PT1663185E - Prevenção e tratamento de perda óssea induzida por inflamação e/ou imunomediada - Google Patents

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ΡΕ1663185 1 DESCRIÇÃO "PREVENÇÃO E TRATAMENTO DE PERDA ÓSSEA INDUZIDA POR INFLAMAÇÃO E/OU IMUNOMEDIADA" A presente invenção refere-se à utilização de um inibidor da ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 ou um seu sal farma-ceuticamente aceitável para a preparação de um agente farmacêutico para a prevenção e/ou o tratamento de perda óssea e/ou de cartilagem induzida por inflamação e/ou imunomediada. A morfogénese e a remodelação óssea requerem a síntese da matriz óssea por osteoblastos e a reabsorção coordenada de osso por osteoclastos. Foi estimado que cerca de 10% da massa óssea total em seres humanos está a ser remodelada todos os anos. Os osteoblastos e osteoclastos surgem de linhagens celulares e processos de maturação distintos, isto é, os osteoblastos surgem de células esta-minais mesenquimais, ao passo que os osteoclastos diferenciam a partir de precursores hematopoiéticos monóci-to/macrófago.

Desequilíbrios entre as actividades dos osteoclastos e osteoblastos podem surgir a partir de uma ampla variedade de mudanças ou perturbações hormonais de facto-res inflamatórios e de crescimento, resultando em anoma- 2 ΡΕ1663185 lias esqueletais caracterizadas pela diminuição (osteopo-rose) ou aumento (osteopetrose) da massa óssea. De facto, em estados patológicos associados à inflamação, células "activadas" (por exemplo, leucócitos infiltrantes, fibro-blastos sinoviais e, em particular, as células T) contribuem com outras moléculas que deslocam o equilíbrio entre as actividades osteoblásticas e osteoclásticas resultando em erosão óssea debilitante e/ou osteoporose.

Uma actividade osteoclástica aumentada pode ser observada em muitas doenças osteopénicas, incluindo a osteoporose pós-menopausa, metástases ósseas líticas ou artrite reumatóide, que levam a uma reabsorção óssea aumentada e a lesão óssea debilitante. Além disso, as características das células T em tecidos periodontais doentes podem ser comparadas às da artrite reumatóide, em que a reabsorção óssea muitas vezes atribuídas ao envolvimento de células T do tipo Thl também foi demonstrada.

Foram descritos vários factores incluindo CSF1 (MCSF), IL1, TGFP, TGFa, TNFa, TNFp, IL6, vitamina 1,25-di-hidroxivitamina D3, IL11, calcitonina, PGE2, ou hormona paratiróide (PTH) que afectam a osteoclastogénese em estágios distintos de desenvolvimento. No entanto, experiências de ablação genética demonstraram que estes factores não são essenciais para o desenvolvimento de osteoclastos in vivo. 0 documento DE 2 050 072 divulga a utilização de 3 ΡΕ1663185 uma composição farmacêutica compreendendo o ácido 3-0-acetilglicirretinico no tratamento de úlcera ou inflamação .

Cooper et al., (Journal of Bone and Mineral Research 16 (6) 2001: 1037-1044) descreve duas isoenzimas de ΙΙ-β-hidroxiesteróide-desidrogenase (ΙΙ-β-HSD) que convertem a cortisona inactiva em cortisol activo (11-β-HSD1) ou o cortisol inactivo em cortisona (11-β-Η3ϋ2). Além disso, são mencionadas citocinas inflamatórias que desac-tivam a 11-β-Η3ϋ2 e induzem a ΙΙ-β-HSDl. 0 documento JP 07 291857 A divulga a utilização do ácido glicirretinico no tratamento da doença de Paget. 0 documento WO 02/076435 A descreve a utilização de inibidores de ΙΙ-β-HSDl para a promoção de perfis lipidos ateroprotectores que devem conduzir a uma ateros-clerose reduzida e taxas de doença cardíaca coronária reduzidas. O documento US 3.934.027 divulga derivados amido do ácido 18^-glicirretínico.

Devido aos enormes impactos sociais e económicos da perda óssea e debilitante ao bem estar humano e a busca em aumentar a duração da vida sem os "efeito secundários" da velhice, foi de primordial importância identificar os factores essenciais envolvidos no desenvolvimento de osteoclastos e remodelação óssea. 4 ΡΕ1663185

As moléculas essenciais foram recentemente identificadas como sendo as proteínas RANKL, RANK e OPG da super família TNF-TNFR. A molécula RANKL da família TNF (receptor activador do ligando NFkB; também conhecida como o ligando osteoprotegerina (RANKL); citocina induzida por activação relacionada ao TNF (TRANCE), factor de diferenciação de osteoclasto (ODF) e TNFSF11) e o seu receptor RANK (TNFRSF11 A) são reguladores chave da remodelação óssea e essenciais para o desenvolvimento e a activação de osteoclastos. 0 RANKL também regula as comunicações das células T/células dendríticas, a sobrevivência das célula dendríticas e a organogénese dos gânglios linfáticos.

Além disso, a produção de RANKL por células T activadas controla directamente a osteoclastogénese e a remodelação óssea e explica porque as doenças autoimunes, cancros, leucemias, asma, infecções virais crónicas e doenças periodontais resultam em perda óssea sistémica e local.

Em particular, o RANKL parece ser o princípio patogénico que provoca a destruição óssea e de cartilagem em artrite. A inibição da função do RANKL por meio do receptor chamariz natural osteoprotegerina (OPG, TNFRSF11B) evita a perda óssea em osteoporose pós-menopausa e metástases de cancro e bloqueia completamente a perda óssea e invalidez em vários modelos roedores de artrite. Intrigantemente, o RANKL e o RANK desempenham 5 ΡΕ1663185 papéis essenciais na formação de uma glândula mamária lactante na gravidez. Este sistema proporcionou um novo e inesperado paradigma que liga a morfogénese óssea, a activação das células T e a organização de tecidos linfóides e a formação de glândula mamária necessárias para a sobrevivência das espécies mamíferas. A inibição da activação de osteoclastos induzida por inflamação e/ou imunomediada pelo bloqueio da activação com pequenas moléculas pode ser o futuro tratamento de eleição para abolir a osteoporose, perda de dente ou invalidez em artrite, bem como outros processos inflamatórios associados à erosão óssea ou perda óssea. Esta última pode ser conseguida evitando a activação das células T, bem como a infiltração da medula óssea com células inflamatórias, inibindo, deste modo, a interacção por contacto entre as células T e os precursores de osteoclastos, ou os seus respectivos receptores e ligandos RANK e RANKL. A secção a seguir resume a racionalidade científica para evitar a activação de osteoclastos induzida por inflamação em doenças específicas.

Doença Periodontal:

