Tópica Álcool estearílico (250 g) e uma vaselina branca (250 g) são fundidos a cerca de 75°C e em seguida é adicionada uma mistura de um composto da invenção (50 g) metilparabeno (0,25 g) , propilparabeno (0,15 g) , laurilsulfato de sódio (10 g) e propileno glicol (120 g) dissolvidos em água (cerca de 370 g) e a mistura resultante é agitada até coagular. 66

MÉTODOS DE TRATAMENTO

Os actuais compostos são utilizados como agentes terapêuticos para o tratamento de patologias em mamíferos que estão causalmente relacionadas ou são atribuíveis a actividade aberrante de MMP1 e / ou MAPKAPK5. Por conseguinte, os compostos e composições farmacêuticas desta invenção encontram aplicação como agentes terapêuticos para prevenir e/ou tratar doenças inflamatórias em mamíferos incluindo humanos.

Esta invenção também se refere à utilização dos actuais compostos no fabrico de um medicamento para tratamento ou profilaxia de uma patologia prevenida, melhorada ou eliminada pela administração de um inibidor de Proteína Cinase 5 Activada por Proteína Cinase Activada por Mitogénio, ou uma patologia caracterizada por actividade anormal da colagenase, ou uma patologia associada a degradação de ECM ou uma patologia seleccionada de doenças envolvendo inflamação, muito preferencialmente para o tratamento de artrite reumatóide.

Como um outro aspecto da invenção são proporcionados os actuais compostos para serem utilizados como fármacos especialmente no tratamento ou prevenção das seguintes condições: uma patologia associada a degradação da matriz extracelular (ECM), em particular artrite, e mais particularmente, artrite reumatóide; uma patologia associada a uma expressão celular anormal de MMP1; uma patologia caracterizada por actividade anormal de metaloproteinases da matriz; 67 doenças e distúrbios os quais são mediados por ou resultam em inflamação como, por exemplo artrite reumatóide e osteoartrite, enfarte do miocárdio, várias doenças e distúrbios autoimunes, uveite e aterosclerose; irritação na pele / prurido como, por exemplo psoríase; e distúrbios renais; uma patologia caracterizada por actividade anormal da colagenase, ou uma patologia associada a degradação de ECM ou uma patologia seleccionada de doenças envolvendo inflamação, muito preferencialmente para o tratamento de artrite reumatóide.

Também é aqui proporcionada a utilização dos actuais compostos no fabrico de um medicamento para o tratamento ou prevenção de uma das patologias e doenças supramencionadas. É descrito um método o qual compreende a administração a um indivíduo que sofre de uma condição patológica caracterizada por inflamação, com uma quantidade eficaz para inibir a metaloprotease da matriz de um composto da presente invenção durante um período de tempo suficiente para reduzir os níveis anormais de degradação de matriz extracelular no doente, e preferencialmente terminar, os processos auto-sustentados responsáveis pela referida degradação. Uma forma de realização especial do método compreende a administração de uma quantidade eficaz para inibir a metaloprotease da matriz de um composto da presente invenção a um doente que sofre ou está susceptível ao desenvolvimento de artrite reumatóide, durante um período de tempo suficiente para reduzir ou prevenir, respectivamente, a degradação de colagénio e osso nas articulações do referido doente, e preferencialmente 68 terminar, os processos auto-sustentados responsáveis pela referida degradação.

Os níveis de dose de injecção variam de cerca de 0,1 mg/kg/hora até pelo menos 10 mg/kg/hora, todos durante cerca de 1 até cerca de 120 horas e especialmente 24 até 96 horas. Também se pode administrar um "bolus" de pré-carga de cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 10 mg/kg ou mais para se alcançar níveis de estado estacionário adequados. Não é expectável que a dose total máxima exceda cerca de 2 g/dia para um doente humano de 40 até 80 kg.

Para a prevenção e/ou tratamento de patologias a longo prazo, tais como patologias inflamatórias e autoimunes, o regime de tratamento estende-se geralmente ao longo de muitos meses ou anos, sendo por conseguinte preferida a administração para conveniência e tolerância pelo doente. Com administração oral, um até cinco e especialmente dois até quatro e tipicamente três doses orais por dia são regimes representativos. Utilizando estes padrões de administração, cada dose proporciona de cerca de 0,01 até cerca de 20 mg/kg do composto da invenção, em que as doses preferidas proporcionam cada uma cerca de 0,1 até cerca de 10 mg/kg e especialmente cerca de 1 até cerca de 5 mg/kg.

As doses transdérmicas são duma maneira geral seleccionadas para proporcionar níveis no sangue semelhantes ou menores do que os alcançados utilizando doses injectáveis.

Quando utilizados para prevenir o aparecimento de uma patologia inflamatória, os compostos desta invenção serão administrados a um doente em risco de desenvolver a patologia, tipicamente no dispositivo e sob a supervisão de 69 um médico, aos níveis de dosagem descritos acima. Os doentes em risco de desenvolver uma patologia particular incluem, duma maneira geral, aqueles que têm um passado familiar da patologia, ou aqueles que foram identificados em testes genéticos ou rastreios como sendo particularmente susceptíveis ao desenvolvimento da patologia.

Os compostos desta invenção podem ser administrados como único agente activo ou eles podem ser administrados em associação com outros agentes, incluindo outros compostos que apresentam a mesma actividade terapêutica ou actividades semelhantes, e que são considerados seguros e eficazes para essa administração associada.

PROCEDIMENTOS GERAIS DE SÍNTESE

Os compostos de triazolo[1,5-a]piridilo desta invenção podem ser preparados a partir de materiais de partida prontamente disponíveis utilizando os seguintes métodos e procedimentos gerais. Entender-se-á que quando são fornecidas condições de processo (isto é, temperaturas de reacção, tempos, proporções molares de reagentes, solventes, pressões, etc.) típicas ou preferidas; também podem ser utilizadas outras condições de processo a menos que indicado de outro modo. As condições óptimas de reacção podem variar com os reagentes ou solventes particulares utilizados, mas tais condições podem ser determinadas por um especialista na técnica através de procedimentos de optimização de rotina.

Além disso, como técnica, podem convencionais para impedir será evidente para os especialistas na ser necessários grupos de protecção que determinados grupos 70 funcionais sofram reacções indesejadas. A escolha de um grupo de protecção adequado para um grupo funcional particular e as condições adequadas para protecção e desprotecção são bem conhecidas na técnica. Por exemplo, um grande número de grupos de protecção, e a sua introdução e remoção, são descritos em T. W. Greene e P. G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, Second Edition, Wiley, Nova Iorque, 1991, e referências ali citadas.

Os seguintes métodos são apresentados com detalhes no que se refere à preparação de biciclo-heteroarilos representativos que foram listados acima. Os compostos da invenção podem ser preparados de materiais de partida e reagentes conhecidos ou comercialmente disponíveis por um especialista na técnica de síntese orgânica.

Via geral de sintese

Br

N [I ,NH,

N

Br ^N^OMe OMe

EtOH

NH2OH.HCI MeOH

Br PPA, 7<rc 2h

R9 44- O. ,0 B R9

HN R8 h2n-r8

Br

DMF, H20, NaOf-Bu Pd(PPh3)4, 90DC /'-Pr2NEt, /-PrOH, refluxo

Br

Br

Geral 71

Todos os reagentes foram de tipo comercial e foram utilizados conforme recebidos sem mais purificação, a menos que indicado de outro modo. Foram utilizados solventes anidros comercialmente disponíveis nas reacções realizadas sob atmosfera inerte. Em todos os outros casos foram utilizados solventes de tipo reagente, a menos que especificado de outro modo. A cromatografia em coluna foi realizada sobre silica gel 60 (35-70 pm). A cromatografia em camada fina foi realizada utilizando placas pré-revestidas com silica gel F-254 (espessura 0,25 mm) . Os espectros de RMN de ΧΗ foram registados num espectrómetro Bruker DPX 400 NMR (400 MHz). Os desvios químicos (δ) para os espectros de RMN de ΧΗ são indicados em partes por milhão (ppm) em relação ao tetrametilsilano (δ 0,00) ou ao pico apropriado do solvente residual, isto é, CHCI3 (δ 7,27), como referência interna. As multiplicidades são dadas como singleto (s), dupleto (d), tripleto (t), quarteto (q) , multipleto (m) e largo (1) . As constantes de acoplamento (J) são dadas em Hz. Os espectros de MS de electropulverização foram obtidos num espectrómetro LC/MS Micromass platform. Coluna utilizada em todos os ensaios de LCMS: Waters Acquity UPLC BEH C18 l,7pm, 2,lmm ID x 50mm L (Referência 186002350)). HPLC preparativa: Waters XBridge Prep C18 5pm ODB 19mm ID x lOOmm L (Referência 186002978). Todos os métodos utilizam gradientes de MeCN/H20. A H20 contém 0,1 % de TFA ou 0,1 % de NH3. Sínteses Representativas de Compostos da Invenção

Composto 1: (4-Morfolin-4-ilfenil)-[5-(lH-pirazol4-il)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]amina 72 72 Passo 1: Ν' - (3, 6-Dibromo-pirazin-2-il)-N, N- dimetilformamidina N. .Br Bi"

N

Uma mistura de 3,6-dibromo-pirazin-2-ilamina (15,37 g, 60, 80 mmol) e dimetilacetal de N,N-dimetilformamida (10,1 mL, 76,00 mmol), suspendida em etanol (150 mL), é aquecida a refluxo durante 2 horas. A mistura reaccional é evaporada in vacuo proporcionando o composto em epigrafe (18,6 g) . RMN de 1H (400MHz, CDC13) δ (ppm) 3,20 (s, 3H) , 3,21 (s, 3H), 7,93 (s, 1H), 8,48 (s, 1H). LCMS: Tr 3,81 min (99,1%), m/z (APCI) 307 (M+H)+ .

Passo 2: N-(3, 6~Dibromo-pirazin-2-il)-N'-hidroxiformamidina

N

OH A uma solução de N-(3,6-dibromo-piraz in-2-il)-N,N- dimetilformamidina (18,6 g, 60,80 mmol) em metanol (200 mL) é adicionado cloridrato de hidroxilamina (5,91 g, 85,12 mmol) numa porção. A reacção é agitada à temperatura ambiente durante 16 horas. O solvente é evaporado e o residuo sólido é tratado com água fria (arrefecimento com gelo) e recolhido por filtração. O precipitado é lavado duas vezes com água e éter de petróleo e seco in vacuo 73 produzindo o composto em epígrafe (17,45 g) como um sólido branco. RMN de ΧΗ (400MHz, d6-DMSO) δ (ppm) 7,82 (1H, s 1), 8,21 (1H, s), 8,34 (1H, m), 11,17 (1H, s 1). LCMS: Tr 3,17 min (98,7 %), m/z (APCI) 295 (M+H)+.

Passo 3: 5, 8-Dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina

Br

Br

N >

N N- (3,6-dibromo-pirazin-2-il)-N' -hidroxiformamidina (17,4 mg, 58,80 mmol) é tratada com ácido polifosfórico (150 g) durante uma hora a 50°C e em seguida durante 1,75 horas a 70 °C. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, é adicionada água à mistura reaccional. A suspensão resultante é trazida até pH 8 pela adição cuidadosa de NaHCCh sólido em pequenas porções. O precipitado formado é recolhido por filtração, lavado uma vez com NaOH IN, três vezes com água e seco in vacuo. O resíduo é partilhado entre acetato de etilo e NaOH IN e a fase orgânica é lavada mais uma vez com NaOH IN e uma vez com solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A fase orgânica é seca sobre MgS04, filtrada e evaporada para dar o composto em epígrafe (10,15 g) como um sólido branco. RMN de 1H (400MHz, d6~ DMSO) δ(ppm) 8,43 (s, 1H), 8,92 (s, 1H). LCMS: Tr 2,73 min (94,2 %), m/z (APCI) 277 (M+H)+.

Passo 4: (5-Bromo-[1,2, 4]triazolo[1, 5-a]pirazin-8-il)-(4- morfolin-4-ilfenil)amina 74

Br

Uma mistura de 5,8-dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina (123 mg, 443 pmol), 4-(4-morfolino) anilina (118 mg, 0,664 mmol) e IV-etildiisopropilamina (116 mL, 0,664mmol) é aquecida a refluxo em 2-propanol (3 mL) durante 4,5 horas. A mistura reaccional é evaporada até à secura e o resíduo partilhado entre diclorometano e ácido cítrico (10 %). A fase orgânica é lavada uma vez com água e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca sobre MgS04, filtrada e evaporada para fornecer o composto em epígrafe (156 mg, 94 %) como um sólido amarelo. RMN de ΧΗ (400MHz, d6-DMSO) δ (ppm) 3,11 (m, 4H) , 3,78 (m, 4H) , 6,97 (d, 2H) , 7,82 (d, 2H) , 7,87 (s, 1H), 8,71 (s, 1H) , 9,93 (s 1, 1H) . LCMS, Tr 3,32 min (96,8 %) m/z (APCI) 375 (M+H)+.

Passo 5: (4-Morfolin-4-ilfenil)-[5-(lH-pirazol-4-il)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]amina

o N-N H 75

Uma suspensão de (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-ilfenil)amina (220 mg, 0,586 mmol), 4-(4,4,5,5-tetratmetil-l,3,2-dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole (171 mg, 0, 879 mmol), Pd(PPh3)4 (68 mg, 59 pmol) e NaOtBu (225 mg, 2,34 mmol) em 4 mL de DMF/água (3:1) é desarejada durante 5 min num tubo selado. A mistura reaccional é aquecida no tubo selado a 90°C dum dia para o outro. Após evaporação dos solventes, o resíduo é recolhido por filtração, lavado com água (3x) e éter (2x) e seco in vacuo. O produto em bruto é purificado por cromatografia em coluna (sílica gel, DCM/MeOH 96:4) produzindo o composto em epígrafe (76 mg, 36 %) como um sólido amarelo. RMN de ΤΗ (400MHz, de-DMSO) δ (ppm) 3,11 (4H, m) , 3,79 (4H, m) , 6,98 (2H, d), 7,90 (2H, d), 8,17 (1H, s), 8,35 (1H, s 1), 8,64 (1H, s 1), 8,75 (1H, s), 9,73 (1H, s 1). LCMS: Tr 2,68 min (97,7 %) m/z (APCI) 363 (M+H)+.

Composto 4: 4-(8-(4-(4-metilpiperazin-l-il)fenilamino)- [1,2,4]triazolo[1,5a]pirazin-5-il)piridin-2(1H)-ona

Passo 1: [5- (2-Metoxi-piridin-4-il)-[1,2, 4]triazolo[1, 5- a]pirazin-8-il]-[4 - (4-metil-piperazin-l-il)-fenil]-amina

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4 utilizando (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-metil-piperazin- 76 1-il)-fenil]-amina (80mg, 0,206mmol), ácido 2- metoxipiridina-4-borónico (63mg, 0,412mmol), Pd(PPh3)4 (0,052mmol) e Na2C03 1,5N (l,lmL, l,65mmol) em DMF/dioxano 2:1 (2,2mL) . 0 produto em bruto é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel utilizando DCM:NH3 96:4 (7M em MeOH) e as fracções contendo o produto desejado são combinadas e evaporadas para proporcionar o composto em epígrafe (40mg, 47%). HPLC (254nm): Tr 2,26min (65%).

Passo 2: 4-(8- (4-(4-Metilpiperazin-l-il)fenilamino)- [1,2, 4] triazolo [1, 5a]pirazin-5-il)piridin-2 (1H) -ona

H

Uma solução de [5-(2-metoxi-piridin-4-il)- [1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-[4-(4-metil-piperazin-1-il)-fenil]-amina (40mg, 0,096mmol) e cloridrato de piridina (55mg, 0,48mmol) em água (lmL) é agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. 0 solvente é removido in vacuo e o resíduo é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM:NH3 (7M em MeOH) 96:4. É isolado o composto em epígrafe (23mg, 60%). llmg (0,0273mmol) do composto de base livre são dissolvidos na quantidade mínima de MeOH/DCM, (aquecido a refluxo para dissolver) e é adicionado ácido metanossulfónico 0,1 M (0,273mL) em MeOH. Após evaporação do solvente, o resíduo é triturado várias vezes com uma mistura de acetato de etilo-éter dietílico 1:1 e DCM-éter dietílico, filtrado e seco in 77 vacuo para proporcionar o composto alvo como um sal de mesilato (13mg, 99%). RMN de XH (400MHz, d6-DMSO) δ(ppm) 2, 21 (3H , s) , 2, 91 (3H, , s, MsOH) . 3, 00 (2H, t) , 3,18- -3, 26 (2H, m) , 3,58 (2H, d) , 3,90 (2H , d) r 6, 83 (1H, s) , 7, 07 (2H, d) , 7, 25 (1H, s) . 7,53 (1H , d) r 7, 93 (2H, d) , 8, 14 (1H, s) , 8, 76 (1H, s) , 9,69 (1H, s 1) r 10,21 (1H, s) , 13 ,3 (1H, s 1) . LCMS: Tr 1,71 min (97, 5% ) , m/ z (APCI) 403 (M+H)+.

Composto 6: Amida do ácido 4-{8-[4-(4-metil-piperazin-l-il)fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-tiofeno-2-carboxílico

Passo 1: (5-Bromo[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-metil-piperazin-l-il) -fenil] -ainina

Br

Uma mistura de 5,8-dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina (2 g, 7,20 mmol), 4-(4-metil-piperazin-l-il)-fenilamina (1,65 g, 8,64 mmol) e iv-etildiisopropil-amina (1,5 mL, 8,64 mmol) é aquecida a 80°C em 2-propanol (50 mL) durante 8 horas. A mistura reaccional é evaporada até à secura e o resíduo partilhado entre diclorometano e água. A fase aquosa é extraída duas vezes com diclorometano. As camadas orgânicas são lavadas com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secas sobre MgS04, filtradas e evaporadas para fornecer o composto em epígrafe (1,41 g) como um sólido cinzento. RMN de 1R (400MHz, d6-DMSO) δ(ppm) 2,27 78 (3H, s), 2,54 (4H, m) , 3,14 (4H, m) , 6, 97 (2H, d), 7,80 (2H, d), 7,87 (1H, s) , 8,72 (1H, s), 9,92 (1H, s 1) . LCMS:

Tr 2,07 min (77,4 %), m/z (APCI) 388 (M+H)+.

Passo 2: Amida do ácido 4-bromo-tiofeno-2-carboxílico

Br.

Uma solução de ácido 4-bromo-tiofeno-2-carboxílico (2,0g, 9,66mmol), cloridrato de l-etil-3-(3'- dimetilaminopropil)carbodiimida (2,04g, 10,63mmol) e hidrato de 1-hidroxibenzotriazole (l,44g, 10,63mmol) em DMF (20mL) é agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura reaccional é então arrefecida até 0°C e é adicionado NH3 aq. (lmL, 17,3mmol). A mistura é agitada à temperatura ambiente durante mais 5 horas, em seguida é adicionada água à mistura reaccional e o precipitado resultante é recolhido por filtração e lavado com NaOH 1M, H2O e éter de petróleo. O composto em epígrafe é isolado como um sólido branco (l,56g, 78%).

Passo 3: Amida do ácido 4- (4, 4,5,5-tetrametil- [1,3,2]dioxaborolan-2-il)-tiofeno-2-carboxílico 79

Amida do ácido 4-bromo-tiofeno-2-carboxílico (l,3g, 6,34mmol), bis(pinacolato)diboro (3,22g, 12,7mmol),

PdCl2dppf (0,26g, 0,318mol) e KOAc (l,87g, 19,10mmol) são suspendidos em dioxano (20mL), purgados com azoto durante 5 minutos e em seguida aquecidos a 90°C dum dia para o outro. O solvente é removido in vacuo e o resíduo partilhado entre acetato de etilo e água. A camada aquosa é extraída três vezes com acetato de etilo e as fases orgânicas combinadas são lavadas com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, filtradas através de MgS04 e evaporadas. O produto em epígrafe é cristalizado de AcOEt-éter de petróleo (2,135g, 77% puro por LCMS).

Passo 4: Amida do ácido 4-{8-[4- (4-metil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[1,2, 4]triazolo[1, 5-a]pirazin-5-il}-tiofeno-2-carboxílico

N N

HN O

NH2 />

Uma suspensão de 5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-fenil]-amina (100 mg, 258 mmol), amida do ácido 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxa-borolan-2-il)-tiofeno-2-carboxílico (130 mg, 516 mmol) e Pd(PPh3)4 (74 mg, 64,5 mmol) em Na2CC>3 aquoso (1,37 mL, 1,5 M, 2,06mmol) e DMF/dioxano 2/1 (2,75 mL) é desarejada durante 5 min num tubo de reacção. O tubo é selado e a mistura reaccional é aquecida a 90°C dum dia para o outro. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente a mistura 80 reaccional é partilhada entre acetato de etilo e água. O precipitado é recolhido por filtração e lavado com água (lx) e éter (2x) e seco in vacuo. O produto em bruto é purificado por cromatografia em coluna (sílica gel, DCM/MeOH/NH3 96:4) produzindo o composto em epígrafe (43 mg) como um sólido amarelo. RMN de 1H (400MHz, d6~DMSO) δ(ppm) 2,26 (3H, s), 2,50 (4H, m), 3,15 (4H, m,), 6,99 (2H, d), 7,60 (1H, s 1), 7,88 (2H, d), 8,10 (2H, m) , 8,48 (1H, s), 8,66 (1H, s), 8,79 (1H, s), 9,97 (1H, s 1). LCMS: Tr 1,99 min (97,6 %), m/z (APCI) 435 (M+H)+.

Composto 9: Amida do ácido 5-{8-[4-(4-metil-piperazin-l-il) -fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-tiofeno-2-carboxílico

Passo 1: Amida do ácido 5-bromo-tiofeno-2-carboxílico

i h2n

Uma solução de ácido 5-bromo-tiofeno-2-carboxílico (4,51g, 21,78mmol), hidrato de 3-hidroxibenzotriazole (3,24g, 23,96mmol), l-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida (4,6g, 23,96mmol) em DMF (70mL) é agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura reaccional é então arrefecida até 0°C e é adicionado NH3 aq. a 35% (2,2mL) . A mistura é agitada à temperatura ambiente dum dia para o outro. O solvente é removido in vacuo e o resíduo dissolvido em AcOEt, lavado com NaHC03 IN e solução aquosa saturada de cloreto de sódio. As camadas orgânicas são combinadas, secas sobre MgS04, filtradas e concentradas para proporcionar o composto em epígrafe (3,78g, 84%) . HPLC (254nm): Tr 2,46min (96,5%). 81

Passo 2: Amida do ácido 5- (4,4,5,5-tetrametil- [1,3,2]dioxaborolan-2-il)-tiofeno-2-carboxílico

Amida do ácido 5-bromo-tiofeno-2-carboxílico (0,5g, 2,426mmol), bis(pinacolato)diboro (678mg, 2,669mmol),

PdCl2dppf (59mg, 0,072mmol) e KOAc (0,714g, 7,28mmol) são suspendidos em dioxano (5mL), purgados com azoto durante 5 minutos e em seguida aquecidos a 85°C dum dia para o outro. 0 solvente é removido in vacuo e o resíduo partilhado entre acetato de etilo e água. A camada aquosa é novamente extraída com acetato de etilo e as fases orgânicas combinadas são lavadas com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, filtradas através de MgS04 e evaporadas in vacuo para proporcionar o composto em epígrafe (417mg, 68%) .

Passo 3: Amida do ácido 5-{8-[4- (4-metil-piperazin-l-il)-fenilamíno]-[1,2,4]triazolo[1, 5-a]pirazín-5-il}-tiofeno-2-carboxílico

82

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4 utilizando 5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-metil-piperazin-l-il) -fenil] -amina (lOOmg, 0,258mmol), amida do ácido 5-(4,4,5, 5-tetrametil-[1,3,2]dioxa-borolan-2-il)-tiofeno-2-carboxílico (130mg, 0,516mmol) e Pd(PPh3)4 (74mg, 0,0645mmol) em Na2C03 aquoso 1,5M (l,37mL, 2,06mmol) e dioxano (2,75mL). Após evaporação do solvente, o resíduo é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM:NH3 (7M em MeOH) 96:6 para proporcionar o composto em epígrafe (23mg, 21%). LCMS: Tr l,94min (97,9%). RMN de XH (400MHz, d6-DMSO) õ(ppm) 2,26 (3H, s), 2,49 (4H, m) , 3,14 (4H, m) , 6,98 (2H, d), 7,51 (1H, s 1), 7,85-7,89 (2H, m) , 8,03 (2H, d), 8,10 (1H, s 1), 8,38 (1H, s), 8,82 (1H, s), 10,10 (1H, s) . LCMS: Tr l,94min, (97,9%), m/z (APCI) 435 (M+H)+ .

Composto 12: 5-(5-Metil-lH-pirazol-4-il)-N-(4- morfolinofenil)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-amina

1

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4 utilizando (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il- fenil)-amina (0,2g, 0,53mmol), 5-metil-4-(4, 4,5, 5- tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-ΙΗ-pirazole (222mg,

l,06mmol) e Pd(PPh3)4 (0,154mg, 0,134mmol) em Na2C03 1,5M 83 (aq) (2,84mL, 4,26mmol) e dioxano (8,5mL). A mistura reaccional é purificada por cromatografia em coluna sobre sílica gel utilizando DCM:NH3 (7M in MeOH) 98:2 e 97:3 para dar o composto em epígrafe (15mg, 7,5%). A conversão no sal de mesilato utilizando ácido metanossulfónico 0,1M em MeOH (0,398mL) proporciona o composto em epígrafe (15mg) como um sólido pálido verde. RMN de ΤΗ (400MHz, d6-DMS0) õ(ppm) 2,41 (3H, s, MsOH) , 2,46 (3H, s), 3,20 (4H, m) , 3,71 (4H, m) , 7,11 (2H, d), 7,74 (1H, s), 7,97 (2H, d), 8,15 (1H, s), 8,69 (1H, s), 9,88 (1H, s). LCMS: Tr 2,41min (98,3%), m/z (APCI) 377 (M+H)+ .

Composto 15: Amida do ácido 4-[8-(4-morfolin-4-il- fenilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-tiofeno-2-carboxílico r

N

HN

NH2

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4 utilizando (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina (0,2g, 0,53mmol), amida do ácido 4-(4,4,5,5- tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-tiofeno-2-carboxílico (0,27mg, l,06mmol) e Pd(PPh3)4 (0,15mg, 0,133mmol) em Na2C03 1,5M (aq) (2,84mL, 4,26mmol) e dioxano (lOmL). A mistura reaccional é partilhada entre água e acetato de etilo. É formado um precipitado, recolhido por filtração e 84 purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel utilizando DCM:MeOH 95:5 para dar o composto em epígrafe (84,lrng, 37,4%). RMN de ΤΗ (400MHz, d6-DMSO) δ(ppm) 3,13 (4H, m) , 3,79 (4H, m) , 7,01 (2H, d), 7,60 (1H, s 1), 7,91 (2H, d), 8,10 (2H, s), 8,48 (1H, s), 8,66 (1H, s), 8,79 (1H, s), 9,96 (1H, s) . LCMS: Tr 2,61min (97,1%), m/z (APCI) 422 (M+H)+.

Composto 16: 5-(5-Metil-lH-pirazol-4-il)-N—(4-(4- metilpiperazin-l-il)fenil)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8— amina

Passo 1: 5-Metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole

O-B

H

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 86, passo 2 utilizando 4-bromo-5-metil-lH-pirazole (3g, 18,6mmol), bis(pinacolato)diboro (8,52g, 33,5mmol), PdCl2dppf (913mg, l,118mmol) e KOAc (5,49mg, 55,9mmol) em dimetilsulfóxido (30mL). A mistura reaccional é purificada por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com éter de petróleo: acetato de etilo 7:3 seguido de 1:1 para proporcionar 5-metil-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole (3,87g, 100%) . 85

Passo 2: 5-(5-Metil-lH-pirazol-4-il)-N- (4- (4-metilpiperazin-l-il)fenil)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-amina 85

N—NH

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4 utilizando (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-metil-piperazin-1-il)-fenil]-amina (132mg, 0,340mmol), 5-metil-4-(4,4,5,5- tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-ΙΗ-pirazole (141mg,

0,68mmol), Pd(PPh3)4 (98mg, 0,085inmol) e Na2C03 1,5N (l,81mL, 2,72mmol) em dioxano (5,4mL). 0 produto em bruto é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM:NH3 (7M in MeOH) 95:5, seguido de trituração com éter dietílico e éter de petróleo para proporcionar o composto em epígrafe (9mg, 7%) como um sólido pálido verde. RMN de 1H (400MHz, dg-DMSO) õ(ppm) 2,27 (3H, s), 2,38-2, 49 (7H, m) , 3,14 (4H, m) , 6,97 (2H, d), 7,70 (1H, s), 7,88 (2H, d), 7,99 e 8,43 (1H, s 1), 8,68 (1H, s), 9,71 (1H, s), 12,92 e 12,98 (1H, s 1). A conversão no sal de mesilato utilizando ácido metanossulfónico 0,1 M (0,231mL) produz o composto alvo (llmg). LCMS: Tr l,78min (86%), m/z (APCI) 390 (M+H)+.

Composto 17: N-(3-Fluoro-4-morfolinofenil)-5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-amina 86

Passo 1: (5-Bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-11)-(3 fluoro-4-morfolin-4-il-fenil)-amina

HN !.

Br

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 1 utilizando 5,8-dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina (0,5g, l,799mmol), 3-fluoro-4-morfolin-4-il-fenilamina (0,53g, 2,70mmol) e DIPEA (0,470mL, 2,70mmol) em 2-propanol (6mL). A mistura reaccional é partilhada entre solução aquosa de ácido cítrico a 10% e DCM. A fase orgânica é separada e lavada com água e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca sobre MgS04, filtrada e concentrada sob vácuo para proporcionar o composto em epígrafe (697mg, 98%) o qual é utilizado no passo seguinte sem mais purificação. LCMS: Tr 3,52min (98,2%).

Passo 2: N-(3-Fluoro-4-morfolinofenil)-5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1, 5-a]pirazin-8-amina

o 87

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4, utilizando (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(3-fluoro-4-morfolin-4-il-fenil)-amina (lOOmg, 0,254mmol), 4-(4,4,5,5-tctrametil- [1,3,2]dioxaborolan-2-il)-ΙΗ-pirazole (99mg, 0,51mmol) e

Pd(PPh3)4 (73mg, 0,063mmol) em Na2C03 1,5M (l,36mL, 2,03mmol) e dioxano (4mL). 0 material em bruto é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM:NH3 (7M em MeOH) 98:2 e por trituração com éter dietílico e éter de petróleo para produzir o composto alvo (43mg, 44%). RMN de ΧΗ (400MHz, d6-DMSO) δ (ppm) 3,01 (4H, m), 3,79 (4H, m), 7,08 (1H, t), 7,79 (1H, d), 8,06 (1H, d), 8,26 (1H, s), 8,38 (1H, s), 8,67 (1H, s), 8,79 (1H, s), 10,03 (1H, s), 13,3 (1H, s 1). LCMS: Tr 2,83min (99%), m/z (APCI) 381 (M+H)+ .

