PT1750651T - Composição para melhorar a saúde da pele, cabelo e pelo contendo flavanonas - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO
"COMPOSIÇÃO PARA MELHORAR A SAÚDE DA PELE, CABELO E PELO CONTENDO FLAVANONAS" A presente invenção refere-se a uma composição para prevenir, diminuir e/ou tratar pele e distúrbios ou danos no cabelo/pelo, tais como os afetados por reações inflamatórias, fatores ambientais, envelhecimento ou cancro. Em particular, a presente invenção refere-se à utilização de compostos de flavanonas ou dos seus derivados em composições nutricionais, cosméticas ou farmacêuticas para a melhoria das condições da pele e pelo de animais domésticos ou humanos.
Antecedentes da invenção 0 tecido epitelial mais proeminente nos seres vivos é a pele, a qual representa o maior órgão no organismo. 0 sistema de tegumento da pele, o qual compreende a epiderme, derme e o estrato córneo, correlaciona-se com o dos órgãos internos e interage concorrentemente com a vizinhança. Sendo a interface entre o ambiente e o próprio organismo, a pele é fortemente influenciada por fatores externos e também parâmetros variáveis do sistema interno do organismo. Os mecanismos reguladores da pele necessitam, assim, de estar sempre ativos para induzir alterações sistémicas necessárias para manter os eventos patológicos normais referentes à morfologia e atividades do tegumento da pele.
Uma grande quantidade de processos que asseguram o consumo adequado da afluência aumentada de substâncias energéticas e plásticas de acordo com as necessidades da pele tornam-se garantias da estabilidade morfológica e funcional das estruturas da pele. Assim, o estado do tegumento determina a realização de processos metabólicos necessários para a viabilidade e atividade de células da pele que levam à presença de peculiaridades da pele saudável, tais como função de barreia, elasticidade, propriedades de turgescência, humidade, pigmentação, etc.
Durante o tempo de vida de um ser vivo, aparecem na pele ou cabelo diferente sinais, caracteristicos do envelhecimento, com os principais sinais clínicos sendo o aparecimento de linhas finas e rugas profundas que aumentam ou são acentuadas com a idade, perda de cabelo, densidade de cabelo reduzida, brilho, cor, oleosidade, diâmetro da fibra, etc.
Estes sinais de envelhecimento são ainda promovidos pela exposição da pele e cabelo a influências exógenas, tais como, e. g., radiação UV, poluentes, radicais livres ou substâncias químicas.
Na técnica, foram propostos diversos meios para impedir os efeitos destrutivos do ambiente ou envelhecimento nas células epiteliais da pele. Por exemplo, um meio para impedir a deterioração ou envelhecimento da pele é proporcionar compostos que eliminam radicais livres. A este respeito, o documento EP 0761214 divulga desativadores de oxigénio singuleto compreendendo derivados de anilina e derivados de difurfurilamina, os quais são referidos como reduzindo o stress oxidativo para a pele.
Embora exista uma grande diversidade de compostos ativos para melhorar a saúde da pele e cabelo ou pelo, existe ainda uma necessidade na técnica de proporcionar novos compostos ativos. Em particular, um objetivo da presente invenção é proporcionar composições que podem ser utilizadas durante um longo período de tempo por humanos ou animais domésticos, e suscetível de ser proporcionada na forma de um suplemento nutricional, por exemplo, uma composição nutricional.
Sumário da invenção
Num primeiro aspeto, a presente invenção refere-se a uma composição nutricional, cosmética ou farmacêutica para administração oral a humanos ou animais domésticos, a qual contém, como composto ativo, pelo menos, um composto de flavanona que é hesperidina para utilização na prevenção e/ou tratamento de inflamação da pele.
