KR20110100210A

KR20110100210A - 지방 동원성을 갖는 당단백질 및 이의 치료적 용도

Info

Publication number: KR20110100210A
Application number: KR1020117013021A
Authority: KR
Inventors: 마이클 제이 티스데일; 스티븐 러셀
Original assignee: 아스톤 유니버시티
Priority date: 2008-11-07
Filing date: 2009-11-07
Publication date: 2011-09-09
Also published as: US20100173829A1; EP2355838B1; BRPI0921342B1; EP2355838A2; JP2017002069A; BRPI0921342A2; US20180339019A1; JP2022068320A; CA2743026C; JP2012508222A; JP2019116487A; US20200330554A1; JP2020172540A; CN102271701A; WO2010052563A2; IL212695A0; US20210315969A1; ES2525009T3; US20160220635A1; AU2016204169A1

Abstract

본 발명은 Zn-α₂-당단백질 또는 이의 기능성 단편을 투여하여 고혈당증과 관련된 증상을 완화하는 조성물 및 방법, 혈장 인슐린 수치를 감소시키는 방법, 골격근 질량을 증가시키는 방법, 체중 감량 및 비만 감소를 일으키는 방법을 제공하고, 또한 이에 사용하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

Description

지방 동원성을 갖는 당단백질 및 이의 치료적 용도{GLYCOPROTEINS HAVING LIPID MOBILIZING PROPERTIES AND THERAPEUTIC USES THEREOF}

본 발명은 대체로 고혈당증 및 비만에 대한 치료 및 약물, 보다 구체적으로는 고혈당증과 관련된 증상을 완화시키기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.

당뇨병은 당뇨병 환자에서의 혈당 수치 상승에 의해 다른 것에 비해 명백하게 보이는 포도당 대사작용의 손상을 특징으로 한다. 근원적인 결함에 따라 당뇨병은 2종의 주요 그룹으로 분류된다. 1형 당뇨병, 또는 인슐린 의존적 진성 당뇨병(IDDM)은, 환자가 그 췌장선에 인슐린 생성 베타 세포가 결여된 경우 발병된다. 2형 당뇨병, 또는 비인슐린 의존적 진성 당뇨병(NIDDM)은 베타 세포 기능이 손상되고, 인슐린 작용이 변화된 환자에서 발병된다.

1형과 2형 당뇨병 둘 모두는 골격근 질량 손실과 관련되며, 유비퀴틴-프로테오솜 경로의 활성 증가를 통한 근원섬유 단백질의 분해가 증가되는 원인이 된다. 이는 주로 1형 당뇨병에서 우세하지만, 인슐린 고갈에 의해서는 부분적으로만 설명되고, db/db 마우스 실험 결과는 인슐린 내성이 근육 소모를 일으킴을 보여주었다.

골격근의 손실은 중증 저인슐린혈증(스트렙토조토신 유도됨)과 중증 인슐린 내성(ob/ob) 당뇨병 둘 모두의 마우스 모델에서 발병된다. 당뇨병에서 근육 단백질 손실은 골격근에서의 단백질 분해 증가, 및 단백질 합성 억제와 연관있다. 단백질 분해 증가는 캐스파제-3 및 프로테오솜 둘 모두의 활성 증가와 연관된다.

비만은 인슐린 내성 및 2형 당뇨병과 관련된다. 카테콜라민 유도된 지방분해의 손상, 및 호르몬 감응성 리파제(HSL) 발현의 감소가 비만인 지방세포에서 관찰되며, 지방 조직 저장 증가의 발생, 또는 유지의 원인이 됨을 시사하였다. 대조적으로, 악액질 피험체 유래의 지방세포는 HSL 발현 증가와 함께 지방분해 반응이 2배 내지 3배 증가하는 것으로 나타났다.

아연-α₂-당단백질(ZAG)은 암 악액질에서 지방 손실을 유도하는 잠재력이 있는 지질 동원 인자(LMF)로서 동정되었다. ZAG는 β3-아드레날린작용성 수용체와의 상호작용을 통해 백색 지방세포에서 지방분해를 유도하는 것으로 확인된 한편, 생체 내에서는 갈색 지방 조직(BAT)에서 언커플링 단백질-1(UCP-1)의 발현을 증가시키고, 체지방의 손실을 유도시켰다. 일부 종양에 더하여, ZAG는 또한 백색 지방 조직(WAT) 및 BAT에 의해서도 생산되며 그 발현은 악액질에서 상향조절된다. 대조적으로, 비만 인간의 지방 조직에서 ZAG의 발현은 비만이 아닌 피험체에서 확인되는 것의 단지 30%였다. 이는 WAT에서의 ZAG 발현 손실이 일부 비만 특징을 설명할 수 있음을 시사한다. 마우스에서 2개의 ZAG 대립유전자의 확실한 불활성화는 체중 증가를 초래하였고 이 동물이 고지방식으로 사육되는 경우 더욱 두드러졌다. 다양한 제제에 대한 지방분해 반응은 ZAG 결핍 동물 유래의 지방세포에서는 유의하게 감소되었다.

현재까지, ZAG의 지방 동원 효과에 대한 모든 실험들은 인간 ZAG를 이용해 마우스에서 수행되었지만, 마우스와 인간 간 ZAG의 아미노산 서열 동일성은 겨우 58.6%이다. 래트와 마우스간 서열 상동성이 88.5%이므로, 이는 인간 ZAG가 마우스 수용체에 결합한다면, 래트에서도 효과가 있을 수 있음을 의미한다. 현 실험은 성숙한 숫컷 위스타 래트에서 인간 ZAG의 항비만 효능을 조사한다.

-발명의 요약-

본 발명은 2형 당뇨병의 모델로서, 성숙한 위스타 래트 및 성체 비만 고혈당증(ob/ob) 마우스에서 체중 및 인슐린 반응성에 대해 아연-α₂-당단백질(ZAG)가 효과가 있다는 발견을 기초로 한다. 이러한 발견은 고혈당증과 관련된 증상을 완화시키기 위한 방법에서 유용하다.

따라서, 본 발명은 피험체에서 고혈당증의 증상을 완화시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 이러한 치료를 필요로하는 피험체에게 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편의 치료 유효 용량을 약 10일 또는 그 이상의 기간 동안 투여하여, 치료 후 고혈당증과 관련된 증상이 완화되는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 치료는 10일 동안 매일 투여를 포함한다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 최대 10일 또는 그 이상 동안, 매일, 격일로, 2일마다, 또는 3일 마다 투여된다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 1일 2회 투여된다. 폴리펩티드는 정맥내, 피하, 복강내, 또는 경구 투여될 수 있다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 β3-아드레날린작용성 수용체 (β3-AR) 길항제 및 β3 작용제로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 제제와 조합하여 투여된다. 일 구체예에서, β3-AR 길항제는 SR59230A이다. 다른 구체예에서, β3 작용제는 AMNI-BRL37344(BRL37344)이다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 글리코실화된다.

고혈당증과 관련된 증상의 완화는, 이에 제한되는 것은 아니고, 치료 전의 혈청 수치와 비교하여, 포도당 혈청 수치 감소, 트리글리세리드 혈청 수치 감소, 인슐린 혈청 수치 감소, 및 비에스테르화 지방산 혈청 수치 감소를 포함한다. 일 구체예에서, 증상의 완화는 치료 전의 체온과 비교하여, 치료를 개시한 1일 이내에 약 0.4∼1℃의 체온 증가를 포함한다. 다른 구체예에서, 증상의 완화는 치료 전의 혈장 인슐린 수지와 비교하여, 치료를 개시한 3일 이내에 혈장 인슐린 수치의 감소를 포함한다. 인슐린 및/또는 포도당 및 트리글리세리드의 혈장 수치는 치료 전의 인슐린 및/또는 포도당 및 트리글리세리드의 혈장 수치와 비교하여 36% 만큼 감소될 수 있다. 다른 구체예에서, 증상의 완화는 치료를 개시한 3일 이내에 정맥내 포도당(2 g/kg)에 반응하는 인슐린 분비 및 혈당 수치의 정상화를 포함한다. 다른 구체예에서, 증상의 완화는 치료전 인슐린 췌장 수치와 비교하여, 인슐린 췌장 수치의 증가를 포함한다. 또다른 구체예에서, 증상의 완화는 치료 전의 언커플링 단백질-1(UCP1) 및 언커플링 단백질-3(UCP3)의 발현과 비교하여, 갈색 지방 조직에서의 UCP1 및 UCP3의 발현 증가를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 증상의 완화는 치료 전의 UCP3의 발현과 비교하여, 골격근에서 UCP3의 발현 증가를 포함한다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 글리코실화된다.

다른 측면에서, 본 발명은 피험체에서 혈장 인슐린 수치를 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 상기 피험체에게, 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편의 치료 유효 용량을 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 폴리펩티드는 최대 10일의 기간 동안 피험체에 투여되고, 치료 이후 혈장 인슐린 수치가 감소된다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 최대 21일의 기간 동안 피험체에게 투여되고, 치료 후 혈장 인슐린 수치가 감소된다. 다른 구체예에서, 혈장 인슐린 수치의 감소는 폴리펩티드를 투여한 3일 이내에 일어난다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 β3-아드레날린작용성 수용체(β3-AR) 길항제 및 β3 작용제로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 제제와 조합되어 투여된다. 일 구체예에서, β3-AR 길항제는 SR59230A이다. 다른 구체예에서, β3 작용제는 AMNI-BRL37344(BRL37344)이다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 글리코실화된다.

다른 측면에서, 본 발명은 피험체에서 골격근 질량을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 피험체에게 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 골격근은 비복근 또는 가자미근이다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 최대 10일의 기간 동안 피험체에 투여되고, 치료 후 골격근 질량이 증가된다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 최대 21일의 기간 동안 피험체에 투여되고, 치료 이후 골격근 질량이 증가된다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 β3-아드레날린작용성 수용체(β3-AR) 길항제 및 β3 작용제로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 제제와 조합되어 투여된다. 일 구체예에서, β3-AR 길항제는 SR59230A이다. 다른 구체예에서, β3 작용제는 AMNI-BRL37344(BRL37344)이다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 글리코실화된다.

다른 측면에서, 본 발명은 체중 감량 또는 비만의 감소가 일어나도록 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 β3-아드레날린작용성 수용체(β3-AR) 길항제 및 β3 작용제로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 제제와 조합하여 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편의 치료 유효 용량을 이러한 치료를 필요로하는 피험체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, β3-AR 길항제는 SR59230A이다. 다른 구체예에서, β3 작용제는 AMNI-BRL37344(BRL37344)이다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 글리코실화된다.

다른 측면에서, 본 발명은 체중 감량 또는 비만 감소가 일어나도록 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 β3-아드레날린작용성 수용체 (β3-AR) 길항제 및 β3 작용제로 이루어진 군에서 선택되는 1 이상의 제제와 조합하여 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편의 치료 유효 용량을 이러한 치료를 필요로하는 피험체에게 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, β3-AR 길항제는 SR59230A이다. 다른 구체예에서, β3 작용제는 AMNI-BRL37344(BRL37344)이다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 글리코실화된다.

다른 측면에서, 본 발명은 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드, 및 β3-아드레날린작용성 수용체(β3-AR) 길항제 및 β3 작용제로 이루어진 군에서 선택되는 제제를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, β3-AR 길항제는 SR59230A이다. 다른 구체예에서, β3 작용제는 AMNI-BRL37344(BRL37344)이다. 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 글리코실화된다.