Composto 19: 5-(5-(lH-Pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5- a]pirazin-8-ilamino)-2-morfolinobenzamida

Passo 1: 5-(5-Bromo-[1,2, 4]triazolo[1, 5-a]pirazin-8- ilamino)-l-morfolin-4-il-benzamida

Br

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 1 utilizando 5,8-dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina (250mg, 0,90mmol) 5-amino-2-morfolin-4-il-benzamida (299mg, l,35mmol) e N,N-diisopropiletilamina (0,24mL, l,35mmol) em 2-propanol (7mL) . Trituração com ^rOH e Et20 proporciona o composto em epigrafe (273mg, 73%).

Passo 2: 5- (5- (lH-Pirazol-4-il) - [1,2, 4] triazolo [1, 5- a]pirazin-8-ilamino)-1-morfolinobenzamida

N—NH

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4 utilizando 5-(5-bromo-[1,2, 4]triazolo [1,5-a]pirazin-8-ilamino)-2-morfolin-4-il-benzamida (140mg, 0,33mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil- [1,3,2]dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole (130mg, 0,67mmol) e

Pd (PPh3) 4, (96mg, 0,083mmol) em K2C03 1,5M (aq) (l,93mL) e dioxano (3,44mL). 0 material em bruto é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM seguido de DCM:NH3 (7M em MeOH) 99:1 em seguida 97:3 em seguida 95:5 para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido branco (40,5mg, 30%). RMN de ^ (400Mhz, d6-DMS0) õ(ppm) 2,96 (4H, m), 3,79 (4H, m), 7,28 (2H, d), 7,45 (1H, m), 7,54 (1H, s 1), 8,01-8,09 (1H, dd), 8,25 (1H, s), 8,50 (1H, d), 8,69 (1H, s 1), 8,78 (1H, s), 9,98 (1H, s), 13,3 (111, S D . LCMS: Tr 2,23min (96,9%: ), m/z (APCI) 406 (M+H)+.

Composto 21: 4-(8-(4-(2-Morfolinoetoxi)fenilamino)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)tiofeno-2-carboxamida 89 ί

VN^n Ν ο

Nl-fe

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4, utilizando (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(2-morfolin-4-il-etoxi)-fenil]-amina (113mg, 0,27mmol), 4-(4,4,5,5- tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-tiofeno-2-carboxamida (136mg, 0,537mmol) e Pd(PPh3)4 (78mg, 0,067mmol) em Na2C03 1,5M (l,44mL, 2,16mmol) e dioxano (4,3mL). A mistura reaccional é purificada por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM:NH3 (7M em MeOH) 97:3 para produzir o composto em epígrafe (65mg, 52%). LCMS: Tr l,98min (98,9%). A conversão no sal de mesilato utilizando ácido metanossulfónico 0,1M em MeOH (l,1385mL) proporciona o composto em epígrafe (50mg, 95%). RMN de ΧΗ (400MHz, de DMSO) δ (ppm) 2,37 (3H, s, MsOH) , 3,21-3,64 (6H, m) , 3, 76 (2H, t), 4,05 (2H, d), 4,40 (2H, m) , 7,09 (2H, d) , 7, 61 (1H, s 1), 8,02 (2H, d), 8,11 (2H, s) , 8,48 (1H, s) , 8,67 (1H, s), 8,82 (1H, s), 9,91 (1H, s 1), 10,09 (1H, s) . LCMS: Tr 1, 98min (97,7%), m/z (APCI) 466 (M+H)+. composto 22: 5-(8-(4-(2-Morfolinoetoxi)fenilamino)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)tiofeno-2-carboxamida 90 .Ο

ΗΝ I

/--ΝΗ2 Ο

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4, utilizando (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(2-morfolin-4-il-etoxi)-fenil]-amina (118mg, 0,28mmol), 5-(4,4,5,5- tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-tiofeno-2-carboxamida (142mg, 0,56mmol) e Pd(PPh3>4 (81mg, 0,07mmol) em Na2CC>3 1,5M (l,5mL, 2,24mmol) e dioxano (4,5mL). A mistura reaccional é purificada por cromatografia em coluna sobre silica gel eluindo com DCM: NH3 (7M em MeOH) 97:3 para produzir o composto em epígrafe (33mg, 25%). LCMS: Tr 2,66min (99%) . A conversão no sal de mesilato utilizando ácido metanossulfónico 0,1M em MeOH (0,569mL) proporciona o composto em epígrafe (24mg, 86%) . RMN de ΤΗ (400MHz, d6- DMSO) õ(ppm) 2,37 (3H, s, MsOH) , 3,25 (2H, m) , 3,50-3,64 (4H, m) , 3, . 76 (2H, t), 4,05 (2H, d) , 4, 40 (2H , m) , 7, 09 (2H, d), 7, 51 (1H, S 1), 7,87 (1H , d), 7 ,99-8,0 5 (3H, m) , 8, 11 (1H, s D , 8,37 (1H, s) , 8,84 (1H, s) , 9,92 (1H, s D , 10,21 (1H, s) . LCMS: Tr 1,95min (98,8 %) , m/z (APCI) 466 (M+H)+.

Composto 23: (4-Morfolin-4-il-fenil)-[5-(2H-pirazol-3-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-amina

Passo 1: 1-(Tetra-hidro-piran-2-il)-lH-pirazole 91

Iff-Pirazole (14,3g, 0,21mol) é dissolvido em 3,4-di-hidro- 2H-pirano (26,74g, 0,32mol) na presença de uma quantidade catalítica de TFA (0,lmL, l,3mmol). A mistura reaccional é agitada a 95°C durante 5 horas, arrefecida e em seguida desactivada utilizando NaH (0,2g, 5mmol). 0 solvente é removido para dar o composto em epígrafe como um óleo castanho (33,3g, 99%), o qual é utilizado no passo seguinte sem mais purificação.

Passo 2: Ácido lH-pirazole-2-borónico

HO A uma solução arrefecida (-78°C) de 1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-pirazole (7,6 g, 52mmol) em THF (50mL) são adicionados gota a gota nBuLi (33mL, 2,5M em hexano, 82,5mmol) e triisopropilborano (12,7mL, 55mmol) mantendo a temperatura a -70°C. A mistura reaccional é agitada a -70°C durante uma hora e em seguida deixada atingir a temperatura ambiente ao longo de 4 horas. Depois de desactivar a reacção com HC1 2M, o solvente é removido in vacuo e o pH é ajustado até pH 6 utilizando NaOH 1M. É formado um precipitado, recolhido por filtração e lavado com tolueno e éter de petróleo. A trituração com acetato de etilo proporciona o composto alvo como um sólido branco (2,7g, 48%), o qual é utilizado no passo seguinte sem mais purificação. 92

Passo 3: (4-Morfolin-4-il-fenil)-[5-(2H-p±razol-3-±l)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-amina

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4, utilizando 5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(morfolin-4-il)-fenil]-amina (lOOmg, 0,267mmol), ácido lH-pirazole-2-borónico (60mg, 0,535mmol), Pd(PPh3)4 (93mg, 0,08mmol) e

Na2C03 (88mg, 0,80mmol) em DMF (2mL). A mistura reaccional é colocada num tubo vertical e agitada a 100°C durante 18 horas. Depois de arrefecer, a mistura é diluída com solução de NaHC03 e extraída com AcOEt (4x) . A camada orgânica é lavada com água, seca sobre MgS04, filtrada e evaporada para proporcionar um produto em bruto que é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM seguido de DCM:NH3 (7M em MeOH) 96:4. 0 composto em epígrafe é isolado após trituração com éter dietílico (12,4mg, 13%). A conversão no sal de mesilato utilizando ácido metanossulfónico 0,1M (0,342mL, 0,0342mmol) dá o composto alvo (lOmg, 81%). RMN de 1H (400MHz, de-DMSO) δ(ppm) 2,34 (3H, s, MsOH), 3,14 (4H, m), 3,81 (4H, m), 7,04 (2H, d), 7,27 (1H, m) , 7,92 (3H, m) , 8,24 (1H, s), 8,76 (1H, s), 9,92 (1H, s) . LCMS: Tr 2,45min (97,6%), m/z (APCI) 363 (M+H)+. 93

Composto 28: 4-(8-(4-(4-Isopropilpiperazin-l- il)fenilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)tiofeno-2-carboxamida

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4, utilizando 5-bromo-IV-(6-(4-isopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-amina (lOOmg, 0,24mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-tiofeno-2-carboxamida (121mg, 0,48mmol) e Pd(PPh3)4 (69mg, 0,059mmol) em Na2CC>3 1,5M (l,28mL, l,92mmol) e dioxano (3,84mL). 0 produto em bruto é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM e DCM:NH3 (7M em MeOH)97:3 para produzir o composto em epígrafe (68mg, 61%) como um sólido pálido verde. A conversão no sal de mesilato utilizando ácido metanossulfónico 0,1M em MeOH (l,47mL, 0,147mmol) seguido de trituração com DCM e éter dietílico, proporciona o composto em epígrafe (67mg, 98,5%). RMN de ΤΗ (400MHz, de-DMSO) δ (ppm) 1,35 (6H, d), 2,34 (3H, s, MsOH) , 3, 00 (2H, t) , 3,22-3,25 (2H, m) , 3,56-3,61 (3H, m) , 3,89 (2H, d) , 7, 09 (2H, d), 7,60 (1H, s 1), 7,97 (2H, d) , 8,10 (2H, s) , 8,48 (1H, s), 8,67 (1H, s), 8,81 (1H, s) , 9,23 (1H, s 1) , io ,03 (1H, s) . LCMS: Tr 2,13min (98, 4%) , m/z (APCI) 463 (M+H)+ . 94

Composto 29: 5-(8-(4-Morfolinofenilamino)- [1,2, 4]tr±azolo[l, 5-a]pirazin-5-il)furan-3-carboxamida

Passo 1: Éster terc-butílico do ácido [5-(4-carbamoil-furan-1 -il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-carbâmico

N

boc^ NH2

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 35, passo 3 utilizando éster terc-butilico do ácido (4-morfolin-4-il-fenil)-(5- tributilestananil-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-carbâmico (137mg, 0,199mmol), 5-bromo-furan-3-carboxamida (76mg, 0,4mmol) e Pd(PPh3)4 (23mg, 0,020mmol) em DMF (lmL). A purificação da mistura reaccional eluindo com DCM:MeOH 98:2 e DCM:NH3 (7M em MeOH) 96:4 proporciona o composto em epígrafe (33mg, 33%).

Passo 2: 5- (8- (4-Morfolinofenilamino)-[1,2, 4]triazolo[1, 5- a ] pirazin-5-il)furan-3-carboxamida 95

Uma solução de éster terc-butílico do ácido [5—(4— carbamoil-furan-2-il)-[1,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-carbâmico (33mg, 0,065mmol) numa mistura DCM:TFA 1:1 (2mL) (2 gotas de água) é agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. Após adição de Na2C03 sat., é formado um precipitado, recolhido por filtração e lavado com água, éter dietílico e éter de petróleo. Depois de secar sob vácuo, é isolado o composto em epígrafe (20mg, 76%) . A conversão no sal de mesilato utilizando ácido metanossulfónico 0,1M em MeOH (0,444mL) produz o composto em epígrafe (19mg, 100%) . RMN de XH (400MHz, d6-DMSO) õ(ppm) 2,36 (3H, s, MsOH), 3,22 (4H, m), 3,82-3,89 (4H, m), 7,13 (2H, d) , 7,36 (1H, s 1), 7,86 (1H, s), 7,95 (3H, m) , 8,17 (1H, s) co o (1H, s ), 8,84 (1H, s), 10,17 (1H, s) . LCMS: Tr 2,60min (96,9%), m/z (APCI) 406 (M+H)+.

Composto 33: 5-(8-(4-Morfolinofenilamino)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)isoindolin-l-ona 96

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4 utilizando (5—bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina (l,0g, 2,67mmol), 5-(4,4,5,5-tetrametil- [1,3,2]dioxaborolan-2-il)-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona (ver descrição para o Composto 79) (l,03g, 4,01mmol) e Pd(PPh3)4 (0,77g, 0,67mmol) em Na2C03 1,5M (14,3mL) e dioxano (40mL). A purificação por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM seguido de DCM:NH3 (7M em MeOH) 96:4 proporciona o composto em epígrafe (0,895g, 79%). RMN de ΤΗ (400MHz, d6-DMSO) õ(ppm) 3, 12 (4H , m) , 3, 79 (4H, m) , 4, 51 (2H, s) , 7, 01 (2H, d), 7, 84 (1H, d) , 7, 92 (2H, d) , 8,01 (1H, s) , 8, 09 (1H, d), 8,23 (1H, s) , 8, 72 (1H, s) , 8, 73 (1H, s) , 10,02 (1H, s) . LCMS: Tr 2,51min (97, 8%) , m/ z (APCI) 428 (M+H)+ .

Composto 34: 4-(8-(4-Morfolinofenilamino)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)furan-2-carboxamida 97

Ν, )

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4, utilizando (5-bromo- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il- fenil)-amina (78mg, 0,16mmol), amida do ácido 4-(4,4,5,5- tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-furan-2-carboxilico (lOOmg, 0,34mmol) e Pd(PPh3)4 (60mg, 0,052mmol) em Na2C03 1,5M (aq) (l,lmL, l,68mmol) e dioxano (3mL) . A mistura reaccional é partilhada entre água e acetato de etilo, o composto em epigrafe precipita e é recolhido por filtração. A purificação do sólido por cromatografia em coluna sobre sílica gel, eluindo com DCM e DCM:NH3 (7M em MeOH)95:5, proporciona o composto em epígrafe (42mg, 65%). A conversão no sal de mesilato utilizando ácido metanossulfónico 0,1M (0,82mL) dá um sólido o qual é triturado com éter dietílico para proporcionar o composto em epígrafe (30,5mg). RMN de XH (400MHz, de-DMSO) δ(ppm) 2,19 (3H, s, MsOH) , 3,03-3,07 (4H, m), 3,67 (4H, m), 6,99 (2H, s 1), 7,43 (1H, d), 7,74-7,82 (4H, m), 8,06 (1H, s 1), 8,59 (1H, s 1), 8,64 (1H, s), 9,91 (1H, s 1). LCMS: Tr 2,64min (98,1%), m/z (APCI) 406 (M+H)+.

Composto 35: 6-(8-(4-Morfolinofenilamino)- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)-3,4-di-hidroisoquinolin-1(2H)-ona 98

Passo 1: Éster terc-butílico do ácido (5-bromo- [1,2,4] triazolo [ 1, 5-a]pirazin-8-il) - (4-morfolin-4-il-fenil)-carbâmico boc

/) N

T

Br

Uma solução de 5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-[4-(morfolin-4-il)-fenil]-amina (300mg, 0,800mmol), dimetilaminopiridina (lOmg, 0,08mmol) e dicarbonato de di-terc-butilo (523mg, 2,4mmol) em diclorometano (5ml) é agitada a 50°C dum dia para o outro. A mistura reaccional é partilhada entre DCM e água e a camada orgânica é lavada com NaOH IN e solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica é seca sobre MgSCU, filtrada e concentrada in vacuo para proporcionar um composto em bruto purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel. A eluição com 98:2 DCM:MeOH produz o composto em epígrafe (352mg, 93%). LCMS: Tr 3,45min (97,8%).

Passo 2: éster terc-butílico do ácido (4-morfolin-4-il-fenil)-(5-tributilestananil-[1,2, 4]triazolo[1, 5-a]pirazin-8-il)-carbâmico

boc-. ΊΜ

99 A um solução arrefecida (-78°C) de éster terc-butílico do ácido (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-

morfolin-4-il-fenil)-carbâmico (370mg, 0,78mmol) em THF (12mL) são adicionados cloreto de isopropilmagnésio 2M em THF (0,78mL, l,56mmol), e após 5 minutos de agitação é adicionado cloreto de tributilestanho (0,42, l,56mmol). A mistura reaccional é agitada a -78°C durante 15 minutos e à temperatura ambiente durante mais 15 minutos. Depois de remover o solvente, o resíduo é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com éter de petróleo:acetato de etilo 5:1 seguido de éter de petróleo:acetato de etilo 1:1. É isolado o composto em epígrafe (105mg, 20%).

Passo 3: Éster terc-butílico do ácido (4-morfolin-4-il-fenil)-[5- (1-oxo-1,2,3, 4-tetra-hidro-isoquinolin-6-il)-[1,2, 4]triazolo[1, 5-a]pirazin-8-il]-carbâmico

A uma solução desarejada de éster terc-butílico do ácido (4-morfolin-4-il-fenil)-(5-tributilestananil-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-carbâmico (lOOmg,

0,15mmol) e 6-bromo-3,4-di-hidro-2H-isoquinolin-l-ona em DMF (lmL) é adicionado tetraquis(trifenilfosfina)paládio(0) (17mg, 0,015mmol) e a mistura reaccional é agitada a 90°C dum dia para o outro. Depois de remover o solvente in 100 vacuo, o resíduo é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel. A eluição com éter de petróleo:acetato de etilo 1:1 e acetato de etilo proporciona o composto alvo como um sólido amarelo (30mg, 37%).

Passo 4: 6-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)- [1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-3, 4-di-hidro~2H-isoquinolin-1-ona '0 r

Uma solução de éster terc-butílico do ácido (4-morfolin-4-il-fenil)-[5-(1-oxo-l,2,3,4-tetra-hidro-isoquinolin-6-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-carbâmico (30mg, 0,055mmol) numa mistura 1:1 de TFA:DCM (1 gota de H20) , é agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. 0 solvente é removido in vacuo e o resíduo partilhado entre acetato de etilo e NaHC03 sat. (aq) . A camada aquosa é extraída com acetato de etilo (2x). As camadas orgânicas são combinadas e evaporadas para proporcionar um resíduo purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com acetato de etilo. 0 composto em epígrafe é isolado (18mg, 75%) e convertido no sal de mesilato (16,6mg, 97%) utilizando ácido metanossulfónico 0,1M (0,317mL) em MeOH. RMN de ΤΗ (400MHz, d6-DMSO) õ(ppm) 2,36 (3H, s MsOH) , 3,04 (2H, t) , 3,21 (4H, m) , 3,47 (2H, t) , 3,83 (4H, m), 7,11 (2H, d) , 7,95-8,02 (6H, m) , 8,05 (1H, s) , 8,74 (1H, s), 101 10,09 (1Η, s 1). LCMS: Tr 2,81 min (97,9%), m/z (APCI) 442 (M+H)+.

Composto 36: 5-(8-(4-(4-Isopropilpiperazin-l- il)fenilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)isoindolin-l-ona

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4 utilizando 5-bromo-IV-(6-(4-isopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il)-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-amina (0,6g, l,44mmol), 5-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona (0,56g, 2,16mmol) e Pd(PPh3)4 (0,416g, 0,36mmol) em Na3C03 1,5M (7,7mL) e dioxano (23mL). A purificação por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM seguido de DCM:NH3 (7M em MeOH) 98:2 proporciona o composto em epígrafe (0,36g, 53%) o qual é convertido no sal de mesilato utilizando ácido metanossulfónico 1M em MeOH (0,77mL). Após trituração com éter dietílico e DCM o composto em epígrafe é isolado como um s ólido (0,4 lOg) . RMN de (400MHz, d6-DMSO) 5(ppm) 1,35 (6H, d) , 2,35 (3H, S, MsOH), 3,04 (2H, t), 3,20-3,27 (2H, m) , 3,56- 3,63 (3H, m) , 3,89 (2H, d) , 4,52 (2H, s), 7, 09 (2H, d) , 7, 85 (1H, d) , 7, 95- 8,01 (3H, m) , 8,10 (1H, d) , 8,24 (1H, s) , 8, 72 (1H, s) , 8 , 74 (1H, s), 9,27 (1H, s D , 102 10,07 (1Η, s) . LCMS: Tr 2,93min (97,9%), m/z (ES + ) 469 (M+H)+.

Composto 37: {5-[5-(lH-Pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5- a]pirazin-8-ilamino]-2-morfolinofenil}metanol

Passo 1: (2-Morfolin-4-il-5-nitro-fenil)-metanol

OH "O

A uma solução arrefecida (0°C) de 2-morfolin-4-il-5-nitro-benzaldeído (0,8g, 3,39mmol) em MeOH (5mL) é adicionado

NaBH4 (0,125g, 3,39mmol) e a mistura reaccional é agitada à temperatura ambiente durante 3 horas. Depois de desactivar a reacção com água, o solvente é removido in vacuo e o resíduo dissolvido em acetato de etilo e lavado com solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica é seca sobre MgS04, filtrada e concentrada para proporcionar o composto em epígrafe (870mg), o qual é utilizado no passo seguinte sem mais purificação.

Passo 2: (5-Amino-2-morfolin-4-il-fenil)-metanol

A uma solução de (2-morfolin-4-il-5-nitro-fenil)-metanol (870mg) em etanol (40mL) é adicionado hidróxido de paládio (87mg) e a mistura é agitada num equipamento de Parr sob pressão de hidrogénio (10 bars) durante 4 horas. A mistura 103 reaccional é filtrada sobre Celite 521, lavada com etanol e concentrada in vacuo para dar o composto em epígrafe (640mg, 83%).

Passo 3: 3-(terc-Butil-dimetil-silaniloximetil)-4-morfolin-4-il-fenilamina

Uma solução de (5-amino-2-morfolin-4-il-fenil)-metanol (640mg, 3,07mmol), cloreto de terc-butildimetilsililo (509mg, 3,38mmol) e imidazole (250mg, 3,68mmol) em dimetilformamida (20mL) é agitada à temperatura ambiente dum dia para o outro. O solvente é removido in vacuo e o resíduo partilhado entre água e acetato de etilo. A camada orgânica é lavada com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca sobre MgS04, filtrada e concentrada para proporcionar um produto em bruto. A purificação, utilizando cromatografia em coluna sobre sílica gel, eluindo com DCM seguido de uma mistura de DCM:MeOH 95:5, proporciona o composto em epígrafe como um sólido cor-de-rosa (390mg, 27%) .

Passo 4: (5-Bromo-[1,2,4]triazolo[1,5~a]pirazin-8-il)-[3- (terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-4-morfolin-4-il-fenil]-amina 104

Uma mistura de 5, 8-dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina (0,391g, l,41mmol), 3-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-4-morfolin-4-il-fenilamina (0,5g, l,55mmol) e N- etildiisopropil-amina (0,27mL, l,55mmol) é aguecida a 90°C em 2-propanol (lOmL) durante 8 horas. A mistura reaccional é evaporada até à secura e o resíduo partilhado entre diclorometano e água. A fase aguosa é extraída duas vezes com diclorometano. As camadas orgânicas são combinadas, lavadas com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secas sobre MgSCh, filtradas e concentradas in vacuo para proporcionar o composto em epígrafe (335mg, 46%).

Passo 5: [5-(5-Bromo-[1,2, 4]triazolo[1, 5-a]pirazin-8- ilamino)-2-moryholin-4-il-fenil]-metanol

Br

Uma solução de 5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-4-morfolin-4-il-fenil]-amina (285mg, 0,549mmol) em solução de fluoreto de tetrabutilamónio 1M em THF (0,63 mL) é agitada à 105 temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura reaccional é partilhada entre acetato de etilo e água. A camada orgânica é lavada com solução de ácido cítrico a 10% e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca sobre MgSCU, filtrada e concentrada para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido de cor creme (lOOmg, 45%).

Passo 6: {5-[5-(lH-Pirazol-4-il)-[1,2, 4]triazolo[1, 5- a]pirazin-8-ilamino]-2-morfolinofenil}metanol

^ N HN"

/> N

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4 utilizando [5—(5— bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)-2-morfolin-4-il-fenil]-metanol (85mg, 0,21mmol), 4-(4,4,5,5- tetrametil-[1,3,2]dioxa-borolan-2-il)-ΙΗ-pirazole (81mg, 0,42mmol) e Pd(PPh3) 4 (60mg, 0,052mmol ) em Na2C03 1, 5M (1,12mL) e dioxano (2,0mL). A mistura reaccional é purificada por cromatografia em coluna sobre sílica gel, eluindo com DCM: NH3 (7M em MeOH) 95:3 seguido de purificação por HPLC preparativa de fase inversa. 0 composto em epígrafe é obtido como um sólido castanho pálido (lOmg, 12%). RMN de ΤΗ (400MHz, d6-DMSO) õ(ppm) 2,87 (4H, m) , 3,77 (4H, m) , 4,63 (2H, d), 5,12 (1H, t), 7,11 (1H, d), 7,84 (1H, d), 8,12 (1H, s), 8,21 (1H, s) , 8,39 106 (1Η, s), 8,69 (1H, s), 8,77 (1H, s), 9,78 (1H, s), 13,29 (1H, s 1). LCMS: Tr 2,45min (96,3%), m/z (APCI) 393 (M+H)+.

Composto 41: (6-[Morfolin-4-il]piridin-3-il)-[5-(1H-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]amina

N-N

H

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos como descritos para o Composto 120, utilizando (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(6-morfolin-4-il-piridin-3-il)amina no Passo 4. LCMS: Tr = 0,80 min (95 %) , m/z (ESI) 364 (M+H)+.

Composto 42: [6-(4-[Ciclopropilmetil]piperazin-1- il)piridin-3-il]-[5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]amina

N-N

H 107

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos descritos para o Composto 120, utilizando (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)—[6—(4— [ciclopropilmetil]piperazin-l-il)piridin-3-il]amina no passo 4. LCMS: Tr = 0,80 min (95 %), m/z (ESI) 417 (M+H)+.

Composto 43: [6-(4-Isopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il]- [5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-11]amina

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 120, utilizando (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)—[6—(4— isopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il]amina no Passo 4. LCMS: Tr = 0,77 min (95 %), m/z (ESI) 405 (M+H)+.

Composto 44: [5-(lH-Pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5- a]pirazin-8-il]-{6-[4-(2,2,2-trifluoroetil)piperazin-l-il ]piridin-3-il}amina 108

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 120, utilizando (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-{6-[4-(2,2,2-trifluoroetil)piperazin-l-il]-piridin-3-il}amina no passo 4. LCMS: Tr = 0,95 min (95 %), m/z (ESI) 445 (M+H)+.

Composto 46: {4-[4-(Ciclopropilmetil)piperazin-l-il]fenil}-[5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]amina

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 120, Passo 4, utilizando (5-bromo-[1,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)—{4—[4— ciclopropilmetil)piperazin-l-il]fenil} amina. LCMS: Tr = 1,02 (95 %), m/z (ESI) = 444 (M+H)+. 109

Composto 47: Amida do ácido 4-[8-(6-[morfolin-4-il]piridin-3-ilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]tiofeno-2-carboxilico

H2N

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 167, utilizando (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-(6-morfolin-4-il-piridin-3-il)amina no Passo 4. LCMS: Tr = 0,85 min (95 %), m/z (ESI) 423 (M+H)+.

Composto 48: (5-Benzo[b]tiofen-3-il-[1,2,4]triazolo[1,5- a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-ilfenil)amina

110

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 120, utilizando (5-bromo- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4- ilfenil)amina e 4,4,5,5-tetrametil-2-benzo[b]tiofen-3-il-[ 1,3,2]dioxaborolano no passo 4. LCMS: Tr 0,84 min (95 %), m/z (ESI) 402 (M+H)+.

Composto 50: (4-Morfolin-4-ilfenil)-(5-tiofen-3-il- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)amina

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 120, utilizando (5-bromo-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-ilfenil)amina e 4,4,5,5-tetrametil-2-tiofen-3-il- [ 1,3,2]dioxaborolano no passo 4. LCMS: Tr 1,19 min (95 %) , m/z (ESI) 379 (M+H)+.

Composto 51: [4-(4-Isopropilpiperazin-l-il)fenil]-(5- tiofen-3-il-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)amina 111

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos como descritos para o Composto 50, utilizando (5-bromo[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-isopropilpiperazin-l-il)-fenil]amina no passo final. LCMS : tr = 1,11 min (95 %), m/z (ESI) 420 (M+H)+.

Composto 52: 5-(5-Etil-lH-pirazol-4-il)-N-(4- morfolinofenil)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-amina

Passo 1: 3-Etil-lH-pirazole

A uma solução, mantida sob agitação, de 1-trimetilsilanil-pent-l-in-3-ona (0,5g, 3,25mmol) e sal de sulfato de hidrazina (0,56g, 4,33mmol) em etanol (15mL), é adicionado

Na2C03 sat. (0,52g, 4,87mmol) e a mistura é aquecida a refluxo a 90°C durante 5 horas. A mistura reaccional é diluída com água e solução aquosa saturada de cloreto de sódio e extraída utilizando éter dietílico (3x). As camadas orgânicas são combinadas, secas sobre MgS04, filtradas e concentradas para proporcionar um produto em bruto, 112 purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel. A eluição com éter de petróleo:acetato de etilo 90:10 proporciona o composto em epígrafe (0,1196g, 36%).

Passo 2: 4-Bromo-5-etil-lH-pirazole

A uma solução, mantida sob agitação, de 3-etil-lH-pirazole (0,114g, l,186mmol) em ácido acético (2mL) é adicionado bromo (0,061mL, l,186mmol) e a mistura é agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. A mistura reaccional é basifiçada com NaHCC>3 sat. e extraída utilizando acetato de etilo (3x) . As camadas orgânicas são combinadas, secas sobre MgS04, filtradas e concentradas para dar o composto em epígrafe (0,180g. 87%). O composto é utilizado no passo seguinte sem mais purificação.

Passo 3: 4-Bromo-5-etil-l-(tetra-hidro-piran-2-il)-1H-pirazole e 4-Bromo-3-etil-l-(tetra-hidro-piran-2-il)-1H-pirazole

4-Bromo-5-etil-lH-pirazole (0,179g, l,032mmol) é dissolvido em 3, 4-di-hidro-2H-pirano (0,28mL, 3,098mmol) na presença de uma quantidade catalítica de TFA (0,001mL, 0,00103mmol). A mistura reaccional é agitada a 90°C durante 3 horas, 113 arrefecida e em seguida desactivada utilizando NaH (l,5mg, 0,0061mmol). Depois de remover o solvente, o resíduo é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com uma mistura de éter de petróleo-acetato de etilo 90:10. As fracções contendo os compostos desejados são recolhidas e concentradas in vacuo para proporcionar os compostos em epígrafe (175mg, 66%).

Passo 4: 5-Etil-l-(tetra-hidro-piran-2-il)-4-(4,4,5,5- tetrametil-[1, 3,2]dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole e 3-Etil-1- (tetra-hidro-piran-2-il)-4-(4, 4, 5, 5-tetrametil-[1,3,2] dioxaborolan-2-il) -lH-pirazole

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 86, passo 2 utilizando 4-bromo-5-etil-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-pirazole e 4-bromo-3- (168mg, 1,3mmol) , etil-1-(tetra-hidropiran-2-il)-lH-pirazole 0,65mmol), bis(pinacolato)diboro (331mg,

PdCl2dppf (53mg, 65pmol) e KOAc (190mg, l,95mmol) em dimetilsulfóxido (2mL). A mistura reaccional é purificada por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com éter de petróleo:acetato de etilo 90:10 para proporcionar os compostos em epígrafe (61,lmg, 31%).