Noutro aspeto, a invenção proporciona a utilização oral não terapêutica de, pelo menos, um composto de flavanona que é hesperidina, para melhorar a hidratação, firmeza ou elasticidade da pele. A invenção também proporciona a utilização oral não terapêutica de, pelo menos, um composto de flavanona selecionado de hesperetina e hesperetina-7-0-glucuronida para reduzir os sinais de envelhecimento da pele. A invenção também proporciona uma composição para administração oral, a qual contém, como agente ativo, pelo menos, um composto de flavanona selecionado de hesperetina e hesperetina-7-0-glucuronida, para utilização para prevenir, aliviar ou tratar distúrbios ou danos da pele produzidos por uma situação de stress, tal como químico, biológico ou um stress físico, exposição a oxidantes ou carcinogénios, ou exposição a radiação UV. A composição de acordo com a presente invenção pode estar na forma de uma fórmula nutricional completa, um suplemento alimentar para ser administrado oralmente a um humano ou um animal, ou um composto para utilização farmacêutica. A administração, a um humano ou animal doméstico, de uma composição alimentar, como descrita acima, resulta numa saúde da pele melhorada, e. g., na fotoproteção, hidratação, secura, firmeza, espessura, elasticidade, oleosidade, pigmentação regular, imunidade ou saúde do cabelo e pelo, e. g., melhorando o brilho do cabelo e pelo, densidade do cabelo, cor, oleosidade, melhorando o diâmetro da fibra do cabelo, produção de sebo, brilho e prevenindo a queda de cabelo e pelo. É também descrita uma composição administrada a um humano ou um animal, para melhorar o estado antioxidante, função de barreira, para impedir ou modular o estado oxidativo, produção ou composição de sebo, ou para reduzir os sinais de envelhecimento. Esta também ajuda a reduzir os riscos de cancro ou inflamação.
Descrição detalhada da invenção
De acordo com o primeiro objetivo, a invenção proporciona uma composição nutricional, cosmética ou farmacêutica para administração oral a humanos ou animais domésticos, a qual contém, como composto ativo, pelo menos, um composto de flavanona que é hesperidina para utilização na prevenção e/ou tratamento de inflamação da pele.
Os compostos de flavanona de interesse são glicósidos naturais que podem ser encontrados principalmente em frutas do género Citrus, tais como laranja, limão, laranja amarga, toranja, por exemplo ou numa menor medida, noutros vegetais. Estes estão presentes maioritariamente na casca da fruta, mas também em grandes quantidades na polpa e, assim, também no sumo de frutos cítricos. Os compostos de acordo com a presente invenção podem ser hesperidina, por exemplo, e os seus derivados selecionados das suas formas agliconas, formas chalconas, formas glicosiladas ou formas metiladas. Também são utilizadas as suas formas sulfatadas ou glucuronidatadas, as quais são encontradas como produto de metabolismo no sangue.
Num último aspeto, os derivados podem ser obtidos através de diversos processos conhecidos na técnica, tal como tratamentos enzimáticos. Por exemplo, a glicose-7-hesperetina é preparada por tratamento com ramnosidase ou hesperidinase. 0 composto de flavanona ou derivados de acordo com a invenção, podem ser incluídos em qualquer composição adequada para administrar a substância a um indivíduo, em particular, uma composição alimentar, uma composição cosmética ou uma composição farmacêutica.
Numa forma de realização preferida, é preparada uma composição alimentar para consumo humano. Esta composição pode ser uma fórmula completa nutricional, um produto lácteo, uma bebida gelada ou estável em armazenamento, sopa, um suplemento alimentar, um substituto de refeição e uma barra nutricional ou um produto de confeitaria. A composição pode ser selecionada do grupo consistindo de leite, ou produtos lácteos fermentados, tais como, e. g., iogurte, coalhada, queijo, produtos fermentados à base de leite, gelados, pós à base de leite, fórmulas infantis, produtos de cereais e produtos à base de cereais fermentados, bebidas, água mineral, chocolate ou alimentos para animais de estimação contendo, pelo menos, um composto de flavanona ou um dos seus derivados. 0 suplemento nutricional para administração oral pode estar em cápsulas, cápsulas moles, comprimidos, pastas ou pastilhas, gomas, ou soluções ou emulsões passíveis de serem bebidas. Os métodos para prepará-las são do conhecimento comum.
Como descrito acima, os compostos de flavanonas são encontrados naturalmente em frutos cítricos, em particular, em laranjas, limões e toranja, na sua casca ou polpa. Por conseguinte, num primeiro aspeto, a composição nutricional pode estar na forma de um sumo de tais frutos ou na forma de um concentrado. Assim, a composição nutricional pode estar na forma de qualquer produto alimentar, em particular, qualquer bebida, sumo de citrinos ou qualquer outro extrato da casca ou polpa de frutos cítricos.