As respostas inflamatórias e imunológicas dos hospedeiros a infecções bacterianas orais específicas podem resultar em doenças periodontais, isto é, a perio- 6 ΡΕ1663185 dontite. A periodontite humana é heterogénea em etiologia, mas uma caracteristica típica é a destruição óssea alveo-lar uma das maiores causas de perda dentária em seres humanos. Curiosamente, a periodontite humana foi recentemente envolvida nos riscos aumentados de certas doenças sistémicas, tais como nascimento prematuro com baixo peso, pneumonia bacteriana, doenças cardíacas congestivas e derrame, possivelmente devido a um traço inflamatório subjacente. Cerca de 10-12 microrganismos subgengivais foram implicados na patogénese da periodontite, incluindo Porphyromonas gingivalis, Prevotella intermédia, Bacteroi-des forsythus e espiroquetas mistas. Em particular, o Actinobacillus actinomycetemcomitans, uma bactéria Gram-negativa facultativa capnofílica, em forma de bastonete foi identificada como o agente etiológico de periodontite juvenil localizada (LJP) e de algumas formas graves e de progresso rápido de periodontite. A prevalência de LJP é de cerca de 1-4% entre adolescentes e jovens adultos e 10% entre doentes diabéticos insulino-dependentes. A LJP é caracterizada por uma avançada destruição do osso alveolar num padrão molar-incisivo que muitas vezes leva à mobilidade e perda do dente, resultando em défices funcionais e estéticos. O A. Actinomycetemcomitans é capaz de invadir o epitélio gengival e liberta vários factores de virulência, tais como citotoxinas, endotoxinas e uma potente leucotoxina. A infecção por A. Actinomycetemcomitans é geralmente acompanhada por respostas imunológicas locais e sistémicas específicas ao antigénio. Estudos iniciais demonstraram proporções de células T CD4+/CD8+ alteradas e 7 ΡΕ1663185 reacções de linfócitos autólogos mistos em doentes com LJP e a capacidade das células T auxiliares de ir para os tecidos periodontais em modelos de ratos e ratinhos de periodontite. Além disso, foi anteriormente demonstrado que uma infecção por A. actinomycetemcomitans em ratinhos NOD/SCID enxertados com leucócitos de sangue periférico humano (HuPBLs) leva a uma inflamação periodontal caracte-rizada pela infiltração de células T CD4+, células T CD8+, células B CD20+ e macrófagos Macl+ nos tecidos conjuntivos fibrosos adjacentes às bolsas periodontais. Estes resultados sugerem que as células T poderiam modular a inflamação periodontal induzida por bactéria e/ou a destruição de osso alveolar. Para investigar o mecanismo ou mecanismos precisos que regulam a imunidade periodontal e a destruição de osso alveolar, HuPBLs de doentes com LJP foram transplantados em ratinhos NOD/SCID (que não têm células T e B endógenas), gerando ratinhos HuPBLs-NOD/SCID. Este estudo demonstra que o desafio oral destes ratinhos "humanizados" com A. actinomycetemcomitans (designados Ãa-HuPBLs-NOD/SCID) leva à activação funcional das células T CD4+ humanas no periodonto e desencadeia a destruição de osso alveolar local. A estimulação in vitro das células T CD4+ destes ratinhos com antigénios de A. actinomycetemcomitans leva à expressão do ligando osteo-protegerina (OPGL, também conhecido como TRANCE, ODF e RANKL), um mediador chave da osteoclastogénese e activação de osteoclastos. A inibição da função OPG-L por meio do receptor chamariz osteoprotegerina (OPG) reduz, de forma significativa, a destruição de osso alveolar detectada em 8 ΡΕ1663185 ratinhos Aa-HuPBLs-NOD/SCID depois da inoculação bacte-riana, bem como os números de osteoclastos nos sítios de inflamação periodontal local. Estes resultados identificam pela primeira vez um papel crítico para as células T CD4+ reactivas a microrganismos orais em doença periodontal. Além disso, a indução da expressão de OPGL desencadeada por A. actinomycetemcomitans em células T e a activação de osteoclastos e a perda óssea mediada por OPGL poderia proporcionar uma explicação molecular para a destruição de osso alveolar observada em infecção periodontal local.

Foi recentemente declarado que o conceito desenvolvido acima pode ser traduzido em doença periodontal em geral, uma vez que a esta patologia é sempre acompanhada por um processo inflamatório que resulta na activação das células T. A doença periodontal é a segunda doença mais prevalente nos Estados Unidos depois da doença cardíaca. Embora afecte maias de 50 milhões de pessoas no nível moderado a grave, apenas 15-20% recebem tratamento. Actualmente, mais de 6 mil milhões de dólares são gastos anualmente para tratar a doença nos Estados Unidos. A doença periodontal aumenta a susceptibilidade do tecido e osso oral à degradação por bactéria, criando bolsas entre os dentes e gengivas, deste modo, tornando-a uma principal causa da perda de dentes. as implicações da

Se deixada sem tratamento 9 ΡΕ1663185 doença estendem-se para muito além da boca. Estudos identificaram a doença periodontal como um potencial factor de contribuição para a doença cardíaca, diabetes e prematuros com baixo peso. 0 Relatório de 2000 do Surgeon General dos Estados Unidos aumentou mais a visibilidade pública em torno da doença periodontal como uma importante questão de saúde. Os tratamentos antimicrobianos actuais não conseguem deter a destruição óssea em curso. Mais provavelmente, uma combinação com molécula pequena que evita a infiltração da medula óssea com células inflamatórias e a activação das células T será um tratamento ideal que poderia ser seguido por uma estratégia preventiva incluindo a molécula pequena que bloqueia a infiltração da medula óssea.

Artrite Reumatóide: A perda óssea representa um importante problema não resolvido em artrite reumatóide (AR). As complicações esqueletais da AR consistem em erosões ósseas focais e osteoporose periarticular em locais de inflamação activa e perda óssea generalizada com massa óssea reduzida. Novas evidências indicam que os osteoclastos são os mediadores chave de todas as formas de perda óssea em AR. O TNF-α é uma das citocinas osteoclastogénicas mais potentes produzidas na inflamação e é essencial na patogénese da AR. A produção do factor de necrose tumoral-α (TNF-a) e outras citocinas pró-inflamatórias na AR é em grande parte dependente de células T-CD4 e principalmente um resultado 10 ΡΕ1663185 da secreção de interferão-γ (IFN-γ). As células T sinoviais contribuem para a sinovite pela secreção de IFN—γ e interleucina (IL)-17 bem como pela interacção directa com macrófagos e fibroblastos através de mecanismos de contacto de célula para célula. As células T sinoviais activadas expressam tanto formas solúveis como ligadas a membrana do activador do receptor do ligando NF-kG (RANKL). No sinóvio reumatóide, os fibroblastos também proporcionam uma abundante fonte de RANKL. Além disso, o TNF-α e a IL-1 dirigem-se à células estromal-osteo-blásticas para aumentar a IL-6, a IL-11 e a proteína relacionada à produção da hormona paratiróide (PTHrP), bem como a expressão de RANKL. Apenas na presença de níveis permissíveis de RANKL, o TNF-α actua directamente para estimular a diferenciação de osteoclastos e macrófagos e células progenitoras mielóides. Além disso, o TNF-α induz a libertação de IL-1 por fibrolastos sinoviais e macrófagos e a IL-1 juntamente com o RANKL é um importante sinal de sobrevivência e activação de osteoclastos nascentes. Consequentemente, o TNF-α e a IL-1 em actuação em conjunto com o RANKL podem promover, de forma potente, o recrutamento, a activação e a osteólise de osteoclastos em AR. O suporte mais convincente para esta hipótese vem de estudos in vivo de modelos animais. A protecção óssea na presença de inflamação contínua em ratos artríticos com osteoprotegerina (OPG) suporta o conceito de que os osteoclastos mediam exclusivamente a perda óssea, proporcionando uma prova adicional que a OPG protege a integridade óssea pela regulação descendente da osteoclastogénese e promovendo a apoptose dos osteoclastos. 11 ΡΕ1663185 0 conexão entre a activação das células T, a sobreprodução de TNF-α e o sistema ligando-receptor RANKL/OPG/RANK apontam para um paradigma unificado para todo o espectro da patologia esqueletal em AR. As estratégias que tratam da reabsorção óssea osteoclástica representarão uma importante e nova faceta da terapêutica para AR.

Osteoporose na população em envelhecimento: A. Impacto de mudanças de citocina com deficiência de estrogénio sobre a osteoclastogénese Há uma progressiva perda de tecido ósseo depois da menopausa natural ou cirúrgica que leva a fracturas aumentadas dentro de 15-20 anos a partir da cessação da função ovariana. Receptores de estrogénio (ER) foram detectados em muitas células que existem no tecido ósseo, sugerindo que a menopausa pode ter consequências directas sobre a secreção de citocina por células localizadas no interior do microambiente ósseo. Acreditava-se que as células da medula óssea da linhagem monócito/macrófago eram a fonte principal do aumento pós-menopausa na secreção de TNF-α e IL-1 em tecido ósseo. No entanto, nos últimos anos foi cada vez mais reconhecido que as células T activadas são também uma importante fonte de uma produção aumentada de TNF-α na medula óssea depois da menopausa. As citocinas pró-inflamatórias estão entre os estimulantes mais fortes de 12 ΡΕ1663185 reabsorção óssea conhecidos. Elas intervêm, directamente e através da estimulação de outros factores locais, com cada um dos passos da osteoclastogénese que determina a taxa de reabsorção óssea, desde a proliferação e diferenciação das primeiras células precursoras de osteoclastos até a capacidade de resposta e a duração do osteoclasto maduro. 0 primeiro passo em osteoclastogénese que determina a taxa de reabsorção óssea é a proliferação de células precursoras de osteoclastos. De facto, uma importante consequência da deficiência de estrogénio é a expansão do pool de células precursoras osteoclásticas na medula óssea. A perda da função ovariana é permissiva para a expressão de importantes citocinas que estimulam directamente a proliferação inicial do precursor de osteoclasto, isto é, M-CSF, GM-CSF e IL-6. Aumentos espontâneos nestas citocinas podem ser adicionalmente aumentados pelos aumentos paralelos em IL-1 e TNF-a com a menopausa, que são potentes estimulantes de M-CSF, GM-CSF (292, 298, 308-311) e IL-6.

