PT1900364E - Ácidos gordos de cadeia de comprimento médio, glicéridos e análogos como fatores de sobrevivência e ativação de neutrófilos - Google Patents

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PT1900364E
PT1900364E PT71164255T PT07116425T PT1900364E PT 1900364 E PT1900364 E PT 1900364E PT 71164255 T PT71164255 T PT 71164255T PT 07116425 T PT07116425 T PT 07116425T PT 1900364 E PT1900364 E PT 1900364E
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PT71164255T
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Christopher Penney
Boulos Zacharie
Jean Barabe
Pierre Laurin
Lyne Gagnon
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Prometic Biosciences Inc
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Description

1
DESCRIÇÃO
"ÁCIDOS GORDOS DE CADEIA DE COMPRIMENTO MÉDIO, GLICÉRIDOS E ANÁLOGOS COMO FATORES DE SOBREVIVÊNCIA E ATIVAÇÃO DE NEUTRÓFILOS"
DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se à prevenção e/ou tratamento de neutropenia. Isto inclui o tratamento de neutropenia associada com a utilização de quimioterapia e radioterapia assim como o tratamento de neutropenia resultante de infeções, doenças hematológicas e deficiências nutricionais. A presente invenção também se refere em geral à redução da toxicidade farmacológica e ao aumento da eficácia farmacológica. Em particular, a presente invenção refere-se à utilização de ácidos gordos de cadeia de comprimento médio como um fator de sobrevivência e ativação de neutrófilos ou fator de proliferação de células estaminais de medula óssea.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A quimioterapia refere-se à utilização de agentes
citotóxicos tais como, ciclofosfamida, doxorubicina, daunorubicina, vinblastina, vincristina, bleomicina, etoposida, topotecano, irinotecano, taxotere, taxol, 5-fluorouracil, metotrexato, gemcitabina, cisplatina, carboplatina ou clorambucil de forma a erradicar células cancerígenas e tumores. No entanto, estes agentes são não-específicos e, particularmente a doses elevadas, eles são tóxicos para células normais e que se dividem rapidamente. Isto leva frequentemente a vários efeitos secundários em doentes submetidos a quimioterapia e radioterapia. A 2 mielossupressão, uma redução severa da produção de células sanguíneas na medula óssea, é um de tais efeitos secundários. É caracterizado por leucopenia, neutropenia e trombocitopenia. A neutropenia crónica severa (idiopática, cíclica, e congénita) é também caracterizada por uma diminuição seletiva do número de neutrófilos circulantes e uma suscetibilidade aumentada a infeções bacterianas. A essência do tratamento do cancro com fármacos quimioterapêuticos é combinar um mecanismo de citotoxicidade com um mecanismo de seletividade para células tumorais altamente proliferativas em relação às células hospedeiras. No entanto, é raro os agentes quimioterapêuticos terem uma tal seletividade. A citotoxicidade dos agentes quimioterapêuticos limita as doses administráveis, afeta os ciclos de tratamento e põe seriamente em perigo a qualidade de vida do doente oncológico.
Embora outros tecidos normais possam ser adversamente afetados, a medula óssea é particularmente sensível aos tratamentos específicos para a proliferação tais como quimioterapia ou radioterapia. A toxicidade da medula óssea aguda e crónica é um efeito secundário comum das terapias oncológicas que levam à diminuição das contagens de células sanguíneas e anemia, leucopenia, neutropenia, agranulocitose e trombocitopenia. Uma causa de tais efeitos é uma diminuição do número de células hematopoiéticas (p.ex., células estaminais pluripotentes e outras células progenitoras) causada por tanto um efeito letal dos agentes citotóxicos ou radiação destas células como pela diferenciação de células estaminais provocada por um mecanismo de feedback induzido pela depleção de mais compartimentos de medula óssea maduros. A segunda causa é uma redução da capacidade de autorrenovação de células 3 estaminais, que está também relacionado com ambos os efeitos diretos (mutação) e indiretos (envelhecimento da população de células estaminais). (Tubiana, M., et al., "Radiotherapy and Oncology" 29:1-17, 1993). Assim, os tratamentos oncológicos frequentemente resultam numa diminuição de neutrófilos polimorfonucleares (PMN) ou neutropenia. Os PMN são a primeira linha de defesa contra patogénios invasores e têm um papel central durante a inflamação aguda, sendo a sua função primária a fagocitose e matar os agentes infeciosos. Para realizar este papel, os PMN deixam a circulação em resposta a fatores quimiotáticos e entram na área afetada para exercer as suas funções biológicas. Em indivíduos que exibem contagens das células sanguíneas normais, os neutrófilos constituem aproximadamente 60% dos leucócitos totais. ("SI Units Conversion Guide", 66-67 (1992), New England Journal of Medicine Books) . No entanto, um em cada três doentes a receber tratamento de quimioterapia para o cancro podem sofrer de neutropenia. Uma contagem média de neutrófilos normais para adultos humanos saudáveis está na ordem de 4400 células/yL, com um intervalo de 1800-7700 células/pL. A contagem de 1.000 células a 500 células/pL é neutropenia moderada e uma contagem de 500 células/yL ou menos é neutropenia severa. Doentes em estados de mielossupressão têm tendência para a infeção e frequentemente sofrem de distúrbios de coagulação sanguínea, requerendo hospitalização. A falta de neutrófilos e plaquetas é a principal causa de morbilidade e mortalidade após tratamentos oncológicos e contribui para o elevado custo da terapia oncológica. Nestas situações supra mencionadas, a utilização de qualquer agente capaz de inibir a apoptose dos neutrófilos ou de estimular a ativação e mobilização dos neutrófilos pode ter valor terapêutico. Esforços para restaurar o sistema imunitário do doente após quimioterapia envolve a utilização de fatores de crescimento 4 hematopoiéticos para estimular as restantes células estaminais a proliferarem e a diferenciarem-se em células maduras para o combate à infeção.
No transplante de medula óssea, um fenómeno conhecido como "mobilização" tem também sido explorado, em colher maiores números de células estaminais/progenitoras do sangue periférico. Este método é atualmente utilizado para transplantes de medula óssea autólogos ou alogénico. São utilizados fatores de crescimento para aumentar o número de células estaminais progenitoras periféricas para serem colhidas antes da terapia mieloablativa e infusão de células estaminais progenitoras. 0 pós-tratamento do transplante de medula óssea pode também contra-atacar a neutropenia, mas requere 10-15 dias de tratamento que deixa os doentes vulneráveis à infeção. Agentes capazes de estimular as células estaminais da medula óssea podem facilitar e acelerar o enxerto das células estaminais, encurtando assim a janela neutropénica a seguir ao transplante de medula óssea.
Embora os fatores de crescimento hematopoiéticos tais como fator de estimulação de colónias de granulócitos-macrófagos (GM-CSF) e fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF) possam exercer tais ações, a sua utilização é dispendiosa uma vez que eles têm de ser produzidos por tecnologia recombinante. Tais tratamentos pós-terapêutica melhoradores são desnecessários se os doentes forem "quimioprotegidos" da supressão imunitária.
Os triglicéridos de cadeia média (também referidos aqui como "MCT") são constituídos por glicerol esterificado com ácidos gordos com comprimentos da cadeia de carbono de 8 (8C, ácido octanóico ou ácido caprilico) e 10 (CIO, ácido 5 decanóico ou ácido cáprico) . MCT usualmente contém uma mistura de ésteres de glicerol de C8 e CIO ácidos gordos. No entanto, MCT pode também conter pequenas quantidades (2±1% cada) de ésteres de glicerol de C6 (ácido hexanóico ou ácido caproico) e C12 (ácido dodecanóico ou ácido láurico). CRODAMOL™ é um MCT comercialmente disponível de Croda Ltd., Toronto (Canadá). Como indicado no exemplo 1, CRODAMOL™ é um MCT que contém triésteres de glicerol de ácidos gordos C8 e CIO presentes em proporções variáveis. No entanto, CRODAMOL™ não contém nenhum éster de ácido gordo C6 ou C12.