도 1A는 ZAG의 특징규명 및 ob/ob 마우스의 지방분해와 체중에 대한 그 효과를 보여주는 도면이다. 293 세포 배지 내 총 단백질 및 기술된 바와 같이 정제된 ZAG를 보여주는 12% SDS-PAGE 후 쿠마시 염색 결과.
도 1B는 배양 배지에서 ZAG의 발현 및 정제된 ZAG를 보여주는 웨스턴 블랏 결과를 나타낸 도면이다.
도 1C는 체중 감량을 겪은 MAC16 마우스에서의 지방 조직과 간 조직의 ZAG mRNA 수준을 보여주는 도면이다.
도 1D는 이소프레날린(Iso) 및 ZAG에 반응하는 비비만 마우스(■) 및 ob/ob 마우스(□)에서 유래된 정소상체 지방세포에서의 지방분해 결과를 보여주는 그래프이다. 비비만 마우스와의 편차는 * p<0.05, ** p<0.01 및 ***　p<0.001로 나타내었다.
도 1E는 미처리(■), 이소프레날린(10 μM)(□) 또는 ZAG(0.46 μM)(▨) 처리된 비만(ob/ob) 및 비비만(비 ob) 마우스에서 얻어진 정소상체(ep), 피하(s.c.) 및 내장(vis)에서 유래하는 지방세포에서의 지방분해 결과를 보여주는 그래프이다. 정소상체 지방세포와의 편차는 ** p<0.01로 나타내었다.
도 1F는 방법에서 기술한 바와 같이 PBS(◆)와 비교한, ob/ob 마우스의 체중에 대한 ZAG(■)의 효과를 보여주는 그래프이다. 시점 0 및 PBS 대조군과의 체중 편차는 *** p<0.001로 나타내었다.
도 1G는 PBS 대조군(■)과 비교하여 e에 도시된 마우스의 체온에 대한 ZAG(□)의 효과를 보여주는 그래프이다. 대조군과의 편차는 *** p<0.001로 나타내었다.
도 2A는 ZAG로 처리된 ob/ob 마우스의 비복근 및 지방세포로의 포도당 흡수율, 포도당 내성을 보여주는 그래프이다. 포도당(2 g/kg)의 i.v. 투여 후 3일 동안 ZAG(■) 또는 PBS(◆)로 처리된, 사료를 주는 상태에서의 ob/ob 마우스의 포도당 혈장 수치. PBS와의 편차 p<0.001. 혈액 샘플은 포도당 투여 이후 일정 간격으로 꼬리 정맥에서 채취하였고 포도당과 인슐린 측정에 사용하였다.
도 2B는 포도당의 경구 투여(1 g/kg) 이후 ZAG로 처리된 ob/ob 마우스에서의 혈장 인슐린 수치를 보여주는 그래프이다. PBS와의 편차 p<0.001.
도 2C는 0(■), 1(□) 또는 10(▨) nM 인슐린 존재 하에 5일 동안 ZAG를 처리한 ob/ob 마우스의 정소상체(ep), 내장(vis) 및 피하(s.c.) 지방세포로의 포도당 흡수율을 보여주는 그래프이다. ZAG 존재하의 편차는 *** p<0.001로 나타내었다.
도 2D는 인슐린(100 nM) 부재 또는 존재 하에 5일 동안 ZAG 또는 PBS로 처리된 ob/ob 마우스의 비복근으로 2-데옥시-D-포도당의 흡수율을 보여주는 그래프이다. 인슐린 존재하의 편차는 * p<0.05 또는 ** p<0.01로 나타내었고, ZAG 존재 하의 편차는 *** p<0.001로 나타내었다.
도 2E는 ob/ob 마우스의 골격근에서의 단백질 합성 및 분해에 대한 ZAG의 효과를 보여주는 도면이다. 5일 동안 ob/ob 마우스의 처리 이후 골격근을 제거해내고 GLUT4의 발현에 대해 웨스턴 블랏하였다.
도 3A는 ob/ob 마우스의 골격근에서의 단백질 합성 및 분해에 대한 ZAG의 효과를 보여주는 도면이다. 5일 동안 ob/ob 마우스의 처리 후 골격근을 제거해내고 단백질 합성의 측정에 사용하였다. PBS 대조군, 또는 비비만 동물과의 편차를 *** p<0.001로 나타내었다.
도 3B는 ob/ob 마우스의 골격근에서의 단백질 합성 및 분해에 대한 ZAG의 효과를 보여주는 도면이다. 5일 동안 ob/ob 마우스를 처리한 후 골격근을 제거해내고 단백질 분해의 측정에 사용하였다. PBS 대조군, 또는 비비만 동물과이 편차는 *** p<0.001로 나타내었다.
도 3C는 ob/ob 마우스의 골격근에서의 단백질 합성 및 분해에 대한 ZAG의 효과를 보여주는 그래프이다. 5일 동안 ob/ob 마우스의 처리 후 골격근을 제거해 내고 키모트립신 유사 효소 활성을 측정하는데 사용하였다. PBS 대조군, 또는 비비만 동물과의 편차는 *** p<0.001로 나타내었다.
도 3D는 ob/ob 마우스의 골격근에서의 단백질 합성 및 분해에 대한 ZAG의 효과를 보여주는 도면이다. 5일 동안 ob/ob 마우스의 처리 후 골격근을 제거해내고 20S-프로테오솜 α-서브유닛의 발현에 대해 웨스턴 블랏하였다.
도 3E는 ob/ob 마우스의 골격근에서의 단백질 합성 및 분해에 대한 ZAG의 효과를 보여주는 도면이다. 5일 동안 ob/ob 마우스의 처리 후 골격근을 분리해내고 p42의 발현에 대해 웨스턴 블랏하였다.
도 3F는 ob/ob 마우스의 골격근에서의 단백질 합성 및 분해에 대한 ZAG의 효과를 보여주는 도면이다. 5일 동안 ob/ob 마우스의 처리 후 골격근을 제거해내고 미오신 발현에 대해 웨스턴 블랏하였다.
도 3G는 ob/ob 마우스의 골격근에서의 단백질 합성 및 분해에 대한 ZAG의 효과를 보여주는 도면이다. 5일 동안 ob/ob 마우스를 처리한 후 골격근을 제거해내고 액틴의 발현에 대해 웨스턴 블랏하였다.
도 4A는 5일 동안 PBS 또는 ZAG를 처리한 후 ob/ob 마우스의 비복근에서 인산화 PKR을 웨스턴 블랏함으로써 골격근에서의 이화작용 신호전달 경로에 대한 ZAG의 효과를 보여주는 도면이다. 단백질의 전체 형태는 충전 대조군으로서 제공한다. PBS 대조군과의 편차는 *** p<0.001로 나타내었고 비비만 마우스와의 편차는 # p<0.001로 나타내었다.
도 4B는 5일 동안 PBS 또는 ZAG로 처리한 후 ob/ob 마우스의 비복근에서 인산화 eIF2α를 웨스턴 블랏함으로써 골격근에서의 이화작용 신호전달 경로에 대한 ZAG의 효과를 보여주는 도면이다. 단백질의 전체 형태는 충전 대조군으로서 제공하였다. PBS 대조군과의 편차는 ***　p<0.001로 나타내었고 비비만 마우스와의 편차는 # p<0.001로 나타내었다.
도 4C는 5일 동안 PBS 또는 ZAG로 처리한 후 ob/ob 마우스의 비복근에서 인산화 PLA₂를 웨스턴 블랏함으로써 골격근에서의 이화작용 신호전달 경로에 대한 ZAG의 효과를 보여주는 도면이다. 단백질의 전체 형태를 충전 대조군으로서 제공하였다. PBS 대조군과의 편차는 ***　p<0.001로 나타내었고 비비만 마우스와의 편차는 # p<0.001로 나타내었다.
도 4D는 5일 동안 PBS 또는 ZAG로 처리한 후 ob/ob 마우스의 비복근에서 인산화 p38MAPK를 웨스턴 블랏함으로써 골격근에서의 이화작용 신호전달 경로에 대한 ZAG의 효과를 보여주는 도면이다. 단백질의 전체 형태는 충전 대조군으로서 제공하였다. PBS 대조군과의 편차는 *** p<0.001로 나타내었고 비비만 마우스와의 편차는 # p<0.001로 나타내었다.
도 4E는 5일 동안 PBS 또는 ZAG로 처리한 후 ob/ob 마우스의 비복근에서 캐스파제-3(■) 및 캐스파제-8(□)의 활성을 통해 골격근에서의 이화작용 신호전달 경로에 대한 ZAG의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 5A는 ZAG에 반응한 HSL 및 ATGL의 발현을 보여주는 도면이다. 웨스턴 블랏 결과는 미처리(Con), 또는 이소프레날린(10 μM) 또는 ZAG(0.46 μM) 단독 처리, 또는 ZAG로 처리하고 5일 후 PD98059(25 μM) 존재하에, 이후 3시간 경과 후 비비만 마우스의 지방세포에서의 인산화 HSL의 발현을 보여준다.
도 5B는 ZAG로 처리하고 5일 후 정소상체(ep) 지방세포에서 면역블랏을 통해 HSL의 발현을 보여주는 도면이다.
도 5C는 ZAG로 처리하고 5일 후 피하(sc) 지방세포에서 면역블랏을 통해 HSL의 발현을 보여주는 도면이다.
도 5D는 ZAG로 처리하고 5일 후 내장(vis) 지방세포에서 면역블랏을 통해 HSL의 발현을 보여주는 도면이다.
도 5E는 ZAG로 처리하고 5일 후 정소상체 지방세포에서 ATGL의 발현을 보여주는 도면이다.
도 5F는 ZAG로 처리하고 5일 후 피하 지방세포에서 ATGL의 발현을 보여주는 도면이다.
도 5G는 ZAG로 처리하고 5일 후 내장 지방세포에서 ATGL의 발현을 보여주는 도면이다.
도 5H는 ZAG로 처리하고 5일 후 정소상체 지방세포에서 ERK의 발현을 보여주는 도면이다.
도 5I는 ZAG로 처리하고 5일 후 피하 지방세포에서 ERK의 발현을 보여주는 도면이다.
도 5J는 ZAG로 처리하고 5일 후 내장 지방세포에서 ERK의 발현을 보여주는 도면이다.
도 5K는 5일 동안 PBS 또는 ZAG로 처리한 ob/ob 마우스에서 얻은 정소상체(ep), 피하(sc) 및 내장(vis)에서 유래하는 지방세포의 BRL37344에 대한 반응을 보여주는 그래프이다. PBS 대조군과의 편차는 *** p<0.01로 나타내었고, PD98059 존재하의 편차는 # p<0.001로 나타내었다.
도 6A는 WAT에서 ZAG 및 HSL의 발현, BAT에서 UCP1 및 UCP3의 발현, 및 비복근에서 UCP3의 발현에 대한, ZAG로 5일간 ob/ob 마우스 처리의 효과를 보여주는 도면이다. ep, sc, 및 vis 지방세포에서 ZAG 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 결과. 0일은 지방세포를 마우스에서 제거해낸 날을 의미한다.
도 6B는 방법에 기술한 바와 같이 RMPI 배지에 현탁시킨 정소상체 지방세포에서의 ZAG 발현을 보여주는 도면이다. 샘플은 1일 간격으로 채취하였고 ZAG 발현에 대해 웨스턴 블랏하였다. 0일은 마우스에서 지방세포를 제거해낸 날을 의미한다.
도 6C는 방법에 기술한 바와 같이 RMPI 배지에 현탁시킨 정소상체 지방세포에서의 HSL 발현을 보여주는 도면이다. 샘플을 1일 간격으로 채취하고 HSL 발현에 대해 웨스턴 블랏하였다. 0일 마우스에서 지방세포를 제거해낸 날을 의미한다.
도 6D는 마우스에서 제거해낸 BAT에서의 UCP1 발현을 보여주는 도면이다. PBS 처리한 마우스와의 편차는 *** p<0.001로 나타내었다.
도 6E는 마우스로부터 제거해낸 BAT에서의 UCP3 발현을 보여주는 도면이다. PBS 처리한 마우스와의 편차는 *** p<0.001로 나타내었다.
도 6F는 마우스로부터 제거해낸 비복근에서의 UCP3 발현을 보여주는 도면이다. PBS 처리한 마우스와의 편차는 *** p<0.001로 나타내었다.
도 7A는 21일 실험 동안 ob/ob 마우스의 체중 감량을 보여주는 그래프이다. ZAG는 1, 4, 5, 8, 13, 16, 18, 및 19일에 주사하였고; PBS는 동일 시점에 주사하였다.
도 7B는 ZAG 처리 동안 ob/ob 마우스(체중 80-90 g)의 체중 변화량(g)을 보여주는 그래프이다.
도 7C는 21일 실험 동안 ob/ob 마우스의 체온 상승을 보여주는 그래프이다. ZAG는 1, 4, 5, 8, 13, 16, 18, 및 19일에 주사하였고; PBS는 동일 시점에 주사하였다.
도 8A는 처리의 처음 5일 동안 뇨당 배출의 점진적 감소를 보여주는 그래프이다.
도 8B는 21일 실험 동안 뇨당 배출의 점진적 감소를 보여주는 그래프이다.
도 9는 ZAG 처리 및 미처리된 ob 마우스에서 유래하고 최대 5일 동안 배양시킨 단리된 지방세포에서 이소프레날린(iso)에 의해 자극된 글리세롤 방출을 보여주는 그래프이다.
도 10은 [T. Araki et al. (1988) "Complete amino acid sequence of human plasma Zn-α₂-glycoprotein and its homology to histocompatibility antigens."]에 공개된, 인간 혈장 Zn-α₂-당단백질의 완전한 아미노산 서열(서열번호 1)을 보여주는 도면이다.
도 11은 SR59230A(10 μM) 또는 항-ZAG 항체(1:1000)(IgG)의 부재 또는 존재하에 이소프레날린(10 μM)과 비교하여, 단리된 래트의 정소상체 지방세포에서 인간 ZAG의 지방분해 활성을 보여주는 그래프이다. 각각의 값은 5회의 개별 실험의 평균이다. 대조군과의 편차는 b, p<0.01 또는 c, p<0.001로 나타내었고, ZAG 단독과의 편차는 e, p<0.01 또는 f, p<0.001로 나타내었다.
도 12A는 10일 기간 동안 숫컷 위스타 래트의 체중에 대한, 100 ㎕ PBS 중 ZAG(50 ㎍/100g b.w.)(■) 또는 PBS 단독(◆)의 매일 i.v. 투여의 효과를 보여주는 그래프이다. 실험 프로토콜은 방법 섹션에 제공한다.
도 12B는 도 12A에 도시한 바와 같은 ZAG(■) 또는 PBS(◆) 투여된 숫컷 위스타 래트의 체온을 보여주는 그래프이다.
도 12C는 인슐린(60 μU/㎖) 부재 또는 존재하에, 도 12A에 나타낸 바와 같은, 10일 간 ZAG(□) 또는 PBS(■) 처리 10일 후 숫컷 위스타 래트의 정소상체 지방세포로의 2-데옥시-D-포도당의 흡수율을 보여주는 그래프이다.
도 12D는 인슐린(60 μU/㎖) 부재 또는 존재하에, ZAG 또는 PBS 처리 10일 후 숫컷 위스타 래트의 비복근 및 BAT로의 포도당 흡수율을 보여주는 그래프이다. ZAG 및 PBS 처리 동물 간 편차는 a, p<0.05, b, p<0.01 또는 c, p<0.001로 나타내었고, 인슐린 존재하의 편차는 f, p<0.001로 나타내었다.
도 12E는 ZAG 투여된 ob/ob 마우스에서 조직 Rg를 보여주는 그래프이다. PBS와의 편차 c, p<0.001.
도 13A-13C는 도 12에 도시한 바와 같이 10일간 PBS 또는 ZAG로 처리된 숫컷 위스타 래트의 BAT(도 13A) 및 WAT(도 13B) 및 비복근(도 13C)에서 GLUT4의 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 결과 도면이다. ZAG 및 PBS 처리 동물간 편차는 c, p<0.001로 나타내었다.
도 14A 및 14B는 도 12에 도시한 바와 같이 10일간 PBS 또는 ZAG로 처리된 숫컷 위스타 래트의 BAT(도 14A) 및 WAT(도 14B)에서 UCP1 및 UCP3의 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 결과 도면이다. ZAG 및 PBS 처리 동물간 편차는 c, p<0.001로 나타내었다.
도 15A 및 15B는 도 12에 도시한 바와 같이 10일간 PBS 또는 ZAG로 처리된 숫컷 위스타 래트의 정소상체 지방 조직에서 ATGL(도 15A) 및 HSL(도 15B)의 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 결과 도면이다. ZAG 및 PBS 처리 동물간 편차는 c, p<0.001로 나타내었다.
도 16A-16C는 비복근(도 16A), WAT(도 16B) 및 BAT(도 16C)에서 ZAG의 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 결과 도면이다. 조직은 도 12에 도시한 바와 같이 10일 동안 PBS 또는 ZAG로 처리된 숫컷 위스타 래트에서 절개하였다. ZAG 및 PBS 처리된 동물간 편차는 c, p<0.001로 나타내었다.
도 17A 및 17B는 도 12에 도시된 바와 같이 10일 동안 PBS 또는 ZAG로 처리된 숫컷 위스타 래트의 비복근에서 인산화 및 전체 형태의 PKR(도 17A) 및 eIF2α(도 17B)의 발현을 보여주는 웨스턴 블랏 결과 도면이다. 농도계 분석치는 PBS로 처리된 래트에 대한 값의 비율로서 나타낸, 전체 형태에 대한 인산화 형태의 비율이다.
도 18A 및 18B는 다양한 농도의 포도당 존재하에 4시간 동안 ZAG 처리 및 미처리된 C2C12 근관에서 페닐알라닌 방출(도 18A) 및 단백질 합성(도 18B)을 보여주는 그래프이다. 대조군과의 통계적 유의성 c, P<0.001; 포도당 단독과의 통계적 유의성 f, P<0.001.
도 19는 다양한 농도의 포도당 존재하에 ZAG 처리 및 미처리, 그리고 SR59230A 처리 및 미처리된 C2C12 근관에서 페닐알라닌 방출을 보여주는 그래프이다. 대조군과의 통계적 유의성 b, P<0.01 및 c, P<0.001; 포도당 단독과의 통계적 유의성 e, P<0.05 및 f, P<0.001.
도 20은 다양한 농도의 포도당 존재하에 ZAG 처리 및 미처리, 그리고 SR59230A 처리 및 미처리된 C2C12 근관에서 단백질 합성을 보여주는 그래프이다. 대조군과의 통계적 유의성 b, P<0.01 및 c, P<0.001; 포도당 단독과의 통계적 유의성 e, P<0.05 및 f, P<0.001; 포도당+SR과의 통계적 유의성 I, P<0.001.
도 21은 다양한 농도의 포도당을 처리하면서 ZAG를 처리 및 미처리한 C2C12 근관에서 ROS 활성을 보여주는 그래프이다. 대조군과의 통계적 유의성 c, P<0.001, 포도당 단독과의 통계적 유의성 f, P<0.001.
도 22A는 포도당으로 처리하면서 ZAG를 처리 및 미처리한 C2C12 근관에서 PKR을 보여주는 웨스턴 블랏 도면이다. 대조군과의 통계적 유의성 c, P<0.001, 포도당 단독과의 통계적 유의성 f, P<0.001.
도 22B는 포도당으로 처리하면서 ZAG를 처리 및 미처리한 C2C12 근관에서eIF2α를 보여주는 웨스턴 블랏 도면이다. 대조군과의 통계적 유의성 c, P<0.001, 포도당 단독과의 통계적 유의성 f, P<0.001.
도 23A 및 23B는 ZAG를 처리 및 미처리한 ob/ob 마우스에서의 인슐린 내성 검사 결과를 보여주는 그래프이다. ZAG와의 통계적 유의성 b, P<0.05 및 c, P<0.001.
도 24는 ob/ob 마우스에서 D-[U-¹⁴C 포도당]의 ¹⁴CO₂로의 산화율을 보여주는 그래프이다.
도 25는 ob/ob 마우스에서 [¹⁴C 카르복시]로부터 ¹⁴CO₂의 생성율을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 재조합 인간 아연-α₂-당단백질(ZAG)이 음식 섭취에 영향없이 ob/ob 마우스 및 위스타 래트에서 체중 감량 및 인슐린 반응성 증가를 일으킨다는 관찰결과를 기초로 한다. 이와 같이, 본 발명은 피험체에서 고혈당증 증상의 완화, 피험체에서 혈장 인슐린 수치의 감소, 및 피험체에서 골격근 질량의 증가를 위한 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 피험체에서 체중 감량 또는 비만 감소를 일으킬 수 있는 병용 치료를 제공한다.

