BRPI0921342B1

BRPI0921342B1 - Uso de uma zn-alfa 2 -glicoproteína junto com insulina ou sr59230a na preparação de uma formulação para tratamento de diabetes ou obesidade em um indivíduo

Info

Publication number: BRPI0921342B1
Application number: BRPI0921342-2A
Authority: BR
Inventors: Michael J. Tisdale; Steven Russell
Original assignee: Aston University
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2009-11-07
Publication date: 2022-02-01
Also published as: JP2015013872A; JP2022068320A; US20180339019A1; US20200330554A1; CN102271701A; WO2010052563A3; US20100173829A1; AU2016204169B2; US20210315969A1; CA2743026A1; CA2743026C; WO2010052563A2; JP2020172540A; JP2019116487A; JP2017002069A; BRPI0921342A2; KR20110100210A; IL212695A0; US20240000888A1; JP2012508222A

Abstract

GLICOPROTEÍNAS TENDO PROPRIEDADES DE MOBILIZAÇÃO DE LIPÍDEOS E APLICAÇÕES TERAPÊUTICAS DAS MESMAS. A invenção proporciona composições e métodos para melhorar sintomas associados com hiperglicemia por administração de uma Zn-(alfa)2-gli-coproteína ou um fragmento funcional da mesma, métodos de diminuir os níveis de insulina plasmática, métodos de aumentar a massa de músculo esquelético, e métodos de produzir uma redução de peso ou redução da obesidade. Também são proporcionais composições farmacêuticas para aplicação das mesmas.

Description

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere de modo geral a medicamen to e ao tratamento de hiperglicemia e obesidade, e mais particularmente, a composições e métodos para melhorar sintomas associados com hiperglicemia.

INFORMAÇÃO DE ANTECEDENTES

[0002] Diabetes se caracteriza por metabolismo da glicose prejudi cado se manifestando entre outras coisas por um nível elevado de glicose sanguínea no paciente diabético. Defeitos subjacentes levam a uma classificação do diabetes em dois grupos maiores. Diabetes tipo 1, ou diabetes mellitus insulina dependente (IDDM), surge quando os pacientes carecem de células beta produtoras de insulina em suas glândulas pancreáticas. Diabetes tipo 2, ou diabetes mellitus não insulina dependente (NIDDM), ocorre em pacientes com função das células beta prejudicada e alterações na ação da insulina.

[0003] Tanto o diabetes tipo 1 quanto tipo 2 estão associados com perda de massa de músculo esquelético, a qual tem sido atribuída a um aumento da decomposição de proteínas miofibrilares, através de um aumento da atividade do caminho ubiquitina-proteassoma. Embora isto seja particularmente prevalente no diabetes tipo 1, é somente parcialmente explicado por privação de insulina, e estudos experimentais em camundongos db/db mostram que a resistência a insulina causa degeneração muscular.

[0004] Ocorre perda de músculo esquelético em modelos tanto de severamente hipoinsulinêmicos (induzida por estreptozotocina) quanto de diabetes severamente resistente a insulina (ob/ob) em camundongos. A perda de proteína muscular no diabetes está associada tanto com uma depressão da síntese de proteína, quanto com um aumento na degradação de proteína no músculo esquelético. O aumento na degradação de proteína está associado com aumento da atividade tanto de caspase-3 quanto do proteassoma.

[0005] A obesidade está associada com resistência à insulina e diabetes tipo 2. Uma lipólise induzida por catecolamina prejudicada e redução da expressão de lipase sensível a hormônio (HSL) é observada nos adipócitos na obesidade, a qual foi sugerida que contribui para o desenvolvimento, ou manutenção, de aumento dos depósitos de tecido adiposo. Em contraste, adipócitos de indivíduos caquéxicos apresentam um aumento de duas a três vezes na resposta lipolítica com aumento da expressão de HSL.

[0006] A Zinco-α2-glicoproteina (ZAG) foi identificada como um fator de mobilização de lipídeos (LMF) com o potencial de induzir perda de gordura em caquexia do câncer. Foi demonstrado que ZAG induz lipóli- se nos adipócitos brancos por interação com um receptor β3- adrenérgico, ao passo que aumentou in vivo a expressão de proteína desacopladora-1 (UCP-1) em tecido adiposo marrom (BAT), e induziu perda da gordura corporal. Além de alguns tumores, ZAG também é produzida pelo tecido adiposo branco (WAT) e pelo tecido adiposo marrom (BAT) e sua expressão é suprarregulada em caquexia. Em contraste, a expressão de ZAG no tecido adiposo de humanos obesos foi somente 30% da expressão de ZAG encontrada em indivíduos não obesos. Isto sugere que a perda da expressão de ZAG no tecido adiposo branco pode ser responsável por algumas das características da obesidade. Certamente a inativação de ambos os alelos de ZAG em camundongos leva a um aumento no peso corporal o qual foi mais pronunciado quando os animais foram alimentados com uma dieta de alto teor de gordura. A reação lipolítica a vários agentes foi significativamente reduzida em adipócitos de animais deficientes de ZAG.

[0007] Até o momento todos os estudos sobre o efeito de mobili zação de lipídeos de ZAG foram realizados em camundongos, usando ZAG humana, embora as identidades em sequência de aminoácidos de ZAG entre camundongo e humano sejam de somente 58,6%. Como a homologia de sequência entre rato e camundongo é de 88,5%, isto sugere que se ZAG humana liga ao receptor de camundongo também deve ser eficaz no rato. O presente estudo investiga o efeito antiobesi- dade de ZAG humana em ratos Wistar machos maduros.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0008] A presente invenção se baseia na constatação de que a Zinco-α2-glicoproteina (ZAG) tem um efeito sobre o peso corporal e a responsividade à insulina em camundongos adultos obesos hipergli- cêmicos (ob/ob) e ratos Wistar maduros, como modelos de diabetes tipo 2. Um achado similar é útil em métodos para melhorar os sintomas associados com hiperglicemia.

[0009] Por conseguinte, a presente invenção proporciona um méto do de melhorar sintomas de hiperglicemia em um indivíduo. O método inclui administrar ao indivíduo que necessite de similar tratamento uma dosagem terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo tendo a sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma, por um período de cerca de 10 dias ou mais, resultando em uma melhora de sintomas associados com hiperglicemia depois do tratamento. Em uma modalidade, o tratamento inclui administração diária por 10 dias. Em outra modalidade, o polipeptídeo é administrado diariamente, dia sim, dia não, a cada 2 dias, ou a cada 3 dias, por até 10 dias ou mais. Em outra modalidade, o polipeptídeo é administrado duas vezes ao dia. O polipep- tídeo pode ser administrado por via intravenosa, por via subcutânea, por via intraperitoneal, ou por via oral. Em outra modalidade, o polipeptídeo é administrado em combinação com um ou mais agentes selecionados entre o grupo consistindo em um antagonista de receptor e3-adrenérgico (β3-AR) e um β3 agonista. Em uma modalidade, o antagonista de β3-AR é SR59230A. Em outra modalidade, β3 agonista é AMNI-BRL37344 (BRL37344). Em outra modalidade, o polipeptídeo é glicosilado.

[00010] Melhora dos sintomas associados com hiperglicemia inclui, mas não está limitada a, uma redução nos níveis séricos de glicose, uma redução nos níveis séricos de triglicerídeos, uma redução nos níveis séricos de insulina, e uma redução nos níveis séricos de ácidos graxos não esterificados, em comparação com os níveis séricos antes do tratamento. Em uma modalidade, a melhora dos sintomas inclui um aumento na temperatura corporal de cerca de 0,4° a 1°C dentro de 1 dia de iniciar o tratamento, em comparação com a temperatura corporal antes do tratamento. Em outra modalidade, a melhora dos sintomas inclui uma redução nos níveis de insulina plasmática dentro de 3 dias de iniciar o tratamento, em comparação com os níveis de insulina plasmática antes do tratamento. Os níveis plasmáricos de insulina e/ou de glicose e triglicerídeos podem ser reduzidos tanto quanto 36% em comparação com os níveis plasmáricos de insulina e/ou de glicose e triglicerídeos antes do tratamento. Em outra modalidade, a melhora dos sintomas compreende normalização dos níveis de glicose sanguínea e secreção de insulina em resposta a glicose intravenosa (2 g/kg) dentro de 3 dias de iniciar o tratamento. Em outra modalidade, a melhora dos sintomas compreende um aumento nos níveis de insulina pancreática, em comparação com os níveis de insulina pancreática antes do tratamento. Em ainda outra modalidade, a melhora dos sintomas compreende aumento da expressão de proteína desacopladora- 1 (UCP1) e proteína desacopladora-3 (UCP3) em tecido adiposo marrom, em comparação com a expressão de UCP1 e UCP3 antes do tratamento. Em ainda outra modalidade, a melhora dos sintomas com- preende aumento da expressão de UCP3 em músculo esquelético, em comparação com a expressão de UCP3 antes do tratamento. Em outra modalidade, o polipeptídeo é glicosilado.

[00011] Em outros aspectos, a presente invenção proporciona um método de diminuir os níveis de insulina plasmática em um indivíduo. O método inclui administrar ao indivíduo uma dosagem terapeutica- mente eficaz de um polipeptídeo tendo a sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma. Em uma modalidade, o polipeptídeo é administrado ao indivíduo por um período de até 10 dias, em que há diminuição nos níveis de insulina plasmática depois do tratamento. Em outra modalidade, o polipeptídeo é administrado ao indivíduo por um período de até 21 dias, em que há diminuição nos níveis de insulina plasmática depois do tratamento. Em outra modalidade, a diminuição nos níveis de insulina plasmática ocorre dentro de 3 dias da administração do polipeptídeo. Em outra modalidade, o polipeptídeo é administrado em combinação com um ou mais agentes selecionados entre o grupo consistindo em um antagonista de receptor e3-adrenérgico (β3-AR) e um β3 agonista. Em uma modalidade, o antagonista de β3-AR é SR59230A. Em outra modalidade, β3 agonista é AMNI-BRL37344 (BRL37344). Em outra modalidade, o polipeptídeo é glicosilado.

[00012] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de aumentar a massa de músculo esquelético em um indivíduo. O método inclui administrar ao indivíduo um polipeptídeo tendo a sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma. Em uma modalidade, o músculo esquelético é um músculo gastrocnêmio ou um músculo sóleo. Em outra modalidade, o polipeptí- deo é administrado ao indivíduo por um período de até 10 dias, em que há um aumento na massa de músculo esquelético depois do tratamento. Em outra modalidade, o polipeptídeo é administrado ao indi víduo por um período de até 21 dias, em que há um aumento na massa de músculo esquelético depois do tratamento. Em outra modalidade, o polipeptídeo é administrado em combinação com um ou mais agentes selecionados entre o grupo consistindo em um antagonista de receptor e3-adrenérgico (β3-AR) e um β3 agonista. Em uma modalidade, o antagonista de β3-AR é SR59230A. Em outra modalidade, β3 agonista é AMNI-BRL37344 (BRL37344). Em outra modalidade, o po- lipeptídeo é glicosilado.

[00013] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratar um indivíduo para produzir uma redução de peso ou redução da obesidade. O método inclui administrar ao indivíduo que necessite de similar tratamento uma dosagem terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo tendo a sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma combinação com um ou mais agentes selecionados entre o grupo consistindo em um antagonista de receptor e3-adrenérgico (β3-AR) e um β3 agonista. Em uma modalidade, o antagonista de β3-AR é SR59230A. Em outra modalidade, β3 ago- nista é AMNI-BRL37344 (BRL37344). Em outra modalidade, o polipep- tídeo é glicosilado.

[00014] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de tratar um indivíduo para produzir uma redução de peso ou redução da obesidade. O método inclui administrar ao indivíduo que necessite de tratamento similar a uma dosagem terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo tendo a sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma em combinação com um ou mais agentes selecionados entre o grupo consistindo em um antagonista de receptor e3-adrenérgico (β3-AR) e um β3 agonista. Em uma modalidade, o antagonista de β3-AR é SR59230A. Em outra modalidade, β3 agonista é AMNI-BRL37344 (BRL37344). Em outra modalidade, o po- lipeptídeo é glicosilado.

[00015] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica compreendendo um polipeptídeo tendo a sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 e um agente selecionado entre o grupo consistindo em um antagonista de receptor e3-adrenérgico (β3-AR) e um β3 agonista. Em uma modalidade, o antagonista de β3-AR é SR59230A. Em outra modalidade, β3 agonista é AMNI-BRL37344 (BRL37344). Em outra modalidade, o polipeptídeo é glicosilado.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[00016] A Figura 1A é um diagrama pictorial mostrando a caracterização de ZAG e seu efeito sobre a lipólise e o peso corporal de camundongos ob/ob. Tintura Coomassie depois de SDS-PAGE a 12% mostrando proteínas totais em meio celular 293 e ZAG purificada conforme descrito.

[00017] A Figura 1B é um diagrama pictorial mostrando os resultados de um Western blot mostrando a expressão de ZAG em meio de cultura e ZAG purificada.

[00018] A Figura 1C é um diagrama gráfico mostrando os níveis de RNAm de ZAG em tecido adiposo e tecido hepático em camundongos MAC16 experimentando perda de peso. P<0,01.

[00019] A Figura 1D é um diagrama gráfico mostrando os resultados de lipólise em adipócitos epididimais de camundongos não obesos (■) e ob/ob (□) em resposta a isoprenalina (Iso) e ZAG. Diferenças de camundongos não obesos são mostradas como * P<0,05, ** P<0,01 e *** p<0,001.