Os triglicéridos de cadeia longa (também referidos aqui como "LCT") são constituídos por glicerol esterificado com ácidos gordos com comprimentos da cadeia de carbono maiores que 12. Ácidos gordos tipicos presentes em LCT incluem ácido palmitico (C16) e ácido esteárico (C18). Ao contrário de MCT, LCT é o componente primário de gorduras dietéticas. De fato, MCT e LCT têm diferentes propriedades biológicas significativas. Algumas das diferenças fisiológicas entre MCT e LCT são descritas no "Harrison's Principies of Internai Medicine", 8a edição, 1520- 1521 (1977), McGraw
Hill Book Company ou 15a Edição, 1668- 1669 (2001). Por exemplo, MCT, em contraste com LCT, não requere hidrólise pela lipase pancreática, uma vez que eles podem ser absorvidos pela célula do epitélio intestinal. D. Waitzberg et al., em "Nutrition" 13:128-132 (1997),
com MCT afirma que as emulsões lipidicas (LCT e MCT) apenas diminuem moderadamente a função neutrofilica bactericida e não têm efeito nos monócitos. De fato, a única publicação que dá uma vaga indicação de que MCT pode influenciar neutropenia descreve estudos clínicos nos quais MCT são administrados juntamente com LCT e comparado com LCT isoladamente. Não foram realizados estudos 6 isoladamente e assim o efeito na função imunitária não é aparente. No entanto, os resultados reportados por S. Demirer et al., em "Clinicai Nutrition" 19:253-258 (2000), ensinam que MCT exacerba a neutropenia quando combinado com LCT e relativamente a LCT isoladamente. Isto é, foi sugerido que MCT inibe a função e/ou sobrevivência dos neutrófilos. De certa forma a apoiar esta sugestão, WO95/30413 divulga a utilização de ácidos gordos como um acelerador de proliferação das células estaminais hematopoiéticas. Sugere que ácidos gordos insaturados de cadeia longa tais como ácido linolénico, assim como ácidos gordos saturados de cadeia longa (C16 ou mais), podem funcionar para aumentar a proliferação das células estaminais hematopoiéticas. WOOl/95914 divulga a utilização de lipidos para modular a resposta imunitária. Os lipidos têm um esqueleto de glicerol com pelo menos uma cadeia alquilo ou arilo C10-22·
Sumário da invenção A presente invenção baseia-se na descoberta que certos glicéridos são agentes quimioprotetores. De acordo com a presente invenção, um composto para utilização no transplante de medula óssea ou para utilização no tratamento de uma condição selecionada entre mielossupressão, feridas e neutropenia, é um glicérido com a fórmula para utilização no tratamento
RtCOO- AY-
I 80 7 em que A e B são o mesmo ou diferentes e são cada um H ou RiCO:
Ri é alquilo C7 ou Cg; e Y é 0 ou NH. A presente invenção põe à disposição uma forma de tratar os efeitos da mielossupressão da quimioterapia e radioterapia, e qualquer outra situação na qual a estimulação do sistema hematopoiético pode ser de valor terapêutico tal como, transplante de medula óssea e neutropenia crónica, assim como neutropenia resultante de infeções, doenças hematológicas e deficiências nutricionais. Isto ajuda o sistema hematopoiético a contrariar a mielossupressão, a aumentar a sobrevivência e ativação dos neutrófilos, em doentes submetidos a tal tratamento.
Descrição da invenção
Quando utilizado em quimioterapia e radioterapia, uma composição contendo o glicérido é administrada antes, durante e/ou após o tratamento, de forma a encurtar a janela neutropénica e a acelerar a reposição do sistema hematopoiético. Além disso, é possível utilizar uma combinação de glicéridos em múltiplas alturas relativamente ao tratamento com quimioterapia e radioterapia. Alternativamente, é possível administrar a combinação simultaneamente, antes, durante e/ou após o tratamento com quimioterapia e radioterapia. Em neutropenia severa, uma composição contendo o glicérido é utilizada como o agente terapêutico. No transplante de medula óssea, o glicérido é utilizado para aumentar o número de células estaminais periféricas disponíveis para transplante após radioterapia ou quimioterapia ablativa. 0 glicérido pode também ser utilizado após o transplante de medula óssea, de forma a estimular as células estaminais da medula óssea, encurtando assim o periodo de tempo de recuperação da neutropenia. A invenção é por isso útil para estimular a hematopoiese para tratar a mielossupressão que surge da quimioterapia ou radioterapia; neutropenia crónica ou transitória; neutropenia induzida por fármacos; e neutropenia que surge após uma doença hematológica, deficiência nutricional, infeção ou radioterapia. A neutropenia transitória pode surgir do stress devido ao transporte de um animal ou viagem de um humano ou animal. A invenção é também útil para estimular a hematopoiese para tratar uma ferida no doente, e para induzir a mobilização de neutrófilos para facilitar o transplante de medula óssea num doente.
Conforme utilizado aqui, os termos "um" ou "uma" pode significar um ou mais, dependendo do contexto em que é utilizado.
Conforme utilizado aqui "composição contendo o glicérido " refere-se a uma composição que compreende o dito principio ativo e um ou mais veículos farmacologicamente aceitáveis.
Conforme utilizado aqui, o termo "veículo farmacologicamente aceitável" refere-se a uma substância que não interfere com os efeitos fisiológicos do glicérido e que não é tóxico para mamíferos incluindo humanos.
Uma composição para utilização na presente invenção é formulada utilizando o glicérido e veículos farmacologicamente aceitáveis através de métodos do conhecimento dos peritos na especialidade (Merck Index, Merck & Co., Rahway, NJ) . Estas composições incluem, líquidos, óleos, emulsões, aerossóis, inalantes, cápsulas, comprimidos, pensos transdérmicos e supositórios. 9
Todos os métodos incluem o passo de pôr o(s) principio(s) ativo (s) em associação com o veiculo que constitui um ou mais ingredientes acessórios.
Conforme utilizado aqui, o termo "quimioterapia" refere-se ao processo de matar células em proliferação utilizando um agente citotóxico. A frase "durante a quimioterapia" refere-se ao periodo durante o qual dura o efeito da administração do agente citotóxico. A frase "após a quimioterapia" visa cobrir todas as situações nas quais a composição é administrada após a administração de um agente citotóxico independentemente de qualquer administração anterior do mesmo e também independentemente da persistência do efeito do agente citotóxico administrado.
Quando esta invenção é utilizada na quimioterapia, o glicérido pode ser administrado antes da, durante ou subsequente à quimioterapia (i.e. antes de, durante, ou subsequentemente à administração de um agente citotóxico)
Por "agente citotóxico" entende-se um agente que mata células altamente proliferativas, p.ex., células tumorais, células infetadas por virus, ou células hematopoiéticas. Exemplos de um agente citotóxico que pode ser utilizado para exercer a invenção incluem, ciclofosfamida, doxorubicina, daunorubicina, vinblastina, vincristina, bleomicina, etoposida, topotecano, irinotecano, taxotere, taxol, 5-fluorouracil, metotrexato, gemcitabina, cisplatina, carboplatina ou clorambucil, e um agonista de qualquer dos compostos anteriores. Um agente citotóxico pode também ser um agente antiviral agent, p.ex., AZT (i.e., 3'- azido- 3'- deoxitimidina) ou 3TC/ lamivudina (i.e., 3- tiacitidina). 10
Conforme utilizado aqui, o termo "leucopenia" refere-se a uma redução anormal do número de leucócitos no sangue.
Conforme utilizado aqui, o termo "neutropenia" refere-se à presença de números anormalmente baixos de neutrófilos no sangue.
Numa forma de realização preferida, a composição farmacêutica está sob a forma de qualquer composição apropriada para administração oral, sublingual ou inalação (spray nasal), intravenosa, intramuscular, subcutânea, para utilização no tratamento de neutropenia.
Será de apreciar que a quantidade de uma composição da invenção necessária para utilização no tratamento irá variar com a via de administração, a natureza da condição a ser tratada, a idade e a condição do doente, e será em última análise à descrição do médico assistente. A dose desejada pode convenientemente ser apresentada numa única dose ou em doses divididas tomadas a intervalos apropriados, por exemplo duas, três, quatro ou mais doses por dia.
Enquanto seja possível que, para utilização na terapia, o glicérido seja administrado como o químico em bruto, é preferível apresentar o princípio ativo como uma formulação farmacêutica.
