CN102271701A - 具有脂类动员性质的糖蛋白及其治疗用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供通过给予Zn-α2-糖蛋白或其功能片段改善与高血糖相关的症状的组合物和方法，提供降低血浆胰岛素水平的方法、增加骨骼肌质量的方法以及引起体重减少或肥胖减少的方法。还提供使用其的药物组合物。

Description

具有脂类动员性质的糖蛋白及其治疗用途
发明背景
发明领域
本发明总体上涉及高血糖和肥胖的药物和治疗，更特别地，涉及改善与高血糖有关的症状的组合物和方法。
背景信息
糖尿病的特征是受损的葡萄糖代谢，该葡萄糖代谢通过糖尿病患者中升高的血糖水平使其在其它的事物中显现出来。潜在的缺陷导致糖尿病分为两大类。1型糖尿病或胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)当患者胰腺中缺少产生胰岛素的β细胞时发生。2型糖尿病或非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)发生在具有受损的β细胞功能和胰岛素作用改变的患者中。
1型和2型糖尿病都与骨骼肌质量损失有关，骨骼肌质量损失已被归因于通过泛素-蛋白酶体途径增加的活性引起的肌纤维蛋白的降解。尽管这在1型糖尿病中特别普遍，但是它部分地仅由胰岛素缺乏解释，而db/db小鼠中的实验研究显示胰岛素抵抗引起肌肉萎缩。
骨骼肌丧失发生在小鼠严重低胰岛素血症(链脲菌素诱导的)和严重胰岛素抵抗(ob/ob)糖尿病的模型中。糖尿病中的肌肉蛋白丧失与骨骼肌中蛋白质合成的抑制和蛋白质降解的增加相关。蛋白质降解的增加与胱天蛋白酶-3和蛋白酶体的增加的活性相关。
肥胖与胰岛素抵抗和2型糖尿病相关。在肥胖中的脂肪细胞中观察到受损的儿茶酚胺诱导的脂解作用和减少的激素敏感性脂肪酶(HSL)表达，人们已提出这促成增加的脂肪组织储存物的发展和维持。相反，来自恶病质的(cachexic)受试者的脂肪细胞显示对HSL的增加表达的脂肪分解反应的两到三倍增加。
锌-α2-糖蛋白(ZAG)已被鉴定为脂类动员因子(LMF)，其具有引起癌症恶病质(cancer cacehxia)中脂肪丧失的潜能。显示ZAG在白色脂肪细胞中通过与β3肾上腺素能受体相互作用而引起脂解作用，而在体内它在棕色脂肪组织(BAT)中增加解偶联蛋白1(UCP-1)的表达，并引起身体脂肪的丧失。除了一些肿瘤，ZAG也由白脂肪组织(WAT)和BAT产生，其表达在恶液质中上调。相反，在肥胖人的脂肪组织中ZAG表达只是非肥胖受试者中发现的30％。这提示WAT中ZAG表达的丧失能解释肥胖特征中的一些特征。当然，小鼠中ZAG等位基因的失活导致体重的增加，当喂动物高脂肪饮食时，这更显著。对各种药剂的脂肪分解反应在来自ZAG缺陷型动物的脂肪细胞中显著降低。
迄今为止，已在小鼠中使用人ZAG进行了关于ZAG的脂类动员作用的研究，尽管小鼠和人之间的ZAG氨基酸序列的同源性只是58.6％。由于大鼠和小鼠之间的序列同源性是88.5％，这提示如果人ZAG结合到小鼠受体，它在大鼠中也将是有效的。目前的研究研究了人ZAG在成熟雄性Wistar大鼠中的抗肥胖作用。
发明概述
本发明基于发现——锌-α2-糖蛋白(ZAG)在作为2型糖尿病模型的成年肥胖高血糖(ob/ob)小鼠和成熟Wistar大鼠中对体重和胰岛素反应性具有影响。这样的发现在改善与高血糖相关的症状的方法中是有用的。
因此，本发明提供改善受试者中高血糖的症状的方法。该方法包括给予需要这样治疗的受试者治疗有效剂量的具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽或其片段，持续约10天或更长时间，引起治疗之后与高血糖相关的症状的改善。在一个实施方式中，治疗包括每天给药，持续10天。在另一个实施方式中，每天、每隔一天、每两天或每三天给予多肽，达10天或更长时间。在另一个实施方式中，每天给予多肽两次。多肽可被静脉内、皮下、腹膜内或口服给予。在另一个实施方式中，将多肽与一种或多种选自β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂和β3激动剂的药剂组合给予。在一个实施方式中，β3-AR拮抗剂是SR59230A。在另一个实施方式中，β3激动剂是AMNI-BRL37344(BRL37344)。在另一个实施方式中，多肽是糖基化的。
与高血糖相关的症状的改善包括但不限于，与治疗之前的血清水平相比，葡萄糖血清水平的降低、甘油三酯血清水平的降低、胰岛素血清水平的降低和非酯化脂肪酸血清水平的降低。在一个实施方式中，症状的改善包括与治疗之前的体温相比，在开始治疗的第一天内体温增加约0.4至1℃。在另一个实施方式中，症状的改善包括与治疗之前的血浆胰岛素水平相比，在开始治疗的三天内血浆胰岛素水平的降低。与治疗之前血浆胰岛素和/或葡萄糖和甘油三酯水平相比，血浆胰岛素和/或葡萄糖和甘油三酯水平可降低多达36％。在另一个实施方式中，症状的改善包括开始治疗的三天内响应于静脉内葡萄糖(2g/kg)，血液葡萄糖水平和胰岛素分泌的正常化。在另一个实施方式中，症状的改善包括与治疗之前的胰腺胰岛素水平相比，胰腺胰岛素水平的增加。在另一个实施方式中，症状的改善包括与治疗之前UCP1和UCP3的表达相比，解偶联蛋白-1(UCP1)和解偶联蛋白-3(UCP3)在棕色脂肪组织中增加的表达。在另一个实施方式中，症状的改善包括与治疗之前UCP3的表达相比，UCP3在骨骼肌中增加的表达。在另一个实施方式中，多肽是糖基化的。
在另一个方面，本发明提供降低受试者中血浆胰岛素水平的方法。该方法包括给予受试者治疗有效剂量的多肽或其片段，该多肽具有如SEQ ID NO：1中所显示的序列。在一个实施方式中，将多肽给予受试者持续达10天的时间，其中治疗之后血浆胰岛素水平降低。在另一个实施方式中，将多肽给予受试者持续达21天的时间，其中治疗之后血浆胰岛素水平降低。在另一个实施方式中，血浆胰岛素水平的降低发生在给予多肽3天内。在另一个实施方式中，将多肽与一种或多种选自β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂和β3激动剂的药剂组合给予。在一个实施方式中，β3-AR拮抗剂是SR59230A。在另一个实施方式中，β3激动剂是AMNI-BRL37344(BRL37344)。在另一个实施方式中，多肽是糖基化的。
在另一个方面，本发明提供增加受试者中骨骼肌质量的方法。该方法包括给予受试者多肽或其片段，该多肽具有如SEQ ID NO：1中所显示的序列。在一个实施方式中，骨骼肌是腓肠肌或比目鱼肌。在另一个实施方式中，将多肽给予受试者持续达10天的时间，其中治疗之后骨骼肌质量增加。在另一个实施方式中，将多肽给予受试者持续达21天，其中治疗之后骨骼肌质量增加。在另一个实施方式中，将多肽与一种或多种选自β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂和β3激动剂的药剂组合给予。在一个实施方式中，β3-AR拮抗剂是SR59230A。在另一个实施方式中，β3激动剂是AMNI-BRL37344(BRL37344)。在另一个实施方式中，多肽是糖基化的。
在另一个方面，本发明提供治疗受试者以引起体重减少或肥胖减少的方法。该方法包括给予需要这样治疗的受试者治疗有效剂量的具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽或其片段，联合一种或多种选自β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂和β3激动剂的药剂。在一个实施方式中，β3-AR拮抗剂是SR59230A。在另一个实施方式中，β3激动剂是AMNI-BRL37344(BRL37344)。在另一个实施方式中，多肽是糖基化的。
在另一个方面，本发明提供治疗受试者以引起体重减少或肥胖减少的方法。该方法包括给予需要这样治疗的受试者治疗有效剂量的具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽或其片段，联合一种或多种选自β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂和β3激动剂的药剂。在一个实施方式中，β3-AR拮抗剂是SR59230A。在另一个实施方式中，β3激动剂是AMNI-BRL37344(BRL37344)。在另一个实施方式中，多肽是糖基化的。
在另一个方面，本发明提供药物组合物，其包括具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽和选自β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂和β3激动剂的药剂。在一个实施方式中，β3-AR拮抗剂是SR59230A。在另一个实施方式中，β3激动剂是AMNI-BRL37344(BRL37344)。在另一个实施方式中，多肽是糖基化的。
附图简述
图1A是显示ZAG的表征和其对脂解作用和ob/ob小鼠体重的影响的图。12％SDS-PAGE之后的考马斯染色显示293细胞培养基中的总蛋白和和如所描述的纯化的ZAG。
图1B是显示蛋白质印迹结果的图，该蛋白质印迹显示培养基中ZAG的表达和纯化的ZAG。
图1C是显示经历体重丧失的MAC16小鼠中脂肪组织和肝组织中ZAG mRNA水平的图解。P＜0.01。
图1D是显示来自不肥胖(■)和ob/ob小鼠(□)的附睾脂肪细胞响应于异丙肾上腺素(Iso)和ZAG的脂解作用结果的图解。将与不肥胖小鼠的差异显示为*p＜0.05、**p＜0.01和***p＜0.001。
图1E是显示来自肥胖(ob/ob)和不肥胖(non ob)小鼠附睾(ep)、皮下(s.c.)和内脏(vis)沉积物的脂肪细胞中脂解作用结果的图解，这些小鼠未被处理(■)、用异丙肾上腺素(10μM)(□)或ZAG(0.46μM)
Figure BPA00001394859100041
处理。将与附睾脂肪细胞的差异显示为**p＜0.01。
图1F是显示与方法中所描述的PBS(◆)相比，ZAG(■)对ob/ob小鼠体重的影响的图解。将与时间零点的重量和PBS对照的差异显示为***p＜0.001。
图1G是显示与PBS对照(■)相比，ZAG(□)对小鼠体温影响的图解。将与对照的差异显示为***p＜0.001。
图2A是显示用ZAG处理的ob/ob小鼠的葡萄糖耐受性、葡萄糖摄取进脂肪细胞和腓肠肌的图解。饲养状态中的ob/ob小鼠中的血浆葡萄糖水平，静脉内给予葡萄糖(2g/kg)之后用ZAG(■)或PBS(◆)处理，持续3天。与PBS相比，p＜0.001。葡萄糖给予之后间隔地从尾静脉取出血样并用于葡萄糖和胰岛素的测量。
