KR20060123336A - 피부, 모발 및 털 건강 개선용 플라바논 함유 조성물 - Google Patents
피부, 모발 및 털 건강 개선용 플라바논 함유 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은, 감염성 반응, 환경 요인, 노화 또는 암에 의해 영향을 입는 것과 같은 피부 및 모발/털 질환 또는 손상의 방지, 감소 및/또는 처리용 조성물에 관련된다. 특히, 본 발명은, 인간 또는 동물의 피부 및 털 조건 개선용 영양, 화장 또는 약학 조성물에서의 플라바논 화합물 또는 그 유도체의 용도에 관련된다.
Description
본 발명은, 감염성 반응, 환경 요인, 노화 또는 암에 의해 영향을 입는 것과 같은 피부 및 모발/털 질환 또는 손상의 방지 및 감소 및/또는 처리용 조성물에 관련된다. 특히, 본 발명은, 인간 또는 동물의 피부 또는 털 조건 개선용 영양, 화장 또는 약학 조성물에서의 플라바논 화합물 또는 그 유도체의 용도에 관련된다.
생체내 가장 뚜렷한 상피 조직은 피부로써, 이는 생물 중 가장 큰 기관을 나타낸다. 상피, 진피 및 표피 각질층을 포함하는 피부 외피 시스템은, 내부 기관의 그것들과 관련되며, 주위와 동시에 상호 작용한다. 환경과 생물 자체의 경계면으로써, 피부는 외부 인자 및 생체의 내부 시스템의 가변 인자에 의해 강하게 영향 받는다. 따라서 피부의 조절 기작은, 피부 외피 형태 및 활동 관련 정상 병리현상을 유지하는데 필요한 전신 변화를 유도하도록 항상 활성이어야 한다.
피부 필요에 따른 에너지 및 플라스틱 물질의 증가된 풍부성의 충분한 소비를 보장하는 많은 과정이, 피부 구조의 형태 및 작용 안정성의 보증 인자가 된다. 따라서, 외피의 상태는, 차단 기능, 탄성, 강도 특성, 습도, 착색 등과 같은 건강 피부 특성의 존재를 유도하는 피부 세포의 생존성 및 활성을 위한 대사적 과정의 인지를 결정한다.
생체의 생존기간 동안, 노화의 특징인 상이한 징조가 피부 또는 모발에 나타나며, 주요 임상 징조는, 나이에 따라 증가 또는 뚜렷해지는 미세 선 또는 굵은 주름의 출현, 모발 손실, 모발 밀도, 윤기, 색, 유분성, 섬유 직경 등의 감소이다.
이들 노화 징조는, 모발 및 피부가, UV 조사, 공해물질, 자유 라디칼 또는 화학 물질과 같은 외부 영향에 노출됨에 의해 더 촉진된다.
당업계에서, 환경 또는 노화의 피부 상피 세포에 대한 파괴 효과를 방지하기 위한 여러 방법이 제공되어 왔다. 일례로, 피부 열화 또는 노화를 방지하는 방법은, 자유 라디칼을 파괴하는 화합물을 제공하는 것이다. EP 0 761 214 는 이러한 면에서, 아닐린 유도체 및 디퓨르퓨릴 아민 유도체 함유 싱글릿 산소 켄쳐를 개시하며, 이는, 피부에의 산화성 스트레스를 감소시키는 것으로 보고되었다.
피부 및 모발 또는 털 건강 개선을 위한 매우 다양한 활성 화합물이 있으나, 신규한 활성 화합물의 제공이 당업계에서 여전히 필요하다. 특히, 본 발명의 목적은, 인간 또는 애완동물에 의해 장기간 사용 가능한 조성물로, 영양 보조제, 일례로 영양 조성물 형태로 제공 가능한 조성물을 제공하는 것이다.
제 1 구현에서, 본 발명은, 활성 화합물로 하나 이상의 플라바논 화합물 또는 그 유도체 또는 그 혼합물을, 피부, 모발 및/또는 털 질환의 방지, 치료 또는 경감 및 피부, 모발 및 털 건강 개선에 유효한 양으로 함유하는 인간 또는 애완동물용 영양, 화장 또는 약학 조성물에 관련된다.
다른 구현에서, 본 발명은, 피부, 모발 및/또는 털 질환의 방지 또는 치료, 따라서 인간 및 애완 동물의 피부 건강 개선을 위한 영양, 화장 또는 약학 조성물 제조중 활성 성분으로서의 하나 이상의 플라바논 화합물 또는 그 유도체 또는 그 혼합물의 용도에 관련된다.
본 발명 조성물은, 완전 영양식, 인간 또는 동물에 경구 투여되는 다이어트 보조제 또는 약학 용도의 화합물 형태일 수 있다.