Numa forma de realização preferida desta invenção, a quantidade do princípio ativo administrada é tal que a concentração no sangue (livre e/ou ligado à albumina sérica) seja maior que 1 μΜ. Numa forma de realização particularmente preferida, a concentração no sangue é maior que 1 mM. 11
Numa outra forma de realização, a composição farmacêutica está sob a forma de administração oral (incluindo sublingual), ou parentérica (incluindo intramuscular, subcutânea, rectal e intravenosa). A formulação pode, quando apropriado, ser convenientemente apresentado em unidades de dose discretas e pode ser preparada por qualquer dos métodos bem conhecidos na especialidade farmacêutica. Todos os métodos incluem o passo de colocar em associação o composto ativo com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e depois, se necessário, moldar o produto na formulação desejada. Quando desejado, podem ser empregues as formulações acima descritas adaptadas para se ter a libertação prolongada do princípio ativo. 0 glicérido também pode ser utilizado em combinação com outros agentes terapeuticamente ativos tal como agentes anticancerígenos citotóxicos ou outros agentes anticancerígenos (fármacos imuno-moduladores ou reguladores ou vacinas terapêuticas ou fármacos antiangiogénese, etc.), fármacos imunossupressores (incluindo fármacos anti-inflamatórios) , um fator de crescimento tal como um fator de estimulação de colónias (preferivelmente GM-CSF ou G-CSF) , uma citoquina tal como interleucina 2 ou interleucina 15, ou combinações destes. Os componentes individuais de tais combinações podem ser administrados ou sequencialmente (antes ou depois) ou simultaneamente em formulações farmacêuticas separadas ou combinadas. A combinação referida anteriormente pode convenientemente ser apresentada para utilização sob a forma de uma formulação farmacêutica e assim formulações farmacêuticas que compreendem uma combinação como definido anteriormente juntamente com um veículo farmacologicamente aceitável deste, compreende um outro aspeto da invenção. 12
Numa forma de realização preferida, a composição contém uma mistura de pelo menos dois compostos descritos pela fórmula I, que são triglicéridos de cadeia média (MCTs) em que A, B e Ri são o mesmo e são grupos alquilo C7 e C9 de cadeia linear ou ramificada, saturados ou insaturados, respetivamente. Alternativamente, a composição contém uma mistura de dois triglicéridos em que um primeiro MCT é descrito pela fórmula I, em que A, B e Ri são CH3(CH2)6, e um segundo MCT é descrito pela fórmula I, em que A, B e Ri são CH3(CH2)8· Alternativamente, a composição contém além disso de 0,1% a 3% cada de um terceiro composto descrito pela fórmula I, em que A, B e Ri são CH3(CH2)4, e um quarto composto descrito pela fórmula I, em que A, B e Ri são CH3(CH2)i0. Alternativamente, a composição é uma mistura contendo quatro isómeros geométricos de triglicéridos de ácidos gordos C8 e CIO descritos pela seguinte fórmula: I 2 3 4 & 6 € i 1 m m 6 6 $ s P » 6 s a * CO-
Cn seguintes Exemplos ilustram adicionalmente a prática desta invenção. Será de apreciar que a seleção da dose de glicéridos a ser administrado a qualquer doente individual (humano ou animal) será da descrição do médico assistente, irá ser prescrito de uma forma estabelecida em função com as dosagens apropriadas e irá depender do estádio da doença e fatores semelhantes, exclusivamente da competência do médico assistente. 13
Exemplo 1: Análise de CRODAMOL™ (MCT: Triglicérido
Caprilico/Cáprico) CRODAMOL™ GTCC lote #T1033- 1299 de Croda Ltd. (Toronto, Canadá) foi analisado por cromatografia gasosa. Análise GC FID, condições do gradiente: 100°C- 250°C em 10 minutos, depois 250°C durante 25 minutos; FID 250°C. Foram observados quatro picos: 22,04 minutos (26%), 25,07 minutos (43%), 29,16 minutos (25%) e 34,75 minutos (5%). Uma amostra de triglicérido caprilico (tricaprilina), obtida de Sigma-Aldrich lote #079H1212, foi analisada por cromatografia gasosa. Análise GC FID, condições do gradiente: 100°C- 250°C em 10 minutos, depois 250°C durante 25 minutos; FID 250°C. Sobretudo um pico aos 22,31 minutos (98%) .
Exemplo 2: Acilação de álcool utilizando ácido clorídrico e base piridina
Método A: Piridina, 01*0* Método B í IMiíA?» ¢3¾.¾¾ Método Geral A (Piridina)
Uma solução do álcool (~0.1 M) em CH2CI2 seco e piridina (4:1), foi arrefecida até 0°C sob azoto, e tratado com ácido clorídrico (1,2 equivalentes). Foi permitido a reação aquecer lentamente até temperatura ambiente, e agitado durante a noite. A análise TLC (SÍO2, EtOAc 1:9 hexano) mostrou nenhum álcool remanescente. A mistura reacional foi 14 diluída com CH2C12, e lavada com solução aquosa NH4C1 saturada. A fase aquosa foi extraída com CH2C12 (x 1) e hexano (x 1), e as fases orgânicas combinadas foram lavadas com solução aquosa de NaCl saturada, seco sobre Na2SC>4, filtrado e evaporado em vácuo para se obter o produto bruto. Método Geral B (DMAP)
Uma solução do álcool (~0.1 M) em CH2C12 seco foi arrefecida até 0°C sob azoto, e tratada com DMAP (1,3 equivalentes) e ácido clorídrico (1,2 equivalentes). Foi permitido a reação aquecer lentamente até temperatura ambiente, e foi agitada durante a noite. A análise TLC (Si02, EtOAc 1:9 hexano) mostrou nenhum álcool remanescente. A mistura reacional foi diluída com CH2C12, e lavada com solução aquosa NH4C1 saturada. A fase aquosa foi extraída com CH2C12 (xl) e hexano (xl) , e as fases orgânicas combinadas foram lavadas com solução aquosa NaCl saturada, seco sobre Na2SC>4, filtrado e evaporado em vácuo para se obter o produto bruto.
Exemplo 3: Triglicérido Ácido Nonanóico
Glicerol (120 mg, 1,30 mmol) foi acilado com cloreto nonanoil (751 μΐ, 4,16 mmol) de acordo com o Método Geral A, exemplo 2. A purificação com cromatografia em coluna (Isolute™ Si02, eluição com 0-5% EtOAc em hexano) deu dois produtos contendo frações, que foram evaporados em vácuo para se obter o produto desejado como um líquido incolor, com 89% (127 mg, 19%) e 93% (475 mg, 71%) de pureza respetivamente (GC/FID). Rf 0,46 (Si02, 10% acetato de etilo em hexano) ; NMR (CDCI3, 300 MHz) õH = 5,27 (m, 1H), 4,29 (dd, 2H), 4,14 (dd, 2H), 2,31 (m, 6H) , 1/61 (m, 6H) , 15 1,27 (m, 30H) , 0,88 (t, 9H) ; MS (FAB+) m/z = 510 (M-H+) ; Análise GC FID, condições: gradiente 100°C-250°C em 10 minutos, depois 250°C durante 25 minutos; FID 250°C; 27,25 minutos.
Exemplo 3: 1,2,3-0,N,0-Tridecanoil serinol
Serinol (51 mg, 0,56 mmol) foi acilado com cloreto decanoil (372 μΐ, 1,76 mmol) de acordo com o Método Geral B, exemplo 2. A purificação por MPLC (SÍO2, eluição com 0 depois 10%
EtOAc em hexano) deu 0 produto desej ado como sólido branco (301 mg, 97%) . mp 54 °C; TLC, Rf 0,85 (Si02, EtOAc 2:3 hexano); 1R NMR (CDC1 3 r 300 MHz) õH 0,84 (9H, t), 1,20-1,27 (36H, m) , 1,52- 1, 60 (6H, m) , 2 ,13 (2H, t), 2,28 (4H, t), 4,03 (2H, 2 x A de 2 X ABX), 4, 19 (2H, 2 x B de 2 x ABX, ) , 4,41-4,46 (1H, m) , 5,70 (1H, d); HRMS m/e calculado para C33H63NO5 553, 4706 Descoberto 553,4713. Análise GC-FID, condições do gradiente: 100°C-250°C em 10 minutos, depois 250°C durante 25 minutos; FID 250°C. Sobretudo um pico aos 14,80 minutos (98%).
