PT1751273E - Composto ws727713 - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO "COMPOSTO WS727713"

Campo Técnico A presente invenção refere-se a um novo composto que é útil como um medicamento ou um cosmético, a um processo para a sua produção, a uma composição farmacêutica compreendendo o mesmo e a uma sua utilização. Técnica Anterior A melanocortina (MC) é um grupo de hormonas peptidicas que são derivadas de modificações pós-traducionais por meio de clivagem enzimática da prepro-hormona. As MC incluem hormonas de estimulação dos melanócitos (MSH), tais como a-MSH, β-MSH e γ-MSH, assim como a hormona adenocorticotrópica (ACTH). Estas MC regulam diversas funções fisiológicas através de receptores MC membranares (MC-R). Cinco MC-R (MCl-R, MC2-R, MC3-R, MC4-R e MC5-R) foram clonados e caracterizados. 0 MCl-R (o primeiro verificado como receptor α-MSH) é expresso em melanócitos tegumentários e está envolvido em pigmentação de melanina epidérmica e coloração animal.

Recentemente, foi verificado que o MCl-R está envolvido na dor e inflamação e o ARNm de MCl-R é expresso em células inflamatórias, tais como neutrófilos ou células mononucleares. É provável que o MCl-R contribua para as acções inibidoras de 1 α-MSH na produção de óxido nítrico em monócitos e migração de neutrófilos. Provas mostraram que as moléculas de a-MSH reduziram a reacção inflamatória em modelos animais de respostas inflamatórias em humanos. A α-MSH reduziu inflamação que foi induzida em pele de murganho por irritantes genéricos. Igualmente, a α-MSH inibiu edema de pata de murganho induzido por carragenina. Deste modo, espera-se que os agonistas de MC1-R sejam úteis como um medicamento contra a reacção inflamatória. 0 documento US 3853836 divulga derivados peptídicos psicofarmacologicamente activos destes péptidos. A estrutura dos referidos péptidos é linear. 0 documento WO 01/55106 divulga novas aminas aromáticas e a utilização destas aminas para o tratamento de obesidade, anorexia, inflamação, distúrbios mentais e outras doenças com os receptores de melanocortina ou sistemas relacionados. O documento US 6133003 divulga a utilização de microrganismos da família Pseudonocardiaceae para produção de vanilina, em rendimentos elevados, a partir de ácido ferúlico. Os microrganismos são duas estirpes de Amycolatopsis.

Divulgação Da Invenção A presente invenção refere-se a um novo composto que é útil como um modulador dos receptores de melanocortina, a um processo para a sua produção, a uma composição farmacêutica ou cosmética compreendendo o mesmo e a uma sua utilização. 2

De um modo mais particular, a mesma refere-se a um composto agonista do receptor de melanocortina que tem um efeito de redução sobre a reacção inflamatória. A requerente desta invenção também verificou que um modulador do receptor de melanocortina, nomeadamente WS727713, tem um potente efeito anti-inflamatório. Por conseguinte, um modulador do receptor de melanocortina, nomeadamente WS727713, é útil como um ingrediente activo de um agente anti-inflamatório e útil como um agente terapêutico ou profiláctico para doenças responsivas a regulação de receptores de melanocortina, tais como lesão de isquemia/reperfusão, doenças inflamatórias cerebrais, doenças inflamatórias renais, hepatite, sepsia/choque séptico, artrite reumática (RA), artrite gotosa, artrite juvenil crónica, osteoartrite, nefrite, hipersensibilidade de contacto, doença inflamatória intestinal (IBD), doença intestinal funcional, uveite (especialmente na sindrome de Behçet e sarcoidose), vasculite, doença celíaca.

Consequentemente, um objectivo desta invenção é proporcionar um composto que tem actividades biológicas como anteriormente referidas.

Outro objectivo desta invenção é proporcionar um processo para a produção de WS727713, por intermédio de fermentação da estirpe de actinomicetos anteriormente descrita ou quaisquer seus mutantes, que são capazes da produção de WS727713 num meio de cultura.

Um objectivo adicional desta invenção é proporcionar uma composição farmacêutica contendo, como um ingrediente activo, o WS727713. 3

Ainda um objectivo adicional desta invenção é proporcionar a utilização de WS727713, para a preparação de um medicamento para tratamento e prevenção de doenças e lesões de inflamação aguda e crónica.