상기한 음식 조성물을 인간 또는 애완동물에게 투여하면, 피부 건강의 개선, 즉, 광보호, 수화, 건조성, 단단함, 두께, 탄성, 유분성, 고른 착색, 면역성, 또는, 모발 및 털의 건강, 즉, 모발 및 털의 윤기, 모발 밀도, 색, 유분성, 모발 섬유 직경 개선, 피지 생산, 윤기 및 모발 및 털 손실의 방지를 도모한다. 또한 본 발명 조성물은, 항산화 상태, 차단 기능의 개선, 산화 상태, 피지 생산 또는 조성물의 방지 또는 조절, 또는 노화 징조의 감소를 위해 동물 또는 인간에게 투여된다. 이는 또한 암 또는 감염의 위험을 감소시킨다.
제 1 목적에서, 본 발명은, 활성 화합물로 하나 이상의 플라바논 화합물 또는 그 유도체 또는 그 혼합물을, 피부, 모발 및/또는 털 질환 또는 손상의 방지, 치료 또는 경감 및 따라서 피부, 모발 및 털 건강 개선에 유효한 양으로 포함하는 인간 또는 애완동물 경구 투여용 영양, 화장 또는 약학 조성물을 제공한다.
관심상의 플라바논 화합물은, 천연 글리코사이드로, 일례로 오렌지, 레먼, 쓴 오렌지, 그레잎프룻과 같은 시트러스 속의 과일에서 주로 발견되거나, 다른 채소에서 적은량으로도 발견된다. 이들은 과피에 대부분 존재하나, 또한 과육에도 과량 존재하고 따라서 또한 시트러스 과일 주스에서도 많이 존재한다. 본 발명의 화합물은, 일례로 이소사쿠라네틴, 나링긴, 헤스페리딘, 또는 에리오딕티올, 폰시린, 네오에리오시트린 및 그들의 아글리콘 형태, 찰콘 형태, 글리코실화 형태 또는 메틸화 형태에서 선택되는 그 유도체일 수 있다. 또한, 혈액내 대사 산물로 발견되는 이들의 황산화 또는 글루크유로니데이트화된 형태가 사용된다.
마지막 면에서, 효소 처리와 같은 당업계에 알려진 각종 방법으로 유도체를 수득 가능하다. 일례로, 글루코스-7-헤스페레틴은 람노시다제 또는 헤스피리디나제 처리로 제조한다.
본 발명의 플라바논 화합물 또는 유도체는, 개인에게 물질 투여에 적합한 임의의 조성물, 특히 식품 조성물, 화장 조성물 또는 약학 조성물 내에 포함될 수 있다.
바람직한 구현에서, 인간 소비를 위한 음식 조성물이 제조된다. 이 조성물은, 영양 완전식, 유제품, 냉각 또는 보관 안정성 음료, 수프, 다이어트 보조제, 식사 대체물, 및 영양 바 또는 사탕일 수 있다. 조성물은, 우유, 발효 유제품, 일례로 요거트, 커드, 치즈, 우유 기재 발효제품, 아이스크림, 우유 기재 분말, 이유식, 곡물 제품 및 곡물 기재 제품, 음료, 미네랄수, 쵸컬릿 또는, 적어도 플라바논 화합물 또는 그 유도체 하나를 함유하는 애완동물 식품으로 이루어지는 군에서 선택 가능하다. 경구 투여되는 영양 보조제는, 캡슐, 연질 캡슐, 정제, 페이스트 또는 파스틸, 검 또는 마실 수 있는 용액 또는 에멀젼일 수 있다. 이들의 제조 방법은 상식에 속한다.
상기한 바와 같이, 플라바논 화합물은 자연에서 시트러스 과일, 특히 오렌지, 레먼 및 그레잎프룻의 과피 또는 과육에서 발견된다. 따라서 제 1 면에서, 영양 조성물은, 그러한 과일의 주스 형태 또는 농축물 형태일 수 있다. 따라서, 영양 조성물은, 특히 임의의 음료, 시트러스 주스인 임의의 식품 제품, 또는 시트러스 과피 또는 과육의 임의의 다른 추출물의 형태일 수 있다.
다른 구현에서, 통상의 식품 제품을 바람직하게는 시트러스 추출물 형태인 플라바논으로 풍부화 가능하다. 일례로, 발효 우유, 요거트, 신선한 치즈, 레넷화 우유, 사탕 바, 아침 곡물 플레이크 또는 바, 음료, 우유 분말, 대두 기재 제품, 우유가 아닌 발효 제품 또는 임상 영양용 영양 보조제가 있다. 특히, 오렌지 및 레먼으로부터 플라바논, 특히 헤스페리딘이 풍부한 추출물을 제조하는 방법은 US N0 2,400,693 및 US 2,442,110 에 각각 공지되어있다.
