WO2019066590A1 - Zag 유래 펩타이드 및 그의 용도 - Google Patents

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이광훈
권여선
이은성
김장일
김형구
이환철
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주식회사 엘앤씨바이오
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Definitions

  • the present invention relates to ZAG (Zinc-alpha-2-glycoprotein) protein-derived peptides and uses thereof.
  • the epidermis located at the outermost part of the skin, performs a protective function to protect against external physical, chemical and atopic mechanical stimuli and to prevent excessive exudation of body water through the skin.
  • This protective function is possible by normally forming and maintaining the stratum corneum composed of keratinocytes.
  • the keratinocyte produces intercellular lipids such as natural moisturizing factors, ceramides, cholesterol and fatty acids, and acts as a skin barrier, since the stratum corneum acts as a barrier against the outside.
  • Dry skin syndrome which is considered to be one of the major diseases of modern society, is one of the symptoms caused by skin barrier function abnormality. Recently, it has become increasingly important for skin diseases such as environmental pollution, increase of dry environment such as high rise buildings, increase in social stress, excessive bath culture, It is increasing more and more due to various factors, and the cases where the symptoms are severe and require treatment are also continuously increasing. Atopic dermatitis is also known to be a major cause of dry skin syndrome, and more fundamentally, abnormal skin barrier function.
  • Atopic dermatitis is a chronic and recurrent skin disease with a prevalence of 20% in infancy, 1% to 3% in adults, and is an immune disease caused by genetic and environmental factors.
  • Atopic dermatitis is chronic, it feels dryness of the skin, it is prone to pruritus, and it is easily induced by various stimuli. In severe cases, subacute lesions of erythematous rash with exudative lesions and chronic lesions with thickened skin are progressed.
  • the main pathological changes in atopic dermatitis are the immunological and skin barrier abnormalities.
  • the activity of type 2 T-cells, dendritic cells, eosinophils, etc. due to specific allergens may lead to inflammatory reactions leading to skin barrier abnormalities.
  • Immunoglobulin E (E) is increased in 80 ⁇ 90% of patients with atopic dermatitis. Serum immunoglobulin E levels are high in patients with respiratory atrophy such as allergic rhinitis and asthma.
  • Immunotherapy and pharmacotherapy are being used to treat atopic dermatitis.
  • drugs include steroids, calcineurin inhibitors, immunomodulators, antihistamines, and the like.
  • Steroids and calcineurin inhibitors which are topical preparations, may have side effects such as skin atrophy and vasodilation during prolonged application although they have a short-term effect.
  • Antihistamine a systemic oral preparation, has little effect.
  • moisturizers using ceramides have been used in the pharmaceutical and cosmetic fields to restore dry and broken skin barrier. Despite these medications, adequate treatment for atopic dermatitis has not yet been resolved.
  • Patent Document 1 Korean Patent Application No. 10-2017-0028169 is an invention disclosed for the improvement of skin dryness or skin barrier of ZAG protein and the use of anti-allergy.
  • ZAG proteins of the present invention peptides having excellent effects on skin dryness, skin barrier improvement and antiallergic activity were identified and their effects were confirmed.
  • the present invention provides ZAG (Zinc-alpha-2-glycoprotein) protein-derived peptides and uses thereof.
  • the present inventors have found peptides having particularly excellent effects on skin dryness, skin barrier improvement, anti-allergy and anti-inflammation.
  • the present invention relates to the use of a peptide derived from ZAG protein for the preparation of a medicament or cosmetic for preventing, treating or ameliorating skin dryness or skin barrier function, the use of a peptide derived from ZAG protein for the production of an antiallergic medicament or cosmetic, The use of ZAG protein-derived peptides for the manufacture of anti-inflammatory drugs or cosmetics.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing, treating or ameliorating dry skin or skin barrier function comprising the ZAG protein-derived peptide as an active ingredient, a pharmaceutical composition for preventing, treating or ameliorating a skin barrier or a skin barrier function, An anti-allergy pharmaceutical composition comprising the ZAG protein-derived peptide as an active ingredient, an anti-allergy cosmetic composition containing the ZAG protein-derived peptide as an active ingredient, and a peptide derived from ZAG protein, An anti-inflammatory medicament or a cosmetic composition.
  • the present invention also relates to a method for the prevention, treatment or amelioration of a dry skin disorder or skin barrier function comprising administering to a subject a therapeutically or physiologically effective amount of a ZAG protein-derived peptide, a therapeutically or physiologically effective amount of a ZAG
  • a method of preventing, treating or ameliorating an allergic disease comprising administering to a subject a peptide derived from a protein, comprising administering to the subject a therapeutically or physiologically effective amount of a ZAG protein-derived peptide, Thereby providing an improvement method.
  • the term " ZAG protein-derived peptide " Quot means an active peptide exhibiting a dry skin dryness or skin barrier function improving effect.
  • the " ZAG protein-derived peptide &quot may be a peptide consisting of 10-mer or more and 50-mer or less amino acid sequence containing a fragment of ZAG protein.
  • a fragment of the ZAG protein contained in the " ZAG protein-derived peptide " may be, for example, 10-mer or more and 50-mer or less, for example, 10-mer to 30- -mer, 10-mer to 20-mer, 10-mer to 15-mer consecutive amino acid sequences.
  • the fragment of the ZAG protein may consist of a consecutive amino acid sequence of 10-mer to 30-mer in the amino acid sequence that makes up the ZAG protein.
  • the fragment of the ZAG protein may be composed of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOS: 1-19.
  • the fragment of the ZAG protein may be composed of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOS: 20 to 26.
  • ZAG protein-derived peptide is used interchangeably with “fragment of ZAG protein” in some explanations.
  • the ZAG protein-derived peptide may be composed of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOS: 1-19.
  • the ZAG protein-derived peptide may be composed of any one of the amino acid sequences selected from SEQ ID NOs: 20 to 26.
  • the following examples disclose ZAG protein-derived peptides that exhibit dry skin, improved skin barrier function, anti-allergic or anti-inflammatory properties.
  • the "ZAG protein-derived peptide" of the present invention may be the ZAG protein-derived peptides of Z1 to Z18 shown in Table 1 (SEQ ID NOS: 1 to 18, respectively). These peptides were found to have dry skin or skin barrier function improving effect, anti-allergic effect and anti-inflammatory effect. In particular, it was confirmed that the ZAG protein-derived peptide of Z3 has an immunosuppressive effect equivalent to that of the ZAG protein, thus exhibiting the effect of improving atopic dermatitis.
  • ZAG protein derived peptide is a peptide derived from Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer- 26). ≪ / RTI >
  • the peptides of Z1 to Z18 or Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer-3 and Z15mer-4 are merely examples of "ZAG protein derived peptides"
  • the "ZAG protein derived peptide” may be a partial sequence of Z1 to Z1 or some of Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer-3 and Z15mer-4.
  • some of the peptides may be a combined peptide.
  • the "ZAG protein-derived peptide” is, for example, a peptide of Z1 to Z18 or a peptide of Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer- , Preferably at least 80%, more preferably at least 90%, and most preferably at least 95% sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, respectively.
  • the present invention relates to a method for producing a cell-permeable peptide having a peptide of Z1 to Z18 or a peptide of Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer- , A targeting sequence, a tag, a labeled residue, an amino acid sequence for increasing half-life or peptide stability, or the like.
  • the " ZAG protein-derived peptide " according to the present invention may also include functional variants thereof.
  • Such functional variants include biological equivalents of " ZAG protein-derived peptides " described herein.
  • additional changes can be made to the amino acid or polynucleotide sequence of the peptide to further improve the binding affinity and / or other biological properties of the peptide.