Passo 5: {5-[5-Etil-l-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-pirazol-4-il]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il}-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina e {5-[3-Etil-l-(tetra-hidro-piran-2-il)-1H- 114 pirazol-4-il]-[1,2,4]trlazolo[1,5-a]pirazin-8-il} - (4-morfolin-4-il-fenil)-amina 114 p

XX

P XX, VNH 'V> Yn-n NH nV) ·γΝ-Ν r;r\ J—N N-N y-o. /7 ^ ( ) \^o

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4 utilizando (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina (0,032g, 0,085mmol), 5-etil-l-(tetra-hidro- piran-2-il)-4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-ΙΗ-pirazole e 3-etil-l-(tetra-hidro-piran-2-il)-4- (4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole (0,52mg, 0,17mmol), e Pd(PPh3)4 (0,025mg, 0,021mmol) em

Na2CC>3 1,5M (aq) (0,45mL, 0,6mmol) e dioxano (2mL). A mistura reaccional é purificada por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com éter de petróleo: acetato de etilo 1:1 seguido de éter de petróleo:acetato de etilo 1:4 para produzir o composto em epígrafe (45mg).

Passo 6: 5-(5-Etil-lH-pirazol-4-il)-N-(4-morfolinofenil)- [1,2, 4]triazolo[1, 5-a]pirazin-8-amina

N— NH 115

Uma solução de {5-[5-etil-l-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-pirazol-4-il]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il}-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina e {5-[3-etil-l-(tetra- hidropiran-2-il)-lH-pirazol-4-il]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il}-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina (40mg, 0,077mmol) e HC1 conc. (0,3mL) em MeOH (lOmL) é agitada à temperatura ambiente durante 5 horas. Depois de remover o solvente, o resíduo sólido é partilhado entre acetato de etilo e NaHCC>3 sat.. 0 sólido insolúvel é recolhido por filtração, lavado com água, éter dietílico e éter de petróleo e seco para proporcionar o composto em epígrafe (5mg, 17%). A conversão no sal de mesilato utilizando ácido metanossulfónico 0,1M (0,128mL) proporciona o composto em epígrafe (5,6mg, 89 %) como um sólido. RMN de 1h (400MHz, d6-DMSO) δ (ppm) 1,13 (3H, m), 2,29 (3H, s, MsOH), 2,74 (2H, m) , 3 ,29 (4H, m) , 3, 77 (4H, m) , 7,06 (2H, m), 7,62 (1H, s), -O CO (2H > Q* CO o o (1H, s), 8,61 (1H, s), 9,83 (1H, s) . LCMS : Tr 2,6 9min (9 8 ,4%), m/z (APCI) 391 (M+H)+ .

Composto 53: 6-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-1,1-dioxo-l,2-di-hidro-lX6-benzo[d]isotiazol-3-ona

Passo 1: 1,l-Dioxo-6-(4, 4,5,5-tetrametil- [1, 3,2]dioxaborolan-2-il)-1,2-di-hidro~lÀ6-benzo[d]isotiazol-3-ona ov o B'

116

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 86, passo 2 utilizando 6-bromo-1, 1-dioxo-l, 2-di-hidro-^6-benzo [d] isotiazol-3-ona (0,5, l,9mmol), bis(pinacolato)diboro (0,53g; 2,lmmol), PdCl2dppf (0,047g, 0,058mmol) e KOAc (0,56g, 5,7mmol) em dioxano (lOmL) . o solvente é removido in vacuo e o resíduo é partilhado entre DCM e água. A camada orgânica é lavada com sat NaHCCb e HC1 2M, seca sobre MgS04, filtrada e evaporada para proporcionar o composto em epígrafe (990mg, 169%) utilizado no passo seguinte sem mais purificação.

Passo 2: Éster terc-butílico do ácido (4-morfolin-4-il-fenil)-[5- (1,1, 3~trioxo~2, 3-di-hidro-lH-lÀ6-benzo[d]isotiazol-6-il)-[1,2, 4]triazolo[1, 5-a]pirazin-8-il]-carbâmico

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4 utilizando éster terc-butílico do ácido (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-carbâmico (170mg, 0,36mmol), 1.1- dioxo-6-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)- 1.2- di-hidro-lX6-benzo[d]isotiazol-3-ona (374mg, 0,72mmol) e Pd(PPh3)4 (lOOmg, 0, 082mmol) em Na2C03 1,5M (2mL, 3mmol) e dioxano (6mL). A purificação da mistura reaccional por cromatografia em coluna sobre sílica gel utilizando éter de 117 petróleo:acetato de etilo 1:1 proporciona um composto ainda impuro. Uma segunda cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM:MeOH 10:1 proporciona o composto em epígrafe (91mg, 44%).

Passo 3: 6-[8-(4-Morfolin-4-il~fenilamino)~ [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-1,1-dioxo-l, 2-di-hidro-1λ6 -benzo[d]isotiazol-3-ona

Uma suspensão de éster terc-butílico do ácido (4-morfolin-4-il-fenil)-[5-(l,l,3-trioxo-2,3-di-hidro-lH-lX6-benzo[d]isotiazol-6-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-carbâmico (lOOmg, 0,173mmol) em HC1 4M (2,5mL) em dioxano é agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. O solvente é removido sob vácuo e o resíduo é triturado com DCM, éter dietílico e éter de petróleo para proporcionar o composto em epígrafe (84mg, 100%) . RMN de 1R (400MHz, d6- DMSO) δ(ppm) 3,25 (4H, m) , 3,85 (4H, m) , 7,20 (2H, d), 7,88 (2H, d) , 8,16 (1H, d) , 8,24 (1H, s ) , 8,58 (1H, d), 8,82 (2H, s) , 8,96 (1H, s ), 10,31 (1H, s) . LCMS: Tr 2,31min (95,7%), m/z (APCI) 478 (M+H)+.

Composto 54: Amida do ácido 4-{8-[6-(4- [ciclopropilmetil]piperazin-l-il)-piridin-3-ilamino]-[1,2,4]triazolo [1,5-a]pirazin-5-il}tiofeno-2-carboxílico 118

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos descritos para o Composto 120, utilizando (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-[6-(4- [ciclopropilmetil]piperazin-l-il)piridin-3-il]amina no passo 4. LCMS: Tr = 0,85 min (95 %), m/z (ESI) 476 (M+H)+.

Composto 55: Amida do ácido 4-{8-[6-(4-isopropilpiperazin-1-il)piridin-3-ilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}tiofeno-2-carboxílico

HN

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos como descritos para o Composto 167, utilizando (5-bromo- 119 [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)—[6—(4— isopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il]amina no Passo 4. LCMS: Tr = 0,82 min (95 %), m/z (ESI) 464 (M+H)+.

Composto 56: Amida do ácido 4-(8-{6-[4-(2,2,2- trifluoroetil)piperazin-l-il]-piridin-3-ilamino}- [1.2.4] triazolo[1,5—a]pirazin—5—il)tiofeno—2—carboxilico

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos como descritos para o Composto 167, utilizando (5-bromo- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-{6-[4-(2,2,2- trifluoroetil)piperazin-l-il]-piridin-3-il}amina no passo 4. LCMS: Tr = 0,99 min (95 %), mlz (ESI) 504 (M+H)+.

Composto 57: Amida do ácido 4—(8—{4—[4—(2,2,2— trifluoroetil)piperazin-l-il]-fenilamino}- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)tiofeno-2-carboxilico 120

ΗΝ

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 58, utilizando (5-bromo- [1.2.4] triazolo[l, 5-a]pirazin-8-il)—{4—[4— (2,2,2 — trifluoroetil)piperazin-l-il]fenil}amina. LCMS: Tr = 1,07 min (95 %), m/z (ESI) 503 (M+H)+.

Composto 58: Amida do ácido 4—{8—[4—(4— (ciclopropilmetil)piperazin-l-il)-fenilamino]- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}tiofeno-2-carboxilico

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 46, utilizando ácido 2- 121 (aminocarbonil)tiofeno-4-borónico. LCMS: Tr = 0,93 (95 %) , m/z (ESI) 475 (M+H)+.

Composto 59: [4-(4-Ciclopropilpiperazin-l-il)fenil]-[5-(1H- pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]amina

N-N H

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 46, utilizando (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4- ciclopropilpiperazin-l-il)-fenil]amina. LCMS: Tr = 0,84 (95 %), m/z (ESI) 402 (M+H)+.

Composto 60: [6-(4-Ciclopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il]-[5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]amina

r^N

N-N H 122

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos descritos para o Composto 120, utilizando (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-[6-(4- ciclopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il]amina no passo 4. LCMS: Tr = 0,76 min (95 %), m/z (ESI) 403 (M+H)+.

Composto 61: Amida do ácido 4-[8-(4-morfolin-4-ilfenilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]tiazole-2-carboxílico

h2n

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 73, utilizando amoniaco (7 M em MeOH) no passo 3. LCMS: Tr = 1,00 min (95 %) , m/z (ESI) 423 (M+H)+.

Composto 62: Amida do ácido 4-{8-[4-(4-isopropilpiperazin-1-il)fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}tiazole-2-carboxílico 123

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 61, utilizando (5-bromo[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-isopropilpiperazin-l-il)-fenil]amina no passo final. LCMS : tr = 0,96 min (95 %), m/z (ESI) 464 (M+H)+.

Composto 63: Amida do ácido 4-(8-{4-[l-(2,2,2- trifluoroetil)piperidin-4-il]fenilamino}- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)tiofeno-2-carboxílico

Passo 1: l-Trlfluoroacetil-4-(4-nitrofenil)piperidina

Trietilamina (1,0 mL, 7,3 mmol) e 4-(4-nitrofenil)piperidina (1,0 g, 4,8 mmol) são agitadas em DCM (25 mL) a 0°C sob N2 e é adicionado anidrido trifluoroacético (0,81 mL, 5,8 mmol). A mistura é agitada durante três dias, deixando a temperatura aquecer até à 124 t.a.. A solução é em seguida diluída com DCM (50 mL) e lavada com água (2 x 15 mL) , NaHCCU (aq. 50% sat., 2 x 15 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (15 mL). 0 solvente é seco sobre MgSC>4 e evaporado para proporcionar o composto desejado (1,46 g, 4,66 mmol).

Passo 2: 1-(2, 2, 2-Trifluoroetil)-4-(4-nitrofenil)piperidina

Uma solução de 1-trifluoroacetil-4-(4-nitrofenil)piperidina (1,42 g, 4,7 mmol) em THF (15 mL) é agitada num balão de 2 tubuladuras de 25 mL munido com um condensador e um funil de carga equalizador de pressão. O sistema é purgado com N2, é adicionado NaBH4 (210 mg, 5,6 mmol) e o balão é arrefecido até 0°C. É em seguida adicionada uma solução de iodo (600 mg, 2,3 mmol) em THF (5 mL) gota a gota ao longo de 20 minutos, após o que o funil de carga é removido e a mistura aquecida a refluxo dum dia para o outro. A suspensão amarela pálida resultante é arrefecida até à t.a. e é cuidadosamente adicionado MeOH (1,5 mL), originando uma libertação vigorosa de um gás A evaporação dos solventes proporciona o composto em epígrafe, o qual é utilizado sem mais purificação.

Passo 3: 4-[1-(2,2,2-Trifluoroetil)piperidin-4- il]fenilamina 125

Formato de amónio (1,38 g, 22 mmol) e Pd a 10%/C (230 mg, 0,2 mmol) são adicionados a uma solução de 1-(2,2,2- trifluoroetil)-4-(4-nitrofenil)piperidina (1,26 g, 4,4 mmol) em EtOH (10 mL) e AcOEt (10 mL) . A suspensão é aquecida a refluxo durante 24 horas, adicionando mais

porções de formato de amónio (2 g) após 4 h e 8 h. A mistura é filtrada através de celite e evaporada para proporcionar um sólido laranja. Este é partilhado entre DCM (40 mL) e água (20 mL) e as camadas separadas. A fase aquosa é extraida com DCM (2 x 20 mL) e as camadas orgânicas combinadas são secas sobre MgS04 e evaporadas sob pressão reduzida para proporcionar iV— {4—[1—(2,2,2 — trifluoroetil)piperidin-4-il]fenil}formamida como um sólido laranja pálido (980 mg).

Uma solução da formamida em MeOH (20 mL) é agitada à t.a. e é adicionado HC1 (conc., 1 mL) . A solução púrpura escura é aquecida a refluxo durante 1 h, arrefecida e o MeOH é evaporado. O resíduo é agitado com água (20 mL) e é adicionado NaHC03 (sat. aq.) até terminar a formação de bolhas. A mistura é extraída com DCM (20 mL, 2 x 10 mL) e os extractos combinados são secos sobre MgS04 e evaporados sob pressão reduzida para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido laranja (870 mg).

Este material é utilizado para preparar amida do ácido 4-(8—{4—[1—(2,2,2-trifluoroetil)piperidin-4-il]fenilamino}- 126 [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)tiofeno-2-carboxílico utilizando métodos análogos aos utilizados para o Composto 89 . 126

LCMS: Tr = 2,11 min (100%), m/z (ESI) 502 (M+H)+.

Composto 65: 5-(8-(4-(2-Morfolinoetoxi)fenilamino)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)isoindolin-l-ona

Passo 1: (5-Bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-[4- (2-morfolin-4-il-etoxi)-fenil]-amina O.

NH

Br

Segundo o procedimento descrito para o Composto 6, passo 1, 5,8-dibromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazina (0,5g, l,799mmol), 4-(2-morfolin-4-il-etoxi)-fenilamina (0,6g, 4,5mmol) e N, IV-diisopropiletilamina (0,47mL, 2,7mmol) em 2- 127 propanol (6mL) são agitadas a 95°C dum dia para o outro. Após evaporação do solvente o resíduo é dissolvido em DCM e lavado com água (2x) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica é seca sobre MgSCb, filtrada e concentrada in vacuo para proporcionar um óleo purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel. A eluição com uma mistura de DCMrMeOH 97:3 dá o composto em epígrafe (650mg 86%) como um sólido amarelo claro. LCMS: Tr 2,06min (97,7%) .

Passo 2: 5-(8-(4-(2-Morfolinoetoxi)fenilamino)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazln-5-il)isoindolin-l-ona -0 HN"

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos como descritos para o Composto 6, passo 4, utilizando (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(2-morfolin-4-il-etoxi)-fenil]-amina (80mg, 0,19mmol), 5-(4,4,5,5- tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-2,3-di-hidro-isoindol-1-ona (74mg, 0,29mmol) e Pd(PPh3)4 (55mg, 0,047mmol) em

Na2CC>3 1,5M (l,02mL, l,53mmol) e dioxano (3mL) . A mistura reaccional é purificada por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM e uma mistura de DCM:NH3 (7M em MeOH) 97:3. Após trituração utilizando éter dietílico, o composto em epígrafe é isolado como um sólido (61,9mg, 69%) . A conversão do material no sal de mesilato, 128 utilizando ácido metanossulfónico 1M (0,134mL) em MeOH, proporciona o composto em epígrafe (57,lmg) . RMN de ΤΗ (400MHz, de-DMSO) δ(ppm) 2,40 (3H, s, MsOH), 3,25-3,38 (2H, m) , 3,60-3,78 (4H, m) , 3,84 (2H, t) , 4,09 (2H, d), 4,45 (2H, m) , 4,56 (2H, s) , 7, 14 (2H, d), 7, 90 (1H, d), 8,05- 8,19 (4H, m) , 8,28 (1H, s) , 8,76 (1H, - s 1) , 8,79 (1H, s), 10,00 (1H, s 1 ), io ,16 (1H, s) . LCMS : Tr 1, 9 8min (99,1%), m/z (APCI) 472 (M+H) +

Composto 67: N-(2-Fluoro-4-morfolinofenil)-5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-amina

Passo 1: (5-Bromo-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)- (2- fluoro-4-morfolin-4-il-fenil)-amina

Br

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 1, utilizando 5,8-dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina (0,105g, 0,89mmol), 2-fluoro-4-morfoiin-4-il-fenilamina (93mg, 0,474mmol), DIPEA (0,123mL, 0,706mmol) e 1,4-diazabiciclo[2.2.2]octano (53mg, 0,472mmol) em 2-propanol (2mL). A mistura reaccional é partilhada entre DCM e solução de ácido cítrico a 10% (aq) , a camada orgânica é separada e lavada com solução de ácido cítrico a 10%, água e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca sobre MgS04, filtrada e concentrada in vacuo. O composto em epígrafe é isolado como um sólido 129 vermelho pálido (77mg, 42%) e utilizado no passo seguinte sem mais purificação. LCMS: Tr 3,48min (89%).

Passo 2: N-(2-Fluoro-4-morfolinofenil)-5-(lH-pirazol-4-il) -[1,2, 4]triazolo[l,5~a]pirazin-8-amina

n-n H

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4, utilizando (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(2-fluoro-4-morfolin-4-il-fenil)-amina (80mg, 0,203mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil- [ 1,3,2]dioxaborolan-2-il)-ΙΗ-pirazole (79mg, 0,406mmol) e

Pd(PPh3)4 (59mg, 0,051mmol) em Na2C03 1,5N (l,09mL, l,62mmol) e dioxano (3,25mL). A mistura reaccional é purificada por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM:NH3 (7M em MeOH) 97:3. As fracções contendo o produto são combinadas e evaporadas in vacuo para proporcionar um sólido o qual é triturado com éter dietílico e éter de petróleo para produzir o composto em epígrafe (29mg, 38%). LCMS: Tr 2,90min (96%). A conversão no sal de mesilato utilizando solução de ácido metanossulfónico 0,1 M em MeOH (0,762mL, 0,076mmol) proporciona o composto em epígrafe (35mg). RMN de ΧΗ (400MHz, d6-DMSO) δ (ppm) 2,36 (3H, s, MsOH) , 3,19 (4H, m) , 3,79 (4H, m) , 6, 84-6, 94 (2H, m) , 7,54 (1H, t), 8,08 (1H, 130 s), 8,48 (2H, s), 8,76 (1H, s), 9,31 (1H, s) . LCMS: Tr 2,9lmin (95,4%), m/z (APCI) 381 (M+H)+.

Composto 70: (4-(8-(4-Morfolinofenilamino)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)-lH-pirazol-5-il)metanol

Passo 1: 4-Bromo-5- (terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-1H-pirazole

Uma solução de (4-bromo-2H-pirazol-3-il)-metanol (0,64mg, 3,63mmol), cloreto de terc-butildimetilsililo (0,82g, 5,45mmol) e imidazole (0,42g, 6,18mmol) em N,N- dimetilformamida (20mL) é agitada à temperatura ambiente dum dia para o outro. A mistura reaccional é diluída com uma mistura 50:50 de éter dietílico:acetato de etilo e lavada com água (3x). As camadas orgânicas são secas sobre MgS04, filtradas e concentradas. O resíduo é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com éter de petróleo:acetato de etilo 80:20 para proporcionar o composto em epígrafe (l,035g, 98%).

Passo 2: 4-Bromo-3- (terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-pirazole e 4-Bromo-5- (terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-1- (tetra-hidro-piran-2-il)-lH-pirazole

131 4-Bromo-5-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-lH-pirazole (lg, 3,45mmol) é dissolvido em 3,4-di-hidro-2H-pirano (0,944mL, 10,34mmol) na presença de uma quantidade catalítica de TFA (0,0026mL, 0,035mmol). A mistura reaccional é agitada a 90°C durante 18 horas, arrefecida e em seguida desactivada utilizando NaH (4,69mg, 0,206mmol).

Depois de remover o solvente, o resíduo é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com uma mistura de éter de petróleo-acetato de etilo 95:5, seguido de éter de petróleo-acetato de etilo 90:10. As fracções contendo os compostos desejados são recolhidas e concentradas in vacuo para proporcionar 4-bromo-3-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-ΙΗ-pirazole e 4-bromo-5-(terc-butil-dimetil- silaniloximetil)-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-pirazole (724mg, 56%).

Passo 3: Éster terc-butilico do ácido {5-[5-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-1-(tetra-hidro-piran-2-il) -1H-pirazol-4-il]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il}- (4-morfolin-4-il-fenil)-carbâmico e Éster terc-butilico do ácido {5-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-lH-pirazol-4-il]-[1,1, 4]triazolo[1, 5-a]pirazin-8-il}~(4-morfolin-4-il-fenil)-carbâmico

132

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos como descritos para o Composto 35, passo 3 utilizando éster terc-butilico do ácido (4-morfolin-4-il-fenil)-(5- tributilestananil-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-carbâmico (210mg, 0,30mmol) 4-bromo-3-(terc-butil-dimetil- silaniloximetil)-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-ΙΗ-pirazole e 4-bromo-5-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-1-(tetra-hidro-piran-2-il)-ΙΗ-pirazole (170mg, 0,45mmol) e tetraquis(trifenilfosfina)paládio(0) (35mg, 0,030mmol) em DMF (4mL) . 0 composto em bruto é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com éter de petróleo:acetato de etilo 7:3 em seguida 3:7 para proporcionar os compostos em epígrafe (62,5mg).

Passo 4: (4-(8-(4-Morfolinofenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il)-lH-pirazol-5-il)metanol

N-N H

Uma solução de {5-[3-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-1-(tetra-hidro-piran-3-il)-lH-pirazol-4-il]- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-il}-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina e {5-[5-(terc-butil-dimetil-silaniloximetil)-l-(tetra-hidro-piran-3-il)-lH-pirazol-4-il]- [1.2.4] triazolo [l,5-a]pirazin-8-il}-(4-morfolin-4-il- fenil)-amina (53,6mg, 0,077mmol) e HC1 conc. (0,27mL) em

MeOH (5mL) é agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. Depois de remover o solvente, o resíduo é partilhado 133 entre acetato de etilo e água. A camada aquosa é lavada com acetato de etilo (3x) e as camadas orgânicas combinadas são secas sobre MgS04, filtradas e concentradas. 0 resíduo é dissolvido em HC1 4M em dioxano, concentrado in vacuo e em seguida partilhado entre acetato de etilo e NaHCCb sat.. A camada orgânica é seca sobre MgS04, filtrada e concentrada in vacuo para proporcionar um composto em bruto purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel. 0 composto em epígrafe é isolado eluindo com AcOEt e uma mistura de DCM:MeOH 95:5 (5,4mg, 18%). RMN de XH (400MHz, d6-DMSO) δ (ppm) 3,11 (4H, m) , 3,79 (4H, m) , 4,65 (2H, d), 5,25 e 5,53 (1H, s 1), 6,99 (2H, m) , 7,84 e 8,51 (1H, s 1), 7,92 (2H, d), 8,12 (1H, d), 8,70 (1H, s), 9,74 (1H, s), 13,12 e 13,23 (1H, s 1). LCMS: Tr 2,26min (96,2%), m/z (APCI) 393 (M+H)+.

Composto 73: Metilamida do ácido 4-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-tiazole-2-carboxilico

Passo 1: 2, 4-Dibromotiazole

Br

Br

Tiazolidinona (3,43 g, 29,32 mmol) e POBr3 (25 g, 87,96 mmol, 3 equiv.) são misturados sob azoto como sólidos. A mistura reaccional é em seguida aquecida até 110°C sob agitação durante 3 h originando a formação de um xarope preto. A mistura reaccional é em seguida deixada arrefecer 134 até à temperatura ambiente e é muito cuidadosamente adicionada uma mistura de água/gelo (200 mL) . A suspensão cinzenta resultante é extraída com éter dietílico (3 x 50 mL), as camadas orgânicas são combinadas, filtradas através de um tampão de sílica e evaporadas para proporcionar o composto em epígrafe como um óleo laranja (4 g, 57%) o qual é utilizado no passo seguinte sem mais purificação.

Passo 2: Éster etílico do ácido 4-bromotiazole-2~ carboxílico

Br A uma solução de dibromotiazole (1 g, 4,15 mmol) em THF (15 mL) a 0°C, é adicionada gota a gota uma solução de iPrMgCl em THF (2 M, 2,3 mL, 4,57 mmol, 1,10 equiv.). A reacção é agitada a 0°C durante 0,25 h. À solução laranja resultante é adicionado carbonato de dietilo (3 mL) em THF (5 mL), via uma cânula. A solução verde resultante é ainda agitada à temperatura ambiente durante 0,5 h, altura em que a reacção é desactivada adicionando NH4C1 saturado. O composto em epígrafe é purificado por LC utilizando ciclo-hexano/DCM 6/4 como o eluente para proporcionar 514,2 mg (52%) do composto em epígrafe como um sólido pulverulento amarelo pálido.

Passo 3: Metilamida do ácido 4-bromotiazole-2-carboxílico 135 135

Br 0 éster etílico do ácido 4-bromotiazole-2-carboxílico (500 mg, 2,13 mmol) é dissolvido em metanol (1 mL) e é adicionada metilamina em metanol (10 mL) . A mistura é agitada dum dia para o outro à temperatura ambiente. A evaporação do solvente sob pressão reduzida proporciona o composto em epígrafe como um sólido amarelo. LCMS: Tr 0,92 min (100%) m/z (ESI) 219/221 (M+H)+.

Passo 4: Metilamida do ácido 4-[8- (4-morfolin-4-il- fenilamino)-[1,2,4]triazolo[1, 5-a]pirazin-5-il]-tiazole-2-carboxílico

HN \ A metilamida do ácido 4-bromotiazole-2-carboxílico é convertida ao boronato de um modo análogo ao descrito para o Composto 6, Passo 3. 0 composto em epígrafe é em seguida preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 136 120, passo 4. LCMS: Tr = 1,06 min (95 %) , m/z (ESI) 437 (M+H)+.

Composto 79: 5-(8-(6-(4-Isopropilpiperazin-l-il)piridin-3- ilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)isoindolin-1-ona

Passo 1: Éster metílico do ácido 4-bromo-2-bromometil-benzóico

Br

Ácido 4-bromo-2-metil-benzóico (4,6 g, 21,39 mmol) é dissolvido em HC1 2M em MeOH e aquecido a refluxo durante 3 horas. O solvente é evaporado para dar o éster metílico do ácido 4-bromo-2-metil-benzóico (4,24 g, 86 %) . Este intermediário (18,51 mmol) é dissolvido em tetracloreto de carbono (100 mL) e é adicionada N-bromossuccinimida (NBS) (5,57 g, 24,06 mmol). Em seguida é adicionado AIBN (122 mg, 740 ymol) e a mistura purgada com azoto durante 5 min. A mistura reaccional é em seguida aquecida a refluxo durante 4 horas. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente a mistura reaccional é filtrada e o filtrado é evaporado. O residuo é purificado por cromatografia "flash" (sílica gel, éter de petróleo/acetato de etilo 2:1) para dar o composto em epígrafe (3,42g, 60 %) .

Passo 2: 5-Bromo-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona 137

Éster metílico do ácido 4-bromo-2-bromometil-benzóico (0,5g, 16,2mmol) é tratado com amoníaco metanólico (lOmL, NH3 7 N em MeOH) durante 5 minutos a 90°C. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente é formado um precipitado, recolhido por filtração e lavado com uma pequena quantidade de metanol para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido incolor (224mg, 65%) . RMN de ΤΗ (400MHz, de-DMSO) δ (ppm) 4,41 (2H, s), 7,64 (1H, d), 7,70 (1H, d), 7,87 (1H, s), 8,67 (1H, s 1). LCMS: Tr 2,49min, (99,6%), m/z (APCI) 212 (M+H)+.

Passo 3: 5-(4, 4, 5, 5-Tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)- 2, 3-di-hidro-isoindol-l-ona

5-Bromo-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona (230mg, l,08mmol), bis(pinacolato)diboro (300mg, l,18mmol), PdCl2dppf (25mg, 31pmol) e KOAc (320mg, 3,26mmol) são suspendidos em dioxano (4mL), purgados com azoto durante 5 minutos e em seguida aquecidos a 85°C dum dia para o outro. O solvente é removido in vácuo e o resíduo partilhado entre acetato de etilo e água. A camada aquosa é extraída com acetato de etilo (3x) e as fases orgânicas combinadas são lavadas uma 138 vez com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, filtrada através de MgSCq e evaporada. 0 residuo sólido é triturado com hexano e seco in vacuo para produzir o composto em epígrafe (185mg, 66 %) como um sólido cinzento. RMN de ΧΗ (400MHz, CDC13) δ (ppm) 1,37 (12H, s), 4,45 (2H, s), 6,38 (1H, s 1), 7,87 (1H, d), 7,93 (2H, m).

Passo 4: l-Isopropil-4-(5-nitro-piridin-2-il)-piperazina

A uma solução de 2-cloro-5-nitropiridina (2,5g, 15,7mmol) em THF (25mL), são adicionados 1-isopropilpiperazina (2,01g, 15,7mmol) e K2CO3 (3,25g, 23,6mmol). A mistura reaccional é agitada a 50°C durante 4 horas e em seguida a 70°C dum dia para o outro. 0 solvente é removido in vacuo e o sólido laranja resultante é triturado utilizando éter de petróleo-éter dietílico 10:1. O composto isolado (3,7g, 94%) é utilizado no passo seguinte sem mais purificação.

Passo 5: 6- (4-Isopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-il-amina

(0, 9g, l-Isopropil-4-(5-nitro-piridin-2-il)-piperazina 3,6mmol) é dissolvida em MeOH (20 mL) e é adicionado di-hidrato de dicloreto de estanho (II) (4g, 18mmol). A mistura é arrefecida utilizando um banho de água e é 139 adicionado HC1 conc. (4mL). A reacção é agitada à temperatura ambiente dum dia para o outro. Depois de remover o metanol, a solução amarela clara resultante é basificada utilizando NaOH conc. (pH 11) e formou-se um precipitado branco. 0 sólido é recolhido por filtração e a água é extraída com éter dietílico (5x). As camadas orgânicas são combinadas, secas sobre MgS04, filtradas, concentradas sob vácuo para proporcionar um óleo laranja que cristaliza em repouso para proporcionar um sólido laranja (0,68g, 86%).

Passo 6: 5-Bromo-8-(6-(4-isopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il)-[1,2, 4] triazolo [1, 5-a]pirazin-8-amina

Br

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 1, utilizando 5,8-dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina (0,188g, 0,68mmol), 6- ( 4-isopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-ilamina (0,18 Og, 0,816mmol) e N-etildiisopropil-amina (0,20mL, l,02mmol) em 2-propanol (2mL). A purificação do material em bruto por cromatografia em coluna sobre sílica gel, utilizando DCM seguido de DCM:MeOH 95:5, proporciona o composto em epígrafe como um sólido castanho pálido (260mg, 92%). 140

Passo 5: 5-(8-(6-(4-isopropilpiperazin-l-il)pirldin-3- ilamino)-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)isoindolin-1-ona

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4, utilizando 5-bromo-IV-(6-(4-isopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il)-[ 1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-amina (50mg, 0,12mmol), 5- (4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona (56mg, 0,216mmol) e Pd(PPh3)4 (35mg, 0,03mmol) em Na2C03 1,5M (0,64mL) e dioxano (2mL). O produto em bruto é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM:MeOH 95:5 seguido de DCM:MeOH 90:10. O composto em epígrafe é obtido após trituração com uma mistura de n-hexano:DCM 10:1 (19mg, 34%). A conversão no sal de mesilato, utilizando ácido metanossulfónico 0,1M (0,35mL), dá o composto em epígrafe como um sólido amarelo (20mg, 69%). RMN de XH (400MHz, d6-DMSO) õ(ppm) 1,34 (6H, d), 2,36 (6H, s, 2xMsOH), 3,16-3,21 (5H, m) , 3,57 (2H, m), 4,45 (2H, d), 4,52 (2H, s), 7,11 (1H, d), 7,86 (1H, d), 8,01 (1H, s), 8,10 (1H, d), 8, 24-8,29 (2H, m) , 8,72 (1H, s) , 8,76 (1H, s), 8,82 (1H, d), 9,39 (1H, s 1), 10,21 (1H, s) . LCMS: Tr 1,92min (98,5%), m/z (APCI) 470 (M+H)+. 141

Composto 80: Amida do ácido 3-[8-(4-morfolin-4- ilfenilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-benzo[b]tiofeno-7-carboxílico

Passo 1: l-Bromo-2-(2-etoxivinilsulfanil)benzeno

Br S s o Λ A uma solução de 2-bromotiofenol (10,50 g, 55,87 mmol) em DMF seco (50 mL) sob azoto é cuidadosamente adicionado carbonato de potássio (9,2 mL, 61,46 mmol, 1,10 equiv.). Uma vez finalizada a formação de bolhas, é adicionado 2-bromo-1,1-dietoxietano (8,46 g, 61,46 mmol, 1,10 equiv.) à mistura e agitada durante 2h à temperatura ambiente. A suspensão resultante é vertida para 200mL de água gelada e extraída com éter dietílico (3 x 50 mL). As camadas orgânicas são lavadas com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secas sobre MgS04 para proporcionar, após remoção do solvente, o composto em epígrafe como um óleo laranja viscoso, utilizado sem mais purificação.