Deste modo, a presente invenção proporciona o seguinte: (1) Um composto WS727713 substancialmente puro, tendo as seguintes propriedades: a) Fórmula molecular : C30H44N8O8 b) Espectro de ressonância magnética nuclear de 1H: (500 MHz, DMSO-d6) δ 9,76 (1H, s, permutável), 8,76 (1H, d, J=7,5 Hz, permutável), 8,23 (1H, d, J=5 Hz, permutável), 7,76 (1H, dd, J=8,5 e 3 Hz, permutável), 7,25 - 7,17 (5H, m), 5, 71 (1H, dd, J= =10,5 e 5 Hz ), 5,08 (1H, dd, J=ll e 4 Hz, permutável) , 5, 03 (1H , m) , 4, 99 (1H, m), 4 ,92 (1H, ] m), 4,85 (1H, m), 4, 83 ( 1H , d, J=3 Hz, permutável), 4, 76 (1H, br d, J=12 Hz r permutável) f 4,12 (1H, dd, J=16,5 e 8,5 Hz), 3,65 (1H, dd, J= 16 , 5 e 3 Hz) , , 3,58 (1H, m), 3,07 (1H, dd, J=13,5 e 8,5 Hz), 2, 94 (1H, br d, J=13 Hz), 2,86 (1H, dd, J=13,5 e 6 Hz), 2, 73 - 2,68 (2 H m), 2,58 (1H , m) , 2,24 (1H , br d, J =13 Hz), (1H, br d, J=14 Hz), 1,88 (1H, m), 1,67 (1H, m), 1, , 55 0, 1, 42 - 1,36 (2H, m), 1,21 (1H, m), 1,19 (3H, d, ), 1,09 (1H, m), 0,76 (3H, d, J=6,5 Hz), 0, 75 (3H, d, J=6,5 Hz). 4 c) Espectro de ressonância magnética nuclear de 13C: (125 MHz, DMS0-d6) δ 173,8 (s), 171,7 (s), 170,4 (s), 169,8 (s), 169,1 (s), 167,6 (s), 137,2 (s), 129,2 (d) x2, 128,0 (d) x2, 126,3 (d), 60,2 (d), 53,2 (t), 51,1 (d), 50,8 (d), 49,6 (d), 47,4 (d), 47,0 (t), 44,7 (d), 41,2 (t), 36,4 (t), 35,4 (t), 33,2 (t), 23,6 (d), 23,5 (t), 23,1 (q), 21,7 (q), 21,0 (t), 15,8 (q) . (2) Uma estirpe de actinomicetos, pertencendo ao género Pseudonocardia, que tem um número de depósito FERM BP-7570. (3) Um composto tendo uma actividade moduladora de receptor de melanocortina, que é obtido através do cultivo da estirpe de actinomicetos de (2) anterior num meio de cultura e recuperação do composto a partir de um seu caldo de cultura. (4) Um processo para produção do composto WS727713 de (1) anterior que compreende o cultivo, num meio de cultura, da estirpe de actinomicetos de (2) anterior ou quaisquer seus mutantes, que são capazes da produção de WS727713 e recuperação do composto a partir de um seu caldo de cultura. (5) O processo de (4) anterior, em que a estirpe de actinomicetos é a estirpe de actinomicetos de (2) anterior. (6) Uma composição farmacêutica ou cosmética contendo o composto WS727713 de (1) anterior ou um seu sal, e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, substancialmente não tóxico. (7) Um composto de (1) anterior para utilização como um medicamento ou um cosmético. 5 (8) Um modulador do receptor de melanocortina, compreendendo um composto de (1) anterior ou um seu sal. (9) Utilização de um composto de (1) anterior ou um seu sal deste, para a preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de doença e lesão inflamatória crónica e aguda. (10) Uma composição farmacêutica para tratamento ou prevenção de lesão de isquemia/reperfusão, doenças inflamatórias cerebrais e renais, hepatite, sepsia/choque séptico, artrite reumática (RA), artrite gotosa, artrite juvenil crónica, osteoartrite, nefrite, hipersensibilidade de contacto, doença inflamatória intestinal (IBD), doença intestinal funcional, uveite (especialmente na síndrome de Behçete sarcoidose), vasculite, doença celiaca, que compreende um composto de (1) anterior ou um seu sal, e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, substancialmente não tóxico. (11) Utilização de um composto de (1) anterior ou um seu sal, para a preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de lesão de isquemia/reperfusão, doenças inflamatórias cerebrais e renais, hepatite, sepsia/choque séptico, artrite reumática (RA), artrite gotosa, artrite juvenil crónica, osteoartrite, nefrite, hipersensibilidade de contacto, doença inflamatória intestinal (IBD), doença intestinal funcional, cirrose do figado, uveite (especialmente na síndrome de Behçet e sarcoidose), vasculite, doença celíaca. 6

Breve Descrição Dos Desenhos A Figura 1 mostra um gráfico de espectro infravermelho. A Figura 2 mostra um gráfico de espectro de ressonância magnética nuclear de 1H. A Figura 3 mostra um gráfico de espectro de ressonância magnética nuclear de 13C.

Melhor Modo Para Executar A Invenção 0 composto, que tem um potente efeito de modulação sobre a actividade de receptor de melanocortina, pode ser caracterizado pelas seguintes propriedades. Os gráficos de espectro Infravermelho, espectro de ressonância magnética Nuclear de 1H e espectro de ressonância magnética Nuclear de 13C são mostrados nas Figs. 1-3. a) Fórmula molecular :C30H44N8O8 b) ESI-MS (+:m/z):645 (M+H)+ c) Espectro de infravermelho (Fig. 1): vmax (KBr): 3310,2950, 1640,1545, 1450, 1410,1370, 1350, 1300, 1245, 1160, 1125, 1095, 995 cm'1 d) Espectro de ressonância magnética Nuclear de ΧΗ (Fig. 2): 7 (500 MHz, DMSO- -d6) δ 9,76 (1H, s, permutável), 8, 76 (1H , d, J=7,5 Hz, permutável, 8,23 (1H, d, J= =5 Hz, permutável), 7, 76 (1H, dd, J: =8, 5 e 3 Hz, permutável), 7, ,25 - 7 ,17 (5H, m), 5, 71 (1H, dd, J= =10,5 e 5 Hz), 5,08 (1H, dd, J=ll e 4 Hz , permutável), 5, 03 (1H, m), 4, 99 (1H, m), 4,92 (1H, m) , 4 , 85 (1H, m), 4,83 (1H, d, J=3 Hz, permutável), 4, 76 (1H, br d, l J=12 Hz, permutável) , 4, 12 (1H, dd, J=16,5 e 8,5 Hz), 3,65 (1H, dd, J=16, 5 e 3 Hz), 3, 58 (1H, m), 3,07 (1H, dd, J=13 , 5 e 8,5 Hz), 2, 94 (1H, br d, J=13 Hz), 2,86 (1H :, dd, J=16 5,5 e 6 Hz) , 2, 73 - 2,68 (2 H , m) 1, 2,58 (1H, m) , 2, 24 (1H, br d, J '=13 Hz) , 2, 08 (1H, br d, J =14 Hz), 1,88 (1H, m), 1, 67 (1H, m), 1,55 (1H, m), 1, , 42 - - 1, 36 (2 H, m), 1,21 (1H, m) , 1,19 (3 H , d, J=7 Hz) , 1,09 (1H, m), 0,76 (3 H, d, J=6 > r 5 Hz), 0 ,75 (3 H, d, J=6,5 Hz) . e) Espectro de ressonância magnética Nuclear de 13C (Fig. 3): (125 MHz, DMS0-d6) δ 173,8 (s), 171,7 (s), 170,4 (s), 169,8 (s), 169,1 (s), 167,6 (s), 137,2 (s), 129,2 (d) x2, 128,0 (d) x2, 126,3 (d), 60,2 (d), 53,2 (t) , 51,1 (d), 50,8 (d), 49,6 (d), 47,4 (d), 47,0 (t), 44,7 (d), 41,2 (t), 36,4 (t), 35,4 (t), 33,2 (t), 23,6 (d), 23,5 (t), 23,1 (q), 21,7 (q), 21,0 (t), 15,8 (q) .