  • Such modifications include deletion of the amino acid sequence residues of the antibody. Insertion, and / or substitution, and are based on the relative similarity of amino acid side chain substituents, such as hydrophobicity, hydrophilicity, charge size, and the like.
  • arginine, lysine and histidine are both positively charged residues; Alanine, glycine and serine have similar sizes; Phenylalanine, tryptophan and tyrosine have similar shapes. Based on these considerations, therefore, arginine, lysine and histidine; Alanine, glycine and serine; And phenylalanine, tryptophan and tyrosine are biologically functional equivalents.
  • the peptides of the present invention can be obtained by a variety of methods well known in the art. As an example, it can be produced by polynucleotide recombination and protein expression system, by synthesis in vitro through chemical synthesis such as peptide synthesis, and by cell-free protein synthesis.
  • a protecting group may be attached at the terminal.
  • the protecting group may be an acetyl group, a fluorenylmethoxycarbonyl group, a formyl group, a palmitoyl group, a myristyl group, a stearyl group or a polyethylene glycol (PEG), but it is preferable to modify the peptide,
  • the ingredients may be included without limitation.
  • the term " stability " also refers to the storage stability (e.g., room temperature storage stability) as well as the in vivo stability that protects the peptide of the present invention from attack by a protein cleaving enzyme in vivo.
  • the " ZAG protein-derived peptide " of the present invention is not limited thereto, but may be included in the pharmaceutical composition or cosmetic composition in an amount of 0.0001 to 50% by weight based on the total weight of the composition.
  • the pharmaceutical composition or cosmetic composition according to the present invention may further contain one or more active ingredients showing the same or similar functions in addition to the " ZAG protein-derived peptide ".
  • the " ZAG protein-derived peptide " of the present invention can be used as a pharmaceutical or physiologically or cosmetically acceptable carrier such as a colloidal suspension, powder, saline solution, lipid, liposome, microspheres, Or the like. They may be associated with or associated with carriers and may be in the form of lipids, liposomes, microparticles, gold, nanoparticles, polymers, condensation reagents, polysaccharides, polyamino acids, dendrimers, saponins, And can be delivered in vivo using known delivery systems.
  • a pharmaceutical or physiologically or cosmetically acceptable carrier such as a colloidal suspension, powder, saline solution, lipid, liposome, microspheres, Or the like. They may be associated with or associated with carriers and may be in the form of lipids, liposomes, microparticles, gold, nanoparticles, polymers, condensation reagents, polysaccharides, polyamino acids, dendrimers
  • pharmaceutically or physiologically or cosmetically acceptable carriers may be formulated with pharmaceutically acceptable carriers such as lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, starch, acacia, rubber, calcium phosphate, alginate, gelatin, But may include calcium silicate, microcrystalline cellulose, polyvinylpyrrolidone, cellulose, water, syrup, methyl cellulose, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, But is not limited thereto.
  • a lubricant, a wetting agent, a sweetener, a flavoring agent, an emulsifying agent, a suspending agent, a preservative, and the like may be further included.
  • the term " dry skin syndrome " refers to all the symptoms that arise from dryness of the skin due to lack of moisture in the skin.
  • the skin dryness syndrome of the present invention is not particularly limited as far as the symptom is caused by drying of the skin due to lack of moisture of the skin.
  • the term " skin barrier function &quot refers to all the functions of the skin, particularly, the stratum corneum of the epidermis, which functions as a barrier layer against the outside, such as preventing water outflow to the outside, ,
  • skin barrier function abnormality &quot means any condition in which the skin barrier function is degraded or damaged, as well as the possibility of deterioration or damage, or the need to prevent the skin barrier function.
  • the skin barrier function abnormality in the present specification is not particularly limited as far as the symptom is caused by the deterioration or damage of the skin barrier function.
  • the disease which exhibits dry skin disorder or skin barrier function abnormality may be atopic dermatitis. It has been confirmed that the peptide derived from ZAG protein according to the present invention has an excellent effect for prevention, treatment and improvement of atopic dermatitis.
  • the inventors of the present invention have found that treatment of ZAG protein on the epidermis can lower the level of various inflammatory cytokines, histamine, as well as Th2 cells associated with various immune responses and thus inflammatory responses. Furthermore, the inventors of the present invention have found that the ZAG protein increases the level of regulatory T cell, an immunoregulatory cell.
  • inflammatory cytokines and Treg cells may be associated with the progression of allergic diseases, particularly atopic dermatitis.
  • the inventors of the present invention have found that levels of IL-4, IL-5 and IL-13 secreted by Th2 cells and levels of IL-17 secreted by Th17 cells are significantly increased in the blood of patients with atopic dermatitis .
  • an increase in the level of IL-17 may be one of the immunological-specific characteristics.
  • lowering the level of expression of inflammatory cytokines, particularly the levels of Th2 cells, Th17 cellular cytokines may be a key in inhibiting inflammatory responses and in the prevention and treatment of atopic dermatitis and allergic diseases .
  • Treg cells can be reduced at lesion sites of atopic dermatitis compared with normal subjects.
  • Treg cells serve as priming dendritic cells acting on Th1, Th2, and Th17 cells as immunoregulatory cells, as well as inhibiting the inflammatory reaction and inhibiting the activity of allergen-specific Th2 cells directly, Can minimize the production of the essential cytokines IL-4, IL-5 and IL-13 during the step.
  • Treg cells may play an important role in tissue remodeling by directly acting on mast cells, basophils, and eosinophils, inhibiting allergic inflammation and interacting with tissue cells, and may directly affect B cells and cause allergic antigen-specific IgE Production can be inhibited and the production of IgG4 can be induced.
  • mechanisms that enhance or elevate Treg cell function may be important in inhibiting the immune response, or the inflammatory response caused thereby.
  • such mechanisms may be important in the prevention and treatment of allergic diseases, specifically atopic dermatitis.
  • the inventors of the present invention have recognized that the ZAG protein capable of regulating levels of inflammatory cytokines and Treg cells can be provided as an anti-allergic pharmaceutical composition effective for the prevention or treatment of allergic diseases, and further as an anti-inflammatory pharmaceutical composition Respectively.
  • the present invention further provides an anti-allergy medicine or cosmetic composition comprising a peptide derived from ZAG protein, a pharmaceutical or cosmetic composition for preventing, treating or ameliorating an allergic disease, and a pharmaceutical or cosmetic composition for anti-inflammation.
  • the anti-allergy pharmaceutical composition, the pharmaceutical composition for the prevention or treatment of allergic diseases, and the anti-inflammatory composition according to an embodiment of the present invention can be used as a composition for preventing or treating various allergic diseases.
  • the anti-allergenic pharmaceutical composition can be used as an anti-allergic medicament for allergic diseases including anaphylaxis, allergic rhinitis, asthma, atopic dermatitis, insect allergies, food allergies, drug allergies and urticaria Can be used to prevent or treat diseases.
  • the anti-allergy pharmaceutical composition according to one embodiment of the present invention may be effective for use as a composition for preventing or treating atopic dermatitis, but the present invention is not limited thereto.
  • the anti-inflammatory pharmaceutical composition comprising the ZAG protein-derived peptide according to an embodiment of the present invention can inhibit the inflammatory reaction by lowering the level of the inflammatory cytokine and is effective for inflammatory skin diseases, particularly atopic dermatitis .
  • " prevention " used in the present invention refers to the treatment of skin dryness, skin barrier function abnormality, allergy disease or allergy by administration of a pharmaceutical composition or cosmetic composition comprising the ZAG protein- Or " inflammation. &Quot;
  • " treatment " used in the present invention refers to the treatment of skin dryness, skin barrier function abnormality, allergy disease or allergy by administration of a pharmaceutical composition or cosmetic composition comprising the ZAG protein- Or " inflammation " symptom is to be improved or benefited.