Passo 2: 7-bromobenzo[b]tio feno

Br 142 l-Bromo-2-(2-etoxivinilsulfanil)benzeno é dissolvido em clorobenzeno, (50 mL) e a solução é aquecida até 70 °C. Em seguida é cuidadosamente adicionado PPA (10,5 mL) e a mistura bifásica é aquecida a 150°C dum dia para o outro. O xarope escuro resultante é deixado arrefecer e o solvente sobrenadante removido com uma pipeta. É adicionado clorobenzeno (15mL) ao resíduo e aquecido até 150°C durante 30 min. O solvente é novamente removido e o resíduo lavado com pequenas quantidades de diclorometano até as lavagens serem transparentes. As fracções orgânicas são combinadas e filtradas através de celite para proporcionar uma solução amarela transparente. A concentração sob vácuo seguida de LC utilizando ciclo-hexano como o eluente proporcionou o composto em epígrafe como um óleo incolor viscoso (1,21 g, 35%) .

Passo 3: Éster etílico do ácido benzo[b]tiofeno-7- carboxílico

7-bromobenzo[b]tiofeno (500 mg, 2,36 mmol) é dissolvido em THF seco (5,0 mL) sob azoto. São adicionadas aparas de magnésio (530 mg, 2,83 mmol, 1,20 equiv.) e a mistura resultante é aquecida a refluxo até ocorrer a dissolução do magnésio. A solução amarela turva resultante é deixada arrefecer até à t.a. e é adicionado carbonato de dietilo (2 mL, excesso) e a agitação prosseguida durante uma hora, altura em que é adicionado cloreto de amónio (aq a 10%). A mistura resultante é partilhada entre DCM e água e a camada 143 aquosa é extraída com DCM. As fracções orgânicas são combinadas, lavadas com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, secas sobre Na2SC>4 e adsorvidas sobre sílica. A purificação por LC utilizando ciclo-hexano/diclorometano 8/2 como o eluente proporcionou o composto em epígrafe como um óleo laranja pálido (346,2 mg, 71%).

Step4: Ácido benzo[b]tiofeno-7-carboxílico

O UM A uma solução de éster etilico do ácido benzo[b]tiofeno-7-carboxílico (1,0 g, 48 mmol) em metanol (10 mL) e água (10 mL) é adicionado hidróxido de sódio (5 g, excesso). A solução é agitada à temperatura ambiente durante 30 min, altura em que todo o éster foi consumido. A mistura reaccional é ajustada até pH 1 adicionando solução de HC1 6M e extraída com DCM. As camadas orgânicas combinadas são filtradas através de um tampão de sílica para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido amarelo (505,2 mg, 59%) .

Passo 5: Ãmida do ácido benzo[b]tiofeno-7-carboxílico

O nm2

Uma solução de ácido benzo[b]tiofeno-7-carboxílico (505 mg, 2,84 mmol) em diclorometano (10 mL) é agitada à t.a. e é 144 adicionado cloreto de tionilo (669 mg, 5,68 mmol, 2,0 equiv.), seguido de DMF (0,06 mL) , originando libertação gasosa. A solução resultante é agitada à t.a. durante 1 hora. Em seguida é cautelosamente adicionado amoníaco aquoso (10 mL) à mistura originando libertação gasosa vigorosa. A mistura resultante é em seguida diluída com água (50 mL) , e o pH é trazido até neutro adicionando NaHCCb saturado (aq.). A camada aquosa é extraída com DCM, e as camadas orgânicas são combinadas e secas sobre Na2S04. A evaporação do solvente sob pressão reduzida proporciona o composto em epígrafe (81% puro) como um sólido amarelo (500 mg, 98%) o qual é utilizado sem mais purificação.

Passo 6: Amida do ácido 3-bromobenzo[b]tiofeno-7- carboxilico

Br

O NH. '2

Uma solução de amida do ácido benzo[b]tiofeno-7-carboxílico (500 mg, 2,82 mmol) em diclorometano (5 mL) é agitada à t.a. e é adicionado ácido acético (5 mL) seguido de NBS (750 mg, 4,23 mmol, 1,5 equiv.). A reacção é agitada à temperatura ambiente durante 1 hora altura em que a análise por LC-MS mostra conversão total do material de partida no composto desejado (79%) e material dibromado (21%). A reacção é diluída com água (50 mL), neutralizada com dissulfito de potássio aquoso, seguido de bicarbonato de sódio. A camada aquosa é em seguida extraída com diclorometano e as camadas orgânicas resultantes são combinadas, lavadas com solução aquosa saturada de cloreto 145 de sódio, secas sobre Na2S04 e evaporadas. 0 material em bruto é purificado por LC utilizando DCM como o eluente para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido branco (300 mg, 41%).

Passo 7: Amida do ácido 3-(4,4,5,5- tetrametil[1,3,2]dioxaborolan-2-il)benzo[b]tiofeno-7-carboxílico

Uma solução de amida do ácido 3-bromobenzo[b]tiofeno-7-carboxílico (300 mg, 1,18 mmol) em dioxano (5 mL) é agitada sob azoto. São adicionados Pd(dppf)Cl2 (29 mg, 3% molar), acetato de potássio (230 mg, 2,35 mmol, 2,0 equiv.) e bispinacolato de diboro (450 mg, 1,77 mmol, 1,5 equiv.) e a reacção é aquecida até 80°C e agitada dum dia para o outro. A suspensão laranja resultante é diluída com DCM, filtrada através de celite e concentrada sob vácuo para proporcionar um óleo que é utilizado no passo seguinte sem mais purificação.

Passo 8: Amida do ácido 3-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-benzo[b]tiofeno-7-carboxílico 146

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos como descritos para o Composto 120, Passo 4. RMN de ΤΗ (400MHz, d6-DMS0) δ(ppm) 3,19 (4H, s D, 3,76 (4H, S D , 5, 70 (1H, d), 7,12 (2H, m) , 7, .43 (1H, t), 7,63 (1H, s 1), 7, 76- 7, 80 (2H, m) , 7,92 (1H, d), 8,03 (1H, d) , 8,21 (1H, s) , 8,28 (1H, s), 8,6 (1H, s ), 10,09 (1H, s) . LCMS : Tr = 1, 01 min (95%), m/ z (ESI) 472 (M+H)+.

Composto 81: Amida do ácido 3-{8-[4-(4-isopropilpiperazin-1-il)fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-iljbenzo[b]tiofeno-7-carboxílico

147

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 80, utilizando (5- bromo[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-[4 - (4-isopropilpiperazin-l-il)-fenil]amina no passo final. LCMS : tr = 0,94 min (95 %), m/z (ESI) 513 (M+H)+.

Composto 83: (4-{8-[4-(4-Isopropilpiperazin-l-il)- fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}piridin-2-11)metanol

Passo 1: 1-Óxido de 4-bromo-2-metilpiridina

Br

N

I

O

Uma solução de 4-bromo-2-metilpiridina (5 g, 29 mmol) em DCM (20 mL) é arrefecida até 0°C e é adicionado m-CPBA (7,55 g, 43,87 mmol, 1,5 equiv.) em porções ao longo de 30 min. O banho de gelo é em seguida retirado e a mistura é deixada agitar à temperatura ambiente durante 3 horas. A solução resultante é diluída com bicarbonato de sódio (aq. sat.) e extraída com DCM. As camadas orgânicas são combinadas, lavadas com bicarbonato de sódio (aq. sat.), secas sobre Na2SC>4 e concentradas sob vácuo para proporcionar o composto em epígrafe como um óleo laranja pálido o qual é sem mais purificação.

Passo 2: Éster de 4-bromopiridin-2-ilmetilo do ácido acético 148

A uma solução de 1-óxido de 4-bromo-2-metilpiridina (4,00 g, 21,40 mmol) em DCM (20 mL) é adicionado anidrido acético (6 mL) . A mistura é agitada à temperatura ambiente durante 1 hora e em seguida aquecida a refluxo dum dia para o outro. O solvente é removido sob vácuo e o produto em bruto é filtrado através de um tampão de sílica, eluindo com DCM para proporcionar o composto em epígrafe como um óleo laranja (815 mg).

Passo 3: Éster de 4- (4, 4, 5, 5-tetrametil-[1, 3,2]dioxaborolan-2-il)piridin-2-ilmetilo do ácido acético

Uma solução de éster de 4-bromopiridin-2-ilmetilo do ácido acético (800 mg, 3,49 mmol) em dioxano (5 mL) é agitada sob azoto. São adicionados Pd(dppf)Cl2 (85 mg, 3% molar), acetato de potássio (1,03 g, 10,5 mmol, 3,0 equiv.) e bispinacolato de diboro (1,33 g, 5,24 mmol, 1,5 equiv.), e a reacção é aquecida a 80 °C dum dia para o outro. A 149 suspensão laranja resultante é diluída com DCM, filtrada através de celite e concentrada sob vácuo para proporcionar um óleo que é utilizado no passo seguinte sem mais purificação.

Passo 4: Éster de 4-{8-[4-(4-isopropil-piperazin-l-il)- fenilamino]-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pyazin-5-il}-piridin-2-ilmetilo do ácido acético

O

Uma suspensão de (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-[ 4-(4-isopropil-piperazin-l-il)fenil]amina (300 mg, 0, 723 mmol) e Pd(dppf)Cl2 (59 mg, 10% molar) em dioxano/água 4/1 (5 mL) é agitada à t.a. e são adicionados carbonato de potássio (200 mg, 1,45 mmol, 2,0 equiv.) e éster de 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)piridin-2-ilmetilo do ácido acético (300 mg, 1,08 mmol, 1,5 equiv.)· A mistura resultante é aquecida a 85°C dum dia para o outro. A solução resultante é partilhada entre diclorometano e água, e a camada orgânica é concentrada sobre sílica e purificada por cromatografia em coluna (98/2 DCM/MeOH) para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido amarelo. LCMS: Tr = 0,78min (100%), m/z 445 (M+H)+. 150

Passo 5: (4-{8-[4-(4-Isopropilpiperazin-l-il)fenilamino]- [1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}piridin-2-il)metanol

Éster de 4-{8-[4-(4-isopropilpiperazin-l-il)fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}piridin-2-ilmetilo do ácido acético é agitado à temperatura ambiente dum dia para o outro em 10 mL de uma solução 1,5 M de carbonato de potássio em metanol. O pH é em seguida trazido até neutro pela adição de ácido cítrico aquoso a 10% e a mistura é extraída com DCM. A purificação por LC utilizando DCM/NH3 2M em MeOH 98/2 como o eluente proporciona o composto em epígrafe como um pc 1 amarelo (40,3 mg, 12,5% nos 2 passos). RMN de 1H (400MHz, d6-DMSO) δ(ppm) 1,02 (6H, m) , 2,33 (1H, m) , 2,60 (4H, ml), 3, 10 (4H, m 1) , 4,65 (2H, d) , 5,51 (1H, t) , 6,96 (2H, d) , 7, 84-7, 89 (3H, m) , 8,11 (1H, s), 8,17 (1H, m) , 8,61 (1H, d), 8,73 (1H, m) , 10,08 (1H, s) . LCMS: Tr = 0,78 min (100% ), m/z (ESI) 445 (M+H)+.

Composto 84: [ 4-(l-Isopropilpiperidin-4-il)fenil]-[5-(1H- pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]amina 151

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos como descritos para o Composto 92, utilizando ácido pirazole-4-borónico no passo 4. LCMS: Tr 0,89 min (100 %) m/z (ESI) 403 (M+H)+.

Composto 86: 4-(8-(6-(4-Isopropilpiperazin-l-il)piridin-3- ilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)furan-2-carboxamida

Passo 1: Amida do ácido 4-bromo-furan-2-carboxílico

o A uma solução de ácido 4,5-dibromo-furan-2-carboxílico (7,79g, 28,85mmol) em NH4OH (lOOmL) é adicionado zinco em pó (2,2 9 g, 34,62mmol) em pequenas porções. A mistura reaccional é agitada à temperatura ambiente durante 7 minutos em seguida filtrada sobre celite e lavada com água e HC1 2M. O filtrado é acidificado até pH 2 utilizando HC1 conc. e extraído com acetato de etilo (3x). A fase orgânica é lavada com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, 152 seca sobre MgS04, filtrada e concentrada in vacuo para dar um óleo (4,96g) o qual solidifica em repouso para dar um sólido branco, o qual é utilizado sem mais purificação. 0 sólido (4,93g, 25,81mmol) é dissolvido em cloreto de tionilo (44,2mL) e aquecido a refluxo durante 1 hora. Depois de remover o solvente in vacuo o resíduo é dissolvido em diclorometano (75mL) e é adicionada uma solução de NH3 0,5 M em dioxano (52mL) . A mistura reaccional é agitada à temperatura ambiente durante 1 hora, em seguida é adicionado NH3 aq. a 33% (5mL) e a reacção agitada durante mais 2 horas. O solvente é removido in vacuo e o resíduo refeito com uma solução de sat. de NaHC03. A solução básica é extraída utilizando acetato de etilo (3x), as camadas orgânicas combinadas são secas sobre MgS04 e concentradas in vacuo. A purificação por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com uma mistura de acetato de etilo:éter de petróleo:ácido acético (50:49:1) proporciona o composto em epígrafe (l,2g, 22%).

Passo 2: Amida do ácido 4- (4, 4, 5, 5-tetrametil- [1,3,2]dioxaborolan-2-il)furan-2-carboxílico

Ch o B'

O

Amida do ácido 4-bromo-furano-2-carboxílico (l,2g 6,32mmol), bis(pinacolato)diboro (l,76g, 6,94mmol)

PdCl2dppf (0,154g, 189mol) e KOAc (l,85g, 18,94mmol) são suspendidos em dioxano (20mL), purgados com azoto durante 5 153 minutos e em seguida aquecidos a 90°C dum dia para o outro. O solvente é removido in vacuo e o resíduo partilhado entre acetato de etilo e água. A camada aquosa é extraída três vezes com acetato de etilo e as fases orgânicas combinadas são lavadas com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, filtradas através de MgS04 e evaporadas. O resíduo sólido é triturado com hexano e seco in vacuo para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido (0,984g, 66%) .

Passo 3: 4-(8- (6- (4-Isopropilpiperazin-l-il)piridin-3- ilamino)-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)furan-2-carboxamida

Η 'H

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4 utilizando 5-bromo-8-(6-(4-isopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il)-[ 1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-amina (60mg, 0,144mmol), amida do ácido 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-furan-2-carboxílico (59mg, 0,26mmol) e Pd(PPh3)4 (42mg, 0,036mmol) em Na2C03 1,5M (0,8mL, l,15mmol) e dioxano (2mL). Após evaporação do solvente o material em bruto é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel utilizando DCM seguido de DCM:NH3 (7M em MeOH) 97,5:2,5 e 95:5. O composto em epígrafe é obtido como um sólido 154 amarelo (30mg, 47%). RMN de ΤΗ (400MHz, d6-DMSO) δ(ppm) 1, 05 (6H, d) , 2,54-2,59 (4H, m) , 2,70-2,74 (1H, m) , 3,47 (4H, m) , 6,90 (1H, d), 7, 60 (1H, s 1), 7,91 (1H, s), 7,99 (1H, s 1) , 8,12 (1H, dd), 8,19 (1H, s), 8,68 (1H, s), 8,75 (1H, s) , 8,81 (1H, s), 10,03 (1H, s) . LCMS: Tr 2,64min (98,1%), m/z (APCI) 406 (M+H)+. LCMS: Tr 2,74min (93%), m/z (ES +) 448 (M+H)+ .

Composto 88: 4-(8-(4-(4-Isopropilpiperazin-l- il)fenilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)furan-2-carboxamida

Passo 1: l-Isopropil-4-(4-nitro-fenil)-piperazina

A uma solução de 4-fluoronitrobenzeno (5g, 35,4mmol) em THF (50mL) são adicionados 1-isopropilpiperazina (4,54g, 35,4mmol) e K2CO3 (7,35g, 53,2mmol). A mistura reaccional é agitada à temperatura ambiente dum dia para o outro. 0 solvente é removido in vacuo e o resíduo é partilhado entre AcOEt e água. A camada orgânica é lavada com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca sobre MgS04, filtrada e concentrada. O composto em bruto é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel utilizando 99:1 e 98:2 DCM:NH3 (7M em MeOH) para dar o composto em epígrafe (8,2g, 94%) .

Passo 2: 4-(4-Isopropil-piperazin-l-il)-fenilamina 155

ΝΗ. l-Isopropil-4-(4-nitro-fenil)-piperazina (8,3g, 33,2mmol) é dissolvida em MeOH (120 mL) e é adicionado di-hidrato de dicloreto de estanho (II) (37, 4g, 0,165mol). A mistura é arrefecida utilizando um banho de água e é adicionado HC1 conc. (36mL) . A reacção é agitada à temperatura ambiente dum dia para o outro. Depois de remover o metanol, a solução resultante é basificada utilizando NaOH conc. (pH 11). A fase aquosa é extraída com éter dietílico (3x) e as camadas orgânicas combinadas, secas sobre MgSCq, filtradas, concentradas in vacuo para proporcionar o composto em epígrafe (6,4g, 88%).

Passo 3 (5-Bromo-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-isopropil-piperazin-l-il)-fenil]-amina

HN 1

Br

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 1, utilizando 5,8-dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina (2g, 7,20mmol), 4-(4-isopropil-piperazin-l-il)-fenilamina (l,89g, 8,62mmol) e N,N- diisopropiletilamina (l,88mL, 10,8mmol) em 2-propanol 156 (30mL) são agitados a 95°C dum dia para o outro. 0 composto em epígrafe é isolado após trituração com éter dietílico e éter de petróleo como um sólido cinzento (2,59g, 87%).

Passo 4: 4-(8-(4-(4-Isopropilpiperazin-l-il)fenilamino) [1,2, 4]triazolo[1, 5-a]pirazin-5il)furan-2-carboxamida

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4, utilizando 5-bromo-IV-(6-(4-isopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il)-[ 1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-amina (80mg, 0,21mmol), amida do ácido 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-furan-2-carboxílico (lOlmg, 0,42mmol) e Pd(PPh3)4 (62mg, 0,053mmol) em Na2C03 1,5M (aq) (l,143mL, l,71mmol) e dioxano (4mL). 0 produto em bruto é purificado por

cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM e DCM:NH3 (7M em MeOH) 97:3. 0 composto em epígrafe é isolado após trituração com éter dietílico (35,4mg, 42%). A conversão no sal de mesilato utilizando ácido metanossulfónico 1M em MeOH (0,0793mL) proporciona o composto em epígrafe como um sólido (35mg). RMN de ΧΗ (400MHz, d6~DMS0) δ (ppm) 1,35 (6H, d), 2,35 (3H, s, MsOH) , 3,01 (2H, t), 3,22-3,35 (2H, m) , 3,58 (3H, m) , 157 3, 88 (2H, d) , 7,09 (2H, d), 7,61 (1H, s 1), 7, 94 (2H, m) O O 00 DG \—1 s 1) , 8,22 (1H, s! ), 8,76 (1H, s), 8, 82 (1H, s) 9,27 (1H, s 1) , 10,02 (1H, s) . LCMS: Tr 2, 02min oo 9%) m/z (APCI) 447 (M+H)+.

Composto 89: Amida do ácido 4-{8-[4-(1-isopropilpiperidin-4-il)fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-tiofeno-2-carboxílico

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos como descritos para o Composto 92, utilizando ácido 2-(aminocarbonil)tiofeno-4-borónico no passo 4. LCMS: Tr 0,94 min (100 %) m/z (ESI) 462 (M+H)+.

Composto 90: (4-{8-[6-(4-Isopropilpiperazin-l-il)piridin-3-ilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}piridin-2-il)metanol 158

ί^Ν

OH

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos como descritos para o Composto 83, utilizando (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-[6-(4- isopropilpiperazin-l-il)piridin-3-il]amina no Passo 4. LCMS: Tr = 0,71 min (95 %), m/z (ESI) 446 (M+H)+.

Composto 92: 5-{8-[4-(l-Isopropilpiperidin-4- il)fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-2, 3-di-hidroisoindol-l-ona

Passo 1: l-Isopropil-4-(4-nitrofenil)piperidina

4-(4-Nitrofenil)piperidina (250 mg, 1,21 mmol), K2C03 (170 mg, 1,21 mmol) e 2-iodopropano (240 pL, 2,4 mmol) são agitados em acetonitrilo (3 mL) num tubo selado a 120°C durante 45 min. A mistura é arrefecida e o solvente removido sob pressão reduzida. O resíduo é partilhado entre 159 DCM (20 mL) e água (5 mL), as camadas são separadas e o DCM é lavado com água (5 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (5 mL) e seco sobre MgS04. A evaporação do solvente proporciona o composto em epígrafe (300 mg) o qual é utilizado sem mais purificação.

Passo 2: 4- (1-Isopropilpiperidin—4-il)fenilamina

H2N

Hidrazina (35% em massa em água, 0,67 mL, 7,2 mmol) e Pd a 10%/C (38 mg, 0,03 mmol) são adicionados a uma solução de l-isopropil-4-(4-nitrofenil)piperidina (180 mg, 0,72 mmol) em EtOH (10 mL) e a mistura é aquecida a refluxo durante 3 h. Depois de arrefecer, a mistura é filtrada através de celite e o solvente evaporado. O resíduo é redissolvido em DCM (25 mL) , seco sobre MgS04 e o solvente evaporado para proporcionar o composto desejado como um sólido amarelo pálido (113 mg, 0,52 mmol) o qual foi utilizado sem mais purificação.

Passo 3: (5-Bromo-[1,2, 4]triazolo[1, 5]pirazin-8-il)-[4- isopropilpiperidin-4-il]amina 160 160

λ Ν,Ν-Diisopropiletilamina (200 yL, 1,2 mmol) é adicionada a uma mistura de 4-(l-isopropilpiperidin-4-il)fenilamina (220 mg, 1,0 mmol) e 5,8-dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina (280 mg, 1,0 mmol) em χΡγΟΗ (5 mL) e aquecida a refluxo durante 48 h. A mistura é arrefecida e o solvente evaporado sob pressão reduzida para proporcionar um sólido laranja-castanho. Este é partilhado entre DCM (50 mL) e água (20 mL) e as camadas são separadas. A fase orgânica é lavada com ácido cítrico (aq. a 10%, 3 x 25 mL) . As lavagens combinadas são extraídas com DCM (25 mL) e em seguida tornadas básicas pela adição de NaHCCh (s) . A mistura é extraída com DCM (3 x 25 mL) e os extractos combinados secos sobre MgSCh e evaporados. O produto em bruto foi purificado por cromatografia sobre silica gel, eluindo com 5% - 10% de MeOH em DCM para proporcionar o composto desejado, contaminado com a anilina de partida. Esta foi recristalizada de MeOH para proporcionar o composto em epígrafe puro (110 mg).

Este material pode ser utilizado para preparar 5—{8—[4—(1— isopropilpiperidin-4-il)fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidroisoindol-l-ona de um modo análogo ao passo 4 como descrito para o Composto 79. 161

s/~N Ο Η LCMS: Tr 0,91 min (100 %) m/z (ESI) 468 (M+H)+.

Composto 100: 1-(4-(5-(ÍH-Pirazol—4-il)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)fenil)piperazin-2-ona

Passo 1: Éster terc-butílico do ácido 4- (4-amino-fenil)-3-oxo-piperazina-1-carboxílico

Uma suspensão de p-iodo-anilina (918mg, 4,8mmol), éster terc-butílico do ácido 3-oxo-piperazina-l-carboxílico (960mg, 4,2mmol), (IR,2R)-ciclo-hexano-1,2-diamina (0,05mL, 0,42mmol), iodeto de cobre (I) (14,9mg,0,0042mmol) e K2C03 (l,19g, 2,04mmol) em dioxano (4mL), é purgada com azoto durante 5 min num tubo de reacção. 0 tubo é selado e a mistura reaccional é aquecida a 119°C durante 15 horas. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, a mistura reaccional é filtrada através de um cartucho de sílica 162 lavando com acetato de etilo (40mL). 0 filtrado é concentrado in vacuo para proporcionar o composto em epígrafe como um líquido castanho (l,06g, 87%). LCMS: Tr 0,88min (91%) .

Passo 2: 1-[4-(5-Bromo-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-8- ilamino)-fenil]-piperazin-2-ona

N

X

Br

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 1, utilizando 5, 8-dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina (0,283g, l,00mmol), éster terc-butílico do ácido 4-(4-amino-fenil)-3-oxo-piperazina-l-carboxílico (0,300g, l,00mmol) e N- etildiisopropil-amina (0,20mL, l,02mmol) em 2-propanol (lmL). A purificação do material em bruto por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM seguido de DCM:MeOH 98:2 proporciona éster terc-butílico do ácido 4-[4-(5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)-fenil]-3-oxo-piperazina-l-carboxílico como um sólido branco (0,252g, 51%).

Uma solução de éster terc-butílico do ácido 4-[4-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-fenil]-3-oxo-piperazina-l-carboxílico (0,252mg, 0,6mmol) em DCM:TFA 2:1 (4,8mL) é agitada durante 1 hora à temperatura ambiente. A mistura é em seguida diluída com DCM e basificada com NaHCCU sat.. A camada aquosa é extraída com DCM (3x) e as 163 camadas orgânicas são combinadas, secas sobre MgSCb, filtradas e concentradas para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido (180mg, 78%).

Passo 3: 1-(4-(5- (lH-Pirazol-4-il) - [1,2, 4] triazolo [1, 5- a]pirazin-8-ilamino)fenil)piperazin-2-ona

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 1, passo 5 utilizando 1—[4—(5— bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)-fenil]-piperazin-2-ona (70mg, 0,18mmol) 4-(4,4,5,5-tetrametil- 1,3,2-dioxaborolan-2-il)-ΙΗ-pirazole (64mg, 0,33mmol),

Pd(PPh3)4 (21mg, 18pmol) e NaOfcBu (70mg, 0,72mmol) em 2mL de DMF/água 3:1. A mistura reaccional é concentrada sob vácuo e o resíduo é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com um gradiente de DCM:NH3 (7M em MeOH) 99:1 até 90:10. O composto em epígrafe é isolado como um sólido pálido verde (13mg, 19%). RMN de ΤΗ (400MHz, d6~ DMSO) δ(ppm) 3,05 (2H, m), 3,42 (2H, s), 3,62 (2H, m), 7,32 (2H, d), 8,07 (2H, d), 8,26 (1H, s), 8,39 (1H, s 1), 8,67 (1H, s 1), 8,81 (1H, s), 10,05 (1H, s) , 13,32 (1H, s 1) . LCMS: Tr 6,98min (92,4%), m/z (APCI) 376 (M+H)+. 164

Composto 102: 5-{8-[4-(4-terc-Butil-piperazin-l-il)- fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona

Passo 1: l-terc-Butil-4-(4-nitro-fenil)-piperazina

A uma solução de 1-fluoro-4-nitro-benzeno (314mg, 2,23mmol) e 4-terc-butilpiperazina (lg, 3,34mmol) em dioxano (15mL) é adicionado K2C03 (l,65mg, ll,9mmol) e a reacção é agitada a 130°C dum dia para o outro. 0 solvente é evaporado sob vácuo e o resíduo é partilhado entre acetato de etilo e água. A camada orgânica é lavada com solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca sobre MgSCq, filtrada e concentrada para dar um composto em bruto. A purificação por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM seguido de DCM:NH3 (7M em MeOH) 99:1 proporciona o composto em epígrafe (348mg, 55,4%). LCMS: Tr 3,87min (99%) .

Passo 2: 4- (4-terc-Butil-piperazin-l-il)-fenilamina

165 1-terc-Butil-4-(4-nitro-fenil)-piperazina (348mg, l,32mmol) é dissolvida em MeOH (10 mL) e é adicionado di-hidrato de dicloreto de estanho (II) (l,08g, 4,79mmol). A mistura é arrefecida utilizando um banho de água e é adicionado HC1 conc. (3mL) . A reacção é agitada a 40°C dum dia para o outro. Depois de remover o metanol, a solução resultante é basificada utilizando NaOH conc. (pH 11). A fase aquosa é extraída com éter dietílico (3x) e as camadas orgânicas combinadas, secas sobre MgS04, filtradas, concentradas in vacuo para proporcionar o composto em epígrafe (308mg, 99%) o qual é utilizado no passo seguinte sem mais purificação. LCMS: Tr 2,16min (87%)

Passo 3: (5-Bromo-[1,2, 4]triazolo[1, 5~a]pirazin-8-il)-[4- (4-terc-butil-piperazin-l-il)-fenil]-amina

Br

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 1, utilizando 5,8-dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina (0,308g, l,107mmol), (0,31Og, 4-(4-terc-butil-piperazin-l-il)-fenilamina l,33mmol) e N-etildiisopropil-amina (0,289mL, l,66mmol) em 2-propanol (5mL). A mistura reaccional é partilhada entre D CM e NaOH IN, a camada orgânica é separada e lavada com água e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca sobre MgS04, filtrada e concentrada sob vácuo. A trituração do resíduo com éter dietílico e éter de petróleo 166 proporciona o composto em epígrafe (440mg, 92%) como um sólido de cor creme. LCMS: Tr 2,25min (96%).

Passo 4: 5-{8-[4-(4-terc-Butil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[1, 2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}2,3-di-hidro-isoindol-l- ona

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4, (5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4-terc-butil-piperazin-l-il)-fenil]-amina (lOOmg, 0,232mmol), 5- (4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona (90mg, 0,32mmol) e Pd(PPh3)4 (67mg, 0,058mmol) em Na2C03 1,5M (aq) (l,24mL) e dioxano (3,7mL). A mistura reaccional é partilhada entre acetato de etilo e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, a camada orgânica é separada, seca sobre MgS04 filtrada e evaporada in vacuo. 0 resíduo é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM:NH3 (7M em MeOH) 98:2, seguido de DCM:NH3 (7M em MeOH) 95:5 para dar um sólido o qual é triturado com éter dietílico e éter de petróleo para proporcionar o composto em epígrafe (71mg, 63%). RMN de ^ ( 400MHz, d6-DMSO) δ (ppm) 1,43 (9H, s), 2,36 (3H, s, MsOH) , 3,02 (2H, m) , 3,19-3,26 (2H, m) , 3,67 (2H, d), 3,90 (2H, d), 4,52 (2H, s), 7,10 (2H, d), 7,86 (1H, d), 167 7,96-8,01 (3Η, m) , 8,10 (1H, d), 8,24 (1H, s), 8,72 (1H, s), 8,75 (1H, s), 9,09 (1H, s 1), 10,09 (1H, s). LCMS: Tr 2,07min (99%), m/z (APCI) 483 (M+H)+.