图2B是显示口服给予葡萄糖(1g/kg)之后用ZAG处理的ob/ob小鼠中血浆胰岛素水平的图解。与PBS相比，p＜0.001。
图2C显示葡萄糖摄取进存在0(■)、1(□)或10nM胰岛素
Figure BPA00001394859100042
下用ZAG处理5天的ob/ob小鼠的附睾(ep)、内脏(vis)和皮下(s.c)脂肪细胞的图解。将存在ZAG时的差异表示为***p＜0.001。
图2D显示2-脱氧-D-葡萄糖摄取进存在或不存在胰岛素(100nM)下用ZAG或PBS处理5天的ob/ob小鼠的腓肠肌的图解。将存在胰岛素时的差异显示为*p＜0.05或**p＜0.01，而将存在ZAG时的差异显示为***p＜0.001。
图2E是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的图。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌除去并针对GLUT4的表达进行蛋白质印迹分析。
图3A是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的图解。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌除去并用于蛋白质合成的测量。将与PBS对照或不肥胖动物的差异显示为***p＜0.001。
图3B是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的图解。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌除去并用于蛋白质降解的测量。将与PBS对照或不肥胖动物的差异显示为***p＜0.001。
图3C是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的图解。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌除去并用于糜蛋白酶样酶活性的测量。将与PBS对照或不肥胖动物的差异显示为***p＜0.001。
图3D是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的图。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌除去并针对20S-蛋白酶体α-亚基表达进行蛋白质印迹分析。
图3E是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的图。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌除去并针对p42表达进行蛋白质印迹分析。
图3F是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的图。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌除去并针对肌球蛋白表达进行蛋白质印迹分析。
图3G是显示ZAG对ob/ob小鼠骨骼肌中蛋白质合成和降解的影响的图。处理ob/ob小鼠5天之后，将骨骼肌除去并针对肌动蛋白表达进行蛋白质印迹分析。
图4A是通过用PBS或ZAG处理5天之后ob/ob小鼠的腓肠肌中磷酸PKR的蛋白质印迹分析显示ZAG对骨骼肌中分解代谢的信号转导途径影响的图。蛋白质的全部形式充当荷载对照。将与PBS对照的差异显示为***p＜0.001，而将与不肥胖小鼠的差异显示为#p＜0.001。
图4B是通过用PBS或ZAG处理5天之后ob/ob小鼠的腓肠肌中磷酸eIF2a的蛋白质印迹法显示ZAG对骨骼肌中分解代谢的信号转导途径影响的图。蛋白质的全部形式充当荷载对照。将与PBS对照的差异显示为***p＜0.001，而将与不肥胖小鼠的差异显示为#p＜0.001。
图4C是通过用PBS或ZAG处理5天之后ob/ob小鼠的腓肠肌中磷酸PLA2的蛋白质印迹法显示ZAG对骨骼肌中分解代谢的信号转导途径影响的图。蛋白质的全部形式充当荷载对照。将与PBS对照的差异显示为***p＜0.001，而将与不肥胖小鼠的差异显示为#p＜0.001。
图4D是通过用PBS或ZAG处理5天之后ob/ob小鼠的腓肠肌中磷酸p38MAPK的蛋白质印迹法显示ZAG对骨骼肌中分解代谢的信号转导途径影响的图。蛋白质的全部形式充当荷载对照。将与PBS对照的差异显示为***p＜0.001，而将与不肥胖小鼠的差异显示为#p＜0.001。
图4E是通过用PBS或ZAG处理5天之后ob/ob小鼠的腓肠肌中胱天蛋白酶-3(■)和胱天蛋白酶-8(□)的活性而显示ZAG对骨骼肌中分解代谢的信号转导途径影响的图解。
图5A是显示响应于ZAG的HSL和ATGL表达的图。蛋白质印迹显示在无处理(Con)、或用异丙肾上腺素(10μM)或ZAG(0.46μM)单独处理之后3h、或用ZAG处理5天之后存在PD98059(25μM)时的不肥胖小鼠脂肪细胞中磷酸HSL的表达。
图5B是通过用ZAG处理5天之后附睾(ep)脂肪细胞中的免疫印迹显示HSL表达的图。
图5C是通过用ZAG处理5天之后皮下(sc)脂肪细胞中的免疫印迹显示HSL表达的图。
图5D是通过用ZAG处理5天之后内脏(vis)脂肪细胞中的免疫印迹显示HSL表达的图。
图5E是显示用ZAG处理5天之后附睾脂肪细胞中ATGL表达的图。
图5F是显示用ZAG处理5天之后皮下脂肪细胞中ATGL表达的图。
图5G是显示用ZAG处理5天之后内脏脂肪细胞中ATGL表达的图。
图5H是显示用ZAG处理5天之后附睾脂肪细胞中ERK表达的图。
图5I是显示用ZAG处理5天之后皮下脂肪细胞中ERK表达的图。
图5J是显示用ZAG处理5天之后内脏脂肪细胞中ERK表达的图。
图5K是显示来自用PBS或ZAG处理5天的ob/ob小鼠的附睾(ep)、皮下(s.c.)和内脏(vis)沉积物的脂肪细胞对BRL37344的脂肪分解作用的反应的图解。将与PBS对照的差异表示为***p＜0.01，而将存在PD98059时的差异表示为#p＜0.001。
图6A是显示用ZAG处理ob/ob小鼠5天对WAT中的ZAG和HSL、BAT中的UCP1和UCP3以及腓肠肌中的UCP3表达影响的图。蛋白质印迹显示ZAG在ep、sc和vis脂肪细胞中的表达。0天代表将脂肪细胞从小鼠中除去的日子。
图6B是显示如方法中所描述的悬浮于RMPI培养基中的附睾脂肪细胞中ZAG表达的图。然后将样品以每天的时间间隔取出并对ZAG表达进行蛋白质印迹分析。0天代表将脂肪细胞从小鼠中除去的日子。
图6C是显示如方法中所描述的悬浮于RMPI培养基中的附睾脂肪细胞中HSL表达的图。然后将样品以每天的时间间隔取出并对HSL表达进行蛋白质印迹分析。0天代表将脂肪细胞从小鼠中除去的日子。
图6D是显示从小鼠除去的BAT中UCP1表达的图。将与PBS处理的小鼠的差异显示为***p＜0.001。
图6E是显示从小鼠除去的BAT中UCP3表达的图。将与PBS处理的小鼠的差异显示为***p＜0.001。
图6F是显示从小鼠除去的腓肠肌中UCP3表达的图。将与PBS处理的小鼠的差异显示为***p＜0.001。
图7A是显示21天研究期间ob/ob小鼠体重减轻的图解。在1、4、5、8、13、16、18和19天注射ZAG；在相同是时间点注射PBS。
图7B是显示用ZAG处理期间ob/ob小鼠(重量80-90g)体重变化(g)的图解。
图7C是显示21天研究期间ob/ob小鼠体温升高的图解。在1、4、5、8、13、16、18和19天注射ZAG；在相同是时间点注射PBS。
图8A是显示第一个5天处理期间尿葡萄糖排泄渐进性降低的图解。
图8B是显示21天研究期间尿葡萄糖排泄渐进性降低的图解。
图9是显示由异丙肾上腺素(iso)分离的脂肪细胞刺激的甘油从用和没用ZAG处理的ob小鼠释放的图解，该脂肪细胞已培养达5天。
图10是显示人血浆Zn-α2-糖蛋白的完全氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的图，如T.Araki et al.(1988)“Complete amino acid sequence of human plasma Zn-α2-糖蛋白andits homology to histocompatibility antigens.”所公布的。
图11是显示缺少或存在SR59230A(10μM)或抗ZAG抗体(1∶1000)(IgG)时，与异丙肾上腺素(10μM)相比，分离的大鼠附睾脂肪细胞中人ZAG的脂肪分解活性的图解。每个值是5个独立研究的平均值。将与对照的差异显示为b，p＜0.01或c，p＜0.001，而将与单独ZAG的差异表示为e，p＜0.01或f，p＜0.001。
图12A是显示超过10天的时间，每天静脉内给予溶于100μl PBS的ZAG(50μg/100g b.w.)(■)或单独PBS(◆)对雄性Wistar大鼠体重的影响的图解。方法部分给出了该实验的方案。
图12B是显示如图12A所描述的给予ZAG(■)或PBS(◆)的雄性Wistar大鼠的体温的图解。
图12C是显示缺少或存在胰岛素(60μU/ml)时，如图12A所示用ZAG(开放的框(空心柱))或PBS(封闭的框(实心柱))处理持续10天之后，2-脱氧-D-葡萄糖摄取进雄性Wistar大鼠的附睾脂肪细胞的图解。
图12D是显示缺少或存在胰岛素(60μU/ml)时，用PBS或ZAG处理10天之后，葡萄糖摄取进雄性Wistar大鼠的腓肠肌和BAT的图解。将ZAG和PBS处理的动物之间的差异显示为a，p＜0.05，b，p＜0.01或c，p＜0.001，而将存在胰岛素时的差异显示为f，p＜0.001。
图12E是显示给予ZAG的ob/ob小鼠中组织Rg的图解。与PBS相比，c，p＜0.001。
图13A-13C是显示如图12所示，用PBS或ZAG处理10天的雄性Wistar大鼠的BAT (图13A)和WAT(图13B)和腓肠肌(图13C)中GLUT4表达的蛋白质印迹的图。将ZAG和PBS处理的动物之间的差异显示为c，p＜0.001。
图14A和14B是显示如图12所示，用PBS或ZAG处理10天的雄性Wistar大鼠的BAT(图14A)和WAT(图14B)中UCP1和UCP3表达的蛋白质印迹的图。将ZAG和PBS处理的动物之间的差异显示为c，p＜0.001。
图15A和15B是显示如图12所示，用PBS或ZAG处理10天的雄性Wistar大鼠的附睾脂肪组织中ATGL(图15A)和HSL(图15B)表达的蛋白质印迹的图。将ZAG和PBS处理的动物之间的差异显示为c，p＜0.001。