Em resumo, pode-se declarar que a deficiência de estrogénio, conforme observado depois de ovariectomia ou na menopausa, está associada a uma expressão aumentada de mediadores de inflamação. Além disso, a deficiência de células T evitou de forma eficaz a perda óssea em ratinhos ovariectomizados, claramente enfatizando a via RANK/RANKL como um mecanismo essencial que contribui para aumentar a formação de osteoclastos e a perda óssea.

De interesse, a deficiência de estrogénio também 13 ΡΕ1663185 parece estar correlacionada com a incidência de várias doenças autoimunes que ligam a activação das células T, células B com o estado hormonal e a fisiologia óssea.

Conforme descrito acima, a perda óssea com deficiência de estrogénio envolve um grande número de mudanças inter-relacionadas em factores reguladores estrogénio-dependentes. No entanto, enquanto em outros estados inflamatórios, tais como a artrite inflamatória, a deficiência em citocinas pró-inflamatórias únicas não evita totalmente o processo inflamatório, a deficiência em várias citocinas únicas é suficiente para bloquear completamente a reabsorção óssea excessiva com a deficiência em estrogénio. Esta redundância da função da maior parte destas citocinas para a formação de osteoclastos pode compensar a falta de função de cada um destes componentes em situações à parte de deficiência de estrogénio. As excepções evidentes são o M-CSF e os componentes do sistema RANKL, OPG/RANK, cuja actividade é essencial para a geração de osteoclastos. Esta evidência torna o bloqueio da interacção das células T com os precursores de osteoclastos um caminho muito atraente para novos intervenções terapêutica em perda óssea induzida por estrogénio; sendo esta considerada similar à destruição óssea induzida por inflamação. O circuito cortisona/cortisol: A interconversão de cortisol farmacologicamente activo e cortisona inactiva é conseguida por duas 11-β- 14 ΡΕ1663185 hidroxiesteróide desidrogenases (ll-p-HSD)3 independentes que exibem expressão tecido-especifica. Embora tenha sido proposta uma terceira enzima, a sua existência ainda tem de ser demonstrada. Na maioria das células intactas, a 11-β-HSDl funciona, predominantemente, como uma redutase que gera cortisol activo a partir de cortisona inactiva e, deste modo, aumenta a activação do receptor de glicocor-ticóide. No entanto, há forte evidência que a direcção da reacção pode depender em grande parte no tipo específico de tecido; deste modo, em células de Leydig a ΙΙ-β-HSD-l também pode funcionar como uma desidrogenase. A ΙΙ-β-HSDl é amplamente distribuída entre os tecidos com a expressão predominante ocorrendo em tecidos hepáticos, adiposos, gonadal e do sistema nervoso central. Ratinhos com uma ruptura dirigida do gene ΙΙ-β-HSDl são mais resistentes à hiperglicemia induzida por tensão ou dieta rica em matéria gorda do que os seus correspondentes do tipo selvagem, consistente com a noção emergente de que a activação de glicocorticóides por metabolismo pré-receptor pode ser fundamental ao aparecimento de muitas sequelas de resistência à insulina. A 11-β-Η3ϋ2 que é principalmente expressa na placenta e tecidos alvo de aldosterona tais como os rins e o cólon, actua exclusivamente como uma desidrogenase, evitando, deste modo, a activação de genes sensíveis ao receptor mineralocor-ticóide por excesso de cortisol. 0 ácido 18^-glicirretínico, um componente activo 15 ΡΕ1663185 do alcaçuz é um inibidor da ΙΙ-β-HSDl bem como da ll-p-HSD2 e a ingestão de alcaçuz ou a administração do ácido 18-β-glicirretínico ou o seu derivado hemisuccinato carbe-noxolona resulta em hipertensão e alcalose metabólica devido à inibição de 11-β-Η3ϋ2 devido ao acesso aumentado a cortisol activo nos receptores mineralocorticóides nos rins. Doentes com mutações no gene que codifica a 11-β-Ηεϋ2 sofrem de sindrome do "excesso aparente de mineralocorticóides" resultando me hipocalemia e hipertensão grave. Sintomas similares foram também descritos recentemente para o ratinho knockout 11-β-Ηεϋ2.

Durante várias décadas, os glicocorticóides sintéticos encontraram utilização terapêutica como agentes anti-inflamatórios em várias doenças, tais como a artrite reumatóide, doenças alérgicas, e asma brônquica. Consistente com os efeitos pluripotentes dos glicocorticóides, o receptor de glicocorticóide está amplamente distribuído entre os tecidos periféricos. Em muitos casos, a distribuição no tecido deste receptor e a de ΙΙ-β-HSDl se sobrepõe. Embora os glicocorticóides sejam geralmente receitados por suas acções anti-inflamatórias, até o momento relativamente poucos estudos tratam do envolvimento da ΙΙ-β-HSD em funções imunológicas mediadas por glicocorticóide. Num destes estudos, foi enfatizada a importância do metabolismo pré-receptor pelas enzimas ΙΙ-β-HSD no controlo das respostas inflamatórias demonstrando que a inibição farmacológica da actividade da ΙΙ-β-HSD presente na pele leva a um aumento da acção anti-inflamatória de cortisol aplicado 16 ΡΕ1663185 topicamente sobre as respostas de hipersensibilidade. 0 inibidor aplicado só não apresentou qualquer efeito. Foi proposto que o bloqueio da ΙΙ-β-HSD na pele anula a inactivação do corticóide.

Recentemente, foi investigada a expressão da ΙΙ-β-HSD numa célula efectora inflamatória primária, o monócito/macrófago. Estes estudos confirmam a completa ausência tanto da ΙΙ-β-HSDl como da 11-β-Η3ϋ2 em monócitos humanos em circulação isolados de fresco. No entanto, a actividade ΙΙ-β-redutase foi induzida durante a cultura de monócitos ou depois de estimulação com as citocinas anti-inflamatórias IL-4 e IL-13, sugerindo fortemente que a mesma pode desempenhar um papel importante na regulação das funções imunológicas destas células.

Uma vez que ambas as isoenzimas foram descobertas em células ósseas, foi ainda especulado que a activação da cortisona pela actividade redutase dominante da ΙΙ-β-HSD, por exemplo, a conversão exagerada em cortisol possa ser parte da perda óssea induzida pelos glicocorticóides em geral, incluindo a osteoporose observada em artrite reumatóide. Desta evidência poder-se-ia especular que o bloqueio da ΙΙ-β-HSD resultaria em perda óssea aumentada.

Deste modo, embora tenhamos proposto que o bloqueio da ΙΙ-β-HSD não só melhoraria a artrite permitindo indução de tolerância devido a concentrações aumentadas de glicocorticóide local, preocupa-nos que este tratamento aumentaria a destruição óssea. 17 ΡΕ1663185

Surpreendentemente, este não é o caso. De facto, o bloqueio de ΙΙ-β-HSD não só diminuiu a inflamação, como também evitou completamente a infiltração da medula óssea com células inflamatórias. Uma vez que foi proposto que os pré-osteoclastos são recrutados de linhas celulares sino-viais, bem como medula óssea monocitica, a prevenção da infiltração tem de ser considerada a via efectora principal para a prevenção da erosão óssea em artrite adjuvante e destruição óssea induzida por inflamação em geral. Esta última é ainda corroborada pelo facto de que a injecção do ácido 18-p-glicirretinico precisava para estar em estreita proximidade para drenar os gânglios linfáticos a fim de exibir eficácia clinica seja só ou em associação com um péptido.