  • &quot improvement " as used in the present invention refers to the treatment of skin dryness, skin barrier function abnormality, allergic disease or allergy by administration of a pharmaceutical composition or cosmetic composition comprising the ZAG protein- Or " inflammation " is relieved.
  • &quot means a subject in need of prevention, treatment and improvement of "dry skin syndrome", “skin barrier function abnormality”, “allergic disease or allergy” Or mammals such as non-human primates, mice, dogs, cats, horses and cattle.
  • ZAG protein-derived peptides can be administered to a subject via parenteral or oral administration.
  • ZAG protein derived peptides are used for prevention, treatment, or amelioration of "dry skin syndrome", “skin barrier function abnormality”, “allergic disease or allergy” or “inflammation”
  • a pharmaceutical or cosmetic composition in a form applicable to the skin, and can be administered topically.
  • Forms of topical administration include, but are not limited to, application to the skin, transdermal permeation using microneedles, intradermal injection, and the like.
  • the composition may further comprise additional pharmacological or physiologically acceptable carrier, excipient, diluent in addition to the ZAG protein-derived peptide described above for administration.
  • suitable carriers, excipients and diluents that may be included in such a composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, Methylcellulose, amorphous cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium tealeate, and mineral oil.
  • the composition may further include conventional fillers, extenders, binders, disintegrants, surfactants, anti-coagulants, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers, preservatives and the like in the case of pharmaceutical
  • compositions include solutions, emulsions (including micro-emulsions), suspensions, creams, lotions, gels, powders, or other typical solid or liquid compositions used for application to skin and other tissues to which the present compositions may be applied .
  • Such compositions may contain additional antimicrobials, moisturizers and hydration agents, penetration agents, preservatives, emulsifiers, natural or synthetic oils, solvents, surfactants, detergents, gelling agents, emollients, antioxidants, fragrances, fillers, thickeners, waxes, odor absorbers, dyestuffs, colorants, powders, viscosity-controlling agents and water.
  • an anesthetic an anti-itch active, a botanical extract, a conditioning agent, a darkening or lightening agent, a glitter, a wetting agent humectants, mica, minerals, polyphenols, silicones or derivatives thereof, sunblocks, vitamins, and phytomedicinal.
  • One embodiment of the present invention can provide a cosmetic composition comprising a peptide derived from ZAG protein, and specifically can be a cosmetic composition for atopic skin improvement, anti-allergic or anti-inflammatory.
  • the cosmetic composition may have a formulation selected from the group consisting of suspensions, emulsions, gels and pastes, but is not limited thereto.
  • the dosage of the composition varies depending on the subject's body weight, age, sex, health condition, diet, administration time, administration method, excretion rate, and severity of disease.
  • the daily dose is, but not limited to, about 0.001 to 100 mg / kg, for example, 0.01 to 10 mg / kg.
  • the composition may be administered once to several times a day.
  • the present invention provides a method of preventing, treating or ameliorating a dry skin disorder or a skin barrier function comprising administering to a subject a therapeutically or physiologically effective amount of a ZAG protein-derived peptide.
  • the ZAG protein peptide according to the present invention has the effect of reducing the immune response to acute and chronic atopic dermatitis and thus has the effect of improving the atopic dermatitis. It is possible to reduce the immune response and decrease the expression of IgE, , Skin barrier function abnormality, allergic disease, inflammation, and the like.
  • Figure 1 shows the results of atopic dermatitis test of each peptide in vitro.
  • (a) shows the results in RAW 264.7 macrophages
  • (b) shows the results in RBL-2H3 mast cells
  • (c) shows the results in keratinocyte
  • Fig. 2 shows the results of atopic dermatitis test of each peptide in Table 4 in vitro.
  • (a) shows the results in RAW 264.7 macrophages
  • (b) shows the results in RBL-2H3 mast cells
  • (c) shows the results in keratinocyte
  • peptide candidate sequences (Z1 to Z18, SEQ ID NO: 19) were designed so that 15 amino acids were overlapped in 298 total amino acid sequences (GenBank: AAH05306.1) 1 to 18) were set.
  • Each peptide was prepared by solid phase synthesis.
  • the peptides synthesized in the present invention showed a purity of 90% or more by HPLC analysis.
  • the purified peptides were identified by mass spectrometry (Table 1: peptide candidates and amino acid sequences used to identify ZAG protein active sites).
  • Atopic dermatitis efficacy test was conducted to select the amino acid sequence corresponding to the core active region of ZAG, which is effective in mitigating atopic symptoms in 18 peptide candidate groups.
  • ZAG peptide candidate group Z1-Z18, SEQ ID NOS: 1 to 18
  • ZAG protein Z0, SEQ ID NO: 19
  • the immune response was confirmed by treating the stimulator with time.
  • the positive control group was treated with the stimulator alone and the negative control group was treated with the vehicle alone without the stimulator (Table 2: Atopic dermatitis effect test method).
  • the enzyme is produced by immune cells, and histamine initiates an inflammatory reaction.
  • cytokines such as tumor necrosis factor- ⁇ and TNF- ⁇ and interleukin-6 and IL-6
  • the substance is destroyed or other immune cells are collected to initiate an inflammatory reaction.
  • Interferon- ⁇ , an inflammation-inducing substance, and efficacy test using interferon- ⁇ and skin inflammation related factor CCL-17 / TARC (thymus- and activation-regulated chemokine) are also used to confirm the immune response.
  • Example 1-2 Atopic dermatitis efficacy test using mast cell
  • the concentration of Histamine in the cell culture medium was determined by ELISA assay after treatment with 1 ⁇ g / ml of PMA and 1 ⁇ g / ml of A23187 for 12 hours in the mast cell (RBL-2H3).
  • the concentration of histamine was significantly lower than in the experimental group treated with only the stimulator.
  • Example 1-3 Keratinocyte Atopic dermatitis effect test using
  • Example 1-4 Atopic dermatitis efficacy test using B lymphocytes
  • B lymphocytes (RPMI 1788) were treated with 0.1 ⁇ g / ml of LPS stimulator for 24 hours, and the concentration of IgE eluted in the cell culture medium was confirmed by ELISA assay. Z0, Z3 to Z8, Z12 to Z14 and Z16 to Z18, respectively.
  • Example 1-5 Atopic dermatitis efficacy test using T lymphocytes
  • Atopic dermatitis efficacy tests on T lymphocytes were carried out with six peptide candidate groups (Z3, Z4, Z5, Z12, Z14, and Z15) that were judged to have efficacy in the results of the foregoing Examples 1-1 to 1-4.
  • IL-2 treatment with 50 ng / ml of T-lymphocyte stimulator for 12 hours, IL-4 concentration in cell culture medium was confirmed by ELISA assay. At this time, IL-4 was significantly decreased in the treated sample groups Z3, Z4, Z5, Z12, Z14, and Z15.
  • ZAG3-derived oligopeptides were further synthesized (Table 4) based on ZAG3 peptide (ZAG3) selected as the core active region of ZAG, which has effect on mitigating atopic symptoms in 18 peptide candidates of Z1 to Z18.
  • ZAG3 peptide ZAG3 peptide selected as the core active region of ZAG, which has effect on mitigating atopic symptoms in 18 peptide candidates of Z1 to Z18.
  • ZAG3 peptide ZAG3 peptide
  • Each of the peptides in Table 4 was prepared by solid phase synthesis.
  • the peptides synthesized in the present invention showed a purity of 90% or more by HPLC analysis.