[00020] A Figura 1E é um diagrama gráfico mostrando os resultados de lipólise em adipócitos de depósitos epididimais (ep), subcutâneos (s.c.) e viscerais (vis) de camundongos obesos (ob/ob) e não obesos (non ob) com quer nenhum tratamento (■), isoprenalina (10 μM) (□) ou ZAG (0,46 μM) (H). Diferenças de adipócitos epididimais são mostradas como ** P<0,01.

[00021] A Figura 1F é um diagrama gráfico mostrando o efeito de ZAG (■) sobre o peso corporal de camundongos ob/ob em comparação com PBS (♦) conforme descrito nos métodos. Diferenças em peso do tempo zero e controles de PBS são mostradas como *** p<0,001.

[00022] A Figura 1G é um diagrama gráfico mostrando o efeito de ZAG (□) sobre a temperatura corporal dos camundongos mostrada e em comparação com controles de PBS (■). Diferenças de controle são mostradas como *** p<0,001.

[00023] A Figura 2A é um diagrama gráfico mostrando tolerância a glicose, captação de glicose nos adipócitos e no músculo gastrocnê- mio de camundongos ob/ob tratados com ZAG. Os níveis de glicose plasmática em camundongos ob/ob no estado alimentado quer tratados com ZAG (■) ou com PBS (♦) por 3 dias depois de administração i.v. de glicose (2 g/kg). p<0,001 de PBS. Amostras de sangue foram removidas da veia da cauda em intervalos depois da administração de glicose e usadas para a medição de glicose e insulina.

[00024] A Figura 2B é um diagrama gráfico mostrando os níveis de insulina plasmática em camundongos ob/ob tratados com ZAG depois de administração oral de glicose (1 g/kg). p<0,001 de PBS.

[00025] A Figura 2C é um diagrama gráfico mostrando a captação de glicose nos adipócitos epididimais (ep), viscerais (vis) e subcutâneos (s.c.) de camundongos ob/ob tratados com ZAG por 5 dias na presença de 0 ( ■ ), 1 ( □) ou 10 nM de insulina (H ). Diferenças na presença de ZAG são indicadas como *** p<0,001.

[00026] A Figura 2D é um diagrama gráfico mostrando a captação de 2-deoxi-D-glicose no músculo gastrocnêmio de camundongos ob/ob tratados com quer ZAG ou PBS por 5 dias na ausência ou presença de insulina (100 nM). Diferenças na presença de insulina são mostradas como * P<0,05 ou ** P<0,01, ao passo que diferenças na presença de ZAG são mostradas como *** p<0,001.

[00027] A Figura 2E é um diagrama pictorial mostrando o efeito de ZAG sobre a síntese de proteína e a degradação no músculo esquelético de camundongos ob/ob. Depois do tratamento de camundongos ob/ob por 5 dias o músculo esquelético foi removido e analisado por Western blot para expressão de GLUT4.

[00028] A Figura 3A é um diagrama gráfico mostrando o efeito de ZAG sobre a síntese de proteína e a degradação no músculo esquelético de camundongos ob/ob. Depois do tratamento de camundongos ob/ob por 5 dias o músculo esquelético foi removido e usado para a medição da síntese de proteína. Diferenças de controles de PBS, ou animais não obesos são mostrados como *** p<0,001.

[00029] A Figura 3B é um diagrama gráfico mostrando o efeito de ZAG sobre a síntese de proteína e a degradação no músculo esquelético de camundongos ob/ob. Depois do tratamento de camundongos ob/ob por 5 dias o músculo esquelético foi removido e usado para a medição da degradação de proteína. Diferenças de controles de PBS, ou animais não obesos são mostrados como *** p<0,001.

[00030] A Figura 3C é um diagrama gráfico mostrando o efeito de ZAG sobre a síntese de proteína e a degradação no músculo esquelético de camundongos ob/ob. Depois do tratamento de camundongos ob/ob por 5 dias o músculo esquelético foi removido e usado para a medição da atividade de enzima similar a quimotripsina. Diferenças de controles de PBS, ou animais não obesos são mostrados como *** p<0,001.

[00031] A Figura 3D é um diagrama pictorial mostrando o efeito de ZAG sobre a síntese de proteína e a degradação no músculo esquelético de camundongos ob/ob. Depois do tratamento de camundongos ob/ob por 5 dias o músculo esquelético foi removido e analisado por Western blot para expressão de subunidades-α do 20S-proteassoma.

[00032] A Figura 3E é um diagrama pictorial mostrando o efeito de ZAG sobre a síntese de proteína e a degradação no músculo esquelético de camundongos ob/ob. Depois do tratamento de camundongos ob/ob por 5 dias o músculo esquelético foi removido e analisado por Western blot para expressão de p42.

[00033] A Figura 3F é um diagrama pictorial mostrando o efeito de ZAG sobre a síntese de proteína e a degradação no músculo esquelético de camundongos ob/ob. Depois do tratamento de camundongos ob/ob por 5 dias o músculo esquelético foi removido e analisado por Western blot para expressão de miosina.

[00034] A Figura 3G é um diagrama pictorial mostrando o efeito de ZAG sobre a síntese de proteína e a degradação no músculo esquelético de camundongos ob/ob. Depois do tratamento de camundongos ob/ob por 5 dias o músculo esquelético foi removido e analisado por Western blot para expressão de actina.

[00035] A Figura 4A é um diagrama pictorial mostrando o efeito de ZAG sobre os caminhos de sinalização catabólica no músculo esquelético por análise por Western blot (Western blotting) de fosfo PKR no músculo gastrocnêmio de camundongos ob/ob depois de tratamento com quer PBS ou ZAG por 5 dias. As formas totais das proteínas servem como controles de carga. Diferenças de controles de PBS são mostradas como *** P<0,001 ao passo que diferenças de camundongos não obesos são mostradas como # p<0,001.

[00036] A Figura 4B é um diagrama pictorial mostrando o efeito de ZAG sobre os caminhos de sinalização catabólica no músculo esquelético por análise por Western blot de fosfo eIF2a no músculo gastrocnêmio de camundongos ob/ob depois de tratamento com quer PBS ou ZAG por 5 dias. As formas totais das proteínas servem como controles de carga. Diferenças de controles de PBS são mostradas como *** P<0,001 ao passo que diferenças de camundongos não obesos são mostradas como # p<0,001.

[00037] A Figura 4C é um diagrama pictorial mostrando o efeito de ZAG sobre os caminhos de sinalização catabólica no músculo esquelético por análise por Western blot de fosfo PLA2 no músculo gastroc- nêmio de camundongos ob/ob depois de tratamento com quer PBS ou ZAG por 5 dias. As formas totais das proteínas servem como controles de carga. Diferenças de controles de PBS são mostradas como *** P<0,001 ao passo que diferenças de camundongos não obesos são mostradas como # p<0,001.

[00038] A Figura 4D é um diagrama pictorial mostrando o efeito de ZAG sobre os caminhos de sinalização catabólica no músculo esquelético por análise por Western blot de fosfo p38MAPK no músculo gas- trocnêmio de camundongos ob/ob depois de tratamento com quer PBS ou ZAG por 5 dias. As formas totais das proteínas servem como controles de carga. Diferenças de controles de PBS são mostradas como *** P<0,001 ao passo que diferenças de camundongos não obesos são mostradas como # p<0,001.

[00039] A Figura 4E é um diagrama gráfico mostrando o efeito de ZAG sobre caminhos de sinalização catabólica em músculo esquelético por atividade de caspase-3 (■) e caspase-8 (□) em músculo gas- trocnêmio de camundongos ob/ob depois de tratamento com quer PBS ou ZAG por 5 dias.

[00040] A Figura 5A é um diagrama pictorial mostrando a expressão de HSL e ATGL em resposta a ZAG. Western blots mostram a expressão de fosfo HSL em adipócitos de camundongos não obesos 3 horas depois de nenhum tratamento (Con), ou tratamento com isoprenalina (10 μM) ou ZAG (0,46 μM) somente, ou na presença de PD98059 (25 μM) depois de 5 dias de tratamento com ZAG.

[00041] A Figura 5B é um diagrama pictorial mostrando a expressão de HSL por immunoblotting em adipócitos epididimais (ep) depois de 5 dias de tratamento com ZAG.

[00042] A Figura 5C é um diagrama pictorial mostrando a expressão de HSL por immunoblotting em adipócitos subcutâneos (sc) depois de 5 dias de tratamento com ZAG.

[00043] A Figura 5D é um diagrama pictorial mostrando a expressão de HSL por immunoblotting em adipócitos viscerais (vis) depois de 5 dias de tratamento com ZAG.

[00044] A Figura 5E é um diagrama pictorial mostrando a expressão de ATGL em adipócitos epididimais depois de 5 dias de tratamento com ZAG.

[00045] A Figura 5F é um diagrama pictorial mostrando a expressão de ATGL em adipócitos subcutâneos depois de 5 dias de tratamento com ZAG.

[00046] A Figura 5G é um diagrama pictorial mostrando a expressão de ATGL em adipócitos viscerais depois de 5 dias de tratamento com ZAG.

[00047] A Figura 5H é um diagrama pictorial mostrando a expressão de ERK em adipócitos epididimais depois de 5 dias de tratamento com ZAG.

[00048] A Figura 5I é um diagrama pictorial mostrando a expressão de ERK em adipócitos subcutâneos depois de 5 dias de tratamento com ZAG.

[00049] A Figura 5J é um diagrama pictorial mostrando a expressão de ERK em adipócitos viscerais depois de 5 dias de tratamento com ZAG.

[00050] A Figura 5K é um diagrama gráfico mostrando a resposta dos adipócitos de depósitos epididimais (ep), subcutâneos (sc) e viscerais (vis) de camundongos ob/ob tratados com quer PBS ou ZAG por 5 dias ao efeito lipolítico de BRL37344. Diferenças de controles de PBS são indicadas como *** P<0,01, ao passo que diferenças na presença de PD98059 são mostradas como # p<0,001.

[00051] A Figura 6A é um diagrama pictorial mostrando o efeito do tratamento de camundongos ob/ob por 5 dias com ZAG sobre a expressão de ZAG e HSL em WAT (tecido adiposo branco), UCP1 e UCP3 em BAT (tecido adiposo marrom) e UCP3 no músculo gastroc- nêmio. Western blot mostrando a expressão de ZAG em adipócitos ep, sc, e vis. O Dia 0 representa o dia em que os adipócitos foram removidos dos camundongos.

[00052] A Figura 6B é um diagrama pictorial mostrando a expressão de ZAG em adipócitos epididimais que foram suspendidos em meio RMPI conforme descrito em métodos. As amostras foram colhidas em intervalos diários e analisadas por Western blot para expressão de ZAG. O Dia 0 representa o dia em que os adipócitos foram removidos dos camundongos.

[00053] A Figura 6C é um diagrama pictorial mostrando a expressão de HSL em adipócitos epididimais que foram suspendidos em meio RMPI conforme descrito em métodos. As amostras foram colhidas em intervalos diários e analisadas por Western blot para expressão de HSL. O Dia 0 representa o dia em que os adipócitos foram removidos dos camundongos.

[00054] A Figura 6D é um diagrama pictorial mostrando a expressão de UCP1 em BAT removido de camundongos. Diferenças de camundongos tratados com PBS são mostradas como *** p<0,001.

[00055] A Figura 6E é um diagrama pictorial mostrando a expressão de UCP3 em BAT removido de camundongos. Diferenças de camundongos tratados com PBS são mostradas como *** p<0,001.

[00056] A Figura 6F é um diagrama pictorial mostrando a expressão de UCP3 em músculo gastrocnêmio removido de camundongos. Diferenças de camundongos tratados com PBS são mostradas como *** p<0,001.

[00057] A Figura 7A é um diagrama gráfico mostrando a perda de peso dos camundongos ob/ob durante o estudo de 21 dias. ZAG foi injetada nos dias 1, 4, 5, 8, 13, 16, 18, e 19; PBS foi injetada nos mesmos momentos.

[00058] A Figura 7B é um diagrama gráfico mostrando a alteração de peso (g) dos camundongos ob/ob (peso de 80 a 90 g) durante tratamento com ZAG.

[00059] A Figura 7C é um diagrama gráfico mostrando o aumento da temperatura corporal dos camundongos ob/ob durante o estudo de 21 dias. ZAG foi injetada nos dias 1, 4, 5, 8, 13, 16, 18, e 19; PBS foi injetada nos mesmos momentos.

[00060] A Figura 8A é um diagrama gráfico mostrando uma redução progressiva na excreção urinária de glicose durante os primeiros 5 dias de tratamento.

[00061] A Figura 8B é um diagrama gráfico mostrando uma redução progressiva na excreção urinária de glicose durante o estudo de 21 dias.

[00062] A Figura 9 é um diagrama gráfico mostrando liberação de glicerol estimulada por adipócitos isolados com isoprenalina (iso) os quais tinham estado em cultura até 5 dias de camundongos ob tratados com e sem ZAG.

[00063] A Figura 10 é um diagrama pictorial mostrando a sequência de aminoácidos completa (SEQ ID NO: 1) da Zn-α2-glicoproteina plasmática humana, conforme publicado por T. Araki et al. (1988) “Complete amino acid sequence of human plasma Zn-α2-glycoprotein and its homology to histocompatibility antigens” (“Sequência de amino- ácidos completa de Zn-α2-glicoproteina plasmática humana e sua ho- mologia para antígenos de histocompatibilidade”).