Assim sendo, propomos que o bloqueio da ΙΙ-β-HSD aumenta as concentrações locais de glicocorticóide em tecidos imunológicos, o que evita a interacção entre as células T activadas e precursores de osteoclastos e/ou a activação das células T per se.

Dadas estas constatações, parece muito improvável que os glicocorticóides endógenos contribuam para a perda óssea durante a inflamação aguda; esta última pode, possivelmente ser o caso, em condições fisiológicas não inflamatórias. De facto, em artrite adjuvante em rato, um modelo estabelecido para a doença humana, a dexametasona, um potente glicocorticóide sintético em associação com um 18 ΡΕ1663185 anticorpo empobrecedor de CD4+, fortemente protegeu os ratos contra a erosão óssea. Além disso, a dexametasona também aumentou a melhora induzida por anti-TNF de inflamação sinovial e erosão óssea em modelos de ratos para artrite reumatóide. Assim, o aumento dos níveis locais de glicocorticóides pode ter efeitos benéficos sobre os ossos e a homeostase óssea durante inflamação aguda e/ou durante a activação de destruição óssea imunomediada. Nossas constatações contrastam claramente com a hipótese recentemente apresentada.

Além disso, é muito improvável que a ΙΙ-β-HSD expressa em osteoblastos desempenhe um papel no presente fenómeno, uma vez que a activação de osteoclastos depende da interacção com células T activadas e não osteoblastos na medula óssea. Esta evidência nega ainda um papel funcional da ΙΙ-β-HSD osteoblástica em destruição óssea induzida por inflamação.

Com base nas nossas constatações in vivo, investigamos a expressão do gene de ΙΙ-β-HSD e a actividade biológica em tecidos relevantes para a função imunológica. Pela primeira vez identificamos a actividade da ΙΙ-β-HSD em células dendrítricas e células linfóides (não publicado) tanto em tecidos humanos como de ratos. Curiosamente, análise pelo método TaqMan indica a presença de mARN para mais de uma ΙΙ-β-HSD. Esta evidência sugere fortemente que a ΙΙ-β-HSD pode ter um papel funcional na regulação da imunidade. Além disso, a enzima tipo 3 anteriormente 19 ΡΕ1663185 postulada, bem pode ser um homólogo do tipo 2 estabelecido. Foi proposto anteriormente que, potencialmente, podem existir diferenças nas enzimas ll-P-HSD-2 conhecidas observadas na placenta e nos rins, uma vez que os seus ADNs eram similares, mas não idênticos.

Uma vez que o ácido 18-p-glicirretinico bloqueia tanto a terceira enzima tanto a conhecido como a suposta, actualmente não se pode decidir definitivamente qual enzima é mais responsável pelo efeito benéfico do bloqueio de ΙΙ-β-HSD. 0 facto de que os mediadores inflamatórios, tais como as citocinas podem influenciar o equilíbrio entre a actividade da redutase e a desidrogenase seja alterando o equilíbrio entre as isoenzimas, seja mudando a direcção da reacção no nível da enzima única, necessita do desenvolvimento de inibidores mais selectivos para a identificação do alvo relevante.

Evidência recente estabelece a perda óssea induzida por inflamação e/ou imunomediada como uma interacção directa entre células T activadas e precursores de osteoclastos. Este mecanismo crucial pode ser evitado pela utilização do ácido 18-p-glicirretinico e compostos relacionados que modulam o circuito cortisol/cortisona; isto é, a actividade e/ou a expressão da ΙΙ-β-hidroxiesteróide desidrogenase, bem como inibidores selectivos úteis para a modulação da ΙΙ-β-HSD.

Era um objectivo da presente invenção propor- 20 ΡΕ1663185 cionar um agente farmacêutico para a prevenção e/ou tratamento de perda de osso e/ou de cartilagem induzida por inflamação e/ou imunomediada.

Assim sendo, a presente invenção refere-se à utilização de um inibidor da ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável para a preparação de um agente farmacêutico para a prevenção e/ou o tratamento de perda de osso e/ou cartilagem induzida por inflamação e/ou imunomediada, em que a referida utilização é para a prevenção e/ou tratamento de metástases ósseas líticas, artrite, artrite crónica juvenil e/ou artrite adjuvante, doenças infecciosas, perda óssea por HIV, perda de dente, inflamação da medula óssea e/ou inflamação sinovial.

Pela utilização de fármacos para a terapêutica de inflamações, observou-se que a perda óssea continua a acontecer, uma vez que permanece a activação de osteo-clastos. Constatou-se que a perda óssea pode ser eficazmente prevenida por meio dos inibidores da ΙΙ-β-HSD da invenção.

De acordo com a invenção, os inibidores da ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 são, preferencialmente utilizados para a prevenção e/ou tratamento de perda de osso e/ou cartilagem num mamífero, mais preferencialmente num ser humano.

Foi cuidadosamente considerado que uma perda de 21 ΡΕ1663185 osso e/ou cartilagem induzida por inflamação e/ou imunome-diada pode incluir osteoporose, osteoporose pós-menopausa, metástases ósseas liticas, artrite, artrite crónica juvenil, artrite adjuvante, doenças infecciosas, perda óssea por cancro, perda óssea por HIV, perda de dente, inflamação da medula óssea, inflamação sinovial, erosão de cartilagem e/ou osso e/ou lesão proteoglicana.

Numa forma de realização mais preferida da invenção, a perda de osso e/ou cartilagem imunomediada inclui osteoartrite, artrite reumatóide e/ou periodontite.

De preferência, os inibidores da ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 são seleccionados do grupo que consiste nas seguintes fórmulas:

ΡΕ1663185 22

ΡΕ1663185 23

24 ΡΕ1663185 (continuação)

Nome do Composto Estrutura Fórmula 17 Fórmula 18 O k XxH . Fórmula 19 à cj Fórmula 20 ο Fórmula 21 Cj ° 25 ΡΕ1663185 (continuação)

Nome do Composto Estrutura Fórmula 22 J. o r° Fórmula 23 ΟΟΛ t I Fórmula 25 Fórmula 26 ^ΧΧ,-ρό·" ° o Fórmula 27 —O O / 26 ΡΕ1663185 (continuação)

Nome do Composto Estrutura Fórmula 28 Pjcr γ· ο γ "°Λ rs Fórmula 29 v.) Ο Γ'Τ 0'? j 0 thoó O .^0 Fórmula 30 o' fjf°v j vs ^ x Fórmula 31 ° ’ s fra

Numa forma de realização preferida da invenção, os inibidores da ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 são seleccionados do grupo que consiste nas fórmulas 13 e 25 como a seguir: 27 ΡΕ1663185

Verificou-se que as referidas estruturas são particularmente eficazes na inibição especifica da 11-β-HSD, preferencialmente da ΙΙ-β-HSD-l, 11-β-Η3ϋ-2 e/ou 11-β-HSD-1 e 2.

Preferencialmente, o inibidor é de fórmula 16:

Numa outra forma de realização preferida da invenção, o inibidor da ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 é de fórmula 7: 28 ΡΕ1663185

Outros inibidores da ΙΙ-β-HSD-l ou 2 levados em consideração são para a prevenção e/ou tratamento da perda óssea induzida por inflamação e/ou imunomediada, por exemplo, mas não limitados ao ácido 18-p-glicirretínico, progesterona, 5a-di-hidroprogesterona, 5P-di-hidroproges-terona, 20a-di-hidroprogesterona, 3P5a-tetra-hidroproges-terona, 17a-0H-progesterona, 20a-di-hidro-5a-di-hidropro-gesterona, 20a-di-hidroprogesterona, lla-OH-progesterona, ΙΙβ-ΟΗ-progesterona, corticosterona, ΙΙβ-ΟΗ-androstenoi-dona, 3-alfa, 5-beta-tetra-hidroprogesterona, 3-alfa, 5-beta-tetra-hidro-ll-deoxi-corticosterona, 11-epicortisol, ácido quenodeoxicólico, ácido eólico, ácido glicirretínico (3P-hidroxi-ll-oxooleano-12-eno-30-ácido) e seus derivados tais como glicirricina, ácido glicirricínico e carbeno-xolona; furosemida e seus derivados, flavonóides e seus derivados tais como naringenina, triterpinóides (por exemplo, CHAPS), cetoconazole, saiboku-to, gossipol, metira-pona, 11-epiprednisolona. Outros inibidores adequados são semelhantes a esteróide, tais como dexametasona, budeso-nida, deflazacort e estanozolol.