Exemplo 4:1,3-0,O-Didecanoil serinol
jb)SOC-CIN, Et»N; 08*0*; c) HO. 16
Uma solução de serinol (1,57 gm, 17,2 mmol) em acetona (17 ml) e água (17 ml), foi tratada com trietilamina (3,60 ml, 25,9 mmol) e BOC-ON (4,67 gm, 19,0 mmol), e a reação foi agitada sob azoto durante a noite. A acetona foi evaporada em vácuo, e a mistura bruta foi particionada entre BtOAc e água. A fase aquosa foi extraída com EtOAc (x 3) , e os extratos orgânicos combinados foram secos sobre Na2SC>4, filtrado e evaporado em vácuo, para se obter um sólido amarelo. A purificação com MPLC (Si02, eluição com 40 a 80% EtOAc em hexano) deu o intermediário N-BOC-diol como um sólido cristalino branco (2,10 gm, 64%). TLC, Rf 0,15 (Si02, EtOAc 4:1 hexano); XH NMR (CDC13, 300 MHz) δΗ 1,40 (9H, s), 3,54-3,56 (5H, m). O intermediário .N-BOC-diol (50 mg, 0,26 mmol) foi acilado com cloreto decanoil (173 yL, 0,83 mmol) de acordo com o Exemplo 2. A purificação com MPLC (Si02, eluição com 0 depois 10% EtOAc em hexano) deu o produto intermediário N- BOC- diacilo como um óleo incolor (115 mg, 88%) . TLC, Rf 0,80 (Si02, EtOAc 2:3 hexano); NMR (CDC13 , 300 MHz) ÕH 0,87 (6H, t), 1,23-1,30 (24H, m) , 1,44 (9H, s), 1 ,56-1, 70 (4H, m) , 2,31 (4H, t) , 4,04-4,21 (4H, m) , 4,77-4,80 (1H, m) , 6,73 (1H, d). Uma solução do intermediário N-BOC- diacilo (76 mg, 0,15 mmol) em CH2C12 seco (1,5 mL) foi arrefecida até 0°C, e tratado com uma solução de 4,0 M HC1 anidrido em 1,4-dioxano (375 yL, 1,50 mmol; concentração final 0,8 M) . Foi permitido a reação aquecer até temperatura ambiente, e agitado durante 3 horas à mesma temperatura. Uma outra porção de 4,0 M HC1 anidrido em 1,4-dioxano (375 ml, 1,50 mmol) foi adicionada, e a reação foi agitada por mais 2 horas. A evaporação dos solventes deu o produto desejado, como sólido branco (69 mg, 100%). mp 1010C; TLC, Rf 0,40 (Si02, EtOAc 2:3 hexano); NMR (CDM13 300 MHz) õH 0,88 (6H, t) , 1,20-1,29 (24H, m) , 1,55-1,65 17 (4Η, m) , 2,45-2,52 (4H, m) , 3,72-3, 80 (1H, m) , 4,30-4,51 (2H, m) , 8,6-9,0 (3H, br m) ; HRMS m/e calculado para (M-HC1) , C23H45NO4 339, 3348 Descoberto 339, 3340; Análise GC- FID, condições do gradiente: 100°C-250°C em 10 minutos, depois 250°C durante 25 minutos; FID 250°C. Sobretudo um pico aos 17,14 minutos (94%).
Exemplo 5: Ensaios in vitro de apoptose e sobrevivência dos neutrófilos A sobrevivência dos neutrófilos foi medida como descrito por Lagraoui e Gagnon (Cell. Mol. Biol. 43:313-318, 1997).
Os neutrófilos foram obtidos do sangue periférico de voluntários saudáveis. O sangue foi submetido a centrifugação em gradiente com Lympholyte-poly (Cedarlane, Hornby, Canadá) seguido de lise hipotónica de eritrócitos contaminantes. As células foram suspensas em RPMI (Gibco, Burlington, Canadá) suplementadas com 10% FBS (Hyclone, Logan USA) . As preparações celulares finais consistiram em >95% neutrófilos como determinado por coloração Wright Giemsa. A viabilidade foi maior que 97% como determinado por exclusão azul triptano. Os leucócitos polimorfonucleares (PMN) têm uma semivida curta e rapidamente sofrem alterações caracteristicas indicativas de apoptose. A apoptose foi avaliada de acordo com o método descrito por Nicoletti et al., J. Immunol. Meth. 139:271-279 (1991). Sucintamente, neutrófilos recentemente isolados foram incubados durante 24 horas a 37 °C com diferentes concentrações de MCT. Após incubação, as células foram coradas com iodeto de propidio (PI, Sigma) e analisadas relativamente à apoptose utilizando um citómetro de fluxo XL (Coulter). Os dados foram então expressos como a percentagem de células apoptóticas. A figura 1 representa a compilação de várias experiências nas quais a apoptose de 18 neutrófilos foi medida na ausência (controlo) ou na presença de várias concentrações de MCT. Os resultados indicam que na presença de MCT in vitro, a apoptose de neutrófilos é inibida em até 90% e que a inibição é dose-dependente. Assim, MCT pode aumentar a sobrevivência de neutrófilos e pode ser utilizada como fator de sobrevivência de neutrófilos.
Exemplo 6: Ensaios Jn vitro de fagocitose PMN
Os neutrófilos (2 x 106/ml) foram incubados durante 24 horas, a 37 °C em 5% C02 e 95% humidade com várias concentrações de MCT. Após 24 horas, a viabilidade foi determinada por exclusão azul triptano e as células foram lavadas três vezes com PBS contendo 2 mM glucose, 1 mM MgCl2 e 1 mM CaCl2. A concentração celular foi então ajustada para 1 x 106 células/mL e depois incubadas com microesferas carboxilato de "fluoresbrite" (diluição 1/10). Após 30 minutos de incubação, os neutrófilos foram lavados e fixados em 2% paraformaldeido. Os neutrófilos fixados foram analisados relativamente à ingestão de microesferas utilizando citómetro de fluxo XL (Coulter). Os dados foram então expressos como a percentagem de células fagocitárias. A figura 2 representa uma compilação de várias experiências que medem a atividade fagocitária PMN na ausência (controlo) ou na presença de várias concentrações de MCT. Os resultados indicam que MCT aumenta a atividade fagocitária de PMN humano. A atividade fagocitária é aumentada até duas a três vezes relativamente aos valores controlo e a extensão da estimulação depende do estado imunitário do doador. 19
Exemplo 7: Efeito de doxorubicina na apoptose de neutrófilos
Foram isolados PMN como descrito no exemplo 5. As células (2 x 106/mL) foram incubadas durante 4 horas, a 37°C em 5% CO2 e 95% humidade na presença de várias concentrações de um agente quimioterapêutico, doxorubicina. As células apoptóticas foram avaliadas como descrito no exemplo 10. Os dados são expressos em percentagem de células apoptóticas. A figura 3A e 3B indicam que doxorubicina induz a apoptose PMN.
Exemplo 8: MCT salva a apoptose de neutrófilos induzida por doxorubicina
Foram isoladas PMN como descrito no exemplo 5. As células (2 x 106/mL) foram incubadas durante 4 horas, a 37°C em 5% C02 e 95% humidade na presença de várias concentrações de doxorubicina com ou sem MCT (2,5% e 5,0%). As células apoptóticas foram avaliadas como descrito no exemplo 5. Os dados são expressos em percentagem de células apoptóticas. A tabela 1 representa duas experiências que medem os efeitos quimioprotetores de MCT em PMN. Os resultados são expressos em percentagem de células apoptóticas após 4 horas de incubação na presença ou na ausência de doxorubicina com ou sem MCT. Como no exemplo 7, doxorubicina induz a apoptose PMN in vitro. No entanto, na presença de MCT, a uma concentração de 2,5% e 5% (v/v), os efeitos apoptóticos de doxorubicina são inibidos. Assim, MCT exerce uma ação anti-apoptótica no PMN. A apoptose também foi estudada utilizando o método anexina V-FITC/PI (iodeto de propídio) de acordo com as recomendações do fabricante Biosources ("Apotarget Annexin-VFITC Apoptosis Kit" #PHN 1018). A anexina V liga-se à fosfatidilserina que 20 é transferida da membrana interna para a externa na fase inicial a tardia da apoptose. Sucintamente, os neutrófilos são incubados na presença ou ausência de concentrações variáveis de doxorubicina e MCT. Após 24 horas, os neutrófilos são lavados com PBS e corados com 2 yL de anexina V-FITC e 10 pL de PI (Sigma, 1 mg/mL) durante 20 minutos. Após incubação, as células coradas foram fixadas em paraformaldeido (1%) e analisadas relativamente à apoptose utilizando um citómetro de fluxo XL (Coulter). Os dados foram então expressos como a percentagem de células apoptóticas. A figura 4A representa uma resposta em função do tempo de MCT nos neutrófilos tratados com doxorubicina. MCT salva a apoptose induzida por doxorubicina de neutrófilos humanos de uma forma dependente do tempo e da dose. A figura 4B representa a resposta em função do tempo de doxorubicina em neutrófilos tratados com MCT. MCT protege, de uma forma dependente da dose, os neutrófilos contra a apoptose induzida por doxorubicina até 4 horas antes da introdução do agente tóxico (doxorubicina).