图16A-16C是显示腓肠肌(图16A)、WAT(图16B)和BAT(图16C)中ZAG表达的蛋白质印迹的图。将组织从如图12所示用PBS或ZAG处理10天的雄性Wistar大鼠切除。将ZAG和PBS处理的动物之间的差异显示为c，p＜0.001。
图17A和17B是显示如图12所示，用PBS或ZAG处理10天的雄性Wistar大鼠的腓肠肌中磷酸化的和全体形式的PKR(图17A)和eIF2α(图17B)表达的蛋白质印迹的图。光密度分析是磷酸对全体形式的比，表达为用PBS处理的大鼠的值的百分比。
图18A和18B是显示在各种浓度的葡萄糖存在下，用和没用ZAG处理4h的C2C12肌管中苯丙氨酸释放(图18A)和蛋白质合成(图18B)的图解。与对照相比统计学上显著的c，P＜0.001，与单独葡萄糖相比f，P＜0.001。
图19是显示在各种浓度的葡萄糖存在下，用和没用ZAG处理，以及用和没用SR59230A处理的C2C12肌管中苯丙氨酸释放的图解。与对照相比统计学上显著的b，P＜0.01和c，P＜0.001；与单独葡萄糖相比e，P＜0.05和f，P＜0.001。
图20是显示在各种浓度的葡萄糖存在下，用和没用ZAG处理，以及用和没用SR59230A处理的C2C12肌管中蛋白质合成的图解。与对照相比统计学上显著的b，P＜0.01和c，P＜0.001；与单独葡萄糖相比e，P＜0.05和f，P＜0.001；与葡萄糖+SR相比I，P＜0.001。
图21是显示在各种浓度的葡萄糖存在下用ZAG和没用ZAG处理的C2C12肌管中ROS活性的图解。与对照相比统计学上显著的c，P＜0.001，与单独葡萄糖相比f，P＜0.001。
图22A是显示在葡萄糖存在下用ZAG和没用ZAG处理的C2C12肌管中PKR的蛋白质印迹的图。与对照相比统计学上显著的c，P＜0.001，与单独葡萄糖相比f，P＜0.001。
图22B是显示在葡萄糖存在下用ZAG和没用ZAG处理的C2C12肌管中eIF2α的蛋白质印迹的图。与对照相比统计学上显著的c，P＜0.001，与单独葡萄糖相比f，P＜0.001。
图23A和23B是显示用和没用ZAG处理的ob/ob小鼠中胰岛素耐受性试验的结果的图解。与用ZAG相比统计学上显著的b，P＜0.05和c，P＜0.001。
图24是显示ob/ob小鼠中D-[U-14C葡萄糖]氧化成14CO2的图解。
图25是显示ob/ob小鼠中从[14C羧基]油酸甘油酯产生14CO2的图解。
发明详述
本发明基于发现——重组人锌-α2-糖蛋白(ZAG)在ob/ob小鼠和Wistar大鼠中降低体重和增加胰岛素反应性，对食物摄入没有影响。就这一点而论，本发明提供改善受试者中高血糖的症状、降低血浆胰岛素水平和增加骨骼肌质量的方法。还提供组合的治疗以引起受试者体重减少或肥胖减少。
在描述本发明的组合物和方法之前，将要理解的是该发明不限于描述的特定的组合物、方法和实验条件，因为这样的组合物、方法和条件可变化。还将要理解的是本文使用的术语只是用于描述特定的实施方式的目的，而不是意欲受限制，因为本发明的范围将只由所附的权利要求书的限定。
如本说明书和所附的权利要求书所用，除非上下文清楚地指出，单数形式“一(a)”、“一(an)”、“所述(the)”包括复数的指代物。因此，例如，提及“所述方法”包括一个或更多的方法和/或本文描述的类型的步骤，在阅读该公开等之后，其对于本领域的技术人员将变得明显。
除非另有定义，本文使用的所有的技术和科学术语具有与该发明所属领域的技术人员通常理解的相同的意义。尽管在实践或测试本发明中能使用与本文描述的那些方法和材料相似或相等的任何方法和材料，但是现在描述优选的方法和材料。
ZAG的完全氨基酸序列已在T.Araki等的名称为“Complete amino acid sequenceof human plasma Zinc-α2-glycoprotein and its homology to histocompatibility antigens”(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，85，679-683的论文中被报道，其中糖蛋白被显示为由276个氨基酸残基的单个多肽链组成，其具有三个不同的域结构(A、B和C)并包括两个二硫键加上在三个糖基化位点的N联聚糖。多肽组分的氨基酸序列展示在附图的图10中。尽管一些随后的出版物已指出当从不同的体液或组织中分离出时，人ZAG的组成能改变一点儿，但是该物质的所有制备物具有基本上相同的免疫学特性。如H.Ueyama，et al.(1991)“Cloning and nucleotide sequence of a humanZinc-α2-glycoprotein cDNA and chromosomal assignment of its gene”，Biochem.Biophys.Res.Commun.177，696-703所报道的，ZAG的cDNA已从人肝和前列腺文库中被分离出来，并且如Ueyama et al.，(1993)“Molecular cloning and chromosomal assignment ofthe gene for human Zinc-α2-glycoprotein”，Biochemistry 32，12968-12976所报道的，基因也已被分离出来。H.Ueyama et al.也已在J.Biochem.(1994)116，677-681中描述了，有关来自大鼠和小鼠肝脏的ZAG cDNA的研究，所述ZAG cDNA与相应的mRNA表达的糖蛋白一起已被测序并与人的物质比较。尽管如所期望的，发现不同物种的细节差别，但是发现高度的氨基酸序列同源性与人负体(相应的人，human counterpart)(糖蛋白的B结构域内超过70％的同源性)具有超过50％的同源性。此外，已观察到人、大鼠和小鼠ZAG之间共同的免疫学性质。
基本上根据Ohkubo et al.(Ohkubo et al.(1988)“Purification and characterisation ofhuman plasma Zn-α2-glycoprotein”Prep.Biochem.，18，413-430)描述的方法，从新鲜的人血浆中制备上面讨论的纯化的ZAG。应当理解，在一些情况下，可产生分离的脂类动员因子的片段或ZAG的片段，其没有丧失脂肪分解或脂类动员活性，可进行各种添加、缺失和置换，其也将基本上不影响该活性。就这一点而论，本发明的方法还包括使用ZAG的功能片段。这些治疗应用中使用的糖蛋白或其片段还可通过重组DNA技术而产生，重组DNA技术是本领域所熟知的，其可能基于Zn-α2-糖蛋白的已知cDNA序列，该序列已被公开例如在H.Ueyama et al.(1994)“Structure andExpression of Rat and Mouse mRNAs for Zn-α2-glycoprotein”J.Biochem.，116，677-681中。此外，这些治疗应用中使用的糖蛋白或其片段可进一步包括多肽的表达后修饰，例如糖基化、乙酰化、磷酸化等，以及本领域已知的其它修饰，天然发生的和非天然发生的。
先前已显示ZAG在哺乳动物中引起体重减少和肥胖减少，如美国专利号6,890,899中所公开的，其通过引用以其全部被并入本文。此外，已观察到具有ZAG和/或其片段的相似特性的脂类动员药剂也已用于在哺乳动物中引起引起体重减少和肥胖减少，如美国公开的申请号20060160723中所公开的，其通过引用以其全部被并入本文。本发明显示ZAG和/或其功能片段增加脂肪细胞和骨骼肌的胰岛素反应性，并通过蛋白质合成的增加加上蛋白质降解的减少而引起肌肉质量的增加，不论在治疗期间是否观察到体重减少或肥胖减少。因此考虑本发明的方法在任何可检测的体重减少或肥胖减少之前提供对与高血糖和/或肌萎缩症(muscle wasting disease)相关的症状的可检测的作用。
因此，在一个方面，本发明提供改善受试者中高血糖症状的方法。该方法包括给予需要这样治疗的受试者治疗有效剂量的具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽或其片段，持续达10天或更长的时间。例如该治疗方案可持续数月(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)、或数年。在一个实施方式中，给予多肽持续达21天或更长时间。在另一个实施方式中，症状的改善在开始治疗的数天(例如，1、2、3、4、5、6或7天)、数周(例如1、2、3或4周)、或数月(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月)内检测到。在另一个实施方式中，治疗方案约10天，其中治疗之后有与高血糖相关的症状的改善。在另一个实施方式中，治疗方案约21天，其中治疗之后有与高血糖相关的症状的改善。
术语“受试者”如本文所用指对其进行主题方法的任何个体或患者。一般地，受试者是人，尽管如本领域的技术人员所将理解的，受试者可以是动物。因此其它的动物——包括哺乳动物诸如啮齿动物(包括小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠)、猫、狗、兔子、包括母牛、马、山羊、绵羊、猪等在内的农业动物、和灵长类(包括猴、黑猩猩、猩猩和大猩猩)——包括在受试者的定义内。
高血糖和/或与此相关的病症的示例性的特征包括但不限于前驱糖尿病、2型糖尿病、1型糖尿病、受损的葡萄糖耐受性、多囊卵巢综合征、非酒精性脂肪肝病、肌萎缩病、不产生可检测的高血糖的胰岛素抵抗状态、妊娠糖尿病、心血管危险和心肌梗塞。示例性的肌萎缩病包括但不限于癌症、AIDS、败血病、COPD、肾衰竭、关节炎、充血性心力衰竭、肌肉营养不良症、糖尿病、衰老的少肌症(sarcopenia of aging)、严重创伤(例如，肢体的矫形固定)、代谢性酸中毒、去神经性萎缩和失重。应当理解，具有高血糖和/或糖尿病的受试者可具有正常的或平均的体重。被称作“极瘦糖尿病患者(skinny diabetics)”的这样的个体经常显示一种或多种与高血糖和/或糖尿病相关的症状，没有重量或肥胖的增加。此外，一定比例的超重或肥胖的糖尿病患者实际上是具有重叠在糖尿病上的超重/肥胖的极瘦糖尿病患者。
术语“治疗有效量”或“有效量”指化合物或药物组合物的量，其将引出正被研究人员、兽医、医生或其它的临床医生寻找的组织、系统、动物或人的生物学或医学反应。
