ES2307729T3 - Modulacion de un perfil lipidico con esteroides y agonistas de ppar alfa. - Google Patents

Modulacion de un perfil lipidico con esteroides y agonistas de ppar alfa. Download PDF

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Abstract

Utilización de un agente que reduce la actividad intracelular de 11Beta-HSD1 y un agonista de PPARalfa en la preparación de una composición para la estimulación de un perfil lipídico ateroprotector.

Description

Modulación de un perfil lipídico con esteroides y agonistas de PPAR\alpha.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un procedimiento para modular el perfil lipídico de un individuo para obtener un efecto ateroprotector. En particular, la invención se refiere a la modulación de las concentraciones de la 11\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 1 (11\beta-HSD-1) para el estímulo de las características lipídicas ateroprotectoras.
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Introducción
El síndrome metabólico aparece como uno de los problemas médicos y de salud pública principales tanto en Estados Unidos como en el resto del mundo. Se caracteriza por hipertensión, hipertrigliceridemia e hiperglicemia, se agrava por la obesidad y constituye un factor de riesgo para la cardiopatía coronaria.
La cardiopatía coronaria es una enfermedad que se manifiesta como ataque al corazón (infarto de miocardio), insuficiencia cardiaca o dolor en el pecho (angina de pecho). Está producida por un estrechamiento y endurecimiento de las arterias coronarias (ateroesclerosis). Una de las principales características de la ateroesclerosis es la acumulación de colesterol dentro de las paredes de las arterias coronarias. Los factores de riesgo para la cardiopatía coronaria son las causas subyacentes de la ateroesclerosis. Existen tres causas principales de la cardiopatía coronaria: colesterol LDL elevado, tabaquismo y el síndrome metabólico. Entre éstos el colesterol LDL es la causal principal de la ateroesclerosis. Cuando la concentración en sangre de LDL aumenta, la ateroesclerosis se inicia y se mantiene. El tabaquismo y el síndrome metabólico no obstante constituyen factores de riesgo significativos.
El síndrome metabólico está compuesto de factores de riesgo individuales que en conjunto elevan en gran medida el riesgo de la cardiopatía coronaria. Los factores de riesgo metabólico que constituyen este síndrome son los triglicéridos elevados, las partículas pequeñas de LDL, el colesterol HDL bajo, la presión sanguínea elevada, la glucosa en sangre elevada, una tendencia a la coagulación sanguínea (trombosis) y la inflamación crónica. Considerados en conjunto, estos factores de riesgo aceleran el desarrollo de la aterosclerosis cuando aparecen en presencia de colesterol LDL elevado. Cuando las concentraciones del colesterol LDL son muy bajas, los factores de riesgos del síndrome metabólico pueden presentar menos efecto sobre la aterogénesis; pero una vez las concentraciones de LDL aumentan, estos otros factores de riesgo se cree que se vuelven cada vez más aterógenos.
Muchos pacientes con síndrome metabólico desarrollan por otra parte la diabetes tipo 2 (diabetes al principio de la etapa de adulto). La diabetes tipo 2 se caracteriza por una concentración de glucosa en el plasma en ayunas de 7,0 mmoles/l o superior. La mayoría de las personas con diabetes tipo 2 presentan dos anomalías metabólicas que aumentan la glucosa en sangre para el intervalo de la diabetes. La primera anomalía es la resistencia a la insulina; la otra es una insuficiencia en la producción de insulina por el páncreas.
La diabetes tipo 2 por lo general se desarrolla cuando la resistencia a la insulina se combina con un defecto leve a moderado en la secreción de insulina. La resistencia a la insulina por lo tanto es un trastorno en el metabolismo de los tejidos que interfiere con la acción normal de la insulina para favorecer la absorción de la glucosa por la absorción y la utilización de la glucosa. Habitualmente precede al desarrollo de la diabetes tipo 2 durante muchos años. Existe una relación íntima entre la resistencia a la insulina y los factores de riesgo del síndrome metabólico. La naturaleza de esta relación no se comprende en su totalidad. Un factor parece ser una sobrecarga de tejidos con grasas (lípidos). Los pacientes con resistencia a la insulina normalmente tienen una concentración elevada de ácidos grasos libres, que se liberan del tejido graso (tejido adiposo). Cuando los ácidos grasos en exceso se introducen en el músculo, se produce la sobrecarga de lípidos y esto provoca resistencia a la insulina. Otros factores pueden contribuir a la resistencia a la insulina, pero la sobrecarga en el tejido de los lípidos parece ser el factor principal. Esta sobrecarga en varias maneras parece que engendra factores de riesgo coronario del síndrome metabólico.
Una concentración de colesterol LDL en sangre elevada generalmente no se considera que sea un componente integral del síndrome metabólico. No obstante, es un factor de riesgo independiente principal que debe estar presente antes de los demás componentes del síndrome metabólico puedan venir a desempeñar factores aterógenos. En poblaciones alrededor del mundo en las que varios componentes del síndrome metabólico están presentes, la cardiopatía coronaria ateroesclerósica es relativamente rara cuando las concentraciones de LDL en sangre son muy bajas. En estudios de publicación, solamente cuando las concentraciones de LDL comienzan a aumentar la incidencia de la cardiopatía coronaria comienza a aumentar. Además, las intervenciones con colesterol LDL más bajo, incluyendo la administración de inhibidores de HMGCoA reductasa o fibratos, reducen el número de casos de la cardiopatía coronaria. La conexión entre las concentraciones de LDL en sangre y la resistencia a la insulina no se han estudiado completamente. Claramente muchos factores distintos de la resistencia a la insulina contribuyen al LDL elevado. Sin embargo, cuando existe sobrecarga de grasas en el hígado, la producción de lipoproteínas por el hígado parece ser que aumenta. Esta sobreproducción de lipoproteínas que contienen apolipoproteína B conducirá a algún aumento en las concentraciones de LDL. Por ejemplo, las personas obesas presentan concentraciones de colesterol LDL superiores que las personas delgadas. Por lo tanto no es posible eliminar el LDL elevado completamente del síndrome metabólico.
Otras anomalías en los lípidos de la sangre son más características del síndrome metabólico. Existen por lo general tres anomalías que se agrupan, de ahí su denominación, triada de lípidos. Estas incluyen el aumento de los triglicéridos, pequeñas partículas de LDL y concentraciones de colesterol HDL bajas. La triada de lípidos también ha sido denominada fenotipo de lipoproteína aterógena o dislipidemia aterógena. Cada componente de la dislipidemia aterógena parece que estimula independientemente la ateroesclerosis. El aumento de triglicéridos indica la presencia de lipoproteínas restantes que aparentemente son tan aterógenas como LDL. La pequeña LDL se desliza en la pared arterial más fácilmente que los triglicéridos de tamaño normal, y de este modo presentan aumento de aterogenicidad.
La HDL baja estimula probablemente la ateroesclerosis de varias maneras. Un ejemplo destacable es la capacidad de HDL para eliminar el colesterol en exceso de la pared arterial (transporte inverso del colesterol); cuando la HDL es baja, se retarda el transporte del colesterol inverso.
Una cuarta anomalía con frecuencia acompaña a la triada de lípidos. Ésta es una elevación de la apolipoproteína B (apo B). La apo B es la lipoproteína mayor de LDL y las lipoproteínas ricas en triglicéridos. Algunos investigadores creen que la concentración de apo B1' total es el mejor indicador único de la presencia de dislipidemia aterógena. Ciertamente, cuando las concentraciones totales de apo B son elevadas, una persona está en situación de riesgo creciente de cardiopatía coronaria. Los pacientes con resistencia a la insulina con frecuencia presentan dislipidemia aterógena. Cuando el hígado está sobrecargado con grasas, existe una sobreproducción de lipoproteínas que contienen apo-B. Esto conduce a aumento de triglicéridos, aumento de las lipoproteínas restantes, aumento total de apo B y de LDL pequeña. Todo esto representa una respuesta compensadora por el hígado en su intento de hacer frente al exceso de grasa y eliminarlo.
Además, una enzima importante del hígado, la lipasa hepática, también aumenta en presencia de resistencia a la insulina. Esta enzima degrada la HDL y contribuye a HDL baja asociada a la resistencia a la insulina.
Las hormonas glucocorticoides (cortisol, corticoesterona) producidas por las glándulas suprarrenales también tienen potencial para producir resistencia a la insulina. Esta acción se observa más drásticamente en pacientes que presentan síndromes de Cushing, tal como la enfermedad de Cushing, que son debidas a la sobreproducción de corticoesteroides. Los pacientes son síndromes de Cushing manifiestan una resistencia a la insulina y muchos desarrollan diabetes de tipo 2. Además, los pacientes que reciben glucocorticoides naturales o sintéticos en el tratamiento de la enfermedad también presentan resistencia a la insulina.
Recientemente, un nivel nuevo e importante de control de la acción glucocorticoide se ha puesto de manifiesto, el metabolismo prerreceptor por las 11\beta-hidroxiesteroides deshidrogenasas (11\beta-HSD). La 11\beta-HSD cataliza la interconversión de los 11-hidroxi glucocorticoides fisiológicos activos (cortisol en la mayoría de los mamíferos, corticoesterona en ratas y ratones) y sus formas 11-ceto inertes (cortisona, 11-deshidrocorticoesterona). Existen dos isozimas de 11\beta-HSD, productos de genes distintos (5,6). La 11\beta-HSD de tipo 2 es una deshidrogenasa de gran afinidad que inactiva rápidamente la corticoesterona en los riñones y el colón, excluyendo de este modo los glucocorticoides de otra forma receptores mineralcorticoides no selectivos in vivo (7,8). Sin embargo, este tejido adiposo solamente expresa 11\beta-HSD tipo 1 (9), como lo hace el hígado donde la enzima es especialmente abundante (10, 11).
La 11\beta-HSD-1 es una reductasa predominante en la mayoría de las células íntegras, incluyendo hepatocitos (12), adipocitos (13), neuronas (14) y en el hígado aislado ex vivo (15). Esta dirección de la reacción regenera glucocorticoides activos dentro de las células a partir de 11-cetoesteroides inertes de libre circulación. Los ratones homozigóticos para la destrucción dirigida del gen 11\betaHSD-1 son viables, fértiles y presentan longevidad normal (16). Sin embargo, los ratones sin 11\betaHSD-1 no pueden regenerar la corticoesterona a partir de la 11-deshidrocorticoesterona inerte, lo que indica que esta isozima es la única 11\beta-reductasa. Sorprendentemente, los animales sin 11\betaHSD-1 presentan respuestas gluconeógenas atenuadas sobre el estrés y resisten la hiperglucemia provocada por la alimentación crónica rica en grasas (16). Esto se produce a pesar de concentraciones de corticoesterona moderadamente elevadas en el plasma. Los resultados sugieren que la actividad de 11\betaHSD-1-reductasa es un amplificador importante de la acción glucocorticoide intrahepática in vivo. Desconcertantemente, las alteraciones específicas del tejido en la actividad de 11\betaHSD-1 han estado implicadas en el desarrollo de la obesidad y de la resistencia a la insulina en ratas Zucker (4) obesas y en seres humanos (2; 54).
En el síndrome metabólico, la dislipidemia se caracteriza por hipertrigliceridemia y una lipoproteína aberrante y un perfil de colesterol con VLDL^{1}, pero colesterol HDL "cardioprotector" reducido (17). El perfil lipídico en el plasma está determinado en gran medida por la expresión génica en el hígado. Además, la expresión y la actividad de muchas proteínas del hígado implicadas en el metabolismo de los lípidos, la síntesis, el envasado y la exportación son sensibles a los glucocorticoides. Sin embargo, la función exacta de los glucocorticoides en la patogénesis del metabolismo de los lípidos hepáticos no está clara, con efectos generales dependientes aparentemente de las concentraciones del esteroide, las concentraciones de otras hormonas, particularmente la insulina y en la dieta. De hecho, muchos estudios han utilizado tratamientos a corto plazo y/o concentraciones no fisiológicas de glucocorticoides, haciendo algunas extrapolaciones de los efectos sutiles del difícil metabolismo de los glucocorticoides intracelulares alterado. Además, los glucocorticoides también presentan importantes efectos indirectos, que regulan otros factores claves de transcripción que controlan el metabolismo de los lípidos, produciendo de manera notable el receptor-\alpha activado por el proliferador peroxisoma (PPAR\alpha) (18, 19). PPA-R\alpha dirige la adaptación oxidativa en ayunas (20, 21) y sirve como diana molecular de fármacos de fibrato hipolipidémicos (22, 23).
El amplio intervalo de efectos antiinflamatorios y metabólicos de los glucocorticoides conduce a su utilización en el tratamiento de varias enfermedades. Las indicaciones generales para la terapia de glucocorticoides incluyen la enfermedad ocular, los trastornos hepáticos, la enfermedad hematológia maligna, los tumores sólidos, la enfermedad intestinal y la mayoría de las enfermedades inmunitarias mediadas e inflamatorias mediadas. Sin embargo, la administración de glucocorticoides está asociada a efectos secundarios, que pueden limitar la utilización de dichas terapias. La disregulación del perfil lipídico y del síndrome metabólico, son efectos secundarios frecuentes de la administración de glucocorticoides.
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Sumario de la invención
Se ha determinado que los ratones con 11\beta-HSD-1^{-/-} presentan un perfil con riesgo cardiovascular alterado debido a los cambios dependientes del hígado en el metabolismo de los lípidos y en la sensibilidad a la insulina. Esto se ha demostrado por análisis de los lípidos y lipoproteínas circulantes y la expresión de los genes hepáticos implicados en el metabolismo y transporte de los lípidos, así como fibrinógeno, otro transcrito hepático sensible a glucocorticoides asociado con el riesgo cardiovascular. Los descubrimientos publicados en la presente memoria demuestran que una reducción en 11\beta-HSD1 conduce a un perfil lipídico ateroprotector que contrarresta los efectos de la resistencia a la insulina y del síndrome metabólico.
Según un primer aspecto, por consiguiente, la invención proporciona la utilización combinada de un agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1 intracelular y un agonista de PPAR\alpha en la preparación de una composición para la estimulación de un perfil lipídico ateroprotector.
Como se señaló anteriormente, concentraciones reducidas de HDL y concentraciones aumentadas de triglicéridos en el plasma, el principal componente de LDL, son los principales contribuyentes al riesgo cardiovascular y a la ateroesclerosis. Según la presente invención, se aporta que la inhibición de 11\beta-HSD1 conduce a la reducción de triglicéridos del plasma y de este modo a la de LDL, y a un aumento de la HDL. El perfil lipídico de individuos en situación de riesgo de cardiopatía coronaria, o de otras molestias cardiovasculares, especialmente las relacionadas con el metabolismo subóptimo del colesterol, pueden mejorarse por reducción de las concentraciones de 11\beta-HSD1.
Los agentes que reducen la actividad de 11\beta-HSD1 intracelular incluyen aquellos agentes que modifican el perfil genético de un individuo con objeto de regular por disminución la expresión génica de 11\beta-HSD1. Por lo tanto, la invención comprende estrategias que implican la terapia génica para eliminar o regular por disminución los genes 11\beta-HSD1 endógenos. Dichas estrategias incluyen las estrategias del ácido nucleico complementario, que son capaces de reducir o impedir la transcripción y/o traducción del ARNm in vivo, y otros procedimientos para la manipulación genética que actúan a nivel del ARNm; y la manipulación genética de los genes endógenos para reducir las concentraciones de su expresión en tejidos somáticos.
Preferentemente, el agente que disminuye las concentraciones de 11\beta-HSD1 es un inhibidor de la síntesis o actividad de 11\beta-HSD1. Por lo tanto, tal como se indica a continuación, debe entenderse que "niveles" se refiere a la actividad de 11\beta-HSD1 y no necesariamente a las cantidades físicas de esta enzima presente en tejidos o células. Los inhibidores de 11\beta-HSD1 son conocidos en la técnica y se describen con más detalle a continuación.
De manera ventajosa, el perfil lipídico del individuo tratado presenta una reducción en los triglicéridos del plasma y/o un aumento en el colesterol HDL. Dicho perfil lipídico se reconoce que es ateroprotector.
PPAR\alpha estimula la oxidación de los ácidos grasos en el hígado; como se muestra a continuación, la inhibición de 11\beta-HSD1 conduce a la regulación por incremento de PPAR\alpha, que a su vez conduce a la reducción de los triglicéridos en el plasma. La inhibición de 11\beta-HSD1 también aumenta la expresión de PPAR\gamma en el tejido adiposo, que presenta efectos beneficiosos sobre la sensibilidad a la insulina, el perfil lipídico, la tolerancia a la glucosa y el riesgo cardiovascular.
El agonista de PPAR\alpha puede ser, por ejemplo, un fibrato. Los fibratos activan PPAR\alpha, los triglicéridos menores del plasma y reprimen a apoCIII; una terapia de combinación que comprende tanto un fibrato como un agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1 proporciona un perfil lipídico muy favorable.
Preferentemente, el individuo tratado además presenta una reducción en el fibrinógeno del plasma. El fibrinógeno es un factor de riesgo independiente reconocido para la cardiopatía vascular.
De manera ventajosa, la invención proporciona también una reducción de las concentraciones de apoCIII en el suero. ApoCIII aumenta las concentraciones de triglicéridos en el plasma inhibiendo la glucólisis hepática. Como se describe en la presente memoria la inhibición de la actividad de 11\beta-HSD1 conduce a una reducción en apoCIII en el suero. Por consiguiente, la invención proporciona la utilización de un agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1 y un agonista de PPAR\alpha en la producción de una composición para la reducción de las concentraciones de apoCIII en un individuo. Se sabe que apoCIII está correlacionada positivamente con el riesgo de cardiopatía vascular.
La actividad de 11\beta-HSD1 es preferentemente una actividad intracelular de 11\beta-HSD1.
En la presente memoria se describe la utilización de un agente que reduce la actividad intracelular de 11\beta-HSD1 en la producción de una composición para la estimulación de la sensibilidad de la insulina. Como se señaló anteriormente, la resistencia a la insulina está asociada al riesgo cardiovascular y al síndrome metabólico. La reducción de las concentraciones de 11\beta-HSD1 conduce a un aumento de la sensibilidad a la insulina.
También se describe en la presente memoria la utilización de un agente que reduce la actividad intracelular de 11\beta-HSD1 en la producción de una composición para la mejora de la tolerancia a la glucosa en un individuo. La reducción en las concentraciones de 11\beta-HSD1 conduce a mejoras en el control glucémico dinámico. Esto está de acuerdo con los efectos observados en las mejoras en la sensibilidad a la insulina.
En una forma de realización adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un agonista de PPAR\alpha y un agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1. La composición farmacéutica según la invención puede ser proporcionada como una preparación combinada o como un kit que comprende tanto un agonista de PPAR como un agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1 para la utilización simultánea, simultánea por separado o la utilización sucesiva.
En la presente memoria, se proporciona un procedimiento para reducir el riesgo de enfermedad cardiovascular en un paciente en situación de riesgo de cardiopatía vascular, que comprende administrar a dicho paciente una cantidad farmacéuticamente eficaz de un agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1 en combinación con un agonista de PPAR\gamma.
Incluso en una forma de realización adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un agonista de PPAR\gamma y un agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1. La composición farmacéutica según la invención puede proporcionarse como una preparación combinada, o como un kit que comprende tanto un agonista de PPAR\gamma como un agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1 para la utilización simultánea, simultánea por separado o sucesiva.
Los procedimientos, utilizaciones y composiciones según la invención son útiles en el tratamiento de una variedad de enfermedades que están asociadas al aumento del riesgo de la cardiopatía vascular.