[00064] A Figura 11 é um diagrama gráfico mostrando a atividade lipolítica de ZAG humana em adipócitos epididimais de rato isolados, comparada com isoprenalina (10 μM) na ausência ou presença de SR59230A (10 μM) ou anticorpo anti-ZAG (1:1000) (IgG). Cada valor é uma média de 5 estudos separados. Diferenças do controle são mostradas como b, P<0,01 ou c, P<0,001, ao passo que diferenças de ZAG somente são indicadas como e, P<0,01 ou f, p<0,001.

[00065] A Figura 12A é um diagrama gráfico mostrando o efeito da administração i.v. diária de ZAG (50 μg/100 g de peso corporal) em 100 μL de PBS (■) ou PBS somente (♦) sobre o peso corporal de ratos machos Wistar durante um período de 10 dias. O protocolo para o experimento é dado na seção de métodos.

[00066] A Figura 12B é um diagrama gráfico mostrando a temperatura corporal de ratos machos Wistar administrados quer ZAG (■) ou PBS (♦) conforme descrito na Figura 12A.

[00067] A Figura 12C é um diagrama gráfico mostrando a captação de 2-deoxi-D-glicose em adipócitos epididimais de ratos machos Wis- tar depois de 10 dias de tratamento com quer ZAG (box aberto) ou PBS (box fechado) por 10 dias, conforme mostrado na Figura 12A, na ausência ou presença de insulina (60 μU/mL).

[00068] A Figura 12D é um diagrama gráfico mostrando a captação de glicose nos músculo gastrocnêmio e BAT de ratos machos Wistar depois de 10 dias de tratamento com quer ZAG ou PBS, na ausência ou presença de insulina (60 μU/mL). Diferenças entre animais tratados com ZAG e PBS são mostradas como a, P<0,05, b, P<0,01 ou c, P<0,001, ao passo que diferenças na presença de insulina são mostradas como ou f, p<0,001.

[00069] A Figura 12E é um diagrama gráfico mostrando tecido Rg em camundongos ob/ob administrados ZAG. c, p<0,001 de PBS.

[00070] As Figuras 13A a 13C são diagramas pictoriais de Western blots mostrando a expressão de GLUT4 em BAT (Figura 13A) e WAT (Figura 13B) e no músculo gastrocnêmio (Figura 13C) de ratos machos Wistar tratados com quer PBS ou ZAG por 10 dias conforme mostrado na Figura 12. Diferenças entre animais tratados com ZAG e PBS são mostradas como c, p<0,001.

[00071] As Figuras 14A e 14B são diagramas pictoriais de Western blots mostrando a expressão de UCP1 e UCP3 em BAT (Figura 14A) e WAT (Figura 14B) de ratos machos Wistar tratados com quer PBS ou ZAG por 10 dias conforme mostrado na Figura 12. Diferenças entre animais tratados com ZAG e PBS são mostradas como c, p<0,001.

[00072] As Figuras 15A e 15B são diagramas pictoriais de Western blots mostrando a expressão de ATGL (Figura 15A) e HSL (Figura 15B) em tecido adiposo epididimal de ratos machos Wistar tratados com quer PBS ou ZAG por 10 dias conforme mostrado na Figura 12. Diferenças entre animais tratados com ZAG e PBS são mostradas como c, p<0,001.

[00073] As Figuras 16A a 16C são diagramas pictoriais de Western blots mostrando a expressão de ZAG em músculo gastrocnêmio (Figura 16A), WAT (Figura 16B) e BAT (Figura 16C). Os tecidos foram exci- sados de ratos machos Wistar tratados com quer PBS ou ZAG por 10 dias conforme mostrado na Figura 12. Diferenças entre animais tratados com ZAG e PBS são mostradas como c, p<0,001.

[00074] As Figuras 17A e 17B são diagramas pictoriais de Western blots mostrando a expressão de formas fosforiladas e totais de PKR (Figura 17A) e eIF2α (Figura 17B) em músculo gastrocnêmio de ratos machos Wistar tratados com quer PBS ou ZAG por 10 dias conforme mostrado na Figura 12. A análise densitométrica é a proporção das formas totais para fósforo, expressada como uma percentagem do valor para ratos tratados com PBS.

[00075] As Figuras 18A e 18B é um diagrama gráfico mostrando a liberação de fenilalanina (Figura 18A) e a síntese de proteína (Figura 18B) em miotubos C2C12 tratados com e sem ZAG por 4 horas na presença de várias concentrações de glicose. c Estatisticamente signi- ficante, P<0,001 de controle; f, P<0,001 de glicose somente.

[00076] A Figura 19 é um diagrama gráfico mostrando a liberação de fenilalanina em miotubos C2C12 tratados com e sem ZAG na presença de várias concentrações de glicose e com e sem SR59230A. b estatisticamente significante, P<0,01 e c, P<0,001 de controle; e, P<0,05 e f, P<0,001 de glicose somente.

[00077] A Figura 20 é um diagrama gráfico mostrando a síntese de proteína em miotubos C2C12 tratados com e sem ZAG na presença de várias concentrações de glicose e com e sem SR59230A. b Estatisticamente significante, P<0,01 e c, P<0,001 de controle; e, P<0,05 e f, P<0,001 de glicose somente; I, P<0,001 de glicose+SR.

[00078] A Figura 21 é um diagrama gráfico mostrando a atividade de ROS em miotubos C2C12 tratados com várias concentrações de glicose com e sem ZAG. c estatisticamente significante, P<0,001 de f controle, P<0,001 de glicose somente.

[00079] A Figura 22A é um diagrama pictorial de um Western blot mostrando PKR em miotubos C2C12 tratados com glicose com e sem ZAG. c estatisticamente significante, P<0,001 de f controle, P<0,001 de glicose somente.

[00080] A Figura 22B é um diagrama pictorial de um Western blot mostrando eIF2α em miotubos C2C12 tratados com glicose com e sem ZAG. c estatisticamente significante, P<0,001 de f controle, P<0,001 de glicose somente.

[00081] As Figuras 23A e 23B são diagramas gráficos mostrando os resultados de um teste de tolerância a insulina em camundongos ob/ob tratados com e sem ZAG. b estatisticamente significante, P<0,05 e c, P<0,001 de com ZAG.

[00082] A Figura 24 é um diagrama gráfico mostrando a oxidação de D-[U-14C glicose] para 14CO2 em camundongos ob/ob.

[00083] A Figura 25 é um diagrama gráfico mostrando a produção de 14CO2 a partir de [14C carbóxi] trioleína em camundongos ob/ob.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[00084] A presente invenção se baseia na observação de que Zin- co-α2-glicoproteina (ZAG) humana recombinante produz uma redução no peso corporal e aumento na responsividade à insulina em camundongos ob/ob e em ratos Wistar sem nenhum efeito sobre a ingestão de alimento. Deste modo, a invenção proporciona métodos para melhorar os sintomas de hiperglicemia em um indivíduo, diminuir os níveis de insulina plasmática em um indivíduo, e aumentar a massa de músculo esquelético em um indivíduo. Também são proporcionados tratamentos combinatoriais para produzir uma redução de peso ou redução da obesidade em um indivíduo.

[00085] Antes das presentes composições e métodos serem descritos, deve ser entendido que esta invenção não está limitada a composições, métodos, e condições experimentais particulares descritos, uma vez que similares composições, métodos, e condições podem variar. Também deve ser entendido que a terminologia usada aqui, neste requerimento de patente, é para fins de descrever modalidades particulares somente, e não se pretende que seja limitante, uma vez que o âmbito da presente invenção será limitado somente pelas reivindicações anexadas.

[00086] Conforme usado nesta especificação e nas reivindicações anexadas, as formas singulares “um”, “uma”, e “o”, “a” incluem referências plurais a menos que o contexto claramente dite de modo diverso. Deste modo, por exemplo, referências a “o método” inclui um ou mais métodos, e/ou etapas do tipo descrito aqui, neste requerimento de patente, as quais se tornarão evidentes para as pessoas versadas na técnica ao lerem esta invenção e assim por diante.

[00087] A menos que definido de modo diverso, todos os termos técnicos e científicos usados aqui, neste requerimento de patente, têm o mesmo significado conforme entendido comumente por uma pessoa de conhecimento ordinário da técnica à qual pertence esta invenção. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos aqui, neste requerimento de patente, possam ser usados na prática ou experimentação da invenção, são agora descritos os métodos e materiais preferenciais.

[00088] A sequência de aminoácidos completa de ZAG foi reportada em um artigo intitulado “Complete amino acid sequence of human plasma Zinc-α2-glycoprotein and its homology to histocompatibility antigens” (“Sequência de aminoácidos completa de Zinco-a2-glicoproteína plasmá- tica humana e sua homologia com antígenos de histocompatibilidade”) de T. Araki et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 679-683, em que a glicoproteína foi mostrada como consistindo em uma única cadeia de po- lipeptídeo de 276 resíduos aminoácidos tendo três estruturas de domínios distintas (A, B e C) e incluindo duas ligações de dissulfeto junto com glicanos N-encadeados em três sítios de glicosilação. Esta sequência de aminoácidos do componente polipeptídico é determinada na Figura 10 dos desenhos anexados. Embora algumas publicações subsequentes tenham indicado que a composição da ZAG humana possa variar um pouco quando isolada a partir de diferentes fluidos corporais ou tecidos, todas as preparações deste material têm substancialmente as mesmas características imunológicas. Conforme reportado por H. Ueyama, et al. (1991) “Cloning and nucleotide sequence of a human Zinc-α2- glycoprotein cDNA and chromosomal assignment of its gene” (Clonagem e sequência de nucleotídeos de um cDNA de Zinco-a2-glicoproteína humana e designação cromossômica de seu gene), Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 696-703, o cDNA de ZAG foi isolado de bibliotecas de glândula prostática e fígado humano, e também o gene foi isolado, conforme reportado por Ueyama et al., (1993) “Molecular cloning and chromosomal assignment of the gene for human Zinc-α2-glycoprotein” (Clonagem molecular e atribuição cromossômica do gene para Zinco-α2- glicoproteína humana), Biochemistry 32, 12968-12976. H. Ueyama et al. também descreveram, em J. Biochem. (1994) 116, 677-681, estudos sobre cDNAs de ZAG de fígado de rato e de camundongo os quais, junto com a glicoproteína expressada pelo mRNAs correspondentes, foram sequenciados e comparados com o material humano. Embora tenham sido encontradas diferenças de detalhes conforme seria esperado entre diferentes espécies, foi visto um alto grau de homologia de sequências de aminoácidos com mais de 50% de identidade com o complemento humano (mais de 70% de identidade dentro do domínio B da glicoproteí- na). Novamente, foram observadas propriedades imunológicas comuns entre a ZAG humana, de rato e de camundongo.

[00089] A ZAG purificada discutida acima foi preparada a partir de plasma humano fresco essencialmente de acordo com o método descrito por Ohkubo et al. (Ohkubo et al. (1988) “Purification and characterisation of human plasma Zn-α2-glycoprotein” (Purificação e caracterização de Zn-a2-glicoproteína plasmática humana) Prep. Biochem., 18, 413-430). Será reconhecido que, em alguns casos, podem ser produzidos fragmentos do fator de mobilização de lipídeo isolado ou de ZAG sem perda da atividade lipolítica ou de mobilização de lipídeo, e podem ser feitas várias adições, eliminações ou substituições as quais também não afetarão substancialmente esta atividade. Deste modo, os métodos da invenção também incluem o uso de fragmentos funcionais de ZAG. A glicoproteína ou fragmento da mesma usado nestas aplicações terapêuticas podem ser adicionalmente produzidos por meio de técnicas de DNA recombinan- te tais como são de conhecimento geral na técnica com base possivelmente na sequência de cDNA conhecida para Zn-a2-glicoproteína a qual foi publicada, por exemplo, em H. Ueyama et al. (1994) “Structure and Expression of Rat e Mouse mRNAs for Znα -glycoprotein” (Estrutura e Expressão de mRNAs de Rato e de Camundongo para Zn-α2 - glicoproteína) J. Biochem., 116, 677-681. Além disso, a glicoproteína ou fragmento da mesma usado nestas aplicações terapêuticas podem incluir adicionalmente modificações pós-expressão do polipeptídeo, por exemplo, glicosilações, acetilações, fosforilações e similares, bem como outras modificações de conhecimento na técnica, tanto que ocorrem naturalmente quanto que não ocorrem naturalmente.

[00090] Foi demonstrado previamente que ZAG produz uma redução de peso ou redução da obesidade em mamíferos, conforme descrito na Patente dos Estados Unidos No. 6.890.899, incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade. Além disso, observou-se que um agente de mobilização de lipídeo tendo características similares de ZAG e/ou fragmentos da mesma também tem sido usado para produzir uma redução de peso ou redução da obesidade em mamíferos, conforme descrito na Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. 2006/0160723, incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade. A presente invenção demonstra que ZAG e/ou fragmentos funcionais da mesma aumentam a responsividade a insulina de adipócitos e do músculo esquelético, e produz um aumento na massa muscular através de um aumento na síntese de proteína acoplada com uma redução na degradação de proteína independente de se se observa uma redução de peso ou redução da obesidade durante o tratamento. Portanto é contemplado que os métodos da presente invenção proporcionam um efeito detectável sobre sintomas associados com hiperglicemia e/ou doença de degeneração muscular antes de qualquer redução de peso detectável ou redução da obesidade.