术语“给予(administration)”或“给予(administering)”被定义为包括提供给需要治疗的受试者本发明的化合物或药物组合物的行为。短语“胃肠外给药(parenteraladministration)”和“经胃肠外给药(administered parenterally)”如本文所用指除肠内和局部给药外的给药方式，通常是口服或通过注射，包括但不限于，静脉内的、肌肉内的、动脉内的、鞘内的、囊内的、眶内的、心内的、真皮内的、腹膜内的、经气管的、皮下的、表皮下的、关节内的、囊下的、蛛网膜下的、脊柱内的和胸骨内的注射和输注。短语“全身给药(systemic administration)”、“经全身给药(administeredsystemically)”、“外周给药(peripheral administration)”和“经外周给药(administeredperipherally)”如本文所用指除直接进入到中枢神经系统外的化合物、药物或其它物质的给药，这样它进入受试者的全身，并因此易遭受新陈代谢和其它相似的过程，例如皮下给药。
如本文所用，术语“改善”或“治疗”指由于进行的行为，临床体征和/或与高血糖相关的症状减少。将被监测的体征或症状将具有高血糖特征并对本领域的技术人员来说将是熟知的，这将是用于监测体征和状况的方法。示例性的与高血糖相关的症状包括但不限于与正常的受试者或没有高血糖的受试者相比增加的葡萄糖血清水平、增加的甘油三酯血清水平、增加的胰岛素血清水平和增加的非酯化脂肪酸(NEFA)血清水平。就这一点而论，与高血糖相关的症状的改善包括但不限于，降低葡萄糖血清水平、降低甘油三酯血清水平、降低胰岛素血清水平、降低非酯化脂肪酸血清水平、降低血浆胰岛素水平、增加胰腺胰岛素水平和增加骨骼肌质量。
如本文所用，术语“减低”和“抑制”在一起使用，因为认识到在一些情况下，降低能在特定试验的检测水平以下被减低。就这一点而论，是否表达水平或活性在试验的检测水平以下被“减低”或被完全“抑制”可能不总是清楚的。尽管如此，根据本方法的治疗之后，水平，例如，血清胰岛素的水平从治疗之前的水平至少被减低将是明显可确定的。
ZAG已被认为具有许多生物学作用，但是其作为调节脂类动员和利用的脂肪因子的作用在调节身体组成中是最重要的。先前的研究提示蛋白质合成的增加是由于通过与β-肾上腺素能受体的相互作用引起的环AMP的增加，而蛋白质降解的降低是由于降低的泛素-蛋白酶体蛋白水解途径的活性。db/db小鼠中的研究显示胰岛素抵抗通过增加的泛素-蛋白酶体途径的活性引起肌萎缩。增加的PKR和eIF2α的磷酸化将通过阻断翻译起始而降低蛋白质合成，而PKR的活化将通过活化核因子-κB(NF-κB)、增加蛋白酶体亚基的表达而增加蛋白质降解。在存在高的细胞外葡萄糖时使用肌管的体外研究显示PKR的活化引起p38MAPK的活化和活性氧物质(ROS)的形成。p38MAPK能在Ser-505磷酸化和活化cPLA2，引起花生四烯酸——ROS来源——的释放。在饮食诱发的肥胖模型中已观察到骨骼肌中p38MAPK的超活化。此外已显示胱天蛋白酶-3活性在糖尿病动物的骨骼肌中增加，这可以是信号级联放大的一部分，因为它能分裂PKR，导致活化。不受理论束缚，ZAG减弱这些信号传导途径的能力提供关于它增加肌肉质量的能力的解释。
因此，在另一个方面，本发明提供增加受试者中骨骼肌质量的方法。该方法包括给予受试者具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽或其片段。
此外，ZAG已显示在成年雄性小鼠中增加葡萄糖氧化和增加组织葡萄糖代谢速率。这种增加的葡萄糖的利用将解释在给予ZAG的ob/ob小鼠中血液葡萄糖和胰岛素水平的下降。甘油三酯利用在给予ZAG的小鼠中也增加了，这将解释血浆非酯化脂肪酸(NEFA)和甘油三酯(TG)的下降，尽管血浆甘油增加，指示脂解作用增加。将从BAT中UCP1和UCP3及骨骼肌中UCP3的增加的表达预期增加的脂类利用，导致体温增加。就这一点而论，在一个实施方式中，与高血糖相关的症状的改善还包括治疗期间体温增加约0.5℃至约1℃。在一个实施方式中，体温增加发生在开始治疗4天内。在另一个实施方式中，与高血糖相关的症状的改善还包括与治疗之前胰腺胰岛素水平相比，胰腺胰岛素的增加，因为作为ZAG存在的结果，需要较少的胰岛素来控制血液葡萄糖。
因此，将ZAG识别为能以GTP依赖的过程在小鼠白色脂肪细胞中诱导脂解作用的脂类动员因子，该诱导与脂肪分解激素的诱导相似。本文呈现的数据通过显示ZAG在大鼠脂肪细胞中具有相似的脂肪分解作用，而且，在成熟的雄性大鼠中引起体重和尸体脂肪降低而支持这些发现，尽管大鼠和人ZAG之间的序列同源性仅为59.4％。
ZAG还抵消包括血浆胰岛素水平降低和改善的葡萄糖耐受性试验反应在内的糖尿病状态的代谢特征中的一些特征。因此，在另一个方面，本发明提供降低受试者中血浆胰岛素水平的方法。该方法包括给予受试者治疗有效剂量的具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽或其片段。在一个实施方式中，血浆胰岛素降低发生在开始治疗的3天内。在另一个实施方式中，给予治疗方案，持续10天或更长时间。在另一个实施方式中，给予治疗方案，持续21天或更长时间。
此外，ZAG增加附睾脂肪细胞对β3-肾上腺素能刺激物的脂肪分解的反应性。ZAG还增加HSL和ATGL在附睾脂肪组织中的表达，已发现HSL和ATGL在肥胖的胰岛素抵抗状态中被降低。尚不知道调节HSL和ATGL表达的因子。然而，特异的ERK抑制剂，PD98059响应于ZAG，下调HSL表达，提示在该过程中MAPK的作用。缺少MAPK磷酸酶-1的小鼠在WAT中具有增加的ERK和p38MAPK活性，由于增强的能量消耗而对饮食诱发的肥胖具有抵抗力。先前的研究已提示MAPK在骨骼肌中ZAG诱导的UCP3表达中的作用。ERK活化可通过HSL的丝氨酸残基，诸如Ser-600——由蛋白激酶A磷酸化的位点之一——的磷酸化而在脂肪细胞中调节脂解作用。
本文呈现的结果显示，给予大鼠ZAG还增加大鼠中ATGL和HSL的表达。ATGL在肥胖的过度脂肪储存中可能是重要的，因为ATGL敲除小鼠响应于异丙肾上腺素，具有大量的脂肪沉积和从WAT降低的NEFA释放，尽管它们确实显示正常的胰岛素敏感性。相反，无HSL小鼠，当以正常饮食喂养时，具有与野生型动物相似的体重。然而，与胰岛素敏感状态相比，肥胖的胰岛素抵抗状态中ATGL和HSLd的表达在人WAT中减少，重量减少也降低mRNA和蛋白水平。
就这一点而论，在一个实施方式中，与高血糖相关的症状的改善还包括治疗期间棕色脂肪组织中解偶联蛋白-1(UCP1)和解偶联蛋白-3(UCP3)表达的增加。在另一个实施方式中，与高血糖相关的症状的改善还包括治疗期间骨骼肌中UCP3表达的增加。
单独脂解作用的刺激不会耗尽身体脂肪贮存，因为没有能量池，释放的NEFA在脂肪细胞中将被再合成甘油三酯。为了减少身体脂肪，ZAG不但增加脂解作用，如通过血浆甘油的增加所显示的，而且还增加脂类利用，如通过甘油三酯和NEFA的血浆水平的降低所显示的。该能量形成(channel into)热，如用ZAG处理的大鼠中体温上升0.4℃所证明的。增加的能量利用最可能来自增加的UCP1表达，其已显示在给予ZAG之后BAT和WAT中。增加的UCP1表达将被期望降低NEFA血浆水平，因为在BAT中它们是产热的主要底物。BAT还具有高的葡萄糖利用能力，这将部分地解释血液葡萄糖的降低。此外在骨骼肌和WAT中具有增加的GLUT4表达，这有助于介导存在胰岛素时葡萄糖摄取的增加。在用ZAG处理的小鼠中存在脑、心、BAT和腓肠肌的增加的葡萄糖利用/氧化，和从D-[U-14C]葡萄糖以及[14C羧基]油酸甘油酯的增加的14CO2产生(图24)。ZAG给予之后还存在ob/ob小鼠的BAT氧摄取三倍的增加。
虽然ZAG增加附睾脂肪细胞中HSL的表达，但是在皮下或内脏脂肪细胞中没有增加。对于脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)表达，观察到相似的情形。HSL和ATGL的表达与ERK的活性(磷酸)形式的表达相关。附睾脂肪细胞中HSL和ATGL的表达与响应于β3激动剂，BRL37344的增加的脂肪分解相关。该结果提示ZAG可协同地与β3激动剂起作用。
如本文所用，术语“激动剂”指能引起完全或部分药理学反应的药剂或类似物。例如，激动剂可有成果地结合到受体并在那里模拟生理反应。就这一点而论，本发明的方法可进一步包括给予ZAG或其片段，与β3激动剂诸如BRL37344结合。
提示ZAG诱导的大鼠脂肪细胞中的脂解作用是通过β3-AR介导的，ZAG对脂肪组织和瘦体重的作用还可由于它刺激β3-AR的能力。ZAG引起的UCP1表达的诱导已显示是通过与β3-AR的相互作用介导的。WAT中增加的UCP1表达还可以是通过重塑棕色脂肪细胞前体的β3-AR效应，如β3-AR激动剂CL316,243发生的。使用敲除小鼠，β3-AR刺激的抗肥胖作用通过从WAT释放的NEFA的UCP1依赖性降解已主要归因于BAT中的UCP1，较少地归因于UCP2和UCP3。葡萄糖摄取进动物的外周组织是由寒冷暴露——也是通过β3-AR而被介导的效应——刺激的。然而，靶向作用β3-AR在人类中较在啮齿动物中更难，因为β3-AR在控制人皮下腹部脂肪组织中的脂解作用和营养血流量中较β1和β2-AR亚型起到较不显著的作用。然而，尽管这样，β3-AR激动剂CL316,243已在健康的年轻男性志愿者中显示增加脂肪氧化。这可能是由于β-肾上腺素能激动剂增加来自BAT的质膜中β3-AR数目的能力。
最近的结果显示，脂肪组织中ZAG表达较循环ZAG在局部地方可能是更重要，其通过以旁分泌的方式起作用。因此在人类中，虽然内脏和皮下脂肪中ZAG的mRNA水平与BMI、脂肪质量和胰岛素抵抗负相关，但是通过ELISA测定的血清水平与肥胖的参数(BMI和腰围)和胰岛素抵抗正相关。因此ZAG诱导其自身在腓肠肌、WAT和BAT中表达的能力对它增加脂解作用和能量利用的能力可以是关键的。
这些结果为ZAG在大鼠中动员和利用脂类的能力提供证据——证实物种独立效应，并提示它在人中作为抗肥胖剂可以是有用的。因此，在另一个方面，本发明提供治疗受试者以引起体重减少或肥胖减少的方法。该方法包括给予需要这样治疗的受试者治疗有效剂量的β3激动剂，结合具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽或其片段。在另一个实施方式中，治疗受试者以引起体重减少或肥胖减少的方法包括给予需要这样治疗的受试者治疗有效剂量的β3-AR拮抗剂，结合具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽或其片段。
所有的方法可进一步包括将活性成分(或多个)(例如，ZAG或ZAG的功能片段)与药学上可接受的载体相关联的步骤，该载体构成一种或多种辅助成分。就这一点而论，本发明还提供用于治疗具有与高血糖相关的症状的受试者的药物组合物。在一个实施方式中，该组合物包括作为活性成分的治疗有效剂量的ZAG或如上面所讨论的糖蛋白脂类动员因子，或其脂肪分解活性片段，加上药学上可接受的载体、赋形剂的稀释剂。