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Breve descripción de las figuras
Figura 1. A. Concentraciones de triglicéridos en animales campestres (barras negras) frente a con 11\betaHSD-1^{-/-} (barras blancas) sometidos a manipulación dietética: AL; alimentados a voluntad; F; 24 h en ayunas, 4RF; 24 h de ayuno con 4 h de realimentación y 24RF; 24 h de ayuno con 24 h de realimentación. Los superíndices en letra de la casilla inferior identifican grupos que son similares estadísticamente. B. El perfil FPLC de triglicéridos verdaderos representativos de ratones silvestres alimentados a voluntad y de ratones 11\betaHSD-1^{-/-}. Obsérvense las concentraciones de triglicéridos inferiores alimentados a voluntad en ratones 11\beta-HSD1^{-/-}.
Figura 2. A. Las concentraciones totales de colesterol en animales campestres (barras negras) frente a animales 11\betaHSD-1^{-/-} (barras blancas) sometidos a manipulación de la dieta: AL; alimentados a voluntad, F; 24 h de ayuno, 4RF; 24 h de ayuno con 4 h de realimentación y 24RF; 24 h de ayuno con 24 h de realimentación. B. Concentraciones de colesterol HDL en animales campestres (barras negras) frente a animales con 11\betaHSD-1^{-/-} (barras blancas) sometidos a manipulación de la dieta: AL: alimentados a voluntad; F; 24 h en ayunas, 4RF; 24 h alimentados con 4 h de realimentación y 24RF; 24 h en ayunas con 24 h de realimentación. (* los valores significativamente mayores en ratones 11\beta-HSD1^{-/-} de tipo campestre). C. Las concentraciones de ARNm de la apolipoproteína AI hepática (que codifica el componente principal de la partícula de HDL) en animales campestres (barras negras) frente a los animales 11\betaHSD-1^{-/-} (barras blancas). Los superíndices en letra en la casilla inferior identifican grupos que son estadísticamente similares. Obsérvese las concentraciones de colesterol HDL significativamente mayores en ratones 11\beta-HSD1^{-/-}, así como el ARNm de la apolipoproteína AI mayor alimentada en hígado de ratón 11\beta-HSD-1^{-/-} alimentado.
Figura 3. Concentraciones en el transcrito de proteínas de la serie de reacciones de biosíntesis lipogénica (A-C) y de colesterol (D) en hígados de animales campestres (barras negras) frente a animales 11\betaHSD-1^{-/-} (barras blancas) sometidos a manipulación de la dieta: AL; alimentados a voluntad, F; en ayuno 24 h, 4RF; 24 h de ayuno con 4 h de realimentación y 24RF; 24 h de ayuno con 24 h de realimentación. Se analizaron las concentraciones de transcrito por inmunotransferencia Northern tal como se describe en Materiales y Procedimientos. A. Concentraciones en el transcrito de ácido graso sintasa. B. Concentraciones en el transcrito en la glicerofosfato acil transferasa. C. Elemento regulador del esterol que se une a las concentraciones en el transcrito de proteína-1c. D. Concentraciones en el transcrito de hidroxi-metil-glutaril CoA sintasa. Las concentraciones en el transcrito se corrigieron para la carga de ARN utilizando una sonda de ADNc para la U1 pequeña ribonucleoproteína. Los superíndices en letra de la casilla inferior identifican grupos que son estadísticamente similares. Obsérvese los niveles inalterados de enzimas clave de la biosíntesis de triglicérido y colesterol en ratones 11\beta-HSD1^{-/-} que sugieren que esta dosis no se tenga en cuenta para los triglicéridos reducidos observados. En la realimentación SREBP-1c, FAS, GPAT y HMG-CoAR, se indujeron más rápidamente y/o marcadamente en ratones 11\beta-HSD-1^{-/-}, lo que implica que el hígado de 11\beta-HSD-1^{-/-} presenta mayor acción o sensibilidad de la insulina en términos de las series de reacciones lipogénicas.
Figura 4. Concentraciones en el transcrito de proteínas en la serie de reacciones de oxidación de ácidos grasos en hígados de animales campestres (barras negras) frente a animales 11\betaHSD-1^{-/-} (barras blancas) sometidos a manipulación de la dieta: AL; alimentados a voluntad, F; 24 en ayunas, 4RF; 24 h de ayuno con 4 h de realimentación y 24RF; 24 h de ayuno con 24 h de realimentación. Las concentraciones en el transcrito se analizaron por inmunotransferencia Northern como se describe en Materiales y Procedimientos. A. Concentraciones en el transcrito de carnitinapalmitoiltransferasa-I (CPT-I). B. Concentraciones en el transcrito de acil coA oxidasa. C. Desacoplamiento de las concentraciones en el transcrito de proteína-2. D. Concentraciones en el transcrito del receptor \alpha activado por el proliferador de peroxisoma. Las concentraciones en el transcrito se corrigieron para la carga de ARN utilizando una sonda de ADNc para la pequeña ribonucleoproteína U1. Los superíndices en letra de la casilla inferior identifican grupos que son estadísticamente similares. Obsérvese el aumento de expresión de las enzimas claves de la \beta-oxidación y su factor de transcripción que dirige PPARalfa en ratones 11\beta-HSD1^{-/-} alimentados a voluntad. Los datos sugieren que el aumento del metabolismo de triglicéridos subyace la reducción en concentraciones de plasma observada en ratones 11\beta-HSD-1^{-/-}.
Figura 5. Expresión del ARNm en A\alpha-fibrinógeno hepático en ratones 11\beta-HSD-1^{-/-}. Las concentraciones en el transcrito de A\alpha-fibrinógeno en hígados de animales campestres (barras negras) frente a animales 11\beta-HSD-1^{-/-} (barras blancas) que están: AL; alimentados a voluntad, F; 24 h en ayunas. Los superíndices en letra de la casilla inferior identifican grupos que son estadísticamente similares. Las concentraciones de transcrito se corrigieron para la carga de ARN utilizando una sonda de ADNc para la pequeña ribonucleoproteína U1. Obsérvese que el factor de riesgo cardiovascular independiente, A\alpha-fibrinógeno, las concentraciones de transcrito están reducidas en ratones 11\beta-HSD-1^{-}, indicando además un fenómeno de tipo "cardioprotector".
Figura 6. Efecto de la administración de carbenoxolona sobre los lípidos del plasma en ayunas en seres humanos sanos y pacientes con diabetes mellitus tipo 2. Se administró placebo a 6 hombres con diabetes mellitus de tipo 2 y a 6 referencias sanas (barras negras) y carbenoxolona (barras blancas) en un estudio de entrecruzamiento doble a ciegas al azar, como se conoce en la técnica. Se presentan las concentraciones de lípidos de plasma en ayunas.
Figura 7. Los efectos del estado de alimentación sobre las concentraciones de corticosterona en el plasma en ratones 11\beta-HSD-1^{-/-} y sobre el ARNm de tipo campestre 11\beta-HSD-1 y actividad. A. Concentraciones de corticosterona, B. ARNm de 11\beta-HSD-1 y C. Actividad de 11\betaHSD-1(porcentaje de conversión de corticosterona en 11-deshidrocorticosterona como se esboza en los Procedimientos Experimentales) en animales campestres (barras negras) frente a animales 11\beta-HSD-1^{-/-} (barras blancas) que están: AL; alimentados a discreción, F; 24 h en ayunas, 4RF; 24 h en ayunas con una realimentación a las 4 h y 24RF; 24 h en ayunas con una realimentación a las 24 h.
Figura 8. Los efectos del estado de la dieta y 11\beta-HSD-1modificado genéticamente y glucosa en el plasma, insulina y deposición dinámica de glucosa después de la administración de glucosa intraperitoneal. A. Glucosa en el plasma y B. insulina en el plasma en animales campestres (barras negras) frente a animales 11\beta-HSD-1^{-/-} (barras blancas) que están: AL; alimentados a voluntad, F; 24 h en ayunas, 4RF; 24 h en ayunas con realimentación a las 4 h y 24RF; 24 h en ayunas con realimentación a las 24 h. C. Dinámica de la deposición de glucosa en la carga de glucosa intraperitoneal (2 mg/g de peso corporal) después de 16 horas de ayuno en ratones naturales (círculo relleno) y 11\beta-HSD-1^{-/-} (casilla blanca).
Figura 9. Efecto de la administración de carbenoxolona sobre la tolerancia a la glucosa en ratas Zucker delgadas y obesas. Veh indica animales tratados con el vehículo y CBX indica animales tratados con carbenoxolona. Los datos son la media \pm SEM; * indica p<0,05 en comparación con los animales delgados y obesos en el mismo grupo de tratamiento; # indica p<0,05 en comparación con el grupo del mismo fenotipo tratado con el vehículo.
Figura 10. Efecto de la administración de carbenoxolona sobre el perfil lipídico en el plasma en ratas Zucker delgadas y obesas. Veh indica animales tratados con el vehículo y CBX indica animales tratados con carbenoxolona. NEFA son ácidos grasos no esterificados. Los datos son la media \pm SEM; * indica p<0,05 en comparación con los animales obesos en el mismo grupo de tratamiento; # indica p<0,05 en comparación con el grupo tratado con el vehículo del mismo fenotipo.
Figura 11. Efecto de la administración de carbenoxolona sobre la actividad de 11\beta-HSD1 en diferentes tejidos en ratas Zucker delgadas y obesas. Veh indica animales tratados con el vehículo y CBX indica animales tratados con carbenoxolona. La actividad de 11\beta-HSD se expresa como conversión en porcentaje de corticosterona en 11-deshidrocorticosterona. Los datos son la media \pm SEM; * indica p<0,05 en comparación con los animales delgados y obesos en el mismo grupo de tratamiento; # indica p<0,05 en comparación con el grupo del mismo fenotipo tratado con el vehículo.
Figura 12. Efecto de la administración de carbenoxolona sobre la actividad de 5\beta-reductasa hepática en ratas Zucker delgadas y obesas. Los datos son la media \pm SEM; * indica p<0,05 en comparación con los animales delgados y obesos en el mismo grupo de tratamiento; # indica p<0,05 en comparación con el grupo del mismo fenotipo tratado con el vehículo. La actividad de 5\beta-reductasa se expresa como conversión en porcentaje de corticosterona en 5\beta-tetrahidrocorticosterona.
Figura 13. Efecto de la administración de carbenoxolona sobre las características metabólicas y del eje hipotalámico-pituitario-suprarrenal en ratas Zucker delgadas y obesas. Veh indica animales tratados con el vehículo y CBX indica animales tratados con carbenoxolona. Los datos son la media \pm SEM; * indica p<0,05 en comparación con los animales delgados y obesos en el mismo grupo de tratamiento; # indica p<0,05 en comparación con el grupo del mismo fenotipo tratado con el vehículo.
Figura 14. Composición corporal y bioquímica basal en grupos de hombres con contraste en el contenido de grasa hepática. *p<0,05 entre los grupos, ***p<0,001.
Figura 15. Fenotipo metabólico de ratones con sobreexpresión transgénica de 11\beta-HSD1 en el hígado bajo el activador ApoE. Los paneles muestran los datos como media \pm SEM de 3 a 6 ratones silvestres (símbolos gris claro) y sobreexpresados (símbolos gris oscuro). El primer panel presenta la glucosa en el plasma después de la carga de glucosa intraperitoneal. El segundo panel presenta la insulina en el plasma en ayuno que fue superior en ratones sobreexpresores (**p<0,041). El tercer panel presenta los lípidos en el plasma, con mayores triglicéridos en ayunas (p<0,05) y el colesterol total (p=0,06) en sobreexpresores.
Figura 16. Ganancia de peso, absorción de alimento y temperatura rectal en ratones 11\beta-HSD1 -/- y campestres durante la alimentación prolongada rica en grasas. Los datos son la media \pm SEM de n=7-8 ratones por grupo para los campestres (símbolos gris claro; círculos) y 11\beta-HSD1 -/- (símbolos gris oscuro; cuadrados). El primer panel presenta la prevención de la ganancia de peso y obesidad en ratones 11\beta-HSD1 -/- (*p<0,05 frente a los campestres). El segundo panel presenta el aumento inicial, en lugar de la disminución, en el consumo de alimento en ratones 11\beta-HSD1 -/- (*p<0,05). El tercer panel presenta una temperatura rectal mayor (en grados centígrados) en ratones 11\beta-HSD1 -/- tanto en las condiciones de referencia como en las condiciones de alimentación rica en grasa (*p<0,05).
Figura 17. Ácidos grasos libres en el plasma (FFA) y leptina y ARNm adiposo subcutáneo para leptina, proteína 2 desacoplada (UCP2) y PPARgamma en ratones 11\beta-HSD1 -/- (símbolos negros) y referencias campestres (símbolos grises). Los datos son la media \pm SEM para 6 a 8 ratones por grupo. *indica 0,05 para las diferencias entre grupos.
Figura 18. Los ratones 11\beta-HSD1 -/- presentan regulación por aumento de ARNm de PPAR\gamma en macrófagos. PPAR\gamma es importante en la mediación de la absorción de macrófagos y la exportación de LDL-colesterol oxidado o acetilado, principalmente en la placa ateromatosa en las paredes de los vasos sanguíneos. El efecto dominante parece estar en la exportación del colesterol vía ABCA1 y transportadores relacionados. Los datos implican que la inhibición de 11\beta-HSD1 facilitaría la exportación del colesterol de los macrófagos en la placa, reduciendo la formación de células con espuma y su contribución a la aterogénesis. Los datos son la media \pm SEM para n=6 ratones por grupo para las referencias campestres (símbolos negros) y ratones 11\beta-HSD1 -/- (símbolos grises). *p<0,05 entre ratones campestres y modificados genéticamente. 11-DHC=11-deshidrocorticosterona, que regula por disminución PPAR\gamma en referencias campestres (p<0,05) pero no en ratones 11\beta-HSD1 -/- en los que 11-DHC no puede reactivarse para activar la corticosterona.
Figura 19. Resistencia a la insulina hepática y periférica en hombres con gran contenido de grasa en el hígado. La velocidad de aparición R_{a} de la glucosa endógena durante la última hora de hiperinsulinemia (240-300 min) en hombres con bajo y alto contenido de grasa en el hígado (LFAT), *p<0,05 para bajo frente a alto LFAT. b) concentraciones de FFA en el suero en la referencia antes del comienzo de la infusión de insulina (120 min) y durante la infusión de insulina (120-300 min.) en hombres con bajo y alto contenido en LFAT. *p<0,05, **p<0,02 para hombres con bajo frente a elevado LFAT.
Figura 20. Actividad hepática aumentada de 11\beta-HSD1 en el hígado de hombres con alto contenido de grasa en el hígado (LFAT). Concentraciones de cortisol en el suero durante la supresión de la secreción de cortisol endógeno por dexametasona y después del acetato de cortisona oral en hombres con alto frente a bajo LFAT. *p<0,05 para LFAT alto frente a bajo.
Figura 21. La inhibición de 11\beta-HSD1 protege contra los efectos glucocorticoides de los glucocorticoides hexógenos sintéticos. a) Beclometasona incubada con hígado de rata homogeneizado se convierte en 11-deshidrobeclometasona, lo que indica que el esteroide es un sustrato para 11\beta-HSD1. b) La aplicación tópica de beclometasona (BDP) o BDP con adición del ácido glicirretínico (GA) inhibidor de 11\beta-HSD provoca blanqueamiento de la piel en la piel humana sana in vivo, medido aquí como el área bajo la curva de respuesta a la dosis en unidades arbitrarias. GA atenúa el efecto de la beclometasona en este bioanálisis.
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Descripción detallada de la invención
A menos que se defina de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria tienen el mismo significado que entiende normalmente un experto ordinario en la materia (por ejemplo, en cultivo celular, genética molecular, química de ácidos nucleicos, técnicas de hibridación y bioquímica). Se utilizan técnicas normales para procedimientos moleculares, genéticos y bioquímicos (véase en general, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4ª ed., John Wiley & Sons, Inc. y procedimientos químicos.
Definiciones
Un "agente", tal como el utilizado en la presente memoria, es cualquier sustancia que presente el efecto deseado sobre la actividad de 11\beta-HSD1. Por lo tanto, el agente puede ser un compuesto químico, tal como una pequeña molécula o un compuesto orgánico complejo, una proteína, un anticuerpo o un montaje genético que actúe como concentración de ADN o ARNm en un organismo. El agente puede actuar directa o indirectamente, y puede modular la actividad de una sustancia que automodula la actividad de 11\beta-HSD1.
Un "perfil lipídico" es la concentración de lípidos presentes en la sangre. El perfil lipídico incluye normalmente el colesterol total, el colesterol lipoproteína de alta densidad (HDL), los triglicéridos y la lipoproteína de baja densidad (LDL) calculada. En la presente invención, un perfil lipídico comprende por lo menos la concentración de uno o más triglicéridos y la concentración de colesterol HDL.
Un perfil "ateroprotector" es un perfil que impide, contrarresta o mejora la patogénesis de la aterosclerosis.
El término "Expresión", como en la expresión génica, se utiliza en la presente memoria para referirse al procedimiento de transcripción y traducción de un gen para producir un producto génico, sea ARN o proteína. Por lo tanto, la inhibición de la expresión puede producirse en alguno o más de muchos niveles, incluyendo la transcripción, tratamiento después de la transcripción, traducción, modificación después de la traducción y similares. Los agentes que modulan la expresión génica, incluyendo la transcripción o la traducción, incluyen por ejemplo agentes que regulan por disminución genes endógenos modificados genéticamente; incluyendo los agentes con genes modificados genéticamente en células pluripotentes que dan lugar a todo o parte de un animal.
La inhibición de "síntesis o actividad" de 11\beta-HSD1 se refiere a la inhibición de 11\beta-HSD1 a nivel proteico, para impedir o regular por disminución la producción de la proteína, o por lo menos de una actividad biológica de la proteína una vez producida.
La expresión "Riesgo de cardiovasculopatía" se refiere al riesgo, medido según los factores de riesgo aceptados, al que se expone un animal, de padecer una o más dolencias o patologías cardiovasculares. La cardiopatología vascular (CDV) incluye la cardiopatía coronaria (CHD) y la apoplejía. La medición del propio riesgo es en gran medida estadística; en el contexto de la presente invención, la presencia o ausencia de factores que se ha aceptado que contribuyen a aumentar o disminuir el riesgo de CDV según los análisis estadísticos se considera indicativa de aumento o disminución de riesgo respectivamente.
Una cantidad farmacéuticamente eficaz es una cantidad de una composición que consigue el efecto deseado en un mamífero. La actual cantidad variará con numerosos factores, como es conocido por los expertos en la materia. Utilizando las directrices dadas en la presente memoria y el conocimiento de la técnica, la determinación de una cantidad farmacéuticamente eficaz está dentro de la experiencia ordinaria de un médico. Las cantidades farmacéuticamente eficaces diseñadas para aplicaciones específicas pueden estar envasadas como dosis unitarias para facilitar la administración.
11\beta hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 1
La 11\beta-HSD1 es conocida en la técnica (A. K. Agarwal, C. Monder, B. Eckstein, y P. C. White, Cloning and expression of rat cDNA encoding corticosteroid 11\beta-dehydrogenase. J. Biol. Chem. 264:18939-18943, 1989) y se expresa frecuentemente en el tejido adiposo blanco y en el hígado. La estructura de 11\beta-HSD1 y el gen humano que la codifica son conocidos (GenBank NM_005525.1 GI:5031764). Los clones de ADNc humanos que codifican la 11\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo I se aislaron de un banco de ADNc de testículos por hibridación con el clon de ADNc de 11-HSD de rata aislado anteriormente (Tannin, et al., J. Biol. Chem. 266: 16653-16658, 1991). El ADNc contenía un marco de lectura abierto de 876 nucleótidos, que predijo una proteína de 292 aminoácidos. La secuencia era 77% idéntica a la concentración de aminoácidos en la rata 11\beta-HSD. Mediante la hibridación del ADNc humano con un panel de células híbridas humanas/de hámster (72) se localizó el gen 11\beta-HSD1 en el cromosoma 1. La localización se confirmó aislando el gen de un banco específico para el cromosoma 1 utilizando el ADNc como sonda. El gen está constituido por 6 exones y es por lo menos de 9 kb de longitud.