Noutra forma de realização, um produto alimentar normal pode ser enriquecido com as flavanonas, de um modo preferido, na forma de extrato cítrico. Por exemplo, um leite fermentado, um iogurte, um queijo fresco, um leite coalhado, um barra de produto de confeitaria, flocos ou barras de cereais para o pequeno-almoço, bebidas, leites em pó, produtos à base de soja, produtos fermentados não lácteos ou suplementos nutricionais para nutrição clínica. Em particular, um processo para preparar um extrato enriquecido em flavanonas, em particular hesperidina, de laranja e limão é descrito nos documentos US N° 2400693 e US 2442110, respetivamente.
De acordo com um aspeto adicional, os compostos de flavanonas a ser incluídos na descrição podem ser produzidos sinteticamente.
Uma composição nutricional de acordo com a presente invenção pode compreender os compostos de flavanona, os seus derivados ou as suas misturas numa quantidade adaptada para uma administração oral diária, e de desde cerca de 0,01 mg a 1 g, de um modo preferido, desde cerca de 0,1 mg a 800 mg, de um modo mais preferido, desde 10 mg a 800 mg do equivalente de aglicona do composto de flavanona.
As flavanonas de acordo com a invenção podem ser utilizadas isoladamente ou em associação com outros compostos ativos, tais como vitamina C, vitamina E (tocoferóis e tocotrienóis), carotenoides (carotenos, licopeno, luteína, zeaxantina, beta-criptoxantina, etc.) ubiquinonas (e. g., CoQlO), catequinas (e. g., epigalocatequina gaiato), extratos de café contendo polifenóis e/ou diterpenos (e. g., caveol e cafestol), extratos de chicória, extratos de ginkgo biloba, extratos de uva ou de semente de uva ricos em proantocianidinas, extratos de especiarias (e. g., alecrim), extratos de soja contendo isoflavonas e fitoestrogénios relacionados e outras fontes de flavonoides com atividade antioxidante, ácidos gordos, e. g., ácidos gordos n-3, fibras prebióticas, microrganismos probióticos, taurina, resveratrol, aminoácidos, selénio e precursores de glutationa, por exemplo.
Noutra forma de realização, uma composição farmacêutica pode ser administrada para tratamentos profiláticos e/ou terapêuticos. Em aplicações terapêuticas, as composições são administradas a um doente que já sofre de uma doença, como aqui descrito abaixo, numa quantidade suficiente para curar ou, pelo menos, parar parcialmente os sintomas da doença e as suas complicações. Uma quantidade adequada para realizar isto é definida como "uma dose terapeuticamente eficaz". As quantidades eficazes para esta irão depender da gravidade da doença e do peso e estado geral do doente.
Em aplicações profiláticas, as composições de acordo com a invenção, são administradas a um doente suscetível a ou de outro modo em risco de uma doença particular. Uma tal quantidade é definida como sendo "uma dose eficaz profilática". Nesta utilização, as quantidades precisas dependem novamente do estado de saúde e peso do doente. De um modo preferido, para humanos, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção compreende uma quantidade de compostos de flavanona, dos seus derivados ou sua mistura como descrita acima, para uma administração diária, desde cerca de 0,01 mg a 500 mg. Quando administrada diariamente a animais de estimação, a composição pode compreender desde 1 mg a 500 mg do equivalente de aglicona dos compostos de flavanona.
Os compostos da invenção são, de um modo preferido, administrados com um veículo farmacêutico aceitável, a natureza do veículo difere com o modo de administração, por exemplo, vias parentérica, intravenosa, oral e tópica (incluindo oftálmica).
Será entendido que o especialista irá, com base no seu próprio conhecimento, selecionar os componentes apropriados e forma galénica para direcionar o composto ativo para a pele ou cabelo tendo em conta a via de administração, o qual pode ser por meio de injeção, aplicação tópica, administração intranasal, administração por sistemas de libertação prolongada implantados ou transdérmicos, e semelhantes. A substância em questão também pode ser formulada num produto cosmético, tais como loções, champôs, cremes, protetores solares, cremes pós-solares, bloqueador solar, cremes e/ou pomadas antienvelhecimento. Será entendido que os presentes produtos cosméticos irão conter uma mistura de diferentes ingredientes conhecidos pelo especialista, assegurando uma rápida penetração da substância em questão na pele e prevenindo a sua degradação durante o armazenamento.