Em particular, o WS727713 tem as seguintes propriedades fisico-quimicas: Fórmula molecular: C30H44N8O8 ESI-MS(+:m/z): 645(M+H)+ HR-ESI-TOF/MS (+:m/z) calculada 645,3360(M+H)+ verificada 645,3387(M+H)+

Rotação especifica: [a] d(23 °C) 32° (c=0,5, em DMSO)

Solubilidade:

Solúvel:metanol, acetonitrilo, acetona, acetato de etilo, DMSO

Fracamente solúvel:H20 Reacção de cor

Positiva:reacção de vapor de iodo, reacção de sulfato de cério, reacção de Ehrlich, reacção de Dragendorff Negativa:reacção de Molish, reacção de ninidrina

Cromatografia de camada fina (TLC):

Fase estacionária Solvente de desenvolvimento Valor Rf 9

Espectro de infravermelho (Fig. 1): vmax (KBr):3310,2950,1640,1545, 1450,1410,1370,1350, 1300,1245, 1160,1125,1095, 995 cm-1

Espectro de ressonância magnética Nuclear de (Fig. 2): (500 MHz , DMSO -d6) δ 9,76 (1H, s, . permutável), 8, 76 (1H , d, J=7, 5 Hz, , permutável, 8,23 (1H, d, r J= =5 Hz, permutável), 7, 76 (1H, dd, J=8, 5 e 3 Hz, permutável) , 7. ,25 - 7,17 (5H, m), 5, 71 (1H, dd, J=10,5 e 5 Hz) , 5,08 (1H, dd, J=ll e 4 Hz , permutável), 5, 03 (1H, m), 4, 99 (1E [, m), 4,92 (1H, m) , 4,85 (1H, m), 4,83 (1H, d, J=3 Hz, permutável), 4 ,76 (1H, br d, í J=12 Hz, permutável), 4, 12 ( 1H, dd, J=16,5 e 8,5 Hz), ; 3,65 (1H, dd, J=16 , 5 e 3 Hz) , , 3,58 ( 1H, m), 3,07 (1H, dd, j=13 , 5 e 8,5 Hz), 2, 94 (1H , br d, J =13 Hz), 2,86 (1E [, dd, J=13 i, 5 e 6 Hz), 2, 73 - 2, 68 (2 H :, m), , 2 ,58 (1H, m) , 2, 24 (1H, br d, J '=13 Hz) , 2,08 (1H, , br d, J= 14 Hz), 1,88 ( 1H, m), 1,67 (1H, m), 1,55 (1H, m), 1, 42 - 1, 36 (2H, m), 1 ,21 (1H, m), 1,19 (3H, - d, J=7 Hz), 1,09 (1H, m), 0,76 (3H, d, J=6,5 Hz), 0, 75 (3H , d, J=6,5 Hz) .

Espectro de ressonância magnética Nuclear de 13C (Fig. 3): (125 MHz, DMSO-d6) δ 173,8 (s), 171,7 (s), 170,4 (s), 169,8 (s), 169,1 (s), 167,6 (s), 137,2 (s), 129,2 (d) x2, 128,0 (d) x2, 126,3 (d), 60,2 (d), 53,2 (t), 51,1 (d), 50,8 (d), 49,6 (d), 47,4 (d), 47,0 (t), 44,7 (d), 41,2 (t), 36,4 (t), 35,4 (t), 33,2 (t), 23,6 (d), 23,5 (t), 23,1 (q), 21,7 (q), 21,0 (t), 15,8 (q) .

Cor e condição: Cristal branco

Ponto de fusão: 272-277 °C (decomposição) 10

Características da estirpe de produção N° 727713 A estirpe N° 727713 foi isolada de uma amostra de detritos folhosos, recolhida na Prefeitura de Chiba, Japão. Para o estudo taxonómico da estirpe N° 727713, foram empregues os métodos e meios descritos por Shirling e Gottlieb (Shirling, E. B. e D. Gottlieb: Methods for characterization of Streptomyces species. Int. J. Syst. Bacteriol. 16, 313-340, 1966) e por Waksman (Waksman, S. A.:The actinomycetes Vol. 2: Classification, Identification and description of genera and species: The Williams e WilkinsCo., Baltimore, 1961). As observações foram realizadas após cultivo, durante 14 dias, a 30 °C. As observações morfológicas foram realizadas nas culturas cultivadas em ágar de ácido húmico-vitamina (Hayakawa, M. e Nonomura, H.: Humic acid-vitamin agar, a new médium for the selective isolation of soil actinomycetes. J. Ferment. Technol., 65, 501-509, 1987), utilizando um microscópio óptico e um microscópio electrónico de varrimento. A gama de temperatura para crescimento foi determinada em ágar de extracto de levedura-amido, contendo 2 g de extracto de levedura (Daigo Eiyo, Osaka, Japão), 10 g de amido solúvel e 16 g de ágar em 1000 mL de água da torneira (ajustado para pH 7,2 com NaOH a 1 N, antes de esterilizado). A utilização de carbono foi determinada em meio de Pridoham e Gottlieb (Pridoham, T.G. e D. Gottlieb: The utilization of carbon compounds by some