  • the purified peptides were identified by mass spectrometry.
  • atopic dermatitis The test was conducted. After treatment with various immune cells for 24 hours at a concentration of 1 ⁇ g / mL, Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer-3 and Z15mer- stimulators were treated with time to confirm the immune response.
  • the atopic dermatitis efficacy test was carried out in the same manner as in Examples 1 and 2.
  • the experimental group consisted of the stimulator and the ZAG3 or ZAG3-derived oligopeptides (Z20mer-1, Z20mer-2, and Z20mer-2) in the test group: Negative control: vehicle treated group (Neg), positive control group: stimulator treated group Z15mer-3, Z15mer-3, Z15mer-3, Z15mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer-3 and Z15mer-4.
  • concentration of the cells was measured by ELISA using the culture medium.
  • Example 2-1 Atopic dermatitis efficacy test using Macrophage
  • the concentration of IL-6 eluted in the cell culture medium was confirmed by ELISA assay after treatment with macrophage (RAW 264.7 cell) stimulator LPS at a concentration of 0.1 ⁇ g / ml for 24 hours.
  • the IL-6 concentration was significantly reduced in the ZAG3, 20mer-3, 15mer-1, 15mer-2, 15mer-3 and 15mer-4 treated groups as compared to the positive control group (Pos )
  • Example 2-2 Atopic dermatitis efficacy test using mast cell
  • the concentration of Histamine in the cell culture medium was determined by ELISA assay after treatment with 1 ⁇ g / ml of PMA and 1 ⁇ g / ml of A23187 for 12 hours in the mast cell (RBL-2H3).
  • Histamine release decreased in all oligopeptides treated ( Figure 2-b)
  • Example 11-3 Keratinocyte Atopic dermatitis effect test using
  • Example 2-4 Atopic dermatitis efficacy test using B lymphocytes
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Abstract

본 발명은 ZAG(Zinc-alpha-2-glycoprotein) 단백질 유래 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 ZAG 단백질 유래 펩타이드는 급성, 만성 아토피 피부염에서 보여지는 다양한 면역인자들의 발현 감소 효과를 보이며, 면역 반응 감소, IgE의 발현을 감소시킴으로써 아토피 피부염과 같은 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 이상, 알러지 질환, 염증 등을 예방, 치료 또는 개선하기 위해 사용될 수 있다.

Description

ZAG 유래 펩타이드 및 그의 용도
본 발명은 ZAG(Zinc-alpha-2-glycoprotein) 단백질 유래 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.
피부의 최외각에 위치하고 있는 표피는 외부의 다양한 물리적, 화학적 및 아토피 기계적 자극에 대한 방어 및 피부를 통한 체내 수분의 과도한 발산을 막는 보호 기능을 수행한다. 이러한 보호기능은 각질형성세포로 구성된 각질층이 정상적으로 형성되고 유지됨으로써 가능하다.
각질형성세포는 천연 보습인자와 세라마이드, 콜레스테롤 및 지방산과 같은 세포 간 지질을 생성하여 각질층이 외부와의 차단층 역할을 하게 됨으로써 피부 장벽으로서의 기능을 보유하게 된다.
현대 사회의 주요 질환의 하나로 여겨지는 피부 건조증은 피부 장벽 기능 이상에 의해 야기되는 증상의 하나로, 최근 환경오염, 고층건물과 같은 건조한 환경의 증가, 사회적 스트레스의 증가, 과도한 목욕 문화, 피부 노화 등과 같은 여러가지 요인에 의해 점점 더 증가하고 있으며, 증세가 심하여 치료를 필요로 하는 경우 또한 지속적으로 증가하고 있다. 아토피 피부염 역시 피부 건조증, 보다 근본적으로는 피부 장벽 기능의 이상을 주요 원인으로 하는 것으로 알려져 있다.
아토피 피부염은 만성, 재발성의 피부 질환으로 영, 유아기에서는 20%, 성인에서는 1~3%의 유병률을 보이며, 유전인자와 환경인자가 관여하여 발병하는 면역성 질환이다. 아토피 피부염은 만성적으로 피부 건조증을 느끼며, 소양감이 심하고 각종 자극에 의해 쉽게 피부염이 유발된다. 증상이 심한 경우에는 삼출을 동반한 홍반성 발진의 아급성 병변, 피부가 두꺼워지는 만성 병변으로 진행된다.
아토피 피부염의 주된 병리학적 변화는 면역학적 이상 반응과 피부 장벽의 이상 반응이다. 특정 알레르겐으로 인한 제2형 보고 T 세포, 수지상 세포, 호산구 등의 활성이 염증반응으로 이어져 피부 장벽의 이상을 초래하기도 한다. 또한, 아토피 피부염 환자의 80~90%는 혈청 면역글로블린 E (Immunoglobulin E)가 증가되는데, 특히 알러지성 비염이나 천식 등의 호흡기 아토피가 동반되는 경우는 혈청 면역글로블린 E의 수치가 높게 나타난다.
아토피 피부염의 치료법으로는 면역요법과 약물요법이 시행되고 있다. 대표적으로 사용되는 약물은 스테로이드제, 칼시뉴린억제제, 면역조절제, 항히스타민제 등이 사용되고 있다. 국소 제제인 스테로이드제, 칼시뉴린억제제는 단기간의 효과는 있지만 장기간 도포 시 피부 위축, 혈관 확장 등의 부작용을 일으킬 수 있다. 전신 경구 제제인 항히스타민제 등은 효과가 미미하다. 또한, 건조하고 무너진 피부 장벽을 회복하기 위해 세라마이드를 이용한 보습제들이 제약, 화장품 영역에서 사용되고 있다. 이러한 여러 약물 요법에도 불구하고 아토피 피부염은 적절한 치료법이 아직까지 해결되지 않고 있다.
특허문헌 1(대한민국 특허출원 제10-2017-0028169호)은 ZAG 단백질의 피부 건조증 또는 피부 장벽 개선 및 항알러지 용도에 대해 밝힌 발명이다. 본 발명은 상기 ZAG 단백질 중에서도 피부 건조증, 피부 장벽 개선 및 항알러지에 특히 효과가 우수한 펩타이드를 발굴하고, 이에 대한 효과를 확인한 것이다.
[선행기술문헌]
[특허문헌]
1. 대한민국 특허출원 제10-2017-0028169호
본 발명은 ZAG(Zinc-alpha-2-glycoprotein) 단백질 유래 펩타이드 및 그의 용도를 제공하고자 한다.
본 발명자들은 ZAG 단백질 중에서도 피부 건조증, 피부 장벽 개선, 항알러지 및 항염증에 특히 효과가 우수한 펩타이드를 발굴하였다.