Será entendido que o conceito da presente invenção pode, do mesmo modo, ser aplicado como um assistente da terapia adjuvante em medicações utilizadas presentemente. Uma vez que os compostos da presente invenção podem ser facilmente administrados em conjunto com material alimentar, podem ser aplicados alimentos clínicos especiais contendo uma quantidade elevada das substâncias em questão. Será claro que, ao ler a presente descrição em conjunto com as reivindicações em anexo, o especialista irá prever uma variedade de diferentes alternativas às formas de realização específicas aqui mencionadas.
Em princípio, os compostos selecionados de hesperetina e hesperetina-7-0-glucuronida de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para o tratamento e/ou prevenção de danos na pele que são produzidos por uma situação de stress, e. g., por meio de um stress químico, biológico ou físico, e. g., por exposição a oxidantes ou carcinogénios, ou exposição a radiação UV.
Consequentemente, as substâncias e/ou composições de acordo com a presente invenção podem ser utilizadas para tratar e ou prevenir danos da pele, em particular, danos actinicos e de envelhecimento da pele, tais como secura, queratoses actinicas, pigmentação irregular (notavelmente compreendendo sardas, lentigines, hipomelanose gutada e hiperpigmentação persistente), enrugamento (notavelmente compreendendo linhas de superfície finas e sulcos profundos), pseudocicatrizes estelares, elastose, inelasticidade, telangiectasia, lagos venosos, púrpura, comedões, hiperplasia sebácea, acrocordão, angioma de cereja, queratose seborreica, lentigo, carcinoma de células basais e carcinoma de células escamosas, queimaduras e/ou empolamento da pele, hiperplasia epidérmica, inflamação, imunossupressão, e cancro, e. g., cancros da pele não melanoma e melanoma. Estas têm também benefícios particulares no cabelo e pelo, tal como uma densidade melhorada do cabelo ou pelo, diâmetro da fibra, cor, oleosidade, brilho, produção de sebo e um auxiliar para impedir a queda de cabelo ou pelo. 0 efeito de uma suplementação alimentar em compostos de flavanonas compostos ou os seus derivados de acordo com a presente invenção, na pele de humanos ou animais domésticos, pode ser medido utilizando métodos convencionais incluindo dose eritematoso mínima (MED), colorimetria, perda de água transepidérmica, reparação de ADN (e. g., p.53), medição de interleucinas e produção de proteoglicanos, ou atividade de colagenase, função de barreira ou renovação celular.
Os exemplos seguintes ilustram a invenção em mais detalhe sem limitar a mesma a estes. Estes são precedidos por uma breve descrição das figuras.
Fig. 1: Células HaCat foram incubadas com hesperetina 10 μΜ (hp, barras vermelhas) ou hesperetina-7-O-glucuronida 10 μΜ (hp-7-O-gluc, barras amarelas) ou quantidades iguais de DMSO como um controlo (barras azuis) e tratadas com ou sem menadiona durante mais 5 h. O sobrenadante foi analisado para a atividade de lactato desidrogenase (LDH) e os resultados foram expressos relativamente a células, as quais foram Usadas com trition-XlOO antes da análise (100% da morte) .
Fig. 2: Gráfico que representa a configuração experimental do ensaio de crescimento de hesperidina.
Fig. 3: Análise histopatológica de pele de rato suplementada com hesperidina. Secções em parafina de 6 pm foram desparafinadas, coradas com hematoxilina/eosina e montadas. As imagens representativas em duas ampliações são mostradas para o grupo de controlo (A e D) e os grupos suplementados com hesperidina (0,1%: B e E, C e F a 0,5%) .
Fig. 4: Análise de PCR em tempo real de ARN total isolado de pele de rato alimentado com uma dieta de controlo (Ctrl) ou uma dieta suplementada com hesperidina (Hp a 0,1%, Hp a 0,5%) para a expressão de CDldl e interleucina 6 (IL-6). As amostras foram analisadas em 3 agrupamentos contendo 4 ratos cada e os valores Ct obtidos são mostrados para CDldl em A e IL-6 em B. Os pontos representam médias de triplicados técnicos, as barras a média total por grupo. As alterações em vezes na expressão relativa da suplementação em comparação com a dieta de controlo e relativamente a um gene de manutenção são mostradas em C. A dieta de controlo foi definida para 1 vez e é representada por uma linha grossa.
Os intervalos de confiança foram calculados utilizando ANOVA.