Actinomycetales as na acid for species determination: J. Bacteriol. 56: 107-114, 1948) com adição de extracto de levedura a 0,1%. Os nomes de cores utilizados neste estudo foram retirados de Methuen Handbook of Colour (Kornerup, A. e J. H. Wanscher: Methuen Handbook of Colour, Methuen, Londres, 1978). A preparação de células e a detecção do isómero do ácido diaminopimérico foram realizadas pelo processo de Becker et al. 11 (Becker, B., Μ. P. Lechevalier, R. E. Gordon e Η. A. Lechevalier: Rapid differentiation between Nocardia and Streptomyces by paper chromatogrâphy of whole-cell hydrolysates: Appl. Microbiol. 12, 421-423, 1964). A composição de açúcar de célula intacta foi determinada pelo método de Lechevalier e Lechevalier (Lechevalier, Μ. P. e Η. A. Lechevalier: Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic actinomycetes. Int. J. Syst. Bacteriol., 20, 435-443, 1970). A sequência de ADNr 16S foi determinada pelo método de Reichertet al., (Katrin Reichert, André Lipski, Silke Pradella, Erko Stackebrandt e Karlheinz Altendorf: Pseudonocardia asaccharolytica sp. nov. and Pseudonocardia sulfidoxydans sp. nov., two new dimethyl disulfide-degrading actinomycetes and emended description of the genus Pseudonocardia: Int. J. Syst. Bacteriol. 48, 441-449, 1998). As sequências de ADNr 16S de estirpes tipo foram obtidas da base de dados DDBJ (http: //www. ddb~j. niq. ac. ~jp) . A árvore filogenética foi construída com o programa CLUSTAL (Thompson, J.D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F. e Higgins, D. G.: The CLUSTAL X Windows interface: flexible stradesies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic Acids Res. 24: 4876-4882, 1997) .

As suas características bacteriológicas eram como se segue.

As características de cultivo em diversos meios de ágar e as características fisiológicas são mostradas na Tabelas 1 e 2, respectivamente. O crescimento de estirpe foi observado em ágar de extracto de levedura-extracto de malte, ágar de farinha de aveia e ágar de peptona-extracto de levedura-ferro, mas não em ágar de sais Inorgânicos-amido, ágar de Glicerol-asparagina e ágar de Tirosina. O micélio aéreo foi observado apenas em ágar 12 de ácido húmico-vitamina e a sua cor de massa aérea era branca. A cor da face reversa de crescimento era cor de laranja claro. Não foram produzidos pigmentos melanóides em caldo de triptona-extracto de levedura e ágar de peptona-extracto de levedura-ferro. Não foram produzidos pigmentos solúveis. A cor de massa de micélio não era sensível a pH.

Como características morfológicas, o micélio substrato desenvolveu-se bem e ramificou-se irregularmente. Foi observada a formação de segmentos de hifasdilatadas. A estirpe produziu micélio aéreo, com cadeias de esporos rectos que compreendiam mais de 10 esporos por cadeia. Os esporos tinham a forma de fuso (1,6-2,3 x 0,5-0,6 pm) . As superfícies dos mesmos eram lisas. Não foram observados grânulos escleróticos, esporângios ou fragmentos. A estirpe N° 727713 foi capaz de crescer na gama de temperaturas de 11 a 32 °C, com o óptimo de crescimento a 28 °C. Ácido Meso-Diaminopimélico, lactose e arabinose foram detectados nos hidrolisados de célula intacta desta estirpe e o tipo de parede celular era do tipo IV. A sequência parcial da estirpe N° 727713 é mostrada em SEQ ID N° 1 na listagem de sequências. Valores de semelhança do ADNr 16S entre a estirpe N° 727713 e membros do género Pseudonocardia são 91,8-97,4% e os mesmos produzem um agrupamento simples na árvore filogenética (dados não mostrados).

Com base nas caracteristicas morfológicas e quimicas e análise filogenética anteriormente descritas, considera-se que a 13 estirpe N° 727713 pertence ao género Pseudonocardia (Lechevalier, Μ. P. e Η. A. Lechevalier: Chemical composition as a criterion in the clasification of aerobic actinomycetes. Int. J. Syst. Bacteriol., 20, 435-443, 1970; Pridham, T.G., et al. :

Appl. Microbiol. 6: 54, 1958). Por conseguinte, esta estirpe foi designada como Pseudonocardia sp. N° 727713. A estirpe foi depositada no International Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, AIST Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, ibaraki-ken, 305-8566, Japão, como FERM bp-7570 (data de depósito: 25 de Abril de 2001).

Tabela 1. Características de cultivo da estirpe N° 727713.

Meios

Características de cultivo

Agar de extracto de levedura-extracto de malte (ISP-2) Ágar de farinha de aveia (ISP-3) Ágar de sais inorgânicos-amido (ISP-4) G:Bom A:Não observado R:Cor de laranja claro (5A5) S:Não detectado G:Moderado A:Não observado R:Cor de laranja claro (5A5) S:Não detectado G:Não observado 14 (continuação)

Meios Caracteristicas de cultivo Ágar de (ISP-5) glicerol-asparagina G:Não observado Ágar de peptona-extracto de G:Fraco levedura-ferro (ISP—6) A:Não observado R:Cor de laranja claro (5A5) S:Não detectado Ágar de tirosina G:Não observado

Abreviatura A:micélio aéreo, G: crescimento, S:pigmento solúvel, R:cor reversa.