Composto 105: 5-{8-[4-(2-Oxo-piperazin-l-il)fenilamino]- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-1-ona

Passo 1: Éster terc-butílico do ácido 3-oxo-4-{4-[5- (1-oxo-2, 3-di-hidro-lH-isoindol-5-il)-[1,2, 4]triazolo[1, 5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-piperazina-1-carboxílico

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4, utilizando éster terc-butilico do ácido 4-[4-(5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)-fenil]-3-oxo-piperazina-l-carboxílico (115mg, 0,24mmol), 5-(4,4,5,5-tetrametil- [1,3,2]dioxaborolan-2-il)-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona (92mg, 0,35mmol) e Pd(PPh3)4 (83mg, 0,072mmol) em Na2C03 1,5M (aq) (l,3mL, l,92mmol) e dioxano (2,5mL). A mistura reaccional é diluída com solução aquosa saturada de cloreto de sódio em seguida é adicionado tolueno e forma-se um precipitado que é recolhido por filtração. O sólido resultante é dissolvido em DCM e filtrado através de um cartucho de sílica para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido amarelo (60mg, 47%). 168

Passo 2: 5-{8-[4-(2-Oxo-piperazin-l-il)-fenilamino]- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-1-ona

O

NH

N j> N

N L

Uma solução de éster terc-butílico do ácido 3-oxo-4-{4-[5-(1-oxo-2,3-di-hidro-lH-isoindol-5-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-piperazina-l-carboxílico (59mg, O,lmmol) em DCM:TFA 3:1 (l,2mL) é agitada à temperatura ambiente durante 1 hora. A mistura reaccional é diluida com DCM e basifiçada com NaHC03 sat.. A camada aquosa é extraída com DCM (3x) e as camadas orgânicas são combinadas, secas sobre MgS04, filtradas e concentradas sob vácuo para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido amarelo (38mg, 86%) . RMN de XH (400MHz, de-DMSO) δ (ppm) 3,07 (2H, m) , 3, 44 (2H, S) , 3,64 (2H, m) , 4,50 (2H, s), 7,32 (2H, d), 7,83 (1H, d) , 8,04-8,10 (4H, m) , 8,22 (1H, s), 8,70 (1H, s 1), 8, 74 (1H, s), 10,25 (1H, s). LCMS: Tr 7,17min (93,7%), m/z (APCI) 441 (M+H)+.

Composto 108: 7-Fluoro-5-{8-[4-(4-isopropilpiperazin-l-il)-fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidroisoindol-l-ona 169

Passo 1: Ester metílico do ácido 4-bromo-2, 6- difluorobenzóico

CU

F

F

Br A uma suspensão de ácido 4-Bromo-2,6-difluoro-benzóico (5 g, 21 mmol) em DCM (lOmL) é adicionado cloreto de tionilo (15 mL) e DMF (0,5mL). A mistura é agitada à temperatura ambiente durante 2,5 h. É então arrefecida até 0°C e é cuidadosamente adicionado MeOH (20mL) originando libertação vigorosa de HC1. Depois de agitar durante mais 0,5 h, a solução transparente é partilhada entre DCM (50 mL) e água (50 mL) . A camada orgânica é lavada com NaHCCb saturado, solução aquosa saturada de cloreto de sódio, seca sobre MgSCg e o solvente é removido sob vácuo para proporcionar o composto em epígrafe como um óleo amarelo pálido o qual é utilizado sem mais purificação.

Passo 2: Éster metílico do ácido 4-bromo-2-fluoro-6- (nitrometil) benzóico

Br

Adiciona-se nitrometano (10 mL, 169 mmol, 8 equiv.) cautelosamente a uma suspensão de hidreto de sódio (4,05 g, 170 169 mmol, 8 equiv.) e MgSC>4 (40 g) em DMSO (100 mL) à t.a. e a suspensão viscosa resultante é agitada durante 0,25 h. À suspensão viscosa amarela é adicionado éster metilico do ácido 4-bromo-2,6-difluorobenzóico (5,3 g, 21 mmol) e a mistura é agitada à t.a. durante 3 dias altura em que todo o material de partida foi consumido. São adicionados água (200 mL) e HC1 6M (50 mL) , seguidos de DCM (200 mL) . É adicionada mais água (500 mL) para produzir um sistema bifásico transparente. A camada aquosa é extraída com DCM (3 x 100 mL) , as camadas de DCM são em seguida combinadas, lavadas com NaHC03 saturado e solução aquosa saturada de cloreto de sódio, e secas sobre MgS04. A evaporação do solvente proporciona um sólido laranja contendo 64% do material desejado, utilizado sem mais purificação. LCMS; Tr = 1,27 min (64%).

Passo 3: 5-Bromo-7-fluoro-2,3-di-hidro-isoiudol-l-ona

O éster metilico do ácido 4-bromo-2-fluoro-6-(nitrometil)benzóico em bruto do passo anterior é dissolvido em MeOH (100 mL). A esta solução laranja transparente é adicionado Zinco em pó (3,35 g, 51,3 mmol, 3 equiv.) seguido de formato de amónio (3,23 g, 51,3 mmol, 3 equiv.) o que resulta numa reacção exotérmica. Após 0,3 h, é adicionado NH3 7M em MeOH (50 mL) e a mistura é agitada dum dia para o outro à temperatura ambiente. A mistura resultante é filtrada através de celite, e o filtrado 171 amarelo é adsorvido sobre sílica e grosseiramente limpo por LC utilizando DCM/NH3 7M em MeOH 94/6. A remoção do solvente proporciona um sólido castanho-amarelado que é redissolvido em DCM, lavado com NaOH a 10% e concentrado sob pressão reduzida para deixar um sólido branco, o qual é triturado com pequenas quantidades de DCM para proporcionar o composto em epígrafe. LCMS: Tr 0,96 min (100%) m/z 230/232 (M+H)+.

Passo 4: 7-Fluoro-5-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxabrolan-2-il)-2, 3-di-hidroisoindol-l-ona

°'B'°

O H

Uma solução de 5-bromo-7-fluoro-2,3-di-hidroisoindol-l-ona (531 mg, 2,31 mmol) em dioxano (5 mL) é agitada sob azoto. São adicionados Pd(dppf)Cl2 (94 mg, 5% molar), acetato de potássio (453 mg, 4,62 mmol. 2,0 equiv.) e bispinacolato de diboro (1,17 g, 4,62 mmol, 2 equiv.), e a reacção é aquecida a 80°C durante 3 h. A suspensão laranja resultante é diluída com DCM, filtrada através de celite e concentrada sob vácuo para proporcionar um óleo que é redissolvido num mínimo de DCM. É lentamente adicionado éter dietílico para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido castanho-amarelado. LCMS: Tr 1,18 min (100%) m/z 277/279 (M+H)+. 172

Passo 5: 7-Fluoro-5-{8-[4-(4-isopropilpiperazin-l-il)- fenilamino]-[1, 2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-2, 3-di-hidroisoindol-1 -ona

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 91 utilizando o boronato acima. LCMS: Tr = 0,90 min (95 %), m/z 487 (M+H)+.

Composto 112: 5-(8-(4-(4-Isopropil-2-oxopiperazin-l- il)fenilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)isoindolin-l-ona

Passo 1: 1-[4-(5-Bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8- ilamino)-fenil]-4-isopropil-piperazin-2-ona

HN

A uma solução de 1-[4-(5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)-fenil]-piperazin-2-ona (exemplo 31, 173 passo 2) (180mg, 0,47mmol) em MeOH (4mL) são adicionados ácido acético (0,03mL, 0,47mmol), NaOAc (38mg, 0,47mmol) e acetona (0,2mL, l,18mmol). A mistura reaccional é agitada à temperatura ambiente durante 1 hora em seguida é adicionado NaCNBH3 (60mg, 0,94mmol) e a mistura é agitada a 40°C dum dia para o outro. Depois de arrefecer até à temperatura ambiente, a mistura reaccional é acidificada com HC1 conc. (pH 1) e concentrada in vacuo. 0 resíduo é partilhado entre NaOH 6N e DCM. A camada aquosa é extraída com DCM (3x) e as camadas orgânicas combinadas são secas sobre MgS04 e concentradas in vacuo para proporcionar um composto em bruto o qual é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel. A eluição com DCM e DCM:MeOH 98:2 proporciona o composto em epígrafe como um sólido amarelo (45mg, 25%).

Passo 2: 5- (8- (4-(4-Isopropil-2-oxopiperazin-l- 11)fenilamino)-[1,2, 4]triazolo[1, 5-a]pirazin-5-il)isoindolin-l-ona

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4, utilizando 1— [4—(5 — bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)-fenil]-4-isopropil-piperazin-2-ona (40mg, 0,09mmol), 5-(4,4,5,5- tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-2,3-di-hidro-isoindol-1-ona (37mg, 0,14mmol) e Pd(PPh3)4 (31mg, 0,027mmol) em 174

Na2CC>3 1, 5M (aq) (0,5mL, 0,75mmol) e dioxano (l,2mL). A mistura reaccional é diluída com solução aquosa saturada de cloreto de sódio em seguida é adicionado tolueno e forma-se um precipitado que é recolhido por filtração. 0 filtrado é lavado com éter dietílico, éter de petróleo e MeOH e em seguida purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel. A eluição com DCM:NH3 (7M em MeOH) 99:1 seguido de DCM:NH3 (7M em MeOH) 98:2 e 95:5 proporciona o composto em epígrafe como um sólido amarelo (2 4mg , 55%) . RMN de 2Η (400MHz, dg-DMSO) δ(ppm) 1,08 (6H, d) , 2,73-2,87 (3H; m) , 3,27 (2H, s), 3,62-3,68 (2H, m) , 4, 52 (2H, s) , 7,36 (2H, d), 7,84 (1H, d), 8,07- -8,10 (4H, m) , 8,25 (1H, s) , 8, 70 (1H, s 1), 8,77 (1H, s), 10,28 (1H , s) . LCMS: Tr 1,94min (95,2%), m/z (APCI) 483 (M+H)+.

Composto 114: 5-{8-[4-(4-Isopropilpiperazin-l-il)- fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-3,3-dimetil-2,3-di-hidroisoindol-l-ona

Passo 1: 5-Bromo-2- (4-metoxibenzil)-3, 3-dimetil-2, 3-di- hidroisoindol-l-ona

Uma suspensão de hidreto de sódio (130 mg, dispersão a 60% em óleo mineral, 3,2 mmol) e iodeto de tetra-^butilamónio (243 mg, 0,68 mmol) em THF (20 mL) é agitada à t.a. e é adicionada uma solução de 5-bromo-2,3-di-hidroisoindol-l-ona (675 mg, 3,2 mmol) em THF (20 mL) e DMF (4 mL). Após 75 175 min é adicionado brometo de 4-metoxibenzilo (460 pL, 3,2 mmol) e a agitação é prosseguida durante 4 h. Em seguida é adicionado hidreto de sódio (635 mg, dispersão a 60% em óleo mineral, 15,9 mmol) e a agitação é prosseguida durante 30 min antes de ser adicionado iodometano (1,19 mL, 19 mmol) e a mistura aquecida até 70°C durante 30 min. Depois de arrefecer, é adicionado NH4C1 (aq. sat.) e a mistura é diluída com acetato de etilo (120 mL) . As camadas são separadas, a fase orgânica é seca sobre MgS04 e os solventes removidos sob pressão reduzida. O resíduo é purificado por cromatografia sobre sílica, eluindo com 5% até 10% de acetato de etilo em éter de petróleo para proporcionar o composto em epígrafe como um óleo amarelo (640 mg, 1,78 mmo1).

Passo 2: 5~Bromo~3,3-dimetil-2, 3-di-hidroisoindol-l-ona

Br

//—N O H

Uma solução de 5-bromo-2-(4-metoxibenzil)-3,3-dimetil-2,3-di-hidroisoindol-l-ona (640 mg, 1,78 mmol) e nitrato de amónio cérico (2,91 g, 5,33 mmol) em acetonitrilo (11 mL) e água (5 mL) é agitada a 0°C durante 45 min. A solução é diluída com acetato de etilo (100 mL) e lavada com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (40 mL) . Os solventes orgânicos são secos sobre MgS04 e evaporados sob pressão reduzida. O resíduo é purificado por cromatografia sobre sílica, eluindo com 10% até 50% de acetato de etilo em éter de petróleo para proporcionar o composto em epígrafe (367 mg, 1,53 mmo1). 176

Passo 3: 5-{8-[4- (4-Isopropilpiperazin-l-il)-fenilamino]- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-3, 3-dimetil-2,3-di-hidroisoindol-1-ona

5-Bromo-3,3-dimetil-2,3-di-hidroisoindol-l-ona é convertido no boronato correspondente de um modo análogo ao Composto 6, Passo 3. Este é então utilizado para preparar o composto em epígrafe de (5-bromo[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-[ 4-(4-isopropilpiperazin-l-il)-fenil]amina utilizando métodos como descritos para o Composto 120, Passo 4. LCMS: Tr = 0,92 (100%), m/z = 497 (M+H)+.

Composto 118: 4-(5-(lH-Pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5- a]pirazin-8-ilamino)-N-(piridin-3-ilmetil)benzamida

Passo 1: Éster metílico do ácido 4-(5-bromo- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)-benzóico 177 ο

Br

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 1 utilizando 5,8-dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina (250mg, 0,90mmol), éster metilico do ácido 4-aminobenzóico (163mg, l,08mmol) e N-etildiisopropil-amina (0,19mL, l,08mmol) em 2-propanol (2,5mL). 0 composto em epígrafe é obtido após trituração com 2-propanol como um sólido castanho (148mg, 47%).

Passo 2: Ácido 4-(5-bromo-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)-benzóico o

Br Éster metilico do ácido 4-(5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5- e a] pirazin-8-ilamino)-benzóico (460mg, l,32mmol) suspendido em THF (llmL) e é adicionada uma solução de mono-hidrato de hidróxido de lítio (554mg, 13,2mmol) em água (llmL). A mistura reaccional é agitada à temperatura ambiente durante 4 horas, em seguida é adicionado metanol (llmL) e a mistura é agitada a 50°C durante 24 horas. A mistura é partilhada entre água e DCM, a fase aquosa é acidificada com HC1 2M (pH 2) e forma-se um precipitado amarelo. 0 precipitado é recolhido por filtração, lavado 178 com água e éter dietílico e seco para proporcionar o composto em epígrafe (215mg, 49%).

Passo 3: 4-(5-Bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8- ilamino)-N-piridin-3-ilmetil-benzamida o

Br

Uma solução de ácido 4-(5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)-benzóico (0,230g, 0,69mmol), 3- hidroxibenzotriazole (0,103g, 0,76mmol), hidrato de 1-etil-3-(3'-dimetilaminopropil)carbodiimida (0,146g, 0,76mmol) em DMF (5mL) e 3-picolilamina (0,077mL, 0,76mmol) é agitada à temperatura ambiente durante 21 horas. O solvente é removido in vacuo e o resíduo é triturado com éter dietílico, acetato de etilo e diclorometano. É obtido um sólido amarelo pálido, lavado com água e seco para proporcionar o composto em epígrafe (241mg, 82%).

Passo 4: 4- (5- (lH-Pirazol-4-il) - [1,2, 4] triazolo [1, 5- a]pirazin-8-ilamino)-N- (piridin-3-ilmetil)benzamida

\ / N—NH 179

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4 utilizando 4-(5-bromo- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-3-piridin-3- ilmetil-benzamida (lOOmg, 0,24mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-ΙΗ-pirazole (93mg, 0,48mmol) e

Pd (PPh3) 4 (70mg, 0,06mmol) em K2C03 1,5M (aq) (l,4mL) e dioxano (2,5mL). 0 material em bruto é purificado por cromatografia em coluna sobre silica gel eluindo com DCM seguido de DCM:NH3 (7M em MeOH) 98:2, em seguida 96:4, em seguida 90:10 para proporcionar o composto em epigrafe como um sólido branco (19,6mg, 20%). RMN de XH (400MHz, d6-DMSO) δ (ppm) 4,52 (2H, d), 7,40 (1H, m), 7,78 (1H, d), 7,93 (2H, d), 8,18 (2H, d), 8,32 (1H, s) , 8,48-8,62 (4H, m), 8,82 (1H, s), 9,01 (1H, t), 10,21 (1H, s 1), 13,3 (1H, s 1). LCMS: Tr l,86min (93%), m/z (ES + ) 412 (M+H)+.

Composto 119: 4-(5-(2-Oxo-l,2-di-hidropiridin-4-il)- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)-N-(piridin-3-ilmetil)benzamida

Passo 1: 4-[5-(2-Metoxi-piridin-4-il)-[1,2, 4]triazolo[1, 5-a]pirazin-8-ilamino]-N-piridin-3-ilmetil-benzamida

N 180

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 6, passo 4 utilizando 4-(5-bromo-[1,2,4]triazolo [1,5-a]pirazin-8-ilamino)-N-piridin-3-ilmetil-benzamida (120mg, 0,28mmol), ácido 2- metoxipiridina-4-borónico (87mg, 0,57mmol) e Pd(PPh3)4 (81mg, 0,07mmol) em K2CO3 1,5M (aq) (l,6mL) e dioxano (2,9mL). 0 material em bruto é purificado por cromatografia em coluna sobre sílica gel eluindo com DCM seguido de DCM:NH3 (7M em MeOH) 99:1, em seguida 97:3, em seguida 95:5 para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido branco (92,6mg, 73%).

Passo 2: 4-(5- (2-0xo-l,2-di-hidropiridin-4-il)- [1,2, 4] triazolo [1 r 5-a]pirazin-8-ilamino) -N- (piridin-3-ilmetil)benzamida

O

Uma mistura de 4-[5-(2-metoxi-piridin-4-il)- [l,2,4]triazolo[l,5-a] pirazin-8-ilamino] -IV-piridin-3-ilmetil-benzamida (71,5mg, 0,16mmol) e cloridrato de piridínio (91mg, 0,79mmol) em água (0,5mL) num tubo selado

é aquecida a 150°C durante 25 minutos. Após este periodo de tempo o solvente é removido in vacuo. O resíduo é submetido a cromatografia sobre sílica gel, eluindo com DCM seguido de DCM:NH3 (7M em MeOH) 98:2 e 90:10, e as fracções contendo o produto desejado são combinadas e evaporadas. O 181 composto em epígrafe é isolado como um sólido amarelo (34,5mg, 49%) . RMN de 1H (400MHz, de-DMSO) δ(ppm) 4,52 (2H, d), 6,82 (1H, m) , 7,22 (1H, s), 7,38 (1H, m), 7,51 (1H , d), 7,78 (2H, d) , 8,18 -8,23 (3H, m) , 8,51 (1H, d), 8,62 (1H, s), 8,82 (1H, s) , 9,01 (1H, t), 10,58 (1H, s 1), 11,8 (1H, s 1). LCMS : Tr 1,72min (97%), m/z (ES + ) 439 (M+H)+.

Composto 120: 2-Metoxi-W-(6-metilpiridin-3-il)metil-4-[5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida

Passo 1: 2-Metoxi-N-(6-metilpiridin-3-il)metil-4- nitrobenzamida

Ácido 2-metoxi-4-nitrobenzóico (293 mg, 1,49 mmol) é dissolvido em DMF (2 mL) e são adicionados 4-metilmorfolina (220 pL, 3,0 mmol) e TBTU (1,79 g, 1,7 mmol). A mistura é agitada à t.a. durante 30 min e é adicionado C—(6— metilpiridin-3-il)metilamina (400 mg, 3,27 mmol). A agitação é prosseguida à t.a. durante 12 h. É adicionado DCM (10 mL) e a fase orgânica é lavada com Na2C03 (5% aq.), HC1 (3% aq.) e água, e em seguida seca sobre Na2S04. Após evaporação dos solventes, o resíduo é triturado com éter-hexano para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido branco. 182

Passo 2: 4-Amino-2-metoxi-N-[(6-metilpirldin-3- il)metil]benzamida

Uma solução de 2-metoxi-iV- (6-metilpiridin-3-il) metil-4-nitrobenzamida (448 mg, 1,49 mmol) em EtOH e AcOEt (8 mL cada) é agitada e são adicionados formato de amónio (375 mg, 6 mmol) e Pd a 10%/C (100 mg) . A mistura é aquecida a refluxo durante 20 min, arrefecida, filtrada através de celite, o sólido é lavado com EtOH e os solventes combinados são evaporados para proporcionar o composto em epígrafe.

Passo 3: 4-(5-Bromo-[1,2,4]triazolo[1, 5-a]pirazin-8- ilamino)-2-hidroxi-N-[(6-metil-piridin-3-il)metil]benzamida

O

5,8-Dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina (285 mg, 1,03 mmol) e 4-amino-2-metoxi-IV-[(6-metilpiridin-3-

il) metil] benzamida (280 mg, 1,03 mmol) são agitadas em 1PrOH (5 mL) e é adicionado HBr (aq. a 48%, 380 pL) . A mistura é aquecida a refluxo durante 24 horas. A suspensão 183 arrefecida é vertida para NaHCCb (aq. sat., 25 mL) e água (25 mL) e extraida com CHCI3 (4 x 30 mL). Os extractos são secos sobre MgS04 e evaporados. O resíduo é purificado por cromatografia em coluna, eluindo com 10% de CtbC^/MeOH. As fracções contendo o produto são evaporadas e o resíduo é triturado com MeOH para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido castanho.

Passo 4: 2-Metoxi-N-(6-metilpiridin-3-il)metil-4-[5-(1H- pirazol-4-il)-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida

H O produto obtido é Ácido pirazole-4-borónico (19 mg, 0,17 mmol), 4-(5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino)-2-hidroxi-N-[ (6-metil-piridin-3-il)metil]benzamida (40 mg, 0,085 mmol), K2CO3 (24 mg, 0,17 mmol) e Pd (dppf) CI2CH2CI2 (4 mg, 0,005 mmol) são pesados para um tubo selável. O tubo é purgado com azoto e é adicionado dioxano-água (4:1, 4 mL). O tubo é selado, colocado num banho de ultra-sons sob um corrente de azoto gasoso durante 30 segundos e em seguida colocado num banho de óleo a 85°C. A reacção é agitada durante 28 horas, adicionando porções adicionais de ácido borónico (10 mg) e catalisador (2 mg) após 2 h e 18 h. A mistura em bruto é absorvida em S1O2 e purificada por cromatografia em coluna, eluindo com MeOH/DCM 1% - 10%. 184

redissolvido em MeOH/DCM (4:1, 10 mL) e é adicionado MsOH 0,1 M/MeOH (2 eq), os solventes evaporados e o resíduo refeito em água e liofilizado para proporcionar o composto em epígrafe como o seu sal de bis-mesilato (38 mg). LCMS: Tr 0,92 min (93,9 %) m/z (ESI) 455 (M+H)+.

Composto 122: W-Benzil-2-metoxi-4-[5-(lH-pirazol-4-il)- [1,2,4]triazolo[1,5—a]pirazin—8—ilamino]-benzamida

H

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos descritos para o Composto 120, utilizando benzilamina no passo 1. LCMS: Tr 1,62 min (100 %) m/z (ESI) 440 (M+H)+.

Composto 124: W-Piridin-2-ilmetilo 3-[5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]benzamida

185

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 129 utilizando 2- piridilmetilamina no passo 5. LCMS: Tr = 0,84 min (100 %), m/z (ESI) 412 (M+H)+.

Composto 127: (4-Isopropilpiperazin-l-il)-{3-[5-(1H- pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]fenil}metanona

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 129, utilizando 4-isopropilpiperazina no passo 5. LCMS: Tr = 0,84 min (100 %), m/z (ESI) 432 (M+H)+.

Composto 129: W-Etil 3-[5-(lH-pirazol-4-il)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]benzamida

Passo 1: Éster etílico do ácido 3-(5-bromo- [1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)benzóico

186 5,8-Dibromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazina (1,39 g, 5,00 mmol) e 3-aminobenzoato de etilo (0,93 g, 5,60 mmol) são agitados em 1PrOH (10 mL) e é adicionado HBr (aq. a 48%, 1,14 mL, 10 mmol). A mistura é aquecida a 85°C durante 4 h e então arrefecida até à t.a. e desactivada com NaHCC>3 (aq. sat., 25 mL). A suspensão resultante é arrefecida até 0°C e o sólido branco é recolhido por filtração com sucção e lavado com água (10 mL) . O produto em bruto é refeito em EtOH e o solvente evaporado para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido esbranquiçado (1,79 g, 4,9 mmol) o qual é utilizado sem mais purificação.

Passo 2: Éster etílico do ácido 3-[(5-bromo- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-terc-butoxicarbonil-amino]benzóico

Uma solução de éster etílico do ácido 3-(5-bromo-[ 1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)benzóico (1,79 g, 4,93 mmol) em DCM (20 mL) é agitada sob N2 à t.a. e são adicionados BOC20 (1,34 g, 6,16 mmol) e DMAP (0,30 g, 2,46 mmol). A agitação é prosseguida durante 2 h, altura em que a LCMS indica conversão total do material de partida. A mistura é filtrada e o filtrado é lavado com ácido cítrico diluído (pH 6, 5 mL) e solução aquosa saturada de cloreto de sódio (5 mL) e seca sobre Na2S04. A evaporação do solvente proporciona o composto em epígrafe como um óleo 187 amarelo (1,87 g, 4,0 mmol) o qual é utilizado sem mais purificação.

Passo 3: Éster etílico do ácido 3-{terc-butoxicarbonil-[5-(lH-pirazol-4il)-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-amino}benzóico

Borbulha-se azoto através de uma mistura de éster etílico do ácido 3-[(5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-terc-butoxicarbonil-amino]benzóico (0,58 g, 1,25 mmol), 4-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-lH-pirazole (0,49 g, 2,50 mmol), K2C03 (0,35 g, 2,50 mmol) e

Pd(dppf)C12DCM (102 mg, 0,125 mmol) em dioxano (37,5 mL) e água (9,6 mL). Adapta-se um condensador ao balão, o sistema é evacuado e purgado com N2 (g) e em seguida aquecido a 115°C durante 25 min. O banho de aquecimento é retirado e é adicionado C02 (s) para arrefecer e tamponar o sistema. O solvente é removido sob pressão reduzida e o resíduo é purificado por cromatografia sobre sílica, eluindo com 10% até 50% de acetato de etilo em DCM, para proporcionar o composto em epígrafe como um óleo laranja (0,61 g, > 100%) o qual é utilizado sem mais purificação.

Passo 4: Ácido 3-{terc-butoxicarbonil-[5-(lH-pirazol-4-il) -[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-amino}benzóico

OH Éster etílico do ácido 3-{terc-butoxicarbonil-[5-(1H-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-amino}benzóico impuro (0,61 g, 1,25 mmol) é dissolvido em THF (2,5 mL) e é adicionado KOH (2M aq., 2,5 mL, 5 mmol) e a mistura é aquecida a 60°C dum dia para o outro. A solução é arrefecida e filtrada através de celite, lavando com água. O filtrado é vertido para ácido cítrico (2M aq., 2,5 mL) e agitado a 0°C. O sólido resultante é recolhido por filtração sob sucção, lavando com água e seco suspendendo em EtOH e evaporando sob pressão reduzida, para proporcionar uma goma castanha (280 mg). É obtido mais produto por extracção do filtrado com DCM, para proporcionar um total combinado de 352 mg do composto em epígrafe. Este é utilizado sem mais purificação.

Passo 5: N-Etil 3-[5-(lH-pirazol-4-il)-[1, 2, 4]triazolo[1, 5-a]pirazin-8-ilamino]benzamida 189

Η Ν Η Ácido 3-{terc-butoxicarbonil-[5-(lH-pirazol-4-il) -[ 1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-amino}benzóico (42 mg, 0,10 mmol) , etilamina (12 M aq., 42 pL, 0,50 mmol) e trietilamina (28 pL, 0,20 mmol) são agitados em DMF (0,30 mL) e é adicionado PyBOP (57 mg, 0,11 mmol) . A agitação é prosseguida dum dia para o outro. A mistura reaccional é partilhada entre AcOEt (7 mL) e NaHC03 (aq. sat., 7 mL) e as camadas são separadas. As camadas orgânicas combinadas são lavadas com solução aquosa saturada de cloreto de sódio (2x5 mL) e secas sobre Na2S04. A evaporação do solvente proporciona um óleo o qual é dissolvido em MeOH (0,3 mL) contendo HC1 (12 M aq., 0,15 mL) e agitado dum dia para o outro, são adicionados trietilamina (0,25 mL) e EtOH (2 mL) e os solventes removidos sob pressão reduzida. O resíduo é purificado por HPLC preparativa para proporcionar o composto em epígrafe como um sólido branco (7 mg) . RMN de ΤΗ (DMSO-d6, 400 MHz): δ = 13,29 ppm (s, 0,8 H); 10,01 (s, 0, 9 H); 8,77 (s, 1,0 H) ; 8,65 (s, 1,0 H) ; 8,52 (S, 1,1 H) ; 8, 41 -8,37 (m, 2,1 H); 8,25 (s, 1 , 0 H ); 8,08 (d, 1,0 H) ; 7, 47 (d, 1,0 H); 7,41 (t, 1,1 H) ; 7, 04-7,03 (m, 0,5 H) ; 3,32 (s, 29,2 H (água)) ; 1,14 (t, 3,5 H) . LCMS : Tr = 0,95 min (100 %), m/z (ESI) 349 (M+H)+. 190

Composto 131: N-(4-Hidroxibenzil) 3-[5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]benzamida

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 129, utilizando 4-hidroxibenzilamina no passo 5. LCMS: Tr = 0,98 min (100 %), m/z (ESI) 427 (M+H)+.

Composto 134: W-Benzil-W-metil 3-[5-(lH-pirazol-4-il)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]benzamida

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 129, utilizando N-metilbenzilamina no passo 5. LCMS: Tr = 1,15 min (100 %) , m/z (ESI) 425 (M+H)+. 191

Composto 167: Amida do ácido 4-[8-(6-fenilacetilamino-piridin-3-ilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-tiofeno-2-carboxílico

Passo 1: N- (5-Nitropiridin-2-il)-2-fenilacetamida

H

Uma solução de 2-amino-5-nitropiridina (4,17 g, 30 mmol) em piridina (30 mL) é agitada à t.a. e é adicionado gota a gota uma solução de cloreto de fenilacetilo (4,64 g, 30 mmol) em THF (30 mL). A mistura é agitada durante 24 h e em seguida vertida para gelo-água (250 mL) para proporcionar um sólido castanho, o qual é utilizado sem mais purificação.

Este material é utilizado para preparar N-[5-(5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)-piridin-2-il]-2-fenilacetamida de um modo análogo aos passos 2 e 3 dos métodos como descritos para o Composto 120.

Passo 4: Amida do ácido 4-[8- (6-fenilacetilamino-piridin-3-ilamino)-[1,2, 4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-tiofeno-2-carboxílico 192 Η Ν

Η2Ν

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 120, passo 4, utilizando IV-[5-(5-bromo-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino)-piridin-2-il]-2-fenilacetamida e ácido 2-(aminocarbonil)tiofeno-4-borónico. LCMS: Tr 1,06 min (100 %) m/z (ESI) 471 (M+H)+.