Agentes que modulan la expresión de 11\beta-HSD1
La modulación de la expresión génica es conocida por los expertos en la materia que puede conseguirse de numerosas maneras in vivo e in vitro. Las técnicas complementarias así como la manipulación genética directa son conocidas para su utilización en la modulación de la expresión génica. La invención incluye por lo tanto la utilización de ácidos nucleicos complementarios, que pueden incorporar nucleótidos campestres o modificados, o ambos, ribozimas, incluyendo ribozimas de cabeza de martillo, modificación génica tal como por recombinación homóloga y otras técnicas para reducir los niveles de expresión génica.
Los agentes de ácido nucleico pueden producirse y expresarse según las técnicas conocidas en la materia. Los ácidos nucleicos que codifican agentes deseados pueden incorporarse en vectores para manipulación y expresión. Tal como se utiliza en la presente memoria, vector (o plásmido) se refiere a elementos discretos que se utilizan para introducir ADN heterólogos en células para la expresión o replicación del mismo. La selección y utilización de dichos vehículos están comprendidas dentro de la experiencia del especialista. Muchos vectores están disponibles, y la selección del vector apropiado dependerá de la utilización deseada del vector, es decir, si debe utilizarse para la ampliación del ADN o para la expresión del ADN, el tamaño del ADN que debe insertarse en el vector y la célula hospedadora que debe transformarse con el vector. Cada vector contiene varios componentes dependiendo de su función (ampliación del ADN o expresión de ADN) y la célula hospedadora para la que es compatible. Los componentes del vector incluyen generalmente, pero no se limitan a, uno o más de los siguientes: un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un activador, una secuencia de terminación de la transcripción y una secuencia señal.
Tanto los vectores de expresión como de clonación contienen generalmente la secuencia de ácidos nucleicos que permiten al vector replicarse en una o más células hospedadoras seleccionadas. Por lo general en la clonación de vectores, esta secuencia es la que permite al vector replicarse independientemente del ADN cromosómico del hospedador, e incluye los orígenes de la replicación o de las secuencias que se replican de manera autónoma. Tales secuencias son bien conocidas para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de la replicación en el plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2m es adecuado para levaduras y varios originales víricos (por ejemplo, SV 40, polioma, adenovirus) son útiles para los vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el origen del componente de la replicación no es necesario para los vectores de expresión del mamífero independientemente de que se utilicen en células competentes de mamífero para la replicación del ADN a alto nivel, tales como las células COS.
La mayoría de los vectores de expresión son vectores lanzadera, es decir, son capaces de replicación en por lo menos una clase de organismos pero pueden transferirse a otra clase de organismos para la expresión. Por ejemplo un vector se clona en E. coli y a continuación el mismo vector se transfecta en células de levadura o de mamífero aun cuando no sea capaz de replicarse independientemente del cromosoma de la célula hospedadora. El ADN puede también replicarse por inserción en el genoma del hospedador.
De manera ventajosa, un vector de expresión y clonación puede contener un gen de selección denominado también marcador seleccionable. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o el crecimiento de las células hospedadoras transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospedadoras no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que comunican resistencia a antibióticos y a otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, deficiencias auxótrofas del complemento o suministran nutrientes químicos no disponibles en el medio complejo.
En cuanto a un marcador génico selectivo apropiado para la levadura, puede utilizarse cualquier marcador génico que facilite la selección para los transformantes debida a la expresión fenotípica del gen marcador. Los marcadores adecuados para levadura son, por ejemplo, los que comunican resistencia a antibióticos G418, higromicina o bleomicina, o proporcionan prototrofía en un mutante auxótrofo de levadura, por ejemplo el gen URA3, LEU2, LYS2, TRP1 o HIS3.
Como la replicación de los vectores se realiza de manera conveniente en E. coli, un marcador génico de E. coli y un origen de replicación de E. coli se incluyen con ventaja. Éstos pueden obtenerse a partir de plásmidos de E. coli, tal como pBR322, el vector Bluescript® o un plásmido pUC, por ejemplo pUC 18 o pCU19, que contiene tanto el origen de la replicación de E. coli como el marcador genético de E. coli que comunica resistencia a los antibióticos, tal como la ampicilina.
Los marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son aquellos que permiten la identificación de células que han sido transformadas con el ácido nucleico en cuestión, tales como la dihidrofolato reductasa (DHFR, con resistencia al metotrexato), timidina cinasa, o los genes que comunican resistencia a G418 o la higromicina. Se colocan transformantes de células de mamífero bajo la presión de selección a la que solamente aquellos transformantes que han absorbido y son los que expresan al marcador se adoptan únicamente para sobrevivir. En el caso de una DHFR o marcador de la glutamina sintasa (GS), puede imponerse la presión de selección cultivando los transformantes en condiciones en las que la presión aumente progresivamente, conduciendo de este modo a la ampliación (en su zona de integración en el cromosoma) tanto del gen de selección como del ADN ligado.
Los vectores de expresión y clonación contienen normalmente un activador que es reconocido por el organismo del hospedador y está operativamente ligado al ácido nucleico deseado. Dicho activador puede ser inducible o constitutivo. Los activadores pueden estar operativamente unidos al ácido nucleico en cuestión eliminando el activador del ADN de origen, por ejemplo por digestión con enzima de restricción e insertando la secuencia del activador aislada en el vector. La expresión "operativamente unido" se refiere a la yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera deseada. Una secuencia de referencia "operativamente ligada" a una secuencia de codificación está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se consigue en condiciones compatibles con las secuencias de referencia.
Los activadores adecuados para su utilización en hospedadores procarióticos incluyen, por ejemplo, los sistemas activadores de \beta-lactamasa y lactosa, la fosfatasa alcalina, el sistema activador de triptófano (trp) y activadores híbridos tales como el activador tac. Sus secuencias nucleotídicas han sido publicadas, permitiendo de este modo al investigador experto operativamente ligarlas en vectores requeridos, utilizando conectores o adaptadores para suministrar algunas zonas de restricción requeridas. Los activadores para su utilización en sistemas bacterianos contendrán también generalmente una secuencia Shine-Delgarno.
Los vectores de expresión preferidos son los vectores de expresión bacterianos que comprenden un activador de un bacteriófago tal como phagex o T7 que es capaz de funcionar en las bacterias. En uno de los sistemas de expresión más ampliamente utilizados, el ácido nucleico que codifica la proteína de fusión puede ser transcrito en el vector por la T7 ARN polimerasa (73). En la cepa del hospedador BL21(DE3) de E. coli, utilizada junto con los vectores pET, la T7 ARN polimerasa se produce a partir del \lambda-lisógeno DE3 en la bacteria hospedadora, y su expresión está bajo el control del activador lac UV5 inducible en IPTG. Este sistema se ha ampliado con éxito para la sobreproducción de muchas proteínas. Alternativamente, el gen de polimerasa puede introducirse en un fago lambda por infección con un int-fago tal como el fago CE6 que está disponible en el mercado (Novagen, Madison, UEA). Otros vectores incluyen vectores que contienen el activador lambda PL tales como PLEX (Invitrogen, NL), vectores que contienen los activadores trc tales como pTrcHisXpressTm (Invitrogen) o pTrc99 (Pharmacia Biotech, SE) o los vectores que contienen el activador tac tales como pKK223-3 (Pharmacia Biotech) o PMAL (New England Biolabs, MA, UEA).
Las secuencias activadoras adecuadas para su utilización con hospedadores de levadura puede regularse o constituirse y proceden preferentemente de un gen de levadura muy expresado, especialmente un gen de Saccharomyces cerevisiae. Por lo tanto, pueden utilizarse el activador del gen TRP1, del gen ADHI o ADHII, el gen de la fosfatasa ácida (PH05), un activador de la levadura que aparea genes de feromona que codifican el factor a o \alpha o un activador procedente de un gen que codifica una enzima glucolítica tal como el activador de la enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAP), 3-fosfo glicerato cinasa (PGK), hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glocusa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosa fosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa o genes de glucocinasa, el gen GAL 4 de S. cerevisiae, el gen nmt 1 de S. pombe o un activador del gen de la proteína de fijación a TATA (TBP). Además, es posible utilizar activadores híbridos que comprenden las secuencias de activación corriente arriba (UAS) de un gen de levadura y los elementos del activador corriente abajo que incluyen un casete con función aI TATA y otro gen de levadura, por ejemplo un activador híbrido que incluye el/los UAS(s) del gen PH05 de levadura y los elementos del activador corriente arriba incluyendo una función del casete aI TATA del gen GAP de levadura (activador del híbrido PH05-GAP). Un activador PHOS constitutivo adecuado es por ejemplo, un activador PH05 fosfatasa del ácido acortado desprovisto de los elementos reguladores corriente arriba (UAS) tal como el elemento activador PH05 (-173) comenzando en el nucleótido -173 y finalizando en el nucleótido -9 del gen PH05.
La transcripción génica a partir de vectores en mamíferos hospedadores puede controlarse mediante los activadores procedentes de los genomas de virus tales como poliomavirus, adenovirus, virus de la viruela, virus del papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus (CMV), un retrovirus y el virus 40 de simios (SV40), de activadores heterólogos de mamíferos tales como el activador actina o un activador muy potente, por ejemplo un activador de la proteína ribosómica.
La transcripción de ácidos nucleicos por eucariotas superiores puede incrementarse insertando una secuencia potenciadora en el vector. Los potenciadores son relativamente independientes en orientación y posición. Se conocen muchas secuencias potenciadoras en genes de mamífero (por ejemplo elastasa y globina). Sin embargo, por lo general se empleará un potenciador en un virus de célula eucariótica. Los ejemplos incluyen el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de la replicación (100 a 270 bp) y el potenciador activador precoz CMV. El potenciador puede cortarse y empalmarse en el vector en una posición 5' ó 3' a la secuencia de codificación, pero está preferentemente situado en la posición 5' del activador.
Con ventaja, un vector de expresión eucariótico puede comprender una zona de referencia del locus (LCR). Las LCR son capaces de dirigir la expresión independiente de la zona de integración de alto nivel de los transgenes integrados en la cromatina de la célula hospedadora, que es de importancia especialmente cuando el gen ha de expresarse en el contexto de una estirpe celular eucariótica transfectada permanentemente en la que la integración cromosómica del vector se ha producido, en vectores diseñados para aplicación en terapia génica o en animales transfectados.
Los vectores de expresión eucariótica contienen también secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar en ARNm. Dichas secuencias están normalmente disponibles en las zonas 5' y 3' no traducidas de los ADN o ADNc eucarióticos o víricos. Estas zonas contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la parte no traducida del ARNm.
Un vector de expresión incluye cualquier vector capaz de expresar ácidos nucleicos que estén operativamente unidos con secuencias reguladoras, tal como las zonas de activador, que son capaces de la expresión de dichos ADN. Por lo tanto, un vector de expresión se refiere a un ADN recombinante o montaje de ARN, tal como un plásmido, un fago, virus recombinante u otro vector, que en la introducción en la célula hospedadora apropiada, produce la expresión del ADN clonado. Los vectores de expresión apropiados son bien conocidos por los expertos ordinarios en la materia e incluyen los que son replicables en células eucarióticas y/o procarióticas y los que permanecen episómicos o aquellos que se integran en el genoma de la célula hospedadora.
La construcción de vectores según la invención emplea técnicas de ligadura convencionales. Los plásmidos aislados o los fragmentos de ADN se escinden, se ajustan y se vuelven a ligar en la forma deseada para generar los plásmidos requeridos. Si se desea, el análisis para confirmar las secuencias correctas en los plásmidos construidos se realiza de modo conocido. Los métodos adecuados para construir vectores de expresión, preparar transcritos in vitro, introducir ADN en las células hospedadoras y realizar análisis para evaluar la expresión y función son conocidos por los expertos en la materia. La presencia, la amplificación y/o la expresión del gen pueden medirse en una muestra directamente, por ejemplo, mediante transferencia Southern convencional. La transferencia Northern para cuantificar la transcripción del ARNm, la inmunotransferencia de manchas (análisis de ADN o ARN) o la hibridación in situ, utilizando una sonda marcada de manera apropiada, que puede basarse en una secuencia proporcionada en la presente memoria. Los expertos en la materia contemplan cómo pueden modificarse estos procedimientos, si se desea.
Vectores como los descritos anteriormente pueden utilizarse en técnicas de terapia génica y aplicarse al tratamiento de enfermedades. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico que codifica una molécula complementaria según la presente invención puede insertarse en un vector vírico o no vírico diseñado para la administración de ácidos nucleicos a las células de un paciente, ya sea ex vivo o in vivo.
Ejemplos de vectores víricos incluyen vectores de adenovirus, vectores de virus adenoasociados, vectores retrovíricos. Ejemplos de vectores no víricos incluyen el ADN desnudo, partículas de ADN condensadas, vectores de tipo liposoma que pueden incluir un resto de direccionamiento y, si es aplicable, péptidos de escape procedentes de virus y ADN acomplejado con restos de direccionamiento tal como anticuerpos o ligandos de la superficie celular, que son preferentemente interiorizados por la célula diana.
Los agentes que son capaces de modular la actividad de 11\beta-HSD1 son bien conocidos en la materia. Monder, C. White PC. 11 1\beta-Hydroxysteroid dehydrogenase. Vitamins and Hormones 1993; 47: 187-271, proporcionó una lista extensa de dichos inhibidores en 1993. Esta lista, proporcionada como Tabla IV en la presente memoria, se incorpora a la presente memoria como referencia. Especialmente preferidos son los inhibidores de la actividad de reductasa de 11\beta-HSD1, que incluyen 11-oxoprogesterona, 3\alpha,17,21-trihidroxi-5\beta-pregnan-3-ona, 21-hidroxi-pregn-4-eno-3,11,20-triona, androst-4-eno-3,11,20-triona y 3\beta-hidroxiandrost-5-en-17-ona.
Más inhibidores y modos de administración de los mismos, son conocidos por ejemplo en Walker et al., "Carbenoxolone Increases Hepatic Insulin Sensitivity in Man: A Novel Role for 11-oxosteroid Reductase in Enhancing Glucocorticoid Receptor Activation", J. Clin. Endocrinology and Metabolism 80 (11): 3155-59 (1995); Gómez-Sánchez et al., "Central hypertensinogenic effects of glycyrrhizic acid and carbenoxolone", Am. J. Physiol. 263 (6 Pt 1): E1125-E1130 (1992) que demuestran que el regalíz, el ácido glicirrícico y la carbenoxolona son inhibidores conocidos, así como la infusión del ácido glicirrícico y carbenoxolona en el ventrículo lateral del cerebro de la rata a dosis inferiores a las que presenta un efecto cuando se infunde por vía subcutánea, produce hipertensión, demostrando que dichos compuestos fueron administrados por vía subcutánea, oral o por infusión; véase también Whorwood et al., "Liquorice inhibits 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase Messenger ribonucleic acid levels and potentiates glucocorticoid hormone action", Endocrinology 132 (6): 2287-92 (1993). Aun más todavía, Homma et al., "A Novel 11\beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase Inhibitor Container in Saiboku-To, a Herbal Remedy for Steroid-dependent Bronchial Asthma", J. Pharm. Pharmacol. 46: 305-309 (1994), Zhang et al., "Inhibition of 11\beta-Hydroxysteroid Dehydrogenase Obtained from Guinea Pig Kidney by Furosemide, Naringenin and Some Other Compounds", J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 49(1):81-85 (1994), y Lee et al., "Grapefruit juice and its flavenoids inhibit 11\beta-hydroxysteroid dehydrogenase", Clin. Pharmacol. Ther. 59:62-71 (1996), describen aún más inhibidores que pueden administrarse de maneras conocidas (tanto en términos de dosis como de vías de administración), tal como flavonoides, que "están comercializados en forma de comprimido en establecimientos de alimentos sanitarios y farmacias" y hierbas o constituyentes de hierbas. Además, Morris et al., "Endogenous 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase inhibitors and their role in glucocorticoid Na+ retention and hipertensión", Endocr. Res. 22(4):793-801 (1996) describen metabolitos de progesterona como inhibidores de 11\beta-HSD1, y la progesterona es también una sustancia que puede ser administrada, tanto desde el punto de vista de la dosis como de las vías de administración, sin dificultad por un experto en la materia.
Los agentes según la invención pueden además ser anticuerpos. Los anticuerpos, utilizados en la presente memoria, se refieren a anticuerpos completos o a fragmentos de anticuerpo capaces de unirse a una diana seleccionada, e incluyen Fv, ScFv, Fab' y F(ab')_{2}, anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos modificados genéticamente incluyendo anticuerpos híbridos humanizados, e injertados por CDR y anticuerpos seleccionados de manera artificial producidos utilizando la presentación del fago o técnicas alternativas. Los fragmentos pequeños, tales como Fv y ScFv, poseen propiedades ventajosas para aplicaciones en diagnóstico y terapéuticas teniendo en cuenta su pequeño tamaño y consiguiente distribución superior en el tejido.
Los anticuerpos según la invención están especialmente indicados para aplicaciones en diagnóstico y terapéuticas. Por consiguiente, pueden ser anticuerpos alterados que comprenden una proteína efectora tal como una toxina o una etiqueta. Son especialmente preferidos los marcadores que permiten el diagnóstico por imagen de la distribución del anticuerpo in vivo. Dichos marcadores pueden ser marcadores radioactivos o marcadores radioopacos, tal como las partículas metálicas, que son fácilmente observables dentro del cuerpo de un paciente. Además, pueden ser marcadores fluorescentes u otros marcadores que sean observables en muestras de tejido extraídas de los pacientes.
Para mejorar los anticuerpos de la invención puede utilizarse tecnología de ADN recombinante. Por lo tanto, pueden construirse anticuerpos híbridos con objeto de disminuir la inmunogenicidad de los mismos en aplicaciones para diagnóstico o terapéuticas. Además, la inmunogenicidad puede minimizarse humanizando los anticuerpos por injerto por CDR [véase la patente europea 0 239 400 (Winter)] y, opcionalmente, la modificación del marco de trabajo [patente europea 0 239 400; estudiada en la solicitud de patente internacional WO 90/07861 (Protein Design Labs)].
Los anticuerpos según la invención pueden extraerse del suero del animal, o, en el caso de los anticuerpos monoclonales o de los fragmentos de los mismos, producirse en cultivo celular. Puede utilizarse la tecnología del ADN recombinante para producir los anticuerpos según el procedimiento establecido, en cultivo de células bacterianas o prefe-
rentemente de mamífero. El sistema de cultivo celular seleccionado preferentemente segrega el anticuerpo producto.
Por consiguiente, la presente invención incluye un procedimiento para la producción de un anticuerpo según la invención que comprende cultivar un hospedador, por ejemplo E. coli o una célula de mamífero, que se ha transformado con un vector híbrido que comprende un casete de expresión que comprende un activador operativamente unido a una primera secuencia de ADN que codifica un péptido señal unido en el propio marco de lectura a una segunda secuencia de ADN que codifica dicha proteína y aislar dicha proteína.