对配制用于给予受试者的组合物有用的药学上可接受的载体是本领域熟知的并包括，例如水溶液诸如水或生理缓冲盐水或其它溶剂或载体诸如二醇类、甘油、油类诸如橄榄油或可注射有机酯。药学上可接受的载体可含有生理学上可接受的化合物，该化合物起到，例如稳定或增加结合物的吸收的作用。这样的生理学上可接受的化合物包括，例如碳水化合物，诸如葡萄糖、蔗糖或葡聚糖；抗氧化剂，诸如抗坏血酸或谷胱甘肽；螯合剂；低分子量蛋白质或其它稳定剂或赋形剂。本领域的技术人员将知道包括生理学上可接受的化合物在内的药学上可接受的载体的选择依赖，例如治疗剂的物理化学特性和组合物给药途径，给药途径可以是，例如，口服或胃肠外地诸如静脉内地，和通过注射、插管或本领域已知的其它这样的方法。药物组合物还能含有第二(或更多)化合物(或多种)诸如诊断试剂、营养物质、毒素或治疗剂，例如癌症化学治疗剂和/或维生素(或多种)。
适于口服给药的本发明的制剂可作为不连续的单位诸如胶囊、扁囊剂、片剂或锭剂而存在，每个单位含有以粉末或颗粒形式的预定量的活性化合物；或作为水成液或非水成液中的活性化合物的悬浮液而存在，诸如顿服的糖浆、酏剂、乳剂。
因此，在另一个方面，本发明提供ZAG或如本文所定义的脂类动员剂在制备用在人类医学中的、用于治疗与高血糖相关的症状和/或状况的药物中的应用。这样的药物还可以对刺激肌肉发育和增加肌肉质量、降低葡萄糖的血清水平、降低甘油三酯的血清水平、降低胰岛素的血清水平、降低非酯化脂肪酸的血清水平、降低血浆胰岛素水平和/或增加胰腺胰岛素水平是有用的。
在实践本发明的方法中将要给予的化合物或组合物的总量能作为单一剂量或作为大丸剂或在相对短的时期里通过输注而给予受试者，或能使用分次治疗方案给予，其中在延长的时期里给予多剂量(例如，每天一次、每天两次等)。本领域的技术人员将知道在受试者中治疗与高血糖相关的症状的ZAG或其功能片段的量依赖包括受试者的年龄和一般健康以及给药途径和将要给予的治疗的数目在内的许多因素。考虑到这些因素，必要时熟练的技术人员将调整特定的剂量。一般而言，使用I期和II期临床试验最初测定药物组合物的制剂和给药途径和频率。
因此，在某些实施方式中，本发明的方法包括间隔的治疗方案。观察到在ob/ob小鼠中长期每天给予ZAG导致体重减轻的停止。就这一点而论，在一个实施方式中，每隔一日给予治疗。在另一个实施方式中，每二天给予治疗。在另一个实施方式中，每三天给予治疗。在另一个实施方式中，每四天给予治疗。
因此，本发明证明当ZAG的给予被中断大约3-4天，之后是再输注时，发生另外的体重减轻和/或与高血糖相关的症状的改善。不被理论束缚，这可能是因为正在给予的太多了或存在受体失敏感化——如在TNF看到的。进行试点研究，每组2只小鼠，在约3周中观察到90g小鼠体重减轻8-10g。就这一点而论，考虑较小剂量的ZAG或其功能片段可用于在可观察到的肥胖减少或重量减少之前在受试者中改善高血糖症状。
提供以下实施例以进一步说明本发明的优点和特点，但是这些实施例不是意欲限制本发明的范围。虽然它们在可能使用的那些例子中是典型的，但是本领域的技术人员已知的其它程序、方法学或技术可替代使用。
实施例1
锌-α2-糖蛋白减弱高血糖
为了评价锌-(α2-糖蛋白(ZAG)减弱肥胖和高血糖的能力，给予ob/ob小鼠诱导体重减轻和体温升高——提示增加的能力消耗——的ZAG。棕色脂肪组织中解偶联蛋白1和3的表达增加，尽管甘油增加，而葡萄糖、甘油三酯和非酯化脂肪酸的血清水平降低，指示增加的脂解作用。存在血浆胰岛素降低、对静脉内葡萄糖的改善的反应加上增加的葡萄糖摄取进脂肪细胞和骨骼肌。附睾脂肪细胞中激素敏感性脂肪酶的表达增加。存在骨骼肌质量的增加，这是由于蛋白质合成的增加和降解的减少。这提示ZAG在高血糖的治疗中可以是有效的。
Dulbeccos’Modified Eagle’s(DMEM)和Freestyle培养基购自Invitrogen(Paisley，UK)，而胎牛血清购自Biosera(Sussex，UK)。2-[1-14C]脱氧-D-葡萄糖(sp.act.1.85GBqmmol-1)和L-[2，6-3H]苯丙氨酸(sp.act.37Bq mmol-1)来自American RadiolabeledChemicals(Cardiff，UK)。对磷酸(Thr-202)和总ERK1、总p38MAPK、磷酸HSL(Ser-552)、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、脂肪甘油三酯脂肪酶、激素敏感性脂肪酶、和磷酸PLA2(Ser-505)和对人ATGL的兔多克隆抗体购自Abcam(Cambridge，UK)。对全长人ZAG的小鼠单克隆抗体来自Santa Cruz(California，USA)，对肌球蛋白重链II型的小鼠单克隆抗体来自Novacastra(via Leica Biosystems，Newcastle，UK)。对20S蛋白酶体α-亚基和p42的小鼠单克隆抗体来自Affiniti Research Products(Exeter，UK)。对磷酸(Thr-180/Tyr-182)p38MAPK的小鼠单克隆抗体和对总和磷酸(Thr-451)PKR、磷酸(Ser-162)eIF2α和对总eIF2α的兔多克隆抗血清来自New EnglandBiosciences(Herts，UK)。对UCP1、UCP3和总PKR的多克隆兔抗体和PHOSPHOSAFETM提取试剂来自Calbiochem(via Merk Chemicals，Nottingham，UK)。过氧化物酶偶联的山羊抗兔和兔抗小鼠抗体购自Dako(Cambridge，UK)。对小鼠β-肌动蛋白的多克隆兔抗体和甘油三酯测定试剂盒购自Sigma Aldrich(Dorset，UK)。Hybond A硝酸纤维素膜和增强化学发光(ECL)显影试剂盒来自Amersham PharmaciaBiotech(Bucks，UK)。针对NEFA的WAKO比色测定试剂盒购自Alpha Laboratories(Hampshire，UK)，小鼠胰岛素ELISA试剂盒购自DRG(Marburg，Germany)。使用Boots(Nottingham，UK)血浆葡萄糖试剂盒进行葡萄糖测量。
重组ZAG的产生-用表达载体pcDNA 3.1中的全长人ZAG cDNA转染HEK293F细胞，并将该细胞在37℃在空气中有5％CO2的大气下保持在FreeStyle培养基中。ZAG被分泌到培养基中，将其收集，14天培养之后获得最高蛋白质水平(16μgml-1)。为了纯化ZAG，使用具有10kDa截断的Amicon Ultra-15离心滤器将培养基(200ml)以700g离心15min以去除细胞，并浓缩到1ml无菌PBS的体积。将浓缩物(约2mg蛋白质)加入到悬浮于20ml 10mM Tris，pH 8.8中的2g DEAE纤维素中，于4℃搅拌2h。DEAE纤维素结合ZAG并通过离心(1500g持续15min)沉淀，ZAG通过与含有0.3M NaCl的20ml 10mM Tris，pH8.8于4℃搅拌30min而洗脱。洗涤洗脱液并使用Amicon离心滤器将其在无菌PBS中浓缩到1ml的体积。如用LAL Pyrogent单个测试试剂盒(Lonza，Bucks，UK)所测定的，纯化的ZAG无内毒素。
细胞培养和ZAG的纯化.通过在含有1.5mgml-1胶原酶和4％牛血清白蛋白的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液中在如先前所描述的95％氧：5％CO2的大气下于37℃温育2h而从切碎的脂肪沉积中制备白色脂肪细胞的单细胞悬液。为了时程研究，将脂肪细胞以105个细胞/ml-1的浓度悬浮在含有10％胎牛血清的DMEM中，并于37℃保持在空气中10％CO2的大气下。用含有人ZAG的质粒转染人293细胞，并将细胞以105个细胞/ml-1的浓度接种到FreeStyle培养基中，并于37℃保持在空气中有5％CO2的大气下。14天的培养之后获得最高蛋白质水平(16μgml-1)。然后使用具有10kDa截断的Amicon Ultra-15离心滤器将培养基(200ml)以700g离心15min以去除细胞，并浓缩到1ml无菌PBS的体积。测量样品(约2mg)的蛋白质浓度之后，将其加入到悬浮于20ml的10mM Tris，pH 8.8的2g DEAE纤维素中，于4℃搅拌2h。带有负电荷的ZAG结合到DEAE纤维素，将其通过离心(1500g持续15min)沉淀，并通过与含有0.3M NaCl的20ml 10mM Tris，pH8.8于4℃搅拌30min而洗脱。洗涤洗脱液并使用Amicon离心滤器将其在无菌PBS中浓缩到1ml的体积。
动物-小鼠.在本研究中使用来自在阿斯顿大学(Aston University)保持的群体的纯合的肥胖(ob/ob)小鼠。先前已描述了Aston ob/ob小鼠的出身和特性。将雄性小鼠(20-21周龄，重量90-100g)分成每笼三只，处于22±2℃有空调的房间，具有12h-光亮∶12h-黑暗循环，以饲养饮食(Special Diet Services，Witham，UK)和随意的自来水喂养大鼠和小鼠。通过静脉内给予动物PBS(100μl)b.d.中的ZAG(35μg)，每天监测体重、食物和水的摄入。对照小鼠只接受PBS。通过使用直肠温度计(RS Components，Northants，UK)每天测量体温。所有的动物实验都依据U.K.Animals(ScientificProcedures)Act 1986进行。给予ZAG之后未观察到不良作用。
动物-大鼠.将重540±82.5g、成熟的雄性Wistar大鼠(一岁大，来自我们自己的群体)单个居住并用PBS(100μl)中的ZAG(50μg/100g体重)或用PBS(100μl)作为对照每天经静脉内处理一次。每天测量食物和水的摄入和体重。让动物自由饮食(SpecialDiet Services，Essex，UK)和随意饮水。动物实验在British Home Office强加的福利条件下进行。10天处理之后，终止动物并测定身体组成。将动物加热到80-90℃持续7天直到达到恒定的重量。然后根据湿重和干重的差异测定含水量。如Lundholm et al(14)所描述的，使用氯仿∶甲醇(1∶1)、乙醇/丙酮(1∶1)和二乙醚(每次120ml)的顺序从干的动物尸体提取脂类。将溶剂脱水并称重脂肪。将脱脂的尸体质量计算为尸体的最初重量与水和脂肪的重量之间的差异。