Tabela 1
Efeito protetor de MCT na apoptose dos neutrófilos induzida por doxorubicina j % Apoptose de neutrófilos (PMN)
Concentração de j Experiência 1 j Experiência 2 doxorubicina SControlo MCT 2,5% (v/v) MCT 5% (v/v) (Controlo jMCT 2,5% ! (v/v) í MCT 5% i j (V/v) | 0 | 12,4 9,5 12,3 i 4 9, 6 123, 6 ] 4,6 i s o O T—1 | 9,3 11,7 7,4 |60,6 114, 7 j 23,9 | IO'8 M | 18,7 14,2 8,3 159, 2 (32,5 ( 14,8 | 10'6 M | 23,2 12,7 3, 5 155, 0 (21,6 ( 16,9 | IO'5 M | 23,8 12,3 8,3 i66, 2 (74,7 I" 12, L.......| 10'4 M j 27,5 35,2 17,1 153,2 15 8,6 ( 55,7 i 21
Exemplo 9: MCT salva a apoptose de neutrófilos induzida por doxorubicina: Comparação com GM-CSF A tabela 2 representa o efeito de GM-CSF, MCT e tricaprilina na apoptose de neutrófilos humanos induzida por doxorubicina. GM-CSF e MCT são capazes de salvar ou proteger neutrófilos humanos contra a apoptose induzida por doxorubicina. A tricaprilina salva a apoptose induzida por doxorubina e além disso aumenta a viabilidade de neutrófilos humanos em maiores proporções que aquela observada em neutrófilos não tratados (controlo, ausência de doxorubicina).
Tabela 2
Efeito protetor de MCT e GM-por doxorubicina -CSF na apoptose de neutrófilos induzida % Viabilidade PMN l Controlo 35,9 ± 0,71 iDoxorubicina (DOX) (10”b M) 6,82+0,5 •j iGM-CSF (10“7 M) + DOX 16,75 ±2,05 ÍGM-CSF (10“8 M) + DOX 6,99 ± 0,23 í ÍMCT (24 mM) + DOX 14,20 ± 1,98 í j MCT (12 mM) + DOX 12,37 ± 1,72 i· Tricaprilina (24 mM) + DOX 12,13 ± 1,25 s Tricaprilina (12 mM) + DOX -----------------------------------------------L„ 42,95 ± 6,15 ------------J Exemplo 10: MCT e tricaprina aumentam in vitro a proliferação de medula óssea murina As células da medula óssea foram obtidas do fémur de ratinhos fêmeas C57BL/ 6 (com 6 a 8 semanas de idade). As células foram enxaguadas e lavadas com PBS. As células colhidas foram centrifugadas e ressuspensas a 2 x 106 células/mL. São incubados 100 yL de células (2 x 105 células) numa placa de microtitulação de 96 poços durante 48 horas na presença ou ausência de MCT ou tricaprina. Após 22 incubação, as células são pulsadas com 1 yCi de [3H] -timidina durante 6 horas. As placas foram colhidas num Tomteck e feita a contagem num contador Microbeta β. A incorporação de [3H]-timidina no DNA é uma indicação direta da proliferação celular. A figura 5 representa uma experiência típica sobre o efeito de MCT e tricaprina na proliferação da medula óssea. MCT e tricaprina aumentam a proliferação da medula óssea em 3- a 5- vezes relativamente ao controlo.
Exemplo 11: Estudos de quimioproteção: Indução ou proteção in vivo da proliferação de células imunitárias com MCT
Ratinhos fêmeas C57BL/6, de 6 a 8 semanas de idade, foram imunossuprimidos através do tratamento com 80 mg 5-fluorouracil (5-FU) ou 100-200 mg de ciclofosfamida (CY) ou 12 mg de taxotere (TX) administrado intravenosamente no dia 0. Para examinar o efeito imunoprotetor de MCT ou outros compostos, os ratinhos foram pré-tratados oralmente no dia -3, -2 e -1 ou tratados intravenosamente no dia 0 com o composto teste. Os ratinhos foram sacrificados no dia +5 através de punção cardíaca e deslocamento cervical. Depois, foram preparadas suspensões de células do timo, baço e medula óssea como se segue.
Os tecidos foram esmagados em tampão PBS e os eritrócitos contaminantes foram lisados in tampão ACK (155 mM NH4CI, 12 mM NaHC03, 0,1 mM EDTA, pH 7,3) durante 5 minutos. As células foram então colhidas por centrifugação e lavadas três vezes em PBS e ressuspensas em meio de cultura tecidual. As células foram contadas num hemacitómetro. 23
Os resultados mostram que MCT aumenta significativamente o número de células de tecidos imunitários de animais normais e imunossuprimidos em comparação com o veículo isoladamente como mostrado nas tabelas e figuras seguintes. Dependendo das experiências e do estado imunitário dos ratinhos, MCT pode aumentar a contagem de células da medula óssea e/ou de células do baço e/ou de células do timo. A figura 6 mostra o efeito de MCT na contagem de células da medula óssea em animais imunossuprimidos. Apenas CY e 5-FU deprimiram a contagem de células da medula óssea em comparação com o controlo (nenhum tratamento citotóxico). No ratinho, o tratamento com taxotere não tem efeito significativo na contagem de células da medula óssea. Na medula óssea suprimida, a administração de MCT (6,25 ymol por ratinho) no dia -3, -2 e -1 aumentou significativamente a contagem de células da medula óssea. A figura 7 representa o efeito de MCT na contagem de células do baço em ratinhos imunossuprimidos que receberam o regime de pré-tratamento de MCT per os. Todos os fármacos citotóxicos (CY, 5-FU e TX) reduzem significativamente a contagem das células do baço em comparação com o controlo. A administração de MCT (6,25 ymol por ratinho) no dia -3, -2 e -1 aumenta significativamente a contagem de células do baço com "P" menor que 0,0017, 0,009 e 0,0036 para CY, 5-FU e TX respetivamente.
Além disso, MCT aumenta significativamente a contagem de células de medula óssea em ratinhos normais quando administrado i.v. no dia 0 (tabela 3). No entanto, uma injeção i.v. de MCT não é suficiente para melhorar a contagem de células do baço tanto em ratinhos normais como em imunossuprimidos. 24
Tabela 3 : Efeito de ciclofosfamida (CY) e ide baço (ratinhos normais) CY + MCT nas células de medula óssea e i; 5 Medula óssea j Baço 1 # Células (xlO6) P j # Células (xlO6) i p | ÍControlo | 16 ± 3,94 ! 94 ± 11 1 \ ÍCY 1 13 ± 3,92 0,17 :Í 60+12 \ 0,0014 i :CY + MCT (50 pmol) \ 17 ± 4,28 i 0,87 ií 53+10 1 0,0003 \ ÍCY + MCT (12,5 μπιοί) 1 17 ± 6,15 i 0,95 i 51+10 I 0,0002 \ jMCT (50 μπιοί) 1 41 ± 6,11 i >0,0001 i 103 ± 7 i 0,!9 \ MCT (12,5 μπιοί) I 27 ±4,19 j 0,0018 i 101 ± 11 | 0,31 |
Exemplo 12: Estudos de quimioproteção: In vivo dose-resposta da indução de MCT da proliferação de células imunitárias quando administrado no dia -3, -2 e -1 em ratinhos normais A dose-resposta in vivo da indução de MCT da proliferação das células imunitárias em ratinhos normais foi avaliada através do protocolo descrito no exemplo 11. A tabela 4 representa a dose-resposta do tratamento com MGT administrado oralmente no dia -3, -2 e -1 em ratinhos normais. MCT aumenta significativamente a contagem de células da medula óssea e de células do baço.