추가의 면에서, 본 명세서의 플라바논 화합물은, 합성 제조된 것을 포함한다.
본 발명의 영양 조성물은, 매일 경구 투여에 적합화된 양의 플라바논 화합물, 그 유도체 또는 그 혼합물을 포함가능하며, 이는, 플라바논 화합물 아글리콘 해당물의 약 0.01mg-1g, 바람직하게는 약 0.1mg-800mg, 더 바람직하게는 10mg-800mg이다.
본 발명의 플라바논은, 단독 또는 일례로, 비타민 C, 비타민 E (토코페롤 및 토코트리에놀), 카로티노이드 (카로틴, 리코펜, 루테인, 제아잔틴, β-크립토잔틴 등), 유비퀴논 (즉 CoQ10), 카테킨 (즉 에피갈로카테킨 갈레이트), 폴리페놀 및/또는 디터펜 함유 커피 추출물 (일례로 콰헤올 및 카페스톨), 치커리 추출물, 은행 빌로바 추출물, 프로안토시아니딘이 풍부한 포도 또는 포도씨 추출물, 향료 추출물 (즉, 로스메리), 이소플라본 및 관련 식물에스트로겐 함유 대두 추출물 및 항산화활성의 플라보노이드 기타 공급원, 지방산 (예로써, n-3 지방산), 프리바이오틱 섬유, 프리바이오틱 미생물, 타우린, 레스베라트롤, 아미노산, 셀레늄 및 글루타치온 전구체와 같은 기타 활성 화합물과 조합으로 사용 가능하다.
다른 구현에서, 약학 조성물은, 예방 및/또는 치료 처리를 위해 투여 가능하다. 치료적 적용에서, 조성물은, 질환 및 그 합병증의 증상을 치료 또는 적어도 부분적으로 멈추기에 충분한 양으로, 하기한 질환으로 이미 고생하는 환자에게 투여된다. 이를 달성하기에 충분한 양은 여기에서 '치료적 유효량'으로 정의된다. 이를 위한 유효량은, 질환의 중증도 및 환자의 체중 및 일반 상태에 의존할 것이다.
예방적 적용에서, 본 발명의 조성물은, 특정 질환에 약하거나 이와 다르게 위험에 놓인 환자에게 투여된다. 그러한 양은 '예방적 유효량'으로 정의된다. 이러한 사용에서 정확한 양은, 다시금 환자의 체중 및 건강 상태에 의존한다. 바람직하게, 인간을 위한 본 발명의 약학 조성물은, 상기한 플라바논 화합물, 그 유도체 또는 그 혼합물의 양을 함유하며, 매일 투여를 위해서는, 약 0.01mg-500mg이다. 애완동물에게 매일 투여시, 조성물은 플라바논 화합물의 아글리콘 해당량을 1mg 내지 500mg 함유 가능하다.
본 발명의 화합물은, 바람직하게는 약학 허용 담체와 함께 투여되며, 담체의 종류는, 투여 방식, 일례로, 비경구, 정맥내, 경구 또는 외용 (안과 포함) 경로에 따라 가변이다.
당업자는, 그 자신의 지식을 바탕으로, 주사, 외용 적용, 비강내 투여, 임플랜트 또는 경피 서방성 시스템에 의한 투여 등에 의한 투여 경로를 고려하여, 피부 또는 모발에 활성성분을 전달하기 위한 적합한 성분 및 생약 형태를 선택할 것이다.
목적 물질은, 또한 로션, 샴푸, 크림, 선스크린, 일광 노출후 크림, 태양 차단제, 항노화 크림 및/또는 연고와 같은 화장 제품으로 제형화 가능하다. 본 발명의 화장 제품은, 목적 물질의 신속한 피부 침투 및 보관 중 그들의 분해를 방지하기 위해, 당업자에게 알려진 상이한 성분의 혼합물을 포함할 것이다.
본 발명의 개념은, 현재 사용되는 의약을 보조하는 보조 치료로도 적용될 수 있는 것으로 이해된다. 본 발명의 화합물이 식품 재료와 함께 쉽게 투여 가능하므로, 목적 물질을 높은 양으로 함유하는 특수 임상 식품을 적용 가능하다. 본 명세서 및 청구범위를 읽으면서, 당업자는 여기에 언급된 특수 구현예와 상이한 각종 대안을 도모 가능함이 명백하다.