Exemplo 1: água mineral suplementada com flavanona
Uma água mineral é preparada adicionando hesperetina-7-glicose, numa quantidade de 0,01 mg a 200 mg por litro, estimando-se que o consumo médio é de cerca de 1 litro por dia.
Exemplo 2: Cosmético para administração oral
Uma composição na forma de uma cápsula dura tem a formulação seguinte:
A composição pode ser administrada ao indivíduo numa quantidade de 2 a 3 cápsulas diariamente.
Exemplo 3: Alimentos enlatados para animais domésticos e suplemento
Uma mistura é preparada a partir de 73% de carcaça de aves de capoeira, pulmões de porco e fígado de carne de vaca (moído), 16% de farinha de trigo, 7% de água, 2% de corantes, sabores, vitaminas e sais inorgânicos. Esta mistura é emulsionada a 12 °C e extrudida na forma de um pudim, o qual é depois cozinhado a uma temperatura de 90 °C. Este é arrefecido para 30 °C e cortado em pedaços. 45% dos pedaços são misturados com 55% de um molho preparado a partir de 98% de água, 1% de corante e 1% de goma de guar. As latas de folha-de-flandres são cheias e esterilizadas a 125 °C, durante 40 min.
Como um suplemento a ser misturado com o alimento para animais domésticos antes de servir, é proporcionado embalamento adicional na forma de saqueta com 50 mg de equivalente de hesperetina, na forma de extrato de Citrinos. Este é fornecido como um suplemento numa lata de abertura fácil, em conjunto com as indicações do alimento.
Exemplo 4: Alimento funcional
Um suplemento alimentar foi preparado misturando ou combinando fruto-oligossacárido com inulina nas proporções em peso de cerca de 70% de fruto-oligossacárido para cerca de 30% de inulina e adicionando 500 mg de equivalente de hesperetina. A mistura prebiótica resultante pode ser adicionada ou combinada com qualquer veiculo adequado, por exemplo, um leite fermentado, um iogurte, um queijo fresco, um leite coalhado, uma barra de produto de confeitaria, flocos ou barras de cereais para o pequeno-almoço, uma bebida, leite em pó, produto à base de soja, produto fermentado não lácteo ou um suplemento nutricional para nutrição clinica.
Exemplo 5
Material e Métodos
Ensaio de Citotoxicidade
Queratinócitos imortalizados humanos (HaCaT) foram incubados com hesperetina 10 μΜ, hesperetina-7-O-glucuronida 10 μΜ ou quantidades iguais de DMSO como um controlo negativo durante 16 h e 1 h, antes do desafio. As células foram depois tratadas com menadiona 100 μΜ, um xenobiótico que produz intracelularmente espécies reativas de oxigénio. As células não tratadas com menadiona foram utilizadas como um controlo positivo. Após 5 h, o sobrenadante foi analisado para a atividade da lactato desidrogenase (LDH) como uma medida para a morte celular utilizando o ensaio de citotoxicidade não radioativa CytoTox 96 (Promega, EUA).
Amostras de pele
As biopsias da pele de rato foram obtidas a partir do ensaio de crescimento de Heperidina (Fig. 2) . A pele do dorso foi excisada, uma parte foi fixa em PFA a 4% e embebida em parafina, uma parte foi criconservada e a outra parte foi imediatamente congelada em azoto líquido.
Histologia
Secções de parafina A pele de rato foi dissecada e fixa durante 4 dias, em paraformaldeido a 4% em PBS (pH 7,4) a 4 °C e embebida em parafina utilizando um aparelho de embebimento da Microsysteme Leica. Os tecidos foram lavados em PBS e solução salina (NaCl a 0,9%) e desidratados passando-os através de soluções de solução salina com concentrações de etanol crescentes: 30 min cada em 30%, 50%, 70%, 90%, 99%, 100% e mais uma hora em 100%. As amostras de tecido foram incubadas duas vezes, durante 30 min, em xileno, seguido por incubações de 2-3 h e 3 h em cera de parafina a 60 °C. Foram cortadas secções de parafina espessas de 6 ym utilizando um Micrótomo Leica. As secções foram desparafinadas 5 min em xileno e desidratadas passando-as através de uma série de soluções com concentrações decrescentes de etanol: 1 min cada em etanol a 100%, 96%, 90%, 80%, 70%, e 50%. Por fim, estas foram transferidas para água destilada e coradas.