La multiplicación de células de hibridoma o de células de hospedador de mamífero in vitro se realiza en el medio de cultivo adecuado, que son el medio habitual de cultivo normal, por ejemplo medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) o medio RPMI 1640, rellenado opcionalmente por un suero de mamífero, por ejemplo, suero de ternero fetal, o elementos traza y suplementos de mantenimiento del crecimiento, por ejemplo células alimentadoras tales como las células de exudado de peritoneo de ratón normales, células de bazo, macrófagos de médula ósea, 2-aminoetanol, insulina, transferrina, lipoproteína de baja densidad, ácido oleico o similares. La multiplicación de las células hospedadoras que son células bacterianas o células de levadura se realiza asimismo en un medio de cultivo adecuado conocido en la técnica, por ejemplo, para bacterias en medio LB, NZCYM, NZYM, NZM, caldo de cultivo Terrific, SOB, SOC, 2 \times YT o medio mínimo M9 y para levadura en medio YPD, YEPD, medio mínimo o medio de desprendimiento mínimo completo.
La producción in vitro proporciona preparaciones de anticuerpos relativamente puros y permite aumentar a escala para proporcionar grandes cantidades de los anticuerpos deseados. Las técnicas para cultivo de células bacterianas, levaduras o células de mamífero son conocidas en la técnica e incluyen el cultivo en suspensión homogénea, por ejemplo, en un reactor de transporte con aire o en un reactor con agitador en continuo, o en cultivo celular inmovilizado u ocluido, por ejemplo en fibras huecas, microcápsulas o microlechos de agarosa o cartuchos de cerámica.
Pueden obtenerse también grandes cantidades de los anticuerpos deseados multiplicando las células de mamífero in vivo. Con este objeto, células de hibridoma que producen los anticuerpos deseados se inyectan en mamíferos histocompatibles para producir el crecimiento de tumores que producen anticuerpos. Opcionalmente, los mamíferos se ceban con un hidrocarburo, especialmente aceites minerales tal como pristano (tetrametil-pentadecano), antes de la inyección. Después de una a tres semanas, los anticuerpos se aíslan de los fluidos corporales de estos mamíferos. Por ejemplo, las células de hibridoma obtenidas por fusión de células de mieloma adecuadas con células de bazo que producen anticuerpos de ratones Balb/c o células transfectadas procedentes de la estirpe celular Sp2/0 de hibridoma que producen los anticuerpos deseados se inyecten por vía intraperitoneal en ratones Balb/c opcionalmente pretratados con pristano, y, después de una a dos semanas, se extrae el ácido ascítico de los animales.
Lo anterior, y otras técnicas, se exponen en, por ejemplo, Kohler y Milstein, (1975) Nature 256:495-497; US 4.376.110; Harlow y Lane, Antibodies: a Laboratory Manual, (1988) Cold Spring Harbor. Las técnicas para la preparación de moléculas de anticuerpo recombinantes se describen en las referencias anteriores y también, por ejemplo, en los documentos EP 0623679; EP 0368684 y EP 0436597.
En los sobrenadantes del cultivo celular se identifican los anticuerpos deseados, preferentemente por tinción inmunofluorescente de las células que expresan el anticuerpo deseado por inmunoelectrotransferencia, mediante un inmunoanálisis enzimático, por ejemplo, un ensayo en sandwich, un ensayo de puntos o un radioinmunoanálisis.
Para el aislamiento de los anticuerpos, pueden concentrarse las inmunoglobulinas en los sobrenadantes del cultivo o en el fluido ascítico, por ejemplo por precipitación con sulfato amónico, diálisis frente al material higroscópico tales como polietilenglicol, filtración a través de membranas selectivas o similares. Si es necesario y/o se desea, los anticuerpos se purifican por los procedimientos de la cromatografía habitual, por ejemplo filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía sobre DEAE-celulosa y/o cromatografía de (inmuno-)afinidad, por ejemplo, cromatografía por afinidad con una molécula de 11\beta-HSD1 o con la Proteína-A.
La invención se refiere además a las células de hibridoma que segregan anticuerpos monoclonales de la invención. Las células de hibridoma preferidas de la invención son genéticamente estables, anticuerpos monoclonales segregadores de la invención o la especificidad deseada y pueden activarse en cultivos muy congelados mediante descongelación y reclonación.
La invención se refiere también a un procedimiento para la preparación de una estirpe celular de hibridoma que segrega anticuerpos monoclonales dirigidos contra una molécula de 11\beta-HSD1, caracterizada porque un mamífero adecuado, por ejemplo un ratón Balb/c, se inmuniza con una molécula 11\beta-HSD1 purificada, un portador antigénico que contiene una molécula 11\beta-HSD1 purificada o con células que llevan 11\beta-HSD1, las células productoras de anticuerpo del mamífero inmunizado se fusionan con las células de una estirpe celular de mieloma adecuada, las células híbridas obtenidas en la fusión se clonan y se seleccionan los clones de las células que segregan los anticuerpos deseados. Por ejemplo, las células de bazo de ratones Balb/c inmunizadas con células que llevan 11\beta-HSD1 se fusionan con células de la estirpe celular de mieloma PAI o la estirpe celular de mieloma Sp2/0-Ag14, las células híbridas obtenidas se segregan para la secreción de los anticuerpos deseados, y se clonan las células positivas de hibridoma.
Se prefiere un procedimiento para la preparación de una estirpe celular de hibridoma, caracterizado porque los ratones Balb/c se inmunizan inyectando por vía subcutánea y/o intraperitoneal entre 10 y 107 y 108 células de origen de tumor humano que expresan 11\beta-HSD1 que contiene un adyuvante adecuado varias veces, por ejemplo cuatro a seis veces, durante varios meses, por ejemplo entre dos y cuatro meses, y células de bazo de los ratones inmunizados se toman dos a cuatro días después de la última inyección y se fusionan con células de la estirpe celular de mieloma PAI en presencia de un activador de fusión, preferentemente polietilenglicol. Preferentemente las células de mieloma se fusionan con un exceso de tres a veinte veces de células de bazo procedentes de ratones inmunizados en una solución que contiene aproximadamente 30% a aproximadamente 50% de polietilenglicol de un peso molecular alrededor de 4.000. Después de la fusión las células se expanden en un medio de cultivo adecuado descrito en la presente memoria anteriormente, enriquecido con un medio de selección, por ejemplo medio HAT, a intervalos regulares.
La invención también proporciona anticuerpos intracelulares, capaces de operar dentro de una célula, para la regulación de concentraciones de 11\beta-HSD1 por vía intracelular. Los anticuerpos intracelulares son con ventaja anticuerpos scFv, expresados intracelularmente en vectores de expresión como es conocido en la técnica.
Se ha demostrado que los anticuerpos intracelulares o intracuerpos funcionan en el reconocimiento del antígeno en las células de organismos superiores (estudiado en Cattaneo, A. y Biocca, S. (1997) Intracelular Antibodies: Development and Applications. Landes y Springer-Verlag). Esta interacción puede influir en la función de las proteínas celulares que se han logrado inhibir en el citoplasma, el núcleo o en la serie de reacciones secretoras. Esta eficacia se ha demostrado para la resistencia vírica en la biotecnología de plantas (Tavladoraki, P. et al. (1993) Nature 366:469-472) y se han descrito varias aplicaciones de anticuerpos intracelulares que se unen a proteínas víricas VIH (Mhashilkar, A.M., et al. (1995) EMBO J 14: 1542-51; Duan, L. y Pomerantz, R.J. (1994) Nucleic Acids Res. 22: 5433-8; Maciejewski, J.P., et al. (1995) Nat. Med. 1: 667-73; Levy-Mintz, P., et al. (1996) J. Virol. 70: 8821-8832) y a productos oncogénicos (Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P. & Cattaneo, A. (1993) Biochem. Biophys Res. Commun. 197: 422-7; Biocca, S., Pierandrei-Amaldi, P., Campioni, N. y Cattaneo, A. (1994) Biotechnology (N Y) 12: 396-9; Cochet, O., et al. (1998) Cancer Res. 58: 1170-6).
Lipidograma ateroprotector
Se ha implicado a los glucocorticoides en el desarrollo de varias metabolopatías halladas en el síndrome metabólico. La importancia del metabolismo prerreceptor de los glucocorticoides es evidente para el sistema receptor mineralcorticoide 11\beta-HSD2 en el nefrón distal (7, 8). Cualquier función biológica de 11\beta-HSD1, que se ha propuesto para regenerar corticoides activos en zonas de gran expresión tal como el hígado, ha sido confusa. La presente invención demuestra que la reducción en las concentraciones de 11\beta-HSD1 favorece a un lípido del plasma "cardioprotector" y el fenotipo lipoproteico, por lo menos en parte debido a cambios en la expresión de las enzimas clave de los factores de transcripción en el hígado.
Dependiendo del estado de la dieta pueden definirse distintas respuestas fenotípicas en ratones 11-\betaHSD-1^{-/-}. Ratones 11\betaHSD-1^{-/-} alimentados a discreción presentan un perfil lipídico "favorable" resultante de un aumento aparente en el impulso oxidativo hepático y concentraciones reducidas de varios marcadores asociados al aumento del riesgo cardiovascular. Ratones 11\betaHSD-1^{-/-} en ayunas presentan respuestas inducibles por glucocorticoides atenuados coherentes con lo observado en su metabolismo de carbohidratos (16). La realimentación después del ayuno indica que los ratones 11\betaHSD-1^{-/-} han aumentado la sensibilidad a la insulina hepática. Unas características metabólicas ventajosas están apoyadas también por la demostración del control glicérico mejorado en los ratones 11\betaHSD-1^{-/-}.
En el estado alimentado a discreción, los ratones 11\betaHSD-1^{-/-} presentan varias propiedades de un lípido "cardioprotector" y fenotipo de lipoproteína. Las concentraciones de triglicéridos en el plasma se reducen y el colesterol HDL potencialmente beneficioso se eleva. Además, los animales 11\betaHSD-1^{-/-} han reducido la apoCIII del suero. La apoCIII aumenta los triglicéridos en el plasma inhibiendo la lipólisis hepática (38) e interfiriendo con la transferencia de triglicéridos en el hígado (34, 39). La reducción de apoCIII contribuiría en sí misma, por consiguiente, a triglicéridos reducidos. De hecho, la apoCIII se correlaciona positivamente con el riesgo de la cardiopatía vascular (40). De manera análoga, ninguno de los ratones presentaba aumento de concentraciones de transcrito apoAI, coherentes con el aumento de colesterol HDL en el plasma. La apoAI es el principal componente del HDL y está asociado negativamente con el riesgo cardiovascular (35).
Es improbable que la disminución de la síntesis de triglicérido o colesterol contribuya a este fenotipo ya que no se afectó la expresión de las enzimas lipógenas que limitan la velocidad clave y las colesterógenas, lo que es coherente con el descubrimiento de que el factor de transcripción lipógeno SREBP1c ARNm se mantuvo también en niveles naturales. En cambio, las enzimas claves de la oxidación de ácido graso hepático se elevaron en los ratones deficientes en 11\betaHSD-1, compatible con el catabolismo hepático aumentado de los triglicéridos como mecanismo que dirige los cambios observados en el plasma.
En cambio, los ratones que sobreexpresan 11\betaHSD-1 presentan síntomas asociados al síndrome metabólico. Se han creado ratones transgénicos que expresan 11\betaHSD-1 bajo el control del activador (49) de la proteína de fijación del ácido graso de adipocitos específico para la adiposis (aP2). El trancrito obtenido del transgén se expresó igualmente en tejido adiposo procedente del tejido abdominal subcutáneo, epididímico, mesentérico y de los depósitos del tejido adiposo marrón interescapular (BAT) pero estuvo ausente en el cerebro, hígado, músculo esquelético y riñón de ratones transgénicos (Tg). Los niveles de sobreexpresión de 11\betaHSD-1 fueron similares a los observados en pacientes humanos que padecen del síndrome metabólico. Estos ratones han aumentado los niveles de adiposis de la corticosterona y desarrollaron obesidad visceral que fue exagerada por una dieta rica en grasas. Los ratones también presentaban diabetes resistente a la insulina pronunciada, hiperlipidemia, y, sorprendentemente, hiperfagia a pesar de la hiperleptinemia.
Asimismo, se han creado ratones que sobreexpresan 11\betaHSD-1bajo el control del activador Apo-E específico del hígado para estudiar la sobreexpresión de 11\betaHSD-1en el hígado. Estos ratones presentan por lo menos 5 veces más actividad 11âHSD-1en el hígado que los ratones campestres. El análisis presenta ratones macho que tienen tolerancia a la glucosa normal, lo que sugiere que 11\betaHSD-1 no es limitativo para la homeostasis de la glucosa en las condiciones de referencia. Sin embargo, los animales transgénicos presentan concentraciones aumentadas de insulina en el plasma (\sim50%), triglicéridos en el plasma elevados (\sim2 veces) y colesterol total en el plasma aumentado (20%) en gran parte atribuible a la fracción no de HDL (HDL-colesterol/total = 0,62 transgénico frente a 0,83 campestre). Los análisis histológicos ponen de manifiesto la acumulación de lípido en los hepatocitos de ratones transgénicos, lo que sugiere que el metabolismo de los lípidos puede ser sensible de manera diferenciada a la regeneración de GC aumentada en el hígado. Además, el peso corporal de ratones transgénicos macho es modestamente elevado en comparación con las camadas campestres (6-8%) evidente en \sim10 semanas de vida. Los datos indican que el aumento selectivo en el hígado de 11\betaHSD-1 reduce modestamente la sensibilidad a la insulina, eleva de manera desventajosa los lípidos en el plasma y produce acumulación hepática de lípidos, manifestando de este modo alguno, pero no todos los aspectos, del síndrome metabólico. La interacción entre el hígado y los niveles por GC de adiposis, determinados por 11\betaHSD-1local, parecen cruciales en la determinación de las manifestaciones del Síndrome Metabólico.
PPAR\alpha
El aumento del catabolismo de los triglicéridos observado en ratones 11\betaHSD-1^{-/-} puede provenir de concentraciones elevadas de PPAR\alpha; lo que es coherente con los informes de que los genes de la oxidación de ácidos grasos CPT-I (31), ACO (32), así como UCP-2 (30, 33) son dianas para PPAR\alpha en el hígado.
De hecho, numerosos cambios observados en los ratones 11\betaHSD-1^{-/-} sugieren que elevadas concentraciones de PPAR\alpha pueden desempeñar una función operativa en el fenotipo ateroprotector. Por lo tanto, la activación de PPAR\alpha por ligandos de fibrato reduce los triglicéridos en el plasma y reprime la expresión de apoCIII (23) y de A\alpha-fibrinógeno (41). La reducción del 25% en las concentraciones de transcrito A\alpha-fibrinógeno observadas en ratones 11\betaHSD-1^{-/-} es similar al efecto de la administración de fibrato y es coherente con este transcrito siendo PPAR\alpha reprimible (41). Ya que los cambios en las concentraciones de A\alpha-transcrito siguen íntimamente cambios en las concentraciones en el plasma (41) los autores deducen que las concentraciones en el transcrito reducidas observadas en la presente memoria contribuirían probablemente al perfil ateroprotector global del ratón 11\betaHSD-1^{-/-}. Las concentraciones altas de fibrinógeno están correlacionadas independientemente con el aumento de riesgo cardiovascular (37). Puede decirse, por consiguiente, que los animales 11\betaHSD-1^{-/-} simulan en parte el fenotipo de un animal tratado con fibrato.
Los ratones deficientes en 11\betaHSD-1presentan aparentemente concentraciones de glucocorticoides intracelulares inferiores y acción en la cara de concentraciones basales elevadas de corticosterona en el plasma y después de estrés (por ejemplo en ayunas) (16). Esto subraya la importancia de la regeneración de cortisona de la 11-deshidrocorticosterona en la determinación de los efectos glucocorticoides intracelulares. La falta de inducción de PPAR\alpha con el ayuno es compatible con esta idea, pero no puede explicar las elevadas concentraciones alimentadas de PPAR\alpha. La PPAR\alpha es producida por glucocorticoides (18) y sigue un ciclo diurno que va paralelo a ritmo de la corticosterona (19). Esto implica que el control de la expresión de PPAR\alpha por glucocorticoides se produce no solamente en condiciones extremas tales como la respuesta al estrés en ayunas sino también durante el ciclo diurno normal cuando las concentraciones de glucocorticoide e insulinas presentan los cambios más moderados. Una posible explicación de la expresión elevada de PPAR\alpha en el nadir diurno (8 am) en ratones 11\betaHSD-1^{-/-} es que han elevado sutilmente las concentraciones de corticosterona en el plasma en este periodo (este estudio: campestre 25,2 \pm 7,2 nmoles/l frente a 11\betaHSD-1^{-/-} 47,5 \pm 7,8 nmoles/l, p<0,05, de acuerdo con los informes anteriores de los autores (16, 24). Esto produce alguna retroalimentación negativa alterada en el eje HPA ampliada normalmente por 11\betaHSD-1(16, 24). Resulta interesante que los ratones 11\betaHSD-1^{-/-} presentan una respuesta glucocorticoide intracelular reducida en el cerebro en la cara de un aumento mediado por estrés exagerado en la corticosterona del plasma (42). Esto implicaría que la expresión génica del hígado es quizás menos sensible a la regulación exquisita de la expresión del gen mediada por 11\betaHSD-1en el cerebro y es más sensible a las concentraciones de corticosteroide en el plasma predominantes. Sin embargo, las concentraciones de la proteína CBG de unión hepática sensible a glucocorticoides y de unión GR en el hígado son similares (24) en ratones 11\betaHSD-1^{-/-} alimentados a discreción en la mañana. La falta de regulación por disminución de GR (43) y CBG (44) en el hígado de 11\betaHSD-1^{-/-}, en la cara de concentraciones elevadas de corticosterona en el plasma indican que la acción glucocorticoide eficaz dentro del hígado está realmente atenuada, lo que sugiere que factores aparte de meramente las concentraciones de corticosterona en el plasma son responsables del aumento de la expresión del PPAR\alpha hepático. El PPAR\alpha está regulado por una multitud de factores que incluyen otros esteroides (45), lípidos (46), retinoides (47) y hormonas (48), incluyendo la insulina como se muestra en el presente estudio. Los determinantes exactos del PPAR\alpha básico elevado en el modelo de la eliminación de glucocorticoides crónicos sutiles en el hígado continúa sin determinar.
Es también evidente que PPAR\alpha y GR presentan acciones solapantes y algunas veces de oposición en activadores diana. Por ejemplo, las concentraciones de fibrinógeno están reguladas positivamente por glucocorticoides (36, 49) y están reguladas negativamente por PPAR\alpha (41). Asimismo, la apolipoproteína AI es producida por glucocorticoides (50) mientras que en ratones apoAI (23) y concentraciones de apoAII están representados por PPARa. La observación de los autores de concentraciones elevadas de transcrito ApoAI en ratones 11\betaHSD-1^{-/-} alimentados podría implicar que el activador apoAI es más sensible a la inducción mediada por glucocorticoides que a la represión mediada por PPAR\alpha. Para algunos activadores parece predominar el efecto de GR, para otros PPAR\alpha. Alternativamente, dado que la insulina es conocida por regular positivamente el activador apoAI (85), el aumento de sensibilidad de la insulina en ratones con hígado 11\betaHSD-1^{-/-} puede explicar también la discrepancia observada en la expresión génica. Será necesaria más investigación para determinar el mecanismo subyacente para el modelo de expresión de apoAI. Sin embargo sería de esperar que, ya que este componente del sistema de transporte del colesterol inverso HDL se correlaciona negativamente con el riesgo cardiovascular, concentraciones elevadas podrían contribuir al perfil ateroprotector global de ratones 11\betaHSD-1^{-/-}.