본 발명의 조성물과 방법을 기술하기에 앞서, 본 발명은 기술된 특정 조성물, 방법 및 실험 조건에 한정되지 않으며, 그러한 조성물, 방법 및 조건은 다양할 수 있음을 이해해야 한다. 또한 본원에 사용되는 용어는 특정 구체예만을 설명하려는 목적이며, 본 발명의 범주는 첨부된 청구항에만 제한되므로, 한정시키려는 의도가 없음을 이해해야 한다.

본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수는 달리 명확하게 언급하지 않으면 복수 언급을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "방법"에 대한 언급은 1 이상의 방법들을 포함하고/하거나 본원에 기술된 유형의 단계들 포함하고 이는 본원을 읽는 당분야의 숙련가에게는 자명하다.

달리 정의하지 않으면, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 숙련가 중 한명이 통상 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 또는 균등한 임의의 방법 및 재료가 본 발명의 실시 또는 검사 시에 사용될 수 있지만, 여기서 바람직한 방법 및 재료를 설명한다.

ZAG의 완전한 아미노산 서열은 "Complete amino acid sequence of human plasma Zinc-α₂-glycoprotein and its homology to histocompatibility antigens"의 명칭의 논문으로 [T. Araki et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85, 679-683]에 보고되었으며, 여기서 이 당단백질은 3 글리코실화 부위에 N-연결된 글리칸과 함께 2개의 이황화 결합을 포함하고 3종의 개별 도메인 구조(A, B 및 C)를 갖는 276 아미노산 잔기의 단일 폴리펩티드 사슬로 구성된 것으로 확인되었다. 이 폴리펩티드 성분의 아미노산 서열은 첨부된 도면의 도 10에 도시하였다. 일부 후속 공개물들이 상이한 체액 또는 조직에서 단리시 인간 ZAG의 조성이 어느정도 다양할 수 있다고 지적하였지만, 이러한 재료의 모든 조제물은 실질적으로 동일한 면역학적 특징을 가진다. [H. Ueyama, et al. (1991) "Cloning and nucleotide sequence of a human Zinc-α₂-glycoprotein cDNA and chromosomal assignment of its gene", Biochem. Biophys. Res. Commun. 177, 696-703]에 보고된 바와 같이, ZAG의 cDNA는 인간 간 및 전립선 라이브러리에서 단리되었고, 또한 그 유전자는 [Ueyama et al., (1993) "Molecular cloning and chromosomal assignment of the gene for human Zinc-α₂-glycoprotein", Biochemistry 32, 12968-12976]에 보고된 바와 같이, 단리되었다. H. Ueyama 등은 또한 [J. Biochem. (1994) 116, 677-681]에, 그 상응하는 mRNA에 의해 발현되는 당단백질과 함께, 서열분석되어 인간 재료와 비교한 래트 및 마우스 간 유래의 ZAG cDNA에 대한 연구를 보고하였다. 다른 종에서 예상되는 바와같이 구체적인 차이점이 발견되었지만, 인간 대응물과의 동일성이 50%가 넘게, 고도의 아미노산 서열 상동성이 확인되었다(당단백질의 도메인 B내에서 동일성은 70% 이상). 역시, 인간, 래트 및 마우스 ZAG 간의 공동적인 면역학적 특성이 관찰되었다.

상기 기술된 정제된 ZAG는 문헌 [Ohkubo et al. (Ohkubo et al. (1988) "Purification and characterisation of human plasma Zinc-α₂-glycoprotein" Prep. Biochem., 18, 413-430]에 기술된 방법을 실질적으로 따라 신선한 인간 혈장으로부터 준비하였다. 일부 경우에서 ZAG 또는 단리된 지질 동원 인자의 단편은 지질분해 또는 지질 동원 활성을 상실하지 않고 생성될 수 있으며, 실질적으로 이 활성에 영향을 주지않는 다양한 부가, 결실 또는 치환을 실시할 수 있음을 이해할 것이다. 이와 같이, 본 발명의 방법은 또한 ZAG의 기능성 단편의 용도도 포함한다. 치료적 용도에 사용되는 당단백질 또는 이의 단편은 예를 들어 문헌 [H. Ueyama et al. (1994) "Structure and Expression of Rat and Mouse mRNAs for Zinc-α₂-glycoprotein" J. Biochem., 116, 677-681]에 공개된 가능하게는 아연-α₂-당단백질에 대해 알려진 cDNA 서열을 기초로 당분야에 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기법으로 더욱 생성시킬 수 있다. 또한, 치료 용도에 사용되는 당단백질 또는 이의 단편은 폴리펩티드의 발현후 변형, 예를 들어 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등을 비롯하여, 천연 발생 및 비천연 발생의, 당분야에 공지된 다른 변형을 더 포함할 수 있다.

ZAG는, 전체로 참조되어 본원에 편입되는 미국 특허 제6,890,899호에 개시된 바와 같이, 포유류에서 비만 감소 또는 체중 감량을 일으키는 것으로 앞서 확인되었다. 또한, 전체로 참조되어 본원에 편입되는 미국 공개 특허 출원 제 20060160723호에 개시된 바와 같이, ZAG 및/또는 이의 단편의 유사한 특징을 갖는 지질 동원 제제가 또한 사용되어 포유동물에서 비만 감소 또는 체중 감량을 일으키는 것으로 관찰되었다. 본 발명은 ZAG 및/또는 이의 기능성 단편이 지방세포 및 골격근의 인슐린 반응성을 증가시키고, 치료 동안 비만 감소 또는 체중 감량에 대한 관찰 여부와 무관하게 단백질 분해 감소와 커플링된 단백질 합성의 증가를 통해 근육 질량 증가를 일으키는 것을 검증하였다. 따라서, 본 발명의 방법은 임의의 검출가능한 체중 감량 또는 비만 감소 전에 고혈당증 및/또는 근육 소모성 질환과 관련된 증상에 대한 검출가능한 효과를 제공하는 것을 고려한다.

따라서, 일 측면에서, 본 발명은 피험체에서 고혈당증의 증상을 완화시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 이러한 치료를 필요로하는 피험체에게, 최대 10일 또는 그 이상의 기간 동안, 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편의 치료 유효 용량을 투여하는 것을 포함한다. 예를 들어, 치료 계획은 수개월(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월), 또는 수년간일 수 있다. 일 구체예에서, 일 구체예에서, 폴리펩티드는 21일 이하 또는 그 이상의 기간 동안 투여된다. 다른 구체예에서, 증상의 완화는 치료를 개시하고 수일(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일), 수주(예를 들어, 1, 2, 3, 또는 4주), 또는 수개월(예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 또는 12개월) 이내에 검출가능하다. 다른 구체예에서, 치료 계획은 약 10일이고, 치료 이후 고혈당증과 관련된 증상이 완화된다. 다른 구체예에서, 치료 계획은 약 21일이고, 치료 이후 고혈당증과 관련된 증상이 완화된다.

본원에서 사용하는 용어 "피험체"는 대상 방법을 수행하게 되는 임의의 개체 또는 환자를 의미한다. 대체로, 피험체는 인간이지만, 당분야에서 인지하는 바와 같이, 피험체는 동물일 수 있다. 따라서, 포유동물 예컨대 설치류(마우스, 래트, 햄스터 및 기니 피그 포함), 고양이, 개, 토끼 등, 소, 말, 염소, 양, 돼지 등을 포함한 가축, 및 영장류(원숭이, 침팬지, 오랑우탄 및 고릴라 포함)를 포함하는, 다른 동물도 피험체의 정의에 포함된다.

고혈당증 및/또는 그와 관련된 질병의 예시적인 특징은, 이에 제한되는 것은 아니고, 당뇨병 전증, 2형 당뇨병, 1형 당뇨병, 포도당 내성 손상, 다낭성 난소 증후군, 비알콜성 지방간 질환, 근육 소모성 질환, 검출가능한 고혈당증을 일으키지 않는 인슐린 내성 상태, 임신 당뇨병, 심혈관 위험, 및 심근경색을 포함한다. 예시적인 근육 소모성 질환은 이에 제한되는 것은 아니고, 암, AIDS, 패혈증, COPD, 신부전증, 관절염, 울혈성 심부전증, 근이영양증, 당뇨병, 노화에 의한 근육감소증, 중증 외상(예를 들어, 사지의 정형외과적 부동), 대사성 산증, 탈신경위축, 및 무중력을 포함한다. 고혈당증 및/또는 당뇨병을 갖는 피험체는 정상 또는 평균 체중일 수 있음을 이해해야 한다. "마른 당뇨병"이라고하는 이러한 개체는 체중이나 비만 증가없이 고혈당증 및/또는 당뇨병과 관련된 1 이상의 증상을 나타낸다. 또한, 과체중이거나 비만인 일정 비율의 당뇨병은 사실, 당뇨병에 과체중/비만이 과중된 마른 당뇨이다.

용어 "치료 유효량" 또는 "유효량"은 연구자, 수의사, 의사 또는 다른 임상의가 추구하는 조직, 계, 동물 또는 인간의 생물학적 또는 의학적 반응을 유도시키는 화합물 또는 약학 조성물의 양을 의미한다.

용어 "투여" 또는 "투여하는"은 치료를 필요로하는 피험체에게 본 발명의 화합물 또는 약학 조성물을 제공하는 행동을 포함하는 것으로 정의된다. 본원에서 사용되는 어구 "비경구 투여" 및 "비경구 투여되는"은 일반적으로 경구 또는 주사에 의한, 장 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 제한없이, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내, 피막내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 피하, 경기관, 피하, 피부밑, 관절내, 피막하, 지주막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다. 본원에서 사용하는 어구 "전신 투여", "전신 투여하는", "말초 투여" 및 "말초적으로 투여하는"은 중추신경계에 직접 투여하는 것 이외에 화합물, 약물 또는 다른 물질을 투여하여, 이들이 피험체의 계에 유입되고, 그에 따라 대사 및 다른 프로세스를 겪게되는 투여, 예를 들어 피하 투여를 의미한다.

본원에서 사용하는 용어 "완화되는" 또는 "치료되는"은 고혈당증과 관련된 임상적 징후 및/또는 증상이 수행된 조치의 결과로서 줄어드는 것을 의미한다. 모니터링되는 징후 또는 증상은 고혈당증의 특징이 되며 당분야의 숙련의에게 공지이고, 징후 및 병태를 모니터링하는 방법 역시 그러하다. 고혈당증과 관련된 예시적인 증상은, 이에 제한되는 것은 아니고, 고혈당증을 갖지 않는 피험체 또는 정상 피험체와 비교하여, 높은 포도당 혈청 수치, 높은 트리글리세리드 혈청 수치, 높은 인슐린 혈청 수치 및 높은 비에스테르화 지방산(NEFA) 혈청 수치를 포함한다. 이와 같이, 고혈당증과 관련된 증상의 완화는 이에 제한되는 것은 아니고, 포도당 혈청 수치 감소, 트리글리세리드 혈청 수치 감소, 인슐린 혈청 수치 감소, 비에스테르화 지방산 혈청 수치 감소, 혈장 인슐린 수치 감소, 인슐린 췌장 수치 증가, 및 골격근 질량 증가를 포함한다.

본원에서 사용하는 용어 "감소하다" 및 "억제하다"는 함께 사용되는데, 일부 경우에서, 감소는 특정 분석의 검출 수준 이하로 줄어들 수 있다는 것이 인식되기 때문이다. 이와 같이, 발현 수준 또는 활성이 분석법의 검출 수준 이하로 "감소되는"지 또는 완전하게 "억제되는"지 항상 분명하지 않을 수 있다. 그럼에도, 본 발명에 따른 치료 이후, 예를 들어 혈청 인슐린 수치가 치료 전 수치보다 적어도 감소되었음은 분명히 확인가능하다.

ZAG는 수많은 생물학적 역할에 기여하지만, 아디포카인 조절 지질 동원 및 이용에서의 그 역할이 체조성을 조절하는데 가장 중요하다. 이전 연구들은 단백질 합성의 증가는 β-아드레날린작용성 수용체와의 상호작용을 통한 환형 AMP의 증가에 기인하고, 반면 단백질 분해의 감소는 유비퀴틴-프로테오솜 단백질가수분해 경로의 활성 감소에 기인한다고 시사하였다. db/db 마우스에서의 연구들은 인슐린 내성이 유비퀴틴-프로테오솜 경로의 활성을 증가시키는 것을 통해 근육 소모를 초래시킨다는 것을 보여주었다. PKR 및 eIF2α 둘 모두의 인산화 증가는 번역 개시를 차단시키는 것에 의해 단백질 합성을 감소시키게 되고, 반면 PKR의 활성화는, 프로테오솜 서브유닛의 발현을 증가시키는, 핵인자-κB(NF-κB)의 활성화를 통하여 단백질 분해를 증가시키게 된다. 높은 세포외 포도당 존재하에 근관을 이용한 시험관 내 연구는 PKR의 활성화가 p38MAPK의 활성화와 반응성 산소종(ROS)의 형성을 유발시킴을 보여주었다. p38MAPK는 Ser-505에서 cPLA₂를 인산화 및 활성화시켜, ROS의 공급원인, 아라키돈산의 방출을 야기시킬 수 있다. 골격근에서 p38MAPK의 과활성화가 식이 유발성 비만 모델에서 관찰되었다. 또한, 캐스파제-3 활성이 당뇨병 동물의 골격근에서 증가되는 것으로 확인되었으며, 이러한 활성은 신호전달 캐스캐이드의 일부일 수 있는데, 활성화가 일어나도록 PKR을 절단시킬 수 있기 때문이다. 이론에 국한되지 않고, 이러한 신호전달 경로를 약화시키는 ZAG의 능력은 근육 질량을 증가시키는 그 능력에 대한 설명을 제공한다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 피험체에서 골격근을 증가시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 피험체에게 투여하는 것을 포함한다.