Estas caracteristicas foram observadas após 14 dias de incubação a 30 °C. As descrições de cor são baseadas em

MethuenHandbookofColour (Kornerup, A. e J. H. Wanscher, 3a ed., p. 252, Methuen, Londres, 1978). 15

Tabela 2. Características fisiológicas da estirpe N° 727713,

Condiçoes Características Gama de temperaturas para crescimento 11-32 °C Temperatura óptima para crescimento 28 °C Produção de pigmentos melanóides - Produção de pigmentos solúveis Utilização de carbono — D-Glucose + Sacarose + D-Xilose + D-Frutose + L-Ramnose + Rafinose + L-Arabinose + Inositol + D-Manitol +

Deve ser compreendido que a produção do WS727713 não está limitada à utilização do particular organismo aqui descrito, que é proporcionado apenas para fins ilustrativos. Esta invenção também inclui a utilização de quaisquer mutantes que sejam capazes de produzirem o WS727713, incluindo mutantes naturais, assim como mutantes artificiais, que podem ser produzidos a partir do organismo descrito por meios convencionais, tais como tecnologia de ADN recombinante, irradiação de raios 16 X, radiação ultravioleta, tratamento com N-metil-N'-nitro-N nitrosoguanidina, 2-aminopurina e semelhantes.

Produção do WS727713

Dos compostos que têm as propriedades anteriormente mencionadas, o WS727713 é produzido quando a estirpe que produzWS727713 pertencendo ao Pseudonocardia é cultivada num meio de cultura contendo fontes assimiláveis de carbono e azoto, sob condições aeróbias (e. g., cultura agitada, cultura submersa, etc.).

As fontes preferidas de carbono no meio de cultura são hidratos de carbono, tais como glucose, sacarose, amido, frutose ou glicerina ou semelhantes.

As fontes preferidas de azoto são amendoim em pó, extracto de levedura, extracto de carne, peptona, polipeptona, farinha de glúten, farinha de semente de algodão, soja em pó, farinha de soja, água de maceração de milho, levedura seca, gérmen de trigo, etc., assim como compostos inorgânicos e orgânicos de azoto, tais comosais de amónio (e. g., nitrato de amónio, sulfato de amónio, fosfato de amónio, etc.), ureia ou aminoácido ou semelhantes.

As fontes de carbono e azoto, embora empregues de um modo vantajoso em combinação, não necessitam de ser utilizadas na sua forma pura, em virtude de materiais menos puros, que contêm vestígios de factores de crescimento e quantidades consideráveis de nutrientes minerais, também serem adequados para utilização. 17

Quando desejado, podem ser adicionados ao meio sais minerais, tais como carbonato de sódio ou cálcio, fosfato de sódio ou potássio, cloreto de sódio ou potássio, iodeto de sódio ou potássio, sais de magnésio, sais de cobre, sais de zinco, sais de ferro ou sais de cobalto ou semelhantes.

Se necessário, especialmente quando o meio de cultura forma muita espuma, pode ser adicionado um agente de despumação, tal como parafina liquida, óleo gordo, óleo vegetal, óleo mineral, silicone ou semelhantes. A agitação e arejamento da mistura de cultura podem ser alcançados de uma variedade de modos, tais como agitação por uma hélice ou equipamento de agitação mecânica semelhante, através da rotação ou agitação do fermentador e semelhantes. A fermentação é, habitualmente, conduzida a uma temperatura entre cerca de 10 °C e 40 °C, de um modo preferido, 20 °C a 30 °C, durante um período de cerca de 50 horas a 150 horas, que pode ser alterado, de acordo com condições e escalas de fermentação. O caldo de cultura resultante é, depois, submetido, para recuperação do WS727713, a diversos processos utilizados de modo convencional, para recuperação e purificação de substâncias biológicas activas, por exemplo, extracção por solvente, com um solvente apropriado ou uma mistura de alguns solventes, cromatografia ou recristalização a partir de um solvente apropriado ou uma sua mistura. 18 0 WS727713 pode ser na forma de um solvato que está dentro do âmbito da presente invenção. 0 solvato inclui, de um modo preferido, um hidrato e um etanolato.

Como exemplos para mostrar propriedades biológicas dos compostos do anterior, alguns dados biológicos são mostrados no seguinte.

Teste 1. Ensaio de ligação 0 tampão de ligação era composto por HEPES-KOH a 25 mM (pH 7,0), CaCl2 a 1,5 mM, MgS04 a 1 mM, NaCl a 100 mM, 1,10-fenantrolina a 1 mM, BSA a 0,2% e 1 comprimido de Inibidor Completo de TM Protease/100 mL (Boehringer-Mannheim). O ensaio de ligação foi modificado pelo método de Receptor Biology, Inc. A suspensão membranar (25 pL) , [125I]-NDP-MSH (25 pL, NEN, 3,08xl0-11 M final), tampão (50 pL) e inibidor foram incubados, durante 60 min., a 37 °C. Depois, a mistura foi filtrada sobre GF/C (pré-embebida em polietilenoimina a 0,5%) e lavada, duas vezes, com PBS frio (-). As radioactividades aprisionadas num filtro GF/C foram medidas utilizando um Top Counter (Packard), após secagem. Células Bl6 foram cultivadas em RPMI 1640, suplementado com FBS a 10% e antibióticos. Células subconfluentes foram lavadas, duas vezes, com PBS frio (-) e raspadas. As células foram, depois, sonicadas e centrifugadas a 2000 rpm, a 4 °C, durante 5 min. o sobrenadante deste modo obtido foi centrifugado a 30000 rpm, a 4 °C, durante 60 min. A fracção membranar foi suspendida com PBS frio (-) e armazenada a -80 °C. 19

As concentrações finais de cada proteína receptora eram como se segue:MC1-R (B16), 0,139 mg/mL; MC3-R (recombinante*), 0,0693 mg/mL; MC4-R (recombinante*), 0,104 mg/mL; e MC5-R (recombinante*), 0,070 mg/mL (*: a partir de Receptor Biology, Inc.).