Tabela 4 : Efeito de MCT em ratinhos normais :! Medula óssea :j Baço
:j # Células (xlO®) | P ![ # Células (xlO®) I P ÍControlo ;! 45 ± 7,3 120 ± 12,9 iMCT (3,15 pmol) j 52 ± 4,3 (0,10 i 144 ± 15,8 i 0,018 MCT (6,25 ymol) j 59 ± 11,3 i 0,05 j 134 ± 13,9 i 0,129 iMCT (12,5 pmol) i 54 + 6 ^0,04 i 144 ± 19,8 i 0,04 iMCT (25 yMole) ! 56+3,9 ! 0,01 i 127 ± 17,0 i 0,48 25
Exemplo 13: Estudos de quimioproteção: Indução in vivo da proliferação ou proteção das células imunitárias: Comparação do efeito de MCT versus GM-CSF A comparação in vivo da indução da proliferação/regeneração ou proteção de células imunitárias foi realizada seguindo o protocolo descrito no exemplo 11. Foram realizados estudos comparativos de MCT e GM-CSF em animais normais e imunossuprimidos. Comparado com MCT, GM-CSF não tem atividade significativa na contagem de células da medula óssea e do baço em animais imunossuprimidos. Um efeito significativo de GM-CSF foi apenas observado no peso do timo em ratinhos normais (figura 8). Neste caso, MCT exibiu um efeito similar no GM-CSF.
Exemplo 14: Estudos de quimioproteção 0 efeito de tricaprilina e tricaprina na indução in vivo da proliferação ou proteção de células imunitárias foi avaliado através do protocolo descrito no exemplo 11. Tricaprilina e tricaprina são ambas eficazes na proliferação ou proteção da contagem de células da medula óssea em ratinhos tratados com CY (tabela 5) . Não foi observado nenhum efeito significativo na contagem de células do baço, em comparação com ratinhos tratados com ciclofosfamida.
Tabela 5
Efeito de ciclofosfamida (CY), CY + tricaprilina e CY + tricaprina nas células \ da medula óssea e do baço \
Medula óssea Baço # Células (xlO6) | P/Controlo P/CY # Células(xlO6 ) | P/Controlo P/CY Controlo 55 ± 9,3 113 ± 15,9 CY 22+5,8 jo,0001 36 ± 13,6 | >0,0001 CY + 34 ± 7,8 jO,0033 0,022 37 ± 12,6 1 >0,0001 0,8 26 iEfeito de ciclofosfamida (CY), CY + tricaprilina e CY + tricaprina nas células \ da medula óssea e do baço \ 1 Medula óssea : Baço j # Células (xlO6) 1 P/Controlo j P/CY |# Células(xlO6) | P/Controlo P/CY itricaprilina | :CY + tricaprina 31+3,8 lo, 0008 10,012 i 38 ± 6,8 I >0,0001 0,7 Exemplo 15 : Estudos de quimioproteção 0 efeito de trilaurina e trimiristina na indução in vivo da proliferação ou proteção das células imunitárias foi avaliado através do protocolo descrito no exemplo 11. A trilaurina e trimiristina têm atividade fraca (não significativa) na contagem de células da medula óssea e do baço em ratinhos imunossuprimidos com CY (tabela 6).
Tabela 6
Efeito de ciclofosfamida (CY), CY + trilaurina e CY + trimiristina nas células da medula óssea e do baço
Medula óssea j Baço í; # Células 1 (xlO6) S P/Controlo P/CY # Células s . (XlO6) | P/ControLo P/CY Controlo | 49 ± 7.3 105 ± 23 | CY 1 27 ± 2,8 lo,0014 19 ± 6,5 |0,0007 CY + trilaurina (6,25 μΜ) i 31 ± 6,8 jo,0028 0,219 28 ± 19,5 10,0004 0,302 CY + trimiristina (6,25 μΜ) 1 31 ± 9,9 jo,0067 0,402 15 ± 4,6 :0,0007 0,314
Exemplo 16: Estudos de quimioproteção 0 efeito de MCT caprilato de sódio e caprato de sódio na indução in vivo da proliferação ou proteção das células imunitárias foi avaliado através do protocolo descrito no exemplo 11. 27
Um aumento significativo da proliferação ou proteção da contagem de células da medula óssea foi observado com pró-tratamento com MCT, caprilato de sódio e caprato de sódio em ratinhos tratados com CY (figura 9).
Exemplo 17: Estudos de quimioproteção: Regimes pós-tratamento
Foram realizados estudos de quimioproteção como descrito no exemplo 11 exceto que os ratinhos foram (pós)-tratados com MCT, caprilato de sódio, caprato de sódio ou ácido cáprico per os no dia 1, 2, 3 e 4.
Um aumento significativo na contagem de células da medula óssea foi observado com o pós-tratamento com MCT, caprilato de sódio e caprato de sódio em ratinhos tratados com CY (tabela 7).
Tabela 7
Efeito de ciclofosfamida (CY), CY + MCT, CY + caprilato de sódio e CY + caprato de sódio após o tratamento das células da medula óssea e do baço
Medula óssea
Baço # Células (xlO6) | P P/CY # Células (xlO6) | p 1 P/CY Controlo 52 ± 6, 17 | 110 ± 29,3 | ij ÍCY 19 ± 4,99 \ >0,0001 30 ± 9,5 10,0007 | ÍCY + MCT (12,5 ίμΜ) 26 ± 3,70 |>0,0001 0,0189 38 ± 7,2 ^0,0014 | 0,163 :CY + caprilato de sódio (12,5 μΜ) 26 + 5,33 I>0,0001 0,0455 36 ± 12,5 jo,0009 j 0,394 CY + caprato de sódio (12,5 μΜ) 29 ± 4,45 I 0,0001 0,0140 28 ± 6,3 jo,0007 | 0,696 Exemplo 18: Estudos de quimioproteção: Ensaio de imuno f eno tipagem 28
Ratinhos fêmeas C57BL/ 6, com 6 a 8 semanas de idade, foram pré-tratados no dia - 3, -2 e -1 per os ou intravenosamente no dia 0 com diferentes concentrações de MCT. Também foi realizado a imunofenotipagem em animais imunossuprimidos. Foi alcançada a imunossupressão com 80 mg/kg de 5-fluorouracil (5- FU) ou 100 a 200 mg/kg de ciclofosfamida (CY) ou 12 mg/kg de taxotere (TX) injetado i.v. no dia 0. Os ratinhos foram sacrificados no dia 5 por punção cardíaca. Foram colhidos sangue e baços e foram preparadas suspensões de células e os eritrócitos foram lisados em tampão ACK buffer (155 mM NH4CI, 12 mM NaHC03, 0,1 mM BDTA, pH 7,3) durante 5 minutos. As células foram lavadas três vezes em PBS, pH 7,4 e ressuspensas em meio de cultura tecidual. As células foram então incubadas durante 45 minutos em gelo com marcadores de superfície celular conjugados com isotiocianato de fluoresceina (FITC) ou ficoeritrina (PE) de acordo com a recomendação do fabricante (Gibco/BRL, Cedarlane, Boehringer Mannheim) . As células foram então lavadas em PBS, fixadas com 1% paraformaldeido e analisado com um citómetro de fluxo Coulter XL. A análise de subgrupos de células foi realizada por determinação de marcadores de superfície celular padrão que eram como se segue: TCR (recetor da célula T) , CD4- (T helper), CD8 (citotóxico/supressor T) , CDllb (macrófago) , NK (células NK) e Ly5 (células B). Foram obtidas células da medula óssea como descritos no exemplo 10. As células foram marcadas através de uma incubação de 45 minutos com marcador de superfície celular conjugado com FITC ou com PE de acordo com a recomendação do fabricante. As células foram então lavadas em PBS, fixadas com 1% paraformaldeido e analisadas com um citómetro de fluxo Coulter XL. A análise de subgrupos de células foi realizada por determinação de marcadores de superfície celular padrão que eram como se segue: CD34 (células progenitoras hematopoiéticas), CD41 (plaquetas, megacariócitos) , CD 13 29 (células estaminais mielomonocíticas, mielócitos, pró-monócitos) e CD38 (células estaminais dos linfócitos, pró-B, pré-B) . A tabela 8 representa o efeito de MCT na imunofenotipagem de sangue e de baço em ratinhos normais. Na imunofenotipagem do sangue, MCT aumentou os subgrupos de células CD8+ e LY5+. Em algumas experiências, MCT aumenta fracamente o subgrupo LY5- TCR- (dados não mostrados) . Na imunofenotipagem do baço, MCT aumenta significativamente a percentagem relativa de células LY5+TCR+ e CD4+. LY5- TCR-são células não B- não T- gue poderão representar os neutrófilos.