Os inibidores ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 da presente invenção podem ser utilizados na prevenção e/ou tratamento de perda óssea e/ou de cartilagem induzida por 29 ΡΕ1663185 inflamação e/ou imunomediada sós ou em associação com pelo menos um ingrediente activo sendo eficaz na prevenção e/ou tratamento de perda óssea e/ou de cartilagem induzida por inflamação e/ou imunomediada.

Os produtos de fármaco são produzidos utilizando uma dose eficaz dos compostos da invenção ou seus sais, para além de adjuvantes, veículos e aditivos convencionais. A dosagem dos agentes farmacêuticos pode variar dependendo do modo de administração, a idade e o peso do doente, da natureza e gravidade das doenças a serem tratadas e factores similares. A dose diária pode ser dada como uma dose única, e é, em geral de 5-100 mg/kg de peso corporal, preferencialmente 7-80 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente 10-50 mg/kg de peso corporal e mais preferencialmente 20 mg/kg de peso corporal, em relação a uma pessoa que pesa 70 kg. São adequadas, de acordo com a invenção, a administração oral, sublingual, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, intraocular, intracerebral, intracrnial, respiratória, intratraqueal, nasofaringeal, transdérmica, intradérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, entérica e/ou tópica e/ou administração por via rectal, por perfusão e/ou por implante. A administração oral dos compostos da invenção é particularmente preferida. São utilizadas apresentações farmacêuticas galénicas tais como comprimidos, comprimidos revestidos, cápsulas, pós disper- 30 ΡΕ1663185 sáveis, grânulos, soluções aquosas, substâncias aquosas ou oleosas, xarope, soluções ou gotas.

As formas sólidas podem compreender ingredientes e veículos inertes tais como, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, fosfato de sódio, lactose, amido, manitol, alginatos, gelatina, goma de guar, estea-rato de magnésio ou estearato de alumínio, metilcelulose, talco, sílicas coloidais, óleo de silicone, ácidos gordos de alto peso molecular (tais como o ácido esteárico), agar-agar ou gorduras e óleos vegetais ou animais, polímeros sólidos de alto peso molecular (tais como polietile-noglicol); as preparações adequadas para as administração oral podem compreender, se desejado, aromatizantes e/ou edulcorantes adicionais.

As formas líquidas de fármaco podem ser esterilizadas e/ou, onde apropriado, podem compreender excipi-entes tais como conservantes, estabilizantes, agentes humedecedores, penetrantes, emulsionantes, agentes de espalhamento, solubilizantes, sais, açúcares ou álcoois de açúcar para controlar a pressão osmótica ou para tamponar e/ou reguladores de viscosidade.

Exemplos de tais adições são tampão tartarato e tampão citrato, etanol, agentes complexantes (tais como o ácido etilenodiaminatetracético e os seus sais não tóxicos). Adequados para controlar a viscosidade são os polímeros de alto peso molecular, tais como, por exemplo, 31 ΡΕ1663185 o óxido de polietileno líquido, celuloses microcris-talinas, carboximetilceluloses, polivinilpirrolidonas, dextranos ou gelatina. Exemplos de veículos sólidos são amido, lactose, manitol, metilcelulose, talco, sílicas coloidais, ácidos gordos de peso molecular mais alto (tais como o ácido esteárico), gelatina, agar-agar, fosfato de cálcio, estearato de magnésio, gorduras animais e vegetais, polímeros sólidos de alto peso molecular, tal como polietilenoglicol.

As suspensões oleosas para utilizações paren-téricas ou tópicas podem ser óleos vegetais, sintéticos ou semi-sintéticos, tais como, por exemplo, ésteres líquidos de ácido gordo com, em cada caso, 8 a 22 átomos de C nas cadeias de ácido gordo, por exemplo, o ácido palmítico, láurico, tridecíclico, margárico, esteárico, aráquico, místico, beénico, pentadecíclico, linoléico, elaídico, brasídico, erúcico ou oleico, que são esterifiçados com álcoois mono-hídricos a tri-hídricos com 1 a 6 átomos de C, tais como, por exemplo, metanol, etanol, propanol, butanol, pentanol ou seus isómeros, glicol ou glicerol. Exemplos destes ésteres de ácido gordo encontram-se disponíveis comercialmente migliós, miristato de isopro-pilo, palmitato de isopropilo, estearato de isopropilo, PEG 6-ácido cáprico, ésteres caprílico/cáprico de álcoois gordos saturados, trioleatos de polioxietilenoglicerol, oleato de etilo, ésteres de ácido gordo ceroso tais como gordura da glândula uropigial artificial de pato, ácido gordo de coco, éster isopropílico, oleato de oleílo, oleato de decilo, lactato de etilo, ftalato de dibutilo, 32 ΡΕ1663185 adipato de diisopropilo, ésteres poliólicos de ácido gordo, ínter alia. São também adequados os óleos de silicone que diferem em viscosidade ou álcoois gordos, tais como álcool isotridecilico, 2-octildodecanol, álcool cetilestearilico ou álcool oleilico, ácidos gordos, tais como, por exemplo, o ácido oleico. É também possível utilizar óleos vegetais, tais como o óleo de rícino, óleo de amêndoas, azeite, óleo de sésamo, óleo de semente de algodão, óleo de amendoim ou óleo de soja.

Os solventes, formadores de gel e solubilizantes adequados são água ou solventes miscíveis com água. Exemplos adequados são álcoois tais como, por exemplo, etanol ou álcool isopropílico, álcool benzílico, 2-octildodecanol, polietilenos glicóis, ftalatos, adipatos, propilenoglicol, glicerol, di- ou tripropilenoglicol, ceras, metil Cellosolve, Cellosolve, ésteres, morfolinas, dioxano, sulfóxido de dimetilo, dimetilformamida, tetra-hidrofurano, ciclo-hexanina, etc.

Os formadores de película que podem ser utilizados são éteres de celulose capazes de dissolver ou insuflar tanto em água como em solventes orgânicos, tais como, por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose, metilcelu-lose, etilcelulose ou amidos solúveis. São também possíveis formas combinadas de formadores de gel e formadores de película. Em particular, são utilizadas macromoléculas iónicas para este fim, tais como, por exemplo, carboximetilceluose sódica, ácido poli- 33 ΡΕ1663185 acrílico, ácido polimetilacrílico e seus sais, semigli-colato de amilopectina de sódio, ácido algínico ou algi-nato de propilenoglicol como sal sódico, goma arábica, goma xantana, goma de guar ou carragenina.

Outros auxiliares de formulação que podem ser utilizados são glicerol, parafina de diferentes viscosidade, trietanolamina, colagénio, alantoína, ácido novanti-sólico.

Pode também ser necessário utilizar agentes tensoactivos, emulsionantes ou humedecedores para a formulação, tais como, por exemplo, sulfato de laurilo Na, sulfatos de éter de álcool gordo, di-Na-N-lauril-p-imino-dipropionato, óleo de rícino polietoxilado ou monooleato de sorbitano, monoestearato de sorbitano, polisorbatos (por exemplo, Tween), álcool cetílico, lecitina, monoestearato de glicerilo, estearato de polioxietileno, éter alquilfenólico de poliglicol, cloreto de cetiltrimetil-amónio ou éter mono/dialquilpoliglicólico, sais de monoetanolamina do ácido ortofosfórico.

Estabilizadores, tais como montmorilonitas ou sílicas coloidais para estabilizar as emulsões ou para evitar a degradação das substâncias activas, tais como antioxidantes, por exemplo, tocoferais ou hidroxianisole butilada ou conservantes tais como ésteres p-hidroxibenzóicos, podem igualmente ser necessários, onde apropriado, para preparar as formulação desejadas. 34 ΡΕ1663185

As preparações para administração parentérica podem estar presentes em formas unitárias de dose separada, tais como, por exemplo, ampolas ou frascos. Soluções do ingrediente activo são preferencialmente utilizadas, preferencialmente soluções aquosas e especialmente soluções isotónicas, mas também suspensões. Estas formas de injecções podem ficar disponíveis como um produto final ou serem preparadas apenas imediatamente antes da utilização, misturando o composto activo, por exemplo, o liofilizado, onde apropriado, com outros veículos sólidos, com o solvente ou agente de suspensão desejado.