脂肪分解测定.将要测定的样品与105至2×105脂肪细胞在1ml pH 7.2的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液中温育2h。用Wieland的方法(Wieland，O.GlycerolUV method.In Methods of Enzymatic Analysis(ed.Bergmeyer，H.U.)(Academic Press，London，UK，pp 1404-1409，1974))酶法测定释放的甘油浓度。分析只含有脂肪细胞的对照样品以测定自然的甘油释放。将活性表示为μMol释放的甘油/105脂肪细胞/2h。
血清代谢物测定.使用Wako-ASC-ACOD试剂盒(Wako Chemical GmbH，Neuss，Germany)测定非酯化脂肪酸(NEFA)。使用甘油三酯试剂盒(Sigma Chemical Co.，Poole，United Kingdom)测定甘油三酯，使用定量酶测定试剂盒(Sigma)测定3-羟基丁酸盐。使用葡萄糖分析仪(Beckman，Irvine，Calif.)测量葡萄糖，使用如Academic Press，London(1974)出版的“Methods of Enzymatic Analysis”(Ed.Bergmeyer，H.U.)Vol.3，pp1404-1409中描述的Wieland方法酶法测定甘油。
小鼠脂肪细胞质膜的分离.在典型的操作中，除了将细胞在250mM蔗糖、2mM乙二醇双(β-氨基乙醚)-N，N，N′，N′(EGTA)、10mM Tris-HCl(pH 7.4)中洗之外，如上面所参考的，从小鼠附睾脂肪垫分离白色脂肪细胞。将脂肪细胞悬浮在20ml上面的缓冲液中并通过Swinny滤器抽吸至少10次而匀浆化。然后将细胞匀浆以300g离心5min，从表面去除脂肪饼并将剩余的沉淀物和下层漂浮物转移至干净的管中。将它们在4℃以30,000g离心1h，并将形成的膜沉淀物重悬在蔗糖缓冲液(200to 400μl)中。在PERCOLLTM胶体二氧化硅颗粒的自形成梯度上将质膜与其它的细胞器膜分离。组分是250mM蔗糖、2mM EGTA、10mM Tris-HCl，pH 7.4；PERCOLLTM；和2M蔗糖、8mM EGTA、80mM Tris-HCl，pH 7.4，与膜悬液以32∶7∶1的比混合在一起(总体积8ml)。将该混合物于4℃以10,000g离心30min。将梯度分成0.75ml的部分，测定每部分琥珀酸脱氢酶、NADH-细胞色素c还原酶、乳酸脱氢酶和5′-核苷酸酶的存在以定位质膜部分。将膜部分重悬浮于150mM NaCl、1mM EGTA、10mMTris-HCl，pH 7.4中并于4℃以10,000g离心2min。将该过程重复两次。然后将洗过的质膜在10mM Tris-HCl，pH 7.4、250mM蔗糖、2mM EGTA和4μM苯甲基磺酰氟(PMSF)中以1-2mg/ml稀释，在液氮中速冻并储存在-70℃直到使用。
大鼠脂肪细胞中的脂肪分解活性-如(Beck SA，et al.Production of lipolytic andproteolytic factors by a murine tumor-producing cachexia in the host.Cancer Res47：5919-5923，1987)所描述的，使用胶原酶消化从雄性Wistar大鼠(400g)精细切碎的附睾脂肪组织制备白色脂肪细胞。通过在1ml pH 7.2的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液中温育105至2×105脂肪细胞2h测定脂肪分解活性，通过测量释放的甘油来测定脂解作用的程度(Wieland，O.Glycerol UV method.In Methods of Enzymatic Analysis(ed.Bergmeyer，H.U.)(Academic Press，London，UK，pp 1404-1409，1974))。通过单独温育脂肪细胞测量自然的甘油释放。将脂肪分解活性表示为μMol释放的甘油/105脂肪细胞/2h。
凝胶电泳.根据Laemmli的方法制备凝胶，该凝胶通常由5％浓缩胶和15％SDS-PAGE分离胶(变性或还原条件)或10％SDS-PAGE分离胶(非变性或非还原条件)组成。将样品以1-5μg/泳道加样。通过用考马斯亮蓝R-250或银染色使带可视化。通过在0.0625M Tris-HCl，pH 6.8、10％甘油、1％SDS、0.01％溴酚蓝和5％2-巯基乙醇中于100℃加热5min制备用于还原条件的样品。
葡萄糖摄取进脂肪细胞.将分离的脂肪细胞(5×104)在1ml pH 7.2的Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液(KRBS)中洗涤两次，并进一步在含有18.5MBq 2-[1-14C]脱氧-D-葡萄糖和非放射的2-脱氧-D-葡萄糖的0.5ml KRBS中于室温温育10min至0.1mM的终浓度。通过加入1ml冰冷的无葡萄糖的KRBS终止摄取，将细胞用1mlKRBS洗三次，通过加入0.5ml 1M NaOH而裂解，在用液体闪烁计数测定放射性之前将其放置于室温至少1h。
葡萄糖摄取进腓肠肌-将腓肠肌在Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液中于37℃温育45min，然后在含有185M Bq 2-[1-14C]脱氧-D-葡萄糖和非放射的2-脱氧-D-葡萄糖的5ml Krebs-Henseleit缓冲液中再温育10min至0.1mM的终浓度。然后将肌肉取出并在0.9％NaCl中洗5min，之后在0.5ml 1M NaOH中溶解并用液体闪烁计数测定放射性。
葡萄糖摄取进比目鱼肌.将比目鱼肌在Krebs-Henseleit碳酸氢盐缓冲液中于37℃温育45min，然后在含有185M Bq 2-[1-14C]脱氧-D-葡萄糖和非放射性2-脱氧-D-葡萄糖的5ml Krebs-Henseleit缓冲液中温育10min至0.1mM的终浓度。然后将肌肉取出并在0.9％NaCl中洗5min，之后在0.5ml 1M NaOH中溶解并用液体闪烁计数测定放射性。
肌肉中蛋白质合成和降解.先前已描述了测定肌肉中蛋白质合成和降解的方法(Smith，K.L.& Tisdale，M.J.Increased protein degradation and decreased protein synthesisin skeletal muscle during cancer cachexia.Br.J.Cancer 67，680-685(1993))。使用结扎线切除腓肠肌并将其在缺少酚红的RPMI 1640培养基中于37℃温育30min，并用O2∶CO2(19∶1)饱和，然后用PBS洗。用2h的时期通过将L-[2，6-3H]苯丙氨酸(640MBq)掺入酸不溶解的物质中测量蛋白质合成，其中将肌肉在没有酚红的RPMI 1640培养基中于37℃温育，并用O2∶CO2(19∶1)饱和。然后将肌肉在非放射的培养基中漂洗，在2％高氯酸中涂污和匀浆。通过用酸溶解的放射性的量除以蛋白质结合的放射性的量来计算蛋白质合成速度。蛋白质降解通过2h时期内在3ml pH7.4、含有5mM葡萄糖和0.5mM放线酮的氧合的Krebs-Henseleit缓冲液中从腓肠肌释放的酪氨酸而测定。
蛋白酶体和胱天蛋白酶活性的测量.如先前针对肌管所描述的，通过测量7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)在360nm的激发波长和460nm的发射波长从荧光底物N-琥珀酰Lys Lys Val Tyr.AMC(SEQ ID NO：2)的释放而经荧光测量方法测定蛋白酶体的‘糜蛋白酶样’活性(Whitehouse，A.S.& Tisdale，M.J.Increased expression of theubiquitin-proteasome pathway in murine myotubes by proteolysis-inducing factor(PIF)isassociated with activation of the transcription factor NF-κB.Br.J.Cancer 89，1116-1122(2003))。将腓肠肌在20mM Tris，pH7.5，2mM ATP、5mM MgCl2和50mM DTT于4℃匀浆化、声波处理并于4℃以18,000g离心10min以沉淀不溶解的物质，将所得的上清液用于在存在或缺少蛋白酶体抑制剂乳胱素(10μM)时测量‘糜蛋白酶样’酶活性。只有乳胱素可抑制的活性被认为是真正的蛋白酶体活性。存在或缺少胱天蛋白酶-3(AcAspGluValAsp-CHO)(SEQ ID NO：5)或胱天蛋白酶-8(Ile Glu Phe Thr Asp-CHO)(SEQ ID NO：6)抑制剂(100μM)的情况下，使用来自上面的上清液(50μg蛋白质)和胱天蛋白酶-3或胱天蛋白酶-8底物(10μM)于37℃持续1h，通过AMC从AcAsp.Gly.Val.Asp.AMC(SEQ ID NO：3)的释放测定胱天蛋白酶-3的活性，通过7-氨基-4-三氟甲基香豆素(trifluromethylcoumarin)(AFC)从特定底物Z-Ile Glu Phe ThrAsp-AFC(SEQ ID NO：4)的释放测定胱天蛋白酶-8的活性。如上测定由于AFC的荧光的增加，而用400nm的激发波长和505nm的发射波长测量由于AFC的荧光的增加。缺少或存在胱天蛋白酶抑制剂时值的差异是活性的量度。
蛋白质印迹分析.将新切除的腓肠肌在PBS中洗涤并在PHOSPHOSAFETM提取试剂中于室温裂解5min，之后于4℃超声处理。将裂解液于4℃以18,000g离心5min而澄清，将胞质蛋白(5μg)的样品在12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳上于180V解析大约1h。之后将其转移至0.45μM硝酸纤维素膜，然后将其用pH 7.5、Tris-缓冲盐水中的5％Marvel于4℃封闭一晚上。一抗和二抗以1∶1000稀释使用，除了抗肌球蛋白(1∶250)。温育于室温持续1h，用ECL显影。用光密度计扫描印迹以定量差别。
将从用ZAG或PBS处理5天的大鼠上切除的附睾WAT、BAT和腓肠肌的样品在0.25M蔗糖、1mM HEPES，pH 7.0和0.2M EDTA中匀浆化，然后以4,500rpm离心10min。将胞质蛋白(10μg)的样品在12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳上解析，然后将其转移至0.45μM硝酸纤维素膜，将该膜用pH 7.5、Tris-缓冲盐水中的5％Marvel于4℃封闭一晚上，以后的四个15min用PBS中0.1％Tween洗涤，与二抗于室温温育1h。用ECL显影。