Coloração com hematoxilina/eosina
As secções reidratadas foram coradas durante 45 s em solução de hematoxilina de Mayer, enxaguadas com a série seguinte de solução durante 1 min cada: água destilada, água da torneira, água destilada e etanol a 70%. Após corar 10 s em solução de eosina (1% (v/v) em etanol a 90%) as secções foram enxaguadas em etanol a 90% e 100%. Após duas incubações de 10 min em xileno, foram montadas lamelas com Eukit e secas ao ar durante 2 h, à temperatura ambiente.
Métodos de ARN
Indicações gerais para trabalhar com ARN
Para as experiências com ARN, foram utilizados recipientes esterilizados de plástico ou de vidro cozido (180 °C durante, pelo menos, 8 h) . Todas as superficies foram limpas com ARNase ZAP antes da utilização, incluindo as pipetas, e apenas foram utilizadas pontas resistentes a aerossol.
Equipamento
Sistema de Deteção de Sequência ABI PRISM® 7000HT, Applied Biosystems, EUA
Software de RT-PCR ABI PRISM® 7000, Applied Biosystems, EUA Ciclador de PCR, e. g., Controlador Térmico Programável PTC-100, MJ Research Inc., EUA
Bioanalisador Agilent 2100, Agilent Technologies, EUA
Leitor de Placas de Fluorescência, e. g., Spectra Fluor Plus F 129005, Tecan, EUA
Multifuge 3S, Heraeus, com baldes especiais para centrifugação MFC, Kendro Laboratory Products, Suiça
Centrífuga de Arrefecimento, e. g., Centrífuga 5417R, Eppendorf, Alemanha
Reagentes
Kit Totally RNA (Art. N° 1910), Ambion, EUA Matriz de Lise D (Art. N° 6913-100), Q BlOgene, França Nanoensaio RNA 6000 (Art. N° 5065-4475 e 5065-4476), Agilent Technologies, EUA
Ensaios sob demanda (20x stock, Applied Biosystems, EUA)
ARNase ZAP (Art. N° 9780), Ambion, EUA Água livre de nuclease (ddH20, Art. N° 9939), Ambion, EUA Água filtrada Milli-Q (0,22 μΜ, ddH20)
Etanol, GR para análise (Art. N° 02860), Fluka
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (PBS, Art. N° D8537), Sigma
β-Mercaptoetanol (Art. N° M7522), Sigma, EUA
Kit de Quantificação de ARN RiboGreen (Art. N° R-11490), Molecular Probes, EUA
Inibidor de ARNase SUPERase-In (20U/yL, Art. N° 2694), Ambion,
EUA
Transcriptase inversa ARNase H~ Superscript II (200 U/yL, Art. N° 18064-014), Invitrogen, EUA
Tampão de primeira cadeia (5x) : NaCl 250 mM, EDTA 0,1 mM, DTT 1 mM, NP-40 a 0,1% (v/v) , glicerol a 50% (v/v) , incluído com a transcriptase inversa ARNase H~ Superscript II
Ditiotreitol (DTT, 1 mM) , incluído com transcriptase inversa ARNase H" Superscript II 2 '-Desoxiadenosina-5'-trifosfato (dATP, 100 mM, Art. N° 272050), Amersham Biosciences, Inglaterra 2'-Desoxicitidina-5'-trifosfato (dCTP, 100 mM, Art. N° 272060),
Amersham Biosciences, Inglaterra 2'-Desoxiguanosina-5'-trifosfato (dGTP, 100 mM, Art. N° 272070), Amersham Biosciences, Inglaterra 2'-Desoxitimidina-5'-trifosfato (dTTP, 100 mM, Art. N° 272080),
Amersham Biosciences, Inglaterra
Hexâmero Aleatório pd(N)6 (Art. N° 27-2166-01), Amersham Biosciences, Inglaterra
Master Mix de PCR TaqMan Universal (Art. N° PN4304437), Applied Biosystems, EUA
Tab. 1: Ensaios a pedido utilizados (ID do Ensaio), incluindo nomes dos genes, símbolos de genes e sequências de referência.
Extração de ARN
As amostras de pele foram homogeneizadas com Matriz de Lise D, os ARN totais foram extraídos utilizando o Kit Totally RN A seguindo as instruções do fabricante. 0 ARN foi eluído com 40 pL de água livre de nuclease.