또한, ZAG는 성체 숫컷 마우스에서 포도당 산화를 증가시키고 조직 포도당 대사율을 증가시키는 것으로 확인되었다. 이러한 포도당 이용율 증가는 ZAG 투여된 ob/ob 마우스에서 혈당과 인슐린 수치 둘 모두의 저하를 설명해 준다. 트리글리세리드 이용율도 ZAG 투여된 마우스에서 증가되어, 지방분해 증가를 의미하는, 혈장 글리세롤의 증가에도 불구하고 비에스테르화 지방산(NEFA) 및 트리글리세리드(TG) 혈장 수치 하락이 설명된다. 지질 이용율 증가는 BAT에서의 UCP1 및 UCP3, 그리고 골격근에서의 UCP3의 발현 증가에 의해 예측되는 바였고, 결과적으로 체온이 상승된다. 이와 같이, 일 구체예에서, 고혈당증과 관련된 증상의 완화는 또한, 치료 동안 약 0.5℃∼약 1℃의 체온 상승을 포함한다. 일 구체예에서, 체온 상승은 치료를 개시하고 4일 이내에 일어난다. 다른 구체예에서, 고혈당증과 관련된 증상의 완화는 또한 치료 전 췌장 인슐린 수치와 비교하여, 췌장 인슐린의 증가를 포함하는데, ZAG의 존재 결과로서 혈당을 제어하는데 인슐린이 덜 요구되기 때문이다.

따라서, ZAG는 지방분해 호르몬에 의해 유도되는 것과 유사한, GTP-의존적 프로세스로 마우스의 백색 지방세포에서 지방분해를 유도할 수 있는 지질 동원 인자로서 동정되었다. 본원에 제시하는 데이타는 래트와 인간 ZAG 간 서열 상동성이 단지 59.4%라는 사실에도 불구하고, ZAG가 래트 지방세포에서 유사한 지방분해 효과를 가지며, 또한 성숙한 숫컷 래트에서 체중과 도체 지방을 감소시킨다는 것을 보여줌으로써 이러한 발견을 뒷받침한다.

ZAG는 또한 포도당 내성 검사에서 반응성 향상 및 혈장 인슐린 수치 감소를 포함하여, 당뇨병 상태의 대사 특징 일부에 대항한다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 피험체에서 혈장 인슐린 수치를 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 피험체에게 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편의 치료 유효 용량을 투여하는 것을 포함한다. 일 구체예에서, 혈장 인슐린 감소는 치료를 개시하고 3일 이내에 일어난다. 다른 구체예에서, 치료 계획은 10일 또는 그 이상 동안 투여된다. 다른 구체예에서, 치료 계획은 21일 또는 그 이상 동안 투여된다.

또한, ZAG는 β3-아드레날린작용성 자극제의 지방분해 효과에 대한 정소상체 지방세포의 반응성을 증가시킨다. ZAG는 또한 비만 인슐린-내성 상태에서 감소되는 것으로 확인된 정소상체 지방 조직에서의 HSL 및 ATGL의 발현을 증가시킨다. HSL 및 ATGL의 발현을 조절하는 인자는 알려져 있지 않다. 그러나, 특이적 ERK 억제제인, PD98059가 ZAG에 반응하여 HSL 발현을 하향조절하여, 이러한 프로세스에서 MAPK의 역할을 시사하였다. MAPK 포스파타제-1이 결여된 마우스는 WAT에서 ERK 및 p38MAPK 활성이 증가되며, 강화된 에너지 소비에 기인하여 식이 유도성 비만에 내성이다. 이전 연구들은 골격근에서 UCP3의 ZAG 유도된 발현에 있어 MAPK의 역할을 시사하였다. ERK 활성화는 단백질 키나제 A에 의해 인산화되는 부위 중 하나인, HSL의 세린 잔기, 예컨대 Ser-600의 인산화를 통해 지방세포에서의 지방분해를 조절할 수 있다.

본원에 제시한 결과들은 래트에 ZAG 투여가 또한 래트에서 ATGL 및 HSL의 발현을 증가시킴을 보여주었다. ATGL은 비만시 초과량의 지방 저장에 중요할 수 있는데, ATGL 넉아웃 마우스는, 비록 이들이 정상적인 인슐린 감응성을 보이지만, 거대한 지방 침착물을 가지고, 이소프로테레놀에 반응하는 WAT로부터의 NEFA 방출이 감소되었기 때문이다. 대조적으로 HSL 무효 마우스는, 정규식으로 사육시, 야생형 동물과 유사한 체중을 갖는다. 하지만, ATGL 및 HSL 둘 모두의 발현은 인슐린 감응성 상태와 비교하여 비만 인슐린-내성 상태인 인간 WAT에서는 감소하였고, 체중 감량도 역시 mRNA 및 단백질 수치가 감소되었다.

이와 같이, 일 구체예에서, 고혈당증과 관련된 증상의 완화는, 또한 치료 동안 갈색 지방 조직에서 언커플링 단백질-1(UCP1) 및 언커플링 단백질-3(UCP3)의 발현 증가를 포함한다. 다른 구체예에서, 고혈당증과 관련된 증상의 완화는 또한 치료 동안 골격근에서 UCP3의 발현 증가를 포함한다.

지방분해 자극 단독은 체지방 저장물을 고갈시키지 않는데, 에너지 약화없이 방출된 NEFA가 지방세포에서 트리글리세리드로 다시 재합성되기 때문이다. 체지방을 감소시키기 위해, ZAG는 혈장 글리세롤의 증가를 통해 확인되는 바와 같이, 지방분해를 증가시킬뿐만 아니라, 트리글리세리드와 NEFA의 혈장 수치 감소에 의해 확인되는 바와 같이, 지방 이용율을 증가시킨다. ZAG로 처리된 래트에서 체온이 0.4℃ 상승되는 것으로 증명된 바와 같이, 이 에너지가 열로 전해진다. 증가된 에너지 이용율은, ZAG의 투여 후 BAT 및 WAT 둘 모두에서 확인되는, UCP1의 발현 증가로부터 유발되는 듯하다. UCP1의 발현 증가는 NEFA의 혈청 수치 감소가 예상되는데, 이들이 BAT에서의 열발생을 위한 1차적 기질이기 때문이다. BAT는 또한 포도당 이용에 대해 높은 수용능을 가지며, 이것이 부분적으로 혈당 감소를 설명해줄 수 있다. 또한, 골격근 및 WAT에서 GLUT4의 발현이 증가되었고, 이는 인슐린 존재하에 포도당 흡수 증가를 매개하는데 도움을 준다. ZAG로 처리된 마우스에서, 뇌, 심장, BAT 및 비복근에 의해 포도당 이용/산화가 증가되었고, D-[U-¹⁴C] 포도당뿐만 아니라 [¹⁴C 카르복시]트리올레인으로부터 ¹⁴CO₂ 생성이 증가되었다(도 24). 또한 ZAG 투여 이후 ob/ob 마우스의 BAT에 의한 산소 흡수가 3배 증가되었다.

ZAG가 정소상체 지방세포에서 HSL의 발현을 증가시키지만 피하나 내장 지방세포에서는 증가시키지 않았다. 유사한 상황이 지방질 트리글리세리드 리파제(ATGL)의 발현에서 관찰되었다. HSL 및 ATGL의 발현은 ERK의 활성(인산화) 형태의 발현과 상호관련된다. 정소상체 지방세포에서 HSL 및 ATGL의 발현은 β3 작용제, BRL37344에 반응하는 지방분해의 증가와 상호관련된다. 이러한 결과는 ZAG가 β3 작용제와 상승적으로 작용할 수 있음을 시사한다.

본원에서 사용되는 용어 "작용제"는 전체 또는 부분적인 약리적 반응을 유도시킬 수 있는 제제 또는 유사체를 의미한다. 예를 들어, 작용제는 수용체에 생산적으로 결합할 수 있고 그것의 생리적 반응을 모방할 수 있다. 이처럼, 본 발명의 방법은 β3 작용제 예컨대 BRL37344와 조합하여, ZAG 또는 이의 단편을 투여하는 것을 더 포함할 수 있다.

ZAG에 의한 래트 지방세포에서의 지방분해 유도는 β3-AR를 통해 매개되는 것을 시사하고, 지방 조직 및 제지방 체질량에 대한 ZAG의 영향이 또한 β3-AR을 자극하는 그 능력에 기인할 수도 있다. ZAG에 의한 UCP1 발현의 유도는 β3-AR과의 상호작용을 통해 매개되는 것으로 확인되었다. WAT에서 UCP1 발현의 증가는 또한 β3-AR 작용제 CL316,243를 이용해 일어나는 바와 같이, 갈색 지방세포 전구체의 리모델링을 통한 β3-AR의 효과일 수 있다. 넉아웃 마우스를 이용시, β3-AR 자극의 항비만 효과는 주로 BAT에서의 UCP1에 기여하였고, WAT로부터 방출되는 NEFA의 UCP1-의존적 분해를 통한 UCP2 및 UCP3에 대해서는 덜하였다. 동물의 말초 조직으로의 포도당 흡수는 저온 노출에 의해 자극되고, 효과 역시 β3-AR을 통해 매개되었다. 그러나, β3-AR의 표적화는 설치류에서보다 인간에서 더 어려운데, β3-AR가, 인간 피하 복부 지방 조직에서 영양성 혈류 및 지방분해를 제어하는데 있어 β1 및 β2-AR 아형보다 그 역할이 덜 두드러지기 때문이다. 그러나, 그럼에도 불구하고 β3-AR 작용제 CL316,243는 건강하고 젊은 남성 지원자에서 지방 산화를 증가시키는 것으로 확인되었다. 이는 BAT로부터의 원형질막에서 β3-AR의 숫자를 증가시키는 β-아드레날린작용성 작용제의 능력에 기인하는 듯하다.

최근의 결과는 지방 조직에서 ZAG 발현은, 주변분비적 방식으로 작용하여, 순환하는 ZAG보다는 국지적으로 더욱 중요할 수 있음을 시사한다. 따라서, 인간에서, 내장과 피하 지방에서의 ZAG의 mRNA 수준은 BMI, 지방 질량 및 인슐린 내성과 음성적으로 상호관련된 반면, ELISA로 측정된 혈청 수준은 지방과다의 매개변수(BMI 및 허리 둘레) 및 인슐린 내성과 양성적으로 상호관련되었다. 따라서, 비복근, WAT 및 BAT에서 그 자체의 발현을 유도하는 ZAG의 능력은 지방 분해 및 에너지 이용율을 증가시키는 능력에 핵심적일 수 있다.

이러한 결과들은 ZAG가 래트에서 지방을 동원하여 이용할 수 있는 능력에 대한 증거를 제시하여, 종 독립적 효과를 확증시켜주며, 인간에서 항비만제로서 유용할 수 있음을 시사한다. 따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 체중 감량 또는 비만 감소가 일어나도록 피험체를 치료하는 방법을 제공한다. 이 방법은 이러한 치료를 필요로하는 피험체에게 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편과 조합하여 β3 작용제의 치료 유효 용량을 투여하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 체중 감량 또는 비만 감소가 일어나도록 피험체를 치료하는 방법은 이러한 치료를 필요로하는 피험체에게 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편과 조합하여 β3-AR 길항제의 치료 유효 용량을 투여하는 것을 포함한다.

모든 방법들은 활성 성분(들)(예를 들어, ZAG 또는 ZAG의 기능성 단편)을, 1 이상의 부가 성분을 포함하는, 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 이와같이, 또한 본 발명은 고혈당증과 관련된 증상을 갖는 피험체를 치료하는데 사용하기 위한 약학 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 조성물은 활성 성분으로서, 상기 기술한 바와 같은 ZAG 또는 당단백질 지질 동원 인자, 또는 이의 지방분해 활성 단편의 치료 유효량을, 약학적으로 허용되는 담체, 희석세 또는 부형제와 함께 포함한다.

피험체에 투여하기 위해 조성물을 제제화하는데 유용한 약학적으로 허용되는 담체는 당분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들어 수용액 예컨대 물 또는 생리적 완충 염수 또는 다른 용매 또는 비히클 예컨대 글리콜, 글리세롤, 오일 예컨대 올리브유 또는 주사용 유기 에스테르 등을 포함한다. 약학적으로 허용되는 담체는, 예를 들어 접합체의 흡수를 증가시키거나 또는 안정화시키도록 작용하는 생리적으로 허용되는 화합물을 함유할 수 있다. 이러한 생리적으로 허용되는 화합물은 예를 들어, 탄수화물, 예컨대 포도당, 수크로스 또는 덱스트란, 항산화제, 예컨대 아스코르브산 또는 글루타티온, 킬레이팅제, 저분자량 단백질 또는 다른 안정화제 또는 부형제를 포함한다. 당분야의 숙련가는 생리적으로 허용되는 화합물을 포함하여, 약학적으로 허용되는 담체의 선택이, 예를 들면 치료제의 생리-화학적 특징, 및 예를 들어 경구 또는 비경구 예컨대 정맥내, 및 주사, 기관내삽입, 또는 당분야에 공지된 다른 그러한 방법일 수 있는, 조성물의 투여 경로에 따라 좌우됨을 알고 있다. 약학 조성물은 또한 제2(또는 그 이상의) 화합물(들) 예컨대 진단 시약, 영양 성분, 독소, 또는 치료제 예를 들어 암 화학치료제 및/또는 비타민(들)을 함유할 수도 있다.

경구 투여에 적합한 본 발명의 제형은, 각각 분말이나 과립 형태인 활성 성분의 사전결정된 양을 함유하는, 개별 단위 예컨대 캡슐, 샤세, 정제 또는 로젠지; 또는 수성액 또는 비수성액 중 활성 화합물의 현탁액 예컨대 시럽, 엘릭시르, 물약의 에멀션으로 존재할 수 있다.

따라서, 다른 측면에서, 본 발명은 고혈당증과 관련된 증상 및/또는 병태를 치료하기 위한 인간 의료에 유용한 의약의 제조를 위한, 본원에 정의된 바와 같은, ZAG 또는 지질 동원제의 용도를 제공한다. 그러한 의약은 또한 근육 발달 촉진 및 근육량 증가, 포도당의 혈청 수치 감소, 트리글리세리드의 혈청 수치 감소, 인슐린의 혈청 수치 감소, 비에스테르화 지방산의 혈청 수치 감소, 혈장 인슐린 수치 감소, 및/또는 췌장 인슐린 수치 증가에 유용할 수 있다.