Quando administrado a ratinhos imunossuprimidos, MCT aumenta a presença relativa de células LY5- TCR-(provavelmente neutrófilos) e CD11+ (macrófagos) na imunofenotipagem de sangue e de baço em comparação com ciclofosfamida isoladamente. Estes subgrupos de células têm origem no precursor da célula mieloide (Tabela 9).
Tabela 8
Efeito de MCT n normais Subgrupos de células Imunofenotipage a imunofenol Controlo n do sangue bipagem de sangi 6,25 μΜ ie e de baço em 12,5 μΜ ratinhos 50 μΜ | CD8 + 12,76 ± 1,23 16,41 ± 1,16 p< 0,0004 - 13,18 ± 2,08 j p = 0,68 \ LY5+ Imunofenotipagei LY5-TCR- 15,57 ± 6, 91 τι do baço 13,02 ± 2,54 24,0 ± 4,92 p < 0,037 16,84 ± 0,83 p < 0,0257 26,75 ± 4,11 { p < 0,01 \ CD4 + 19,9 ± 1,09 22,25 ± 1,64 p < 0,013 - 22 ± 0,47 p < 1 0,091 | 30
Tabela 9
Efeito de MCT na imunofenotipagem de sangue e de baço em ratinhos imunossuprimidos com ciclofosfamida (CY, 200 mg/kg)
Subgrupos de células ; CY Imunofenotipagem do sangue LY5-TCR- 6,25 μΜ 12,5 μΜ 50 μΜ 36,82 ± 9, 93 51,67 ± 11,10 p ^ 0,05 46,32 ± 5, 63 p = 0,1254 CD11 + 26,41 ± 4,54 42,12 ± 8,77 p < 0,0119 42,56 ± 8, 62 p < 0,0098 i 20,2 ± ii 23, 92 ± 1,61 p < 0,07 | | 4,05 ) (fraco) i 16, 31 ±:i 27,47 ± 11,48 p < 0,06 ! \ 4,85 5 (fraco)
Imunofenotipagem do baço LY5-TCR- CD11 +
Exemplo 19: Estudos de quimioproteção: Imunofenotipagem da medula óssea 0 efeito de MCT, caprilato de sódio, caprato de sódio na imunofenotipagem da medula óssea foi avaliado através do protocolo descrito no exemplo 18. 0 tratamento com ciclofosfamida induz um aumento significativo em todos os subgrupos estudados (CD34+, CD13+, CD41+ e CD38+). A adição de MCT ou caprilato de sódio ou caprato de sódio amplifica o número da linhagem CD13+ que são células estaminais mielomonocíticas, mielócitos e pró-monócitos. Este aumento na percentagem relativa de CD13+ é significativo em comparação com ciclofosfamida isoladamente. Os resultados demonstram claramente que MCT e outros compostos relacionados induzem um aumento significativo do número de células da medula óssea (como exemplificado nos exemplos anteriores) e além disso aumenta a percentagem relativa do percursor de células fagociticas (PMN e monócitos). Isto pode resultar numa melhor recuperação do tratamento citotóxico ou proteção contra agentes infeciosos (tabela 10) . 31
Tabela 10 iEfeito de MCT, caprilato de sódio e caprato de sódio na jimunofenotipagem da medula óssea em ratinhos imunossuprimidos com iciclofosfamida (CY, 200 mg/kg) % Células | CD34+ i CD13 + S CD41+ | CD38+ iControlo co o +1 \—1 \—1 0,8 ± 0,2 i 1,6 + 1 29,8+ i \ \ j 0,2 | 6,5 i iciclofosfamida(CY) o \—1 +1 o \—1 32 ± 0,5 i 4,2 + S 39,6+ % ; : 0,6 | 13,6 CY+MCT \ 11,2+ ! ! i'3 4,5 ± 0,5 p<0,001 ! 4,5 + ! 0,4 |42 ± 15,7 iCY + Caprilato de sódio ! 11,2+ i | 1,3 j 4,9 ± 1,2 p<0,017 i! 4,6 + | 1,3 | 36 ± 9,7 | iCY + Caprato de sódio I 9,1 ± 3,1 4,7 ± 1,7 p<0,0 6 ^ 3,7 + j 0,7 i 44,3 ± i 22,8
Exemplo 20: Estudos de quimioproteção 0 efeito de tridecanoil serinol e didecanoil serinol na indução in vivo da proliferação ou proteção das células imunitárias foi avaliado através do protocolo descrito no exemplo 11.
Como mostrado na tabela 11, o tridecanoil serinol aumenta significativamente a contagem de células do baço. Não demonstrado nenhum efeito significativo na contagem de células da medula óssea.
Tabela 11
Efeito de ciclofosfamida (CY), CY + tridecanoil serinol e CY + didecanoil serinol nas células da medula óssea e do baço :Í Medula óssea \ Baço ! # Células i (xlO6) 1 P/Controlo \ P/CY i # Células i (xlO6) \ P/Controlo | p/cy Controlo 53 ±4,8 i 113 ± i 15,5 | iCY 2 8 ± 3,4 | >0,0001 | i 29 ± 9,2 | >0,0001 ÍCY + itridecanoil i serinol 1 2 8 ±4,6 i >0,0001 |o,95 i ! 42 ± 8,4 \ >0,0001 I0,035 ÍCY + i didecanoil i 30 ±3,8 i >0,0001 jo,54 i i 36 ± 9,9 \ >0,0001 | 0,27 32
Efeito de ciclofosfamida (CY), CY + tridecanoil serinol e CY + \ didecanoil serinol nas células da medula óssea e do baço s serinol Medula óssea j Baço \ # Células (xlO6) P/Controlo j P/CY \ # ?e^ÍlaS \ P/Controlo j P/CY \ i; |j ( Xl U ) !; ζ i
Exemplo 21: Atividade antitumoral
Ratinhos fêmeas C57BL/6 de 6-8 semanas de idade foram injetados intravenosamente no dia 0 com 1 x 105 B 16F 10 células de melanoma de ATCC (fonte de cultura celular, Dr. L J. Fidler). Os animais foram então injetados i.v. com ou sem MCT (25 ymol/ratinho) no dia 7, 9, 14 e 16 e 10 mg/kg doxorubicina no dia 10 e 17. Os ratinhos foram sacrificados no dia 22. Foram registados o peso corporal e o volume do tumor. Foi obtido o volume do tumor em série através de medições do diâmetro bidimensional com compassos, utilizando a fórmula 0,4 (a x b2) em que "a" era o diâmetro maior do tumor e "b" o diâmetro menor perpendicular.