PPAR\gamma
PPAR\gamma es importante en la mediación de la absorción de macrófagos y exportación de LDL-colesterol oxidado o acetilado, principalmente en la placa ateromatosa en las paredes de los vasos sanguíneos. El efecto dominante parece ser sobre la exportación del colesterol por ABCA1 y transportadores relacionados (75, 76). La inhibición de 11\beta-HSD1 por consiguiente facilita la exportación del colesterol desde los macrófagos en la placa aumentando la expresión de PPAR\gamma, reduciendo la formación de células con espuma y su contribución a la aterogénesis.
Ratones transgénicos 11\beta-HSD1 presentan aumento de los niveles de la expresión del macrófago PPAR\gamma, demostrando que la utilización de agonistas de PPAR\gamma tales como las tiazolidindionas y análogos de N-(2-benzoilfenil)tirosina es eficaz para reducir el almacenamiento del colesterol en macrófagos y la formación de células con espuma.
Los fármacos del agonista de PPAR disponibles, tales como la rosiglitazona y pioglitazona, están indicados para tratar la resistencia a la insulina en la diabetes de tipo 2. Se observan niveles de expresión aumentados de PPAR\gamma también en el tejido adiposo de ratones transgénicos 11\beta-HSD1, lo que indica que la combinación de inhibidores de 11\beta-HSD1 y agonistas de PPAR\gamma es eficaz en el tratamiento de la sensibilidad a la insulina y otros efectos del perfil metabólico, tal como el perfil lipídico del plasma, la tolerancia a la glucosa y el riesgo cardiovascular. Además, ya que los efectos secundarios del tratamiento con agonistas de PPAR\gamma tal como las tiazolindionas incluyen ganancia de peso, la terapia de combinación con un inhibidor de 11\beta-HSD1 está indicada para controlar el aumento en el tejido adiposo asociado a la terapia del agonista de PPAR\gamma.
Metabolismo de la glucosa
Entre las funciones fisiológicas de los glucocorticoides está la adaptación de los animales a la privación prolongada de nutrientes. Durante esta respuesta, concentraciones elevadas de glucocorticoides impulsan el aumento de la producción de la glucosa hepática y la oxidación de ácidos grasos que a la vez facilitan simultáneamente la lipólisis del tejido adiposo para proporcionar los ácidos grasos y el glicerol requeridos por el hígado. En estado de ayunas, los ratones 11\beta-HSD-1^{-/-} presentan atenuación de la expresión génica sensible a glucocorticoides. PPAR\alpha y apoAI presentan inducción atenuada mientras que GPAT presenta una represión atenuada en ayunas. Estos resultados están de acuerdo con los descubrimientos anteriores sobre la atenuación del metabolismo de la glucosa inducible por glucocorticoides en ratones 11\beta-HSD-1^{-/-} (16). Esto implica que los ratones deficientes tienen una carencia relativa de glucocorticoides intracelulares durante el ayuno o el estrés. A pesar de esta producción atenuada, los ratones parecen ser capaces de mantener su sistema hepático de oxidación de ácidos grasos en un ayuno de mas de 24 horas. Por lo tanto, a pesar de la producción suprimida de PPAR\alpha en ayunas en ratones 11\beta-HSD-1^{-/-}, parece que se produce normalmente una proporción mayor que limita la enzima en la oxidación mitocondrial (CPT-1), y las concentraciones de glucosa en el plasma en ayunas no son significativamente inferiores a las de los animales campestres. Esto está en contraste con los descubrimientos en los ratones deficientes alimentados con PPAR\alpha que presentan profunda hipoglucemia durante el ayuno prolongado (20, 21). Existe una acumulación de lípidos relativamente pronunciada en el hígado de 11\betaHSD-1^{-/-} en ayunas, reminiscente del hígado graso observado en ratones deficientes en PPAR\alpha en ayunas (20, 21). Sin embargo, la acumulación de lípidos parece resolverse en ratones 11\betaHSD-1^{-/-} en realimentación. Si la acumulación de lípidos es debida a aumentos impulsados por PPAR\alpha truncado en la oxidación de ácidos grasos, como en los ratones transgénicos PPAR\alpha en ayunas, sigue sin determinarse. Realmente, mientras que PPAR\alpha puede regular las concentraciones de CPT-I en el estado a discreción (31), la inducción mediada rápida de CPT-I no está afectada en los ratones transgénicos PPAR\alpha (83) lo que implica que este procedimiento es independiente del factor de transcripción. Una explicación alternativa podría provenir de la observación de los autores de la represión atenuada en ayunas mediada por glucocorticoides de la enzima GPAT de esterificación de lípidos. Elevadas concentraciones de dicha enzima que limita la velocidad en la serie de reacciones de la síntesis de lípidos podrían contribuir a la acumulación de lípidos observada. De hecho, las concentraciones crecientes de GPAT pueden explicar también en parte la reducción inferior del pliegue en los triglicéridos del plasma en ayunas en ratones deficientes comparados con los campestres. Ya que GPAT es inducible por la insulina, este descubrimiento es también coherente con las pruebas de crecimiento de que el hígado de 11\betaHSD-1^{-/-} es más sensible que el de tipo campestre para nivelar las concentraciones de insulina sumamente bajas encontradas durante el ayuno. Los transcritos ACO y UCP-2 sensibles a PPAR\alpha presentan inducción atenuada con el ayuno y pueden reflejar la sensibilidad relativamente mayor de estos activadores, en comparación con los de CPT-I, para la regulación de PPAR\alpha en ayunas. La inducción parcial de genes diana corriente arriba por PPAR\alpha frente a un aumento de truncamiento en ayunas de las concentraciones de PPAR\alpha podría significar que la activación de las concentraciones de PPAR\alpha en 11\betaHSD-1^{-/-} ya elevadas dentro de un periodo de ayuno de 24 horas es suficiente para activar una respuesta metabólica adaptativa en ratones 11\betaHSD-1^{-/-}. Esto es una posibilidad ya que los ácidos grasos endógenos activan a PPAR\alpha (84) y existe un aumento de aporte de ácido graso al hígado durante el ayuno. Alternativamente, otros procedimientos pueden elevar la expresión de las enzimas oxidativas durante el ayuno (83).
La realimentación después de un ayuno se caracteriza por un pronunciado sobreexceso mediado por insulina en la expresión génica del hígado de las enzimas en la serie de reacciones lipogénicas y la represión de los procedimientos oxidativos. Los autores han utilizado esto como medida de sensibilidad de la insulina hepática. Los ratones 11\betaHSD-1^{-/-} han aumentado claramente la sensibilidad a la insulina hepática ya que en la realimentación existe una supresión exagerada (CPT-I, UCP-2) o inducción (SREBP-1c, FAS, GPAT, HMG-CoA-R) de las concentraciones de transcrito para las enzimas oxidativas y lipógenas, respectivamente. La pronunciada producción de la serie de reacciones lipógenas (SREBP-1c, FAS y GPAT) combinada con una represión exagerada del metabolismo oxidativo de los lípidos (CPT-I, UCP-2) en la realimentación después del ayuno puede tenerse en cuenta también para el retorno rápido de los triglicéridos a valores con alimento a discreción durante 4 h y el sobreexceso de triglicéridos en el plasma observado en el periodo de realimentación de 24 horas en ratones 11\betaHSD-1^{-/-}. La contención del aumento de la sensibilidad de la insulina apoyada por las pruebas de tolerancia de la glucosa intraperitoneal que presentan ratones 11\betaHSD-1^{-/-} ha mejorado el control glucémico. Sin embargo, el músculo es la zona principal posprandial de la deposición de la glucosa y no está claro si la sensibilidad mejorada a la insulina en el hígado de ratones 11\beta-HSD-1^{-/-} puede considerarse completamente para la mejor tolerancia a la glucosa. Los estudios directos sobre el músculo de ratones 11\betaHSD-1^{-/-} se requieren para estudiar este asunto. Evidentemente, ya que la resistencia a la insulina es uno de los principales mecanismos subyacentes atribuidos al desarrollo patógeno del síndrome metabólico, la demostración del aumento de la sensibilidad a la insulina hepática y la mejor tolerancia de la glucosa pueden interpretarse como beneficiosos.
Ratones con una destrucción dirigida en el gen que codifica a la enzima 11\betaHSD-1 representan un modelo animal que carece de un mecanismo crucial de reampliación de glucocorticoides intracelulares. Los ratones 11\betaHSD-1^{-/-} resisten la hiperglucemia durante el estrés y la obesidad (16) y presentan unas características metabólicas y lipidémicas favorables debido a la expresión alterada y a la actividad de proteínas en el hígado. Sin embargo, 11\betaHSD-1 se expresa también en otros tejidos tales como la grasa y el cerebro, zonas importantes que regulan los lípidos y la homeostasis de nutrientes. 11\betaHSD-1 puede también, por consiguiente, modular la acción de glucocorticoides en el balance energético central así como el almacenamiento periférico de grasas, la acción de la insulina y la tolerancia a la glucosa. Estos efectos no pueden ser regulados ya que tienen un comportamiento sobre el perfil lipídico, en combinación con los efectos hepáticos de 11\betaHSD-1 transgénico en el metabolismo de los lípidos descritos en la presente memoria. No obstante, los mejores perfiles metabólicos alimentados y realimentados en ratones deficientes en 11\betaHSD-1 sugieren que inhibidores de esta enzima puedan presentar efectos favorables en varios factores de riesgo cardiovasculares. Esto es particularmente oportuno ya que la expresión de la enzima en el hígado no estaba afectada por las manipulaciones de la dieta in vivo, lo que sugiere que se mantiene la supuesta diana del fármaco. Además, una combinación de un inhibidor de 11\betaHSD-1 y del agonista de PPAR\alpha representa una estrategia terapéutica sumamente potente para tratar las dislipidemias, la tolerancia a la glucosa y la hiperfibrinogenemia.
La carbenoxolona mejora el perfil lipídico en ratas obesas
Se han examinado los efectos de la inhibición de 11\betaHSD con la carbenoxolona en ratas Zucker, una cepa en la que la disregulación específica para el tejido de 11\beta-HSD1 (aumentó en la adiposis, disminuyó en el hígado) refleja los cambios en la obesidad humana (4; 3; 54). La obesidad en estos animales está asociada a un aumento de 11\beta-HSD1 en el tejido adiposo y la regulación por disminución en el hígado. Como en las ratas delgadas, la carbenoxolona fue eficaz en inhibir la actividad de 11\beta-HSD1 en el hígado y la actividad de 11\beta-HSD2 en los riñones. Esto ilustra que puede conseguirse más reducción en la actividad de 11\beta-HSD1 hepática farmacológicamente en los animales obesos, más allá de su regulación por disminución basal de la expresión y actividad enzimáticas. La carbenoxolona no tiene ningún efecto sobre la glucosa en el plasma en ayunas o la tolerancia a la glucosa, como en las ratas delgadas. Sin embargo, en las ratas obesas la carbenoxolona no produjo el mismo modelo de perfil lipídico alterado (con disminución de triglicéridos y aumento de colesterol HDL) que ha sido observado en ratones transgénicos 11\beta-HSD1 (55). En el modelo de ratón, esto se ha atribuido a aumento de la oxidación hepática de lípidos y probablemente procede de la regulación por aumento de PPAR\alpha en el hígado (55).
La inhibición de 11\beta-HSD1 con la carbenoxolona en el hígado tiene de este modo efectos beneficiosos sobre el metabolismo de los lípidos en ratas obesas Zucker, a pesar de la actividad basal inferior de la "diana" 11\beta-HSD1.
Reducción del contenido de grasas intrahepático
Los estudios en ratones ZIP1 sin grasa han demostrado que la acumulación ectópica de grasa en el hígado y en el músculo esquelético está asociada a la resistencia grave a la insulina y a los defectos de señalización tal como los defectos en la actividad de la PI 3-cinasa asociada a IRS-1 e IRS-2 estimulados por la insulina (50). El tratamiento de la lipodistrofia en estos ratones con trasplante invierte completamente la resistencia a la insulina (51). En seres humanos, la acumulación ectópica de grasas en el hígado está también asociada a la resistencia hepática a la insulina independiente del peso corporal y del consumo de alcohol (52; 53).
11\betaHSD-1 amplía la acción glucocorticoide local catalizando la conversión intracelular de la cortisona inactiva para activar el cortisol específicamente en el hígado. Los ratones deficientes en 11\beta-HSD1 presentan concentraciones de triglicéridos en el suero notablemente bajas, respuestas gluconeógenas reducidas al estrés o a la alimentación de grasa y aumento de sensibilidad a la insulina hepática. Estos datos demuestran que la producción de glucocorticoide local modula la acción de la insulina en el hígado del roedor. En los seres humanos, la inhibición de 11\beta-HSD1 por la carbenoxolona aumenta la cantidad de glucosa requerida para mantener la normoglucemia sin alterar la absorción de la glucosa en el antebrazo, lo que sugiere un aumento de la sensibilidad a la insulina hepática.
Se estudiaron hombres con un peso corporal relativamente anormal para determinar si el contenido de grasa en el hígado, medido utilizando espectroscopia de protones está asociado a las propiedades de resistencia a la insulina independientes del peso corporal. Se ha descubierto que el contenido de grasa en el hígado es un determinante independiente de la sensibilidad de la producción de la glucosa endógena a insulina. Un contenido elevado de grasa en el hígado estaba también asociado, independientemente del peso corporal y del tejido adiposo visceral, a varias facetas de resistencia a la insulina incluyendo la hiperinsulinemia, hipertrigliceridemia y un ligero aumento de la presión sanguínea sistólica ambulatoria.
Se observó supresión alterada de FFA del suero en hombres con grasa alta frente a baja en el hígado, de nuevo independiente de todas las mediciones de adiposidad general. Ninguno de los cambios característicos del eje HPA que se producen con la obesidad se observó en los hombres con grasa alta en el hígado. Sin embargo, estos hombres convirtieron más acetato de cortisona oral en cortisol en el suero durante la supresión de la secreción de cortisol endógeno, lo que sugiere un aumento de la actividad de 11\beta-HSD-1 en el hígado.
Hígado graso, junto con perfiles lipídicos desfavorables y resistencia a la insulina, se observó también en ratones transgénicos específicos con ApoE-11\beta-HSD1 en el hígado, que expresan concentraciones elevadas de 11\beta-HSD1 en el hígado. De este modo, la inhibición de 11\beta-HSD1 en el hígado reduce el contenido de grasas intrahepático y de este modo mejora el perfil lipídico, reduciendo los triglicéridos y elevando las concentraciones de colesterol HDL, potencia la sensibilidad de la insulina y reduce las transaminasas elevadas y reduce la posibilidad de evolución a la esteatohepatitis no alcohólica o a la cirrosis. El fármaco antidiabético metformina reduce las concentraciones del receptor glucocorticoide en el hígado, lo que indica que la administración conjunta de metformina y un inhibidor de 11\beta-HSD1 es sinérgica.
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Administración
Los agentes según la invención pueden administrarse por los métodos convencionales de la medicina, en forma de composición farmacéutica. Una composición farmacéutica según la invención es una composición de materia que comprende una combinación de un agonista de PPAR\alpha y un inhibidor de 11\beta-HSD1. Se contempla el/los ingrediente(s)
activo(s) de una composición farmacéutica según la invención para presentar actividad terapéutica excelente, por ejemplo, en el alivio de enfermedades cardiovasculares. Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta terapéutica óptima. Por ejemplo, pueden administrarse diariamente varias dosis divididas o puede reducirse proporcionalmente la dosis indicada por las exigencias de la situación terapéutica.
El compuesto activo puede administrarse de una manera conveniente tal como por las vías oral, intravenosa (si es soluble en agua), intramuscular, subcutánea, intranasal, intradérmica o por supositorio o por implantación (por ejemplo, utilizando moléculas de liberación lenta). Dependiendo de la vía de administración, puede requerirse el ingrediente activo que está recubierto de un material que proteje dichos ingredientes de la acción de las enzimas, ácidos y otras condiciones naturales que pueden inactivar dicho ingrediente.
Con objeto de administrar la combinación por otra vía de administración aparte de la parenteral, se recubrirá de, o se administrará con, un material que impida su inactivación. Por ejemplo, la combinación puede administrarse en un adyuvante, administrarse conjuntamente con inhibidores enzimáticos o en liposomas. Se utiliza adyuvante en su sentido más amplio y se incluye cualquier compuesto de estimulación inmunitaria tal como el interferón. Los adyuvantes contemplados en la presente memoria incluyen resorcinoles, tensioactivos no iónicos tales como polioxietilen oleil éter y éter de n-hexadecil polietileno. Inhibidores enzimáticos incluyen la tripsina pancreática.
Los liposomas incluyen las emulsiones CGF de agua en aceite en agua así como liposomas convencionales.
El compuesto activo puede administrarse también por vía parenteral o intraperitoneal. Las dispersiones pueden también prepararse en glicerol, polietilenglicoles líquidos y mezclas de los mismos y en aceites. En condiciones ordinarias de almacenamiento y utilización, estas preparaciones contienen un conservante para impedir el crecimiento de microorganismos.
Las formas farmacéuticas adecuadas para utilización inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (si son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En todos los casos, la forma debe ser estéril y debe ser fluida de forma que sea fácil de inyectar. Debe ser estable en las condiciones de preparación y almacenamiento y debe conservarse frente a la acción contaminante de los microorganismos tales como bacterias y hongos. El portador puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido y similares), sus mezclas adecuadas, y aceites vegetales, pueda mantenerse la fluidez apropiada, por ejemplo mediante la utilización de un recubrimiento tal como lecitina para el mantenimiento del tamaño de partícula adecuado en caso de dispersión y mediante la utilización de tensioactivos.
La prevención de la acción de los microorganismos puede ser efectuada por varios agentes antibacterianos y antimicóticos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timerosal y similares. En muchos casos, será preferible que incluya agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares o cloruro sódico. La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede realizarse mediante la utilización en las composiciones de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.
Las soluciones inyectables estériles se preparan incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida y el disolvente apropiado con varios de los demás ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtración. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el ingrediente activo esterilizado en un vehículo estéril que contenga el medio de dispersión básico y los demás ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los procedimientos de preparación preferidos son el secado al vacío y la técnica de liofilización que proporciona un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de la solución previamente filtrada y esterilizada de la misma.
Cuando la combinación de polipéptidos está adecuadamente protegida como se describió anteriormente, puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o con un portador comestible asimilable o puede estar ocluida en cápsulas de gelatina de carcasa dura o blanda o puede estar prensada en comprimidos o puede incorporarse directamente con el alimento de la dieta. Para la administración terapéutica oral, el compuesto activo puede incorporarse con excipientes y utilizarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, pastillas, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas y similares. La cantidad de compuesto activo en dichas composiciones terapéuticamente útiles será tal para que se obtenga una dosis adecuada.
Los comprimidos, grageas, píldoras, cápsulas y similares pueden contener también los siguientes componentes: un aglutinante tal como goma tragacanto, acacia, almidón de maíz o gelatina; excipientes tales como fosfato dicálcico; un agente disgregador tal como almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; y puede añadirse un agente edulcorante tal como sacarosa, lactosa o sacarina o un agente saborizante tal como menta, aceite de gualteria, o saborizante de cereza. Cuando la forma unitaria farmacéutica es una cápsula, puede contener, además de los materiales del tipo anterior, un portador líquido.
Varios otros materiales pueden estar presentes como recubrimientos o sino modificar la forma física de la unidad de dosificación. Por ejemplo, comprimidos, píldoras o cápsulas pueden recubrirse con goma laca, azúcar o ambos. Un jarabe o elixir puede contener el compuesto activo, sacarosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservantes, un colorante y saborizante tal como aroma de cereza o de naranja. Desde luego, cualquier material utilizado en la preparación de cualquier forma unitaria farmacéutica debe ser farmacéuticamente puro y sustancialmente inocuo en las cantidades empleadas. Además, puede incorporarse el compuesto activo en las preparaciones y formulaciones de liberación lenta.