[00091] Por conseguinte, em um aspecto, a invenção proporciona um método de melhorar sintomas de hiperglicemia em um indivíduo. O método inclui administrar ao indivíduo que necessite de tratamento similar a uma dosagem terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo tendo a sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 1, ou fragmentos da mesma, por um período de até 10 dias ou mais. Por exemplo, o regime de tratamento pode ser por meses (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 meses), ou anos. Em uma modalidade, o polipeptídeo é administrado por um período de até 21 dias ou mais. Em outra modalidade, a melhora dos sintomas é detectável dentro de dias (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7 dias), semanas (por exemplo, 1, 2, 3, ou 4 semanas), ou meses (por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, ou 12 meses) do início do tratamento. Em outra modalidade, o regime de tratamento é cerca de 10 dias em que há melhora de sintomas associados com hiperglice- mia depois do tratamento. Em outra modalidade, o regime de tratamento é cerca de 21 dias em que há melhora de sintomas associados com hi- perglicemia depois do tratamento.

[00092] O termo “indivíduo” conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a qualquer indivíduo ou paciente para o qual os métodos em questão são realizados. Geralmente o indivíduo é humano, embora conforme será reconhecido por aqueles na técnica, o indivíduo pode ser um animal. Portanto outros animais, incluindo mamíferos tais como roedores (incluindo camundongos, ratos, hamsters e porcos da índia), gatos, cães, coelhos, animais de criação incluindo vacas, cavalos, cabras, carneiros, porcos, etc., e primatas (incluindo macacos, chimpanzés, orangotangos e gorilas) estão incluídos dentro da definição de indivíduo.

[00093] Caracterizações exemplares de hiperglicemia e/ou distúrbios associados com a mesma incluem, mas não estão limitadas a, pré-diabetes, diabetes tipo 2, diabetes tipo 1, redução da tolerância a glicose, síndrome dos ovários policísticos, doença hepática gordurosa não alcoólica, doenças de degeneração muscular, estados de resistência a insulina não produzindo hiperglicemia detectável, diabetes gestacional, risco cardiovascular, e enfarte do miocárdio. Doenças de degeneração muscular exemplares incluem, mas não estão limitadas a, câncer, AIDS, septicemia, doença pulmonar obstrutiva crônica, falência renal, artrite, falência cardíaca congestiva, distrofia muscular, diabetes, sarcopenia associada ao envelhecimento, trauma severo (por exemplo, imobilização ortopédica de um membro), acidose metabólica, atrofia por denervação, e ausência de peso (weightlessness). Deve ser entendido que um indivíduo tendo hiperglicemia e/ou diabetes pode ser de peso corporal normal ou médio Indivíduos similares, referidos como “diabéticos magros” frequentemente apresentam um ou mais dos sintomas associados com hiperglicemia e/ou diabetes sem um aumento de peso ou obesidade. Além disso, uma certa proporção dos diabéticos que estão com excesso de peso ou são obesos são, de fato, diabéticos magros com sobrepeso / obesidade sobreposta no di-abetes.

[00094] O termo “quantidade terapeuticamente eficaz” ou “quantidade eficaz” significa a quantidade de um composto ou composição farmacêutica que provocará a resposta biológica ou medicinal de um tecido, sistema, animal ou humano que está sendo buscada pelo pesquisador, veterinário, médico ou outro clínico.

[00095] Os termos “administração” ou “administrar” são definidos para incluir uma ação de proporcionar um composto ou uma composição farmacêutica da invenção a um indivíduo que necessite de tratamento. As expressões “administração parenteral” e “administrado por via parenteral” conforme usados aqui, neste requerimento de patente, significam modos de administração diferente de administração enteral e tópica, geralmente por via oral ou por injeção, e inclui, sem limitação, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal e intraesternal. As expressões “administração sistêmica”, “administrada sistemicamente,” “administração periférica” e “administrada perifericamente” conforme usado aqui, neste requerimento de patente, significam a administração de um composto, fármaco ou outro material diferente de diretamente no sistema nervoso central, de tal modo que penetra no sistema do indivíduo e, deste modo, está indivíduo a metabolismo e outros processos similares, por exemplo, administração subcutânea.

[00096] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo “melhorar” ou “tratar” significa que os sinais clínicos e/ou os sintomas associados com hiperglicemia são reduzidos em consequência das ações realizadas. Os sinais ou sintomas a serem monitorados serão característicos de hiperglicemia e serão de conhecimento geral do clínico versado, assim como os métodos para monitorar os sinais e condições. Exemplos de sintomas associados com hiperglicemia incluem, mas não estão limitados a, aumento dos níveis séricos de glicose, aumento dos níveis séricos de triglicerídeos, aumento dos níveis séri- cos de insulina e aumento dos níveis séricos de ácidos graxos não es- terificados (NEFA), em comparação com um indivíduo normal ou um indivíduo que não tem hiperglicemia. Deste modo, uma melhora dos sintomas associados com hiperglicemia inclui, mas não está limitada a, redução dos níveis séricos de glicose, redução dos níveis séricos de triglicerídeos, redução dos níveis séricos de insulina, redução dos níveis séricos de ácidos graxos não esterificados, redução dos níveis de insulina plasmática, aumento dos níveis de insulina pancreática, e aumento da massa de músculo esquelético.

[00097] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, os termos “reduzir” e “inibir” são usados juntos porque se reconhece que, em alguns casos, uma redução pode ser reduzida abaixo do nível de detecção de um teste em particular. Deste modo, pode não ser sempre claro se o nível de expressão ou atividade está “reduzido” abaixo de um nível de detecção de um teste, ou é completamente “inibido”. Não obstante, será claramente determinável, seguindo um tratamento de acordo com os presentes métodos, que o nível de, por exemplo, insulina sérica, é no mínimo reduzido a partir do nível antes do tratamento.

[00098] A ZAG foi atribuída uma série de funções biológicas, mas sua função como uma adipocina regulando a mobilização e utilização de lipídeos é a mais importante na regulação da composição corporal. Estudos prévios sugeriram que o aumento na síntese de proteína foi devido a um aumento no AMP cíclico através de interação com o β- adrenoreceptor, ao passo que a redução na degradação de proteína foi devida a atividade reduzida do camimho proteolítico ubiquitina- proteassoma. Estudos em camundongos db/db mostram que a resistência a insulina causa degeneração muscular através de uma atividade aumentada do caminho ubiquitina-proteassoma. Uma fosforilação aumentada de tanto PKR quanto eIF2a reduzirá a síntese de proteína bloqueando a iniciação da translação, ao passo que a ativação de PKR aumentará a degradação de proteína através de ativação do fa- tor-KB nuclear (NF-KB), aumentando a expressão de subunidades de proteassoma. Estudos in usando miotubos na presença de alto nível de glicose extracelular mostraram que a ativação de PKR levou à ati-vação de p38MAPK e formação de espécies de oxigênio reativo (ROS). p38MAPK pode fosforilar e ativar cPLA2 em Ser-505 causando liberação de ácido araquidônico, uma fonte de ROS. A hiperativação de p38MAPK em músculo esquelético tem sido observada em modelos de obesidade induzida por dieta. Além disso, foi demonstrado que a atividade da caspase-3 está aumentada em músculo esquelético de animais diabéticos, o que pode ser parte da cascata de sinalização, uma vez que pode clivar PKR levando a ativação. Sem ser limitada pela teoria, a capacidade de ZAG para atenuar estes caminhos de si- nalização proporciona uma explanação com respeito a sua capacidade para aumentar a massa muscular.

[00099] Por conseguinte, em outro aspecto, a invenção proporciona um método de aumentar a massa de músculo esquelético em um indivíduo. O método inclui administrar ao indivíduo um polipeptídeo tendo a sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma.

[000100] Além disso, foi demonstrado que ZAG aumenta a oxidação de glicose e aumenta o índice metabólico de glicose tecidual em camundongos machos adultos. Este aumento da utilização de glicose explicaria a queda tanto nos níveis de glicose sanguínea quanto nos níveis de insulina em camundongos ob/ob aos quais foi administrada ZAG. A utilização de triglicerídeos também estava aumentada em camundongos aos quais foi administrada ZAG, o que explicaria a queda nos ácidos graxos não esterificados plasmáticos (NEFA) e nos triglicerídeos (TG) apesar do aumento no glicerol plasmático, indicativo de lipólise aumentada. O aumento da utilização de lipídeos seria previsto a partir do aumento da expressão de UCP1 e UCP3 em BAT e UCP3 em músculo esquelético, resultando em um aumento na temperatura corporal. Deste modo, em uma modalidade, melhora dos sintomas associados com hiperglicemia também inclui um aumento na temperatura corporal de cerca de 0,5°C a cerca de 1°C durante o tratamento. Em uma modalidade, o aumento na temperatura corporal ocorre dentro de 4 dias de iniciar o tratamento. Em outra modalidade, melhora dos sintomas associados com hiperglicemia também inclui um aumento na insulina pancreática em comparação com os níveis de insulina pancreática antes do tratamento, uma vez que menos insulina é necessária para controlar a glicose sanguínea em consequência da presença de ZAG.

[000101] Portanto, ZAG é identificada como um fator de mobilização de lipídeos capaz de induzir lipólise em adipócitos brancos dos ca- mundongos em um processo dependente de GTP, similar ao induzido por hormônios lipolíticos. Os dados apresentados aqui, neste requerimento de patente, corroboram estes achados mostrando que ZAG tem um efeito lipolítico similar nos adipócitos de rato, e, além disso, produz uma redução no peso corporal e gordura na carcaça em ratos machos maduros, apesar do fato de que a homologia de sequência entre ZAG de rato e humana é de somente 59,4%.

[000102] ZAG também combate algumas das características metabólicas do estado diabético incluindo uma redução dos níveis de insulina plasmática e aumento da resposta no teste de tolerância a glicose. Portanto, em outro aspecto, a invenção proporciona um método de diminuir os níveis de insulina plasmática em um indivíduo. O método inclui administrar ao indivíduo uma dosagem terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo tendo a sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma. Em uma modalidade, a redução na insulina plasmática ocorre dentro de 3 dias de iniciar o tratamento. Em outra modalidade, o regime de tratamento é administrado por 10 dias ou mais. Em outra modalidade, o regime de tratamento é administrado por 21 dias ou mais.

[000103] Além disso, ZAG aumenta a responsividade de adipócitos epididimais ao efeito lipolítico de um estimulante e3-adrenérgico. ZAG também aumenta a expressão de HSL e ATGL em tecido adiposo epi- didimal os quais foi visto que estão reduzidos no estado obeso resistente a insulina. Não são conhecidos fatores reguladores da expressão de HSL e ATGL. No entanto, o inibidor de ERK específico, PD98059 regula negativamente a expressão de HSL em resposta a ZAG, sugerindo um papel para MAPK neste processo. Camundongos carecendo de MAPK fosfatase-1 têm atividades aumentadas de ERK e p38MAPK em WAT, e são resistentes a obesidade induzida por dieta devido ao aumento do consumo de energia. Estudos prévios sugeriram um papel para MAPK na expressão de UCP3 induzida por ZAG em músculo esquelético. A ativação de ERK pode regular a lipólise nos adipócitos por fosforilação de resíduos serina de HSL, tais como Ser-600, um dos sítios fosforilados por proteína quinase A.

[000104] Os resultados apresentados aqui, neste requerimento de patente, mostram que a administração de ZAG ao rato também aumenta a expressão de ATGL e HSL no rato. ATGL pode ser importante em excesso de armazenamento de gordura na obesidade, uma vez que camundongos nocaute ATGL (ATGL knockout) têm grandes depósitos de gordura e reduzida liberação de ácidos graxos não esterifi- cados (NEFA) a partir de tecido adiposo branco em resposta a isoproterenol, embora tenha apresentado sensibilidade a insulina normal. Em contraste camundongos HSL null, quando alimentado com uma dieta normal, tiveram pesos corporais similares aos animais selvagens. No entanto, a expressão de tanto ATGL quanto HSL estão reduzidas em WAT humano no estado resistente a insulina obeso comparado com o estado sensível a insulina, e redução de peso também diminuiu os ní-veis de mRNA e de proteína.

[000105] Deste modo, em uma modalidade, uma melhora dos sintomas associados com hiperglicemia também inclui um aumento na expressão de proteína desacopladora-1 (UCP1) e proteína desaco- pladora-3 (UCP3) em tecido adiposo marrom durante o tratamento. Em outra modalidade, melhora dos sintomas associados com hiperglice- mia também inclui um aumento na expressão de UCP3 em músculo esquelético durante o tratamento.

[000106] A estimulação de lipólise somente não exauriria os estoques de gordura corporal, uma vez que sem um dissipador de energia os ácidos graxos não esterificados liberados seriam ressintetizado de volta para triglicerídeos nos adipócitos. Para reduzir a gordura corporal, ZAG não somente aumenta a lipólise, conforme mostrado por um aumento no glicerol plasmático, mas também aumenta a utilização de lipídeos, conforme mostrado pela diminuição nos níveis plasmáticos de triglicerídeos e ácidos graxos não esterificados. Esta energia é canalizada para dentro do coração, conforme evidenciado pelo aumento de 0,4°C na temperatura corporal em ratos tratados com ZAG. O aumento da utilização de energia mais provavelmente decorre do aumento da expressão de UCP1, que tem sido demonstrado tanto em BAT quanto em WAT depois da administração de ZAG. Seria esperado que um aumento da expressão de UCP1 reduziria os níveis plasmáticos de ácidos graxos não esterificados, uma vez que eles são os substratos primários para termogênese em BAT. BAT também tem uma elevada capacidade para utilização de glicose, a qual poderia explicar parcial-mente a redução na glicose sanguínea. Além disso, houve aumento da expressão de GLUT4 em músculo esquelético e WAT, o que ajuda a mediar o aumento na captação de glicose na presença de insulina. Em camundongos tratados com ZAG houve um aumento da utilização de glicose / oxidação pelo cérebro, coração, BAT e músculo gastrocnê- mio, e aumento da produção de 14CO2 a partir de D-[U-14C] glicose, bem como [14C carbóxi] trioleína (Figura 24). Também houve um aumento de três vezes na captação de oxigênio por BAT de camundongos ob/ob depois da administração de ZAG.