Esta experiência foi realizada para verificar se MCT não está a exacerbar ou a proteger as células cancerígenas em vez das células imunitárias. A figura 10 representa o efeito quimioprotetor e a eficácia antitumoral de MCT em combinação com uma concentração sub-terapêutica de doxorubicina no modelo melanoma B16F10. MCT induz uma fraca redução (T/C cerca de 20%) do volume do tumor tão próximo quanto a concentração sub-terapêutica de doxorubicina (T/C cerca de 25% redução) quando utilizado isoladamente. Um efeito aditivo é observado quando MCT é utilizado em combinação com doxorubicina (T/C cerca de 45 a 50%). Estes resultados indicam que é possível obter atividade terapêutica quando MCT é combinado com uma concentração sub-terapêutica de fármacos citotóxicos. 33
Exemplo 22: Atividade antitumoral 0 tumor singénico DMBA3 (DA-3, modelo carcinoma da mama) surgiu de uma lesão pré-neoplásica tratado com 7,12-dimetilbenzantraceno em ratinhos fêmeas BALB/c. Foram cultivadas células DA-3 como culturas em monocamada em balões de plásticos em RPMI-1640 contendo 0,1 mM de aminoácidos não-essenciais, 0,1 μΜ piruvato de sódio, 2 mM L-glutamina e 100 pg/mL sulfato de gentamicina. Isto foi além disso suplementado com 50 μΜ 2-mercaptoetanol e 10% soro fetal bovino. Os tumores DA-3 foram passados em série in vivo por inoculação s.c. de 5xl05 células tumorais viáveis para produzir tumores localizados nos ratinhos BALB/c com 6- a 8-semanas de idade. Os animais foram então monitorizados em série através de palpação manual relativamente à evidência de tumor. O volume do tumor em série foi obtido por medições do diâmetro bidimensionais com compassos, utilizando a fórmula 0,4 (a x b2) em que "a" era o maior diâmetro do tumor e "b" o diâmetro menor perpendicular. Os tumores eram palpáveis, em geral, 7-10 dias após a inoculação.
Foram utilizados dois regimes de tratamento para a avaliação da eficácia antitumoral e da proteção de MGT em combinação com ciclofosfamida (CY, 100 mg/kg) e taxotere (TX, 20 mg/kg) no modelo tumor DA-3. Ratinhos BABL/c foram injetados com células tumorais no dia 0. O tratamento com MCT foi realizado per os no dia 6, 7 e 8; dia 13, 14 e 15; dia 20, 21 e 23 seguido por tratamento com CY ou TX administrado i.v. como única injeção em bólus no dia 9 e 16. O peso corporal e o volume do tumor foram monitorizados do dia 4 até ao dia 23. No dia 23, todos os animais foram sacrificados. A % T/C (tratamento relativamente a controlo) foi calculado como a proporção dos volumes do tumor na data 34 final no grupo de tratamento dividido pelos respetivos volumes no grupo de controlo multiplicado por 100. Pelo critério NCI o produto é considerado eficaz se % T/C for < 40%. Esta experiência foi realizada para verificar se MCT não está a exacerbar ou a proteger as células cancerígenas em vez das células imunitárias. A figura 11 mostra que o efeito quimioprotetor e eficácia antitumoral de MCT em combinação com concentração sub-terapêutica de CY e TX no modelo carcinoma da mama DA-3. MCT induz uma fraca redução (T/C cerca de 18%) do volume do tumor em comparação com o controlo. Quando MCT é utilizado em combinação com CY ou TX, não é observado uma exacerbação do volume do tumor. No entanto, quando utilizado em combinação com CY, é observada uma resposta terapêutica (T/C = 39,4%). Estes resultados indicam que a atividade terapêutica pode ser obtida quando MCT é combinado com uma concentração sub-terapêutica de CY. Este efeito pode ser devido a um aumento global da eficiência das células imunitárias em animais tratados com MCT (figura 11 e tabela 12).
Tabela 12
Efeito de MCT no volume do tumor em combinação com uma concentração sub-terapêutica de ciclofosfamida (CY, 100 mg/kg) e taxotere (TX, 20 mg/kg) j Volume do tumor Tratados/Controlo (%) \ Controlo 58,8 ± 60,1 \ CY 27,5 ± 15,9 46,8 i TX 37,9 ± 41,5 64,5 \ CY+MCT 23,2 ± 13,1 39,4 | TX+MCT 38,8 ± 31,0 66,1 \ MCT 48,5 ± 35,2 82,5 \ 35
Exemplo 23: Atividade antitumoral A eficácia antitumoral e de quimioproteção foi avaliada através do protocolo descrito no exemplo 30, com a exceção da utilização de uma concentração terapêutica de fármacos citotóxicos (ciclofosfamida, 200 mg/kg; taxotere, 30
mg/kg). Esta experiência foi realizada para verificar se MCT não está a exacerbar ou a proteger as células cancerígenas em vez das células imunitárias. A figura 12 mostra o efeito quimioprotetor e eficácia antitumoral do MCT em combinação com concentração terapêutica de CY e TX no modelo do carcinoma da mama DA-3. MCT induz uma fraca redução do volume do tumor em comparação com o controlo. Quando MCT é utilizado com CY ou TX, não é observado exacerbação do volume tumor. Quando tratado com CY ou CY+MCT, é observado uma redução significativa do volume do tumor. Além disso, uma resposta significativa na diminuição do volume do tumor é obtida com o tratamento de MCT combinado com TX (p < 0,0327) em comparação com TX isoladamente o qual não é significativo em comparação com os ratinhos controlo (p = 0,1211) (tabela 13). Estes resultados indicam que pode ser obtida uma atividade terapêutica quando MCT é combinado com uma concentração terapêutica não-significativa de TX. Este efeito pode ser devido a um aumento global da eficiência das células imunitárias em animais tratados com MCT. 36
Tabela 13 [Efeito de MCT no volume do tumor em combinação com uma concentração terapêutica de ciclofosfamida (CY, 200 mg/kg) e taxotere (TX, 30 mg/kg) Tratamento [ T/C(%) [ P/Controlo \ P/CY [ P/TX [Controlo j [ [j [ ÍMCT [0,4299 ÍCY i 18, 8 [0,0337 CY-MCT [22,1 Í0,0022 | 0,2 92 8 [TX [64,7 [0,1211 :TX-MCT [46,7 [0,0327 1 [0,5468 Lisboa, 12 de De zembro de 2013

Claims (21)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um composto com a fórmula I RjCOO- AY- 80- em que A e B são o mesmo ou diferentes e são cada um H ou RiCO: Ri é alquilo C7 ou Cg; e Y é 0 ou NH. para utilização no transplante de medula óssea ou para utilização no tratamento de uma condição selecionada entre neutropenia, feridas e mielossupressão que surgem da quimioterapia ou radioterapia.
2. Um composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a condição é mielossupressão que surge da quimioterapia.
3. Um composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a condição é mielossupressão que surge da radioterapia.
4. Um composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a condição é neutropenia crónica. 2
5. Um composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a condição é uma neutropenia transitória.
6. Um composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a condição é neutropenia que surge de uma doença hematológica.
7. Um composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a condição é neutropenia induzida por fármacos.
8. Um composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a condição é neutropenia que surge de uma deficiência nutricional.
9. Um composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a condição é neutropenia que surge de uma infeção.
10. Um composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a condição é neutropenia que surge da radioterapia.
11. Um composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a condição é uma ferida.
12. Um composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com a reivindicação 1, para transplante de medula óssea. 3
13. Um composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com qualquer reivindicação precedente, que é triglicérido de ácido caprilico.
14. Um composto da reivindicação 1 para utilização de acordo com qualquer reivindicação precedente, que é triglicérido de ácido cáprico.
15. Uma mistura de dois compostos da reivindicação 1 para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, em que A = B = RiCO e Ri é alquilo C7 e Cg, respetivamente.
16. Uma mistura da reivindicação 15 para utilização de acordo com a reivindicação 15, em que Ri é CH3(CH2)6- e CH3(CH2)8- respetivamente.
17. Uma mistura de compostos para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, que compreende quatro isómeros geométricos de triglicéridos de ácidos gordos Cs e Cio descritos pela seguinte fórmula:
18. Um composto de qualquer das reivindicações 1 a 14 ou mistura de qualquer das reivindicações 15 a 17 para 4 utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 17, em que o sujeito da administração é submetido à administração separada ou simultânea de um fator de estimulação de colónias humano.
19. Um composto de qualquer das reivindicações 1 a 14 mistura de qualquer das reivindicações 15 a 17 para utilização de acordo com a reivindicação 18, em que o fator de estimulação de colónias é G-CSF ou GM-CSF.
20. Um composto de qualquer das reivindicações 1 a 14 ou mistura de qualquer das reivindicações 15 a 17 para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 17, em que o sujeito da administração é submetido à administração simultânea de uma citoquina humana.
21. Um composto de qualquer das reivindicações 1 a 14 ou mistura de qualquer das reivindicações 15 a 17 para utilização de acordo com a reivindicação 20, em que a citoquina é interleucina 2 ou interleucina 15. Lisboa, 12 de Dezembro de 2013
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