Tal como se utiliza en la presente memoria "portador y/o diluyente farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todos los disolventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antimicóticos, agentes retardantes isotónicos y de absorción y similares. La utilización de dichos medios y agentes para las sustancias farmacéuticamente activas es bien conocida en la materia. Excepto en la medida en que cualquier medio o agente convencional sea compatible con el ingrediente activo, se contempla la utilización del mismo en las composiciones terapéuticas. Pueden incorporarse también ingredientes activos complementarios en las composiciones.
Resulta especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria farmacéutica para facilidad de administración y uniformidad de la dosis. Forma farmacéutica unitaria tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a unidades físicamente discretas aconsejadas como formas farmacéuticas unitarias para los mamíferos que han de ser tratados; cada unidad que contiene una cantidad predeterminada de material activo se calcula para producir el efecto terapéutico deseado junto con el portador farmacéutico requerido. La especificación para las nuevas formas unitarias farmacéuticas de la invención están dictadas por, y son directamente dependientes de, (a) las características exclusivas del material activo y el efecto terapéutico específico que debe conseguirse, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la composición de dicho material activo para el tratamiento de la enfermedad en seres vivos que padecen una enfermedad en la que se altera la salud corporal.
Los ingredientes activos principales se componen para la administración conveniente y eficaz en cantidades eficaces de un portador farmacéuticamente aceptable adecuado en la forma de dosificación unitaria. En el caso de las composiciones que contienen ingredientes activos complementarios, las dosis se determinan con relación a la dosis habitual y a la manera de administración de dichos ingredientes.
La invención se describe con más detalle a continuación a título de ilustración, en los ejemplos siguientes.
Ejemplos Procedimientos experimentales-ratones 11\betaHSD-1 transgínicos
Animales - Ratones macho campestres de tipo MF1 11\betaHSD-1^{-/-} y sus referencias, criados como se describió anteriormente (16), se enjaulan en las condiciones habituales en un ciclo de 12 h de luz: 12 h de oscuridad (encendidas a las 7 a.m.). Para los experimentos, los animales se enjaularon de uno en uno y se les dejó que se aclimataran durante por lo menos dos días. Se asignó un espacio a los animales al azar (n=6 por grupo) para que tuvieran acceso al pienso a discreción, un ayuno de 24 h, un ayuno de 24 h con una realimentación de 4 h o un ayuno de 24 h con una realimentación de 24 h. Todos los ayunos comenzaron a las 8 a.m. Se sacrificaron los animales por decapitación en una sala independiente de su alojamiento 1 min. una vez alterada su jaula.
Grupos de ocho ratas Zucker macho de 5 semanas de vida obesas y flacas (Harlan Orlac, Bicester, UK) fueron caracterizadas por el fenotipo; se mantuvieron en condiciones controladas de luz (0800 h a 2000 h) y temperatura (21ºC) y se les dejó libre acceso al pienso normal para ratas (Special Diet Services, Witham, U.K.) y al agua potable.
Parámetros del plasma - Se extrae sangre del tronco rápidamente, se separa el plasma y las muestras se mantienen en hielo hasta la medición de triglicéridos, ácidos grasos libres, colesterol total y colesterol HDL. Se determinan los triglicéridos utilizando el kit TG colorimétrico a base de lipasa (Roche, Mannheim, GmbH). Se determina el colesterol total y el HDL utilizando los kits CHOL y HDL C-Plus (Roche). Se determina la glucosa con un kit Glucosa HK (Sigma, Poole, U.K.). Se determina la insulina en el plasma utilizando un ensayo ELISA realizado según las instrucciones de los fabricantes (Crystalchem, Chicago, EUA). Se determinan las concentraciones de corticosterona por radioinmunoanálisis, según se describe (24). Se extrae también suero y se analizan los triglicéridos puros (pico sin glicerol por separación FPLC) y las características del colesterol por FPLC seguido de métodos enzimáticos descritos anteriormente (23). Se determinan apoAI, apoAII, apoCII, apoB y apoE por nefelometría utilizando anticuerpos específicos en muestras representativas.
Extracción y análisis de ARN - Se congelan con fraccionamiento tejidos en nitrógeno líquido y se homogeinizan en Trizol (Gibco BRL, Paisley, U.K.). Se purifica el ARN total añadiendo una matriz de unión (Rnaid Plus kit, BIO 101, Anachem, U.K.) y se eluye de la matriz en agua pretratada con pirocarbonato de dietilo (Sigma) que contiene 400 unidades por ml de ARNsin (Promega, Southampton, U.K.) y DTT 10 mM. El ARN (5-20 \mug) se resuelve en gel de MOPS formaldehído al 1% y se coagula según el procedimiento de electroinmunotransferencia Northern habitual en 20\times SSC en membranas Hybond N^{+} (Amersham, Little Chalfont, U.K.). Se marcan las sondas con ^{32P}d-CTP utilizando el kit de marcado sondado al azar (Roche), purificado a través de Nick Columns (Pharmacia-Amersham, Little Chalfont, U.K.) y se hibrida toda la noche en tampón de fosfato con SDS elevado (6%) (NaH_{2}PO_{4} 0,2 M, Na_{2}HPO_{4} 0,6 M, EDTA 5 mM) que contiene 0,5 mg/ml de ADN desnaturalizado de testículos de salmón (Sigma) a 65ºC. Se lavan las inmunotransferencias a 65ºC hasta una severidad máxima de 0,5xSSC, SDS al 0,1%, se exponen a la película de diagnóstico por imagen de fósforo (FLA2000, Fujifilm, Londres, U.K.) y se analizan mediante el programa informático de diagnóstico por imagen de fósforo cuantitativo (Aida, Raytek Scientific, Sheffield, U.K.). Las inmunotransferencias se exponen también a la película (biomax-MR, Kodak, U.K.). Las sondas utilizadas para este estudio se detallan en la ref. 55 y se generan a partir de cebadores diseñados para las secuencias en el Genbank. Todas las identidades de la sonda se confirman por secuenciado utilizando el kit Thermosequenase (USB, Cleveland, EUA) en geles habituales de secuenciado de acrilamida al 8%.
Prueba de tolerancia a la glucosa intraperitoneal - En un experimento independiente, se hacen ayunar ratones transgénicos y campestres durante la noche y a continuación se inyectan por vía intraperitoneal con 2 mg/g de D-glucosa (solución madre al 25% en solución salina tamponada con fosfato). Se extraen muestras de sangre por la sección de la vena de la cola en microtubos con EDTA (Sarstedt, Leicester, U.K.) a intervalos de cero (antes de la inyección y a 1 minuto de alterar la jaula) y a intervalos de 5, 15, 30, 60 y 120 minutos después de la carga de glucosa.
Actividad de la enzima 11\beta-HSD-1 - Se homogeinizan muestras de hígado como se describe (12). La reacción incluyó 0,1 mg/ml de proteína, corticosterona tritiada 25 nM y un exceso (2 \muM) del cofactor NADP específico para 11\betaHSD-1 (en condiciones in vitro en tejidos homogeneizados, 11\beta-HSD1 es bidireccional, con el ensayo de deshidrogenación más estable). El ensayo está en el intervalo lineal de concentración de proteína y formación del producto. Después de 10 min. de incubación, se extraen los esteroides con acetato de etilo. Se separan los esteroides por cromatografía en capa fina (TLC), se identifican por migración en comparación con la corticosterona no marcada y patrones de 11-deshidrocorticosterona y se cuantifica con tamiz de tritio phosphorimager (Fujifilm). Los resultados de la TLC se validan por análisis HPLC de un grupo representativo de muestras de cada grupo experimental.
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Técnicas experimentales - Ratas Zucker
Tratamiento con fármacos - El tratamiento con fármacos se inició cuando los animales tenían 6 semanas de vida. Se administró carbenoxolona (50 mg/kg de peso corporal) o un volumen igual de vehículo (agua; 1 ml/kg/día) mediante alimentación forzada diaria a las 09:00 h. Se pesaron regularmente los animales para permitir la dosis adecuada de fármacos y seguir la evolución de la ganancia de peso. Se midió diariamente la ingesta de alimento para cada jaula de 4 animales. Después de dos semanas de tratamiento los animales experimentaron una prueba de tolerancia a la glucosa oral, que consistía en un ayuno durante la noche, seguido de una carga de glucosa oral de 2 g/kg a las 09:00 h. Se tomaron muestras de sangre por punción en la cola a los 0, 30 y 120 min. después de la inyección intravenosa de glucosa. A las nueve semanas de vida, después de tres semanas de tratamiento con carbenoxolona o con vehículo, se decapitaron los animales entre las 09:00 y 11:00 h, se recogió sangre del tronco, se disecaron los tejidos y se congeló bruscamente en nieve carbónica o se homogeneizó mecánicamente en tampón de Ringer con bicarbonato de Krebs (NaCl 118 mM, KCl 3,8 mM, KH_{2}PO_{4} 1,19 mM, CaCl_{2} 2,54 mM, MgSO_{4} 1,19 mM, NaHCO_{3} 25 mM, pH = 7,4).
Análisis del plasma - Se determinaron las concentraciones de corticosterona en el plasma preparada a partir de muestras de sangre terminal recogidas entre las 09:00 y las 11:00 h utilizando un radioinmunoanálisis portátil (74). Los coeficientes de variación inter e intra-análisis fueron <10%.
Se determinaron las concentraciones de glucosa utilizando un kit de análisis de hexocinasa glucosa (Sigma, Poole, U.K.), para el que los coeficientes inter- e intra-análisis de variación fueron ambos <2%. Se determinó la insulina utilizando un kit de radioinmunoanálisis [^{125}I]-insulina para rata (Amersham, Buckinghamshire, U.K.) para el que los coeficientes de inter- e intra-análisis, de variación, fueron <15 y <10% respectivamente.
Se determinaron las concentraciones de lípidos en el plasma preparado a partir de muestras de sangre terminal recogidas entre las 09:00 y 11:00 h. Se determinaron los triglicéridos, el colesterol total y el colesterol HDL utilizando kits ELISA (TG, CHOL y HDL C-plus respectivamente) de Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania. Se determinaron los ácidos grasos no esterificados (NEFA) utilizando un análisis enzimático NEFA C de Wako (Alpha Laboratories Ltd, Hampshire, U.K.).
Medición de actividades enzimáticas in vitro - Se determinó la actividad de 11\beta-HSD1 en homogeneizados de tejidos mediante incubación por duplicado a 37ºC, en glucosa que contiene tampón de Krebs Ringer que contiene glucosa (0,2%), NADP (2 mM) y 1,2,6,7-[^{3}H]_{4}-corticosterona (100 nM). Se optimizaron las condiciones en cada tejido para asegurar la cinética de primer orden, ajustando las concentraciones de proteína de la manera siguiente: 10 \mug/ml para el hígado; 1,5 mg/ml para el músculo esquelético del cuádriceps; 0,5 mg/ml para la grasa subcutánea lumbar y 1 mg/ml para la grasa epiploica. Después de 60 min de incubación, se extrajeron los esteroides con acetato de etilo, se evaporó la fase orgánica bajo nitrógeno y los extractos se volvieron a poner en suspensión en la fase móvil (20% de metanol, 30% de acetonitrilo y 50% de agua). Se separaron los esteroides por HPLC utilizando una columna \mu-Bondapak C18 en fase inversa a 20ºC y se analizó cuantitativamente por recuento de centelleo líquido en línea. No se detectaron picos en estas condiciones aparte de ^{3}H-corticosterona y ^{3}H-11-deshidrocorticosterona.
Se determinó la actividad de 11\beta-HSD2 en los riñones de manera similar, con los homogeneizados (concentración de SO en \mug/ml en la proteína) incubados con NAD (2 mM) como cofactor y [^{3}H]-corticosterona 10 nM. Se extrajeron los esteroides con acetato de etilo y se separaron por HPLC como anteriormente.
Se evaluó la actividad de 5\beta-reductasa en el hígado mediante la conversión de [^{3}H]-corticosterona a [^{3}H]-5\beta-tetrahidrocorticosterona en preparaciones de citosol hepático. La localización subcelular y la preferencia de cofactor de 11\beta-HSD1 y de 5\beta-reductasa se diferencian de modo que las actividades enzimáticas pueden medirse independientemente una de otra. Se preparó citosol hepático por centrifugación repetida según el procedimiento de (Fleischer y Kervina 1974). Se determinó la actividad enzimática incubando citosol (100 \mug de proteína/ml) por duplicado a 37ºC, en tampón fosfato (Na_{2}PO_{4} 40 mM, sacarosa 320 mM, ditiotreitol 1 mM, pH 7,5) que contiene NADPH (1 mM) y [^{3}H]-corticosterona (150 nM). Se realizaron incubaciones durante 60 min., a continuación se extrajeron los esteroides con acetato de etilo, se evaporó la fase orgánica bajo nitrógeno y se volvieron a poner en suspensión los extractos en fase móvil (25% de metanol, 10% de acetonitrilo y 65% de agua). Se separaron los esteroides por HPLC utilizando una columna C8 en fase inversa a 10ºC y se cuantificaron por recuento de centelleo líquido en línea. En estas condiciones, la producción de ^{3}H-11-deshidrocorticosterona fue inferior al límite de detección (es decir <2%).
Los esteroides radiomarcados eran de Amersham (Bucks, U.K.). Los disolventes eran de calidad destilada en vidrio por HPLC de Rathburn Chemicals (Walkerburn, U.K.). Otros productos químicos fueron de Sigma (Poole, U.K.).
Estadística - Todos los datos están expresados como media \pm desviación estándar. Se analizaron los datos por análisis de varianza seguido de pruebas de diferencia de mínimos cuadrados post hoc. N=8 para todos los grupos.
Técnicas experimentales-acumulación de grasa hepática
Pacientes y diseño del estudio - Se inscribieron hombres sanos en los servicios sanitarios de trabajo en Helsinki. Los pacientes estaban sanos según se interpretó por anamnesis y exploración física y no se utilizó ningún fármaco. Los pacientes no presentaban pruebas serológicas de hepatitis A, B o C, o de hepatitis autoinmunitaria, ni presentaban signos o síntomas clínicos de errores congénitos de metabolismo o antecedentes de utilización de toxinas o fármacos asociados a la esteatosis^{15}. Los pacientes se dividieron en grupos "LFAT alta" y "LFAT baja" basándose en su LFAT media (5%). Como se detallará a continuación, los pacientes se sometieron a mediciones de i) conversión de cortisona en cortisol in vivo, ii) sensibilidad a la insulina in vivo de glucosa R_{a} y R_{d} utilizando la técnica de fijación de la insulina euglucémica combinada con infusión de [3-^{3}H]glucosa, iii) contenido en grasa hepática por espectroscopia de protones, iv) volúmenes de grasa s.c., visceral y total por MRI, v) VO_{2} máx., y vi) presión sanguínea ambulatoria a las 24 horas.
Se explicó a los pacientes la finalidad, naturaleza y riesgos potenciales de los estudios antes de obtener su consentimiento informado por escrito. El protocolo experimental fue aprobado por el comité ético del Hospital Universitario de Helsinki.
Secreción y metabolismo del cortisol - La conversión de cortisona en cortisol por 11\beta-HSD-1 en primer paso a través del hígado se determinó después que los pacientes tomaron 1 mg de dexametasona oral a las 11 p.m. para suprimir la producción de cortisol endógeno y ayunaron toda la noche (3; 54; 56). A la mañana siguiente, se insertó un catéter en la vena precubital para muestreo de sangre y los pacientes ingirieron 25 mg de acetato de cortisona. Se determinó a continuación el cortisol del suero cada 15 min. durante 90 min.
Sensibilidad a la insulina in vivo de la producción y utilización de glucosa - A las 8 a.m. después del ayuno de toda la noche, se colocaron dos catéteres en el interior, uno en la vena del antecúbito y el otro posteriormente en la vena de la mano calentada, para infusión de glucosa, insulina y [3-^{3}H]glucosa y para el muestreo de sangre venosa arterializada. Para determinar las velocidades de producción de glucosa (R_{a}) y la utilización (R_{d}) en condiciones basales e hiperinsulinémicas, se infundió [3-^{3}H]glucosa de modo cebado (20 \muCi) continuo (0,2 \muCi/min) durante un total de 300 min. (52; 58). Se extrajeron muestras de sangre de referencia para la medición de las concentraciones de insulina y de glucosa en el suero en ayunas y para las mediciones bioquímicas listadas en la Figura 14. Tras 120 minutos, se infundió insulina de modo continuo cebado (0,3 mU/kg\cdotmin) como se describió anteriormente (52). La glucosa en el plasma se mantuvo a 5 mmoles/l (90 mg/dl) hasta 300 min. utilizando una infusión a velocidad variable de glucosa al 20% (58). Las muestras de sangre para la medición de la actividad específica de la glucosa se tomaron a 90, 100, 110 y 120 y a intervalos de 15 a 30 entre 120 y 300 min. Se determinaron concentraciones de insulina exenta de suero cada intervalos de 60 min. durante la infusión de insulina.
Se determinó la actividad específica de [3-^{3}H]glucosa como se describió anteriormente (59). Se calcularon R_{a} y R_{d} de la glucosa utilizando la ecuación de Steele, suponiendo una fracción de la mezcla de 0,65 para la glucosa y un volumen de distribución de 200 ml/kg para la glucosa (60). Se calculó R_{a} de la glucosa endógena sustrayendo la velocidad de infusión de la glucosa endógena requerida para mantener la euglucemia durante la hiperinsulinemia a partir de la tasa de R_{a} de la glucosa total. El % de supresión de la R_{a} de la glucosa endógena basal durante la última hora (240-300 min.) por insulina se utilizó como índice de sensibilidad de la producción de glucosa endógena a insulina (% de supresión).
Contenido de grasa en el hígado (espectroscopia de protones) - El espectro de protones de un solo vóxel (2 \times 2 \times 2 cm^{3}) del hígado se obtuvo utilizando 32 excitaciones, un serpentín de la superficie del bucle y un dispositivo de resonancia magnética de 1,5 T (Magnetom Visión, Siemens, Erlangen, Alemania). Se consiguió la posición espacial utilizando un modo de obtención de eco estimulado aplicado con un tiempo de repetición de 3.000 ms y con tiempo de eco de 20 ms. Se seleccionaron un tiempo de repetición prolongado y un tiempo de eco corto para minimizar los efectos de la relajación de T1 y T2, respectivamente, en las intensidades de señal. Se midieron los desplazamientos químicos en comparación con la intensidad de la señal del agua a 4,8 ppm (S_{agua}). Se midió la intensidad de la señal del metileno a 1,4 ppm (S_{grasa}), que representa los triglicéridos intracelulares en el hígado (52). Se obtuvieron intensidades de señal mediante una rutina VAPRO-MRUI (www.mrui.uab.es/mruiHomePage.html) de ajuste del dominio temporal. Esta medición de la grasa hepática en % por espectroscopia de protones se validó frente al contenido de lípidos de biopsias de hígado en seres humanos (61). También se ha validado frente a las mediciones de la densidad del hígado realizadas por tomografía digital. Esta última validación ha sido realizada también por los autores previamente (52). El % de grasa hepática se calculó dividiendo 100 veces S_{grasa} por la suma de S_{grasa} y S_{agua}.