[000107] Apesar de ZAG ter aumentado a expressão de HSL em adipócitos epididimais, não houve aumento quer em adipócitos subcutâneos ou viscerais. Uma situação similar foi observada com expressão de lipase de triglicerídeos de tecido adiposo (ATGL). A expressão de HSL e ATGL se correlacionou com expressão da forma ativa (fosfo) de ERK. A expressão de HSL e ATGL em adipócitos epididimais se correlacionou com uma resposta lipolítica aumentada ao β3 agonista, BRL37344. Este resultado sugere que ZAG pode agir sinergicamente com β3 agonistas.

[000108] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo “agonista” se refere a um agente ou análogo que é capaz de induzir uma resposta farmacológica total ou parcial. Por exemplo, um agonista pode ligar produtivamente a um receptor e simular a reação fisiológica respectiva. Deste modo, os métodos da invenção podem incluir adicionalmente administrar ZAG, ou um fragmento da mesma, em combinação com um β3 agonista tal como BRL37344.

[000109] Foi sugerido que a indução de lipólise em adipócitos de rato por ZAG é mediada através de um β3-AR, e o efeito de ZAG sobre tecido adiposo e massa corporal magra também pode ser devido a sua capacidade para estimular o β3-AR. Foi demonstrado que a indução da expressão de UCP1 por ZAG é mediada através de interação com um β3-AR. O aumento da expressão de UCP1 em tecido adiposo branco (WAT) também pode ser um efeito do β3-AR através de remo- delagem de precursores de adipócitos marrons, conforme ocorre com o β3-AR agonista CL316.243. Usando camundongos nocaute o efeito antiobesidade de estimulação de β3-AR tem sido essencialmente atribuído a UCP1 em tecido adiposo marrom (BAT), e menos a UCP2 e UCP3 através da degradação, dependente de UCP1, de ácidos graxos não esterificados liberados a partir de tecido adiposo branco. A captação de glicose em tecidos periféricos de animais é estimulada por exposição ao frio, um efeito também mediado através do β3-AR. No entanto, ter por alvo o β3-AR é mais difícil em humanos do que em roedores, uma vez que β3-AR tem um papel menos proeminente do que os subtipos β1 e β2-AR no controle de lipólise e fluxo sanguíneo nutritivo em tecido adiposo abdominal subcutâneo humano. No entanto, apesar disto foi demonstrado que o β3-AR agonista CL316.243 aumenta a oxidação de gordura em voluntários do sexo masculino jovens e saudáveis. Isto pode ser devido à capacidade dos agonistas β- adrenérgico para aumentar o número de β3-AR nas membranas plas- máticas de BAT.

[000110] Resultados recentes sugerem que a expressão de ZAG em tecido adiposo pode ser mais importante localmente do que ZAG circulante, agindo em uma maneira parácrina. Portanto em humanos, enquanto os níveis de mRNA de ZAG em gordura visceral e subcutânea são correlacionados negativamente com o índice de massa corporal (IMC), a massa gorda e a resistência a insulina, os níveis séricos, determinados por ELISA, se correlacionaram positivamente com parâmetros de adiposidade (IMC e circunferência da cintura) e resistência a insulina. Portanto a capacidade de ZAG para induzir sua própria expressão em músculo gastrocnêmio, WAT e BAT pode ser crucial para sua capacidade para aumentar a lipólise e a utilização de energia.

[000111] Estes resultados proporcionam evidência para a capacidade de ZAG para mobilizar e utilizar lipídeo em ratos, confirmando um efeito independente da espécie, e sugerem que pode ser útil como um agente antiobesidade no homem. Por conseguinte, em outro aspecto, a invenção proporciona um método de tratar um indivíduo para produzir uma redução de peso ou redução da obesidade. O método inclui administrar ao indivíduo que necessite de similar tratamento uma dosagem terapeuticamente eficaz de um β3 agonista em combinação com um polipeptídeo tendo a sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma. Em outra modalidade, o método de tratar um indivíduo para produzir uma redução de peso ou redução da obesidade inclui administrar ao indivíduo que necessite de tratamento similar a uma dosagem terapeuticamente eficaz de um antagonista de β3-AR em combinação com um polipeptídeo tendo a sequência conforme mostrado na SEQ ID NO: 1 ou um fragmento da mesma.

[000112] Todos os métodos podem incluir adicionalmente a etapa de trazer o um ou mais ingredientes ativos (por exemplo, ZAG ou fragmentos funcionais de ZAG) em associação com um veículo farmaceu- ticamente aceitável, o qual constitui um ou mais ingredientes acessórios. Deste modo, a invenção também proporciona composições farmacêuticas para uso no tratamento de indivíduos tendo sintomas associados com hiperglicemia. Em uma modalidade, a composição inclui como o constituinte ativo uma quantidade terapeuticamente eficaz de ZAG ou glicoproteína fator de mobilização de lipídeo conforme discutido acima, ou um fragmento lipoliticamente ativo da mesma, junto com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitáveis.

[000113] Veículos farmaceuticamente aceitáveis úteis para formular uma composição para administração a um indivíduo são de conhecimento geral na técnica e incluem, por exemplo, soluções aquosas tais como água ou solução salina fisiologicamente tamponada ou outros solventes ou veículos tais como glicóis, glicerol, óleos tais como azeite de oliva ou ésteres orgânicos injetáveis. Um veículo farmaceuticamen- te aceitável pode conter compostos fisiologicamente aceitáveis que agem, por exemplo, estabilizando ou aumentando a absorção do conjugado. Os compostos fisiologicamente aceitáveis referidos incluem, por exemplo, carboidratos, tais como glicose, sacarose ou dextranos, antioxidantes, tais como ácido ascórbico ou glutationa, agentes que- lantes, proteínas de baixo peso molecular ou outros estabilizantes ou excipientes. técnico no assuntosaberia que a escolha de um veículo farmaceuticamente aceitável, incluindo um composto fisiologicamente aceitável, depende, por exemplo, das características fisico-químicas do agente terapêutico e da via de administração da composição, a qual pode ser, por exemplo, por via oral ou por via parenteral tal como por via intravenosa, e por injeção, intubação, ou outro método similar conhecido na técnica. A composição farmacêutica também pode conter um segundo (ou mais) composto(s) tal como um reagente diagnóstico, uma substância nutricional, uma toxina, ou um agente terapêutico, por exemplo, um agente quimioterápico contra câncer e/ou vitamina(s).

[000114] Formulações da presente invenção adequadas para administração oral podem ser apresentadas como unidades distintas tais como cápsulas, pílulas, comprimidos ou pastilhas, cada uma contendo uma quantidade predeterminada do composto ativo sob a forma de um pó ou grânulos; ou como uma suspensão do composto ativo em um líquido aquoso ou um líquido não aquoso tal como um xarope, um elixir, uma emulsão de uma inalação.

[000115] Por conseguinte, em outro aspecto, a invenção proporciona o uso de ZAG ou um agente de mobilização de lipídeo, conforme definido aqui, neste requerimento de patente, para a fabricação de um medicamento útil em medicina humana para tratar sintomas e/ou condições associados com hiperglicemia. Um medicamento similar também pode ser útil para estimular o desenvolvimento muscular e aumentar a massa muscular, reduzir os níveis séricos de glicose, reduzir os níveis séricos de triglicerídeos, reduzir os níveis séricos de insulina, reduzir os níveis séricos de ácidos graxos não esterificados, reduzir os níveis de insulina plasmática, e/ou aumentar os níveis de insulina pancreática.

[000116] A quantidade total de um composto ou composição a ser administrada na prática de um método de a invenção pode ser administrada a um indivíduo como uma única dose, quer como um bolus ou por infusão durante um período de tempo relativamente curto, ou pode ser administrada usando um protocolo de tratamento fracionado, no qual múltiplas doses são administradas durante um período de tempo prolongado (por exemplo, uma vez ao dia, duas vezes ao dia, etc.). Técnico no assuntosaberia que a quantidade de ZAG ou de fragmento funcional da mesma para tratar sintomas associados com hiperglice- mia em um indivíduo depende de muitos fatores incluindo a idade e a saúde geral do indivíduo bem como a via de administração e o número de tratamentos a serem administrados. Em vista destes fatores, o técnico no assunto ajustaria a dose em particular conforme necessário. Em geral, a formulação da composição farmacêutica e as vias e frequência de administração são determinadas, inicialmente, usando estudos clínicos Fase I e Fase II.

[000117] Por conseguinte, em algumas modalidades, os métodos da invenção incluem um regime de tratamento intervalado. Observou-se que a administração diária de longo termo de ZAG em camundongos ob/ob resulta em uma cessação da perda de peso. Deste modo, em uma modalidade, o tratamento é administrado dia sim, dia não. Em outra modalidade, o tratamento é administrado a cada dois dias. Em outra modalidade, o tratamento é administrado a cada três dias. Em outra modalidade, o tratamento é administrado a cada quatro dias.

[000118] Portanto, a invenção demonstra que ocorre perda de peso adicional e/ou melhora dos sintomas associados com hiperglicemia quando a administração de ZAG é interrompida por aproximadamente 3 a 4 dias seguida por reinfusão. Sem ser limitado por esta teoria, isto pode ser porque está sendo administrado muito ou que porque há dessensibização de receptor conforme é visto com TNF. Foi realizado um estudo piloto com 2 camundongos em cada grupo e se observou uma perda de peso de 8 a 10 g de um camundongo de 90 g em cerca de 3 semanas. Deste modo, é contemplado que menores dosagens de ZAG ou de um fragmento funcional da mesma podem ser usadas para melhorar os sintomas de hiperglicemia em um indivíduo antes de uma redução observável na obesidade ou redução no peso.

[000119] Os exemplos que se seguem são proporcionados para ilustrar adicionalmente as vantagens e características da presente invenção, mas não se pretende que limitem o âmbito da invenção. Apesar de eles serem típicos daqueles que podem ser usados, outros procedimentos, metodologias, ou técnicas de conhecimento do técnico no assunto podem ser usados alternativamente.

EXEMPLO 1 Zinco-a2-glicoproteína atenua hiperglicemia

[000120] Para avaliar a capacidade da Zinco-a2-glicoproteína (ZAG) atenuar obesidade e hiperglicemia, a camundongos ob/ob foi administrada ZAG a qual induziu uma perda de peso corporal, e um aumento na temperatura corporal, sugerindo um aumento do consumo de energia. A expressão de proteínas desacopladoras-1 e -3 em tecido adiposo marrom estava aumentada, ao passo que houve uma redução nos níveis séricos de glicose, triglicerídeos e ácidos graxos não esterifica- dos, apesar de um aumento no glicerol, indicativo de lipólise aumentada. Houve uma redução na insulina plasmática e uma resposta aprimorada a glicose intravenosa junto com um aumento na captação de glicose nos adipócitos e músculo esquelético. A expressão de lipase sensível a hormônio em adipócitos epididimais estava aumentada. Houve um aumento na massa de músculo esquelético devido a um aumento na síntese de proteína e redução na degradação. Isto sugere que ZAG pode ser eficaz no tratamento de hiperglicemia.

[000121] Meios de Eagle Modificado por Dulbeccos (DMEM) e Freestyle foram adquiridos da Invitrogen (Paisley, Reino Unido) ao passo que soro de feto de vitelo foi da Biosera (Sussex, Reino Unido). 2-[1- 14C] Deoxi-D-glicose (sp.act.1.85GBq mmol-1) e L-[2,6-3H] fenilalanina (sp.act.37Bq mmol-1) foram da American Radiolabeled Chemicals (Cardiff, Reino Unido). Anticorpo policlonal de coelho para fosfo ERK1 (Thr-202) e totais, p38MAPK totais, fosfo HSL (Ser-552), transportador de glicose 4 (GLUT4), lipase de triglicerídeos de tecido adiposo, lipase sensível a hormônio, e fosfo PLA2 (Ser-505) e para ATGL humano foram adquiridos da Abcam (Cambridge, Reino Unido). Anticorpo monoclonal de camundongo para ZAG humana de extensão total foi da Santa Cruz (California, EUA), e anticorpo monoclonal de camundongo pa- ra cadeia pesada de miosina tipo II foi da Novacastra (via Leica Biosystems, Newcastle, Reino Unido). Anticorpos monoclonais de camundongo para 20S proteassoma subunidades α e p42 foram da Affi- niti Research Products (Exeter, Reino Unido). Anticorpos monoclonais de camundongo para fosfo (Thr-180/Tyr-182) p38MAPK e antissoros policlonais de coelho para PKR totais e fosfo (Thr-451) PKR, fosfo (Ser-162) eIF2α e para eIF2α totais foram da New England Biosciences (Herts, Reino Unido). Anticorpos policlonais de coelho para UCP1, UCP3 e PKR total e Reagente de Extração PHOSPHOSAFE™ (Extraction Reagent) foram da Calbiochem (via Merk Chemicals, Nottingham, Reino Unido). Anticorpos de cabra anti-coelho conjugados a peroxidase e de coelho anti-camundongo foram adquiridos da Dako (Cambridge, Reino Unido). Anticorpo policlonal de coelho para β-actina de camundongo e o kit de teste de triglicerídeos foram adquiridos da Sigma Aldrich (Dorset, Reino Unido). Membranas de nitrocelulose Hybond A e kits de desenvolvimento de quimiluminescência aumentada (ECL) foram da Amersham Pharmacia Biotech (Bucks, Reino Unido). Um kit de teste colorimétrico WAKO para ácidos graxos não este- rificados foi adquirido da Alpha Laboratories (Hampshire, Reino Unido), e um kit ELISA de insulina de camundongo foi adquirido da DRG (Marburg, Alemanha). Medições de glicose foram preparadas usando um kit de glicose plasmática Boots (Nottingham, Reino Unido).