As preparações intranasais podem ser na forma de soluções aquosas ou oleosas ou de suspensões aquosas ou oleosas. Podem ser também na forma de liofilizados que são preparados antes da utilização com o solvente ou agente de suspensão adequado. A preparação, engarrafamento e cerre dos produtos tem lugar em condições antimicrobianas e assépticas habituais.

Numa outra forma de realização preferida da invenção, a composição farmacêutica é seleccionada do grupo que consiste na fórmula 13 e 25 conforme definido acima.

Mais preferencialmente, a estrutura é a fórmula 16, conforme definido acima. 35 ΡΕ1663185

Numa outra forma de realização da presente invenção, a composição farmacêutica tem a fórmula 7, conforme definido acima.

De acordo com a invenção, uma composição farmacêutica é, preferencialmente, para a prevenção e/ou o tratamento da perda de osso e/ou de cartilagem induzida por inflamação e/ou imunomediada, mais preferencialmente, para a prevenção e/ou o tratamento de osteoporose, osteoporose pós-menopausa, metástases ósseas liticas, artrite, osteo-artrite, artrite reumatóide, artrite crónica juvenil, artrite crónica, artrite adjuvante, doenças infecciosas, perda óssea por cancro, perda óssea por HIV, perda de dente, inflamação da medula óssea, inflamação sinovial, erosão de cartilagem/osso e/ou lesão proteoglicana. A composição farmacêutica da presente invenção, para além de um inibidor de ΙΙ-β-HSD tipo 1 e/ou tipo 2 e um veiculo ou diluente farmaceuticamente aceitável, pode compreender pelo menos um ingrediente activo sendo eficaz na prevenção e/ou tratamento de perda de osso e/ou de cartilagem induzida por inflamação e/ou imunomediada.

As composições farmacêuticas podem ser administradas por qualquer número de vias incluindo, mas não limitada a administração oral, sublingual, intravenosa, intramuscular, intra-articular, intra-arterial, intrame-dular, intratecal, intraventricular, intraocular, intrace-rebral, intracranial, respiratória, intratraqueal, nasofa-ringeal, transdérmica, intradérmica, subcutânea, intrape- 36 ΡΕ1663185 ritoneal, intranasal, entérica e/ou tópica e/ou administração por via rectal, por perfusão e/ou por implante. De preferência, a referida via de administração é oral. 0 termo "farmaceuticamente aceitável" significa um material não tóxico que não interfere com a eficácia da actividade biológica dos ingredientes activos. Tais preparações podem rotineiramente conter concentrações farmaceuticamente aceitáveis de sais, agentes tampões, conservantes, veículos compatíveis, agentes imunopoten-ciadores suplementares tais como adjuvantes e citocinas e, opcionalmente, outros agentes terapêuticos, tais como agentes quimioterapêuticos.

Quando utilizados em medicamentos, os sais devem ser farmaceuticamente aceitáveis, mas sais não farma-ceuticamente aceitáveis podem ser utilizados de forma conveniente para preparar seus sais farmaceuticamente aceitáveis e não estão excluídos do âmbito da invenção.

As composições farmacêuticas podem conter agentes tampões adequados, incluindo o ácido acético na forma de um sal; o ácido cítrico na forma de um sal; o ácido bórico na forma de um sal; e o ácido fosfórico na forma de um sal.

As composições farmacêuticas, opcionalmente, também podem conter conservantes adequados, tais como cloreto de benzalcónio, clorobutanol, parabenos e tio-mersal. 37 ΡΕ1663185

As composições farmacêuticas podem, convenientemente, ser apresentadas em forma de dosagem unitária e podem ser preparadas por meio de qualquer um dos métodos conhecidos na técnica de farmácia. Todos os método incluem o passo de pôr o agente activo em associação com um veiculo que constitui um ou mais ingredientes acessórios. De um modo geral, as composições são preparadas pondo o composto activo, de forma uniforme e intima, em associação com um veiculo liquido, um veiculo sólido finamente dividido ou ambos e, depois, se necessário, dar forma ao produto.

As composições adequadas para a administração oral podem ser apresentadas como unidades distintas, tais como cápsulas, comprimidos, pastilhas, cada uma contendo uma quantidade predeterminada do composto activo. Outros compostos incluem suspensões em líquidos aquosos ou líquidos não aquosos tais como xarope, elixir ou uma emulsão.

As composições adequadas para a administração parentérica compreendem, convenientemente, uma preparação estéril aquosa ou não aquosa que é preferencialmente isotónica com o sangue do recipiente. Esta preparação pode ser formulada de acordo com métodos conhecidos utilizando agentes de dispersão ou humedecimento adequados e agentes de suspensão. A preparação estéril injectável também pode ser uma solução ou suspensão injectável estéril num diluente ou solvente não tóxico parentericamente 38 ΡΕ1663185 aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butano diol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser utilizados estão a água, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotónica. Além disso, óleos fixos estéreis são utilizados convencionalmente como solvente ou um meio de suspensão. Para este fim, qualquer óleo fixo suave pode ser utilizado incluindo mono ou diglicéridos sintéticos. Além disso, ácidos gordos, tais como o ácido oleico, podem ser utilizados na preparação de injectáveis.

Formulações veículo adequadas para administrações oral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, etc., podem ser encontradas em Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA.

Numa forma de realização preferida da invenção, as composições farmacêuticas são administradas a um mamífero, preferencialmente um ser humano, numa dose de 5-100 mg/kg de peso corporal por dia, mais preferencialmente 7-80 mg/kg de peso corporal por dia, ainda mais preferencialmente 10-50 mg/kg de peso corporal por dia e, mais preferencialmente, 20 mg/kg de peso corporal por dia. Esta dose refere-se a uma pessoa que pesa 70 kg.

Numa outra forma de realização preferida da invenção, a composição farmacêutica é para a inibição da actividades dos osteoclastos, uma vez que o desequilíbrio entre as actividades dos osteoclastos e osteoblastos o resulta em sentido da actividade dos osteoclastos 39 ΡΕ1663185 anomalias esqueletais caracterizados pela perda de osso e/ou de cartilagem.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Artrite induzida por adjuvante (AIA)

Uma injecção na base da cauda, com Mycobacterium tuberculosum morta por calor em Adjuvante de Freund resulta em artrite destrutiva em 14 dias em estirpes de ratos DA ou LEW susceptiveis de linha pura. A AIA também pode ser induzida com paredes celulares de outros tipos bacterianos em IFA, embora a artritogenicidade varie. A síntese aumentada do factor de necrose tumoral a (TNF-a) , da interleucina 1 (IL-1) e da IL-6 é detectada já no dia quatro depois da injecção de adjuvante. A doença progride rapidamente durante várias semanas no que parece ser clinicamente um processo monofásico.

Os granulócitos e as células CD4 auto-reactivas desempenham papéis importantes na doença. Os mecanismos imunológicos humorais não parecem contribuir para o processo da doença. Este modelo específico de doença em rato representa um processo sistémico que envolve não apenas as articulações mas também os tractos gastrointestinal e gênito-urinário, a pele e os olhos. Embora clínica e histologicamente a AIA tenha semelhanças com a artrite reumatóide humana. 40 ΡΕ1663185

Neste modelo animal foi demonstrado de forma impressionante que a perda óssea e parcialmente a des truição da cartilagem relacionada essencialmente depende da activação dos osteoclastos pelas células T.

Deste modo, este modelo animal serve, de forma ideal, para investigar os mecanismos e alvos que podem ser adequados para o desenvolvimento de novas terapêuticas com eficácia terapêutica melhorada. De facto, a maior parte dos tratamentos actuais para a artrite e outros estados associados à perda óssea imunomediada apenas melhora a inflamação mas não detém a perda de osso e cartilagem. A Figura 2 apresenta o efeito do ácido 18-β- glicirretínico (BX-1) sobre a inflamação, bem como a perda óssea e de cartilagem. BX-1 inicial: BX-1 injectado i.d. no momento da indução da doença (dia 0) e dia 2, dia 4 BX-1 tardio: BX-1 injectado i.d. aos primeiro sinais de artrite, dia 9, dia 11, dia 13

As amostras são do membro esquerdo e direito traseiros de três ratos por grupo de uma experiência representativa.