Grasa intraabdominal (diagnóstico por imágenes por resonancia magnética) - Una serie de exploraciones transaxiales ponderadas de T1 para la determinación de la grasa visceral y subcutánea se obtuvieron en una zona que se extiende desde 4 cm por encima hasta 4 cm por debajo del 4º y 5º interespacio lumbar (16 secciones, campo de vista de 375 \times 500 mm^{2}, espesor de la sección 10 mm, tiempo de repetición de respiración mantenida dividida por el tiempo de eco 138,9 ms/4,1 ms). Se midieron las áreas de grasa visceral y subcutánea utilizando un programa de análisis de imagen (www.perceptive.com/ALICE.HTM). Se presentó un histograma de intensidad de píxel en la zona intraabdominal y la intensidad correspondiente al nadir entre los picos fino y grueso se utilizó como punto de corte. El tejido adiposo visceral se definió como el área de píxels en la zona intraabdominal por encima de este punto de corte. Para el cálculo del área de tejido adiposo subcutáneo, se dibujó manualmente una zona de interés en la demarcación del tejido adiposo subcutáneo y del tejido visceral como se describió anteriormente (52).
Potencia aeróbica máxima (VO_{2}max) - Se midió la potencia aeróbica máxima utilizando una prueba de ejercicio de pie de trabajo realizado a incrementos con un ergómetro de ciclo frenado eléctricamente (Ergometer Ergoline 900ERG, Alemania) combinado con análisis continuo de gases de expiración y poca ventilación (serie Vmax229, SensorMedics). El ejercicio comenzó a una carga de trabajo de 50 vatios. Se incrementó a continuación la carga de trabajo mediante 50 vatios cada 3 min. hasta que se alcanzó un cansancio percibido o un cociente respiratorio de 1,10. La potencia aeróbica máxima fue definida como VO_{2}max de los últimos 30 s. de ejercicio.
Presión sanguínea ambulatoria de 24 h. - Se realizó el control de la presión sanguínea ambulatoria no agresiva un día de entre semana con un dispositivo de control de presión sanguínea ambulatorio automático (Diasys Integra, Novacor, Francia). Se ajustó el dispositivo para registrar la presión sanguínea y la frecuencia cardiaca cada 15 minutos durante el día y cada 30 minutos durante la noche. El día y la noche se definieron a partir de los periodos de paseo y sueño en el diario del paciente.
Otras mediciones - Se determinaron concentraciones de glucosa en el plasma por duplicado por el método de glucosa oxidasa utilizando el analizador II para glucosa de Beckman (Beckman Instruments, Fullerton, CA) (63). Se determinó HbA_{1c} por cromatografía líquida de alta presión (62) utilizando el sistema analizador automático de hemoglobina glucosilada (BioRad, Richmond, CA). Se determinaron el colesterol total, el colesterol HDL y los triglicéridos como se describió anteriormente (64). Se determinó la insulina libre en el suero utilizando radioinmunoanálisis (Pharmacia Insulin RIA kit, Pharmacia, Uppsala, Suecia) tras la precipitación con polietilenglicol (65). Se determinó la FFA en el suero utilizando un procedimiento fluorométrico (66). Se determinó el % de grasa corporal por pletismografía de bioimpedancia (Bio-Electrical Impedance Analysis System, modelo nº BIA-101A, RJL Systems, MI) (67).
Análisis estadístico - Se utilizó la prueba de la t para datos no emparejados para comparar los valores medios entre los grupos con LFAT bajo y alto. Se analizaron los factores que explican la variación en las concentraciones de cortisol en el suero después del cortisol oral utilizando ANOVA para mediciones repetidas y análisis de regresión lineal múltiple. Se hicieron cálculos utilizando el paquete estadístico Systat, versión 10.0 (Systat, Evanston, IL) y GraphPad Prism versión 2.01 (GraphPad Inc., San Diego, CA). Todos los datos se muestran como la media \pm desviación estándar de la media. Un valor p inferior a 0,05 se consideró estadísticamente significativo.
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Ejemplo 1 Ratones 11\betaHSD-1^{-/-} tienen menos triglicéridos en el plasma y más colesterol HDL
Los triglicéridos en el plasma son inferiores en los ratones deficientes en 11\betaHSD-1 alimentados a discreción (Fig. 1A). Un perfil FPLC representativo de triglicéridos "auténticos" a discreción (Fig. 1B) indicaba que la interferencia del glicerol no se tiene en cuenta para las diferencias entre genotipos. El ANOVA de dos días indicaba que la reducción en triglicéridos en ratones 11\betaHSD-1^{-/-} en ayunas es significativamente menor en magnitud en comparación con los campestres (Fig. 1A). Sin embargo, mientras que las concentraciones de triglicérido del tipo natural volvían a los valores alimentados a discreción durante 24 horas de realimentación, los valores de triglicéridos 11\betaHSD-1^{-/-} volvían a los valores a discreción durante 4 horas y presentaban un exceso para los niveles significativamente mayores a los del grupo alimentado a discreción en 24 horas. El colesterol total y HDL no variaron significativamente con la manipulación de la dieta (Fig. 2A y 2B). Sin embargo, existe un efecto muy significativo del genotipo, en los ratones 11\betaHSD-1^{-/-} con concentraciones de HDL colesterol mayores (\sim130% de tipo natural; Fig. 2B). Las concentraciones de glucosa en el plasma son similares en ambos genotipos en estado alimentado (campestre 6,24 \pm 0,04 frente a deficiente 5,8 \pm 0,5 mmoles/l), con una tendencia hacia la glucosa en ayunas inferior en ratones 11\betaHSD-1^{-/-} (campestre 4,04\pm0,3 frente a deficiente 3,4\pm0,1 mmoles), como se observó recientemente (16). Las concentraciones de glucosa realimentada a las cuatro horas son similares (campestre en 5,37\pm0,45 frente a nula 5,51\pm0,29 mmoles/l), sin embargo, hay una pequeña pero significativa disminución en las concentraciones de glucosa de 11\betaHSD-1deficiente a las 24 horas después de la realimentación después de un ayuno (5,51\pm0,45 campestre frente a deficiente 4,64\pm0,15 mmoles/l, p<0,05). Esto podría reflejar el aumento de tolerancia a la glucosa en ratones 11\betaHSD-1^{-/-}. La insulina en el plasma es muy variable pero similar en todos los estados de alimentación en los 2 genotipos.
El perfil del hígado de Fed 11\betaHSD-1^{-/-} indica una síntesis normal de lípidos y un aumento de la oxidación de lípidos - Para investigar los orígenes de las alteraciones en los lípidos del plasma, la expresión de los ARNm que codifican los enzimas implicados en las series de reacciones de síntesis de lípidos (Fig. 3) y de oxidación de ácidos grasos (Fig. 4) se examinan por análisis de inmunotransferencia Northern. La ácido graso sintasa (FAS) (Fig. 3A) y la glicerol-fosfato acil transferasa (GPAT) (Fig. 3B), enzimas implicadas en la síntesis y esterificación de triglicéridos, respectivamente, se expresan de manera similar en ratones 11\betaHSD-1^{-/-} y campestres en condiciones de alimentación a discreción. Realmente los niveles del factor de transcripción SREBP-1c lipógeno crucial que conduce la expresión de FAS, GPAT y otras enzimas en la serie de reacciones de lípidos (25, 26) son comparables entre genotipos (Fig. 3c). Esto implica que la síntesis y esterificación reducidas de triglicéridos es poco probable que desempeñe un papel en la disminución del perfil de triglicéridos en el plasma de ratones 11\betaHSD-1^{-/-}. Además, el ARNm que codifica la enzima limitativa de la velocidad en la síntesis del colesterol, la hidroxi-metil-glutaril-CoA-reductasa (HMG-CoAR) se expresa también a niveles similares en ambos genotipos en el estado alimentado (Fig. 3D).
En cambio, cuando se examinan las enzimas de la oxidación de ácidos grasos los autores descubrieron que los ARNm que codifican la carnitinapalmitoíl-transferasa-I (CPT-1), una enzima clave limitativa de la velocidad en la serie de reacciones mitocondriales de la \beta-oxidación (27), acil-CoA oxidasa (ACO), enzima mitocondrial implicada en la oxidación de ácidos grasos (28) y la proteína-2 de desacoplamiento (UCP-2), proteína implicada también en la oxidación de ácidos grasos (29) y conocida por expresarse en hepatocitos (30), están todas elevadas en los hígados de ratones 11\betaHSD-1^{-/-} alimentados (Fig. 4A, 4B, 4C). Además, el ARNm de PPAR\alpha, factor de transcripción clave hepático que regula estos genes de oxidación de ácidos grasos está elevado en ratones 11\betaHSD-1^{-/-} alimentados (Fig. 4D). La expresión elevada de CPT-I, ACO y UCP-2 es coherente con estos genes que son dianas corriente abajo de PPAR\alpha (30-33).
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Ejemplo 2 Los ratones 11\betaHSD-1^{-/-} presentan características ateroprotectoras de lipoproteína y fibrinógeno
Los autores investigaron también la expresión de las lipoproteínas sensibles a glucocorticoides para examinar más detenidamente el origen de las concentraciones reducidas de triglicérido y aumentadas de HDL. Se realiza la nefelometría con anticuerpos anti-apolipoproteína específicos en una muestra representativa de suero en ambos genotipos en estado alimentado. Coherente con una reducción cardioprotectora en los triglicéridos circulantes, las concentraciones en suero de apoCIII, componente de VLDL rico en triglicéridos que desempeña una función clave en la determinación de las concentraciones de triglicérido en el plasma (34), están notablemente reducidas en ratones 11\betaHSD-1^{-/-} (campestre 0,87\pm0,14 frente a deficiente 0,48 \pm 0,1 g/l). El ARNm de la apolipoproteína AI, que codifica el componente principal de la partícula HDL (35), está elevado de manera significativa en el hígado del ratón 11\betaHSD-1^{-/-} alimentado (Fig. 5A), con concentraciones de apoAI en el plasma circulantes elevadas. Es de destacar, que apoAII en el suero, otra lipoproteína asociada a la partícula HDL está reducida (campestre 0,53\pm0,1 frente a deficiente 0,28\pm0,1 g/l). Las concentraciones en el suero de apoB y apoE no son diferentes entre genotipos.
Para evaluar un transcrito hepático no relacionado con las lipoproteínas o el metabolismo de los lípidos, los autores investigaron el ARNm del A\alpha-fibrinógeno, que codifica un factor del plasma sensible a glucocorticoides (36) que es un factor de riesgo cardiovascular independiente (37). Las concentraciones de transcrito del A\alpha fibrinógeno se redujeron en el 25% en ratones 11\betaHSD-1^{-/-} alimentados (Fig. 5B).
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Ejemplo 3 Los ratones 11\betaHSD-1^{-/-} presentan inducción atenuada de transcritos sensibles a glucocorticoides en ayunas
El ayuno produce una doble inducción de PPAR\alpha en los ratones campestres (Fig. 4D), coherente con los informes de que este factor de transcripción media en la oxidación de ácidos grasos inducida por glucocorticoides (20, 21). Sin embargo, aunque las concentraciones de PPAR\alpha en el hígado de 11\betaHSD-1^{-/-}, son mayores a las concentraciones de tipo natural durante las condiciones con alimentación a discreción, la provocación en ayunas de ARNm de PPAR\alpha está anulada en animales 11\betaHSD-1^{-/-} (Fig. 4D). A pesar de la inducción suprimida de PPAR\alpha, los genes diana ACO y UCP-2 corriente abajo presentaban una inducción en ayunas. Esta inducción es más pequeña en comparación con el tipo campestre a discreción para la inducción en ayunas. Dicha modesta inducción podría reflejar la presencia de concentraciones de PPAR\alpha alimentadas a discreción relativamente elevadas en ratones que están activados por el aumento de las concentraciones de activadores endógenos PPAR\alpha, ácidos grasos, durante el ayuno. El transcrito apoAI inducible por glucocorticoides también presenta un aumento atenuado en el ayuno, compatible con las concentraciones reducidas de glucocorticoide eficaz en los hepatocitos (Fig. 5B).
De acuerdo con la respuesta atenuada en ayunas, se observa una represión truncada mediada por el ayuno de la enzima GPAT de esterificación de lípidos en ratones deficientes en comparación con los ratones campestres (Fig. 3B). Asimismo, la inducción en ayunas de CPT-I (Fig. 4A) parece normal y la glucosa en el plasma en ayunas no es significativamente diferente entre los genotipos. Esto implica que la atenuación de efectos glucocorticoides en la oxidación de ácidos grasos y la gluconeogénesis no es lo suficientemente drástica para producir hipoglucemia después de un ayuno de 24 horas en los ratones 11\betaHSD-1^{-/-}.
11\betaHSD-1^{-/-} no responde intensamente al ayuno/realimentación en ratones campestres - Para determinar que la diferencia entre los ratones campestres y 11\betaHSD-1^{-/-} no es meramente debida a las alteraciones relacionadas con la alimentación en la actividad de 11\betaHSD-1, se determinan las concentraciones de transcrito y la actividad de 11\betaHSD-1 campestre a través de los grupos experimentales. Ni el ARNm de 11\betaHSD-1 ni los niveles de actividad están afectados por un ayuno intenso de 24 horas o la subsiguiente realimentación (Fig. 7A, 7B). De este modo, aunque la enzima es crítica para regular la concentración de glucocorticoide intracelular activo, no parece estar regulada de manera aguda por el aumento de corticosterona (campestres, alimentados a discreción 25,2\pm7,2 frente al ayuno de los campestres 222\pm76 nmoles/l, p<0,05). Además, el ARNm de 11\betaHSD-1 y la actividad no está afectada por las concentraciones reducidas de insulina asociadas al ayuno (campestres, a voluntad 3131\pm81 frente a el ayuno de los campestres 564\pm36 ningún/ml) o con el ulterior aporte de insulina en la realimentación (valor realimentado de 4 horas 6052\pm654 ningún/ml).
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Ejemplo 4 Los ratones 11\betaHSD-1 han aumentado la sensibilidad a la insulina hepática en la realimentación tras el ayuno
Los autores han investigado la sensibilidad de la insulina hepática evaluando los cambios relativos en las concentraciones de transcritos sensibles a la insulina en la realimentación después de un ayuno de 24 horas. El análisis Northern demuestra que los transcritos reprimibles por insulina tales como CPT-1 y UCP-2 se suprimen de manera más notable en los ratones 11\betaHSD-1^{-/-} (Fig. 4A y 4C) en la realimentación. Por el contrario, los transcritos inducibles por insulina, tales como aquellos en la serie de reacciones lipógena (SREBP-1, FAS, GPAT) y colesterológena (HMG-CoAR), se producen de manera más apreciable en los ratones 11\betaHSD-1^{-/-} en la realimentación (Fig. 3A-D).
Los ratones 11\betaHSD-1 han mejorado la tolerancia a la glucosa - Los estudios de la deposición dinámica de la glucosa indican que los ratones 11\betaHSD-1^{-/-} han mejorado el control glucémico (Fig. 8). Teniendo en cuenta las concentraciones reducidas de glucosa en el tiempo cero en ratones 11\betaHSD-1^{-/-}, después del ayuno que probablemente refleja la reacción atenuada al estrés en la producción de glucosa en ayunas (16), el área bajo la curva para las concentraciones de glucosa en ratones 11\betaHSD-1^{-/-} indica la mejora de deposición general de la glucosa después de una carga de glucosa intraperitoneal en comparación con el tipo campestre. Esto se mantiene con sensibilidad mejorada de la insulina hepática.
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Ejemplo 5 Efecto de la carbenoxolona sobre el perfil lipídico en seres humanos
La Figura 6 presenta el efecto de la administración de carbenoxolona sobre los lípidos del plasma en ayunas en seres humanos sanos y pacientes con diabetes mellitus de tipo 2.
Se administró placebo (barras negras) y carbenoxolona (barras blancas) a 6 hombres con diabetes mellitus tipo 2 y 6 referencias sanas en un estudio de entrecruzamiento al azar doble a ciegas, conocido en la materia. Se presentan las concentraciones de lípidos en el plasma en ayunas. La carbenoxolona no afectó al colesterol total, pero disminuyó los triglicéridos y aumentó las concentraciones de colesterol HDL (lipoproteína de alta densidad).
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Ejemplo 6 Efecto de la carbenoxolona sobre el perfil lipídico en ratas Zucker
Se determinan los efectos de la inhibición de 11\beta-HSD1en ratas Zucker obesas, para comprobar los efectos metabólicos de la manipulación farmacológica in vivo de 11\betaHSD-1, y para evaluar la importancia de los cambios específicos en el tejido de la actividad de 11\beta-HSD1sobre la respuesta terapéutica en la obesidad. La carbenoxolona, un derivado del regaliz que inhibe ambas isozimas de 11\beta-HSD in vivo (68; 69) se utilizó en estos ensayos.
Obesidad
Las ratas Zucker obesas tratadas con vehículo presentaban un consumo de alimento mayor y ganaron más peso en el periodo de tratamiento de tres semanas que los animales delgados (Figura 13). El tratamiento con carbenoxolona no tuvo ningún efecto sobre la ingesta de alimento o el peso corporal tanto en los animales delgados como en los obesos.
Tolerancia a la glucosa
En ratas tratadas con vehículo, los animales obesos presentaban hiperglucemia relativa e hiperinsulinemia tanto en el ayuno como después de la glucosa (Figura 9). El tratamiento con carbenoxolona no presentó ningún efecto significativo sobre la glucosa en el plasma en ambos grupos. En cambio, la carbenoxolona aumentó la insulina en el plasma en el estado de ayuno y 30 min. después de la glucosa tanto en animales delgados como obesos, y también a los 120 min. en animales obesos.
Concentraciones de lípido en el plasma sin ayuno
El colesterol total fue superior en las ratas obesas que en las delgadas, pero no fue afectado por la carbenoxolona (Figura 10). En cambio, el colesterol HDL no fue diferente entre las ratas delgadas y obesas, y aumentó por la carbenoxolona en animales obesos. Los triglicéridos eran mayores en las ratas obesas que en las delgadas, y se redujeron mediante tratamiento con carbenoxolona en animales obesos. Las NEFA del plasma no en ayunas no eran diferentes entre ninguno de los grupos.
Actividades de 11\beta-HSD in vitro
Entre las ratas tratadas con vehículo, se confirmó la desregulación específica del tejido de la actividad de 11\beta-HSD1 en la obesidad (), de modo que los animales obesos presentaban actividad inferior en el hígado pero actividad superior en el tejido adiposo epiploico (Figura 11). La administración de carbenoxolona produjo inhibición mensurable similar ex vivo de las actividades de 11\beta-HSD1 y de 11\beta-HSD2 renal en animales delgados y obesos.
Eje suprarrenal pituitario hipotalámico (HPA)
En las ratas tratadas con vehículo, el peso suprarrenal fue superior en los animales obesos que en los delgados (Figura 13). El tratamiento con carbenoxolona no produjo ningún efecto sobre el peso suprarrenal en los animales delgados, pero mejoró la hipertrofia suprarrenal en las ratas obesas.
Las concentraciones de corticosterona en el plasma fueron variables, reflejando probablemente el estrés incontrolado en el momento de la decapitación. No hubo diferencias estadísticamente significativas en las concentraciones de corticosterona en el plasma, pero existió una tendencia para la corticosterona en el plasma que era mayor en los animales obesos que en los delgados (Figura 13) y para la carbenoxolona para aumentar la corticosterona en el plasma en ambos grupos.
Actividad de 5\beta-reductasa in vitro
El ácido glicirretínico, del que se obtiene la carbenoxolona, se ha descrito que inhibe otras enzimas que metabolizan esteroides, incluyendo la 5\beta-reductasa (70). La 5\beta-reductasa reduce irreversiblemente el anillo A de los glucocorticoides, inactivándolos de este modo. La actividad de la 5\beta-reductasa hepática fue superior en los animales obesos que en los delgados (Figura 12). La carbenoxolona, en lugar de inhibir la 5\beta-reductasa, empeoró el aumento en los animales obesos.