[000122] Produção de ZAG recombinante - Células HEK293F foram transfectadas com cDNA de ZAG humana de extensão total no vector de expressão pcDNA 3.1, e mantidas em meio FreeStyle sob uma atmosfera de 5% de CO2 em ar a 37°C. ZAG foi secretada no meio, o qual foi coletado, e foram obtidos níveis máximos de proteína (16 μgmL-1) depois de 14 dias de cultura. Para purificar ZAG, o meio (200 mL) foi centrifugado a 700 g por 15 min para remover células, e concentrado em um volume de 1 mL de PBS estéril usando um filtro cen- trífugo Amicon Ultra-15 com um corte de 10 kDa. O concentrado (cerca de 2 mg de proteína) foi adicionado 2 g de celulose DEAE suspendida em 20 mL de Tris a 10 mM, pH 8,8 e agitado por 2 h a 4°C. A celulose DEAE ligou ZAG e foi sedimentada por centrifugação (1500 g por 15 min) e a ZAG foi elutriada por agitação com 20 mL de Tris a 10 mM, pH 8,8 contendo 0,3 M de NaCl por 30 min a 4°C. O elutriado foi lavado e concentrado em um volume de 1 mL em PBS estéril usando um filtro centrífugo Amicon. A ZAG purificada estava livre de endotoxina, conforme determinado com um kit de teste único LAL Pyrogent (Lonza, Bucks, Reino Unido).

[000123] Cultura celular e purificação de ZAG. Suspensões de células únicas de adipócitos brancos foram preparadas a partir de depósitos adiposos picados por incubação a 37°C por 2h em tampão de bio- carbonato de Krebs-Ringer contendo 1,5 mgmL-1 de colagenase, e 4% de albumina sérica bovina sob uma atmosfera de 95% de oxigênio: 5% de CO2 conforme previamente descrito. Para estudos do curso de tempo os adipócitos foram suspendidos em DMEM contendo 10% soro de feto de vitelo em uma concentração de 105 células mL-1 e mantidos sob uma atmosfera de 10% de CO2 em ar a 37°C. Células 293 humanas transfectadas com um plasmídeo contendo ZAG humana foram semeadas em uma concentração de 105 células mL-1 em meio FreeStyle e mantidas sob uma atmosfera de 5% de CO2 em ar a 37°C. Níveis de proteína máximos (16 μgmL-1) foram obtidos depois de 14 dias de cultura. O meio (200 mL) foi em seguida centrifugado a 700 g por 15 min para remover células e concentrado em um volume de 1 mL de PBS estéril usando um filtro centrífugo Amicon Ultra-15 com um corte de 10 kDa. Depois de medição da concentração de proteína da amostra (cerca de 2 mg) foi adicionada a 2 g de celulose DEAE suspendida em 20 mL de Tris a 10 mM, pH 8,8 e agitada a 4°C por 2 h. ZAG sendo negativamente carregada liga à celulose DEAE, a qual foi sedimen- tada por centrifugação (1500 g por 15 min), e elutriada por agitação com 20 mL de Tris a 10 mM, pH 8,8 contendo NaCl a 0,3 M p30min a 4°C. O sobrenadante foi lavado e concentrado até um volume de 1 mL em PBS estéril usando o filtro centrífugo Amicon.

[000124] Animais - camundongos. Camundongos obesos homozi- gotos (ob/ob) da colônia mantida na Aston University foram usados no presente estudo. A origem e as características dos camundongos ob/ob da Aston foram descritas previamente. Camundongos machos (de 20 a 21 semanas de idade, peso de 90 a 100 g) foram agrupados em três por gaiola em um ambiente com ar condicionado a 22 ± 2°C com um ciclo de 12 horas de luz: 12 horas de escuridão e alimentado com uma dieta de criação de rato e camundongo (Special Diet Services, Witham, Reino Unido) e água corrente à vontade. Aos camundongos foi administrada ZAG (35 μg) em PBS (100 μL) duas vezes ao dia por administração i.v. e o peso corporal e a ingestão de ração e de água foram monitorados diariamente. Camundongos controles receberam somente PBS. A temperatura corporal foi medida diariamente pelo uso de um termômetro retal (RS Components, Northants, Reino Unido). Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com o U.K. Animals (Scientific Procedures) Act 1986. Não foram observados efeitos adversos depois da administração de ZAG.

[000125] Animal - Ratos. Ratos Wistar machos adultos (um ano de idade de nossa própria colônia) pesando 540±82,5 g foram alojados individualmente e tratados uma vez ao dia i.v., com quer ZAG em PBS (100 μL) (50 μg por 100 g de peso corporal), ou com PBS (100 μL) como um controle. Tanto a ingestão de ração quanto de água quanto o peso corporal foram medidos diariamente. Os animais tiveram livre acesso a ração (Special Diet Services, Essex, Reino Unido) e água à vontade. O experimento animal foi realizado sob as condições de saúde e bem-estar impostas pelo British Home Office. Depois de 10 dias de tratamento os animais foram terminados e a composição corporal foi determinada. Os animais foram aquecidos até 80 a 90°C por 7 dias até ser obtido peso constante. O teor de água foi em seguida determinado a partir da diferença entre o peso a úmido e a seco. Lipídeos foram extraídos da carcaça a seco usando uma sequência de clorofórmio:metanol (1:1), etanol/acetona (1:1) e éter dietílico (120 mL de cada) conforme descrito por Lundholm et al (14). Os solventes foram evaporados e a gordura pesada. A massa de carcaça sem gordura foi calculada como a diferença entre o peso inicial da carcaça e o peso de água e gordura.

[000126] Prova lipolítica. Amostras a serem testadas foram incubadas com 105 a 2x105 adipócitos por 2 h em 1 mL de tampão de bicarbonato Krebs-Ringer, pH 7,2. A concentração de glicerol liberado foi determinada enzimaticamente pelo método de Wieland (Wieland, O. Glycerol UV method. In Methods of Enzymatic Analysis (ed. Bergmey- er, H.U.) (Academic Press, Londres, Reino Unido, pp 1404-1409, 1974)). Amostras controles contendo adipócitos somente foram analisadas para determinar a liberação espontânea de glicerol. A atividade foi expressa como μmol de glicerol liberado/105 adipócitos/2h.

[000127] Determinações de Metabólitos Séricos. Ácidos graxos não esterificados (NEFA) foram determinados usando um kit Wako-ASC- ACOD (Wako Chemical GmbH, Neuss, Alemanha). Os triglicerídeos foram determinados usando um kit de Triglicerídeo (Sigma Chemical Co., Poole, Reino Unido) e 3-hidroxibutirato por um kit de determinação enzimática quantitativa (Sigma). A glicose foi medida usando um analisador de glicose (Beckman, Irvine, Calif.) e o glicerol foi determinado enzimaticamente usando o método de Wieland conforme descrito em “Methods of Enzymatic Analysis” (Métodos de Análise Enzimática) (Ed. Bergmeyer, H. U.) Vol. 3, pp1404-1409, publicado pela Academic Press, Londres (1974).

[000128] Isolamento de Membranas Plasmáticas de Adipócitos de Ca-mundongo. Em um procedimento típico adipócitos brancos foram isolados de almofadas de gordura epididimal de camundongo conforme referido acima exceto que as células foram lavadas em 250 mM de sacarose, 2 mM de etileno glicol bis(e-aminoetiléter)-N,N,N',N' (EGTA), 10 mM de Tris-HCl (pH 7,4). Os adipócitos foram ressuspendidos em 20 mL do tampão acima e homogenizados por aspiração através de um filtro Swinny por no mínimo 10 vezes. O homogenizado celular foi em seguida centrifugado a 300 g por 5 min, o bolo de gordura foi removido da superfície e o pélete remanescente e o infranadante foram transferidos para tubos limpos. Estes foram centrifugados a 30,000 g por 1 h a 4°C e o pé- lete de membrana formado foi ressuspendido no tampão de sacarose (200 a 400 μL). As membranas plasmáticas foram separadas de outras membranas de organelas em um gradiente de auto-formação de partículas de sílica coloidial PERCOLL™. Os constituintes foram 250 mM de sacarose, 2 mM de EGTA, 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4; PERCOLL ™; e 2 M de sacarose, 8 mM de EGTA, 80 mM de Tris-HCl, pH 7,4, misturados em uma proporção de 32:7:1 junto com a suspensão de membrana (em um volume total de 8 mL). Esta mistura foi centrifugada a 10.000 g por 30 min a 4°C. O gradiente foi fracionado em porções de 0,75 mL e cada porção foi testada para a presença de succinato deidrogenase, NADH- citocroma c redutase, lactato deidrogenase e 5'-nucleotidase para localizar a fração de membrana plasmática. As frações de membrana foram ressuspendidas em 150 mM de NaCl, 1 mM de EGTA, 10 mM de Tris- HCl, pH 7,4 e centrifugadas a 10.000 g a 4°C por 2 min. O processo foi repetido duas vezes. As membranas plasmáticas lavadas foram em seguida diluídas em 10 mM de Tris-HCl, pH 7,4, 250 mM de sacarose, 2 mM de EGTA e 4 μM de fluoreto de fenilmetilsulfonila (PMSF) a 1 a 2 mg/mL, rapidamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a -70°C até a aplicação.

[000129] Atividade lipolítica em adipócitos de rato - Adipócitos brancos foram preparados a partir de tecido adiposo epididimal finamente picado de ratos machos Wistar (400 g) usando digestão por colage- nase, conforme descrito (Beck SA, et al. Production of lipolytic and proteolytic factors by a murine tumor-producing cachexia in the host. (Produção de fatores lipolíticos e proteolíticos por uma caquexia produtora de tumor murino no hospedeiro.) Cancer Res 47:5919-5923, 1987). A atividade lipolítica foi determinada incubando 105-2x105 adipócitos por 2 h em 1 mL de tampão de bicarbonato de Krebs-Ringer, pH 7,2, e a extensão da lipólise foi determinada medindo o glicerol liberado (Wieland O. Glycerol UV method. Methods of Enzymatic Analysis, editado por Bergmeyer HU. Academic Press, Londres, pp 1404-1409, 1974). A liberação espontânea de glicerol foi medida incubando apenas adipóci- tos. A atividade lipolítica foi expressa como μmol de glicerol libe- rado/105 adipócitos/2h.

[000130] Eletroforese por Gel. Géis foram preparados de acordo com o método de Laemmli e consistiram de modo geral de um gel de empilhamento a 5% e um gel de resolução SDS-PAGE a 15% (condições desnaturantes ou redutoras) ou um gel de resolução SDS-PAGE a 10% (condições não desnaturantes ou não - redutoras). As amostras foram carregadas a 1 a 5 μg/ alameda. As bandas foram visualizadas por tintura quer com azul brilhante Coomassie R-250 (Coomassie brilliant blue) ou por prata. As amostras foram preparadas para condições redutoras por aquecimento por 5 min a 100°C em 0,0625 M de Tris- HCl, pH 6,8, 10% de glicerol, 1% de SDS, 0,01% de azul de bromofe- nol e 5% de 2-mercaptoetanol.

[000131] Captação de glicose em adipócitos. Adipócitos isolados (5x104) foram lavados duas vezes em 1 mL de tampão de bicarbonato Krebs-Ringer, pH 7,2 (KRBS) e adicionalmente incubados por 10 min em temperatura ambiente em 0,5 mL de KRBS contendo 18,5 MBq 2- [1-14C] deoxi-D-glicose e 2-deoxi-D-glicose não radioativa até uma concentração final de 0,1 mM. A captação foi terminada pela adição de 1 mL de KRBS livre de glicose gelado, e as células foram lavadas três vezes com 1 mL de KRBS, lisadas por adição de 0,5 mL de NaOH a 1 M e deixadas por no mínimo 1h em temperatura ambiente antes da radioatividade ser determinada por contagem por cintilação em líquido.

[000132] Captação de glicose em músculo gastrocnêmio - Músculos gastrocnêmios foram incubados em tampão de bicarbonato Krebs- Henseleit por 45 min a 37°C e em seguida incubados por um adicional de 10 min em 5 mL de tampão Krebs-Henseleit contendo 185 M Bq 2- [1-14C] deoxi-D-glicose e 2-deoxi-D-glicose não radioativa até uma concentração final de 0,1 mM. Em seguida os músculos foram removidos e lavados em 0,9% de NaCl por 5 min seguido por dissolução em 0,5 mL de NaOH a 1 M e a radioatividade foi determinada por contagem por cintilação em líquido.

[000133] Captação de glicose em músculo sóleo. Músculos sóleos foram incubados em tampão de bicarbonato Krebs-Henseleit por 45 min a 37°C e em seguida incubados por um adicional de 10 min em 5 mL de tampão Krebs-Henseleit contendo 185MBq 2-[1-14C] deoxi-D- glicose e 2-deoxi-D-glicose não radioativa até uma concentração final de 0,1 mM. Em seguida os músculos foram removidos e lavados em 0,9% de NaCl por 5 min seguido por dissolução em 0,5 mL de NaOH a 1 M e a radioatividade foi determinada por contagem por cintilação em líquido.