본 발명의 방법을 실시하는데서 투여되는 화합물 또는 조성물의 총량은 비교적 짧은 기간 동안 주입에 의해 또는 볼러스로서, 단일 용량으로 피험체에게 투여될 수 있거나, 또는 장기간 동안 복수 용량을 투여하는, 분류된 치료 프로토콜을 이용하여 투여될 수 있다(예를 들어, 1일 1회, 1일 2회 등). 당분야의 숙련가는 피험체에서 고혈당증과 관련된 증상을 치료하기 위한 ZAG 또는 이의 기능성 단편의 양이 투여되는 치료제의 수 및 투여 경로와, 피험체의 연령 및 전반적인 건강을 포함한 많은 요인들에 의존적임을 알고 있다. 이러한 요인들의 관점에서, 당분야의 숙련가는 필요에 따라 특정 용량을 조정한다. 대체로, 약학 조성물의 제형 및 투여 경로와 빈도는, 초기에, I기 및 II기 임상 실험을 이용해 결정된다.

따라서, 일정 구체예에서, 본 발명의 방법은 일정간격 치료 계획(intervalled treatment regimen)을 포함한다. ob/ob 마우스에서 ZAG의 장기간 매일 투여는 체중 감량을 중지시키는 것으로 관찰되었다. 이러하여, 일 구체예에서, 치료제는 격일로 투여된다. 다른 구체예에서, 치료제는 2일마다 투여된다. 다른 구체예에서, 치료제는 3일마다 투여된다. 다른 구체예에서, 치료제는 4일마다 투여된다.

따라서, 본 발명은 ZAG의 투여를 대략 3-4일간 중단 후 재주입이 후속되는 경우에 부가의 체중 감량 및/또는 고혈당증과 관련된 증상의 완화가 일어나는 것으로 확인되었다. 이론에 한정되지 않고, 이는 너무 많이 투여된 것이거나 또는 TNF에서 확인된 바와 같은 수용체 탈감작화가 존재하기 때문인 듯하다. 각 그룹 당 2마리의 마우스를 이용한 파일럿 실험을 수행하였고 약 3주 동안 90 g 마우스가 8-10 g 체중 감량됨이 관찰되었다. 이에 따라, 비만 감소 또는 체중 감량이 관찰되기 이전에, 피험체에서 고혈당증의 증상을 완화시키기 위해 보다 적은 용량의 ZAG 또는 이의 기능성 단편을 사용할 수 있을 것으로 여겨진다.

이하 실시예를 본 발명의 장점 및 특징을 더욱 설명하기 위해 제공하지만, 본 발명의 범주를 한정시키려는 의도는 없다. 사용될 수 있는 전형적인 형태이지만, 당분야의 숙련가에게 공지된 다른 절차, 방법 또는 기술을 대안적으로 사용할 수 있다.

실시예 1

아연-α ₂ -당단백질이 고혈당증을 약화시킨다

고혈당증 및 비만을 약화시키는 아연-α₂-당단백질(ZAG)의 능력을 평가하기 위해, ob/ob 마우스에게 ZAG를 투여하였고 체중 감량이 유도되었고, 에너지 소비가 증가됨을 시사하는, 체온 상승이 유도되었다. 갈색 지방 조직에서 언커플링 단백질-1 및 언커플링 단백질-3의 발현이 증가된 한편, 지방분해 증가의 지표가 되는, 글리세롤 증가에도 불구하고, 포도당, 트리글리세리드 및 비에스테르화 지방산의 혈청 수치 감소가 존재하였다. 지방세포 및 골격근으로의 포도당 흡수율 증가와 함께 정맥내 포도당에 대한 반응성이 향상되었고 혈장 인슐린이 감소하였다. 정소상체 지방세포에서 호르몬-감응성 리파제의 발현이 증가되었다. 단백질 합성 증가 및 분해 감소로 인해 골격근 질량이 증가되었다. 이는 ZAG가 고혈당증의 치료에 효과적임을 시사한다.

둘베코의 변형 이글 배지(DMEM) 및 FreeStyle 배지를 Invitrogen(Paisley, UK)에서 구매하였고, 태아 소혈청은 Biosera(Sussex, UK)에서 구매하였다. 2-[1-¹⁴C]데옥시-D-포도당(sp.act.1.85GBq mmol^-1) 및 L-[2,6-³H]페닐알라닌(sp.act.37Bq mmol^-1)은 American Radiolabeled Chemicals(Cardiff, UK)에서 구매하였다. 인산화(Thr-202) 및 전체 ERK1, 전체 p38MAPK, 인산화 HSL(Ser-552), 포도당 트랜스포터 4(GLUT4), 지방질 트리글리세리드 리파제, 호르몬 감응성 리파제, 및 인산화 PLA₂(Ser-505) 및 인간 ATGL에 대한 토끼 다클론성 항체는 Abcam(Cambridge, UK)에서 구매하였다. 전체 길이 인간 ZAG에 대한 마우스 단일클론 항체는 Santa Cruz(California, USA)에서 구매하였고, 미오신 중쇄 II형에 대한 마우스 단일클론 항체는 Novacastra(via Leica Biosystems, Newcastle, UK)에서 구매하였다. 20S 프로테오솜 α-서브유닛 및 p42에 대한 마우스 단일클론 항체는 Affiniti Research Products(Exeter, UK)에서 구매하였다. 인산화 (Thr-180/Tyr-182) p38MAPK에 대한 마우스 단일클론 항체, 및 전체 및 인산화 (Thr-451) PKR, 인산화(Ser-162) eIF2α 및 전체 eIF2α에 대한 토끼 다클론 항혈청은 New England Biosciences(Herts, UK)에서 구매하였다. UCP1, UCP3 및 전체 PKR에 대한 다클론 토끼 항체, 및 PHOSPHOSAFE™ 추출 시약은 Calbiochem(via Merk Chemicals, Nottingham, UK)에서 구매하였다. 퍼옥시다제-접합된 염소 항토끼 및 토끼 항마우스 항체는 Dako(Cambridge, UK)에서 구매하였다. 마우스 β-액틴에 대한 다클론 토끼 항체, 및 트리글리세리드 분석 키트는 Sigma Aldrich(Dorset, UK)에서 구매하였다. Hybond A 니트로셀룰로스막 및 강화 화학발광(ECL) 발색 키트는 Amersham Pharmacia Biotech(Bucks, UK)에서 구매하였다. NEFA에 대한 WAKO 비색 분석 키트는 Alpha Laboratories(Hampshire, UK)에서 구매하였고, 마우스 인슐린 ELISA 키트는 DRG(Marburg, Germany)에서 구매하였다. 포도당 측정은 Boots(Nottingham, UK) 혈장 포도당 키트를 사용해 실시하였다.

재조합 ZAG 의 생성 - HEK293F 세포를 발현 벡터 pcDNA 3.1 중의 전체 길이 인간 ZAG cDNA로 형질감염시키고, 37℃에 공기중 5% CO₂의 대기 하에 FreeStyle 배지에서 유지시켰다. ZAG가 배지로 분비되었고, 이를 회수하였으며, 최대 단백질 수치(16 ㎍mL^-1)는 배양 14일 후에 얻어졌다. ZAG를 정제하기 위해, 배지(200 mL)를 700 g에서 15분간 원심분리하여 세포를 분리하고, 컷오프가 10 kDa인 Amicon Ultra-15 원심분리 필터를 이용해 1 mL 멸균 PBS 부피로 농축하였다. 이 농축물(약 2 mg 단백질)을 20 mL의 10 mM Tris, pH 8.8에 현탁시킨 2 g DEAE 셀룰로스에 부가하고, 2시간 동안 4℃에서 교반하였다. DEAE 셀룰로스 결합된 ZAG 및 이를 원심분리(1500 g에서 15분간)하여 침강시키고, 0.3 M NaCl을 함유하는 20 mL의 10mM Tris, pH 8.8를 사용하여 30분간 4℃에서 원심분리하여 ZAG를 용리하였다. 용리물을 세척하고 Amicon 원심분리 필터를 이용해 멸균된 PBS 중 1 mL 부피로 농축시켰다. 정제된 ZAG는 LAL Pyrogent 단일 검사 키트(Lonza, Bucks, UK)로 측정시, 내독소를 함유하지 않았다.

세포 배양 및 ZAG 의 정제 - 백색 지방세포의 단일 세포 현탁액은 이전에 기술된 바와 같이 95% 산소 : 5% CO₂의 대기 하에서 4% 소혈청 알부민 및 1.5 mgmL^-1 콜라게나제를 함유하는 Krebs-Ringer 중탄산염 완충액 중에 37℃에서 2시간 동안 배양하여 잘게 썰어진 지방질 침착물로부터 준비하였다. 시간 경과 실험을 위해, 지방세포를 10⁵ 세포 mL^-1의 농도로 10% 태아소혈청을 함유하는 DMEM에 현탁시키고, 공기중 10% CO₂의 대기 하에 37℃에서 유지시켰다. 인간 ZAG를 포함하는 플라스미드로 형질감염된 인간 293 세포를 FreeStyle 배지 중에 10⁵ 세포 mL^-1의 농도로 접종하고, 공기 중 5% CO₂의 대기 하에 37℃에서 유지시켰다. 최대 단백질 수치(16 ㎍mL^-1)는 배양 14일 후 얻어졌다. 이 배지(200 mL)를 이후 700 g에서 15분간 원심분리하여 세포를 분리하고 컷오프가 10 kDa인 Amicon Ultra-15 원심분리 필터를 이용해 멸균 PBS 1 mL의 부피로 농축시켰다. 샘플의 단백질 농도(약 2 mg)를 측정 한 후, 20 mL의 10 mM Tris, pH 8.8에 현탁된 2 g DEAE 셀룰로스에 부가하고 4℃에서 2시간 동안 교반하였다. 음으로 하전된 ZAG가 DEAE 셀룰로스에 부착되었고, 이를 원심분리(1500 g에서 15분간)로 침강시키고, 0.3 M NaCl을 함유하는 20 mL의 10mM Tris, pH 8.8을 이용해 30분간 4℃에서 교반하여 용리하였다. 상등액을 세척하고 Amicon 원심분리 필터를 이용해 멸균 PBS 중에 1 mL 부피로 농축하였다.

동물 : 마우스 - 아스톤 유니버시티에서 유지시킨 콜로니 유래의 동형접합 비만(ob/ob) 마우스를 이 실험에 사용하였다. 아스톤 ob/ob 마우스의 기원 및 특징은 이전에 기술된 바와 같다. 숫컷 마우스(20-21 주령, 체중 90-100g)를 12시간-명; 12시간-암 주기에서, 래트와 마우스 사육식(Special Diet Services, Witham, UK)과 임의량의 식수를 제공하면서 22±2℃의 에어컨이 설치된 방에서 케이지 당 3마리로 분류하였다. 이들에게 PBS(100 ㎕) 중 ZAG(35 ㎍) b.d.을 i.v. 투여하고 체중 및 사료와 식수 섭취량을 매일 모니터링하였다. 대조군 마우스는 PBS 만을 투약받았다. 체온은 매일 항문용 온도계(RS Components, Northants, UK)를 이용해 측정하였다. 모든 동물 실험은 U.K. 동물(Scientific Procedures) 법 1986에 따라 수행하였다. ZAG 투여 후 어떠한 부작용도 관찰되지 않았다.

동물 : 래트 - 체중이 540±82.5 g인 성숙한 숫컷 위스타 래트(우리 자체의 콜로니로부터 얻은 1연령)를 개별적으로 수용하고 1일 1회 i.v.로 PBS(100㎕) 중 ZAG(체중 100 g 당 50 ㎍), 또는 대조군으로서 PBS(100 ㎕)를 처리하였다. 사료와 식수 섭취량과 체중을 매일 측정하였다. 동물이 임의량으로 식수와 사료(Special Diet Services, Essex, UK)에 자유롭게 접근하도록 하였다. 이 동물 실험은 British Home Office가 부여한 사육 조건 하에 수행하였다. 처리 10일 후, 동물들을 희생시키고 체조성을 측정하였다. 일정 중량이 획득될 때까지 7일 동안 80-90℃로 동물들을 가열시켰다. 이어서, 수분 함량을 습윤 중량과 건조 중량간 편차로 결정하였다. 문헌 [Lundholm et al (14)]에 기술된 바 대로 클로로포름:메탄올(1:1), 에탄올/아세톤(1:1) 및 디에틸에테르(각각 120 mL)의 순서를 이용해 건조 사체로부터 지질을 추출하였다. 용매를 증발시키고 지방을 칭량하였다. 무지방 사체 질량은 사체의 초기 중량과, 물과 지방의 중량간 편차로서 계산하였다.

지방분해 분석 - 분석하려는 샘플을 10⁵내지 2x10⁵ 지방세포와 함께 2시간 동안 1 mL Krebs-Ringer 중탄산염 완충액, pH 7.2에서 항온반응시켰다. 방출되는 글리세롤의 농도는 Wieland(Wieland, O. Glycerol UV method. In Methods of Enzymatic Analysis (ed. Bergmeyer, H.U.) (Academic Press, London, UK, pp 1404-1409, 1974))의 방법에 따라 효소적으로 측정하였다. 지방세포만을 함유하는 대조군을 분석하여 자발적인 글리세롤 방출량을 측정하였다. 활성은 방출된 글리세롤 μmol/10⁵ 지방세포/2시간으로서 나타내었다.

혈청 대사물질 측정 - 비에스테르화 지방산(NEFA)은 Wako-ASC-ACOD 키트(Wako Chemical GmbH, Neuss, Germany)를 이용해 측정하였다. 트리글리세리드는 트리글리세리드 키트(Sigma Chemical Co., Poole, United Kingdom)로 측정하였고 3-히드록시부티레이트는 정량적 효소 측정 키트(Sigma)로 측정하였다. 포도당은 포도당 분석기(Beckman, Irvine, Calif.)를 이용해 측정하였고, 글리세롤은 ["Methods of Enzymatic Analysis"(Ed. Bergmeyer, H. U.) Vol. 3, pp1404-1409, published by Academic Press, London (1974)]에 기술된 Wieland의 방법을 이용해 효소적으로 측정하였다.

마우스 지방세포 원형질막의 단리 - 전형적인 절차에서, 백색 지방세포는 250 mM 수크로스, 2 mM 에틸렌글리콜 비스(β-아미노에틸에테르)-N,N,N',N'(EGTA), 10 mM Tris-HCl (pH 7.4)로 세포를 세척하는 것을 제외하고 상기 참조한 바와 같이 마우스 정소상체 지방대로부터 단리하였다. 지방세포를 상기 완충액 20 mL에 재현탁하고 적어도 10회 Swinny 필터를 통한 흡입에 의해 균질화시켰다. 세포 균질물을 이어 300 g에서 5분간 원심분리하고, 지방 케이크를 표면으로부터 분리해내고 나머지 펠렛과 하층물을 깨끗한 튜브로 옮겨담았다. 이들을 30,000 g에서 1시간 동안 4℃에서 원심분리하고, 형성된 막 펠렛을 수크로스 완충액(200∼400 ㎕)에 재현탁시켰다. 원형질막은 PERCOLL™ 콜로이드성 실리카 입자의 자가 형성 농도구배 상에서 다른 세포기관 막들과 분리시켰다. 성분들은 막 현탁물과 함께 32:7:1의 비율로 혼합된, 250 mM 수크로스, 2 mM EGTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4; PERCOLL™ 및 2M 수크로스, 8 mM EGTA, 80 mM Tris-HCl, pH 7.4였다(총 부피는 8 mL). 이 혼합물을 10,000 g에서 30분간 4℃에서 원심분리하였다. 0.75 mL 부분으로 구배물이 분획되었고 각 부분은 숙시네이트 디히드로게나제, NADH-사이토크롬 c 리덕타제, 락테이트 디히드로게나제 및 5'-뉴클레오티다제의 존재에 대해 분석되어 원형질막 분획의 위치를 확인하였다. 그러한 막 분획을 150 mM NaCl, 1 mM EGTA, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4에 재현탁하고 10,000 g로 4℃에서 2분간 원심분리하였다. 이 과정을 2회 반복하였다. 이후 세척한 원형질막을 10 mM Tris-HCl, pH 7.4, 250 mM 수크로스, 2 mM EGTA 및 4 μM 페닐메틸술포닐 플루오라이드(PMSF)에 1-2 mg/㎖로 희석시키고, 액체 질소에 재빨리 동결시킨 후 사용 전까지 -70℃에 보관하였다.