따라서, 본 발명은 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 이상의 예방, 치료, 또는 개선용 의약 또는 화장료의 제조를 위한 ZAG 단백질 유래 펩타이드의 용도, 항알러지용 의약 또는 화장료의 제조를 위한 ZAG 단백질 유래 펩타이드의 용도, 항염증용 의약 또는 화장료의 제조를 위한 ZAG 단백질 유래 펩타이드의 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 이상의 예방, 치료, 또는 개선용 의약 조성물, 상기 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 이상의 개선용 화장료 조성물, 상기 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항알러지용 의약 조성물, 상기 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항알러지용 화장료 조성물, ZAG 단백질 유래 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항염증용 의약 또는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 치료상 또는 생리학적으로 유효한 양의 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 이상의 예방, 치료, 또는 개선 방법, 치료상 또는 생리학적으로 유효한 양의 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 알러지성 질환의 예방, 치료, 또는 개선 방법, 치료상 또는 생리학적으로 유효한 양의 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 염증의 예방, 치료 또는 개선 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 「ZAG 단백질 유래 펩타이드」는 ZAG 단백질의 아미노산 서열 중 피부건조증 또는 피부장벽기능 개선 효과를 나타내는 활성 펩타이드를 의미한다. 본 발명의 구체예에서,「ZAG 단백질 유래 펩타이드」는 ZAG 단백질의 단편(fragment)을 포함하는 10-mer 이상 50-mer 이하의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드일 수 있다. 「ZAG 단백질 유래 펩타이드」에 포함되는 ZAG 단백질의 단편은 ZAG 단백질을 이루고 있는 아미노산 서열 중 예를 들어, 10-mer 이상 50-mer 이하, 예컨대, 10-mer 내지 30-mer, 10-mer 내지 25-mer, 10-mer 내지 20-mer, 10-mer 내지 15-mer의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 한 구체예에서, ZAG 단백질의 단편은 ZAG 단백질을 이루고 있는 아미노산 서열 중 10-mer 내지 30-mer의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, ZAG 단백질의 단편은 서열번호 1 내지 19로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 구체예에서, ZAG 단백질의 단편은 서열번호 20 내지 26으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 명세서에서, 「ZAG 단백질 유래 펩타이드」은 일부 설명에서 「ZAG 단백질의 단편」과 상호교환적으로 사용되기도 한다. 예를 들어, ZAG 단백질 유래 펩타이드는 서열번호 1 내지 19로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다. 다르게는, ZAG 단백질 유래 펩타이드는 서열번호 20 내지 26으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
하기 실시예에서는 피부건조증, 피부장벽기능 개선 효과, 항알러지 또는 항염증를 나타내는 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 개시한다. 이에 제한되는 것은 아니나, 본 발명의 「ZAG 단백질 유래 펩타이드」는 표 1에 나타낸 Z1 내지 Z18의 ZAG 단백질 유래 펩타이드(각각 서열번호 1 내지 18)일 수 있다. 이들 펩타이드들은 피부건조증 또는 피부장벽기능 개선 효과, 항알러지 효과, 항염증 효과를 갖는 것으로 확인되었다. 특히, Z3의 ZAG 단백질 유래 펩타이드는 ZAG 단백질과 동등한 수준의 면역반응 감소 효능을 가져 아토피 피부염 개선 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다. 본 발명의 구체예에서, 「ZAG 단백질 유래 펩타이드」는 표 4에 나타낸 Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer-3, Z15mer-4(각각 서열번호 20 내지 26)의 ZAG 단백질 유래 펩타이드일 수 있다.
Z1 내지 Z18, 또는 Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer-3, Z15mer-4의 펩타이드들은 본 발명에 따른 「ZAG 단백질 유래 펩타이드」의 예시일 뿐이며, 「ZAG 단백질 유래 펩타이드」는 Z1 내지 Z1 또는 Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer-3, Z15mer-4 중의 일부 서열일 수 있다. 다르게는, 각 펩타이드 중 일부가 합쳐진 펩타이드일 수 있다.
본 발명에 따른 「ZAG 단백질 유래 펩타이드」는 예를 들어, Z1 내지 Z18의 펩타이드 또는 Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer-3, Z15mer-4의 펩타이드의 아미노산 서열과 각각 75% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
또한, 「ZAG 단백질 유래 펩타이드」는 활성 펩타이드를 이루는 아미노산 서열, 즉, ZAG 단백질의 단편 외에도, 세포투과성 펩타이드, 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성을 증가시키기 위한 특정 목적으로 제조된 아미노산 서열도 추가적으로 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발명은 Z1 내지 Z18의 펩타이드 또는 Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer-3, Z15mer-4의 펩타이드의 어느 한 말단에 세포투과성 펩타이드, 표적화 서열, 태그 (tag), 표지된 잔기, 반감기 또는 펩타이드 안정성 증가용 아미노산 서열이 융합된 융합 펩타이드일 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 「ZAG 단백질 유래 펩타이드」는 그의 기능성 변이체도 포함 할 수 있다. 상기 기능성 변이체는 본 명세서에 기재된 「ZAG 단백질 유래 펩타이드」 의 생물학적 균등물들을 포함한다. 예를 들면, 펩타이드의 결합 친화도 및/또는 기타 생물학적 특성을 보다 개선시키기 위하여 펩타이드의 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 추가적인 변화를 줄 수 있다. 이러한 변형은 항체의 아미노산 서열 잔기의 결실. 삽입, 및/또는 치환을 포함하며, 아미노산 곁사슬 치환체의 상대적인 유사성, 예컨대, 소수성, 친수성, 전하 크기 등에 기초하여 이루어진다. 아미노산 곁사슬 치환체의 크기, 모양 및 종류에 대한 분석에 의하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘은 모두 양전하를 띤 잔기이고; 알라닌, 글라이신과 세린은 유사한 크기를 갖으며; 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신은 유사한 모양을 갖는다는 것을 알 수 있다. 따라서 이러한 고려 사항에 기초하여, 아르기닌, 라이신과 히스티딘; 알라닌, 글라이신과 세린; 그리고 페닐알라닌, 트립토판과 타이로신 등은 생물학적으로 기능 균등물이라 할 수 있다.
또한, 본 발명의 펩타이드는 당해 분야에서 널리 공지된 다양한 방법으로 획득할 수 있다. 일례로서, 폴리뉴클레오타이드 재조합과 단백질 발현 시스템을 이용하여 제조하거나 펩타이드 합성과 같은 화학적 합성을 통하여 시험관 내에서 합성하는 방법, 및 무세포 단백질 합성법 등으로 제조될 수 있다.
또한, 보다 나은 화학적 안정성, 강화된 약리 특성 (반감기, 흡수성, 역가, 효능 등), 변경된 특이성 (예를 들어, 광범위한 생물학적 활성 스펙트럼), 감소된 항원성을 획득하기 위하여, 펩타이드의 N- 또는 C-말단에 보호기가 결합되어 있을 수 있다. 바람직하게, 상기 보호기는 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 또는 폴리에틸렌글리콜(PEG)일 수 있으나, 펩타이드의 개질, 특히 펩타이드의 안정성 증진시킬 수 있는 성분이라면, 제한없이 포함할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 용어, 「안정성」은 생체 내 단백질 절단효소의 공격으로부터 본 발명의 펩타이드를 보호하는 인 비보 안정성 뿐만 아니라, 저장 안정성 (예컨대, 상온 저장 안정성)도 의미한다.
본 발명의 「ZAG 단백질 유래 펩타이드」는 이에 제한되는 것은 아니나, 의약 조성물 또는 화장료 조성물에서, 조성물 총 중량에 대하여 0.0001 내지 50 중량%로 포함될 수 있다. 본 발명에 따른 의약 조성물 또는 화장료 조성물은 「ZAG 단백질 유래 펩타이드」외에도 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.
한편, 본 발명의 「ZAG 단백질 유래 펩타이드」는 콜로이드 현탁액, 분말, 식염수, 지질, 리포좀, 미소구체 microspheres), 또는 나노 구형입자와 같은 약학적으로 또는 생리학적으로 또는 화장품학적으로 허용될 수 있는 담체에 의해 대상체 내로 운반될 수 있다. 이들은 운반 수단과 복합체를 형성하거나 관련될 수 있고, 지질, 리포좀, 미세입자, 금, 나노입자, 폴리머, 축합 반응제, 다당류, 폴리아미노산, 덴드리머, 사포닌, 흡착 증진 물질 또는 지방산과 같은 당업계에 공지된 운반 시스템을 사용하여 생체 내 운반될 수 있다.