Os dados são apresentados como EPM (Erro Padrão da Média). 41 ΡΕ1663185

BX-1 inibe a inflamação bem como a erosão óssea em AA o H '0 H 0 P W H Λ 0 ><o (0 £ 0 cu 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1.5 1 0,5 0

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Histologia

Articulações extirpadas de rato foram manchadas com H&E. Uma pontuação histológica sinovial foi determinada sobre as secções manchadas utilizando uma escala semiquantitativa que mede a inflamação sinovial (0-4) erosões ósseas e de cartilagem (0-4), infiltração na medula (0-4) e inflamação extra-articular (0-4) (pontuação máxima, 16).

Estatística

Testes t de Student de duas vias não emparelhados foram utilizados para comparar os níveis Ab, níveis de citocina, pontuações de artrite clínica e pontuações de histologia utilizando StatView (SAS Institute, Cary, NC) e software de computador Mathsoft (Mathsoft, Cambridge, MA). 42 ΡΕ1663185

Resultados histológicos de secções da articulação traseira de ratos artríticos Lâminas de tornozelos de rato foram avaliadas histologicamente de acordo com cinco critérios (avaliação cega por DL Boyle et al., Universidade da Califórnia em San Diego (J. Immunol., Janeiro 2002; 168:51-56): 1. Inflamação extra-articular 2. Inflamação da medula óssea (BM) 3. Inflamação sinovial 4. Erosão de cartilagem/osso 5. Lesão proteoglicana A completa ausência de infiltração da medula óssea não foi observada com nenhum tratamento a curto prazo e/ou tratamento descontinuado com um fármaco de molécula pequena anteriormente.

Os dados indicam ainda que o BX-1 (ácido 18-β-glicirretinico) influencia, de forma positiva, todos os ramos da patologia da artrite; a activação das células T e células dendríticas, a inflamação sistémica e a infiltração da medula óssea. Efeitos similares foram observados com o hemissucinato de BX-1, a carbenoxolona (não ilustrado).

As constatações histológicas podem explicar porque os animais entram em remissão depois do tratamento 43 ΡΕ1663185 tardio, isto é, depois do aparecimento da doença e porque não há absolutamente nenhum sinal de reexacerbação da doença depois da cessação do tratamento em que qualquer modelo que investigamos até agora; isto é, a artrite adjuvante e a artrite induzida por pristano.

Como um todo, estes dados sugerem que o BX-1 pode ser um fármaco ideal para reduzir a destruição óssea induzida por inflamação e/ou imune conforme observado não apenas em artrite reumatóide, mas também doenças peri-dontais e outros estados inflamatórios. De facto, a patologia das doenças periodontais e outras patologias que resultam na destruição óssea parece seguir uma via similar como esta actualmente aceite para a destruição óssea em artrite reumatóide (Annu. Rev. Immunol., Janeiro de 2002; 20: 795-823), que abre novas oportunidades ad hoc para o BX-1 e fármacos relacionados. Uma vez que o BX-1 é um inibidor estabelecido da ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2, as enzimas que bloqueiam estas com inibidores parecem ser uma a via muito promissora para curar as doenças associadas a inflamação e/ou a perda óssea imunomediada.

Exemplo 2

Materiais

Os reagentes de cultura celular foram adquiridos da Invitrogen (Carlsbad, CA) [1,2,6,7-3H]-cortisona da American Radiolabeled Chemicals (St. Louis, MO) e [ 1,2,6,7-3H]-cortisol da Amersham Biosciences (General 44 ΡΕ1663185

Electrics Healthcare, Piscataway, NJ). As placas de cromatografia de camada fina (TLC) (SIL G-25 UV254) foram adquiridas da Macherey-Nagel, Oensingen, Suíça.

Ensaio para detecção da actividade de Ιΐβ-HSD 0 ensaio de rastreio utilizado para determinar a inibição da actividade da enzima Ιΐβ-HSD tem por base a conversão de cortisona ou cortisol radiomarcados em lisados celulares de células HEK-293, tranfectadas de forma estável com ΙΙβ-HSD-l humana ou 11β-Η3ϋ-2 humana (Schweizer et al., 2003, Frick et al., 2004). As células foram desenvolvidas em placas de 10 cm por 80% de confluência e incubadas durante 16 horas em meio livre de esteróide (soro bovino fetal (FCS) tratado com carvão da HyClone, Logan, Utah). As células foram enxaguadas uma vez com soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS), separadas e centrifugadas durante 3 minutos a 150 x g. O sobrenadante foi removido e o grânulo de células foi rapidamente congelado num banho de etanol de gelo seco. No dia da experiência, os grânulos de células foram suspensos em tampão TS2 (NaCl 100 mM, EGTA 1 mM, EDTA 1 mM, MgCl2 1 mM, sacarose 250 mM, Tris-HCl 20 mM, pH 7,4), sonicado e as actividades determinadas imediatamente. A taxa de conversão de cortisol em cortisona ou a reacção inversa foi determinada em placas de reacção de PCR óptico de 96 poços (Applied Biosystems, Foster City, CA) num volume final de 22 pL e os tubos foram tampados durante a reacção para evitar evaporação. 45 ΡΕ1663185

Determinação da actividade de oxidase:

As reacções foram iniciadas adicionando simul

taneamente 10 pL de lisado celular e 12 pL de tampão TS2 contendo a concentração apropriada do composto inibidor a ser testado, NAD+, 30 nCi de [1,2,6,7-3H]-cortisol e cortisol não marcado. Foi utilizada uma concentração final de 40 0 μΜ de NAD+ e 25 nM de cortisol. As soluções mãe dos inibidores em metanol ou DMSO foram diluídas em tampão TS2 para dar as concentrações apropriadas, de modo que a concentração de metanol ou DMSO nas reacções foram mantidas inferiores a 0,1%. Foram realizadas reacções de controlo com ou sem 0,1% do solvente. A incubação foi a 37 °C durante 10 minutos com agitação, as reacções foram terminadas pela adição de 10 pL de solução de interrupção contendo 2 mM de cortisol não marcado e cortisona dissolvida em metanol. A conversão do cortisol radiomarcado foi determinada pela separação do cortisol e cortisona utilizando TLC e um sistema de solvente de 9:1 (v/v) de clorofórmio:metanol, seguido por contagem por cintilação. Na ausência de inibidores, aproximadamente 30% de cortisol foi convertido em cortisona.

Determinação da actividade de redutase:

As reacções foram iniciadas simultaneamente pela adição de 10 pL de lisado celular e 12 pL de tampão TS2 contendo a concentração apropriada do composto inibidor a ser testado, NADPH, 30 nCi de [1,2,6,7-3H]-cortisona e cortisona não marcada, de modo que as concentrações finais 46 ΡΕ1663185 eram de 400 μΜ de NADPH e 100 nM de cortisona. As actividades foram determinadas imediatamente depois da ruptura celular medindo a conversão da cortisona radiomarcada em cortisol durante 10 minutos. A cinética enzimática foi analisada por regressão não linear utilizando Data Analysis Toolbox (MDL Information Systems Inc.) adoptando taxa de cinética de primeira ordem. Os dados representam a média ± DP de quatro a cinco experiências independentes.

Referências

Schweizer, R. A. Atanasov, A. G., Frey, B. M., e Odermatt, A. (2003) Mol Cell Endocrinol 212, 41-49.

Christoph Frick, Atanas G. Atanasov, Peter Arnold, Juris Ozols e Alex Odermatt (2004) J Biol Chem, 279, 131-138.