Como mostrado na Tabela 3, WS727713 inibiu a ligação de [125I]-NDP-MSH a receptores de melanocortina. O resultado mostra que WS727713 irá funcionar como um agonista ou um antagonista para receptores de melanocortina.

Tabela 3. Efeitos de WS727713 e NDP-MSH na ligação de [125I]-NDP-MSH a receptores de melanocortina IC50 (M) MCl-R MC3-R MC4-R MC5-R NDP-MSH 4,05xl0“u 8,15xl0~n 2, 64xlO~10 5,58xlO~10 WS727713 1,21xl0-7 4, ΙβχΙΟ-6 l,81xl0“6 2,50xl0“6

Teste 2. Redução dependente de dose daprodução de TNF-ot induzida por LPS em murganhos por WS727713 O factor de necrose tumoral (TNF-α) está subjacente a processos patológicos e distúrbios funcionais em doença e lesão inflamatória aguda e crónica. O péptido neuroimunomodulador α-MSH modula a acção e produção de citocinas proinflamatórias, incluindo TNF-α. De modo a testar para WS727713, murganhos macho (ICR) foram injectados intraperitonealmente, quer com lipopolissacárido (LPS; Sigma, L-3129, E. coli 0127: B8, 100 pg/cabeça) em solução salina, ou 20 apenas solução salina, em duas experiências repetidas. 0 WS727713 foi injectado intraperitonealmente, 30 min. antes da injecção de LPS. Os murganhos foram sacrificados 60 min. após injecção de LPS. Os níveis séricos de TNF-α foram medidos utilizando o ensaio de imunoabsorção enzimática (kit ELISA de TNF-α; Amersham). O resultado é mostrado na Tabela 4.

Como mostrado na Tabela 4, o nível de TNF-α induzido por LPS foi reduzido pela administração de WS727713, num modo dependente de dose. O resultado mostra que WS727713 tem a função como um agonista de receptor de melanocortina.

Tabela 4. Efeito de WS727713 sobre a produção de TNF-α induzida por LPS em murganhos Nível sérico de TNF-a (pg/mL) Inibição (%) Controlo de Veículo (0,5% MC/solução salina) 853311602 0 WS727713 (10 mg/kg, i. p .) 36951385 56,7 WS727713 (32 mg/kg, i. p.) 2556+892 70,0 WS727713 (100 mg/kg, i. p.) 2038+973 76,1 NDP-MSH (100 pg/cabeça, i. p.) 4808+175 43, 7 NDP-MSH (100 pg/cabeça, i. v.) 2187+1120 74, 4 MC rmetilcelulose 21 0 composto substancialmente puro de WS727713 é um modulador dos receptores de melanocortina MCl-R, MC3-R, MC4-R e/ou MC5-R, em particular, tendo a actividade agonista de MCl-R. A composição farmacêutica compreendendo o composto substancialmente puro de WS727713 é útil como um agente terapêutico ou profiláctico para doenças causadas por estado inflamatório. Adicionalmente, é útil tratar inflamação, particularmente inflamação causada pela activação de NF-κΒ e/ou libertação de citocinas inflamatórias.

Além disso, preparações farmacêuticas compreendendo o composto substancialmente puro do WS727713 são úteis para a terapia e profilaxia das seguintes doenças.

Doenças associadas a inflamação crónica e aguda, tais como doença inflamatória intestinal, sindrome de intestino irritável, doença celíaca, doença de vesícula biliar, doença de Crohn, colite ulcerativa, artrite reumatóide, artrite gotosa, osteoartrite, artrite traumática, artrite de rubéola, degenerescência muscular, pancreatite (aguda ou crónica), psoríase, urticária, tiroidite crónica, dermatite (de contacto ou atópica), dermatomiosite, eczemas atópicos, sepsia. Distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central, tais como encefalite de HIV, malária cerebral, meningite. Infecção activa de hepatite crónica ou hepatite aguda (incluindo hepatite A, hepatite B e hepatite C) . Doenças do sistema cardiovascular, tais como doença vascular inflamatória, restenose, acidente vascular cerebral, ataque isquémico transiente, isquemia do miocárdio e enfarte do miocárdio. Acidente vascular cerebral e outras doenças cerebrais isquémicas. Queimadura solar. 22

Uveíte, especialmente na síndrome de Behçet e sarcoidose, vasculite e infecções microbianas. A composição farmacêutica e cosmética desta invenção pode ser utilizada na forma de preparação farmacêutica, por exemplo, numa forma sólida, semi-sólida ou liquida, que contém o modulador do receptor de melanocortina, tal como o composto de WS727713, como um ingrediente activo em mistura com um veiculo ou excipiente, orgânico ou inorgânico, adequado, para administração externa, entérica ou parentérica. 0 ingrediente activo pode ser misturado, por exemplo, com os habituais veículos não tóxicos, farmaceuticamente aceitáveis, para comprimidos, peletes, cápsulas, supositórios, soluções, emulsões, suspensões, injecções, pomadas, linimentos, gotas oculares, loção, gel, creme e qualquer outra forma adequada para utilização.

Os veículos que podem ser utilizados são água, glucose, lactose, goma de acácia, gelatina , manitol , pasta de amido, trissilicato de magnésio, talco, amido de milho, queratina, sílica coloidal, amido de batata , ureia e outros veículos adequados para utilização no fabrico de preparações, numa forma sólida, semi-sólida ou líquida e, adicionalmente, podem ser utilizados agentes auxiliares, estabilizantes, de espessamento, solubilizantes e corantes e perfumes.