이 외에도, 약학적으로 또는 생리학적으로 또는 화장품학적으로 허용되는 담체는 제제시 통상적으로 이용되는 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아, 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세 결정성 셀룰로스, 폴리비닐 피로리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필 히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, 「피부 건조증」은 피부의 수분이 부족하여 피부가 건조해짐으로 인해 발생하는 모든 증상을 의미한다. 본 명세서의 상기 피부 건조증은 피부의 수분이 부족하여 피부가 건조해짐으로 인해 발생하는 증상이라면, 그 구체적인 증상의 종류나 정도가 특별히 제한되지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 용어, 「피부 장벽 기능」이란, 피부 특히 표피의 각질층이 외부로의 수분 유출을 방지하고 외부로부터의 물질 출입을 통제하는 등 외부와의 차단층 역할을 수행하는 모든 기능을 의미하며, 본 명세서에서 사용되는 용어, 「피부 장벽 기능 이상」은 상기 피부 장벽 기능이 저하되거나 손상된 상태뿐만 아니라 저하되거나 손상될 가능성이 있거나 이를 예방할 필요가 있는 모든 상태를 의미한다. 본 명세서의 상기 피부 장벽 기능 이상은 피부 장벽 기능이 저하되거나 손상되는 것으로 인해 발생하는 증상이라면, 그 구체적인 증상의 종류나 증상의 정도가 특별히 제한되지 않는다.
본 발명의 한 구체예에서, 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 이상을 나타내는 질환은 아토피 피부염일 수 있다. 본 발명에 따른 ZAG 단백질 유래 펩타이드는 아토피 피부염의 예방, 치료, 개선에 탁월한 효과가 있는 것으로 확인되었다.
나아가, 본 발명의 발명자들은 ZAG 단백질을 표피에 처리함으로써 다양한 면역 반응 및 이에 따른 염증 반응과 연관된 Th2 세포뿐만 아니라 다양한 염증성 사이토카인의 수준, 히스타민의 수준을 낮출 수 있다는 것을 발견하였다. 나아가, 본 발명의 발명자들은 ZAG 단백질이 면역 조절세포인 Treg 세포 (regulatory T cell) 의 수준을 증가시키는 것을 발견하였다.
여기서, 염증성 사이토카인과 Treg 세포는 알러지성 질환 특히, 아토피피부염의 진행과 연관될 수 있다. 특히, 본 발명의 발명자들은 아토피피부염 환자의 혈액내에서는 Th2 세포가 분비하는 IL-4, IL-5 및 IL-13의 수준과 Th17 세포가 분비하는 IL-17의 수준이 크게 증가하는 것을 발견하였다. 이때, IL-17의 수준의 증가는 면역학적 이상의 특징 중 하나일 수 있다. 따라서, 염증성 사이토카인의 발현 수준을 낮추는 기작, 특히 Th2 세포, Th17 세포성 사이토카인의 수준을 낮추는 것은 염증 반응을 억제하고, 아토피피부염 나아가, 알러지성 질환의 예방과 치료에있어서, 핵심일 수 있다.
나아가, Treg 세포는 아토피피부염의 병변부위에서 정상인에 비하여 감소될 수 있다. 이때, Treg 세포는 면역조절세포로서 Th1, Th2, Th17 세포에 작용하는 수지상세포의 프라이밍 (priming) 역할 뿐 아니라 염증반응을 억제 시키고, 직접적으로 알러지 항원 특이 Th2 세포의 활성을 억제 시킴으로써 알러지 반응의 작동기 단계 동안 필수 사이토카인인 IL-4, IL-5 및 IL-13의 생성을 최소화 시킬 수 있다. 또한, Treg 세포는 비만 세포와 호염기구, 호산구에 직접 작용하여 알러지 염증을 억제 시키고 조직 세포와 상호작용 함으로써 조직 재구성에 중요한 역할을 할 수 있으며, B 세포에 직접 영향을 가하여 알러지 항원-특이 IgE의 생성을 억제하고 IgG4의 생성을 유도할 수 있다. 따라서, Treg 세포의 기능을 항진시키거나 이의 수준을 증가시키는 기작은 면역반응, 또는 이에 의한 염증 반응을 억제하는 데 있어 중요할 수 있다. 나아가, 이러한 기작은 알러지성 질환, 구체적으로 아토피 피부염의 예방과 치료에 있어서, 중요할 수 있다.
이에 따라, 본 발명의 발명자들은 염증성 사이토카인 및 Treg 세포의 수준을 조절할 수 있는 ZAG 단백질이 알러지성 질환의 예방 또는 치료에 효과적인 항알러지 약학 조성물, 더 나아가 항염증 약학 조성물로 제공될 수 있음을 인지하였다.
이에, 본 발명은 추가로 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 포함하는 항알러지 의약 또는 화장료 조성물, 알러지성 질환의 예방, 치료 또는 개선용 의약 또는 화장료 조성물 및 항염증용 의약 또는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물, 알러지성 질환의 예방용 또는 치료용 약학 조성물 및 항염증 조성물은 다양한 알러지성 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 이용될 수 있다. 예를 들어, 상기 항알러지용 의약조성물은 과민증 (anaphylaxis), 알러지성 비염 (allergic rhinitis), 천식 (asthma), 아토피피부염, 곤충알러지, 식품알러지, 약품알러지 및 두드러기 (urticaria) 를 포함하는 알러지성 질환을 예방하거나 치료하는데 이용할 수 있다. 보다 바람직하게 본 발명의 일 실시예에 따른 항알러지 약학 조성물은 아토피피부염의 예방 또는 치료용 조성물로서 이용되는 것에 효과적일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 포함하는 항염증 약학 조성물은 염증성 사이토카인의 수준을 낮춤으로써 염증 반응을 억제할 수 있고, 이에, 염증성 피부질환, 특히 아토피피부염에 효과적일 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어, 「예방」은 본 발명에 따른 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 포함하는 의약 조성물 또는 화장료 조성물의 투여에 의해 「피부 건조증」, 「피부 장벽 기능 이상」, 「알러지성 질환 또는 알러지」 또는「염증」을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, 「치료」는 본 발명에 따른 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 포함하는 의약 조성물 또는 화장료 조성물의 투여에 의해 「피부 건조증」, 「피부 장벽 기능 이상」, 「알러지성 질환 또는 알러지」 또는「염증」 증세가 호전되도록 하거나 이롭게 되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서 사용되는 용어, 「개선」은 본 발명에 따른 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 포함하는 의약 조성물 또는 화장료 조성물의 투여에 의해 「피부 건조증」, 「피부 장벽 기능 이상」, 「알러지성 질환 또는 알러지」 또는「염증」 증세가 완화되도록 하는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 「대상체」는 「피부 건조증」, 「피부 장벽 기능 이상」, 「알러지성 질환 또는 알러지」 또는「염증」의 예방, 치료, 개선을 필요로 하는 대상을 의미하며, 보다 구체적으로 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐(mouse), 개, 고양이, 말 및 소 등의 포유류를 의미한다.
ZAG 단백질 유래 펩타이드는 비경구 또는 경구를 통해 대상체에 투여될 수 있다. 이에 제한되는 것은 아니나, ZAG 단백질 유래 펩타이드는 「피부 건조증」, 「피부 장벽 기능 이상」, 「알러지성 질환 또는 알러지」 또는「염증」의 예방, 치료, 또는 개선을 위한 용도로 사용되므로 비경구, 특히 피부에 적용가능한 형태의 의약 또는 화장료 조성물로 제제화되어 국소투여될 수 있다. 예를 들어, 연고, 겔, 크림, 로션, 등의 제형으로 제제화될 수 있다. 국소투여의 형태는 이에 제한되는 것은 아니나, 예를 들어 피부에의 도포, 마이크로니들을 이용한 경피 투과, 피내주사 등일 수 있다. 예컨대, 상기 조성물을 도포하거나 상기 조성물을 포함하는 패치 제형을 피부에 부착하는 것이 바람직할 수 있다.