[000134] Síntese e degradação de proteína em músculo. O método para a determinação de síntese e degradação de proteína em músculo foi descrito previamente (Smith, K.L. & Tisdale, M.J. Increased protein degradation and decreased protein synthesis in skeletal muscle during cancer cachexia. (Aumento da degradação de proteína e redução da síntese de proteína em músculo esquelético durante caquexia do cân- cer.) Br. J. Cancer 67, 680-685 (1993)). Músculos gastrocnêmios foram excisados usando ligaduras e incubados por 30 min a 37°C em meio RPMI 1640 carecendo de vermelho fenol e saturado com O2:CO2 (19:1) e em seguida lavados com PBS. A síntese de proteína foi medida pela incorporação de L-[2,6-3H] fenilalanina (640 MBq) em material insolúvel em ácido usando um período de 2 horas no qual os músculos foram incubados a 37°C em RPMI/640 sem vermelho fenol e saturado com O2:CO2 (19:1). Em seguida os músculos foram enxaguados em meio não radioativo, blotted e homogenizados em ácido perclórico a 2%. A taxa de síntese de proteína foi calculada dividindo a quantidade de radioatividade ligada a proteína pela quantidade de radioatividade solúvel em ácido. A degradação de proteína foi determinada pela liberação de tirosina pelo músculo gastrocnêmio durante um período de 2 horas em 3 mL de tampão Krebs-Henseleit oxigenado, pH 7,4, contendo 5 mM de glicose e 0,5 mM de ciclo-heximida.

[000135] Medição da atividade do proteassoma e de caspase. A atividade ‘similar a quimotripsina’ do proteassoma foi determinada fluorome- tricamente medindo a liberação de 7-amido-4-metilcumarina (AMC) em um comprimento de onda de excitação de 360 nm e um comprimento de onda de emissão de 460 nm do substratoi fluorogênico N-succinil Lys Lys Val Tyr.AMC (SEQ ID NO: 2) conforme previamente descrito para miotu- bos (Whitehouse, A.S. & Tisdale, M.J. Increased expression of the ubiqui- tin-proteasome pathway in murine myotubes by proteolysis-inducing factor (PIF) is associated with activation of the transcription factor NF-/JB. (Expressão aumentada do caminho ubiquitina-proteassoma em miotubos murinos por fator de indução de proteólise (PIF) está associada com ativação do fator de transcrição NF-KB) Br. J. Cancer 89, 1116-1122 (2003)). Músculo gastrocnêmio foi homogenizado em 20 mM de Tris, pH 7,5, 2 mM de ATP, 5 mM de MgCl2 e 50 mM de DTT a 4°C, sonicado e centrifugado a 18.000 g por 10 min a 4°C para peletizar material insolú- vel, e o sobrenadante resultante foi usado para medir a atividade enzimá- tica ‘similar a quimotripsina’ na presença ou ausência do inibidor do pro- teassoma lactacistina (10 μM). Somente atividade supressível de lactaci- stina foi considerada como verdadeira atividade do proteassoma. A atividade de caspase-3 foi determinada pela liberação de AMC a partir de AcAsp.Gly.Val.Asp.AMC (SEQ ID NO: 3), e a atividade de caspase-8 foi determinada pela liberação de 7-amino-4-triflurometilcumarina (AFC) a partir do substrato específico Z-Ile Glu Phe Thr Asp-AFC (SEQ ID NO: 4), usando o sobrenadante de acima (50 μg de proteína), e quer o substrato de caspase-3 ou de caspase-8 (10 μM) por 1 hora a 37°C, na presença ou ausência dos inibidores (100 μM) de caspase-3 (AcAspGluValAsp- CHO) (SEQ ID NO: 5) ou de caspase-8 (Ile Glu Phe Thr Asp-CHO) (SEQ ID NO: 6). O aumento na fluorescência devido a AFC foi determinado conforme acima, ao passo que o aumento na fluorescência devido a AFC foi medido com um comprimento de onda de excitação de 400 nm e um comprimento de onda de emissão de 505 nm. A diferença nos valores na ausência e na presença dos inibidores de caspase foi uma medida da atividade.

[000136] Análise Western blot. Músculos gastrocnêmios recém exci- sados foram lavados em PBS e lisados em Reagente de Extração PHOSPHOSAFE™ (PHOSPHOSAFE™ Extraction Reagent) por 5 min em temperatura ambiente seguido por sonicação a 4°C. O lisado foi clareado por centrifugação a 18.000 g por 5 min a 4°C e amostras de proteína citosólica (5 μg) foram resolvidas em eletroforese por gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida a 12% a 180V por aproximadamente 1 hora. Isto foi seguido por transferência para membranas de nitrocelulose de 0,45 μm, as quais foram em seguida bloqueadas com Marvel a 5% em solução salina Tris-tamponada, pH 7,5, a 4°C de um dia para o outro. Foram usados tanto anticorpos primários quanto secundários em uma diluição de 1:1000 exceto antimiosina (1:250). A incubação foi por 1 h em temperatura ambiente, e o desenvolvimento foi por ECL. Os blots foram escaneados por um densitômetro para quantificar diferenças.

[000137] Amostras de tecido adiposo branco epididimal, tecido adiposo marrom e músculo gastrocnêmio excisados de ratos tratados com ZAG ou PBS por 5 dias foram homogenizadas em 0,25 M de sacarose, 1 mM de HEPES, pH 7,0 e 0,2 M de EDTA, e em seguida centrifugadas por 10 min a 4.500 rpm. Amostras de proteína citosólica (10 μg) foram resolvidas em eletroforese por gel de dodecil sulfato de só- dio-poliacrilamida a 12% e as proteínas foram em seguida transferidas para membranas de nitrocelulose de 0,45 μm, as quais tinham sido bloqueadas com Marvel a 5% em solução salina Tris-tamponada, pH 7,5, a 4°C de um dia para o outro, e seguindo quatro lavagens de 15 min com 0,1% de Tween em PBS, incubação com o anticorpo secundário foi realizada por 1h em temperatura ambiente. O desenvolvimento foi por ECL.

[000138] Análise estatística. Os resultados são mostrados como médias ± SEM por no mínimo três experimentos em replicata. Diferença nas médias entre os grupos foi determinada por análise one-way da variância (ANOVA) seguida pelo teste de múltipla comparação Tukey-Kramer. Valores de P de menos de 0,05 foram considerados significativos.

[000139] Resultados - camundongos. Purificação de ZAG resultou em um produto que foi mais do que 95% puro (Figura 1A), confirmado como ZAG por immunoblotting (Figura 1B). ZAG estimulou lipólise em adipóci- tos epididimais (Figura 1D) mas o efeito lipolítico foi consideravelmente reduzido nos adipócitos tanto de depósitos subcutâneos quanto viscerais, embora tenha sido significativamente elevado acima dos níveis basais (Figura 1E). Não houve diferença significativa na extensão da estimulação de lipólise entre isoprenalina e ZAG em qualquer grupo de adipóci- tos, embora ZAG tenha sido mais potente na indução de lipólise do que isoprenalina em uma base molar. O efeito de ZAG sobre o peso corporal de camundongos ob/ob durante um período de 5 dias é mostrado na Figura 1F. Enquanto os animais controles permaneceram com peso estável, os animais tratados com ZAG apresentaram uma perda de peso progressiva, de tal modo que depois de 5 dias houve uma diferença de peso de 3,5 g entre os grupos, apesar de ingestão igual de ração (PBS 32 ± 3,1 g; ZAG 30 ± 2,5g) e água (PBS 140 ± 8,2 mL; ZAG 135 ± 3,2 mL) durante o decorrer do experimento. Houve um aumento significativo na temperatura corporal de 0,4°C depois de 4 dias da administração de ZAG (Figura 1G), indicativo de um aumento no índice metabólico basal. A medição dos níveis de metabólitos plasmáticos sugere um aumento na utilização de substrato metabólico em animais tratados com ZAG (tabela 1). Portanto houve uma significativa redução na glicose plasmática, triglice- rídeos (TG) e ácidos graxos não esterificados (NEFA) em animais tratados com ZAG, apesar de um aumento na concentração de glicerol indica-tivo de uma lipólise aumentada. Houve uma redução de 36% nos níveis de insulina plasmática sugerindo que ZAG é eficaz na redução do estado diabético. Os níveis de mRNA de ZAG em vários tecidos são mostrados na Figura 1C. Tabela 1 - Níveis plasmáticos de metabólitos e de insulina e, ca-mundongos ob/ob tratados com ZAG por 120 h

[000140] Para investigar isto, foi realizado um teste de tolerância a glicose, em animais alimentados, depois de 3 dias de administração de ZAG (Figura 2A). Enquanto os níveis de glicose sanguínea foram sig-nificativamente elevados em controles de PBS, houve somente um pequeno aumento nos animais tratados com ZAG, o qual permaneceu significativamente abaixo do grupo controle do início ao fim do curso do estudo. Além disso, os níveis de insulina plasmática foram significativamente menores em animais tratados com ZAG no início do estudo e permaneceram assim durante os 60 min de observação (Figura 2B). A administração de ZAG aumentou a captação de glicose nos adipóci- tos epididimais, viscerais e subcutâneos na ausência de insulina e também aumentou a captação de glicose nos adipócitos epididimais e viscerais na presença de baixo teor de insulina (1 nM) (Figura 2C). A captação de glicose no músculo gastrocnêmio também foi significativamente aumentada em animais tratados com ZAG tanto na ausência quanto na presença de insulina (100 nM) (Figura 2D). A captação de glicose no músculo gastrocnêmio de camundongos tratados com ZAG foi maior do que a resposta a insulina em animais não tratados.

[000141] A administração de ZAG também atenuou o efeito de hiper- glicemia sobre atrofia do músculo esquelético. Portanto camundongos ob/ob tratados com ZAG apresentaram um aumento significativo no peso a úmido tanto dos músculos gastrocnêmio quanto sóleo (tabela 1). Isto foi associado com aumento de mais de duas vezes na síntese de proteína no músculo sóleo (Figura 3A), e uma redução de 60% na degradação de proteína (Figura 3B). Os músculos gastrocnêmios de camundongos tratados com ZAG apresentaram uma atividade reduzida da atividade de enzima ‘similar a quimotripsina’ do proteassoma (Figura 3C), a qual não foi significativamente diferente da atividade encontrada em camundongos não obesos, e uma expressão reduzida de ambas as subunidades α do proteassoma 20S (Figura 3D), e p42, uma subunidade de ATPase do 19S regulador (Figura 3E), sugerindo uma atividade reduzida do caminho ubiquitina-proteassoma. Os níveis de miosina foram aumentados em camundongos tratados com ZAG (Figura 3F), ao passo que os níveis de actina não se alteraram (Figura 3G). Além disso houve uma redução no nível de formas fosforiladas da proteína quinase dsRNA-dependente (PKR) (Figura 4A) e fator de iniciação eucariótica 2α (eIF2a) (Figura 4B), as quais foi demonstrado serem responsáveis por atrofia muscular induzida por fatores catabólicos tumorais, e altos níveis de glicose extracelular. Outras enzimas neste caminho incluindo fosfolipase A2 (PLA2) (Figura 4C), proteína quinase ativada por mitógeno p38 (Figura 4D) e caspases-3 e -8 (Figura 4E) também estavam atenuadas nos músculos gastrocnêmios de camundongos ob/ob tratados com ZAG. Estas alterações foram coincidentes com uma redução na sinalização catabólica no músculo em resposta a ZAG.

[000142] ZAG, mas não isoprenalina aumentou a expressão de fosfo HSL em adipócitos a qual foi completamente atenuada pelo inibidor de quinase regulada por sinal extracelular (ERK) PD9805914. Apesar de ZAG ter aumentado a expressão de HSL em adipócitos epididimais, não houve aumento quer nos adipócitos subcutâneos ou viscerais (Figuras 5B a 5D). Uma situação similar foi observada com expressão de lipase de triglicerídeos do tecido adiposo (ATGL) (Figuras 5E a 5G). A expressão de HSL e ATGL se correlacionou com a expressão da forma ativa (fosfo) de ERK (Figuras 5H a 5J). A expressão de HSL e ATGL em adipócitos epididimais se correlacionou com um aumento da resposta lipolítica ao β3 agonista, BRL37344 (Figura 5K). Este resultado sugere que ZAG pode agir de modo sinérgico com β3 agonistas.

[000143] Conforme previamente reportado, a administração de ZAG aumentou sua expressão em tecido adiposo (Figura 6A). A expressão de ZAG permaneceu elevada, por um adicional de 3 dias em cultura de tecido na ausência de ZAG (Figura 6B). A expressão de HSL também ficou elevada em adipócitos por 3 dias em cultura de tecido na ausência de ZAG (Figura 6C). A administração de ZAG aumentou a expressão de UCP1 (Figura 6D) e UCP3 (Figura 6E) em BAT (Figura 6D) e UCP3 em músculo esquelético (Figura 6F). Seria esperado que um aumento da expressão de proteínas desaco- pladoras canalizariam substratos metabólicos para o coração conforme observado (Figura 1G).

[000144] Depois de 21 dias, foram observados os níveis de metabó- litos plasmáticos nos camundongos ob/ob (tabela 2), com parâmetros monitorados mostrados na tabela 3. Foram observados uma queda adicional na glicose sanguínea (de 2,03 a 15,2 mM) e um aumento no glicerol, o qual parece maior uma vez que o controle é menor do que antes. Não foi observada alteração nos ácidos graxos não esterifica- dos, nos triglicerídeos ou na insulina no Dia 21, em comparação com o Dia 5 (Tabela 1). Observou-se que há muito mais insulina no pâncreas em animais tratados com ZAG apresentando uma queda na insulina plasmática, a qual não é devida a menor produção de insulina (por exemplo, conforme aconteceria com uma toxina para células beta pancreáticas), porém de preferência devida ao fato de que é necessária menos insulina para controlar a glicose sanguínea nos animais tratados com ZAG. Tabela 2 - Níveis plasmáticos de metabólitos e de insulina em camundongos ob/ob tratados com ZAG no Dia 21.