기본적으로, 본 발명의 화합물은, 스트레스 상황으로 만들어지는 피부 손상의 치료 및/또는 방지에 사용 가능하여, 이는, 일례로, 화학, 생물 또는 물리적 스트레스, 일례로, 산화제 또는 발암제에 대한 노출, 박테리아, 바이러스, 균류, 주위 세포 및/또는 미생물로부터 유도된 지방에 대한 노출, 또는 UV 조사에 대한 노출에 의한 것이다.
결과적으로, 본 발명의 물질 및/또는 조성물은, 피부 손상의 치료 및 또는 방지에 사용 가능하며, 이는 특히, 피부의 여드름성 및 노화 손상, 일례로, 건조, 여드름성 각화증, 불균일 착색 (주로, 주근깨, 흑점증, 적상 저멜라닌증 및 지속성 과다 색소증을 포함함), 주름 (주로, 미세 표면선 및 깊은 골을 포함), 성상 가상처 (stellate pseudoscar), 탄력 섬유증, 비탄성, 모세관확장증, 정맥성 레이크, 자반, 코메돈, 피지 과형성, 유경소종양, 체리 안지오제마, 지루 각화증, 렌티고, 기저 세포 육종 및 인상 세포 육종, 피부 화상 및/또는 블리스터링, 상피 과형성, 감염, 면역 억제 및 암, 일례로, 비멜라노마 및 멜라노마 피부암이다. 이는 또한, 모발 및 털에 특히 장점을 지니며, 일례로 개선된 모발 또는 털 밀도, 섬유 직경, 색, 유분성, 광택, 피지 생산을 가지며, 모발 또는 털 손실 방지를 돕는다.
본 발명에서 인간 또는 애완 동물 피부에 대해 플라바논 화합물 또는 그 유도체를 식품에 보충하는 효과는, 최소 에리써멀 (erythemal) 투여량 (MED), 색도계, 경피성 수분 감소, DNA 보수 (예로써, p53), 인터루킨 및 프로테오글리칸 생성 또는 콜라게나제 활성, 차단 기능 또는 세포 재생의 측정을 포함하는 통상의 방법으로 측정 가능하다.
하기의 실시예는 본 발명을 제한하지 않으면서 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그 전에 도면의 간단한 설명이 제공된다.
도 1: 10μM 헤스페레틴 (hp, 붉은 막대) 또는 10μM 헤스페레틴-7-O-글루크유로니드 (hp-7-O-gluc, 노란 막대) 또는 동일한 양의 DMSO를 대조군 (파란 막대) 으로 하여 HaCat 세포를 배양하고, 추가의 5시간 동안 메나디온 존재 또는 부재하에 처리하였다. 상층액에 대해 젖산 탈수소효소 (LDH) 활성을 분석하여, 결과를 분석전에 Triton-X100으로 용해시킨 세포 (100% 사멸)에 대해 상대적으로 표시하였다.
도 2: 헤스페리딘 성장 시험의 실험 계획을 나타내는 차트
도 3: 헤스페리딘으로 보충한 래트 피부의 조직병리학적 분석. 6μm 파라핀 부분을 탈왁스하여 헤마톡실린/에오신으로 염색하여 걸어두었다. 2개 확대도의 대표적 이미지를 대조군 (A 및 D)와, 헤스페리딘 보충 군 (0.1%: B 및 E, 0.5% C 및 F)에 대해 나타내었다.
도 4: CD1d1 및 인터루킨 6 (IL-6)의 발현을 위한 대조군 다이어트 (대조군) 또는 헤스페리딘 보충 다이어트 (0.1% Hp, 0.5% Hp)를 공급한 래트 피부에서 분리한 전체 RNA의 실시간 PCT 분석. 샘플을, 각 4개의 래트를 포함한 3개의 풀에서 분석하여 수득한 Ct 값을 A에서는 CD1d1, B에서는 IL-6에 대해 나타내었다. 점들은, 기술적 3개의 평균을 나타내며, 막대는 그룹 당 총 평균이다. 대조군 다이어트 및 하우스키핑 유전자에 대한 보충의 상대적 발현의 배수 변화를 C에 나타내었다. 대조군 다이어트를 1배로 하였고, 굵은 선으로 표시한다. 확신 구간은 ANOVA를 사용하여 계산하였다.
실시예 1:
플라바논
보충
미네랄수
리터 당 0.01mg-200mg 양의 헤스페레틴-7-글루코스를 첨가하여 미네랄수를 제조하며, 이의 평균 소비량은 매일 약 1리터로 추정하였다.