상기 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 ZAG 단백질 유래 펩타이드 이외에 추가적으로 약제학적이나 생리학적으로 허용되는 담체, 부형제, 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 조성물에 포함될 수 있는 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는 락토오스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 비정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 테아레이트 및 광물유 등을 들 수 있다. 상기 조성물은 약제화하는 경우, 통상의 충진제, 증량제, 결합제, 붕해제, 계면활성제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물의 제형은 용액, 에멀션(마이크로에멀션 포함), 현탁액, 크림, 로션, 겔, 분말, 또는 본 조성물이 적용될 수 있는 피부 및 기타 조직에 적용하기 위해 이용되는 기타 전형적인 고체 또는 액체 조성물을 포함할 수 있다. 그와 같은 조성물은 추가적인 항미생물제(antimicrobial), 보습제 및 수화제(hydration agent), 투과제(penetration agent), 보존제, 유화제, 천연 오일 또는 합성 오일, 용매, 계면활성제, 세정제(detergent), 겔화제(gelling agent), 연화제(emollient), 항산화제, 향료, 충진제, 증점제(thickener), 왁스, 냄새 흡수제, 염료(dyestuff), 착색제, 분말, 점도-조절제(viscosity-controlling agent) 및 물을 포함할 수 있고, 선택적으로, 마취제, 항-가려움 활성제(anti-itch active), 식물 추출물(botanical extract), 컨디셔닝제(conditioning agent), 흑화제 또는 미백제(darkening or lightening agent), 글리터(glitter), 습윤제(humectant), 운모, 미네랄, 폴리페놀, 실리콘 또는 그의 유도체, 일광 차단제(sunblock), 비타민, 및 약용식물(phytomedicinal)을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구체예는, ZAG 단백질 유래 펩타이드를 포함하는 화장료 조성물을 제공할 수 있고, 구체적으로는 아토피 피부 개선용, 항알러지용, 또는 항염증용 화장료 조성물일 수 있다. 화장료 조성물은 현탁액, 유탁액, 겔 및 페이스트로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 가질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물의 투여량은 대상의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 이에 제한되는 것은 아니나 약 0.001 내지 100 ㎎/㎏, 예컨대, 0.01 내지 10 ㎎/㎏ 이다. 상기 조성물은 하루 일 회 내지 수 회에 나누어 투여할 수 있다.
본 발명은 치료상 또는 생리학적으로 유효한 양의 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 대상체에 투여하는 것을 포함하는 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 이상의 예방, 치료, 또는 개선 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 ZAG 단백질 펩타이드는 급성, 만성 아토피 피부염에 작용하는 면역반응의 감소 효능을 가져 아토피 피부염 개선 효과를 지님을 확인할 수 있었으며, 면역 반응 감소, IgE의 발현을 감소시킴으로써 아토피 피부염과 같은 피부 건조증, 피부 장벽 기능 이상, 알러지 질환, 염증 등을 예방, 치료 또는 개선하기 위해 사용될 수 있다.
도 1은 in vitro에서 각 펩타이드들의 아토피 피부염 효력시험 결과이다. (a)는 RAW 264.7 macrophage에서의 결과, (b)는 RBL-2H3 mast cell에서의 결과, (c)는 keratinocyte에서의 결과, (d) B lymphocyte에서의 결과, 그리고 (e)는 T lymphocyte에서의 결과이다.
도 2는 in vitro에서 표 4의 각 펩타이드들의 아토피 피부염 효력시험 결과이다. (a)는 RAW 264.7 macrophage에서의 결과, (b)는 RBL-2H3 mast cell에서의 결과, (c)는 keratinocyte에서의 결과, (d) B lymphocyte에서의 결과, 그리고 (e)는 T lymphocyte에서의 결과이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 것이며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
제조예 1. 펩타이드 합성 및 분리정제
ZAG 단백질에서 활성부위를 포함하는 펩타이드를 발굴하기 위해, 298개의 전체 아미노산 서열(GenBank: AAH05306.1)(서열번호 19)에서 15개의 아미노산이 중복되도록 18개의 펩타이드 후보군 (Z1~Z18, 각각 서열번호 1 내지 18)을 설정하였다. 각 펩타이드는 고체상 펩타이드 합성법(solid phase synthesis)을 통해 제작하였다. 본 발명에서 합성한 펩타이드는 90% 이상의 순도를 나타냄을 HPLC 분석을 통해 확인하였다. 정제된 펩타이드는 Mass Spectrometry를 통해 분자량을 확인하였다.(표 1: ZAG 단백질 활성 부위를 발굴하기 위해 사용된 펩타이드 후보군 및 아미노산 서열)
Figure PCTKR2018011593-appb-T000001
실시예 1. In vitro 아토피 피부염 효력 시험을 통한 펩타이드 선별
18개의 펩타이드 후보군에서 아토피 증상 완화에 효력을 갖는 ZAG의 핵심 활성 영역에 해당하는 아미노산 서열을 선별하기 위해 아토피 피부염 효력 시험을 진행하였다. ZAG 펩타이드 후보군 (Z1-Z18, 각각 서열번호 1 내지 18)과 ZAG 단백질(Z0, 서열번호 19)을 1 μg/ml의 농도로 5가지 면역 관련 세포에 24시간 동안 처리한 후, 각 세포주에 해당하는 Stimulator를 시간 별로 처리하여 면역 반응을 확인하였다. 양성 (positive) 대조 실험군으로는 stimulator만 처리한 군, 음성(negative) 대조 실험군으로는 stimulator 없이 vehicle만 처리한 군으로 진행하였다.(표 2: 아토피 피부염 효력 시험 방법) Stimulator로 사용한 염증 반응과 관련된 효소는 면역세포에 의해 생산되며, 히스타민(histamine)은 염증반응을 개시한다. 손상된 부위로 이동한 면역세포는 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α), 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6)과 같은 사이토카인(cytokine)을 분비하여 직접적인 외부침입물질을 파괴하거나 다른 면역세포들을 모아 염증반응을 개시한다. 염증유발 물질인 인터페론-γ(interferon-γ과 피부염증관련 인자 CCL-17/TARC (thymus- and activation-regulated chemokine)를 이용한 효력 시험 또한 면역반응을 확인하기 위함이다.