래트 지방세포에서 지방분해 활성 - 백색 지방세포는 문헌 [Beck SA, et al. Production of lipolytic and proteolytic factors by a murine tumor-producing cachexia in the host. Cancer Res 47:5919-5923, 1987]에 기술된 바와 같이, 콜라게나제 분해법을 이용해 숫컷 위스타 래트(400 g)의 미세하게 잘게 썰어진 정소상체 지방 조직으로부터 준비하였다. 지방분해 활성은 10⁵-2x10⁵ 지방세포를 2시간 동안 1 mL Krebs-Ringer 중탄산염 완충액, pH 7.2에서 항온반응시켜 측정하였고, 지방분해량은 방출된 글리세롤을 측정하여 결정하였다(Wieland O. Glycerol UV method. Methods of Enzymatic Analysis, edited by Bergmeyer HU. Academic Press, London, pp 1404-1409, 1974). 자발적인 글리세롤 방출은 지방세포만을 항온반응시켜 측정하였다. 지방분해 활성은 방출된 글리세롤량 μmol/10⁵ 지방세포/2시간으로 나타내었다.

겔 전기영동 - 겔은 Laemmli의 방법에 따라 제조하였으며 대체로 5% 스태킹 겔 및 15% SDS-PAGE 분해(resolving) 겔(변성 또는 환원 조건) 또는 10% SDS-PAGE 분해 겔(비변성 또는 비환원 조건)로 구성된다. 샘플을 1-5 ㎍/레인으로 충전시켰다. 밴드는 쿠마시 브릴리언트 블루 R-250 또는 은으로 염색하여 가시화하였다. 샘플을 0.0625 M Tris-HCl, pH 6.8, 10% 글리세롤, 1% SDS, 0.01% 브로모페놀 블루 및 5% 2-머캅토에탄올 중 100℃에서 5분간 가열하여 환원 조건용으로 준비하였다.

지방세포로 포도당 흡수 - 단리한 지방세포(5x10⁴)를 2회 1 mL Krebs-Ringer 중탄산염 완충액, pH 7.2(KRBS)으로 세척하고, 최종 농도 0.1 mM로 18.5MBq 2-[1-¹⁴C] 데옥시-D-포도당 및 비방사성 2-데옥시-D-포도당을 함유하는 0.5 mL KRBS 중에 실온에서 10분간 더 항온반응시켰다. 1 mL 빙냉 포도당-무함유 KRBS를 부가하여 흡수를 종결시켰고, 세포를 3회 1 mL KRBS로 세척하였고, 0.5 mL의 1 M NaOH를 부가하여 세포용해시킨 후, 1시간 이상동안 실온에 방치시키고 방사능을 액체 섬광 계측법으로 측정하였다.

비복근으로의 포도당 흡수 - 비복근을 Krebs-Henseleit 중탄산염 완충액 중에서 45분간 37℃에서 항온반응시킨 후, 최종 농도 0.1 mM로 185M Bq 2-[1-¹⁴C] 데옥시-D-포도당 및 비방사성 2-데옥시-D-포도당을 함유하는 5 mL의 Krebs-Henseleit 완충액 중에서 1분간 더 항온반응시켰다. 다음으로, 근육을 분리해내고 0.9% NaCl로 5분간 세척한 후 0.5 mL의 1M NaOH에 용해시키고 방사능을 액체 섬광 계수법으로 측정하였다.

가자미근으로의 포도당 흡수 - 가자미근을 Krebs-Henseleit 중탄산염 완충액 중에서 45분간 37℃에서 항온반응시킨 후, 최종 농도 0.1 mM로 185MBq 2-[1-¹⁴C] 데옥시-D-포도당 및 비방사성 2-데옥시-D-포도당을 함유하는 5 mL Krebs-Henseleit 완충액 중에서 10분간 더 항온반응시켰다. 이후 이 근육을 분리해 내고 0.9% NaCl로 5분간 세척한 후, 0.5 mL의 1M NaOH에 용해시키고 방사능을 액체 섬광 계측법으로 측정하였다.

근육에서의 단백질 합성 및 분해 - 근육에서 단백질 합성 및 분해를 측정하기 위한 방법은 이전에 기술된 바 있다(Smith, K.L. & Tisdale, M.J. Increased protein degradation and decreased protein synthesis in skeletal muscle during cancer cachexia. Br. J. cancer 67, 680-685 (1993)). 결찰사를 이용하여 비복근을 절제하고, O₂:CO₂(19:1)로 포화되고 페놀 레드가 없는 RPMI 중에서 30분간 37℃에서 항온반응시킨 후 PBS로 세척하였다. 37℃에서 페놀 레드가 없고 O₂:CO₂(19:1)로 포화된 RPMI/640 중에서 항온반응시키는 2시간 기간을 이용하여 산불용성 물질로의 L-[2,6-³H] 페닐알라닌(640 MBq)의 유입량을 통해 단백질 합성을 측정하였다. 다음으로 근육을 비방사성 배지로 세정하고, 블랏팅하였으며 2% 과염소산 중에서 균질화하였다. 단백질 합성율은 단백질 결합 방사능량을 산용해성 방사능량으로 나누어 계사하였다. 단백질 분해는 5 mM 포도당 및 0.5 mM 시클로헥시미드를 함유하는, 3 mL의 산소공급된 Krebs-Henseleit 완충액, pH 7.4 중에서 2시간 기간 동안 비복근으로부터의 티로신 방출량을 통해 측정하였다.

프로테오솜 및 캐스파제 활성의 측정 - 프로테오솜의 '키모트립신-유사' 활성은, 근관에 대해 이전에 기술된 바와 같이 460 nm의 발광 파장 및 360 nm의 여기 파장에서 형광발광성 기질 N-숙시닐 Lys Lys Val Tyr.AMC(서열번호 2)로부터 7-아미도-4-메틸쿠마린(AMC)의 방출량을 측정하여 형광발광적으로 측정하였다(Whitehouse, A.S. & Tisdale, M.J. Increased expression of the ubiquitin-proteasome pathway in murine myotubes by proteolysis-inducing factor (PIF) is associated with activation of the transcription factor NF-kB. Br. J. Cancer 89, 1116-1122 (2003)). 비복근을 20 mM Tris, pH 7.5, 2 mM ATP, 5 mM MgCl₂ 및 50 mM DTT 중에 4℃에서 균질화하고, 초음파처리한 후, 18,000 g에서 10분간 4℃에서 원심분리하여 불용성 물질을 펠렛화시키고, 최종 상등액을 이용하여 프로테오솜 억제제 락타시스틴(10 μM) 존재 또는 부재 하에 '키모트립신-유사' 효소 활성을 측정하였다. 락타시스틴 억제가능한 활성만을 진정한 프로테오솜 활성으로 간주하였다. 캐스파제-3의 억제제(AcAspGluValAsp-CHO)(서열번호 5) 또는 캐스파제-8의 억제제(Ile Glu Phe Thr Asp-CHO)(서열번호 6)(100 μM)존재 또는 부재하에서, 상기로부터의 상등액(50 ㎍ 단백질), 그리고 캐스파제-3 또는 캐스파제-8 기질(10 μM)을 1시간 동안 37℃에서 이용하여, 캐스파제-3의 활성은 AcAsp.Gly.Val.Asp.AMC(서열번호 3)으로부터의 AMC 방출량으로 측정하였고, 캐스파제-8의 활성은 특이적 기질 Z-Ile Glu Phe Thr Asp-AFC(서열번호 4)로부터의 7-아미노-4-트리플루오로메틸쿠마린(AFC)의 방출량을 측정하여 결정하였다. AFC에 의한 형광발광성 증가는 상기와 같이 측정하였는데, AFC에 의한 형광발광은 400 nm의 여기 파장 및 505 nm의 발광 파장을 이용해 측정하였다. 캐스파제 억제제의 존재 및 부재시 측정값의 편차가 활성의 측정치이다.

웨스턴 블랏 분석 - 새롭게 절제한 비복근을 PBS로 세척하고 5분간 실온에서 PHOSPHOSAFE™ 추출 시약으로 세포용해시킨 후 4℃에서 초음파처리하였다. 용해물을 18,000 g에서 5분간 4℃에서 원심분리하여 투명하게 한 후 세포액 단백질 샘플(5 ㎍)을 대략 1시간 동안 180 V에서 12% 나트륨 도데실 설페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분해하였다. 이후 0.45 ㎛ 니트로셀룰로스막으로 이동시키고, 4℃에서 밤새 Tris-완충된 염수, pH 7.5 중 5% Marvel로 블로킹하였다. 항미오신(1:250)을 제외하고 1차 및 2차 항체는 1:1000 희석하여 사용하였다. 실온에서 1시간 동안 항온반응시키고, ECL로 발색시켰다. 블랏을 농도계로 스캐닝하여 편차를 정량화하였다.

5일 동안 ZAG 또는 PBS로 처리한 래트로부터 절제한 정소상체 WAT, BAT 및 비복근 샘플을 0.25 M 수크로스, 1 mM HEPES, pH 7.0 및 0.2 M EDTA에서 균질화시킨 후, 10분간 4,500 rpm으로 원심분리하였다. 세포액 단백질 샘플(10 ㎍)을 12% 나트륨 도데실설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분해한 후 단백질을 0.45 ㎛ 니트로셀룰로스막으로 옮기고, 4℃에서 밤새 Tris-완충된 염수, pH 7.5 중 5% Marvel로 블로킹한 후, 15분씩 4회 PBS 중 0.1% Tween으로 세척하였고, 2차 항체와의 항온반응은 1시간 동안 실온에서 수행하였다. ECL로 발색시켰다.

통계 분석 - 결과는 3회 이상의 반복 실험의 평균 ± SEM으로 나타내었다. 그룹 간 평균값의 편차는 편차의 단측 분석(ANOVA) 후 Tukey-Kramer 다중 비교 검증법을 실시하여 결정하였다. 0.05 미만의 P 값을 유의한 것으로 간주하였다.

결과 : 마우스 - ZAG의 정제 결과 순도 95%가 넘는 생성물(도 1a)이 얻어졌고, 면역블랏을 통해 ZAG임을 확인하였다(도 1b). ZAG는 정소상체 지방세포에서 지방분해를 자극(도 1d)하였으나, 기준치보다는 유의하게 상승되었지만, 피하와 내장 침착물 유래의 지방세포에서는 지방분해 효과가 상당히 감소되었다(도 1e). 몰 기준으로 이소프레날린보다 지방분해 유도에서 ZAG가 더 강력하였지만, 임의의 지방세포 그룹에서 이소프레날린과 ZAG의 지방분해 자극 정도에는 유의한 차이가 존재하지 않았다. 5일 동안 ob/ob 마우스의 체중에 대한 ZAG의 효과를 도 1f에 도시하였다. 대조군 동물은 체중이 안정적으로 유지된 반면, ZAG를 처리한 동물은 점진적인 체중 감량을 보였으며, 그에 따라 5일 후, 실험 동안 동량의 사료(PBS 32 ± 3.1g; ZAG 30 ± 2.5g) 및 식수(PBS 140 ± 8.2 mL; ZAG 135 ± 3.2 mL) 섭취량에도 불구하고, 그룹 간에 3.5 kg의 체중 차이가 존재하였다. ZAG 투여 4일 후 0.4℃의 유의한 체온 상승(도 1g)이 존재하여, 기초 대사율 증가를 시사하였다. 혈장 대사물질 수치의 측정결과는 ZAG 처리된 동물에서 물질대사 기질 이용도 증가를 시사하였다(표 1). 따라서, 지방분해 증가의 지표가 되는 글리세롤 농도 증가에도 불구하고, 혈장의 포도당, 트리글리세리드(TG) 및 비에스테르화 지방산(NEFA) 수치가 유의하게 감소하였다. 혈장의 인슐린 수치가 36% 감소하였고, 이는 ZAG가 당뇨 상태를 감소시키는데 효과적임을 의미한다. 다양한 조직에서의 ZAG mRNA 수준을 도 1c에 도시하였다.

120시간 동안 ZAG를 처리한 ob/ob 마우스에서 혈장 대사물질 및 인슐린 수치
	PBS	ZAG
포도당 (mmol/ℓ)	24.5 + 0.4	20.3 + 0.8 p<0.01
TG (mmol/ℓ)	1.2 + 0.3	0.9 + 0.1 p<0.05
글리세롤 (μmol/ℓ)	359 + 23	429 + 36 p<0.001
인슐린 (ng/㎖)	41.2 + 0.6	26.3 + 0.52 p<0.001
BAT (g)	0.35 ± 0.09	0.73 ± 0.12 p<0.01
NEFA (mEq/ℓ)	0.6 + 0.12	0.23 + 0.05 p<0.001
가자미근 (g)	0.52 ± 0.13	0.80 ± 0.09 p<0.01
비복근 (g)	0.85 ± 0.12	1.12 ± 0.14 p<0.01
인슐린 췌장 (pg /g 췌장)	4.52 ± 2.91	16.3 ± 3.1 p=0.0042

이를 조사하기 위해, ZAG 투여 3일 후, 사육 동물에 대해, 포도당 내성 검사를 수행하였다(도 2a). 백혈구 포도당 수치는 PBS 대조군에서 유의하게 상승된 반면, ZAG 처리 동물에서는 단지 소량의 상승만이 존재하였고, 실험 전반에서 대조군보다 유의하게 낮게 유지되었다. 또한, 혈장의 인슐린 수치는 실험 시작시 ZAG 처리된 동물에서 유의하게 더 낮았고 60분간의 관찰 동안에도 그렇게 유지되었다(도 2b). ZAG 투여로 인슐린 부재하에 정소상체, 내장 및 피하 지방세포로의 포도당 흡수율이 증가되었고, 또한 낮은(1 nM) 인슐린 존재하에서도 정소상체 및 내장 지방세포로의 포도당 흡수율이 증가되었다(도 2c). 비복근으로의 포도당 흡수율도 역시 인슐린 부재 및 존재(100 nM) 둘 모두에서, ZAG 처리된 동물에서 유의하게 강화되었다(도 2d). ZAG 처리된 마우스의 비복근으로의 포도당 흡수율은 미처리된 동물에서 인슐린에 반응하는 것보다 높았다.