Para aplicação da composição a humanos, é preferido aplicar a mesma por administração intravenosa, intramuscular, tópica ou oral. Embora a dosagem da quantidade terapeuticamente eficaz do modulador do receptor de melanocortina, tal como o composto de WS727713, varie e também dependa da idade e estado de cada doente individual a ser tratado, quando um doente individual se 23 destine a ser tratado, no caso de administração intravenosa, uma dose diária de 0,001-100 mg do modulador do receptor de melanocortina, tal como o composto de WS727713, por kg de peso de humano, no caso de administração intramuscular, uma dose diária de 0,001-100 mg do modulador do receptor de melanocortina, tal como o composto de WS727713, por kg peso de humano e, no caso de administração oral, uma dose diária de 0,01-320 mg do modulador do receptor de melanocortina, tal como o composto de WS727713, por kg peso de humano é, em geral, proporcionada para tratamento.

Os exemplos seguintes são proporcionados para efeitos de ilustração da presente invenção em maior detalhe.

Exemplo 1 (1) Fermentação de Pseudonocardiasp. N° 727713 para a produção de WS727713:

Uma ansada da cultura inclinada foi inoculada dentro de 60 mL de meio de cultura de inoculação esterilizado, contendo amido solúvel a 2%, extracto de levedura a 0,8% e ágar a 0,5% (ajustado para pH 7,0, antes da esterilização) num frasco Erlenmeyer de boca larga de 225 mL. O frasco foi incubado a 30 °C, durante 7 dias, num agitador rotativo (220 rpm, curso de 5,1 cm) e, depois, inoculado (2%) dentro de 80 mL do mesmo meio esterilizado em cada de cinco frascos Erlenmeyer de boca larga de 225 mL. E os frascos foram incubados a 30 °C, durante 4 dias, num agitador rotativo (220 rpm, curso de 5,1 cm). 24 A cultura de inoculação resultante foi inoculada (2%) dentro de 20 litros de meio de produção esterilizado num fermentador de garrafa de 30 litros . 0 meio de produção era composto por glucose a 1%, amido solúvel a 1,5%, extracto de levedura a 0,5%, 1% de (3-ciclodextrina, CaC03 a 1%, Adekanol lg-109 a 0,05% (AsahiDenkaKogyo K. K., Japão) e Silicone km-70 a 0,05% (Shin-EtsuChemicalCo., Ltd., Japão), o pH sendo ajustado para pH 7,0, antes de esterilização. A fermentação foi efectuada a 28 °C, durante 5 dias, sob arejamento de 20 litros e agitação de 200 rpm. A produção do WS727713 no caldo de fermentação foi monitorizada por análise de HPLC, indicada abaixo. (condições de HPLC analítico) coluna eluente caudal temperatura detecção tempo de retenção

Mightysil RP-18 GP 150-4.6, 5 pm (5 pm, 4,6 mm IDxl50 mm L, Kanto Chemical Co., Ltd., Japão) CH3CN: H20=35 : 65 1 mL/min. temperatura ambiente UV a 210 nm 9,3 min. (2) Isolamento de WS727713:

Após a conclusão da cultura, o caldo de cultura (16 litros) foi extraído com um volume igual de acetona por agitação, 25 durante alguns minutos, à temperatura ambiente. 0 extracto foi filtrado com auxilio de terra de diatomáceas. 0 filtrado foi concentrado in vacuo, de modo a proporcionar uma solução aquosa (15 litros). A solução foi aplicada à coluna Diaion HP20 (Mitsubishi Chemical Co., Ltd.) (800 mL) e a coluna foi lavada com acetonitrilo a 20% (4 litros). A coluna foi eluida com acetonitrilo a 40% (2,4 litros) e acetonitrilo a 60% (3,6 litros). O eluato (6,0 litros) foi diluído com água para 12 litros e passado através de uma coluna (1 litro) de Daisogel SP-120-ODS-B (15/30 pm, DAISO Co., Ltd., Japão) empacotada com água. A coluna foi eluida com acetonitrilo a 32,5%. A eluição foi monitorizada por HPLC analítico, indicado anteriormente. Fracções contendo WS727713 foram combinadas e concentradas in vacuo, de modo a proporcionar um pó. Este pó foi dissolvido numa pequena quantidade de metanol e cristalizado a partir de água. Os cristais foram filtrados e secos, de modo a proporcionarem 1,5 g de WS727713, sob a forma de agulha branca.

Aplicabilidade Industrial O novo composto da presente invenção tem uma actividade moduladora de receptor de melanocortina e é útil como um ingrediente activo de um agente anti-inflamatório e útil como um agente terapêutico ou profiláctico para doenças e lesões inflamatórias crónicas e agudas.

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <100>Fujisawa Pharmaceutical Co., Ltd. <120> Novo Composto 26 <13Ο> 09726 <150> AU2004901919 <151> 2004-04-08 < 16 0 > 1 <170> Patentln versão 3.2

< 210 > 1 <211> 1483 <212> ADN <213>Pseudonocardi asp. N° 727713 <220> <221>característica_misc <222> (469)..(470) <223>n é a, c, g ou t <220> <221>característica_misc <222> (530)..(530) <223>n é a, c, g ou t <220> <221>característica_misc <222> (836)..(836) <223>n é a, c, g ou t <220> <221>característica_misc <222> (865) . . (865) <223>n é a, c, g ou t 27 < 4 Ο Ο > 1 gcacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgagcggtaaggcctttcggggta 60 cacgagcggcgaacgggtgagtaacacgtgggtgacctgccctcagctctgggataagcc 120 tgggaaactgggtctaataccggatatgacttcacatcgcatggtgtgttgtggaaagtt 180 ttttcggctggggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggggtgatggcctaccaa 240 ggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggccacactgggactgagacacggcc 300 cagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcgcaatgggcggaagcctgacgcag 360 cgacgccgcgtgggggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcgccagggacgaaga 420 gtgattgacggtacctggataagaagcaccggccaactacgtgccagcnnccgcggtaat 480 acgtagggtgcgagcgttgtccggaattattgggcgtaaagagctcgtangcggtgtgtc 540 gcgtcgatcgtgaaaacttggggcttaactctgagcttgcggtcgatacgggcatcactt 600 gagttcggcaggggagactggaattcctggtgtagcggtgaaatgcgcagatatcaggag 660 gaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggccgatactgacgctgaggagcgaaagcgtg 720 gggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggcgctaggtgt 780 gggggccattccacggtctctgtgccgcagcaacgcattaagcgccccgcctgggnagta 840 cggccgcaaggctaaaactcaaagnaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgt 900 ggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggtttgacatgcactagacgcacat 960 agagatatgtgttcccttgtggctggtgtgcaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtg 1020 tcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaaccctcgttccatgttgccagcgg 1080 gttatgccggggactcatgggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacg 1140 tcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggccagtacagag 1200 ggctgcgagaccgtgaggtggagcgaatcccttaaagctggtctcagttcggattggggt 1260 ctgcaactcgaccccatgaagttggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggt 1320 gaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcacgaaagttggtaacacccg 1380 aagccgacggcctaacccgcttgcgggagggagtcgtcgaaggtgggactggcgattggg 1440 acgaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaaggtgcggctgta 1483