실시예 2: 경구 투여용 화장품
경질 캡슐 형태의 조성물은 하기의 조성을 가진다;
| 화합물 | 캡슐당 mg |
| 헤스페리딘 (헤스페레틴 해당물) | 250 |
| 핵을 위한 부형제 | |
| 셀룰로스 미세결정질 | 70 |
| EncompressTM | 60 |
| 마그네슘 스테아레이트 | 3 |
| 실리콘 콜로이드 무수물 | 1 |
| 코팅제 | |
| 검-lac | 5 |
| 타크 | 61 |
| 슈크로스 | 250 |
| 폴리비돈 | 6 |
| 2산화티타늄 | 0.3 |
| 착색제 | 5 |
상기 조성물은 매일 2 내지 3개 캡슐의 양으로 개인에게 투여된다.
실시예 3: 애완 동물용 캔 식품 및 보조제
73%의 가금류 시체, 돼지 허파 및 소 간 (분쇄한 것), 16% 밀 분말, 7% 물, 2% 염료, 향료, 비타민 및 무기산으로 혼합물을 제조하였다. 이 혼합물을 12℃에서 에멀젼화하여, 푸딩의 형태로 압출하여 90℃의 온도에서 조리하였다. 이를 30℃로 냉각하여 덩어리로 잘라낸다. 45%의 덩어리를, 98% 물, 1% 염료 및 1% 구아르 검으로 제조한 55% 소스와 혼합한다. 주석 접시 캔에 채워 넣고 40분간 125℃에서 살균하였다.
공급 이전 애완동물 식품과 혼합되는 보조제로, 시트러스 추출물 형태의 헤스페레틴 50mg 해당량을 사쳇 형태에 추가로 포장한다. 이는 공급 안내서와 함께 캔으로부터 제거 가능하도록 부착된 보조제로 제공된다.
실시예 4: 기능성 식품
중량으로 약 70%의 프락토올리고사카라이드 및 약 30%의 이눌린의 비율로 프락토올리고사카라이드와 이눌린을 혼합 또는 블렌딩하고, 500mg의 헤스페레틴 해당량을 첨가하여 식품 보조물을 제조하였다. 결과의 프리바이오틱 혼합물은, 임의의 적절한 담체, 일례로 발효 우유, 요거트, 신선한 치즈, 레넷화된 우유, 사탕 바, 아침 곡물 플레이크 또는 바, 음료, 우유 분말, 대두 기재 제품, 우유가 아닌 발효 제품 또는 임상 영양을 위한 영양 보조제에 첨가 또는 블렌딩 가능하다.
실시예 5
물질 및 방법
조직독성 어세이
인간 비사멸화 케라티노사이트 (HaCaT)를 10μM 헤스페레틴, 10μM 헤스페레틴-7-O-글루크유로니드 또는 동일한 양의 DMSO를 음성 대조군으로 하여 16시간 동안 및 챌런지 1시간 전에 배양하였다. 이후 세포를, 세포내에서 반응성 산소종을 발생하는 생체이물질 (xenobiotic)인 메나디온 100μM 로 처리하였다. 메나디온 비처리 세포를 양성 대조군으로 사용하였다. 5시간 이후, CytoTox 96 비방사능성 조직독성 어세이 (Promega, USA)를 이용하여 세포 사멸에 대한 측정으로써의 상층액에 대해 젖산 탈수소효소 (LDH) 활성을 분석하였다.
피부 샘플
래트 피부 생체조직검사는, 헤페리딘 성장 시험으로부터 수득하였다 (도 2). 등쪽 피부를 벗겨내어 한 부분은 4% PFA로 고정하여 파라핀 함침시키고, 한 부분은 냉동 보관하고, 다른 부분은 액체 질소로 즉각 동결시켰다.
조직학
파라핀 섹션
래트 피부를 절단하여 4일간 4℃ PBS (pH 7.4) 중 4% 파라포름알데히드에서 고정시키고, Leica Microsysteme 함침 기구를 사용하여 파라핀내 함침시켰다. 조직을 PBS 및 식염수 (0.9% NaCl)로 세척하고, 에탄올 농도를 하기와 같이 증가시키면서 식염수 용액으로 통과시켜 탈수시켰다; 30%, 50%, 70%, 90%, 99%, 100% 각각에서 30분씩 및 100%에서는 추가 1시간. 조직 샘플을 자일렌에서 30분간 2회 저장후, 60℃ 파라핀 왁스내에서 2-3시간 및 3시간 저장하였다. Leica Microtome을 이용하여 6㎛ 두께의 파라핀 섹션을 잘라내었다. 섹션을 5분간 자일렌에서 탈왁스하고, 에탄올 농도를 하기와 같이 감소시키면서 일련의 용액으로 통과시켜 탈수시켰다; 100%, 96%, 90%, 80%, 70%, 및 50% 에탄올 내에서 각각 1분씩. 최종적으로, 이를 증류수에 옮겨서 염색하였다.