Quantificação de ARN A quantificação foi realizada utilizando o Kit de quantificação de ARN Ribogreen® em placas de 96 poços e um leitor de microplacas de fluorescência de acordo com o manual. As medições foram realizadas em duplicado. As amostras foram diluídas 1:680 ou 1:3400 num volume final de 100 pL tampão lxTE. As diluições de ARN ribossomal numa concentração de 1, 0,5, 0,1, 0,02, 0 pg/mL foram utilizadas como padrões. A integridade de 1 pL de ARN foi controlada utilizando NanoEnsaio RNA 6000.
Transcrição inversa
Todas as manipulações foram realizadas em gelo. Foram adicionados 2 pL de hexâmero aleatório pd(N)6 e 1 pL de dNTP (10 mM) a 2 pg de ARN em água livre de nuclease num volume final de 12 pL. Após 5 min de incubação, a 65 °C, as amostras foram colocadas imediatamente em gelo e centrifugadas rapidamente. Em seguida, foram adicionados 4 pL de 5X tampão de primeira cadeia, 2 pL de ditiotreitol, 1 pl de inibidor de ARNase e 1 pL de transcriptase inversa ARNase H- Superscript II (volume final 20 pL). A reação de transcrição inversa foi realizada num ciclador de PCR utilizando o seguinte programa de temperaturas: ativação da enzima: 10 min, a 25 °C; reação de transcrição inversa: 60 min, a 42 °C; inibição da enzima: 20 min, a 70 °C. A amostra foi depois mantida no congelador a -20 °C até utilização posterior.
Reação em cadeia de polimerase em tempo real A PCR em tempo real foi realizada de acordo com o método TaqMan® em placas de 96 poços (96WP) utilizando iniciador e sondas a pedido. A análise foi realizada em triplicado utilizando um master mix (3,5x) a qual continha 43,7 pL de master mix de PCR TaqMan® 2x Universal, 4,4 pL de iniciadores e sondas sob demanda, 21,9 pL de água livre de nuclease e 17,5 pL de ADNc (87,5 ng = 25 ng por replicado). Os triplicados de 25 pL de master mix foram carregados numa placa de reação ABI PRISM de 96 poços, coberta com uma cobertura adesiva ótica transparente e centrifugada três vezes a 2000 rpm durante 1 min ou até todas as bolhas de ar terem sido removidas. A reação de PCR foi depois realizada no Sistema de Deteção de Sequência ABI PRISM® 7000 utilizando o seguinte programa de temperaturas: ativação da enzima: 2 min, a 50 °C; desnaturação: 10 min, a 95 °C e 40 ciclos de amplificação do alvo: 15 s de emparelhamento a 95 °C e 1 min de extensão a 60 °C. A análise dos gráficos da ampliação foi realizada utilizando o software ABI PRISM® os ajustamentos de linha de base com foram realizados individualmente (116: 15-25, Cdldl: 10-20, Pena: 15-25; Gapd: 6-15), enquanto os limites foram definidos manualmente a 0,2 para todos os iniciadores. Os valores de Ct resultantes foram exportados para o Microsoft Excel para análise posterior.
Análise estatística
Os dados foram analisados por ANOVA.
Resultados e Discussão
As experiências in vitro utilizando queratinócitos imortalizados (HaCat) demonstraram que o tratamento com hesperetina (hp) e hesperetina-7-0-glucuronida (hp-7-0-gluc) reduz a morte celular sob condições de cultura normal. 0 efeito protetor de hp e hp-7-0-gluc foi ainda mais pronunciado em células desafiadas com menadiona, um xenobiótico que aumenta os níveis intracelulares de espécies reativas de oxigénio (ROS). Além disso, hp-7-0-gluc, o principal metabolito de hesperidina no sangue, parece ser mais potente em comparação com hp, a aglicona (Fig. 1) .