Lisboa, 25 de Fevereiro de 2011 28

Claims (3)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Composto WS727713, substancialmente puro, tendo as seguintes propriedades: a) Fórmula molecular:C30H44N8O8 b) Espectro de ressonância magnética nuclear de 1H: (500 MHz, DMSO-d6) δ 9,76 (1H, s, permutável), 8,76 (1H, d, J=7,5 Hz, permutável), 8,23 (1H, d, J=5 Hz, permutável), 7,76 (1H, dd, J=8,5 e 3 Hz, permutável), 7,25 - 7,17 (5H, m), 5,71 (1H, dd, J=10,5 e 5 Hz), 5,08 (1H, dd, J=ll e 4 Hz, permutável), 5,03 (1H, m), 4,99 (1H, m), 4,92 (1H, m), 4,85 (1H, m) , 4,83 (1H, d, J=3 Hz, permutável), 4,76 (1H, br d, J=12 Hz, permutável), 4,12 (1H, dd, J=16,5 e 8,5 Hz), 3,65 (1H, dd, J= 16,5 e 3 Hz), 3,58 ( 1H, m), 3, 07 (1H, dd, J=13 , 5 e 8, 5 Hz) , 2,94 (1H, br d, J= 13 Hz), 2, 86 (1H, dd, J=13 , 5 e 6 Hz) , 2, 73 - 2,68 ( 2H, m) , 2,58 (1H, m) , 2,24 (1H, br d, J= =13 Hz), 2,08 (1H, br d, , J=14 Hz), 1 , 88 (1H, m), 1,67 (1H, m) , 1,55 (1H, m) , 1, 42 - 1,36 (2 H, m), 1,21 (1H, m), 1,19 (3 H, d, J=7 Hz), 1, 09 (1H, m) , 0,76 (3 H , d, J=6, 5 Hz) , 0,75 ( :3H, d, J=6,5 Hz), e c) Espectro de ressonância magnética nuclear de 13C: (125 MHz, DMSO-d6): δ 173, 8 (s), 171, 7 (s), 170,4 (s), 169,8 (S), 169,1 (s), 167, 6 ( !s), 137,2 (s), 129,2 (d) x2, 128,0 (d) x2, 126,3 (d) , 60, 2 (d), 53,2 (t), 51,1 (d), 50, 8 (d), 49,6 (d), 47,4 (d) / 47, 0 (t), 44,7 (d), 41,2 (t), 36,4 1 (t), 35,4 (t), 33,2 (t), 23,6 (d), 23,5 (t), 23,1 (q), 21,7 (q), 21,0 (t), 15,8 (q).
2. 2. Estirpe de actinomicetos, pertencendo ao género Pseudonocardia, que tem um número de depósito FERM BP-7570.

   3. Composto de acordo com a reivindicação 1, que é obtido através do cultivo da estirpe de actinomicetos da Reivindicação 2 num meio de cultura e recuperação do composto a partir de um seu caldo de cultura.

   4. Processo para produção do composto WS727713 da Reivindicação 1, que compreende o cultivo, num meio de cultura, da estirpe de actinomicetos da reivindicação 2, ou quaisquer seus mutantes, que são capazes da produção de WS727713 e recuperação do composto a partir de um seu caldo de cultura.

   5. Processo da Reivindicação 4, em que a estirpe de actinomicetos é a estirpe de actinomicetos da Reivindicação 2.

   6. Composição farmacêutica contendo o composto WS727713 da Reivindicação 1 ou um seu sal e um veiculo ou excipiente farmaceuticamente aceitável, substancialmente não tóxico.

   7. Composto da Reivindicação 1 ou um seu sal, para utilização como um medicamento ou um cosmético.

   8. Modulador do receptor de melanocortina, compreendendo o composto da Reivindicação 1 ou um seu sal. 2 9. Composto da reivindicação 1 ou um seu sal, para utilização num método para tratamento ou prevenção de doença e lesão inflamatória crónica e aguda.

   10. Composto da Reivindicação 9, em que a doença inflamatória aguda e crónica é uma doença inflamatória intestinal.

   11. Composto da reivindicação 10, em que a doença inflamatória intestinal é a doença de Crohn ou colite ulcerativa.

   12. Utilização do composto da Reivindicação 1 ou um seu sal, para a preparação de um medicamento para tratamento ou prevenção de doença e lesão inflamatória crónica e aguda. Utilização da reivindicação 12, em que a doença inflamatória aguda e crónica é uma doença inflamatória intestinal. Utilização da reivindicação 13, em que a doença inflamatória intestinal é a doença de Crohr 1 ou colite ulcerativa. Lisboa, 25 de Fevereiro de 2011 3 1/3 WS727713 KBr Fig. 1

   Número de onda [cm *] degradação acumulação de contagem apodização data e hora de medição 4 cm 16 Co-seno 00/03/17 15:02 2/3 Fig. 2
3. 3/3 Fig. 3