统计分析.针对至少三次重复实验，将结果显示为平均值±SEM。组之间的平均值差异通过单向方差分析(ANOVA)，之后是Tukey-Kramer多重比较检验而测定。小于0.05的P值认为是显著的。
结果-小鼠.ZAG的纯化导致大于95％纯的产物(图1A)，通过免疫印迹法证实为ZAG(图1B)。ZAG在附睾脂肪细胞中刺激脂解作用(图1D)但是在来自皮下和内脏沉积物的脂肪细胞中脂肪分解作用降低很多，尽管它超过基础水平显著地升高(图1E)。任何脂肪细胞组中，在异丙肾上腺素和ZAG之间，没有显著的脂解作用刺激程度差异，尽管在摩尔基础上ZAG较异丙肾上腺素更有效地诱导脂解作用。将5天时期中ZAG对ob/ob小鼠体重的影响显示在图1F中。虽然对照动物保持重量稳定，但是用ZAG治疗的动物显示渐进的体重减轻，这样5天之后组之间有3.5g重量差别，尽管实验过程中具有相等的食物(PBS 32±3.1g；ZAG 30±2.5g)和水(PBS140±8.2ml；ZAG 135±3.2ml)摄入。ZAG给予4天之后有0.4℃的显著体温上升(图1G)，表示基础代谢率的增加。血浆代谢水平的测量提示ZAG治疗的动物中代谢底物利用增加(表1)。因此在ZAG治疗的动物中血浆葡萄糖、甘油三酯(TG)和非酯化脂肪酸(NEFA)显著降低，尽管存在表示增加的脂解作用的增加的甘油浓度。存在血浆胰岛素水平36％的降低，提示ZAG在减少糖尿病状态中是有效的。将各种组织中的ZAGmRNA水平显示在图1C中。
表1-用ZAG治疗120h的ob/ob小鼠中的血浆代谢物和胰岛素水平
为了研究这个，在ZAG给予3天之后，在饲养的动物上进行了葡萄糖耐受性试验(图2A)。虽然PBS对照中血液葡萄糖水平显著地升高，但是在ZAG处理的动物中只有小的升高，在整个研究过程中其保持显著地低于对照组。此外在研究开始时ZAG处理的动物中血浆胰岛素水平显著地较低，并在60min的观察期间保持这样(图2B)。缺少胰岛素时ZAG给予增加葡萄糖摄取进附睾、内脏和皮下的脂肪细胞，存在低(1nM)胰岛素时ZAG给予也增加葡萄糖摄取进附睾和内脏脂肪细胞(图2C)。在ZAG处理的动物中，缺少或存在胰岛素(100nM)时葡萄糖摄取进腓肠肌也显著地增强(图2D)。ZAG处理的小鼠的腓肠肌中的葡萄糖摄取大于非处理的动物中对胰岛素的反应。
ZAG给予还减弱高血糖对骨骼肌萎缩的影响。因此用ZAG治疗的ob/ob小鼠显示腓肠肌和比目鱼肌湿重的显著增加(表1)。这与足底肌肉中蛋白质合成的超过两倍的增加(图3A)和蛋白质降解60％的降低(图3B)有关。来自用ZAG治疗的小鼠的腓肠肌显示蛋白酶体‘糜蛋白酶样’酶活性的降低的活性(图3C)——这与不肥胖小鼠中发现的不是显著的不同——和20S蛋白酶体α-亚基(图3D)、p42、19S调节子的ATP酶亚基(图3E)降低的表达，这提示泛素-蛋白酶体途径的降低的活性。ZAG治疗的小鼠中肌球蛋白水平增加(图3F)，而肌动蛋白水平不改变(图3G)。此外存在dsRNA-依赖性蛋白激酶(PKR)(图4A)和真核起始因子2α(eIF2α)(图4B)的磷酸化形式水平的降低，这已被显示引起肿瘤分解代谢因子诱发的肌肉萎缩，和高水平的细胞外葡萄糖。包括磷脂酶A2(PLA2)(图4C)、p38促分裂原活化蛋白激酶(图4D)和胱天蛋白酶3和8(图4E)在内的该途径的其它的酶在用ZAG治疗的ob/ob小鼠的腓肠肌中也被减弱。这些改变与肌肉内响应于ZAG的分解代谢信号传导的降低相当。
ZAG而不是异丙肾上腺素，增加脂肪细胞中磷酸HSL的表达，这被细胞外信号调节激酶(ERK)抑制剂PD9805914完全地减弱。虽然ZAG增加附睾脂肪细胞中HSL的表达，但是不存在皮下或内脏脂肪细胞中的增加(图5B-5D)。在脂肪甘油三酯脂酶(ATGL)的表达中观查到相似的情形(图5E-5G)。HSL和ATGL的表达与ERK的活性(磷酸)形式的表达相关(图5H-5J)。附睾脂肪细胞中HSL和ATGL的表达与响应于β3激动剂，BRL37344的增加的脂肪分解相关(图5K)。该结果提示，ZAG可协同地与β3激动剂起作用。
如先前所报道的，ZAG给予增加其在脂肪组织中的表达(图6A)。ZAG表达保持升高，缺少ZAG时在组织培养中持续另外3天(图6B)。缺少ZAG时在组织培养中脂肪细胞中的HSL表达也升高，持续3天(图6C)。ZAG的给予增加BAT(图6D)中的UCP1(图6D)和UCP3(图6E)以及骨骼肌中UCP3(图6F)的表达。解偶联蛋白的增加的表达将被期望如所观察的引导代谢底物形成热(图1G)。
21天之后，观察ob/ob小鼠中血浆代谢水平(表2)，具有表3中显示的监测的参数。观察到血液葡萄糖的进一步的下降(从2.03至15.2mM)和甘油的升高，这似乎较大，因为对照较以前较低。与天5时相比，在21天时观察到NEFA、TG或胰岛素没有改变(表1)。注意的是，显示血浆胰岛素下降的ZAG治疗的动物的胰腺中有多很多的胰岛素，这不是由于较低的胰岛素产生(例如，对胰腺β细胞的毒素将发生)，而更是由于在ZAG治疗的动物中需要较少的胰岛素来控制血液葡萄糖的事实。
表2-在21天时用ZAG治疗的ob/ob小鼠血浆代谢物和胰岛素水平
Figure BPA00001394859100231
表3-在21天时用ZAG治疗的ob/ob小鼠中监测的参数
  参数   PBS   ZAG   p
  开始重量   92.5±3.1   93.1±1.9
  结束重量   89.9±1.3   83.95±2.2
  食物(g)   135±6   145±4
  水(ml)   268±15   259±20
  BAT(g)   0.36±0.21   0.41±0.35
  腓肠肌(g)   0.26±0.15   0.39±0.12   0.01
 比目鱼肌(g)   0.15±0.06   0.18±0.07
此外，四天内ob/ob小鼠的体温增加0.5至1℃(图1G)并刚好在它们丧失重量的最大值之前达到峰值38.1℃(图7)。这将与棕色脂肪组织的重量相关，该重量从对照中的0.33±0.12g增加到ZAG治疗的动物中的0.52±0.08g(图7)。腓肠肌的重量也从0.2±0.05g增加到0.7±0.1g，而存在尿葡萄糖排泄中具有渐进地降低(图8A和8B)。
结果-大鼠.与异丙肾上腺素比较，人ZAG对大鼠附睾脂肪细胞的脂肪分解作用的显示在图11中。在浓度233和700nM之间ZAG产生甘油释放的剂量相关的增加，这种增加被抗-ZAG单克隆抗体减少，显示作用的特异性。大鼠脂肪细胞中脂解作用的程度与先前在小鼠中报道的相似。在小鼠中，ZAG的脂肪分解作用被β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂SR59230A完全减弱，提示ZAG的作用是通过β3-AR介导的。这些结果提示ZAG在诱导大鼠脂肪减少中可以是有效的。
每天单一静脉内注射ZAG(50βg/100g b.w.)对成熟的雄性Wistar大鼠(540±83g)体重的影响显示在图12A中。与给予相同体积的溶剂(PBS)的对照大鼠相比，给予ZAG的大鼠显示体重渐进地降低，这样10天之后，当用PBS处理的大鼠显示体重增加13g，而用ZAG处理的动物显示体重下降5g(表4)。研究过程期间两组的食物(ZAG：102±32g；PBS：98±25g)或水(ZAG：135±35ml；PBS：125±25ml)摄入没有差别，但是ZAG处理的动物显示体温一致的升高0.4℃，这在第一次给予ZAG的24h内是显著的(图12B)，表示提高的能量消耗。身体组成分析(表4)显示ZAG诱导的体重减轻是由于尸体脂肪的减少，这被瘦体重的显著增加部分地抵消。用ZAG处理的大鼠的血浆甘油浓度增加50％(表5)，表示增加的脂解作用，但非酯化脂肪酸(NEFA)的血浆水平降低55％，提示增加的利用。葡萄糖和甘油三酯的血浆水平也降低36-37％(表5)，也提示增加的利用。2脱氧葡萄糖摄取进用ZAG处理10天的大鼠的附睾脂肪细胞中显著增加，这在存在胰岛素时增加(图12C)。然而，存在胰岛素时葡萄糖摄取进来自PBS或ZAG处理的动物的脂肪细胞中无显著差异(图12C)。与PBS对照相比，葡萄糖摄取进用ZAG处理的大鼠的腓肠肌和BAT中有小的、非显著的增加，但是存在胰岛素时有摄取的显著增加(图12D)。这些结果提示血液葡萄糖的降低是由于BAT、WAT和骨骼肌的增加的利用，这得到所有三种组织中(图13)增加的葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)表达的支持。
表4-用PBS或ZAG处理之后雄性大鼠的身体组成
Figure BPA00001394859100241
将与用PBS处理的动物的差异显示为a，p＜0.05或b，p＜0.01
表5-用PBS或ZAG处理10天的大鼠中的血浆代谢物和胰岛素水平
  代谢物   PBS   ZAG
  葡萄糖(mmol/l)   25.5±2.3   16.2±2.1c
  甘油三酯(mmol/l)   1.75±0.01   1.1±0.09a
  甘油(umol/l)   300±52   450±51c
  NEFA(mEq/l)   0.58±0.008   0.26±0.06b
将与用PBS处理的动物的差异显示为a，p＜0.05；b，p＜0.01或c，p＜0.001
ZAG给予增加BAT和WAT中解偶联蛋白(UCP)1和3的表达几乎两倍(图13A和13B)，这将有助于增加的底物利用。在用ZAG处理的大鼠中，附睾脂肪组织中(图15)还有脂肪分解酶脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)和激素敏感性脂肪酶(HSL)的增加的表达，又是两倍的增加。ATGL主要引起甘油三酯分子中第一酯键的水解，形成二酰甘油，而由HSL将其转变成单酰甘油。用ZAG处理10天的大鼠的骨骼肌(图16A)、WAT(图16B)和BAT(图16C)的ZAG表达也显著地增加，显示外源性ZAG在外周组织中促进其自身产生。
用ZAG处理的大鼠腓肠肌的β-亚基上有dsRNA-依赖性蛋白激酶(PKR)和真核起始因子2(eIF2)的磷酸化形式表达的显著降低，而总量不变(图17A和17B)。在给予ZAG的ob/ob小鼠中已观察到相似的变化(未公布的结果)，该变化与骨骼肌中蛋白质降解的降低和蛋白质合成的增加一致。
实施例2
锌-β2-糖蛋白的间隔给予
观察到在ob/ob小鼠中长期每天给予ZAG导致体重减轻的停止。就这一点而论，决定中断3-4天，之后再输注ZAG导致连续的体重减轻和与高血糖相关的症状的改善。
尽管不想被理论束缚，但可以是受试者正接受太多的ZAG或如在TNF所看到的存在受体脱敏。每组中用2只小鼠进行试点研究以确定ZAG递送的最佳安排。在约3周中观察到从90g小鼠的8-10g体重减轻。