ZAG 투여는 또한 골격근 위축시 고혈당증의 효과를 약화시켰다. 따라서, ZAG 처리된 ob/ob 마우스는 비복근과 가자미근 둘 모두의 습윤 중량이 유의하게 증가된 것으로 나타났다(표 1). 이는 가자미근에서 단백질 합성의 2배 이상 증가(도 3a), 및 단백질 분해의 60% 감소(도 3b)와 관련있다. ZAG로 처리된 마우스 유래의 비복근은 프로테오솜 '키모트립신-유사' 효소 활성이 감소된 것으로 나타났고(도 3c), 이러한 결과는 비비만 마우스에서 확인되는 것과 유의하게 다르지 않았으며, 20S 프로테오솜 α-서브유닛(도 3d), 및 19S 조절인자의 ATPase 서브유닛, p42(도 3e) 둘 모두의 감소는, 유비퀴틴-프로테오솜 경로의 활성 감소를 시사한다. 미오신 수준은 ZAG 처리된 마우스에서 증가(도 3f)된 반면, 액틴 수준은 변화하지 않았다(도 3g). 또한, 높은 세포외 포도당 수치, 및 종양 이화 인자가 유도하는 근육 위축의 원인인 것으로 확인된, dsRNA-의존적 단백질 키나제(PKR)(도 4a) 및 진핵생물 개시 인자 2α(eIF2α)(도 4b)의 인산화된 형태의 수준이 감소된 것으로 확인되었다. 포스포리파제 A₂(PLA₂)(도 4c), p38 미토겐 활성화된 단백질 키나제(도 4d) 및 캐스파제-3 및 캐스파제-8을 포함하는 이 경로의 다른 효소들(도 4e)도 역시 ZAG 처리한 ob/ob 마우스의 비복근에서 약화되었다. 이러한 변화들은 ZAG에 반응하는 근육 내 이화 신호전달의 감소와 상응하는 것이다.

ZAG는 세포외 신호-조절 키나제(ERK) 억제제 PD98059¹⁴에 의해 완전히 약화되는 지방세포에서의 인산화 HSL의 발현을 증가시켰지만, 이소프레날은 그러하지 않았다. ZAG가 정소상체 지방세포에서 HSL의 발현은 증가시켰지만, 피하 또는 내장 지방세포에서는 증가시키지 않았다(도 5b-5d). 유사한 상황이 지방질 트리글리세리드 리파제(ATGL)의 발현에서 관찰되었다(도 5e-5g). HSL 및 ATGL의 발현은 ERK의 활성(인산화) 형태의 발현과 상호관련있었다(도 5h-5j). 정소상체 지방세포에서 HSL 및 ATGL의 발현은 β3 작용제, BRL37344에 대한 지방분해 반응 증가와 상호관련있었다(도 5k). 이러한 결과는 ZAG가 β3 작용제와 상승적으로 작용함을 시사한다.

앞서 보고된 바와 같이, ZAG 투여는 지방 조직에서 그 발현을 증가시켰다(도 6a). ZAG 발현은, ZAG 부재하에 조직 배양시 추가 3일 동안 상승된 상태로 유지되었다(도 6b). HSL의 발현도 ZAG 부재하에 조직 배양시 3일 동안 지방세포에서 상승되었다(도 6c). ZAG의 투여는 BAT(도 6d)에서 UCP1(도 6d) 및 UCP3(도 6e)의 발현, 그리고 골격근에서 UCP3의 발현(도 6f)을 증가시켰다. 언커플링 단백질의 발현 증가는 관찰된 바와 같이 물질대사 기질을 열로 전환시킬 것으로 예상된다(도 1g).

21일 이후, ob/ob 마우스에서 혈장 대사물질의 수치를, 표 3에 나타낸 매개변수들을 모니터링하면서 관찰하였다(표 2). 추가적인 혈당 강하(2.03 mM에서 15.2 mM) 및 글리세롤 상승이 관찰되었는데, 이러한 결과는 대조군이 이전보다 더 낮기 때문에 보다 큰 듯하다. 5일과 비교하여, 21일에 NEFA, TG 또는 인슐린은 변화가 관찰되지 않았다(표 1). 혈장 인슐린이 강하된 것으로 나타난 ZAG 처리 동물의 췌장에 인슐린이 더 많이 존재하는데, 이는 낮은 인슐린 생성(예를 들어, 췌장 베타 세포에 대한 독소에 의해 일어나는 바와 같이)에 기인한 것이 아니라, ZAG 처리 동물에서 혈당을 제어하는데 인슐린이 덜 필요하다는 사실에 기인하는 것임을 주의한다.

21일에 ZAG 처리된 ob/ob 마우스에서 혈장의 대사물질 및 인슐린 수치
	PBS	ZAG
포도당 (mmol/ℓ)	24.1 ± 2.3	15.2 ± 2.1	p=0.0085
NEFA(mEq/ℓ)	0.62 ± 0.008	0.22 ± 0.06	p=0.0025
글리세롤	290 ± 25.2	450 ± 36.2	p=0.0058
트리글리세리드 (mmol/ℓ)	1.72 ± 0.05	0.89 ± 0.08	p=0.0072
인슐린 (ng/㎖)	39.5 ± 0.96	28.5 ± 0.34	p=0.0056
인슐린 췌장 (pg/g 췌장)	6.2 ± 3.2	14.5 ± 2.5	p=0.0035

21일에 ZAG 처리된 ob/ob 마우스에서 모니터링한 매개변수
매개변수	PBS	ZAG	p
시작 체중	92.5 ± 3.1	93.1 ± 1.9
최종 체중	89.9 ± 1.3	83.95 ± 2.2
사료 (g)	135 ± 6	145 ± 4
식수 (ml)	268 ± 15	259 ± 20
BAT (g)	0.36 ± 0.21	0.41 ± 0.35
비복근 (g)	0.26 ± 0.15	0.39 ± 0.12	0.01
가자미근 (g)	0.15 ± 0.06	0.18 ± 0.07

또한, ob/ob 마우스의 체온은 4일 이내에 0.5℃ 내지 1℃(도 1g) 승온하였고, 최대 체중량을 잃기 직전에 38.1℃의 피크에 도달하였다(도 7). 이는 대조군에서 0.33±0.12 g로부터 ZAG 처리 동물에서 0.52±0.08 g으로 증가된 갈색 지방 조직의 중량과 상관관계가 있는 것이다(도 7). 비복근의 중량이 또한 0.2±0.05 g에서 0.7±0.1 g으로 증가하였고, 뇨당 배출이 점진적으로 감소하였다(도 8a 및 8b).

결과 : 래트 - 이소프레날린과 비교한, 래트 정소상체 지방세포에 대한 인간 ZAG의 지방분해 효과를 도 11에 도시하였다. 233 내지 700 nM의 농도에서, ZAG는 글릴세롤 방출에 대해 용량 관련된 증가를 일으켰고, 이는 항-ZAG 단일클론 항체에 의해 약화되어, 그 작용의 특이성을 보여주었다. 래트 지방세포에서 지방분해 정도는 마우스에서 이전에 보고된 바와 유사하였다. 마우스에서처럼, ZAG의 지방분해 효과는 β3-아드레날린작용성 수용체(β3-AR) 길항제, SR59230A에 의해 완전하게 약화되어, ZAG의 작용이 β3-AR을 통해 매개됨을 시사하였다. 이러한 결과들은 ZAG가 래트에서 지방 손실을 유도하는데 효과적일 수 있음을 의미한다.

성숙한 숫컷 위스타 래트(540±83 g)의 체중에 대한 ZAG(50 ㎍/100g b.w.)의 매일 단회 i.v. 주사 효과를 도 12a에 도시하였다. 동량의 용매(PBS)를 투여한 대조군 래트와 비교하여, ZAG를 투여한 래트는 점진적인 체중 감소를 보였는데, 그에 따라 10일 후, PBS 처리한 래트는 체중이 13 g 증량된 것으로 나타난 반면, ZAG를 처리한 동물은 체중이 5 g 감량된 것으로 나타났다(표 4). 실험 기간 동안 2 그룹 간 사료(ZAG: 102±32 g; PBS:98±25 g) 또는 식수(ZAG: 135±5 mL; PBS: 125±5 mL) 섭취량에는 차이가 없었지만, ZAG-처리 동물은 체온이 일관되게 0.4℃ 승온한 것으로 나타났는데, 이는 ZAG를 처음 투여한 24시간 내에 현저하였고(도 12b), 에너지 소비 증가를 의미하는 것이다. 체조성 분석 결과(표 4)는 ZAG에 의해 유도된 체중 감량이 사체 지방의 손실에 기인하는 것이고, 이는 부분적으로 제지방 체질량의 상당한 증가로 상쇄되었음을 보여주었다. ZAG 처리한 래트에서, 지방분해 증가를 의미하는, 혈장의 글리세롤 농도가 50% 증가되었지만(표 5), 비에스테르화 지방산(NEFA)의 혈장 수치가 55% 감소되어, 이용율이 증가되었음을 시사하였다. 포도당과 트리글리세리드의 혈장 수치가 또한 36-37% 감소되어(표 5), 활용도 증가를 또한 시사하였다. 10일 동안 ZAG로 처리된 래트의 정소상체 지방세포로 2-데옥시포도당의 흡수율이 상당히 증가하였고, 이는 인슐린 존재하에 증가하였다(도 12c). 그러나, 인슐린 존재 하에 ZAG 처리 또는 PBS 처리 동물간 지방세포로의 포도당 흡수율에는 유의한 차이가 존재하지 않았다(도 12c). PBS 대조군과 비교하여 ZAG 처리한 래트의 비복근 및 BAT로의 포도당 흡수율은 적게, 유의하지 않게 증가되었지만, 인슐린 존재하에 흡수율은 상당히 증가하였다(도 12d). 이러한 결과들은 혈당 감소가 BAT, WAT 및 골격근에 의한 이용율 증가에 기인하는 것임을 의미하고, 모든 3 조직에서 포도당 트랜스포터 4(GLUT4)의 발현 증가로 뒷받침된다(도 13).

PBS 또는 ZAG 처리 후 숫컷 래트의 체조성
처리	시작 체중 (g)	최종 체중 (g)	체중 변화량 (g)	수분		지방		지방외
처리	시작 체중 (g)	최종 체중 (g)	체중 변화량 (g)	(g)	(%)	(g)	(%)	(g)	(%)
PBS	510±30	523±2	+13±3	326±32	62±2	105±14	20±3	90±6	17±3
ZAG	530±45	525±1	-5±1	331±5	63±3	92±5^b	18±1	96±2^a	18±2
PBS 처리한 동물과의 편차는 a, p<0.05 또는 b, p<0.01로 표시함

10일 동안 PBS 또는 ZAG를 처리한 래트에서 대사물질 및 인슐린의 혈장 수치
대사물질	PBS	ZAG
포도당 (mmol/ℓ)	25.5±2.3	16.2±2.1^c
트리글리세리드 (mmol/ℓ)	1.75±0.01	1.1±0.09^a
글리세롤 (umol/ℓ)	300±52	450±51^c
NEFA (mEq/ℓ)	0.58±0.008	0.26±0.06^b
PBS로 처리한 동물과의 편차는 a, p<0.05; b, p<0.01 또는 c, p<0.001로 표시함

ZAG 투여는 거의 2배 만큼 BAT 및 WAT 둘 모두에서 언커플링 단백질(UCP)-1 및 -3의 발현을 증가시켰고, 이는 기질 이용율 증가에 기여한다. ZAG로 처리한 래트에서, 또한, 지방분해 효소의 발현이 증가하는데, 정소상체 지방 조직에서 지방질 트리글리세리드 리파제(ATGL) 및 호르몬 감응성 리파제가 역시 2배 증가하였다(도 15). ATGL는 디아실글리세롤이 형성되는, 트리아실글리세롤 분자의 첫번째 에스테르 결합의 가수분해를 주로 담당하고, 모노아실글리세롤로의 전환은 HSL가 수행한다. ZAG의 발현은 또한 10일 간 ZAG 처리된 래트의 골격근(도 16a), WAT(도 16b) 및 BAT(도 16c)에서 상당히 증가하여, 외생성 ZAG가 말초 조직에서 그 자신의 생성을 증강시킴을 보여주었다.

ZAG 투여한 래트의 비복근의 α-서브유닛에서 dsRNA-의존적 단백질 키나제(PKR) 및 진행생물 개시 인자 2(eIF2) 둘 모두의 인산화 형태의 발현이 상당히 감소하였지만, 전체량은 변하지 않았다(도 17a 및 17b). 유사한 변화가 ZAG 투여된 ob/ob 마우스에서 관찰된 적이 있었고(미공개 결과), 골격근에서의 단백질 합성 증가 및 단백질 분해의 억제와 일관되었다.

실시예 2

아연-α ₂ -당단백질의 일정간격 투여

ob/ob 마우스에서 ZAG의 장기간 매일 투여는 체중 감량을 중지시켰다. 그에 따라, 3-4일의 휴약기 이후 ZAG의 재주입이 지속적으로 체중을 감량시키고 고혈당증과 관련된 증상을 완화시키는지 확인하였다.

일정 이론에 국한시키지 않고, 피험체가 ZAG를 너무 많이 투약받았거나 또는 TNF에서 보이는 바와 같은 수용체 탈감작화이 있을 수 있다. ZAG 전달의 최적 일정계획을 정하기 위해 각 그룹 당 2 마리 마우스를 이용해 파일럿 실험을 수행하였다. 약 3주간 90 g 마우스가 8-10 g 체중 감량됨이 관찰되었다.

ZAG 투여 5일 이후 마우스로부터 지방세포를 제거해내고 이소프레날린(iso)에 대한 그들의 반응도를 ZAG 부재하에 배양 후 측정하였다(도 9). iso에 대한 반응도는 ZAG 처리된 마우스에서 더 높았고, 이는 추가 4일간 지속되었으며(ZAG 및 HSL의 발현이 증가되었을 때임), 이후 5일(발현이 증가되지 않았을 때)에 PBS 대조군 수치로 떨어졌다.

실시예 3

아연-α ₂ -당단백질이 ob / ob 마우스에서 근육 위축을 약화시킨다

이 실시예는 새롭게 개발된 시험관 내 모델(Russell et al, Exp. Cell Res. 315, 16-25, 2009)을 이용하여 ob/ob 마우스에서 ZAG가 근육 위축을 약화시키는 기전을 확인하였다. 이는 포도당 농도가 높은(10 또는 25 mM) 마우스 근관을 이용한다. 도 18에 도시한 바와 같이, 높은 포도당은 단백질 분해의 증가를 자극하고(도 18a), 단백질 합성을 억제하였으며(도 18b), 이러한 효과 둘 모두는 ZAG(25 ㎍/㎖)에 의해 완전히 약화되었다. 따라서, 길항제 SR59230A를 이용하여 ZAG의 효과가 β3-AR을 통해 매개되는지 확인하였다. 그러나, SR 화합물(즉, SR59230A)이 또한 β-작용제로서 작용할 수 있고, 이들 실험에서 그러할 것으로 보인다. 따라서, 10 및 25 mM 포도당 둘 모두에 의해 유도된 단배질 분해는 ZAG와 SR 화합물에 의해 약독화되었고, 이러한 조합은 길항적이기보다는 부가적이었다(도 19). 단백질 합성(도 20)의 경우, SR 화합물은 어떠한 반대 증거없이 ZAG와 유사한 것으로 보였고, 반면 10 mM 포도당을 사용시, SR 화합물은 단백질 합성 억제가 증가되게 하였다.