Composto 169: 2-(4-{4-[5-(lH-Pirazol-4-il)- [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]fenil}-piperidin-l-il)acetamida

N-N H

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 84, utilizando 2-bromoacetamida no passo 1. LCMS: Tr = 0,81 min (100%), m/z (ESI) 418 (M+H)+. 193

Composto 170: 5-{8-[4-(4-Isopropilpiperazin-l-il)-3- trifluorometilfenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidroisoindol-l-ona

Este composto pode ser preparado utilizando os métodos como descritos para o Composto GB15, utilizando 5-(4,4,5,5-tetrametil-[1,3,2]dioxaborolan-2-il)-2,3-di-hidroisoindol-l-ona. LCMS: Tr = 0,99 min (95 %), m/z (ESI) 537 (M+H)+.

Composto 171: [4-(4-Isopropilpiperazin-l-il)-3- trifluorometilfenil]-[5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]amina

N

F r^N

HN N

N- <*// N-N H

N 194

Este composto pode ser preparado utilizando métodos como descritos para o Composto 46, utilizando (5-bromo-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-[4-(4- isopropilpiperazin-l-il)-3-trifluorometilfenil]amina. LCMS: Tr = 0,99 (95 %), m/z (ESI) 472 (M+H)+.

Outros exemplos de compostos da invenção preparados pelos procedimentos anteriores são descritos acima.

Condições de Purificação e Caracterização

Após a síntese todos os compostos podem ser rotineiramente purificados utilizando HPLC de fase inversa utilizando um sistema de HPLC preparativo Gilson (bomba 322, detector UV/Vis 155, manipulador de líquidos 215) . O Gilson 215 actua como amostrador automático e colector de fracções. Os compostos também podem ser purificados por cromatografia "flash" sobre sílica gel.

Os compostos são caracterizados por espectrometria de massa utilizando um equipamento de quadrupolo simples como uma fonte de electropulverização.

Ensaios Biológicos que Demonstram a Utilidade dos compostos

Exemplo 1: Ensaio MAPKAP-K5

As reacções de MAPKAP-K5 sao realizadas no formato de FlashPlate utilizando 0,1 ou 0,2 pCi de 33P-ATP; ΑΤΡ Ο,βμΜ; 195

ImU de MAPKAP-K5; substrato peptídico de MAPKAP-K5 3μΜ, incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos.

Ensaio Flashplate: A reacção de MAPKAP-K5-cinase é realizada numa placa de 384 poços em polipropileno (Matrix Technologies) e em seguida transferida para uma Flashplate (Perkin-Elmer) de 384 poços revestidos com estreptavidina. A dois poços contendo 2pL de composto de ensaio ou inibidor padrão são adicionados 13pL de mistura de Enzima ou diluente utilizando Hydra (Robbins Scientific).

As reacções são iniciadas pela adição de 10pL de cocktail de substrato [2,5x] utilizando um Multidrop (Thermo-Labsystems), para se obter concentrações finais no ensaio de: 1 mU de MAPKAP-K5 substrato peptídico de MAPKAP-K5 3μΜ ΑΤΡ Ο,βμΜ 0,004μ0ί de [33P]-γ-ΑΤΡ/μμ Tampão de reacção lx

As placas são incubadas à temperatura ambiente durante 30 minutos.

As reacções são terminadas pela adição de 25pL de EDTA (50mM) a cada poço utilizando um Micro-fill (Biotek).

As reacções são transferidas para uma Flashplate revestida com estreptavidina utilizando um sistema robótico Zymark. 196

As placas são incubadas durante 60 minutos à temperatura ambiente.

Todos os poços são lavados 3 vezes com 100pL de soro fisiológico tamponado com fosfato utilizando um lavador de placas Tecan. A radioactividade é determinada por contagem de cintilação da Flashplate (poços vazios) num Packard TopCount.

Mistura de Enzima:

Enzima

Tris Hcl 50mM (pH 7,5)

EGTA 0,lmM DTT 2mM 1 mg/mL de BSA

Tampão de Reacção:

Tris Hcl 50mM (pH 7,5)

EGTA 0,lmM

Acetato de magnésio lOmM DTT 2mM

Os seguintes compostos foram ou podem ser preparados de acordo com os métodos de síntese descritos acima. Para efeitos dos Quadro I e Quadro 2 abaixo, a actividade de cada composto, a qual pode ser determinada utilizando o método de ensaio de MAPKAPK5 descrito no Exemplo 1, é expressada do seguinte modo:

++++ composto exibiu uma IC5o para a MAPKAPK5 de 1-100 nM +++ composto exibiu uma IC5o para a MAPKAPK5 de 101-500 nM 197

++ composto exibiu uma IC50 para a MAPKAPK5 de 501-1000 nM

+ composto exibiu uma IC50 para a MAPKAPK5 >1000 nM QUADRO 1: Estrutura e actividade de Compostos Ilustrativos

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 1 r? >3 i' N-N 362,40 + + 2 w X; N—N 375,44 + 3 t 428,50 + 4 ζΡ m'K^ fe 402,46 + H 5 xjn0° 415,46 + 6 £P te te 0 434,53 + + + + 7 55 446,49 + 198

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 8 ff C'XJ HN ií 446,49 + 9 »kv> 434,53 + + 10 £1° t 433,45 + 11 jC° 433,45 + 12 rJJ V" ír IM—N H 376,42 + + 13 - n jj~ jjtt 'n 421,48 + 14 n CCJ HN ^ 3 451,44 + 15 rr(J 1 421,48 + + + 16 rf- N<i'-T^N ίγΝ-./ íV N-N 389,47 + 199

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 17 rVN° m ^ V^N Λ N-N H 380,39 + 18 Cl X 0 Xo hnA^ X") Λ N-N H 396,84 + 19 HXO° MN"'* -' XN> y~N Ω 405,42 + 20 jQXO X X-n~n o N-N H 406,45 + 21 HN X/ ^ .,ίΧ^Ν Xi? °x NH, 465,54 + + + 22 χχο Hljl ^ Χ·Ν"|/ cy Vnh. 0 465,54 + + 23 O— o XXCj 362,40 + 24 - X rX í 449,54 + + 25 X ír 430,40 + 200

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 26 |T 492,54 + 27 r» *7 ^s' 420,50 + + + 28 . Γιλ 0=KNH 462,58 ++++ 29 O & J-f °=( 405,42 + 30 7 446,52 + 31 jcr^ Q 403,49 + + + 32 aò' fc. 462,58 + + + 33 Oy. ΐ '3 0 H 427,47 + + + 34 °ri à$ \-N\% 0 405,42 + + + 201

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 35 'Οχ lo „íò 441,50 + 36 ι?°Λ £ 0 H 468,57 ++++ 37 ΓΓ9 ,tV..... HN ^ N N 392,42 + 38 CJcl 403,49 + + 39 o Xa 7 441,50 + 40 r> XX fVN> LyNV O N-N H 361,41 + + 41 Γ'ν N N^.-1 NòrN> IN r_/? 363,38 + 42 ./X'" Χη LYn-n Λ N-N H 416,49 + 43 cr HN rXr"> X 404,48 + 202

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 44 F rrt Xr t 444,43 + 45 F „o':n Í 443,44 + 46 J> 415,50 + 47 0o 0 422,47 + + + 48 Hl/^ r.) H3 428,52 + 49 {V> & 469,62 + 50 χχΝ^0 utK&N r 378,46 + 51 οΛ ip ò 419,56 + 52 o í Υ'Χ 390,45 + 203

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 53 jo" tó C H 477,51 + 54 ”6) α y-NH, 0 475,58 + + + 55 »οΛ π 5- 463,57 + + + 56 .CrOÍ' 0 503,51 + + 57 ητ° F HN ^ Λ-Ί 0 502,52 + + + 58 ΗΝ-'Ο" f"NH2 474,59 + + + 59 ,σ°" f 401,48 + 60 ij N N 402,47 + 61 O »V,> K H.N 422,47 + 204

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 62 fY; X" '>Jy0 463,57 + + 63 ptt> f )=o HjN 501,54 + 64 £r°* HN f'r), Γ N-N 442,45 + 65 0 rJ jX t 471,52 + + + 66 jOr° V, w 429,51 + 67 r? Frr° HN £ N-N H 380,39 + 68 Ck^-^-N-^P I 1 HN fV,> p" 396,84 + 69 ÍJ nr° fo 420,50 + 70 r? [ If HN'^X/ fSp kVN'’N OH N-N 392,42 + 205

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 71 xte te í 468,52 + 72 Hxte N-Ó 414,43 + 73 ΓΓ° te 436,50 + 74 „teJ te 477,60 + 75 445,46 + 76 rte te & & 0 H 461,91 + 77 te te 503,01 + + + 78 - f? XI ~ MT» nh2 389,42 + 79 „ Y *17 te 3= 469,55 ++++ 206

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 80 r? J0r° 0 2 471,54 + 81 rA X X % 512,64 + Ω mIJ “ 82 OH 403,45 + 83 cl „0 fVl Y* 444,54 + X OH 84 ,X lo 402,51 + + X 85 r? JO to 0 470,56 + 17 HjN 86 N ολ jCJ J 447,50 ++++ 87 N o χτ X> X 0 H 428,46 ++++ 88 ολ jcX £ 446,52 ++++ 207

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 89 η,°Λ $3 a- 461,59 ++++ 90 rY" jOr° 445,53 + 91 _acl íY 446,53 + 92 Y ^ò^íi 467,58 ++++ 93 Γι γγ 412,46 + 94 γ° β 0 406,41 ++++ 95 Y íe Λ. 476,61 + 96 Y°" Y> > 477,60 + 97 y/ hY ' 468,57 + 208

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 98 S- 469,55 + 99 .0° Òrl & 0 H 429,44 + + + 100 f J HN X" N-N 375,40 + 101 í 470,54 + + + 102 CnX: ja o> 482,59 ++++ 103 xj°nX Λ 417,52 + + 104 jf’ 412,46 + 105 O,-, ,„o1J £ 440,47 ttt+ 106 Λ r/- í: r ’ £ 453,55 + 209

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 107 *5 A 470,58 + 108 7 486,56 ++++ 109 οΛ· 468,57 + 110 /P HN ^ f 405,47 + 111 fj0 HJJ t 417,43 + + + 112 °γ^ N-A. jGr° θ'/ H 482,55 + + + 113 n Ϋ 0 N 433,50 + + 114 cA xr A 11 c H 496,62 + 115 Q -Αγ- 0 H 348,41 + + + 210

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 116 Í 0 H 350,38 + 117 NH % 0 H 360,35 + 168 ζΧ, 332,33 + 169 ,οΟΎ" 417,48 + + 170 t 536,56 + + + 171 X U 471,49 + 172 rA /X° kX X" 403,49 + 173 .Xo % 469,55 + 174 xxF t 378,34 + 175 t 484,57 + + + 211

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 176 £ to> 372,39 + + + 177 1 χτυ" to £ 375,40 + 178 toA‘' r 449,52 + + 179 470,54 + + + 180 rV> £ 503,01 ++++ 181 334,38 + + + 182 JH * 320,36 + + + 183 O “ Cr r °^M„ 460,54 ++++ 184 to & 362,44 + + + 185 tor "to> '3 349,40 + 186 ,rj 391,48 + 212

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 PARA MAPKAPK5 (nM) 187 cry í? 417,52 + Cyr ff ' 188 íf 482,59 + + + + ¥ 189 XJ° íf 483,58 + + + + 190 ¥ % 469,55 + + + QUADRO 2: Estrutura e actividade de Compostos de Benzamida Ilustrativos

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 para MAPKAPK5 (nM) 118 jdV, Ϊ 1 J ¥ " 411,43 + 119 0 X f J Γ JC 0 VN'“ α H 438,45 + 120 xxVcx HN 0 N x LI <’ á: N ν' 455,48 + 121 JOÍTO- 514,57 + 213

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 para MAPKAPK5 (nM) 122 0 11 ,1 H [l J HN'' '0 ^ f 440,47 + 123 fVN> 0 V O N-N H 410,44 + 124 A V hn^Ynh γΙγ^Ν 0 N-N H 411,43 + 125 Ac fV 0 Λ N-N H 376,42 + 126 jOlo Hl? Y ° Λ Nl-N H 374,41 + 127 a rA Y — Y“-' nÀ^n 0 ic' N-N 431,50 + + 128 VN> 0 ΑΑ 13 N-N 320,32 + 129 r V„> 0 r N-N 348,37 + 130 jXaO HN * v0 X’ N-N 1- 416,49 + 214

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 para MAPKAPK5 (nM) 131 /^0H A^n 0 Γ r /> ΟγΥ A N-N 426,44 + 132 hn - y kl'> Y k° HjN 499,56 + 133 Α'Υ A Ύ HjN 456,49 + 134 A Y f vr A>0 y-N Λ N-N H 424,47 + 135 J-L X "o HN fV;> >;· N-N H 397,40 + 136 N-N Y Hf HN Y^Y,nx Y 0 445,49 + + 137 H N-N V A HN "Â- 425,46 + + 138 o 0 HN. _ AO" 0 417,48 + + 139 H N-N Y Γρ N-^x^N Ap o A 431,50 + + 215

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 para MAPKAPK5 (nM) 140 H 4 XX/} o 372,39 + + 141 <'yS r d V 0 461,53 + + 142 4 tr1·γΝ 0 374,41 + 143 N-N 4 HNv^, YY/lY~N 0 /'=0 445,49 + + 144 d 44 õ HN. /-v ^ ur^ 0 497,54 + + 145 d dO ™γ-χ r-^N'4' Y, r jN 0 465,52 + + 146 4 “cio °s 418,46 + 147 Y, CS 479,55 + + + 148 d ν-.,-Λχ. N T N"V "XX/J^ 0 466,51 + + 216

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 para MAPKAPK5 (nM) 149 N-N HN_ 1 '1 H Υγ- 406,45 + 150 N-N Y Y / J WJ· 0 447,50 + + 151 H N-N V (/ N *| Ν-—γ.Ν HV^s IY_ 5 ' u ^ OH 440,47 + 152 N-N „ Y (Ni n I. r XXCr V ^ o 445,53 + + 153 Y A-q. kl 494,56 + + 154 1 Ovf '0 496,53 + 155 N-N . 1 <ΥΥ γ (ΥγΝ 0 NH Ύ 0 488,56 + + 156 H 5 UfÍ ™Y_. Π ~ 0' o 392,42 + 157 Y Ν-.Λ <ki 1 N γ HN. /-v XX r 0 406,45 + 217

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 para ΜΑΡΚΑΡΚ5 (ηΜ) 158 H 9 <9 0 404,43 + + 159 4 0 386,42 + + 160 N—N .3 <'J 1 N HNn t ^Y^S- 0 394,46 + + 161 N-N y /N'N^j n HN. /v U uXV 0 434,46 + + 162 By <y\ " r hn_. I 1 h i 0 Λ 447,55 + + 163 Η N-N V <9 0 431,50 + + + 164 N-N Y irS tfKt-u my^ 0 376,42 + 165 Η N-N V φ N r γγ ™1Ί rvN^ Υ-γ-Ύ Ο 471,57 + 16 6 N-N Υ< Ν γΝ ™νχ ¥ Η Ο 364,37 + + 218

Composto # ESTRUTURA MM (calc.) IC50 para MAPKAPK5 (nM) 167 XrYO HlO '>· 470,52 + + 191 XrV“ 479,55 + 192 f'r}. 0 X 477,49 + 193 X >5'Q 547,58 + 194 x/x Μ V 5r 0 482,51 + 195 'X 544,62 + + + 196 Pa" X 544,62 + + + 197 _χ^-ιτνΟ 542,56 + 198 476,50 +

Exemplo 2. Desenvolvimento de um ensaio para a identificação de reguladores da expressão de MMP1 por fibroblastos sinoviais primários activados. 219

Para identificar compostos que diminuem a actividade de degradação de ECM de células, a actividade de degradação de ECM de células pode ser induzida para permitir uma detecção apropriada da sua actividade e para se atingir uma leitura mais clara. No contexto de RA, as células de eleição são fibroblastos sinoviais de mamíferos e os activadores que podem ser utilizados para induzir a actividade de degradação de ECM são citoquinas relevantes no campo da artrite: por exemplo TNF-α, ILip, IL6, OSM, IL17 e MIFl-a. Esta lista não é compreensiva devido à pletora de citoquinas potencialmente envolvidas na patogénese da RA (Smolen e Steiner, 2003). Para conceber um ensaio in vitro que seja tão próximo quanto possível da complexidade da patologia, o activador aplicado deveria ser uma mistura de factores gerados pondo em contacto células produtoras de citoquinas relevantes no campo da artrite, como monócitos, macrófagos, células T e células B, com um activador. As células produtoras de citoquinas responderão ao contacto produzindo uma mistura complexa e não distorcida de factores. Se a célula produtora de citoquina utilizada também está presente num pannus, e a citoquina aplicada para produzir esta activação está presente no fluido sinovial de doentes com artrite reumatóide, a mistura de factores produzida no final conterá parte dos factores que estão presentes nas articulações de doentes com artrite.

Princípio do 'ensaio de MMP"

As metaloproteases da matriz (MMPs) possuem vários papéis fisiológicos, como por exemplo, a maturação de outras proteases, factores de crescimento e a degradação de componentes da matriz extracelular. A MMP1 é um dos membros da família de MMP que é capaz de degradar colagénio nativo, 220 o componente principal de osso e cartilagem. Um aumento da expressão de MMP1 por fibroblastos sinoviais (SF) é diagnóstico para a progressão de doença artrítica e é diagnóstico para processos erosivos nas articulações (Cunnane et al., 2001). A expressão de MMP1 por SF pode ser aumentada pela activação de SF com activadores relevantes para a artrite reumatóide, como citoquinas como TNF-α ou ILlβ (Andreakos et al., 2003). No seu conjunto, a medição dos níveis de MMP1 produzidos por SF activados é uma leitura que é extremamente relevante no contexto de RA já que este evento reflecte o nível de activação de SF para um fenótipo erosivo como é observado no pannus. Se uma expressão reduzida de um alvo do fármaco candidato nos SF activados conduzir à redução da expressão de MMP1 por estas células, demonstra-se em seguida que o alvo do fármaco está envolvido na regulação da expressão de MMP1 e é assim considerado relevante para o desenvolvimento de estratégias terapêuticas para o tratamento de RA.

Nos exemplos seguintes, o desenvolvimento de um ensaio, chamado adicionalmente como 'ensaio de MMP, monitoriza a produção de MMP1 por fibroblastos sinoviais (SF) em resposta a vários sinais activadores (Exemplo 2.1). A utilização deste ensaio é em seguida descrita para a validação de produtos de genes que são considerados alvo de fármacos para o desenvolvimento de terapêuticas para RA (Exemplo 2.2). A validação de alvos de fármacos é realizada utilizando adenovírus recombinantes, também chamados de vírus anulados ou Ad-siRNAs, que medeiam a expressão de shRNA em células as quais reduzem os níveis de expressão de genes alvo por um mecanismo com base em (RNA de interferência) RNAi (ver WO 03/020931). A identificação de compostos que modulam a actividade dos alvos validados de 221 fármacos é em seguida descrita no Quadro 3. A utilização do 'ensaio de MMP para testar compostos que modulam a actividade de alvos de fármacos identificados é descrita mais abaixo.

Exemplos de Ensaios Vírus de controlo utilizados:

Os vírus de controlo utilizados nestes estudos são listados a seguir. Os adenovírus dEl/dE2A são gerados destes plasmídeos adaptadores por cotransfecção do plasmídeo auxiliar pWEAdãAfHI-rITR.dE2A em células de encapsidação PER.E2A, como descrito em W099/64582.

Virus de controlo negativo:

Ad5-eGFP_KD: Sequência alvo: GCTGACCCTGAAGTTCATC (SEQ ID NO: 1) . Clonado utilizando sítios Sapl em vector e vírus gerados como descrito em W003/020931.

Ad5-Luc_vl3_KD: Sequência alvo GGTTACCTAAGGGTGTGGC (SEQ ID NO: 2). Clonado utilizando sítios Sap 1 em vector e vírus gerados como descrito em W003/020931.

Ad5-M6PR_vl_KD: Sequência alvo CTCTGAGTGCAGTGAAATC (SEQ ID NO: 3). Clonado utilizando sítios Sapl em vector e vírus gerados como descrito em W003/020931. Vírus de controlo positivo:

Ad5-MMPl_vlO_KD: Sequência alvo ACAAGAGCAAGATGTGGAC (SEQ ID NO: 4) . Clonado utilizando sítios Sap 1 em vector e vírus gerados como descrito em W003/020931. Vírus utilizados para validaçao do alvo: 222

Ad5-MAPKAPK5_vl3_KD: Sequência alvo C GGCAC T T TACAGAGAAGC (SEQ ID NO: 5). Clonado utilizando sítios Sap 1 em vector e vírus gerados como descrito em W003/020931.

Ad5-MAPKAPK5_vl2_KD: Sequência alvo ATGATGTGTGCCACACACC (SEQ ID NO: 6). Clonado utilizando sítios Sap 1 em vector e vírus gerados como descrito em W003/020931.

Exemplo 2.1: Desenvolvimento do ensaio de MMP

É desenvolvida uma ELISA em formato de 384 poços para medição de MMP1. São testados vários anticorpos primários, bem como vários protocolos ELISA. 0 seguinte protocolo é desenvolvido e validado para medir níveis de MMP1 em sobrenadantes de SF em placas de 384 poços: placas de 384 poços Lumitrac 600 brancas (Greiner) são revestidas com 2 pg/mL de anticorpo anti-MMPl MAB1346 (Chemicon). O anticorpo é diluído em tampão 40 (1,21 g base Tris (Sigma), 0,58 g NaCl (Calbiochem) e 5 mL NaN3 a 10% (Sigma) em 1 L de água milliQ e ajustada até pH 8,5). Após incubação dum dia para o outro a 4°C, as placas são lavadas com PBS (80 g NaCl, 2g KC1 (Sigma), 11,5 g Na2HP04.7H20 e 2 g KH2P04 em 10 L de milliQ: pH 7,4) e bloqueadas com 100 pL/poço de tampão de caseína (Caseína a 2% (VWR International) em PBS) . No dia seguinte, o tampão de caseína é removido das placas ELISA e substituído por 50 pL/poço de tampão EC (4 g caseína, 2,13 g Na2HP04 (Sigma), 2 g albumina de bovino (Sigma), 0,69 g NaH2P04.H20 (Sigma), 0,5 g CHAPS (Roche) , 23,3 g NaCl, 4 mL de EDTA 0,5 M pH 8 (Invitrogen), 5 mL de NaN3 a 10% em 1 L de milliQ e ajustada até pH 7,0) . É adicionado 0,25 mM de DTT (Sigma) as placas de amostras descongeladas. Após remoção do tampão EC, 20 pL de amostra são transferidos para as placas de ELISA. Após incubação dum dia para o outro a 4°C, as placas são lavadas duas 223 vezes com PBS e uma vez com PBST (PBS com 0,05% de Tween-20 (Sigma)) e incubadas com 35 pL/poço de solução de anticorpo anti-MMPl biotinilado (R&D). Este anticorpo secundário é diluído em tampão C (0,82 g NaH2P04.H20, 4, 82 g Na2HP04, 46,6 g NaCl, 20 g albumina de bovino e 4 mL de EDTA 0,5M pH 8 em 2 L de milliQ e ajustada até pH 7,0) a uma concentração de 5 pg/mL. Após 2 h de incubação à t.a., as placas são lavadas como descrito acima e incubadas com 50 pL/poço de conjugado de estreptavidina-HRP (Biosource). O conjugado de estreptavidina-HRP é diluído em tampão C a uma concentração de 0,25 pg/mL. Após 45 min, as placas são lavadas como descrito acima e incubadas durante 5 min com 50 pL/poço de substrato de ELISA BM Chem (Roche). A leitura é realizada no Luminómetro Luminoscan Ascent (Labsystems) com um tempo de integração de 200 ms ou com um leitor Envision (Perkin Elmer). O aumento da expressão de MMP1 por SF após tratamento com citoquinas relevantes no campo da RA (TNF-α, ILip e OSM) ou uma combinação destas é mostrado na Figura 2 como barras brancas. Para esta experiência, os SF são aplicados em placas de 96 poços, 3.000 células/poço. 24 h depois, o meio é trocado para meio M199 suplementado com 1% de FBS. Um dia depois da troca do meio, as citoquinas ou combinações destas são adicionadas às culturas, sendo cada citoquina adicionada até uma concentração final de 25 ng/mL. 72 h após a adição de citoquinas, o sobrenadante é recolhido e processado no ELISA MMP1 como descrito no protocolo dado acima. Em simultâneo com esta experiência, os SF são activados, utilizando o mesmo protocolo, com o sobrenadante de células THP1 (diluído 2 vezes em M199 + 1% FBS) tratado com as mesmas citoquinas ou combinações de citoquinas durante 48 h em meio M199 + 1% FBS. Os níveis de MMP1 para 224 estas amostras são mostrados na Figura 2 como barras cinzentas. A indução da expressão e MMP1 por SF activados com os sobrenadantes de células THP1 tratadas com TNF-α é mais forte (indução >4,5 vezes) relativamente aos SF activados com TNF-α recombinante sozinho (indução 3 vezes) e quase iguala a indução de 5 vezes obtida com uma mistura de 3 citoquinas purificadas (TNF-α, IL13b, OSM). Este resultado indica que o sobrenadante de células THP1 induzidas com TNF-α contém, além de TNF-oc, outros factores pró-inflamatórios que activam SF para a expressão de MMP1. Como o papel do TNF-oí na patogénese de RA está validada (os bloqueadores de TNF-α como Infliximab e Etanercept mostram alguma eficácia no tratamento de doentes com RA) e como as células THP-1 são representativas de monócitos / macrófagos presentes nas articulações de doentes com RA, a mistura activadora com base em TNF-α preparada pondo em contacto células THP-1 com TNF-α conterão factores presentes nas articulações de doentes com RA e é subsequentemente relevante para a RA. Este activador complexo com base em TNF-α, também chamado de 'activador complexo', será também utilizado como base para o 'ensaio de MMP'. A inibição da activação de SF pelo 'activador complexo' é mostrada utilizando dexametasona, um agente anti-inflamatório potente que também reduz fortemente a artrite induzida por colagénio em roedores (Yang et al., 2004) (Figura 3). Demonstra-se que a dexametasona reduz, de modo dependente com a dose, as quantidades de MMP1 produzida pelos SF activados pelo activador complexo. Os SF são aplicados a uma densidade de 3000 células/poço em placas de 96 poços. 24h após aplicação são adicionadas concentrações crescentes de dexametasona às células. Após incubação dum dia para o outro, o meio de cada poço é renovado para o 225 sobrenadante de células THP-1 tratadas com TNF-oí (diluído a 50% em M199 + 0,5%FBS) e a mesma concentração de dexametasona que a adicionada no dia anterior. 48h após tratamento, o sobrenadante é recolhido e submetido à ELISA MMP1 descrita acima. A adição de dexametasona reduz claramente a expressão de MMP1 por SF, com um valor de IC50 de cerca de lnM (ver Figura 3) . Estes dados mostram que a expressão de MMP1 por SF activados pode ser reduzida pela adição de um inibidor fisiologicamente relevante e representam uma prova de princípio para o 'ensaio de MMP'.

Exemplo 2.2: ΜΆΡΚΆΡΚ5 Modula a Expressão de MMPl induzida pelo 'Activador complexo' de SF (A) Vírus Ad-siKNA Actua para anular a Expressão de MAPKAPK5.

Adenovírus recombinantes que medeiam a expressão de siRNA direccionados para MAPKAPK5 e eGFP são gerados de acordo com o procedimento descrito em W003/020931. A sequência alvo utilizada no adenovírus recombinante é: CGGCAC T T TACAGAGAAGC (SEQ ID NO: 5) e ATGATGTGTGCCACACACC (SEQ ID NO: 6). A sequência alvo no ARNm de eGFP utilizado no adenovírus recombinante é: GCTGACCCTGAAGTTCATC (SEQ ID NO: 1). Estas sequências são clonadas no plasmídeo adaptador utilizando sítios Sapl. Adenovírus dEl/dE2A são gerados de estes plasmídeos adaptadores por cotransfecção do palsmídeo auxiliar pWEAd5AfHI-rITR.dE2A em células de encapsidação PER.E2A, como descrito em W099/64582. A funcionalidade de um adenovírus direccionado para MAPKAPK5 é testada como se segue. Estes adenovírus são utilizados para infectar SF humanos primários cultivados em 226

placas de petri como se segue. No dia 1, aplica-se 500.000 SF por placa de petri. Um dia depois, as células são infectadas com Ad5-MAPKAPK5-vl3_KD (1,6E 9 VP/mL) ou Ad5-eGFP-v5_KD (1,3E10 VP/mL) a um MOI de 4000 (com base nos títulos (número de partículas de vírus por mL) definidos para o vírus por Q-rt-PCR) . No dia 7, as células são desprendidas da placa de petri segundo procedimento corrente utilizando uma solução de tripsina EDTA. A tripsina é em seguida neutralizada pela adição de meio de crescimento DMEM suplementado com 10% de FBS. As células são em seguida recolhidas por um passo de centrifugação (1000 rpm, 5 min) . O sedimento é submetido a lise em 100pL de tampão RIPA fresco (Tris 50mM pH7,5, NaCl 150mM, 1% de desoxicolato, 1% de Triton X100, 0,1% de SDS). As amostras são em seguida submetidas a ultra-sons durante lOs. A concentração de proteína das amostras é em seguida determinada utilizando o estojo BCA (Pierce, N° Cat 23227) como descrito pelo fornecedor, utilizando BSA como um padrão. A 30pg de lisado de células diluído a 19,5pL em tampão RIPA, são adicionados 3,5pL de agente de redução (agente de redução NuPage N°10, Invitrogen NP0004) e 7,5yL de tampão de amostra (tampão de amostras NuPage LDS, Invitrogen NP0007). A amostra de 30pL é em seguida aquecida à ebulição durante 5min e transferida para um gel de poliacrilamida a 10% (Invitrogen NP0301). Para permitir estimar o nível de anulação da proteína, 15pg, 7,5pg e 3,75pg do lisado das células Ad5-eGFP-v5_KD infectadas também são transferidos para o gel. O gel é em seguida corrido durante 2 horas a 100V em tampão de corrida lx MOPS/SDS NuPage (Invitrogen NP001). São utilizados 10pL de padrão Seablue Plus pré-revelado (Invitrogen LC5925) para estimar o tamanho da proteína no gel. As proteínas no gel são em seguida transferidas para uma membrana de PVDF 227 (Invitrogen LC2002) por um procedimento de transferência húmida utilizando um tampão de transferência preparado misturando lOOmL de tampão de transferência Nupage 20* (NP0006-1), 400mL de metanol e 1500mL de água Milli Q. Antes da transferência, a membrana é inicialmente embebida em metanol e no tampão de transferência. A transferência é realizada a 100V durante 90 minutos. A membrana é em seguida bloqueada durante 30 min embebendo em tampão de bloqueio (2% de potência de bloqueio (Amersham, RPN 2109) preparado em PBST (PBS suplementado com 0,1% de Tween 20 (Sigma, P1379)). Após bloqueamento, a imunodetecção é realizada utilizando um anticorpo monoclonal de ratinho contra MAPKAPK5 (BD Biosciences, Cat N°612080) diluído a 250 vezes em tampão de bloqueio. Após incubação dum dia para o outro com este anticorpo primário, a membrana é lavada 3 vezes com PBST e incubada 1 h com o anticorpo secundário ((Ig policlonal de cabra anti-rato, conjugado com HRP (DAKO P0447) diluído 50000 vezes em tampão de bloqueio. A mancha é em seguida lavada 3 vezes em PBST e a detecção é realizada com ECL advance (RPN2109, Amersham) num Kodakimager de acordo com as instruções dos fabricantes. A transferência de Western revelou um nível de expressão inferior de MAPKAPK5 nas células infectadas com Ad5-MAPKAPK5-vl3_KD relativamente às células infectadas com vírus de controlo negativo Ad5-eGFP-v5_KD. A comparação com as amostras infectadas com Ad5-eGFP-v5_KD diluídas permitiu estimar que a redução na expressão era de 2 vezes. A transferência igual das amostras de 30yg é demonstrada por imunodetecção de β-actina após remoção do anticorpo MAPKAPK5 por um 'procedimento de remoção' (ebulição da membrana em PBST durante 5 minutos). A imunodetecção de β-actina é realizada de acordo com o método descrito para a detecção de MAPKAPK5, mas utilizando um anticorpo 228 policlonal de cabra contra β-actina (Santa Cruz, N° Cat SC-1615) a uma diluição de 1000 vezes como anticorpo primário e um anticorpo de coelho anti-cabra a uma diluição de 50000 vezes como um anticorpo secundário. Os resultados desta experiência são dados na Figura 4. No seu conjunto, esta experiência demonstrou a funcionalidade do vírus Ad-siRNA produzido para reduzir os níveis de expressão de MAPKAPK5 em SF primários humanos.