헤마톡실린/에오신 염색
재수화된 섹션을 Mayer 헤마톡실린 용액에서 45초간 염색하고, 하기 시리즈로 각 1분씩 세척하였다; 증류수, 수돗물, 증류수 및 70% 에탄올. 에오신 용액 (90% 에탄올 중 1% (v/v))에서 10초간 염색후, 섹션을 90% 및 100% 에탄올로 세척하였다. 자일렌 중에서 10분간 2회 저장후, Eukit으로 커버슬립을 걸어두고 2시간 동안 실온에서 공기 건조하였다.
RNA 방법
RNA 작업 일반 사항
RNA 실험을 위해, 멸균 플라스틱 또는 가열한 (적어도 18 시간 동안 180℃) 유리 용기를 사용하였다. 피펫맨을 포함한 모든 표면은 사용전 RNase ZAP으로 세척하였고, 에어로졸 저항성 팁만을 사용하였다.
설비
ABI PRISM
7000HT Sequence Detection System, Applied Biosystems, USA
ABI PRISM
7000 RT-PCR software, Applied Biosystems, USA
PCR Cycler, 즉 PTC-100 Programmable Thermal Controller, MJ Research Inc., USA
Agilent 2100 bioanalyzer, Agilent Technologies, USA
Fluorescence Plate Reader, 즉 Spectra Fluor Plus F 129005, Tecan, USA
Multifuge 3S, Heraeus (MFC centrifugation을 위한 특수 버킷과 함께), Kendro Laboratory Products, Switzerland
Cooling Centrifuge, 즉 Centrifuge 5417R, Eppendorf, Germany
시약
Totally RNA Kit (Art. No. 1910), Ambion, USA
Lysing Matrix D (Art. No. 6913-100), Q BIOgene France
RNA 6000 Nano Assay (Art. No. 5065-4475 및 5065-4476), Agilent Technologies, USA
Assays-on-demand (20x스탁, Applied Biosystems, USA)
RNase ZAP (Art. No. 9780), Ambion, USA
Nuclease 없는 물 (ddH2O, Art. No. 9939), Ambion, USA
Milli-Q 여과수 (0.22μM, ddH20)
에탄올, 분석용 GR (Art. No. 02860), Fluka
Dulbecco's 인산 완충 식염수 (PBS, Art. No. D8537), Sigma
β-머캅토에탄올 (Art. No. M7522), Sigma, USA
RiboGreen RNA Quantitation Kit (Art. No. R-11490), Molecular Probes, USA
SUPERase-In RNase Inhibitor (20U/μl, Art. No. 2694), Ambion, USA
SuperScript II RNase H- 역전사효소 (200U/μl, Art. No. 18064-014), Invitrogen, USA
First-strand buffer (5x): 250mM NaCl, 0.1mM EDTA, 1mM DTT, 0.1% (v/v) NP-40, 50% (v/v)글리세롤, SuperScript II RNase H- 역전사효소에 포함
다이티오트레이톨 (DTT, lmM), SuperScript II RNase H- 역전사효소에 포함
2'-디옥시아데노신-5'-트리포스페이트 (dATP, 100mM, Art. No. 272050), Amersham Biosciences, England
2'-디옥시시스티딘-5'-트리포스페이트 (dCTP, 100mM, Art. No. 272060), Amersham Biosciences, England
2'-디옥시구아노신-5'-트리포스페이트 (dGTP, 100mM, Art. No. 272070), Amersham Biosciences, England
2'-디옥시싸이미딘-5'-트리포스페이트 (dTTP, 100mM, Art. No. 272080), Amersham Biosciences, England
pd(N)6 Random hexamer (Art. No. 27-2166-01), Amersham Biosciences, England
TaqMan Universal PCR Master Mix (Art. No. PN4304437), Applied Biosystems, USA
표 1: 유전자 이름, 유전자 심벌 및 참조 서열을 포함한, Assays-on-demand 사용 (Assay ID)
RNA 추출
Lysing Matrix D를 이용하여 피부 샘플을 균질화하고, 전체 RNA를 제조자의 안내에 따라 Totally RNA Kit으로 추출하였다. 뉴클리아제가 없는 물 40㎕로 RNA를 용출하였다.
RNA 정량
96 웰 플레이트상에서 Ribogreen
RNA 정량 키트 및 매뉴얼에 따른 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여 정량을 실시하였다. 측정은 2 세트로 하였다 (duplicate). 샘플을 최종 부피 100 ㎕ 1xTE 완충액으로 1:680 또는 1:3400으로 희석하였다. 1, 0.5, 0.1, 0.02, 0 ㎍/ml 농도의 리보소옴 RNA 희석물을 표준으로 사용하였다. 1㎕ RNA의 완전성은 RNA 6000 Nano Assay를 사용하여 조절하였다.