Exemplo 3 A inibição da 11β -HSD1 foi determinada em 100 nM de cortisona, a inibição da lip-HSD2 em 25 nM de cortisol como substratos (em aproximadamente 30% de concentrações Km aparentes). 0 ensaio com 20 μΜ do composto correspondente na mistura de reacção, adicionado simultaneamente com o substrato: 47 ΡΕ1663185 1Ιβ-HSDl controlo

10 μΜ de CBX BNW1 BNW2 BNW3 BNW4 BNW5 BNW6 BNW7 BNW8 BNW9 BNW10 BNW11 BNW12 BNW13 BNW14 BNW15 BNW16 BNW17 BNW18 BNW19 BNW2 0 BNW21 BNW2 2 BNW2 3 BNW2 4 BNW2 5 BNW2 6 BNW2 7 BNW2 8 BNW2 9 BNW3 0 % de controlo de 1Ιβ-HSDl 99,9999986 4,43030125 102,112595 78,8440316 60,2536577 82,2425505 69,7522595 79,6439869 9,59257261* 41,7056688 30,6544131 64,325535 70,0994104 85,3624514 3,87940281* 20,1589034* 50,3669741 2,70799056* 88,2225144 92,0338994 51,0824709 46,8261929 48,9418364 41,3182359 85,0676295 3,93928545* 2,88437681* 94,0659079 78,6422701 76,7298316 75,2887485 48,3569192 % de controlo de 11β-Η3ϋ2 100 15,52151455 96,77455646 77,95067459 53,56660046 95,04764105 97,47129918 145,0319346 139,5062669 102,7042587 77,43471825 128,6701314 120,918247 132,1217751 14,37405632* 25,52077188* 56,94887208 27,37171929 120,1411745 82,80931996 73,62927124 120,655235 121,5916615 104,3264654 132,6608 13,34505396* 13,92786069* 136,7564992 126,3527217 136,975487 115,4231371 139,9742227 ΡΕ1663185 48

Exemplo 4

Determinação dos valores IC50 utilizando 7 concentrações diferentes de inibidores em intervalos de 2 factores: ηβ-HSDl Todos os valores em BNW7 BNW13 BNW14 BNW16 BNH24 BNW25 IC 50 1 l,95e+0 6,66e—1 2,75e+0 l,49e-l 7,33e-l 1,47e—1 2 l,91e+0 7,56e-l 3,09e+0 1,68e-l 9,05e-l 2,06e-l 3 2,24e+0 6,52e-l 2,58e+0 1,14e-l 7,74e-l 1,61e-l Valor médio 2,03e+0 6,91e-l 2,81e+0 1,44e-l 8,04e-l 1,72e—1 11P-HSD2 Desvio padrão 0,178522195 0,05642599 0,25800854 0,02724464 0,08980411 0,033079395 IC 50 1 Não inibiu Fora cb ç^ra Etra da gara Fora cb çpm Fcm da. çpra Rza cb ^ra 2 Não inibiu 2,63e-l 2, 01e+0 4,04e+0 1,69e-l 5, 46e-2 3 Não inibiu 2,99e-l 2,69e+0 3,87e+0 2,34e-l 6,49e-2 Valor médio n.d. 2.81e-l 2,35e+0 3,95e+0 2,02e-l 5, 97e-2 Desvio padrão n.d. 0,02520514 0,48148793 0,11686909 0,04659304 0,00731635

Lisboa, 9 de Fevereiro de 2009

Claims (17)

1. ΡΕ1663185 1 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de um inibidor de ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 ou um seu sal farmaceuticamente aceitável, para a preparação de um agente farmacêutico para a prevenção e/ou o tratamento de perda óssea e/ou cartilagem induzida por inflamação e/ou imunomediada, em que a referida utilização é para a prevenção e/ou tratamento de metástases ósseas líticas, artrite, artrite crónica juvenil e/ou artrite adjuvante, doenças infecciosos, perda óssea por HIV, perda de dente, inflamação da medula óssea e/ou inflamação sinovial.
2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1 para a prevenção e/ou tratamento da perda de osso e/ou de cartilagem induzida por inflamação e/ou imunomediada num mamífero.
3. 3 ΡΕ1663185 (continuação) Nome do Composto Estrutura Fórmula 6 CJ—f \ O F F Fórmula 7 Fórmula 8 oFvp' 0 Fórmula 9 u. ° CT Fórmula 10 NNs] m /¾ Fórmula 11 ! ci' ° ΡΕ1663185 4

   3. Utilização de acordo com a reivindicação 2, em que o mamífero é um ser humano.
4. 4. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida utilização é para a prevenção e/ou tratamento de periodontite e/ou artrite seleccionada do grupo que consiste em osteoartrite e/ou artrite reumatóide.
5. 5 ΡΕ1663185 (continuação) Nome do Composto Estrutura Fórmula 19 o.jC F à ά Fórmula 20 ο Fórmula 21 I Ο Fórmula 22 Cl 1 ο-? Fórmula 23 t I 6 ΡΕ1663185 (continuação) Nome do Composto Estrutura Fórmula 25 Fórmula 26 -0ΧΧ.»γΟ-° ° ò Fórmula 27 °v-'° í -ίώΑ?, Ο'^Ό" Fórmula 28 Ύ ο γ °yS rs Fórmula 29 v,) ( J ,caO Oirci 0'V ^ 0 7 ΡΕ1663185 (continuação) Nome do Composto Estrutura Fórmula 30 o' ^ τγ Fórmula 31 9 ' s nra

   5. Utilização de acordo com qualquer das 2 ΡΕ1663185 reivindicações 1 a 4, em que o inibidor de ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 é o ácido 18-p-glicirretinico ou um seu derivado, tal como a glicirrizina ou a carbenoxolona.
6. 6. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em que o inibidor de ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 é seleccionado do grupo que consiste nas seguintes fórmulas:
7. 7. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o inibidor de ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 é selec-cionado do grupo que consiste nas seguintes fórmulas:
8. 8. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que o inibidor de ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 é: 8 ΡΕ1663185
9. 9. Utilização de acordo com a reivindicação 6, em que o inibidor de ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 é:
10. 10 ΡΕ1663185 (continuação)

    10. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, em que o agente farmacêutico compreende pelo menos um inibidor de ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 em associação com pelo menos um ingrediente activo sendo eficaz na prevenção e/ou tratamento da perda de osso e/ou de cartilagem induzida por inflamação e/ou imunomediada.
11. 11. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, em que o agente farmacêutico é administrado numa dose de 5 a 100 mg/kg de peso corporal por dia.
12. 12. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, em que o agente farmacêutico é administrado por via oral, sublingual, intravenosa, intramus- 9 ΡΕ1663185 cular, intra-articular, intra-arterial, intramedular, intratecal, intraventricular, intraocular, intracerebral, intracranial, respiratória, intratraqueal, nasofaringeal, transdérmica, intradérmica, subcutânea, intraperitoneal, intranasal, entérica, por via rectal, por perfusão e/ou por implante.
13. 13. Utilização de acordo com a reivindicação 12, em que o agente farmacêutico é administrado por via oral.
14. 14. Utilização de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 4, em que o inibidor de ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 é a 11-a-OH-progesterona ou a ΙΙ-β-ΟΗ-progesterona.
15. 15. Composição farmacêutica compreendendo como ingrediente activo um inibidor de ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 ou um seu sal, em que o referido inibidor de ΙΙ-β-HSD tipo 1 e tipo 2 é seleccionado do grupo que consiste nas seguintes fórmulas 16, 7, 13 e 25:
16. 16. Utilização do ácido 18-p-glicirretinico para a prevenção e/ou tratamento de perda de osso e/ou cartilagem induzida por inflamação e/ou imunomediada em perio-dontite.
17. 17. Utilização do ácido 18-p-glicirretinico para a prevenção e/ou tratamento de perda de osso e/ou cartilagem induzida por inflamação e/ou imunomediada em artrite reumatóide. Lisboa, 9 de Fevereiro de 2009 1 ΡΕ1663185 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * D£ 2GS0072 A ‘ W00207S43SA * JP72918S7A * US -3934027 A Literatura que nao e de patentes > CQGPER st al. Jonrnaí ot Bemts and Minera! Re-semsh, 2C©t, vol. 16 {6), 1037-1044 * J. tòtmunst., January 2002, wA 168, £1-56 * Ajfltt. Rm. SíTímutmí., JanuarySOea vol, 20.79S-S23 na Descrição - SCHWEIZER, R A,; ATANASOV, A. G.; FRE¥, B. H.; D DE RM ATT. A Moí CeS Eínhcdnai, 2003, vol. 212, 41-48 » CHRISTOPH FR1CK; ATANAS G. ATANASOV; PETER ARNOLD: JURfS OZOLS; ALEX ODER-MATT. JBMGbem, 2004, vol. 278.131-138