(B) Ad-siRNA com MAPKAPK5 anulada Reduz a Expressão de MMPl induzida por SF A eficácia do vírus Ad5-MAPKAPK5-vl3_KD no 'ensaio MMP' é testada como se segue. Dia 1, SF (passagem 9 a 10) são aplicados em placas de 96 poços a uma densidade de 3000 células por poço em meio de crescimento sinovial completo (Cell Applications) . Um dia depois, as células são infectadas com quantidades crescentes de (3, 6; 9, 12 ou 15 pL) dos seguintes vírus: Ad5-eGFP-v5_KD, Ad5-MAPKAPK5-vl2_KD, Ad5-MAPKAPK5-vl3_KD, Ad5-MMPl-vl0_KD. A carga de vírus é corrigida pela adição do vírus neutro Ad5-Luc-vl3_KD para trazer o volume final de vírus nas células até 15pL em todos os poços. Esta correcção garante que o efeito observado não resulta da carga de vírus aplicada nas células. As células são em seguida incubadas durante 5 dias antes do passo de activação. Este passo envolve a substituição, em todos os poços, do meio de crescimento por 75pL de meio M199 suplementado com 25pL de 'activador complexo'. 48 h após o passo de activação, o sobrenadante é recolhido e submetido a ELISA de MMPl como descrito no Exemplo 1. Os resultados da experiência são mostrados na Figura 5. A qualidade da experiência é demonstrada pela eficácia do vírus Ad-siRNA direccionado para o próprio 229 ΜΜΡ1. Este vírus de controlo positivo reduz fortemente a expressão de MMP1 por SF, enquanto o vírus de controlo negativo, concebido para atingir a expressão de luciferase, não influencia os níveis de expressão de MMP1. Dois vírus utilizados para validar o alvo de MAPKAPK5 (Ad5-MAPKAPK5-vl2_KD e Ad5-MAPKAPK5-vl3) também conduzem a uma redução clara da expressão de MMP1 induzida por activador complexo pelos SF primários humanos. Desta experiência pode concluir-se que a MAPKAPK5 representa um alvo útil do fármaco que se demonstrou que modula a expressão de MMP1 em SF. Analogamente, também é expectável que a inibição da actividade enzimática de MAPKAPK5 por um composto de molécula pequena reduza a expressão de MMP1 induzida pela 'citoquina de complexo' no 'ensaio de MMP. Também é expectável que a inibição da actividade enzimática de MAPKAPK5 por um composto de molécula pequena reduza a degradação das articulações associada à RA. (C) 'Ensaio de MMP' in vitro para Testar Compostos que Inibem a MAPKAPK5

Os compostos que inibem a actividade de MAPKAPK5 num ensaio bioquímico (isto é, sem células, utilizando enzima purificada), são testados no 'ensaio de MMP' segundo o protocolo seguinte.

As soluções-mães de composto (todas a uma concentração de lOmM em 100% de DMSO) são diluídas 10 vezes em água (água destilada, GIBCO, isenta de DNAse e RNAse) para se obter uma solução de trabalho intermédia a lmM em DMSO a 10%. Esta solução de trabalho intermédia é ainda diluída 3 vezes (ou 10 vezes) em DMSO a 10% para se obter uma solução de trabalho intermédia de concentração 333μΜ (ou 100μΜ), 230 respectivamente, em DMSO a 10%. As soluções de trabalho intermédias a lmM bem como a 333μΜ (ou ΙΟΟμΜ) são em seguida diluídas 10 vezes em DMSO a 1,1% para se obter soluções de trabalho lOx com concentração de ΙΟΟμΜ e 33,3μΜ (ou 1 ΟμΜ) em DMSO a 2%. Esta solução de trabalho lOx é em seguida diluída 10 vezes em meio M199 suplementado com 1% de FBS para se obter a "preparação de composto lx" final contendo os compostos a ΙΟμΜ e 3,33μΜ (ou ΙμΜ) e DMSO a 0,2%. Estas são as condições finais às quais os compostos são testados nas células. Em paralelo, a solução de trabalho lOx é diluída 10 vezes em "activador complexo" (isto é, o sobrenadante de TNF-α tratado células THP1 produzidas como descrito no Exemplo 1) que é diluído 2 vezes em M199 suplementado com 1% de FBS para produzir a "composto lx em preparação de activador complexo a 50%".

No dia 1, aplica-se RASF em placas de 96 poços (fundo plano, tratados com cultura de tecidos, Greiner) a uma densidade de 3000 células/ poço em meio de crescimento sinovial completo (Cell Applications). No dia 5, os compostos são adicionados às células cultivadas como se segue. O meio é completamente retirado das células e substituído por 75pL das "preparações de composto lx" contendo os compostos a 10μΜ ou 3,33μΜ (ou ΙμΜ) em meio M199 suplementado com 1% de FBS e DMSO a 0,2%. Após um período de incubação de 2 horas, o que permite que os compostos equilibrem e penetrem nas células, são adicionados 25pL do 'composto lx em preparações de activador complexo a 50%' aos poços por cima da "preparação de composto lx", nos poços contendo os compostos correspondentes à concentração correspondente. Deste modo, em última análise aplica-se um activador complexo diluído 8 vezes às células. Em seguida é realizada uma incubação de 231 48h e são depois processados 20pL do sobrenadante das células na ELISA de MMP1 como descrito acima, fornecendo dados primários (RLU: unidades relativas de luminescência). Os seguintes controlos são incluídos nas experiências. Um controlo de sinal máximo, no qual as células são activadas pelo activador complexo mas é apenas adicionado o veículo de DMSO a 0,2% (e, deste modo, sem composto). Este controlo indica o nível máximo de MMP1 que pode ser conseguido no ensaio. Um controlo de sinal mínimo também é incluído nestas experiências. Aqui, as células não são activadas. O meio das células é em seguida trocado para 100pL de meio M199 suplementado com 1% de FBS no dia 5. Este controlo fornece os níveis de base de MMP1 produzidos pelo RASF. A percentagem de inibição da expressão de MMP1 conseguida pelos compostos é em seguida calculada com base nos dados de RLU fornecidos pelo ELISA usando a seguinte fórmula: [[(níveis máximos de MMPl - níveis mínimos de MMPl) -(nível de MMPl para o composto X à concentração Y - níveis mínimos de MMPl)]/( níveis máximos de MMPl - níveis mínimos de MMPl)]xlOO. A toxicidade dos compostos é avaliada como se segue. Dia 1, aplica-se SF em placas de 96 poços brancas, tratadas com cultura de tecido a uma densidade de 3000 células por poço em 100yL de meio de crescimento sinovial completo. 0 manuseamento do composto, a adição do composto às células e a activação das células são realizados como descrito acima neste exemplo para a determinação dos níveis de MMPl. Após o período de incubação de 48h, o meio é removido dos poços, substituído por 50pL de meio M199 fresco suplementado com 1% de FBS. Em seguida são adicionados 50pL de substrato (estojo de viabilidade celular Celltiter Glow da Promega) aos poços. Após um período de incubação de 10 min, mede-se 232 o sinal de luminescência. Uma redução do sinal de luminescência em mais do que 50% em comparação com os poços de controlo máximo é considerada reflectir uma toxicidade significativa. Não se observa qualquer toxicidade para os compostos testados no 'ensaio de MMP'.

Entender-se-á que factores como a capacidade diferencial de penetração na célula dos vários compostos podem contribuir para discrepâncias entre a actividade dos compostos na bioquímica in vitro e nos ensaios de MMP celulares.

Para os efeitos dos Quadro 3 e Quadro 4 abaixo, a EC50 para a MMP1 de cada composto, a qual pode ser determinada utilizando o método de ensaio aqui descrito, é expressada como se segue:

**** composto apresentou uma EC50 para a MMP1 de 1-100 nM *** composto apresentou uma EC50 para a MMPl de 101-500 nM ** composto apresentou uma EC50 para a MMPl de 501-1000 nM

* composto apresentou uma EC50 para a MMPl >1000 nM QUADRO 3 Composto # ECso MMPl (nM) 1 * 2 * 3 k k k 4 k 5 k k k 6 k k k 7 k 8 k k

Composto # ECso MMPl (nM) 13 k k k 14 k 15 k k k 16 k 17 k 18 k k 19 k 20 k 233 Composto # EC50 MMP1 (nM) 9 * * 10 * * 11 k k k 12 k * 25 * 26 * 27 * * 28 * * 29 * 30 * 31 * 32 * * 33 k k k 34 k k k k 35 k k k 36 k k k 37 k * 38 * 39 * 40 * 41 * 42 * 43 * 44 * 45 * 46 * 47 * * 48 k k k 49 k

Composto # EC50 MMP1 (nM) 21 k k k 22 k 23 * 24 k k k 52 k 53 k k 54 k k k 55 k k k 56 k k 57 k k k 58 k k k 59 k 60 k 61 k k 62 k 63 k k k 64 k 65 k k k 66 k k 67 k 68 k 69 k 70 k 71 k 72 k 73 k 74 k 75 k 76 k k 234 Composto # EC50 MMP1 (nM) 50 k k k 51 k * 79 * * 80 k k k 81 k 82 k 83 k 84 k 85 k 86 k 87 k k k 88 k k 89 k k 90 k 91 k 92 k k k 93 k 94 k 95 k 96 k 97 k 98 k 99 k 100 k 101 k 102 k 103 k k 104 k 105 k

Composto # EC50 MMP1 (nM) 77 * 78 * 106 107 108 * 109 * 110 * 11 * 112 * 113 k k k 114 k 115 * 116 * 117 k k k 168 k 169 * 170 * 171 * 172 * 173 * 174 * 175 * 176 * * 177 * 178 * 179 * 180 * 181 * 182 * 235 Composto # EC50 MMP1 (nM) 183 * 184 * QUADRO 4 Composto # MMP1 EC5o (nM) 118 * 119 * 120 * 121 * 122 * 123 * 124 * 125 * 126 * 127 * 128 * 129 * 130 * 131 * * 132 * 133 * 134 * * 135 136 * 137 * 138 * 139 *

Composto # EC50 MMP1 (nM) 185 *

Composto # MMP1 EC5o (nM) 144 145 * 146 * 147 * 148 * 149 * 150 * 151 * 152 * 153 * 154 * 155 * 156 * 157 * 158 * 159 * 160 * 161 * 162 * 163 * 164 * 165 * 236 Composto # MMP1 EC5o IlllllllIllMilIIIIllllll 140 * 141 k 142 k 143 k 194 k k 195 k 19 6 k

Composto # MMP1 EC50 ijjjli!!!!!!!!!!!!!! 166 * 167 * 191 * 192 k k k 193 k 197 k 198 zk

Exemplo 3: Ensaio para avaliar o efeito de compostos na libertação de citoquinas por PBMC humanos Células mononucleares de sangue periférico humano (PBMC) são isoladas de "crostas inflamatórias" preparadas do sangue de voluntários saudáveis, isoladas essencialmente segundo o método de Boyum (1984). Resumidamente, a crosta inflamatória é diluída 1:1 com PBS lx (Gibco) e 30 mL são cuidadosamente colocados por cima de 20 mL de Lymphoprep™ (Lucron Bioproducts) em tubos Falcon de 50 mL. Após centrifugação (35 min, 400 g, 18°C), as células mononucleares são recolhidas da interfase branca e lavadas 3 vezes com PBS lx por ressuspensão e centrifugação (10 min, 200 g). Os PBMC isolados são finalmente ressuspendidos em RPM1 1640 (N° Cat. 21875, Gibco) que é suplementado com 10% de FBS termicamente inactivado (Hyclone).

Para o ensaio, as PBMC são aplicadas a 2,5E6 células/mL em 160 pL em placas de 96 poços (Nunc) . A diluição em série dos compostos de ensaio são feitas primeiro em DMSO (Sigma) e depois diluídas 50 vezes em meio M199 (Gibco) contendo 1% 237 de FBS termicamente inactivado. Os compostos são ainda diluídos a 1/10 nas placas de ensaio para se obter uma concentração final de DMSO de 0,2%. As células são pré-incubadas com os compostos durante lha 37°C, 5% de CO2. Em seguida, as células são estimuladas com LPS (Escherichia coli serotipo 026:B6, N° Cat. L2654, Sigma) que é adicionado num volume de 20 pL para uma concentração final de 1 pg/mL e as células são ainda cultivadas durante 24 h. As placas são centrifugadas e o sobrenadante é recolhido e conservado a -80°C até análise de diluições apropriadas em ELISA.

Desenvolveu-se o seguinte protocolo ELISA de quimioluminescente de 384 poços para medir os níveis de TNFa no sobrenadante: Placas Lumitrac 600 brancas de 384 poços (Greiner) são revestidas com (40 pL/poço) anticorpo de captura anti-TNFa (N° Cat. 551220, BD Pharmingen) que é diluído a 1 pg/mL em PBS lx (Gibco). Após incubação dum dia para o outro a 4°C, as placas são lavadas com PBS lx (80 g NaCl, 2g KC1 (Sigma), 11,5 g Na2HP04.7H20 e 2 g KH2P04 em 10 L de milliQ; pH 7,4) e bloqueadas com 100 pL/poço de tampão B (PBS lx contendo 1% de BSA (Sigma), 5% de sacarose (Sigma) e 0,05% de NaN3 (Sigma)) . Após 4 h de incubação à t.a., o tampão de bloqueio é removido e as placas são lavadas uma vez com PBST (PBS lx com 0,05% de Tween-20 (Sigma)). Em seguida, são transferidos 40 pL de amostra para as placas de ELISA e as placas são incubadas a 4°C. NO dia seguinte, as placas são lavadas 3 vezes (duas vezes com PBST e uma vez com PBS) e são adicionados 35 pL/poço de anticorpo anti-TNFa biotinilado (N° Cat. 554511, BD Pharmingen) diluído primeiro até uma concentração de 250 ng/mL em tampão D (PBS lx com 1% de BSA) . Após 2 h de incubação à t.a., as placas são lavadas como descrito acima 238 e são adicionados 35 pL/poço de uma diluição a 1/2000 de conjugado de estreptavidina-HRP (N° Cat. SNN2004, Biosource) em tampão D. Após 45 min, as placas são lavadas como descrito acima e incubadas durante 5 min com 50 pL/poço de Substrato de ELISA de Quimioluminescência BM POD (Roche). A leitura é realizada no Luminómetro Luminoscan Ascent (Labsystems) com um tempo de integração de 100 ms fornecendo dados primários (RLU: unidades relativas de luminescência). Os seguintes controlos são incluídos nas experiências, um controlo de sinal máximo, no qual as células são activadas por LPS mas é apenas adicionado o veículo DMSO a 0,2% (e, desse modo, sem composto). Este controlo indica o nível máximo de TNFa que pode ser alcançado no ensaio. Nestas experiências também é incluído um controlo de sinal mínimo. Aqui, as células não são activadas. Este controlo fornece os níveis de base de TNFa produzidos pelos PBMC. A percentagem de inibição (PIN) da libertação de TNFa, conseguida pelos compostos é depois calculada com base nos dados de RLU fornecidos pelo ELISA utilizando a seguinte fórmula: 100 - [((nível de TNFa com o composto X à concentração Y - níveis mínimos de TNFa)/(niveis máximos de TNFa - níveis mínimos de TNFa))x]00]. Quando os compostos são testados a 8 concentrações (diluição em série a 1/3), os valores de EC50 podem ser calculados por adaptação de curva às médias dos dados de PIN obtidos para um composto a cada concentração de ensaio.

Para avaliar o efeito de compostos na libertação de IL1 e IL6 por culturas de PBMC estimuladas por LPS, pode medir-se diluições apropriadas do sobrenadante utilizando o mesmo protocolo de ELISA como descrito acima. Pode utilizar-se pares de anticorpos condizentes para ELISA de IL1 e IL6 239 (todos de R&D Systems) como se segue: anticorpo de captura anti-lLl (N° Cat. MAB601) utilizado a 0,5 pg/mL, anticorpo de detecção anti-ILl biotinilado (N° Cat. BAF201) utilizado a 50 ng/mL; anticorpo de captura anti-IL6 (N° Cat. MAB206) utilizado a 1 pg/mL; anticorpo de detecção anti-IL6 biotinilado (N° Cat. BAF206) utilizado a 50 ng/mL.

Para efeitos do Quadro 5 abaixo, EC5o para PBMC de cada composto, a qual pode ser determinada utilizando o método de ensaio aqui descrito é expressado como se segue:

#### composto apresentou uma EC5o para PBMC de 1-100 nM

### composto apresentou uma EC5o para PBMC de 101-500 nM

## composto apresentou uma EC50 para PBMC de 501-1000 nM

# composto apresentou uma EC50 para PBMC >1000 nM QUADRO 5 Composto # EC50 PBMC (nM) 1 # 2 # 3 # 4 # 5 # 6 # 7 # 15 ## 16 # 17 # 18 # 19 # 20 # 21 #

Composto # EC50 PBMC (nM) 8 # 9 ### 10 # 11 # 12 # 13 # 14 # 43 # 43 # 43 # 44 # 45 # 46 # 47 # 240 Composto # EC50 PBMC (nM) 22 # 23 # 24 # 25 # 26 ## 27 # 28 # 29 # 30 # 31 # 32 ## 33 # 34 # 34 # 35 # 36 # 36 # 36 # 36 # 36 # 36 # 37 # 38 # 39 # 40 ## 41 # 42 # 43 ### 43 ##

Composto # EC50 PBMC (nM) 48 # 49 # 50 # 51 # 52 # 53 # 54 ## 54 # 56 # 57 # 58 # 59 # 60 # 61 # 62 ## 62 ## 63 # 64 # 65 # 66 # 67 # 68 # 69 # 70 # 71 # 72 # 73 # 74 # 75 # 241 Composto # EC5q PBMC IIIlllllBIIIIIIIIlI 76 # 77 # 78 ## 79 # 81 # 84 # 85 # 86 # 87 # 88 #### 88 # 89 # 90 # 91 # 92 # 94 # 99 ## 101 # 102 #

Composto # EC50 PBMC (nM) 103 ### 104 # 105 # 108 # 110 # 113 # 115 # 116 # 117 # 169 # 170 # 171 ## 172 # 174 # 176 # 179 # 180 # 181 # 0 presente pedido descreve um método de tratamento ou prevenção de doenças inflamatórias, o qual compreende administrar a um indivíduo necessitado daquele, uma quantidade inibidora terapeuticamente eficaz de um inibidor de Proteína Cinase 5 Activada por Proteína Cinase Activada por Mitogénio de um composto de acordo com a Fórmula 1.

Outro aspecto do presente pedido refere-se a um método de tratamento ou profilaxia de uma patologia caracterizada por 242 actividade anormal de metaloproteinase da matriz, o qual compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de inibição de metaloproteinase da matriz de acordo com a Fórmula 1.

Um outro aspecto do presente pedido é um método de tratamento ou profilaxia de uma patologia seleccionada de doenças envolvendo degradação de matriz extracelular, o qual compreende administrar uma quantidade de inibição de metaloproteinase da matriz terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a Fórmula 1.

Ainda outro aspecto do presente pedido é um método de tratamento ou profilaxia de uma patologia seleccionada de doenças envolvendo expressão celular anormal de MMP1, o qual compreende administrar uma quantidade de inibição de metaloproteinase da matriz terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a Fórmula 1.

Uma forma de realização especial do pedido é um método de tratamento ou prevenção de artrite reumatóide, o qual compreende administrar a um indivíduo necessitado daquele, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto de acordo com a Fórmula 1.

Esta invenção também se refere à utilização dos actuais compostos no fabrico de um medicamento para tratamento ou profilaxia de uma patologia prevenida, melhorada ou eliminada pela administração de um inibidor de Proteína Cinase 5 Activada por Proteína Cinase Activada por Mitogénio, ou uma patologia caracterizada por actividade anormal da colagenase ou uma patologia seleccionada de 243 doenças envolvendo inflamaçao, muito preferencialmente para o tratamento de artrite reumatóide. A administração do composto da presente invenção ao indivíduo doente inclui auto-administração e administração por outra pessoa. 0 doente pode estar necessitado de tratamento para uma doença ou condição médica existente, ou pode desejar tratamento profiláctico para prevenir ou reduzir o risco de doenças e condições médicas afectadas por um distúrbio no metabolismo do osso. 0 composto da presente invenção pode ser administrado ao doente por via oral, transdérmica, via inalação, injecção, nasal, rectal ou via uma formulação de libertação sustentada.

Um regime preferido do presente método compreende a administração, a um indivíduo que sofra de uma condição patológica caracterizada por inflamação, com uma quantidade eficaz para inibir a metaloprotease da matriz de um composto da presente invenção durante um período de tempo suficiente para reduzir os níveis anormais de degradação de matriz extracelular no doente, e preferencialmente terminar, os processos auto-sustentados responsáveis pela referida degradação. Uma forma de realização especial do método compreende a administração de uma quantidade eficaz para inibir a metaloprotease da matriz de um composto da presente invenção a um doente que sofre ou está susceptível ao desenvolvimento de artrite reumatóide, durante um período de tempo suficiente para reduzir ou prevenir, respectivamente, a degradação de colagénio e osso nas articulações do referido doente, e preferencialmente terminar, os processos auto-sustentados responsáveis pela referida degradação. 244 A toxicidade e eficácia terapêutica de tais compostos podem ser determinadas por procedimentos farmacêuticos correntes em culturas de células ou animais experimentais, por exemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e a ED50 (a dose terapeuticamente eficaz em 50% da população). A proporção de dose entre os efeitos tóxico e terapêutico é o índice terapêutico e pode ser exprimido como a razão LD50/ED50. São preferidos os compostos que apresentam índices terapêuticos grandes. Embora possam ser utilizados compostos que exibem efeitos secundários tóxicos, deverão ser tomadas precauções para conceber sistemas de administração que direccionem tais compostos para o sítio do tecido afectado para minimizar a lesão potencial de células não infectadas e, desse modo, reduzir os efeitos secundários.

Os dados obtidos dos ensaios em culturas de células e estudos animais podem ser utilizados na formulação de uma gama de dosagem para utilização em humanos. A dosagem de tais compostos situa-se preferencialmente numa gama de concentrações em circulação que incluem a ED50 com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro desta gama dependendo da forma de dosagem empregue e da via de administração utilizada. Para qualquer composto utilizado no método da invenção, a dose terapeuticamente eficaz pode ser inicialmente estimada de ensaios com culturas de células. Uma dose pode ser formulada em modelos animais para se conseguir uma gama de concentração no plasma em circulação que inclui a IC50 (isto é, a concentração do composto de ensaio que alcança uma inibição semi-máxima de sintomas) como determinada em cultura de células. Essa informação pode ser utilizada para determinar com mais exactidão doses úteis em humanos. Os níveis no plasma podem 245 ser medidos, por exemplo, por cromatografia líquida de alta eficiência.

Uma quantidade terapeuticamente eficaz preferida do composto da presente invenção para administrar a um indivíduo doente é de cerca de 0,1 mg/kg até cerca de 10 mg/kg administrada de uma até três vezes por dia. Por exemplo, um regime efectivo do presente método pode administrar cerca de 5 mg até cerca de 1000 mg do referido composto da presente invenção de uma até três vezes por dia. No entanto, entender-se-á, que o nível de dose específica para qualquer indivíduo doente particular dependerá de uma diversidade de factores incluindo a idade, peso corporal, estado físico geral, género, dieta, tempo de administração, via de administração, taxa de excreção, associação de fármacos e a gravidade da patologia inflamatória particular. Uma consideração destes factores está dentro da competência do clínico médio para os efeitos de determinar a quantidade de dosagem terapeuticamente eficaz ou profilacticamente eficaz necessária para prevenir, contrariar ou parar o progresso da patologia.

Os compostos da invenção podem ser incorporados em composições farmacêuticas adequadas para administração. Tais composições compreendem tipicamente pelo menos um composto da invenção e pelo menos um veículo farmaceuticamente aceitável. Como aqui utilizada a linguagem "veículo farmaceuticamente aceitável" destina-se a incluir veículos sólidos como lactose, estearato de magnésio, terra de diatomáceas, sacarose, talco, ácido esteárico, gelatina, agar, pectina, goma-arábica ou semelhantes; e líquidos como óleos vegetais, óleo de amendoim e água estéril, ou semelhantes, qualquer e todos 246 os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e de retardamento da absorção, e semelhantes, compatíveis com administração farmacêutica. Esta listagem de veículos farmaceuticamente aceitáveis não é para ser interpretada como restritiva. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente activas é bem conhecida na técnica. Excepto se qualquer meio ou agente convencional for incompatível com o composto activo, está contemplada a sua utilização nas composições. Também podem ser incorporados compostos activos adicionais nas composições.

Uma composição farmacêutica da invenção é formulada para ser compatível com a sua via de administração pretendida. Exemplos de vias de administração incluem a administração parentérica, por exemplo, intravenosa, intradérmica, subcutânea, oral (por exemplo, inalação), transdérmica (tópica), transmucosal e rectal. As soluções ou suspensões utilizadas para aplicação parentérica, intradérmica ou subcutânea podem incluir os seguintes componentes: um diluente estéril como água para injecção, soro fisiológico, óleos fixos, polietileno glicóis, glicerina, propileno glicol ou outros solventes sintéticos; agentes antibacterianos como álcool benzílico ou metilparabenos; antioxidantes como ácido ascórbico ou bissulfito de sódio; agentes quelantes como ácido etilenodiaminatetraacético; tampões como acetatos, citratos ou fosfatos e agentes para ajuste da tonicidade como cloreto de sódio ou dextrose. 0 pH pode ser ajustado com ácidos ou bases, como ácido clorídrico ou hidróxido de sódio. A preparação parentérica pode ser encerrada em ampolas, seringas descartáveis ou frascos de doses múltiplas feitos de vidro ou plástico. 247

As composições farmacêuticas adequadas para utilização injectável incluem soluções aquosas estéreis (quando solúvel em água) ou dispersões e pós estéreis para preparação extemporânea de soluções ou dispersões injectáveis estéreis. Para administração intravenosa, os veículos adequados incluem soro fisiológico, água bacteriostática, Cremophor ELTM (BASF, Parsippany, NJ) ou soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). Em todos os casos, a composição tem de ser estéril e deveria ser fluida até ao ponto em que existe uma introdução fácil através de seringa. Tem de ser estável nas condições de fabrico e armazenagem e tem de ser conservada contra a acção contaminante de microrganismos como bactérias e fungos. 0 veículo pode ser um solvente ou meio de dispersão contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por exemplo, glicerol, propileno glicol e polietileno glicol líquido, e semelhantes), e misturas adequadas destes. A fluidez adequada pode ser mantida, por exemplo, através da utilização de um revestimento como lecitina, por conservação do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pela utilização de tensioactivos. A prevenção da acção de microrganismos pode ser conseguida por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabenos, tclorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal e semelhantes. Em muitos casos, será preferível incluir agentes isotónicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois como manitol, sorbitol, cloreto de sódio na composição. A absorção prolongada de composições injectáveis pode ser conseguida incluindo na composição um agente que retarde a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio e gelatina. 248

As soluções injectáveis estéreis podem ser preparadas incorporando o composto activo (por exemplo, um composto de acordo com uma forma de realização da invenção) na quantidade requerida de um solvente apropriado com um ou uma combinação de ingredientes enumerados acima, consoante necessário, seguido de esterilização por filtração. Duma maneira geral, as dispersões são preparadas incorporando o composto activo num veiculo estéril o qual contém um meio de dispersão básico e outros ingredientes necessários dos enumerados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injectáveis estéreis, os métodos de preparação preferidos são secagem por vácuo e liofilização os quais produzem um pó do ingrediente activo com qualquer ingrediente adicional desejado a partir de uma solução destes previamente esterilizada por filtração.

As composições orais incluem, duma maneira geral, um diluente inerte ou um veiculo comestível. Elas podem ser encerradas em cápsulas de gelatina ou prensadas em comprimidos. Para o efeito de administração terapêutica oral, o composto activo pode ser incorporado com excipientes e utilizado na forma de comprimidos, trociscos ou cápsulas. As composições orais também podem ser preparadas utilizando um veículo fluido para serem utilizadas como colutório, em que o composto no veículo fluido é aplicado oralmente e bochechado e expectorado ou engolido.

Podem ser incluídos aglutinantes farmaceuticamente compatíveis e/ou materiais auxiliares como parte da composição. Os comprimidos, pílulas, cápsulas, trociscos e semelhantes podem conter qualquer um dos seguintes ingredientes, ou compostos de uma natureza semelhante: um 249 aglutinante como celulose microcristalina, goma de tragacanta ou gelatina; um excipiente como amido ou lactose, um desintegrante como ácido alginico, Primogel ou amido de milho; um lubrificante como estearato de magnésio ou Sterotes; um deslizante como dióxido de silício coloidal; um edulcorante como sacarose ou sacarina; ou um aromatizante como hortelã-pimenta, salicilato de metilo ou aroma de laranja.

Para administração por inalação, os compostos são administrados na forma de um aerossol pulverizado de um recipiente pressurizado ou distribuidor que contém um propulsor adequado, por exemplo, um gás como dióxido de carbono, ou um nebulizador. A administração sistémica também pode ser por via transmucosal ou transdérmica. Para administração transmucosal ou transdérmica são utilizados penetrantes apropriados para a barreira a ser permeada na formulação. Tais penetrantes são, duma maneira geral, conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, para administração transmucosal, detergentes, sais biliares e derivados de ácido fusídico. A administração transmucosal pode ser conseguida através da utilização de gotas nasais ou supositórios. Para administração transdérmica, os compostos activos são formulados em pomadas, unguentos, geles ou cremes como é, duma maneira geral, conhecido na técnica.