0 efeito protetor da hesperidina foi adicionalmente investigado num de intervenção animal utilizando ratos wistar fêmeas em crescimento. Após o desmame, os ratos foram aleatorizados em 3 grupos com 12 animais cada e suplementados com uma dieta de controlo, ou uma dieta suplementada com hesperidina utilizando duas doses diferentes (0,1% e 0,5%). Na idade de 12 semanas, os ratos foram sacrificados e o tecido de pele foi utilizado para histologia de pele e análise de ARNm (Fig. 2) . A análise histopatológica da pele revelou um número reduzida de células inflamatórias em animais alimentados com a dieta com hesperidina. As imagens representativas são mostradas na Fig. 3 (3A+D (controlo) vs. 3B+E (0,1% hesperidina) vs. 3C+F (hesperidina)). Estas observações histológicas poderiam ser confirmadas ao nível do ARNm. Os ratos alimentados com hesperidina a 0,5% mostraram niveis significativamente reduzidos de IL-6, uma citocina inflamatória (Fig. 4A+C). Além disso, os niveis de ARNm de CDldl foram significativamente diminuídos em ambos os grupos suplementados com hesperidina (Fig. 4B+C).
Estes dados demonstram claramente as propriedades citoprotetoras e anti-inflamatórias da hesperidina administrada oralmente para a pele.
Lisboa, 8 de fevereiro de 2018
Claims (1)
- REIVINDICAÇÕES Composição para administração oral, a qual contém como ingrediente ativo, pelo menos, um composto de flavanona que é hesperidina para utilização na prevenção e/ou tratamento de inflamação da pele. Composição para utilização de acordo com a reivindicação 1, na qual o composto de flavanona é extraído da polpa ou casca de frutos Cítricos, tais como laranja, limão, laranja amarga ou toranja. Composição para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 2, a qual contém ainda outros compostos ativos, tais como vitamina C, vitamina E, carotenoides, ubiquinonas, catequinas, extratos de café contendo polifenóis e/ou diterpenos, extratos de chicória, extratos de ginkgo biloba, extratos de uva ou de semente de uva ricos em proantocianidinas, extratos de especiarias, extratos de soja, outras fontes de flavonoides com atividade antioxidante, ácidos gordos, fibras prébióticas, microrganismos probióticos, taurina, resveratrol, aminoácidos, selénio ou precursores de glutationa. Composição para utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 3, a qual é leite, iogurte, coalhada, queijo, leites fermentados, produtos fermentados à base de leite, gelados, pós à base de leite, fórmulas infantis, produtos de cereais, produtos à base de cereais fermentados, água mineral, chocolate ou alimentos para animais domésticos, suplemento alimentar, comprimidos. Utilização oral não terapêutica de, pelo menos, um composto de flavanona que é hesperidina, para melhorar a hidratação, firmeza ou elasticidade da pele. Utilização oral não terapêutica de, pelo menos, um composto de flavanona selecionado de hesperetina e hesperetina-7-0-glucuronida para reduzir os sinais de envelhecimento da pele. Utilização não terapêutica de acordo com a reivindicação 6 para melhorar a hidratação, firmeza ou elasticidade da pele. Composição para administração oral, a qual contém como agente ativo, pelo menos, um composto de flavanona selecionado de hesperetina e hesperetina-7-0-glucuronida, para utilização para prevenir, aliviar ou tratar distúrbios ou danos da pele produzidos por uma situação de stress, tais como stress químico, biológico ou físico, exposição a oxidantes ou carcinogénios, ou exposição a radiação UV. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 7 ou composição para utilização de acordo com a reivindicação 8, na qual o composto de flavanona é extraído da polpa ou casca de frutos Cítricos, tais como laranja, limão, laranja amarga ou toranja. . Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 7 ou 9 ou composição para utilização de acordo com a reivindicação 8 ou 9, em que a composição é uma composição nutricional ou farmacêutica. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 7, 9 ou 10, ou composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, na qual a composição contém ainda compostos ativos, tais como vitamina C, vitamina E, carotenoides, ubiquinonas, catequinas, extratos de café contendo polifenóis e/ou diterpenos, extratos de chicória, extratos de ginkgo biloba, extratos de uva ou de semente de uva ricos em proantocianidinas, extratos de especiarias, extratos de soja, outras fontes de flavonoides com atividade antioxidante, ácidos gordos, fibras prébioticas, microrganismos probióticos, taurina, resveratrol, aminoácidos, selénio ou precursores de glutationa. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 5 a 7 ou 9 a 11 ou composição para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, na qual a composição é leite, iogurte, coalhada, queijo, leites fermentados, produtos fermentados à base de leite, gelados, pós à base de leite, fórmulas infantis, produtos de cereais, produtos à base de cereais fermentados, água mineral, chocolate ou alimentos para animais de estimação, suplemento alimentar, comprimidos. Lisboa, 8 de fevereiro de 2018
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