실시예 4

아연-α ₂ -당단백질은 ROS 형성을 약화시킨다

반응성 산소종(ROS)의 형성은 높은 당부하에 의해 유도된 단백질 분해에서 중요한 것으로 확인되었다. 도 21의 데이타는 ZAG가 포도당에 의해 생성되는 ROS의 증가를 완전하게 약화시키는 것을 보여주어, 단백질 분해의 감소와 상응하였다(도 18a). 고포도당은, ZAG에 의해 역시 약화되었던, ob/ob 마우스의 골격근에서 확인된 바와 같이, PKR의 활성화(인산화)(도 22a)와 eIF2α(도 22b)의 후속 인산화를 또한 유도하였다. 이들 결과는 이러한 시험관내 모델이 분자수준에서 ZAG가 어떻게 근육 질량에 영향을 미치는지 연구하는데 유용하다는 것을 시사한다.

실시예 5

아연-α2-당단백질은 인슐린 내성을 증가시킨다

인슐린 내성 검사를 또한 3일간 ZAG 투여된 ob/ob 마우스에서 수행하였다(도 23). 동물에게 2 용량의 인슐린(10 및 20 U/kg)을 i.p. 주사로 투여하고 이후 60분간 혈당을 측정하였다. 확인할 수 있는 바와 같이(도 23a), ZAG 처리된 동물은 PBS를 투여한 동물보다 인슐린(10 U/kg)에 대한 감응성이 증가된 것으로 나타났다. 더 높은 인슐린 농도(20 U/kg)에서, 이러한 차이는 사라졌다(도 23b). 20 U/kg + PBS에 대한 포도당 소실 그래프는 10 U/kg + ZAG에 대한 것과 거의 동일하였고, 따라서 이러한 용량 수준에서, ZAG는 인슐린 요구도를 50% 만큼 감소시키지만, 더많은 인슐린을 제공하여 극복할 수 있다.

실시예 6

아연-α ₂ -당단백질의 5일 투여

첨부 1에 도시한 데이타는 ZAG를 5일 동안 하루 기준으로 1일당 35 ㎍을 i.v. 투여한 5일 실험으로 얻은 것이다. 실험 종결시, 조직을 분리해내고 블랏팅하거나, 또는 단리된 지방세포를 이용해 기능 분석을 실시하였다. 도 6a에 도시한 바와 같이, ZAG 투여는 정소상체(ep), 피하(sc) 및 내장(vis) 지방에서 약 2배 그 발현을 증가시켰다. ep 지방세포를 준비하고 조직 배양(RPMI 1640 +10% FCS)으로 유지시, ZAG 발현은, 배양 배지에 ZAG를 부가하지 않더라도, 추가 3일 동안 유지되었다(도 6b). 또한, ZAG 처리한 마우스 유래의 지방세포는 이소프레날린(10 μM)에 대한 반응이 증가된 것으로 나타났고, 이 역시 ZAG 부재하의 조직 배양에서 4일간 유지되었다(도 9). 이소프레날린에 대한 반응 증가는 ZAG에 의한 HSL의 발현 증가에 기인하는 것이고, 역시 ZAG 부재 하에 4일간 조직 배양에서 유지되었다(도 6c). 이러한 결과는 ZAG의 효과는, ZAG를 뺀 경우에도 추가 3일간 유지되며 따라서 1일 기준으로 투여할 필요가 없음을 보여주는 것이다. 사실, 상기 기술한 바와 같이, 너무 많은 ZAG는 반응을 증가시키기보다는 내성을 일으킬 수 있다.

HSL의 발현 증가는 ZAG 처리 5일후 ep 지방세포에서만 확인되었고(도 5b-5d), ATGL(도 5e-5g)도 동일하다. ep 지방 조직에서만 pERK의 발현이 증가되었고(도 5h-5j), pERK의 억제제(PD98059 10μM)는 3시간 동안 ZAG와 항온반응시킨 ep 지방세포에서 HSL의 발현 증가를 약화시켰다(도 5a). ZAG는 BAT(도 6d 및 6e) 및 근육(도 6f)에서 UCP1와 UCP3의 발현을 증가시켰으며, 지방분해 증가에도 불구하고 혈청에서 TG 및 NEFA의 감소 그리고 체온 증가를 설명해 준다.

본 발명은 상기 실시예들을 참조하여 설명하였지만, 이의 변형 및 변화가 본 발명의 사조 및 범주에 포함됨을 이해할 것이다. 따라서, 본 발명은 이하의 청구항에 의해서만 제한된다.

SEQUENCE LISTING <110> ASTON UNIVERSITY TISDALE, Michael J. RUSSELL, Steve <120> GLYCOPROTEINS HAVING LIPID MOBILIZING PROPERTIES AND THERAPEUTIC USES THEREOF <130> HALSA1120-2KR <150> PCT/IB/2009/007373 <151> 2009-11-07 <150> US 61/253,023 <151> 2009-10-19 <150> US 61/112,623 <151> 2008-11-07 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 276 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Gln Glu Asn Gln Asp Gly Arg Tyr Ser Leu Thr Tyr Ile Tyr Thr Gly 1 5 10 15 Leu Ser Lys His Val Glu Asp Val Pro Ala Phe Gln Ala Leu Gly Ser 20 25 30 Leu Asn Asp Leu Gln Phe Phe Arg Tyr Asn Ser Lys Asp Arg Lys Ser 35 40 45 Gln Pro Met Gly Leu Trp Arg Gln Val Glu Gly Met Glu Asp Trp Lys 50 55 60 Glu Asp Ser Gln Leu Gln Lys Ala Arg Glu Asp Met Glu Thr Leu Lys 65 70 75 80 Asp Ile Val Glu Tyr Tyr Asn Asp Ser Asn Gly Ser His Val Leu Gln 85 90 95 Gly Arg Phe Gly Cys Glu Ile Glu Asn Asn Arg Ser Ser Gly Ala Phe 100 105 110 Trp Lys Tyr Tyr Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr Ile Glu Phe Asn Lys Glu 115 120 125 Ile Pro Ala Trp Val Pro Phe Asp Pro Ala Ala Gln Ile Thr Lys Gln 130 135 140 Lys Trp Glu Ala Glu Pro Val Tyr Val Gln Arg Ala Lys Ala Tyr Leu 145 150 155 160 Glu Glu Glu Cys Pro Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Leu Lys Tyr Ser Lys 165 170 175 Asn Ile Leu Asp Arg Gln Asp Pro Pro Ser Val Val Val Thr Ser His 180 185 190 Gln Ala Pro Gly Glu Lys Lys Lys Leu Lys Cys Leu Ala Tyr Asp Phe 195 200 205 Tyr Pro Gly Lys Ile Asp Val His Trp Thr Arg Ala Gly Gln Val Gln 210 215 220 Glu Pro Glu Leu Arg Gly Asp Val Leu His Asn Gly Asn Gly Thr Tyr 225 230 235 240 Gln Ser Trp Val Val Val Ala Val Pro Pro Gln Asp Thr Ala Pro Tyr 245 250 255 Ser Cys His Val Gln His Ser Ser Leu Ala Gln Pro Leu Val Val Pro 260 265 270 Trp Glu Ala Ser 275 <210> 2 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 2 Lys Lys Val Tyr 1 <210> 3 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 3 Asp Gly Val Asp 1 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 4 Ile Glu Phe Thr Asp 1 5 <210> 5 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 5 Asp Glu Val Asp 1 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Synthetic construct <400> 6 Ile Glu Phe Thr Asp 1 5

Claims

피험체에서 고혈당증의 증상을 완화시키는 방법으로서, 이러한 치료를 필요로하는 피험체에게 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편의 치료 유효 용량을 약 10일 또는 그 이상의 기간 동안 투여하는 것을 포함하고, 이러한 치료 이후 고혈당증과 관련된 증상이 완화되는 것인 치료 방법.
제1항에 있어서, 치료는 10일 동안 폴리펩티드의 매일 투여를 포함하는 것인 치료 방법.
제1항에 있어서, 치료는 21일 동안 폴리펩티드의 매일 투여를 포함하는 것인 치료 방법.
제1항에 있어서, 폴리펩티드는 최대 21일 동안 격일로, 2일 마다 또는 3일 마다 투여되는 것인 치료 방법.
제1항에 있어서, 증상의 완화는 치료 전의 혈청 수치와 비교하여, 포도당의 혈청 수치 감소, 트리글리세리드의 혈청 수지 감소, 인슐린의 혈청 수치 감소, 비에스테르화 지방산의 혈청 수치 감소로 이루어진 군에서 선택된 1 이상의 증상을 포함하는 것인 치료 방법.
제1항에 있어서, 증상의 완화는 치료 전의 체온과 비교하여, 치료 개시 4일 이내에 약 0.4℃∼1℃의 체온 증가를 포함하는 것인 치료 방법.
제1항에 있어서, 증상의 완화는 치료 전의 혈장 인슐린 수치와 비교하여, 치료 개시 3일 이내에 혈장 인슐린 수치의 감소를 포함하는 것인 치료 방법.
제7항에 있어서, 치료 전의 혈장 인슐린 수치와 비교하여, 혈장 인슐린 수치가 36% 감소하는 것인 치료 방법.
제7항에 있어서, 치료 전의 혈장 포도당 및 트리글리세리드 수치와 비교하여, 혈장 포도당 및 트리글리세리드 수치가 약 36% 감소하는 것인 치료 방법.
제1항에 있어서, 증상의 완화는 치료 개시 3일 이내에 정맥내 포도당(2 g/kg)에 반응하는 인슐린 분비 및 혈당 수치의 정상화를 포함하는 것인 치료 방법.
제1항에 있어서, 증상의 완화는 치료 전 췌장 인슐린 수치와 비교하여, 췌장 인슐린 수치의 증가를 포함하는 것인 치료 방법.
제1항에 있어서, 증상의 완화는 치료 전 언커플링 단백질-1(UCP1) 및 언커플링 단백질-3(UCP3)의 발현과 비교하여, 갈색 지방 조직에서 UCP1 및 UCP3의 발현 증가를 포함하는 것인 치료 방법.
제1항에 있어서, 증상의 완화는 치료 전 UCP3의 발현과 비교하여, 골격근에서 UCP3의 발현 증가를 포함하는 것인 치료 방법.
제1항에 있어서, 폴리펩티드는 1일 2회 투여되는 것인 치료 방법.
제1항에 있어서, 폴리펩티드는 정맥내, 피하, 복강내, 또는 경구 투여되는 것인 치료 방법.
제1항에 있어서, 폴리펩티드는 3일 마다 1회 투여되는 것인 치료 방법.
제1항에 있어서, 폴리펩티드는 β3 작용제와 조합되어 투여되는 것인 치료 방법.
제17항에 있어서, β3 작용제는 BRL37344인 치료 방법.
제1항에 있어서, 폴리펩티드는 β3-아드레날린작용성 수용체(β3-AR) 길항제와 조합되어 투여되는 것인 치료 방법.
제19항에 있어서, β3-AR 길항제는 SR59230A인 치료 방법.
제1항에 있어서, 폴리펩티드는 글리코실화되는 것인 치료 방법.
피험체에서 혈장 인슐린 수치를 감소시키는 방법으로서, 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편의 치료 유효 용량을 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 감소 방법.
제22항에 있어서, 폴리펩티드는 최대 10일의 기간 동안 피험체에게 투여되고, 치료 후에 혈장 인슐린 수치가 감소되는 것인 감소 방법.
제22항에 있어서, 폴리펩티드는 최대 21일의 기간 동안 피험체에게 투여되고, 치료 후 혈장 인슐린 수치가 감소되는 것인 감소 방법.
제22항에 있어서, 혈장 인슐린 수치의 감소는 폴리펩티드 투여 3일 이내에 일어나는 것인 감소 방법.
제24항에 있어서, 폴리펩티드 투여 전 혈장 인슐린 수치와 비교하여, 혈장 인슐린 수치가 36% 감소되는 것인 감소 방법.
제24항에 있어서, 폴리펩티드 투여 전 혈장 포도당 및 트리글리세리드 수치와 비교하여, 혈장 포도당 및 트리글리세리드 수치가 36% 감소되는 것인 감소 방법.
제22항에 있어서, 폴리펩티드는 β3 작용제와 조합되어 투여되는 것인 감소 방법.
제28항에 있어서, β3 작용제는 BRL37344인 감소 방법.
제22항에 있어서, 폴리펩티드는 β3-아드레날린작용성 수용체(β3-AR) 길항제와 조합되어 투여되는 것인 감소 방법
제30항에 있어서, β3-AR 길항제는 SR59230A인 감소 방법.
제22항에 있어서, 폴리펩티드는 글리코실화되는 것인 감소 방법.
피험체에서 골격근 질량을 증가시키는 방법으로서, 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편을 상기 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 증가 방법.
제33항에 있어서, 골격근은 비복근 또는 가자미근인 증가 방법.
제33항에 있어서, 폴리펩티드는 최대 10일의 기간 동안 피험체에게 투여되고, 치료 후 골격근 질량이 증가되는 것인 증가 방법.
제33항에 있어서, 폴리펩티드는 최대 21일의 기간 동안 피험체에게 투여되고, 치료 후 골격근 질량이 증가되는 것인 증가 방법.
제33항에 있어서, 폴리펩티드는 β3 작용제와 조합되어 투여되는 것인 증가 방법.
제37항에 있어서, β3 작용제는 BRL37344인 증가 방법.
제33항에 있어서, 폴리펩티드는 β3-아드레날린작용성 수용체(β3-AR) 길항제와 조합되어 투여되는 것인 증가 방법.
제39항에 있어서, β3-AR 길항제는 SR59230A인 증가 방법.
제33항에 있어서, 폴리펩티드는 글리코실화되는 것인 증가 방법.
제33항에 있어서, 피험체는 암, AIDS, 패혈증, COPD, 신부전증, 관절염, 울혈성 심부전증, 근이영양증, 당뇨병, 또는 노화에 의한 근육감소증을 갖는 것인 증가 방법.
체중 감량 또는 비만 감소가 일어나도록 피험체를 치료하는 방법으로서, 이러한 치료를 필요로하는 피험체에게 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편과 조합하여 β3 작용제의 치료 유효 용량을 투여하는 것은 포함하는 치료 방법.
제43항에 있어서, β3 작용제는 BRL37344인 치료 방법.
제43항에 있어서, 폴리펩티드는 글리코실화되는 것인 치료 방법.
체중 감량 또는 비만 감소가 일어나도록 피험체를 치료하는 방법으로서, 이러한 치료를 필요로하는 피험체에게 서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 단편과 조합하여 β3-아드레날린작용성 수용체(β3-AR) 길항제의 치료 유효 용량을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법.
제46항에 있어서, β3-AR 길항제는 SR59230A인 치료 방법.
제46항에 있어서, 폴리펩티드는 글리코실화되는 것인 치료 방법.
서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 및 β3 작용제를 포함하는 약학 조성물.
서열번호 1에 나타낸 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드 및 β3-아드레날린작용성 수용체(β3-AR) 길항제를 포함하는 약학 조성물.