Os compostos também podem ser preparados na forma de supositórios (por exemplo, com bases convencionais para supositórios como manteiga de cacau e outros glicéridos) ou enemas de retenção para administração rectal. 250

Numa forma de realização, os compostos activos são preparados com veículos que protegerão o composto contra eliminação rápida do organismo, como uma formulação de libertação controlada, incluindo implantes e sistemas de administração microencapsulados. Podem ser utilizados polímeros biodegradáveis, biocompatíveis, como acetato de etileno vinilo, polianidridos, poli(ácido glicólico) , colagénio, poliortoésteres e poli(ácido láctico). Os métodos de preparação de tais formulações serão evidentes para o especialista na técnica. Os materiais também podem ser obtidos comercialmente de Alza Corporation e Nova Pharmaceuticals, Inc. As suspensões de lipossomas (incluindo lipossomas direccionados para células infectadas com anticorpos monoclonais contra antigénios virais) também podem ser utilizadas como veículos farmaceuticamente aceitáveis. Estas podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos do especialista na técnica. É especialmente vantajoso formular composições orais ou parentéricas em forma de dosagem unitária para facilidade de administração e uniformidade de dosagem. Forma de dosagem unitária como aqui utilizada refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias para o indivíduo a ser tratado; contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de composto activo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veiculo farmacêutico requerido. A especificação para as formas de dosagem unitárias da invenção são ditadas e directamente dependentes das caracteristicas únicas do composto activo e do efeito terapêutico particular a ser alcançado, e das limitações inerentes na técnica de formulação de um tal composto activo para o tratamento de indivíduos. 251

As composições farmacêuticas podem ser incluídas num recipiente, embalagem ou distribuidor em conjunto com instruções para administração.

Um composto de acordo com uma forma de realização da invenção pode ser proporcionado como um sal, preferencialmente como um sal farmaceuticamente aceitável dos compostos de fórmula III. Exemplos de sais farmaceuticamente aceitáveis destes compostos incluem aqueles derivados de ácido orgânicos como ácido acético, ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido láctico, ácido oxálico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido benzóico, ácido salicílico, ácido fenilacético, ácido mandélico, ácido metanossulfónico, ácido benzenossulfónico e ácido p-toluenossulfónico, ácidos minerais como ácido clorídrico e sulfúrico e semelhantes, originando metanossulfonato, benzenossulfonato, p-toluenossulfonato, cloridrato e sulfato, e semelhantes, respectivamente ou aqueles derivados de bases como bases orgânicas e inorgânicas. Exemplos de bases inorgânicas adequadas para a formação de sais de compostos para esta invenção incluem os hidróxidos, carbonatos e bicarbonatos de amoníaco, lítio, sódio, cálcio, potássio, alumínio, ferro, magnésio, zinco e semelhantes. Os sais também podem ser preparados com bases orgânicas adequadas. Tais bases adequadas para a formação de sais de adição de base farmaceuticamente aceitáveis com compostos da presente invenção incluem bases orgânicas as quais são não tóxicas e suficientemente fortes para formar sais. Tais bases orgânicas já são bem conhecidas na técnica e podem incluir aminoácidos como arginina e lisina, mono-, di- ou tri-hidroxialquilaminas como mono-, di- e trietanolamina, 252 252 colina, mono-, di-dimetilamina e metilglucosamina; etilenodiamina; e trialquilaminas, como metilamina, trimetilamina, guanidina; N- A/-metilpiperazina; morfolina; IV-benzilf enetilamina; tris(hidroximetil)aminometano; e semelhantes.

Os sais dos compostos de acordo com uma forma de realização da invenção podem ser preparados de um modo convencional utilizando métodos bem conhecidos na técnica. Os sais de adição de ácido dos referidos compostos básicos podem ser preparados dissolvendo os compostos de base livre de acordo com o primeiro ou segundo aspectos da invenção em solução aquosa ou solução aquosa de álcool ou noutros solventes adequados contendo o ácido requerido. Quando um composto da invenção contém uma função ácida, um sal de base do referido composto pode ser preparado fazendo reagir o referido composto com uma base adequada. 0 sal de ácido ou base pode separar-se directamente ou pode ser obtido concentrando a solução, por exemplo, por evaporação. Os compostos desta invenção também podem existir em formas solvatadas ou hidratadas.

Será entendido pelos especialistas na técnica que a descrição precedente é de natureza ilustrativa e explicativa, e destina-se a ilustrar a invenção e as suas formas de realização preferidas. Através de experimentação de rotina, um técnico reconhecerá modificações e variações evidentes que podem ser feitas sem que se saia do espirito da invenção. Assim, a invenção é definida não pela descrição acima, mas pelas reivindicações seguintes.

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Da descrição precedente surgirão ao especialista na técnica várias modificações e alterações nas composições e métodos desta invenção. Todas essas modificações que fiquem dentro do âmbito das reivindicações apensas destinam-se a serem aqui incluídas.

Entender-se-á que factores como a capacidade de penetração diferencial na célula dos vários compostos podem contribuir para discrepâncias entre a actividade dos compostos nos ensaios bioquímicos in vitro e celulares.

Os nomes químicos dos compostos da invenção dados neste pedido são gerados utilizando a ferramenta do software ISIS Draw Autonom da MDL e não foram verificados. Preferencialmente, no caso de inconsistência, a estrutura representada tem precedência. 255

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Galapagos N.V.

Andrews, Martin J I Edwards, Paul Chambers, Mark S Schmidt, Wolfgang Clase, Juha A Bar, Gregory Hirst, Kim L Angus, MacLeod

ÚTEIS PARA O & INFLAMATÓRIAS

<120> COMPOSTOS DE TRIAZOLOPIRAZINA

TRATAMENTO DE DOENÇAS DEGENERATIVAS

<130> GAL-033-WO-PCT <150> US 60/803,552 <151> 2006-05-31 <150> US 60/ <151> 2007-05-25 <150> US 60/ <151> 2007-05-25 <150> US 60/ 256 <151> 2007-05-25 <150> US 60/ <151> 2007-05-29 <160> 6 <1 7 0> Patentln Versão 3.4 <210> 1 <211> 19 <212> ADN <213> artificial <220> <223> Sequência alvo <400> 1 gctgaccctg aagttcatc 19 <210> 2 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência alvo <400> 2 ggttacctaa gggtgtggc 19 <210> 3 <211> 19 257 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência alvo <400> 3 ctctgagtgc agtgaaatc 19 <210> 4 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <22 0> <223> Sequência alvo <40 0> 4 acaagagcaa gatgtggac 19 <210> 5 <211> 19 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência alvo <40 0> 5 cggcacttta cagagaagc 19 <210> 6 <211> 19 258 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Sequência alvo <400> 6 atgatgtgtg ccacacacc 19

Lisboa, 30 de Junho de 2010

Claims (32)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composto de acordo com a fórmula III:

(ΙΠ) em que R1 é H, ou alquilo substituído ou não substituído; e cada um de R1 2 3 4 5 6 7 e R8 é independentemente seleccionado de cicloalquilo substituído ou não substituído, heterocicloalquilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, heteroarilo substituído ou não substituído; ou um seu sal, solvato farmaceuticamente aceitável; e estereoisómeros, variantes isotópicas e tautómeros daqueles. 1 Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que R7 é 2 seleccionado de ciclopentilo substituído ou não 3 substituído, ciclo-hexilo, fenilo substituído ou não 4 substituído, piridilo substituído ou não substituído, 5 pirimidina substituída ou não substituída, e pirazina 6 substituída ou não substituída, pirrole substituído ou 7 não substituído, pirazole substituído ou não 8 substituído e imidazole substituído ou não substituído. 2

3. Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que R8 é seleccionado de fenilo substituído, piridilo substituído e pirimidina substituída; e a substituição é -L-R8d; e em que L é seleccionado de ligação, alquileno, heteroalquileno, -0-, -N(R8e)-, -C0-, -C02-, -S0-, -S02-, -CON (R8e) -, -S02N (R8e) -, -N (R8e) C0-, -N(R8e)S02-, -N(R8e)CON(R8e)-, -N(R8e) S02N(R8e)e R e seleccionado de alquilo substituído ou nao substituído, cicloalquilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, heterocicloalquilo substituído ou não substituído, heteroarilo substituído ou não substituído, amino substituído ou não substituído, aralquilo substituído ou não substituído, heteroarilalquilo substituído ou não substituído e aminoalquilo substituído ou não substituído; e R8e é seleccionado de H, alquilo substituído ou não substituído e cicloalquilo substituído ou não substituído.

4. Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que R8 é

8 d ~ ~ em que L, e R sao como na reivindicação 3; o subscrito n é seleccionado de 1-4; e cada R8a é 3 independentemente seleccionado de hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído, alcoxilo, ciano e halo.

5. Composto de acordo com a Reivindicação 4, em que L é uma ligação, -0-, -C0-, -C0N(R8e)- ou - N(R8e)C0-; R e seleccionado de alquilo substituído ou não substituído, cicloalquilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, heterocicloalquilo substituído ou não substituído, heteroarilo substituído ou não substituído, aralquilo substituído ou não substituído, heteroarilalquilo substituído ou não substituído e aminoalquilo substituído ou não substituído; e R8e é seleccionado de H, alquilo substituído ou não substituído.

6. Composto de acordo com a Reivindicação 4, em que L é ligaçao, -C0-, -0(CH2)mi-, -CON(H) (CH2)mi-, ou - NHC0-; o subscrito ml é seleccionado de 1-4; e R8d é

e em que o anel P é heterocicloalquilo substituído ou não substituído. Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que o composto é de acordo com a fórmula IVa, IVb, IVc ou IVd: 7. 4

e em que L e o anel P são como na reivindicação 6; o subscrito n, é seleccionado de 1-4; cada R8a é independentemente seleccionado de hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído, alcoxilo, ciano e halo; e R9 é independentemente seleccionado de arilo substituído ou não substituído e heteroarilo; ou um seu sal, solvato farmaceuticamente aceitável; e estereoisómeros, variantes isotópicas e tautómeros daqueles.

8. Composto de acordo com a Reivindicação 7, em que L é uma ligação.

9. Composto de acordo com a Reivindicação 7, em que L é -NHCO- ou -CONH-.

10. Composto de acordo com a Reivindicação 7, em que L é -OCH2-CH2- ou -NHCH2-CH2-.

11. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 6-10, em que o anel P é piperidina, morfolina ou piperazina substituída ou não substituída. 5

12. Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que o composto é de acordo com a fórmula Va, Vb, Vc, Vd, Ve ou Vf:

e em que R9 é como na Reivindicação 1 e R8b é hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído.

13. Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que R9 é seleccionado de arilo substituído ou não substituído. . ~ 9 ,

14. Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que R e seleccionado de heteroarilo substituído ou não substituído.

15. Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que R9 é seleccionado de fenilo, piridilo, indolilo, isoindolilo, pirrolilo, furanilo, tienilo, pirazolilo, 6 oxazolilo e tiazolilo substituídos ou não substituídos.

16. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, em que R9 é 17.

R9b OU R9b e cada um de A1, A2 e A3 é independentemente seleccionado de S , 0, N, NR9a e CR9a; cada um de R9a é independentemente H ou alquilo substituído ou não substituído; e R9b é C0NH2 , CONHMe ou CN. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, em que R9 é

N-N N-N Η ’ H O N-N H CN ou

Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, em que R9 é

18. 7

ο ο ο . ο

reivindicações

19. Composto de acordo com qualquer uma das 1-15, em que R9 é

(R9d)m e em que o subscrito m é seleccionado de 1-4 e cada um de R9d é independentemente H, alquilo substituído ou não substituído ou halo.

20. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-15, em que R9 é

e em que o subscrito m é seleccionado de 1-4 e cada um de R9d é independentemente H, alquilo substituído ou nao substituído ou halo. Reivindicação 1

21. Composto de acordo com a composto é de acordo com a VlIIb, VIIIc, VlIId, VlIIe OU VlIIf: em que o fórmula VlIIa,

o m. ou nao ou não e R e hidrogénio, alquilo substituído substituído ou cicloalquilo substituído substituído.

22. Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que o composto é de acordo com a fórmula IXa, IXb, IXc, IXd, IXe ou IXf: 9

e R8b é hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído.

23. Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que o composto é de acordo com a fórmula Xa, Xb, Xc, Xd, Xe ou Xf:

10

Xc · Xe ou Xf e R8b é hidrogénio, alquilo substituído ou não substituído ou cicloalquilo substituído ou não substituído.

24. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 21-23, em que R8b é H.

25. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 21-23, em que RSb é cicloalquilo.

26. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 21-23, em que R8b é ciclopropilo.

27. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 21-23, em que R8b é alquilo substituído ou não substituído.

28. Composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 ou 21-23, em que R8b é Me, Et, Pr, i-Pr, t-Bu, i-Bu, CF3, CH2CF3, CH2CONH2 ou ciclopropilmetilo.

29. Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que o composto é de acordo com a fórmula Xlla, Xllb, XIIc ou XI Id: 11

30 . Composto de acordo com a Reivindicação 1, em que o composto é de acordo com a fórmula XVa, XVb ou XVc:

e L é uma ligaçao, -CO- ou -0-CH2-CH2-; o anel P é

e R8b é H, Me, i-Pr, t-Bu, CH2CONH2, ciclopropilmetilo ou CH2CF3. 12

31. Composto de acordo com a Reivindicação 30, em que L é uma ligação e o anel P é

32. Composto de acordo com a reivindicação 1 em que o composto é seleccionado de (4-Morf olin-4-il-f enil) - [ 5- (líf-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amina; [ 4- ( 4-Metil-piperazin-l-il) -fenil]-[5-( lfí-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amina; 4-{8-[4-(4-Metil-piperazin-l-il)-fenilamino]- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-benzamida; 4-{8-[4-(4-Metil-piperazin-l-il)-fenilamino]- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-lH-piridin-2-ona; 4-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-benzamida; Amida do ácido 4-{8-[4-(4-metil-piperazin-l-il)- fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-tiofeno-2-carboxílico; 2- Fluoro-4-{8-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-fenilamino]- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-benzamida; 3- Fluoro-4-{8-[4-(4-metil-piperazin-l-il)-fenilamino]- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-benzamida; Amida do ácido 5-{8-[4-(4-metil-piperazin-l-il)- fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-tiofeno-2-carboxilico; 3-Fluoro-4-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-benzamida; 13 2-Fluorο-4-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-benzamida; [5- (5-Metil-lií-pirazol-4-il) -[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-(4-morfolin-4-il-feni1)-amina; Amida do ácido 5-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-tiofeno-2-carboxílico; 2,6-Difluoro-4-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-benzamida; Amida do ácido 4-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)- [1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-tiofeno-2-carboxílico; [ 4-(4-Metil-piperazin-l-il)-fenil]-[5-(5-metil-lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amina; (3-Fluoro-4-morfolin-4-il-fenil)-[5-(1H-pirazol-4-il)- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-amina; (3-Cloro-4-morfolin-4-il-fenil)-[5-(lH-pirazol-4-il)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amina; [4-(2-Morfolin-4-il-etoxi)-fenil]-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amina; Amida do ácido 4-{8-[4-(2-morfolin-4-il-etoxi)- fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-tiofeno-2-carboxilico; Amida do ácido 5-{8-[4-(2-morfolin-4-il-etoxi)- fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-tiofeno-2-carboxílico; (4-Morfolin-4-il-fenil)-[5-(2H-pirazol-3-il)- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-amina; Amida do ácido 4-{8-[4-((2R,6S)-2,6-dimetil-morfolin-4-il)-fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-tiofeno-2-carboxílico; 14 (4-Morfolin-4-il-3-trifluorometil-fenil) -[5-(1H-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-amina; 2,6-Difluoro-4-{8-[4-(4-isopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[1,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-benzamida; Amida do ácido 4-[8-(4-piperazin-l-il-fenilamino)- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-tiofeno-2-carboxílico; Amida do ácido 4-{8-[4-(4-isopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-tiofeno-2-carboxilico; Amida do ácido 5-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-furan-3-carboxilico; Amida do ácido 5-{8-[4-(4-isopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-furan-3-carboxílico; [5-(lH-Pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-i1] — [4 —((2S,5R)-2,4,5-trimetil-piperazin-l-il)-fenil]-amina; Amida do ácido 4-{8-[4-((2S,5R)-2,4,5-trimetil-piperazin-l-il ) -fenilamino]-[1,2,4]triazolo [1,5-a]pirazin-5-il}-tiofeno-2-carboxilico; 5- [8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; Amida do ácido 4-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-furan-2-carboxilico; 6- [8-(4-Morfolin-4-i1-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-3, 4-di-hidro-2ií-isoquinolin-l-ona; 5- {8-[4-(4-Isopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; { 2-Morf olin-4-il-5 - [5 - (lfí-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-metanol; [ 4-(4-Isopropil-piperazin-l-il)-fenil]-[5-(lH-pirazol 4-il)- [ 1,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8 — i1]-amina; 6- [8-(4-Morfolin-4-i1-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5 a] pirazin-5-il] -3,4-di-hidro-lfí-quinolin-2-ona; (4-Piperazin-l-il-fenil) - [5- (lfí-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amina; (6-Morf olin-4-il-piridin-3-il) - [ 5- (lfi-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amina; [6-(4-Ciclopropilmetil-piperazin-l-il)-piridin-3-il]-[5 - (lií-pirazol-4-il) - [l,2,4]triazolo[l, 5-a] pirazin-8-il]-amina; [6-(4-Isopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-il]-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]- amina; [5- (lfí-Pirazol-4-il) - [l,2,4]triazolo[l, 5-a] pirazin-8-il]—{6—[4—(2,2,2-trifluoro-etil)-piperazin-l-il]-piridin-3-il}-amina; [5-(ΙΗ-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-{4-[4-(2,2,2-trifluoro-etil)-piperazin-l-il]-fenil}-amina; [ 4-(4-Ciclopropilmetil-piperazin-l-il)-fenil]-[5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amina; Amida do ácido 4-[8-(6-morfolin-4-il-piridin-3 ilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-tiofeno-2-carboxílico; 16 (5-Benzo[b]tiofen-3-il-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8—i1) — (4-morfolin-4-il-fenil)-amina; (5-Benzo[b]tiofen-3-il-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8—il)—[4—(4-isopropil-piperazin-l-il)-fenil]-amina; (4-Morfolin-4-il-fenil)-(5-tiofen-3-il-[1,2, 4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-amina; [ 4-(4-Isopropil-piperazin-l-il)-fenil]-(5-tiofen-3-il- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-amina; [5 - (5-Etil-lfí-pirazol-4-il) - [1,2, 4] triazolo [1,5-a]pirazin-8-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina; 6-[8-(4-Morfolin-4-i1-fenilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-l,1-dioxo-l,2-di-hidro-^6-benzo[d]isotiazol-3-ona; Amida do ácido 4-{8-[6-(4-ciclopropilmetil-piperazin-1-il)-piridin-3-ilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-tiofeno-2-carboxilico; Amida do ácido 4-{8-[6-(4-isopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-ilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-tiofeno-2-carboxílico; Amida do ácido 4-(8-{6-[4-(2,2,2-trifluoro-etil)- piperazin-l-il]-piridin-3-ilamino}- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il)-tiofeno-2-carboxilico; Amida do ácido 4-(8-{4-[4-(2,2,2-trifluoro-etil)- piperazin-l-il]-fenilamino}-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il)-tiofeno-2-carboxilico; Amida do ácido 4-{8-[4-(4-ciclopropilmetil-piperazin-1-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-tiofeno-2-carboxilico; [4-(4-Ciclopropil-piperazin-l-il)-fenil]-[5-(1H-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-amina; 17 [6-(4-Ciclopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-il]-[5-(lH-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amina; Amida do ácido 4-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-tiazole-2-carboxílico; Amida do ácido 4-{8-[4-(4-isopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-tiazole-2-carboxílico; Amida do ácido 4-(8-{4-[1-(2,2,2-trifluoro-etil)- piperidin-4-il]-fenilamino}-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il)-tiofeno-2-carboxílico; [5-(lH-Pirazol-4-il)-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]—{4—[1—(2,2,2-trifluoro-etil)-piperidin-4-il] -fenil}-amina; 5-{8-[4-(2-Morfolin-4-il-etoxi)-fenilamino]- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; (5-Benzotiazol-6-il-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina; (2-Fluoro-4-morf olin-4-il-f enil) - [ 5 - (lfí-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amina; (2-Cloro-4-morfolin-4-il-fenil)-[5-(1H-pirazol-4-il)- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-amina; 1-{5-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-tiofen-2-il}-etanona; {4-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-2H-pirazol-3-il}-metanol; 18 6-{4-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)- [ 1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-fenil}-4, 5-di- hidro-2lí-piridazin-3-ona; (5-Benzo[1,2,5]oxadiazol-5-il-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il)-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina; Metilamida do ácido 4-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-tiazole-2-carboxílico; Metilamida do ácido 4-{8-[4-(4-isopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-tiazole-2-carboxílico; 5-[8-(2-Fluoro-4-morfolin-4-il-fenilamino)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; 5-[8-(2-Cloro-4-morfoiin-4-il-fenilamino)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; 5-{8-[2-Cloro-4-(4-isopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; [5-(2-Amino-pirimidin-5-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina; 5-{8-[6-(4-Isopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-ilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; Amida do ácido 3-[8-(4-morfolin-4-il-fenilamino)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-benzo[b]tiofeno-7-carboxilico; Amida do ácido 3-{8-[4-(4-isopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-benzo[b]tiofeno-7-carboxílico; 19 {4-[8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-piridin-2-il}-metanol; ( 4-{8-[4-(4-Isopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-piridin-2-il)-metanol; [ 4- (l-Isopropil-piperidin-4-il) -fenil]-[5-( lH-pirazol- 4- il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amina; {5-[4-(2-Amino-tiazol-4-il)-fenil]- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-il}-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina; Amida do ácido 4-{8-[ 6-(4-isopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-ilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il }-furan-2-carboxilico; 5- [8-(6-Morfolin-4-il-piridin-3-ilamino)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; Amida do ácido 4-{8-[4-(4-isopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-furan-2-carboxílico; Amida do ácido 4-{8-[4-(l-isopropil-piperidin-4-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l, 5-a]pirazin-5-il}-tiofeno-2-carboxílico; (4—{8—[6-(4-Isopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-ilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-piridin-2-il)-metanol; [5-(2-Fluorometil-piridin-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-[4-(4-isopropil-piperazin-l-il)-fenil]-amina; 5-{8-[4-(l-Isopropil-piperidin-4-il)-fenilamino]- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; 20 [5-(lH-Indazol-6-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina; Amida do ácido 4-[8-(6-morfolin-4-il-piridin-3-ilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-furan-2-carboxilico; Amida do ácido 4-{8-[4-(4-isopropil-piperazin-l-il) -fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-5-metil-tiofeno-2-carboxílico; Amida do ácido 4-{8-[ 6-(4-isopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-ilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-5-metil-tiofeno-2-carboxílico; 4-{8-[4-(4-Isopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; 4- {8 - [6-(4-Isopropil-piperazin-l-il)-piridin-3- ilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; 5- [8-(2-Morfolin-4-il-pirimidin-5-ilamino)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; 1— { 4— [ 5— (lií-Pirazol-4-il) - [l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-piperazin-2-ona; 5-{8-[2-(4-Isopropil-piperazin-l-il)-pirimidin-5-ilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; 5—{8—[4—(4-terc-Butil-piperazin-l-il)-fenilamino]- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; [4-(4-terc-Butil-piperazin-l-il)-fenil]-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-amma; 21 [5-(lH-Indazol-5-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-(4-morfolin-4-il-fenil)-amina; 5— {8—[4-(2-Oxo-piperazin-l-il)-fenilamino]-[1,2, 4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; [5-(lH-Indazol-6-il)-[1,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il]-[4-(4-isopropil-piperazin-l-il)-fenil]-amina; [ 6-(4-Isopropil-piperazin-l-il)-piridin-3-il]-(5-{(E)- 1- [4-metileno-2,4-di-hidro-pirazol-(3E)-ilidenometil]-propenil}-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-il)-amina; 7-Fluoro-5-{8-[4-(4-isopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; 6- {8-[4-(4-Isopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; (3-Metilaminometil-4-morfolin-4-il-fenil)-[5-(1H-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-amina; 2 - [ 8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-5,6-di-hidro-furo[2,3-c]pirrol-4-ona; 5-{8-[4-(4-Isopropil-2-oxo-piperazin-l-il)-fenilamino]-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; 2- [8-(4-Morfolin-4-il-fenilamino)-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-4,5-di-hidro-tieno[2,3-c]pirrol-6-ona; 5-{8-[4-(4-Isopropil-piperazin-l-il)-fenilamino]- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-5-il}-3,3-dimetil-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; 5-(8-Ciclo-hexilamino-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il)-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona; 22 5-[8-(Tetra-hidrο-piran-4-ilamino)- [1,2, 4] triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-2,3-di-hidro- isoindol-l-ona; [4-(4-terc-Butil-piperazin-l-il)-fenil]-[5-(1H-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-il]-amina; 2-[8-(4-Morfolin-4-i1-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-4,5-di-hidro-tieno[2,3-c]pirrol-6-ona; e 5-[8-(4-Fluoro-fenilamino)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-2,3-di-hidro-isoindol-l-ona.

33. Composto de acordo com a reivindicação 1 em que o composto é seleccionado de: 4- [ 5 - (lií-Pirazol-4-il) -[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino] -IV-piridin-3-ilmet il-benzamida; 4-[5-(2-Oxo-l,2-di-hidro-piridin-4-il)- [1.2.4] triazolo[l,5 -a] pira zin-8-i lamino] -iV-piridin-3-ilmetil-benzamida; 2- Metoxi-N- (6-metil-piridin-3-ilmetil) — 4— [5 — (1 íí— pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; Amida do ácido 4-(8-{3-metoxi-4-[(β-metil-piridin-3-ilmetil)-carbamoil]-fenilamino}-[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il)-tiofeno-2-carboxílico; iV-Benzil-2-metoxi-4 - [ 5 - (lH-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; N- Benzi 1-3- [5- (lií-pirazol-4-il) - [l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; 3- [5-(lH-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin- 8-ilamino] -iV-piridin-2-ilmetil-benzamida; 23 N, IV-Dietil-3- [5-( lfí-pirazol-4-il) - [1,2, 4] triazolo [1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; {3-[5-(lfí-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l, 5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-pirrolidin-l-ilmetanona; ( 4-Isopropil-piperazin-l-il) - {3 - [ 5 - (l#-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-metanona; 3 - [5- (ltf-Pirazol-4-il) - [l,2,4]triazolo[l, 5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; iV-Etil-3- [5 - (llí-pirazol-4-il) -[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; iV-Ciclo-hexilmetil-3- [5 - (lií-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; N— (4-Hidroxi-benzil) -3- [ 5 - (lií-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; Amida do ácido 4-[8-(4-benzilcarbamoil-3-metoxi-fenilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]- tiofeno-2-carboxílico; Amida do ácido 4-[ 8-(6-benzoilamino-piridin-3-ilamino)-[1,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-5-il]-tiofeno-2-carboxilico; IV-Benzil-IV-metil-3- [ 5 - (lfí-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; N-{5-[5-(lH-Pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5- a]pirazin-8-ilamino]-piridin-2-il}-benzamida; Metilamida do ácido 1-{ 4-[ 5-(lfí-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzoil}-piperidina-4-carboxílico; 4 - [ 5 - (lfí-Pirazol-4-il) - [l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-N- (2-piridin-4-il-etil)-benzamida; (4-Etil-piperazin-l-il) -{4-[5-(lfí-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-metanona; N- (1-Etil-pirrolidin-2-ilmetil)-4-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; (2,5-Di-hidro-pirrol-l-il)-{4-[5-(líf-pirazol-4-il)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-metanona; [4-(2-Etoxi-etil) -piperazin-l-il ] - { 4 - [ 5 - (1 Jf-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-metanona; iV-Ciclopropilmet il-4 - [ 5 - (lfí-pirazol-4-il) -[1,2,4]-triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; iV-Met il-iV- (1- { 4 - [ 5 - (lfí-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzoil}-pirrolidin-3-il)-acetamida; [4-(4-Fluoro-benzil)-piperazin-l-il]-{4-[5-(lfí-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-metanona; (4-Fenil-piperazin-l-il) -{ 4- [5- (lfí-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-metanona; ((S)-2-Metoximetil-pirrolidin-l-il)-{4-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-metanona; N- ( (R) -l-Benzil-pirrolidin-3-il) -4- [ 5 - (lií-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; {4-[5-(lH-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-(4-piridin-2-il-piperazin-l-il)-metanona; 25 Ν- (1-Metoximetil-propil)-4-[5-(lH-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; [ 4- (2-Metoxi-etil) -piperazin-l-il] - { 4- [5- (lfí-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-metanona; N- [2-(4-Hidroxi-fenil)-etil]-4-[5-(1H-pirazol-4-il)- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; (4-sec-Butil-piperazin-l-il)-{4-[5-(lH-pirazol-4-il)- [1.2.4] triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-metanona; N- [4-(4-Metil-piperazin-l-il)-fenil]-4-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; Éster etílico do ácido (benzil-{4- [5-(lH-pirazol-4-il)- [ 1,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzoil}-amino)-acético; N-Isopropil-2- ( 4 - { 4 - [ 5 - (lfí-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzoil}-piperazin-l-il)-acetamida; N- (2-Metoxi-etil) -IV- me ti 1-4- [5 - (lfí-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; N-Etil-N- (2-metoxi-et il) -4 - [ 5 - (lfí-pirazol-4-il) - [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; 4-[5-(lH-Pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-N- (tetra-hidro-furan-2-ilmetil)-benzamida; (3,6-Di-hidro-2íí-piridin-l-il) - { 4 - [ 5 - (líí-pirazol-4-il) — [1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-metanona; N- (2-Met ilsulf anil-et il) -4 - [ 5 - (lfí-pirazol-4-il) -[1,2, 4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; 26 Ν- (2,2-Dimetil-[1,3]dioxolan-4-ilmetil)-4-[5-(1H-pirazol-4-il)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; IV- (2-Diisopropilamino-etil)-4-[5-(lH-pirazol-4-il)- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; N- ((S)-1-Etil-pirrolidin-2-ilmetil)-4-[5-(lH-pirazol-4-il)-[l,2,4]triazolo[l,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; IV-Isobutil-4- [5 - (lfí-pirazol-4-il) - [1,2, 4] triazolo [1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; [1,4']Bipiperidinil-1il—{4—[5—(lH-pirazol-4-il)- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-fenil}-metanona; N- (2-Hidroxi-etil)-4-[5-(lH-pirazol-4-il)- [1.2.4] triazolo[1,5-a]pirazin-8-ilamino]-benzamida; e Amida do ácido 4-[ 8-(6-fenilacetilamino-piridin-3-ilamino)-[1,2,4]triazolo[1,5-a]pirazin-5-il]-tiofeno-2-carboxílico.

34. Composição farmacêutica compreendendo um veiculo farmaceuticamente aceitável e uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 33.

35. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 33 no fabrico de um medicamento para tratamento ou profilaxia de uma patologia caracterizada por degradação de ECM.

36. Utilização de um composto de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 até 33 no fabrico de um medicamento para tratamento ou profilaxia de uma 27 patologia seleccionada de doenças envolvendo inflamação.

37. Utilização de um composto de acordo com a reivindicação 36, em que a referida doença é artrite reumatóide. Lisboa, 30 de Junho de 2010