역전사
모든 조작은 얼음상에서 실시하였다. 2㎕ pd(N)6 랜덤 헥사머 및 1㎕ dNTP (10mM)을 뉴클리아제가 없는 물 중의 2㎍ RNA에 가하여 최종 부피가 12 ㎕가되게 하였다. 65℃에서 5분간 인큐베이션 후, 샘플을 바로 얼음상에 놓고 신속히 원심분리하였다. 이후, 4㎕의 5x 제 1 표준 완충액, 2㎕ 다이티오트레이톨, 1㎕ RNase 억제제 및 1㎕의 역전사효소 SuperScript II RNase H-를 가하였다 (최종 부피 20㎕). 역전사 반응을 하기 온도프로그램을 이용하여 PCR 사이클러로 실시하였다; 효소 활성화: 25℃에서 10 분: 역전사 반응: 42℃에서 60분: 효소 억제: 70℃에서 20분. 이후 샘플을 -20℃ 냉동고에 추가 사용시까지 보관한다.
실시간 중합효소 연쇄 반응
실시간 PCR을, assay-on-demand 프라이머 및 프로브를 사용하여 96 웰 플레이트 (96WP)에서 TaqMan
방법으로 실시하였다. 43.7㎕ TaqMan
2x Universal PCR 매스터 혼합물, 4.4㎕ assay-on-demand 프라이머 및 프로브, 21.9㎕ 뉴클리아제 없는 물 및 17.5㎕ cDNA (87.5ng = 리플리케이트 당 25ng)을 함유한 매스터 혼합물 (3.5x)를 사용하여 분석을 3 세트로 실시하였다 (triplicate). 25㎕ 매스터 혼합물의 3 세트를 ABI PRISM 반응 플레이트의 96 웰 에 가하고, 투명 광학 접착 커버로 덮고 1분간 2000rpm에서 3회 또는, 모든 공기 거품이 제거될 때까지 원심분리하였다. 이후 PCR 반응을 ABI PRISM
7000 Sequence Detection System으로 다음 온도프로그램을 사용하여 실시하였다; 효소 활성화: 50℃에서 2 분: 변성: 95℃에서 10분 및 목적 증폭 40 사이클: 95℃에서 15초간 어닐링 및 60℃에서 1분간 신장. 증폭 플랏의 분석은 ABI PRISM
소프트웨어 사용하여 실시하였으며 베이스라인 조절은 개별적으로 실시하였고 (I16 15-25, Cd1d1: 10-20, Pcna: 15-25; Gapd: 6-15), 반면 경계값 (threshold)는 모든 프라이머에 대해 0.2로 수동으로 세팅하였다. 결과의 Ct 값을 추가의 분석을 위해 Microsoft Excel에 대입하였다.
통계적 분석
데이터는 ANOVA로 분석하였다.
결과 및 논의
비사멸화 케라티노사이트 (HaCat)를 이용한 인 비트로 실험은, 헤스페레틴 (hp) 및 헤스페레틴-7-O-글루크유로니드 (hp-7-O-gluc)의 처리가 정상 세포 배양 조건하에서 세포 사멸을 감소시킴을 나타낸다. hp 및 hp-7-O-gluc의 보호 효과는, 세포내 반응성 산소종 (ROS) 레벨을 증가시키는 이종 물질인 메나디온으로 챌 런지한 경우 더욱 현저하였다. 또한, 혈액내 헤스페리딘의 주요 대사물인 hp-7-O-gluc은 아글리콘인 hp에 비해 더욱 강력한 것으로 보인다 (도 1).
헤스페리딘의 보호 효과를, 성장하는 암컷 Wistar 래트를 사용한 동물간섭 시험에서 추가로 연구하였다. 이유후, 래트를 각 12마리씩 3개의 군으로 랜덤화시키고 대조군 다이어트 또는 2개의 상이한 투여량 (0.1% 및 0.5%)의 헤스페리딘 보조 다이어트를 공급하였다. 12주령에 래트를 희생시켜 피부 조직 및 mRNA 분석을 위해 피부 조직을 사용하였다 (도 2). 피부의 조직병리학적 분석은, 헤스페리딘 다이어트를 공급한 동물에서 감염 세포의 수가 감소함을 나타내었다. 대표적 이미지를 도 3에 나타내었다 (3A+D (대조군) 대 3B+E (0.1% 헤스페리딘) 대 3C+F (헤스페리딘)). 이들 조직학적 관찰은 mRNA 레벨에서도 확인가능하다. 0.5% 헤스페리딘을 공급한 래트는 감염성 사이토카인인 IL-6의 레벨이 상당히 감소되었다 (도 4A+C). 또한, CD1d1 mRNA 레벨은 헤스페리딘을 보충한 2 그룹 모두에서 현격하게 감소하였다 (도 4B+C).