Este experimento evaluó la eficacia de la carbenoxolona en los animales con la desregulación característica específica del tejido de 11\beta-HSD1 que se produce en la obesidad (4; 3; 54). La obesidad en estos animales se confirma que está asociada al aumento de 11\beta-HSD1 en el tejido adiposo y la regulación por disminución en el hígado. Como en las ratas delgadas, la carbenoxolona fue eficaz en la inhibición de la actividad de 11\beta-HSD1 en el hígado y en la actividad en 11\beta-HSD2 en los riñones. Esto ilustra que la reducción adicional en la actividad hepática de 11\beta-HSD1 puede conseguirse farmacológicamente en los animales obesos, más allá de su regulación por disminución basal de la expresión y actividad enzimática. La carbenoxolona no tuvo ningún efecto sobre la glucosa en el plasma en ayunas o sobre la tolerancia de la glucosa. Sin embargo, en estas ratas obesas la carbenoxolona no produjo el mismo modelo de perfil lipídico alterado (con disminución de triglicéridos y aumento de colesterol HDL) que se ha observado en el ratón transgénico 11\beta-HSD1 (55). En el modelo de ratón, esto se ha atribuido a la aumento de oxidación del lípido hepático en lugar de al metabolismo de la adiposis alterado y probablemente procede de la regulación por aumento de PPAR\alpha en el hígado (55). Una enseñanza más del ratón transgénico 11\beta-HSD1 es que las diferencias en el metabolismo hepático de la glucosa se produjeron solamente durante la experimentación dinámica (ayuno y sobrealimentación) (16) mientras que las diferencias en el perfil lipídico fueron más fácilmente aparentes. Puede ser que los ensayos dinámicos del metabolismo hepático de la glucosa pusieran de manifiesto efectos más sutiles de la carbenoxolona en el hígado.
El eje HPA está activado en ratas Zucker obesas y la hipertrofia adenocortical y la hipercorticosteronemia ha tenido continuos descubrimientos (71). La hipertrofia suprarrenal pero no la hipercorticosteronemia mejoraron por la carbenoxolona en este experimento (Figura 13). Esto se explica más fácilmente por la inhibición de la inactivación renal de 11\beta-HSD2 de la corticosterona, que produce la disminución por regulación compensadora de la secreción glucocorticoide, como se ha observado en seres humanos a los que se ha administrado carbenoxolona (68).
En resumen, estos datos demuestran que la inhibición de 11\beta-HSD1 con la carbenoxolona en el hígado tiene efectos beneficiosos sobre el metabolismo de los lípidos en ratas Zucker obesas, a pesar de la actividad basal inferior de la "diana" 11\beta-HSD1.
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Ejemplo 7 Expresión de 11\betaHSD-1 específica para el hígado
La 11\beta-HSD1, que amplía las concentraciones de GC, se expresa principalmente en el hígado, el tejido adiposo y el cerebro. Los estudios de direccionamiento génico en ratones han puesto de manifiesto un requisito para 11\beta-HSD1 en la producción de la gluconeogénesis en el hígado en estrés u obesidad (16). Los animales deficientes en 11\beta-HSD presentan aumento de tolerancia a la glucosa y disminución de triglicéridos en el plasma (55). La sobreexpresión específica para la adiposis de 11\beta-HSD1 en ratones transgénicos favorece la obesidad central, la hiperlipidemia y la diabetes resistente a la insulina (49), pero también aumenta la administración por GC al hígado por la vena porta. Para determinar las consecuencias metabólicas en la elevación del contenido GC intracelular hepático solo los autores generaron ratones transgénicos que sobreexpresan 11\beta-HSD1 específicamente en el hígado bajo el control del activador Apo-E.
Un ADNc para rata 11\beta-HSD1 (con el marco de lectura abierto fusionado en el extremo 3' a una etiqueta de epítopo de hemoaglutinina (HA) del virus de la gripe) se insertó en el vector plásmido (86) utilizado anteriormente para dirigir la expresión específica para el hígado de un transgén en ratones (87). La expresión hepática fue dirigida por 3 kb de la secuencia flanqueante 5' más un primer exón e intrón y parte de un segundo exón de la corriente humana del gen apoE del ADNc insertado. La secuencia incluía también parte de un exón final y un potenciador de 770 bp corriente abajo con terminación de la transcripción suministrada por una señal de poliadenilación SV40. Se escindió un fragmento de \sim5,5 kb de este plásmido por digestión de NotI/EcoRI parcial y se inyectó en el pronúcleo de embriones F1 CBA/C3H para la generación de ratones transgénicos.
Los resultados se presentan en la Figura 15. Estas estirpes presentan por lo menos 5 veces más actividad de 1113-HSD1 en el hígado que los tipos campestres. El análisis presenta ratones macho que tienen tolerancia normal a la glucosa, lo que sugiere que 11\beta-HSD1 hepático no es limitativo para la homeostasis de la glucosa en condiciones basales. Sin embargo, los animales transgénicos presentan aumento de las concentraciones de insulina (\sim50%), triglicéridos en el plasma elevados (\sim2 veces) y aumento del colesterol total en el plasma (20%) atribuible en mayor medida a la fracción no del HDL (colesterol HDL/total = 0,62 transgénico frente a 0,83 del tipo campestre). El análisis histológico pone de manifiesto la acumulación de lípido en los hepatocitos de ratones transgénicos, lo que sugiere que el metabolismo de lípidos puede ser diferencialmente sensible al aumento de la regeneración de GC en el hígado. Además, el peso corporal de ratones transgénicos macho es modestamente elevado en comparación con las camadas de tipo campestre (6-8%), evidente desde \sim10 semanas de vida. Los datos indican que los aumentos selectivos de 11\beta-HSD1 en el hígado reducen modestamente la sensibilidad a la insulina, elevan de manera desventajosa los lípidos en el plasma y producen acumulación hepática de lípidos, manifestando de este modo alguno, pero no todos los aspectos del síndrome metabólico. La interacción entre el hígado y los niveles por GC de adiposis, determinados por 11\beta-HSD1 local, parecen cruciales en la determinación de las manifestaciones del síndrome metabólico.
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Ejemplo 8 11\beta-HSD1 influye en el equilibrio metabólico
Ratones transgénicos que sobreexpresan a 11\beta-HSD1 en el tejido adiposo bajo el control del activador aP2 (49) presentan un fenotipo de hiperfagia, que consume una cantidad mayor de alimento que los ratones de tipo campestre, especialmente de alimentación rica en grasas.
En la hiperfagia de los ratones transgénicos 11\beta-HSD1 (véase Figura 16) se observa también al comienzo de la alimentación rica en grasas. Sin embargo, el peso corporal no aumenta como resultado de la hiperfagia en estos animales.
La falta de aumento en el peso corporal se atribuye a un aumento en el índice metabólico observado en los animales transgénicos 11\beta-HSD1 (-/-) comparado con las referencias de tipo campestre (+/+). Se tomó la temperatura rectal (ºC) después de alrededor de 14 semanas de alimentación rica en grasas (HF).
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+/+ dieta de referencia: 37,1+/-0,2ºC (n=16), +/+ hf: 37,6+/-0,2ºC (n=15)
-/- referencia: 37,7+/-0,2ºC (n=12), -/- hf: 38,3+/-0,2ºC (n=15)
por efecto ANOVA de 2 vías del genotipo: P<0,01
efecto de la dieta: P<0,05
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Ratones transgénicos (-/-) alimentados con una dieta rica en grasas presentan un aumento sustancial del índice metabólico, que explica la falta de aumento de peso corporal en respuesta a la hiperfagia.
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Ejemplo 9 La adiposis y PPAR\gamma del macrófago aumenta en ratones 11\betaHSD-1^{-/-}
Además de la regulación por incremento de PPAR\alpha hepática y por consiguiente del sinergismo previsto con antagonistas de PPAR\alpha, se ha demostrado la expresión aumentada de PPAR\gamma en el tejido adiposo en ratones 11HSD1-/-. En la Figura 17 se presentan los datos. Ésta predice el sinergismo con antagonistas de PPAR\gamma (tales como las tiazolidindionas) en sus efectos beneficiosos sobre la sensibilidad de la insulina, el perfil lipídico en el plasma y la tolerancia a la glucosa. Los beneficios de las tiazolidindionas están atenuados por la ganancia de peso; en combinación con la inhibición de 11HSD1 la tasa metabólica aumentada actúa para prevenir la ganancia de peso.
Efectos sobre la manipulación de lípidos en el macrófago. Un actor clave en la patología aterógena es la célula de espuma, un macrófago con acumulación de lípidos dentro de la placa ateromatosa. Los datos recientes en la materia demuestran que los agonistas de PPAR\gamma aumentan la absorción del colesterol en los macrófagos pero crucialmente, presentan un efecto mayor para aumentar el eflujo de colesterol (75, 76). Se ha demostrado la regulación por incremento de ARNm de PPAR\gamma en los macrófagos de ratones 11HSD1 -/-, como se indica en la Figura 18. Sin desear estar ligado a ninguna teoría en concreto, la inhibición de 11\betaHSD-1 en macrófagos puede reducir la formación de células de espuma y el almacenamiento del colesterol en los macrófagos, con efectos beneficiosos en la patología aterógena.
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Ejemplo 10 Efectos de 11\betaHSD-1 sobre el contenido intrahepático de grasa
La sobreexpresión específica para el hígado de 11\beta-HSD1 en ratones produce un aumento en el contenido hepático de grasa.
Se extrajeron hígados de ratones transgénicos ApoE-11\beta-HSD-1 en dietas de pienso normales, se seccionaron y se tiñeron con Oil RedO (55). La acumulación de lípidos se observó en los ratones transgénicos que sobreexpresan 11\beta-HSD-1 selectivamente en el hígado.
La acumulación de grasa ectópica en tejidos sensibles a insulina tal como el hígado y el músculo esquelético está asociada a la resistencia a la insulina específica para el tejido. Como se muestra en la presente memoria, la reactivación excesiva de la cortisona a cortisol por la 11\beta-hidroxiesteroide deshidrogenasa de tipo 1 (11\beta-HSD-1) caracteriza sujetos con aumento de la acumulación de grasa en el hígado y resistencia hepática a la insulina independientemente de la obesidad.
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El estudio se realizó en 19 hombres no diabéticos y aparentemente sanos. En la Figura 14 se presentan mediciones antropométricas y de composición del cuerpo. El contenido medio de LFAT fue 5 veces superior en los hombres con LFAT alta. Los grupos fueron similares con respecto a la edad, condición física (VO2max) y marcadores de absorción de alcohol (MCV 90\pm1 frente a 88\pm1 fl, AST/ALT 0,81\pm0,08 frente a 1,04\pm0,09 alta frente a LFAT baja). Ambas AST (38\pm4 frente a 25\pm2 U/l, p<0,02) y ALT (53\pm9 frente a 27\pm4 U/l, p<0,02) fueron significativamente superiores en hombres con LFAT elevada. Todas las mediciones de obesidad que incluyen el índice de masa corporal, el W/H y las mediciones de MRI de la relación visceral y subcutánea y de la relación visceral/subcutánea fueron similares en los dos grupos.
Las concentraciones de glucosis en el plasma en ayunas y de hemoglobina glucosilada fueron comparables entre los grupos, aunque los hombres con LFAT elevada presentaban insulina en el suero en ayunas superior, 40% más de triglicéridos en el suero en ayunas y presión sanguínea sistólica a las 24 horas superior (Figura 14). Las concentraciones de colesterol HDL y LDL y la presión sanguínea diastólica a las 24 horas no fueron significativamente diferentes entre los grupos.
Acción de la insulina in vivo
La acción de la insulina sobre la producción y deposición de la glucosa endógena. Durante la infusión de insulina, las concentraciones de insulina en el suero fueron de 25\pm2 de promedio en el hombre con una LFAT alta y 21\pm1 mU/l en aquellas con una LFAT baja (NS). El aumento por encima del basal fue de 16 \pm 2 y 15\pm1 mU/l de promedio, respectivamente (NS). Los índices de glucosa endógena basal R_{a} y R_{d} fueron comparables entre los grupos (2,3\pm0,2 frente a 2,5\pm0,2 mg/kg\cdotmin o 102\pm6 frente a 111\pm6 mg/m^{2}\cdotmin, bajo frente a LFAT alto, respectivamente). Durante la última hora de la infusión de insulina, la glucosa endógena R_{a} fue significativamente menos suprimida en el hombre con LFAT alta (41\pm15%) en comparación con aquellas con LFAT baja (91\pm16%) (Figura 19a). Los índices de glucosa R_{d} no fueron diferentes durante la última hora de hiperinsulinemia (3,0\pm0,3 frente a 3,1\pm0,3 mg/kg\cdotmin, respectivamente, NS).
Acción de la insulina sobre las concentraciones de FFA en el suero. Las concentraciones de FFA en el suero en ayunas fueron comparables básicamente (662\pm62 frente a 550\pm54 \mumoles/l, NS, LFAT alta frente a baja) y durante las primeras 2 horas de la infusión de insulina (Figura 19b). Durante la última hora de la infusión de insulina, FFA en el suero permaneció 44% superior en el grupo con LFAT alta (329\pm41 frente a 228\pm23 \mumoles/l en LFAT baja, p<0,05).
Secreción y metabolismo de cortisol. En la Figura 20 se representan las concentraciones de cortisol en el suero después del acetato de cortisona oral. En el análisis univariante, las concentraciones se diferenciaron significativamente a los 75 y 90 min. En ANOVA para mediciones repetidas, tanto LFAT (p<0,05 para tiempo \times LFAT) como BMI (p<0,05 para tiempo \times BMI) fueron independientes, pero al contrario, los determinantes de las concentraciones de cortisol en el suero en estos puntos de tiempo. BMI y LFAT explicaron en conjunto el 57% (p=0,001) de la varianza en el cortisol en el plasma (concentración media a 75 y 90 min.). La ecuación de regresión para la concentración media de cortisol en el suero (media de 75 y 90 min.) fue la siguiente: cortisol (nmoles/l) = (1.098\pm180)-(29\pm7\timesBMI (kg/m^{2}, p<0,01)) + (7,4\pm3,3 \times LFAT (%, p<0,05)). Sobre el intervalo de LFAT observado (1-23%) a una BMI constante de 25 kg/m^{2}, la variación prevista en S-cortisol es 380 a 543 nmoles/l, que correspondería a la variación en BMI de 27 a 22 kg/m^{2} a una LFAT % constante (10%).
Hombres con acumulación ectópica de grasa en el hígado presentan resistencia selectiva a la insulina hepática y convierten más cortisona en cortisol, lo que sugiere el aumento de la actividad hepática de 11\beta-HSD-1. Estos datos apoyan el concepto de que la acción glucocorticoide del tejido en exceso contribuye a la resistencia hepática a la insulina.
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Ejemplo 11 La inhibición de 11b-HSD1 protege de los efectos desfavorables de los glucocorticoides sintéticos
Los glucocorticoides sintéticos pueden utilizarse en la terapia antiinflamatoria (por ejemplo, en la enfermedad inflamatoria del intestino, artritis, asma) y están metabolizados por enzimas 11\beta-HSD. Los ejemplos incluyen la interconversión de la prednisolona con la prednisona (78) y la interconversión de la dexametasona con la 11-deshidrodexametasona (77). Como resultado, el 11-ceto-esteroide inactivo está en circulación durante el tratamiento con estos fármacos y puede reactivarse para activar 11-hidroxi-esteroide en los tejidos en los que se expresa 11-HSD1. De este modo, la inhibición de 11\beta-HSD1 impedirá la reactivación del glucocorticoide en estos puntos y puede proteger contra efectos desfavorables indeseados de los glucocorticoides, permitiendo el direccionamiento de la acción del glucocorticoide a puntos donde los efectos antiinflamatorios son deseables.
Se ha demostrado la manipulación de los efectos glucocorticoides del glucocorticoide sintético beclometasona. La beclometasona se somete al metabolismo por 11\beta-HSD1. La Figura 21a presenta la incubación de la beclometasona con hígado de rata homogeneizado en condiciones conocidas en la materia (82) que contiene 11\beta-HSD1 que en condiciones homogeneizadas funciona como una deshidrogenasa. La conversión de beclometasona en 11-deshidrobeclometasona fue medida por HPLC con detección ultravioleta en línea a 254 nm. La conversión observada durante esta incubación confirma que la beclometasona es un sustrato para 11\beta-HSD1.
La beclometasona es un agonista receptor glucocorticoide. Se demuestra también que la inhibición de 11\beta-HSD1 reduce una respuesta mediada por el receptor glucocorticoide en la piel humana (79). 12 personas sanas de 20 a 33 años de edad tenían aplicada beclometasona en la piel del antebrazo, según Noon et al. 1996. En zonas separadas de la piel, se aplicó beclometasona junto con ácido glicirretínico, un inhibidor de 11\beta-HSD (81). La intensidad del blanqueo de la piel fue registrada al día siguiente por dos observadores que eran ciegos a la orden de aplicación de soluciones esteroides, según se describe (80). Las puntuaciones se calcularon para el área bajo la curva de respuesta a la dosis para la beclometasona o para la beclometasona con adición de ácido glicirretínico. En la Figura 21b se presentan los resultados. El ácido glicirretínico redujo la respuesta del blanqueamiento a la beclometasona, que sin estar ligado a ninguna teoría en particular sugiere que la prevención de la reactivación de la beclometasona en la piel por 11\beta-HSD1 atenúa la potencia glucocorticoide local.
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Claims (16)

1. Utilización de un agente que reduce la actividad intracelular de 11\beta-HSD1 y un agonista de PPAR\alpha en la preparación de una composición para la estimulación de un perfil lipídico ateroprotector.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la que un agente que modula la expresión del gen 11\beta-HSD1 endógeno reduce las concentraciones de 11\beta-HSD1.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que un agente que modula la transcripción o traducción del ARNm de 11\beta-HSD1 reduce las concentraciones de 11\beta-HSD1.
4. Utilización según la reivindicación 1 ó 2, en la que un agente que inhibe la síntesis o actividad de 11\beta-HSD1 reduce las concentraciones de 11\beta-HSD1.
5. Utilización según la reivindicación 4, en la que dicho agente se selecciona de entre el grupo constituido por carbenoxolona, 11-oxoprogesterona, 3a,17,21-trihidroxi-5\beta-pregnan-3-ona, 21-hidroxi-pregn-4-eno-3,11,20-triona, androst-4-eno-3,11,20-triona y 3\beta-hidroxiandrost-5-en-17-ona.
6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el perfil lipídico ateroprotector comprende una reducción en las concentraciones de triglicéridos en el plasma.
7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que el perfil lipídico ateroprotector comprende un aumento en las concentraciones de colesterol HDL.
8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que las concentraciones de apoCIII en el suero se reducen como consecuencia de la reducción de las concentraciones de 11\beta-HSD1.
9. Composición farmacéutica que comprende un agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1 y un agonista de PPAR\alpha.
10. Agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1 y un agonista de PPAR\alpha para la utilización simultánea, independiente o secuencial en el fomento de un perfil lipídico ateroprotector.
11. Kit que comprende un agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1 y un agonista de PPAR\alpha, e instrucciones para su utilización en el fomento de un perfil lipídico ateroprotector.
12. Kit que comprende un agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1 y un agonista de PPAR\alpha, acondicionado en dosis unitarias en el fomento de un perfil lipídico ateroprotector.
13. Composición farmacéutica que comprende un agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1 y un agonista de PPAR\gamma.
14. Agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1 y un agonista de PPAR\gamma para la utilización simultánea, independiente o secuencial en el control del riesgo cardiovascular.
15. Kit que comprende un agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1 y un agonista de PPAR\alpha, e instrucciones para su utilización en el control del riesgo cardiovascular.
16. Kit que comprende un agente que reduce la actividad de 11\beta-HSD1 y un agonista de PPAR\alpha, acondicionado en dosis unitarias para su utilización en el control del riesgo cardiovascular.
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