Tabela 3 - Parâmetros monitorados em camundongos ob/ob tra- tados com ZAG no Dia 21.

[000145] Além disso, a temperatura corporal dos camundongos ob/ob aumentou 0,5° a 1°C (Figura 1G) dentro de quatro dias e atingiu o pico a 38,1°C (Figura 7) logo antes deles perderem a quantidade máxima de peso. Isto se correlacionaria com o peso de tecido adiposo marrom o qual aumenta de 0,33 ± 0,12 g no controle até 0,52 ± 0,08 g nos animais tratados com ZAG (Figura 7). O peso dos músculos gastrocnêmios também foi aumentado de 0,2 ± 0,05 g a 0,7 ± 0,1 g, enquanto houve uma redução progressiva na excreção de glicose urinária (Figuras 8A e 8B).

[000146] Resultados - ratos. O efeito lipolítico de ZAG humana para adipócitos epididimais de rato em comparação com isoprenalina é mostrado na Figura 11. Em concentrações entre 233 e 700 nM ZAG produziu um aumento relacionado com a dose na liberação de glicerol, o qual foi atenuado por anticorpo monoclonal anti-ZAG, mostrando a especificidade da ação. A extensão da lipólise nos adipócitos de rato foi similar à previamente reportada no camundongo. Como no camundongo, o efeito lipolí- tico de ZAG foi completamente atenuado pelo antagonista de receptor e3-adrenérgico (β3-AR) SR59230A, sugerindo que a ação de ZAG foi mediada através de β3-AR. Estes resultados sugerem que ZAG pode ser eficaz na indução de perda de gordura em ratos.

[000147] O efeito de injeção i.v. diária única de ZAG (50 μg/100 g de peso corporal) sobre o peso corporal de ratos Wistar machos maduros (540±83 g) é mostrado na Figura 12A. Comparados com ratos controles aos quais foi administrado o mesmo volume de solvente (PBS), os ratos aos quais foi administrada ZAG apresentaram uma redução progressiva no peso corporal, de tal modo que depois de 10 dias, enquanto os ratos tratados com PBS apresentaram um aumento de 13 g no peso corporal, os animais tratados com ZAG apresentaram uma redução de 5 g no peso corporal (tabela 4). Não houve diferença na ingestão de ração (ZAG: 102±32 g; PBS: 98±25 g) ou água (ZAG: 135±35 mL; PBS: 125±25 mL) entre os dois grupos durante o decorrer do estudo, mas os animais tratados com ZAG apresentaram uma elevação na temperatura corporal de 0,4°C consistente, a qual foi significativa dentro de 24 horas da primeira administração de ZAG (Figura 12B), indicando um consumo de energia elevado. Análise da composição corporal (tabela 4) mostrou que a perda de peso corporal induzida por ZAG foi devida a uma perda de gordura da carcaça, a qual foi parcialmente compensada por um aumento significativo na massa corporal magra. Houve um aumento de 50% na concentração plasmática de glicerol em ratos tratados com ZAG (tabela 5), indicativo de um aumento da lipólise, mas uma diminuição de 55% nos níveis plasmáticos dos ácidos graxos não esterificados (NEFA), sugerindo uma utilização aumentada. Os níveis plasmáticos de glicose e triglicerídeos também foram reduzidos por 36 a 37% (Tabela 5), também sugerindo uma utilização aumentada. Houve um aumento significativo na captação de 2- deoxiglicose em adipócitos epididimais de ratos tratados com ZAG por 10 dias, que estava aumentada na presença de insulina (Figura 12C). No entanto, não houve diferença significativa na captação de glicose nos adipócitos de animais tratados com ZAG ou PBS na presença de insulina (Figura 12C). Houve um aumento pequeno e não significativo na captação de glicose nos músculo gastrocnêmio e BAT de ratos tratados com ZAG em comparação com controles de PBS, mas um au- mento significativo na captação na presença de insulina (Figura 12D). Estes resultados sugerem que a redução na glicose sanguínea é devida a aumento da utilização por BAT, WAT e músculo esquelético, e isto é corroborado por um aumento da expressão de transportador de glicose 4 (GLUT4) em todos os três tecidos (Figura 13). Tabela 4 - Composição corporal de ratos machos depois de tratamento com quer PBS ou ZAG

Diferenças de animais tratados com PBS são mostradas como a, P<0,05 ou b, P<0,01 Tabela 5 - Níveis plasmáticos de metabólitos e insulina em ratos tratados com quer PBS ou ZAG por 10 dias

Diferenças de animais tratados com PBS são mostradas como quer a, P<0,05; b, P<0,01 ou c, P<0,001

[000148] A administração de ZAG aumentou a expressão das proteínas desacopladoras (UCP)-1 e -3 tanto em tecido adiposo marrom (BAT) quanto em tecido adiposo branco (WAT) por quase duas vezes (Figuras 13A e 13B), o que contribuiria para aumento da utilização de substrato. Em ratos tratados com ZAG houve também um aumento da expressão das enzimas lipolíticas lipase de triglicerídeos de tecido adiposo (ATGL) e lipase sensível a hormônio (HSL) em tecido adiposo epididimal (Figura 15), novamente com um aumento de duas vezes. A lipase de triglicerídeos de tecido adiposo é essencialmente responsável pela hidrólise da primeira ligação éster em uma molécula de triacil- glicerol formando diacilglicerol, ao passo que sua conversão para mo- nacilglicerol é realizada por HSL. A expressão de ZAG também estava significativamente aumentada em músculo esquelético, (Figura 16A), tecido adiposo branco (Figura 16B) e tecido adiposo marrom (Figura 16C) de ratos tratados com ZAG por 10 dias, mostrando que ZAG exógena reforça sua própria produção em tecidos periféricos.

[000149] Houve uma significativa redução na expressão das formas fosforiladsa tanto da proteína quinase dsRNA-dependente (PKR) quanto do fator de iniciação eucariótica 2 (eIF2) sobre a subunidade α no músculo gastrocnêmio de ratos aos quais foi administrada ZAG, enquanto a quantidade total não se alterou (Figuras 17A e 17B). Alterações similares foram observadas em camundongos ob/ob aos quais foi administrada ZAG (resultados não publicados) e foram consistentes com uma depressão da degradação de proteína e aumento na síntese de proteína em músculo esquelético.

EXEMPLO 2 Intervalo da Administração de Zinco-a2-glicoproteína

[000150] Observou-se que a administração diária de longo termo de ZAG em camundongos ob/ob resulta em uma cessação da perda de peso. Deste modo, foi determinado que um intervalo de 3 a 4 dias seguido por reinfusão de ZAG resultou em perda de peso contínua e melhora dos sintomas associados com hiperglicemia.

[000151] Apesar de não desejar ser limitado pela teoria, pode ser que os indivíduos estejam recebendo ZAG demais ou que haja dessensibilização de receptor conforme é visto com TNF. Um estudo piloto foi realizado com 2 camundongos em cada grupo para determinar pla- nejamento ótimo de liberação de ZAG. Foi observada uma perda de peso de 8 a 10 g de um camundongo de 90 g em cerca de 3 semanas.

[000152] Adipócitos foram removidos dos camundongos depois de 5 dias de ZAG e sua responsividade a isoprenalina (iso) foi medida depois de cultura na ausência de ZAG (Figura 9). A responsividade a iso é maior em camundongos tratados com ZAG e isto continua por um adicional de 4 dias (que foi quando a expressão de ZAG e HSL foram aumentadas) e em seguida cai no dia 5 (quando a expressão não foi aumentada) de volta a valores do controle de PBS.

EXEMPLO 3 Zinco-a2-glicoproteína atenua atrofia muscular em camundongo ob/ob

[000153] Este exemplo demonstra o mecanismo pelo qual ZAG atenua atrofia muscular no camundongo ob/ob usando um modelo in vitro recém desenvolvido (Russell et al, Exp. Cell Res. 315, 16-25, 2009). Este utiliza miotubos murinos submetidos a concentrações elevadas de glicose (10 ou 25 mM). Conforme mostrado na Figura 18 glicose elevada estimula um aumento na degradação de proteína (Figura 18A), e deprime a síntese de proteína (Figura 18B), e ambos estes efeitos foram completamente atenuados por ZAG (25 μg/mL). Portanto foi determinado se o efeito de ZAG foi mediado através de um β3-AR usando o antagonista SR59230A. No entanto o composto SR (isto é, SR59230A) também pode agir como um β-agonista, o qual pareceu fazer nestes experimentos. Portanto degradação de proteína induzida tanto por 10 quanto por 25 mM de glicose foi atenuada tanto por ZAG quanto pelo composto SR, e a combinação foi aditiva ao invés de antagonista (Figura 19). Para síntese de proteína (Figura 20) o composto SR parece ser similar a ZAG sem evidência de reversão, ao passo que com 10 mM de glicose o composto SR causa um aumento na depressão da síntese de proteína.

EXEMPLO 4 Zinco-a2-glicoproteína atenua a formação de ROS

[000154] Foi demonstrado que a formação de espécies de oxigênio reativo (ROS) é importante na degradação de proteína induzida por carga de glicose elevada. Os dados na Figura 21 mostram que ZAG atenua completamente o aumento em ROS produzidas por glicose, correspondente com a redução na degradação de proteína (Figura 18A). Glicose elevada também induz ativação (fosforilação) de PKR (Figura 22A) e a fosforilação de eIF2α subsequente (Figura 22B) conforme é vista em músculo esquelético de camundongos ob/ob, a qual também foi atenuada por ZAG. Estes resultados sugerem que este modelo in vitro será útil para estudar como ZAG afeta a massa muscular no nível molecular.

EXEMPLO 5 Zinco-a2-glicoproteína aumenta a tolerância a insulina

[000155] Também foi realizado um teste de tolerância a insulina em camundongos ob/ob aos quais foi administrada ZAG por 3 dias (Figura 23). Foram administradas aos animais duas doses de insulina (10 e 20 U/kg) por injeção i.p. e a glicose sanguínea foi medida durante os próximos 60 min. Conforme pode ser visto (Figura 23A) animais tratados com ZAG apresentaram maior sensibilidade a insulina (10 U/kg) do que aqueles que receberam PBS. Na maior concentração de insulina (20 U/kg) esta diferença desapareceu (Figura 23B). A curva de desaparecimento de glicose por 20 U/kg + PBS foi quase idêntica a 10 U/kg + ZAG, de modo que neste nível de dose ZAG está reduzindo a necessidade de insulina por 50%, mas isto pode ser superado administrando mais insulina.

EXEMPLO 6 Administração por 5 dias de zinco-a2-glicoproteína

[000156] Os dados mostrados no Anexo 1 são de um estudo de 5 dias onde ZAG foi administrada a 35 μg por dia i.v. em uma base diária por 5 dias. Ao final do experimento os tecidos foram removidos e blotted, ou provas funcionais foram realizadas com adipócitos isolados. Conforme pode ser visto na Figura 6A, a administração de ZAG aumentou sua expressão em gordura epididimal (ep), subcutânea (sc) e visceral (vis) cerca de duas vezes. Quando adipócitos ep foram preparados e mantidos em cultura de tecido (RPMI 1640 +10% de FCS) a expressão de ZAG foi mantida por um adicional de 3 dias, muito embora ZAG não tenha sido adicionado ao meio de cultura (Figura 6B). Além disso, adipócitos de camundongos tratados com ZAG apresentaram um aumento da resposta a isoprenalina (10 μM), e este também foi mantido por 4 dias em cultura de tecido na ausência de ZAG (Figu-ra 9). O aumento da resposta a isoprenalina é devido a um aumento da expressão de HSL por ZAG, e este também foi mantido em cultura de tecido por 4 dias na ausência de ZAG (Figura 6C). Estes resultados mostram que os efeitos de ZAG são mantidos por um adicional de 3 dias quando ZAG é retirado e portanto não precisa ser administrado diariamente. De fato, conforme discutido acima, muito ZAG é mais provável de levar a resistência do que uma resposta aumentada.

[000157] Uma aumento da expressão de HSL foi visto somente em adipócitos ep depois de 5 dias de ZAG (Figuras 5B a 5D), assim como ATGL (Figuras 5E a 5G). Houve um aumento na expressão de pERK somente em tecido adiposo ep (Figuras 5H a 5J), e um inibidor de pERK (PD98059 10μM) atenuou o aumento na expressão de HSL em adipócitos ep incubados com ZAG por 3 horas (Figura 5A). ZAG aumentou a expressão de UCP1 e UCP3 em BAT (Figuras 6D e 6E) e em músculo (Figura 6F) a qual seria responsável pelo aumento na temperatura corporal e queda nos triglicerídeos e ácidos graxos não esterificados no soro apesar do aumento na lipólise.

[000158] Embora a invenção tenha sido descrita com referência aos exemplos acima, será entendido que modificações e variações são englobadas dentro do espírito e do âmbito da invenção. Por conseguinte, a invenção é limitada somente pelas reivindicações que se seguem.

Claims

1. Uso de uma Zn-a2-glicoproteína (ZAG) junto com insulina ou SR59230A, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma formulação para tratamento de diabetes ou obesidade em um in-divíduo.

2. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a administração da formulação reduz os níveis de glicose no sangue e aumenta os níveis endógenos de Zn-a2-glicoproteína (ZAG) do indivíduo.

3. Uso, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é humano.