ZAG 5天之后将脂肪细胞从小鼠中除去，在缺少ZAG的培养之后测量对异丙肾上腺素(iso)的反应性(图9)。在ZAG处理的小鼠中对iso的反应性较高，这持续另外4天(这是当ZAG和HSL的表达增加时)，然后在第5天下降(当表达不增加时)到PBS对照的值。
实施例3
锌-β2-糖蛋白在ob/ob小鼠中减弱肌肉萎缩
该实施例显示这样的机制，通过该机制ZAG利用新研发的体外模型在ob/ob小鼠中减弱肌肉萎缩(Russell et al，Exp.Cell Res.315，16-25，2009)。这利用经受高浓度葡萄糖(10或25mM)的鼠肌管。如图18所示，高葡萄糖刺激蛋白质降解的增加(图18A)和蛋白质合成的降低(图18B)，这些作用都被ZAG(25μg/ml)完全地减弱。因此使用拮抗剂SR59230A测定是否ZAG的作用是通过β3-AR介导的。然而SR化合物(即SR59230A)还能充当β-激动剂，这似乎是它在这些实验中所做的。因此10和25mM葡萄糖诱导的蛋白质降解被ZAG和SR化合物减弱，该组合是加合的而不是拮抗的(图19)。对于蛋白质合成(图20)，SR化合物似乎与ZAG相似，没有相反的证据，而具有10mM葡萄糖，SR化合物引起蛋白质合成降低的增加。
实施例4
锌-β2-糖蛋白减少ROS形成
已显示反应性氧物质(ROS)的形成在高葡萄糖负荷诱导的蛋白质降解中是重要的。图21中的数据显示ZAG完全地减弱葡萄糖产生的ROS的增加，与蛋白质降解的降低一致(图18A)。高葡萄糖还诱导PKR的活化(磷酸化)(图22A)以及随后eIF2α的磷酸化(图22B)，如在ob/ob小鼠的骨骼肌中所见，这也可被ZAG减弱。这些结果提示，该体外模型对于研究ZAG如何在分子水平影响肌肉质量将是有用的。
实施例5
锌-β2-糖蛋白增加胰岛素耐受性
胰岛素耐受性试验也在给予ZAG持续3天的ob/ob小鼠中进行(图23)。通过腹腔内注射给予动物两个剂量的胰岛素(10和20U/kg)，在下一个60min内测量血液葡萄糖。如所能看到的(图23A)，用ZAG处理的动物较给予PBS的动物显示对胰岛素(10U/kg)增加的敏感性。在较高浓度的胰岛素(20U/kg)时这种差别消失(图23B)。针对20U/kg+PBS的葡萄糖消失曲线与10U/kg+ZAG几乎相同，所以在该剂量水平ZAG减少对胰岛素的需要量50％，但是这能通过给予更多的胰岛素而克服。
实施例6
锌-β2-糖蛋白的5天给予
附件1中显示的数据是来自5天研究，其中每天静脉内给予ZAG 35μg持续5天。在实验结束时将组织除去并印迹，或用分离出的脂肪细胞进行功能试验。如图6A所能看出的，ZAG给予增加其在附睾(ep)、皮下(sc)和内脏(vis)脂肪中的表达约两倍。当制备ep脂肪细胞并将其保持在组织培养(RPMI 1640+10％FCS)中时，ZAG表达维持另外3天，即使没将ZAG加入到培养基中(图6B)。此外来自ZAG处理的小鼠的脂肪细胞显示对异丙肾上腺素(10μM)增加的反应，这也在缺少ZAG时在组织培养中保持4天(图9)。对异丙肾上腺素的增加的反应是由于ZAG引起的HSL的增加的表达，这也在缺少ZAG时在组织培养中保持4天(图6C)。这些结果显示当撤回ZAG时，ZAG的作用保持另外3天，因此不需要每天给予。实际上，如上面所讨论的，太多的ZAG更可能导致抵抗而不是增加的反应。
5天ZAG之后在ep脂肪细胞中只看到增加的HSL的表达(图5B-5D)，ATGL也如此(图5E-5G)。只在ep脂肪组织中有增加的pERK表达(图5H-5J)，pERK的抑制剂(PD98059 10μM)减弱与ZAG温育3h的ep脂肪细胞中HSL表达的增加(图5A)。ZAG增加BAT(图6D和6E)和肌肉(图6F)中UCP1和UCP3的表达，这将解释体温的增加和血清中TG和NEFA的降低，尽管脂解作用的增加。
尽管已参考上面的实施例描述了本发明，将理解的是修改和变型都包括在本发明的精神和范围内。因此，本发明只由以下权利要求进行限定。
Figure IPA00001394858600021
Figure IPA00001394858600031

Claims (50)

1.改善受试者中高血糖的症状的方法，包括给予需要这样治疗的所述受试者治疗有效剂量的具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽或其片段，持续约10天或更长时间，其中治疗之后与高血糖相关的症状得以改善。
2.权利要求1所述的方法，其中所述治疗包括每天给予所述多肽，持续10天。
3.权利要求1所述的方法，其中所述治疗包括每天给予所述多肽，持续21天。
4.权利要求1所述的方法，其中每隔一天、每两天或每三天给予所述多肽，持续达21天。
5.权利要求1所述的方法，其中所述症状的改善包括与治疗之前的血清水平相比，选自葡萄糖血清水平的降低、甘油三酯血清水平的降低、胰岛素血清水平的降低和非酯化脂肪酸血清水平的降低的一种或多种症状。
6.权利要求1所述的方法，其中所述症状的改善包括与治疗之前的体温相比，在开始治疗的4天内体温增加约0.4℃至1℃。
7.权利要求1所述的方法，其中所述症状的改善包括与治疗之前的血浆胰岛素水平相比，在开始治疗的三天内血浆胰岛素水平的降低。
8.权利要求7所述的方法，其中与治疗之前血浆胰岛素水平相比，血浆胰岛素水平降低36％。
9.权利要求7所述的方法，其中与治疗之前血浆葡萄糖和甘油三酯水平相比，血浆葡萄糖和甘油三酯水平降低约36％。
10.权利要求1所述的方法，其中所述症状的改善包括开始治疗的三天内响应于静脉内葡萄糖(2g/kg)，血液葡萄糖水平和胰岛素分泌的正常化。
11.权利要求1所述的方法，其中所述症状的改善包括与治疗之前的胰腺胰岛素水平相比，胰腺胰岛素水平的增加。
12.权利要求1所述的方法，其中所述症状的改善包括与治疗之前UCP1和UCP3的表达相比，解偶联蛋白-1(UCP1)和解偶联蛋白-3(UCP3)在棕色脂肪组织中增加的表达。
13.权利要求1所述的方法，其中所述症状的改善包括与治疗之前UCP3的表达相比，UCP3在骨骼肌中增加的表达。
14.权利要求1所述的方法，其中每天给予所述多肽两次。
15.权利要求1所述的方法，其中静脉内、皮下、腹膜内或口服给予所述多肽。
16.权利要求1所述的方法，其中每三天给予所述多肽一次。
17.权利要求1所述的方法，其中将所述多肽与β3激动剂组合给予。
18.权利要求17所述的方法，其中所述β3激动剂是BRL37344。
19.权利要求1所述的方法，其中将所述多肽与β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂组合给予。
20.权利要求19所述的方法，其中所述β3-AR拮抗剂是SR59230A。
21.权利要求1所述的方法，其中所述多肽是糖基化的。
22.降低受试者中血浆胰岛素水平的方法，包括给予所述受试者治疗有效剂量的具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽或其片段。
23.权利要求22所述的方法，其中将所述多肽给予所述受试者持续达10天的时间，其中治疗之后血浆胰岛素水平降低。
24.权利要求22所述的方法，其中将所述多肽给予所述受试者持续达21天的时间，其中治疗之后血浆胰岛素水平降低。
25.权利要求22所述的方法，其中所述血浆胰岛素水平的降低发生在给予所述多肽的3天内。
26.权利要求24所述的方法，其中与给予所述多肽之前的血浆胰岛素水平相比，血浆胰岛素水平降低36％。
27.权利要求24所述的方法，其中与给予所述多肽之前的血浆葡萄糖和甘油三酯水平相比，血浆葡萄糖和甘油三酯水平降低36％。
28.权利要求22所述的方法，其中将所述多肽与β3激动剂组合给予。
29.权利要求28所述的方法，其中所述β3激动剂是BRL37344。
30.权利要求22所述的方法，其中将所述多肽与β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂组合给予。
31.权利要求30所述的方法，其中所述β3-AR拮抗剂是SR59230A。
32.权利要求22所述的方法，其中所述多肽是糖基化的。
33.增加受试者中骨骼肌质量的方法，包括给予所述受试者具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽或其片段。
34.权利要求33所述的方法，其中所述骨骼肌是腓肠肌或比目鱼肌。
35.权利要求33所述的方法，其中将所述多肽给予所述受试者持续达10天的时间，其中治疗之后骨骼肌质量增加。
36.权利要求33所述的方法，其中将所述多肽给予所述受试者持续达21天的时间，其中治疗之后骨骼肌质量增加。
37.权利要求33所述的方法，其中将所述多肽与β3激动剂组合给予。
38.权利要求37所述的方法，其中所述β3激动剂是BRL37344。
39.权利要求33所述的方法，其中将所述多肽与β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂组合给予。
40.权利要求39所述的方法，其中所述β3-AR拮抗剂是SR59230A。
41.权利要求33所述的方法，其中所述多肽是糖基化的。
42.权利要求33所述的方法，其中所述受试者具有癌症、AIDS、败血病、COPD、肾衰竭、关节炎、充血性心力衰竭、肌肉营养不良症、糖尿病或衰老的少肌症。
43.治疗受试者以引起体重减少或肥胖减少的方法，包括给予需要这样治疗的所述受试者治疗有效剂量的β3激动剂联合具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽或其片段。
44.权利要求43所述的方法，其中所述β3激动剂是BRL37344。
45.权利要求43所述的方法，其中所述多肽是糖基化的。
46.治疗受试者以引起体重减少或肥胖减少的方法，包括给予需要这样治疗的所述受试者治疗有效剂量的β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂联合具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽或其片段。
47.权利要求46所述的方法，其中所述β3-AR拮抗剂是SR59230A。
48.权利要求46所述的方法，其中所述多肽是糖基化的。
49.药物组合物，其包括具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽和β3激动剂。
50.药物组合物，其包括具有如SEQ ID NO：1中所显示序列的多肽和β3-肾上腺素能受体(β3-AR)拮抗剂。
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