이들 데이터는, 경구 투여한 헤스페리딘의, 피부에 대한 세포 보호성 및 항 감염성 특성을 시사하는 것이다.
Claims (16)
- 활성 성분으로 하나 이상의 플라바논 화합물 또는 그 유도체 또는 그 혼합물을, 피부, 모발 및/또는 털 질환의 방지, 경감 또는 치료에 유효한 양으로 함유하는 경구 투여용 영양, 화장 또는 약학 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 플라바논 화합물이, 이소사쿠라네틴, 나링긴, 헤스페리딘, 에리오딕티올, 폰시린, 네오에리오시트린인 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 유도체가, 플라바논의 아글리콘, 찰콘, 글리코실화 또는 메틸화 형태, 또는 혈액내 그 대사 산물인 황산화 또는 글루크유로니데이트화된 형태인 조성물.
- 제 1 항에 있어서, 유도체가, 효소처리로 수득되거나 합성적으로 제조되는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 플라바논 화합물이, 오렌지, 레먼, 쓴 오렌지, 그레잎프룻과 같은 시트러스 과일의 과육 또는 과피에서 추출되는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 비타민 C, 비타민 E, 카로티노이드, 유비퀴논, 카테킨, 폴리페놀 및/또는 디터펜 함유 커피 추출물, 치커리 추출물, 은행 빌로바 추출물, 프로안토시아니딘이 풍부한 포도 또는 포도씨 추출물, 향료 추출물, 대두 추출물, 항산화활성의 플라보노이드 기타 공급원, 지방산, 프리바이오틱 섬유, 프리바이오틱 미생물, 타우린, 레스베라트롤, 아미노산, 셀레늄 또는 글루타치온 전구체와 같은 기타 활성 화합물을 추가로 포함하는 조성물.
- 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 우유, 요거트, 커드, 치즈, 발효유, 우유 기재 발효제품, 아이스크림, 우유 기재 분말, 이유식, 곡물 제품, 발효 곡물 기재 제품, 미네랄수, 쵸컬릿 또는 애완동물 식품, 다이어트 보조제, 정제 또는 화장 제품인 조성물.
- 하나 이상의 플라바논 화합물 또는 그 유도체 또는 그 혼합물을, 피부, 모발 및/또는 털 질환 또는 손상의 방지, 경감 또는 치료를 위한 조성물 제조에서 활성 성분으로 사용하는 용도.
- 하나 이상의 플라바논 화합물 또는 그 유도체 또는 그 혼합물을, 인간 또는 애완 동물에게 투여시 피부, 모발 및/또는 털 상태의 개선을 위한 조성물 제조에서 활성 성분으로 사용하는 용도.
- 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서, 플라바논 화합물이, 이소사쿠라네틴, 나링긴, 헤스페리딘, 에리오딕티올, 폰시린, 네오에리오시트린 또는, 그 아글리콘, 찰콘, 글리코실화 또는 메틸화 형태, 또는 혈액내 그 대사 산물인 이들의 황산화 또는 글루크유로니데이트화된 형태인 용도.
- 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 플라바논 화합물이, 오렌지, 레먼, 쓴 오렌지, 그레잎프룻과 같은 시트러스 과일의 과육 또는 과피에서 추출되는 용도.
- 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이 화장, 영양 또는 약학 조성물인 용도.
- 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 플라바논 화합물, 그 유도체 또는 그 혼합물이, 플라바논 화합물 아글리콘 해당물로 0.01mg-1g, 바람직하게는 0.1mg-800mg의 양으로 존재하는 용도.
- 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 피부 질환 또는 손상이, 화학, 생물 또는 물리적 스트레스, 산화제 또는 발암제, 박테리아, 바이러스, 균류, 주위 세포 및/또는 미생물로부터 유도된 지방에 대한 노출, 또는 UV 조사에 대한 노출에 의한 것과 같은 스트레스 상황 또는 노화에 의해 발생되는 것인 용도.
- 제 8 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이, 산화성 상태, 암 위험, 감염 방지 또는 피지 생산 또는 조성물 조절 및/또는 노화의 징조를 감소시키기 위해, 피부 광보호, 수화, 건조성, 단단함, 두께, 탄성, 유분성, 차단 기능, 고른 착색, 피부 탄성의 개선을 위한 것인 용도.
- 제 8 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물이, 모발 및 털의 윤기, 모발 밀도, 색, 유분성 개선, 모발 섬유 직경, 피지 생산을 개선하고 모발 및 털 손실을 방지하기 위한 것인 용도.
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