Figure PCTKR2018011593-appb-T000002
실시예 1-1. Macrophage을 이용한 아토피 피*염 효력 시험
Macrophage (RAW 264.7 cell)에 stimulator인 LPS를 0.1 μg/ml의 농도로 24시간 동안 처리 후, 세포 배양 배지에 용출된 IL-6의 농도를 ELISA assay을 통해 확인하였다. Z0, Z1~Z10, Z14를 처리한 실험 군에서 IL-6의 농도가 Stimulator만 처리한 실험군보다 유의미하게 감소되었다. (도 1-a)
실시예 1-2. Mast cell을 이용한 아토피 피부염 효력 시험
Mast cell (RBL-2H3)에 stimulator인 PMA 1 μg/ml과 A23187 1 μg/ml을 12시간 동안 처리 후, 세포 배양 배지에 용출된 Histamine의 농도를 ELISA assay을 통해 확인하였다. Z0, Z1~Z11, Z14, Z15, Z17, Z18를 처리한 실험 군에서 Histamine 의 농도가 Stimulator만 처리한 실험군보다 유의미하게 감소되었다. (도 1-b)
실시예 1-3. Keratinocyte을 이용한 아토피 피부염 효력 시험
Keratinocyte (HaCaT cell)에 stimulator인 TNF-α 0.4 μg/ml과 IFN-γ0.4 μg/ml을 24시간 동안 처리 후, 세포 배양 배지에 용출된 CCL17/TARC의 농도를 ELISA assay을 통해 확인하였다. Z0, Z1~Z8, Z10, Z12~Z14, Z18 에서 CCL17/TARC가 유의미하게 감소되었다. (도 1-c)
실시예 1-4. B 림프구를 이용한 아토피 피부염 효력 시험
B림프구 (RPMI 1788)에 stimulator인 LPS 0.1 μg/ml을 24시간 동안 처리 후, 세포 배양 배지에 용출된 IgE의 농도를 ELISA assay을 통해 확인하였다. Z0, Z3~Z8, Z12~Z14, Z16~Z18 에서 IgE가 유의미하게 감소되었다. (도 1-d)
실시예 1-5. T 림프구를 이용한 아토피 피부염 효력 시험
앞선 실시예 1-1 내지 1-4의 결과에서 효력을 가질 것으로 판단되는 6개의 펩타이드 후보군 (Z3, Z4, Z5, Z12, Z14, Z15)으로 T림프구에 대한 아토피 피부염 효력 시험을 진행하였다. T림프구에 stimulator인 IL-2을 50 ng/ml을 12시간 동안 처리한 후, 세포 배양 배지에 용출된 IL-4 농도를 ELISA assay을 통해 확인하였다. 이 때, 처리한 샘플군 Z3, Z4, Z5, Z12, Z14, Z15에서 IL-4가 유의미하게 감소되었다. (도 1-e)
5가지 세포주를 통해 아토피 피부염 효력 시험을 진행한 결과, Z3 펩타이드가 모든 세포주에서 공통적으로 효력을 보이며, 아토피 피부염에 도움이 되는 물질임을 확인하였다. (표 3)
ZAG 단백질 유래 펩타이드의 효력시험 결과
Cell line RAW 264.7 (mouse) RBL - 2H3 (rat) HaCaT (human) B lymphocyte (human) T lymphocyte (human)
target IL-6 Histamine CCL17 / TARC IgE IL-4
Z0 ( AZGP1 ) ● ● ● ● ●
Z1 ● ● ●
Z2 ● ● ●
Z3 ● ● ● ● ●
Z4 ● ● ● ● ●
Z5 ● ● ● ● ●
Z6 ● ● ● ●
Z7 ● ● ● ●
Z8 ● ● ● ●
Z9 ● ●
Z10(Z1-2) ● ● ●
Z11(Z2-2) ●
Z12(Z5-2) ● ● ●
Z13(Z6-2) ● ●
Z14(Z3-2) ● ● ● ● ●
Z15(Z4-2) ●
Z16(Z4-2) ● ●
Z17(Z8-2) ● ●
Z18(Z9-2) ● ● ●
제조예 2. ZAG 유래 펩타이드의 추가 합성.
Z1 내지 Z18의 18개의 펩타이드 후보군에서 아토피 증상 완화에 효력을 갖는 ZAG의 핵심 활성 영역으로 선별된 ZAG3 펩타이드 (ZAG3)를 기반으로, ZAG3 유래 올리고펩타이드를 추가로 합성하였다(표 4). 표 4의 각각의 펩타이드는 고체상 펩타이드 합성법(solid phase synthesis)을 통해 제작하였다. 본 발명에서 합성한 펩타이드는 90% 이상의 순도를 나타냄을 HPLC 분석을 통해 확인하였다. 정제된 펩타이드는 Mass Spectrometry를 통해 분자량을 확인하였다.
ZAG 단백질 활성 부위를 발굴하기 위해 사용된 펩타이드 후보군 및 아미노산 서열
펩타이드명 분자량(g/mol) 서열 서열번호
Z20mer-1 2497.69 EDWKQDSQLQKAREDIFMET 20
Z20mer-2 2379.68 DSQLQKAREDIFMETLKDIV 21
Z20mer-3 2492.75 KAREDIFMETLKDIVEYYND 22
Z15mer-1 1875.98 EDWKQDSQLQKARED 23
Z15mer-2 1811.02 DSQLQKAREDIFMET 24
Z15mer-3 1808.14 KAREDIFMETLKDIV 25
Z15mer-4 1893.16 IFMETLKDIVEYYND 26
실시예 2. In vitro 아토피 피부염 효력 시험을 통한 펩타이드 선별
추가로 합성된 Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer-3, Z15mer-4의 펩타이들 중 보다 우수한 효과를 갖는 아미노산 서열을 선별하기 위해 아토피 피부염 효력 시험을 진행하였다. Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer-3, Z15mer-4를 1 μg/mL 농도로 여러 면역 세포에 24 시간 동안 처리한 후, 각 세포주에 해당하는 stimulator를 시간 별로 처리하여 면역 반응을 확인하였다. 아토피 피부염 효력 시험 방법은 실시예 1 및 표 2와 동일한 방식으로 진행하였다.
실험군은 1) 음성 대조군: vehicle 처리 군 (Neg), 2) 양성 대조군: stimulator만 처리한 군 (Pos), 그리고 3) 실험군: stimulator와 ZAG3 또는 ZAG3 유래 올리고펩타이드(Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer-3, Z15mer-4)를 각각 처리한 군으로 실험을 진행하였다. 세포의 배양액을 사용하여 ELISA로 농도를 측정하였다.
실시예 2-1. Macrophage을 이용한 아토피 피부염 효력 시험
Macrophage (RAW 264.7 cell)에 stimulator인 LPS를 0.1 μg/ml의 농도로 24시간 동안 처리 후, 세포 배양 배지에 용출된 IL-6의 농도를 ELISA assay을 통해 확인하였다. 양성 대조군(Pos)과 비교하였을 때, IL-6 농도가 ZAG3, 20mer-3, 15mer-1, 15mer-2, 15mer-3, 15mer-4를 처리한 군에서 유의하게 감소하였다 (도 2-a)
실시예 2-2. Mast cell을 이용한 아토피 피부염 효력 시험
Mast cell (RBL-2H3)에 stimulator인 PMA 1 μg/ml과 A23187 1 μg/ml을 12시간 동안 처리 후, 세포 배양 배지에 용출된 Histamine의 농도를 ELISA assay을 통해 확인하였다. 양성 대조군(Pos)과 비교하였을 때, 모든 올리고 펩타이드에서 처리 시 histamine release가 감소하였다 (도 2-b)
실시예 11-3. Keratinocyte을 이용한 아토피 피부염 효력 시험
Keratinocyte (HaCaT cell)에 stimulator인 TNF-α 0.4 μg/ml과 IFN-γ0.4 μg/ml을 24시간 동안 처리 후, 세포 배양 배지에 용출된 CCL17/TARC의 농도를 ELISA assay을 통해 확인하였다. 양성 대조군(Pos)과 비교하였을 때, CCL17/TARC 농도가 ZAG3, 20mer-1, 15mer-3, 15mer-4를 처리한 군에서 유의하게 감소하였다. (도 2-c)
실시예 2-4. B 림프구를 이용한 아토피 피부염 효력 시험
B림프구 (RPMI 1788)에 stimulator인 LPS 0.1 μg/ml을 24시간 동안 처리 후, 세포 배양 배지에 용출된 IgE의 농도를 ELISA assay을 통해 확인하였다. 양성 대조군(Pos)과 비교하였을 때, 모든 올리고 펩타이드에서 처리 시 IgE가 감소하였다. (도 2-d)
실시예 2-5. T 림프구를 이용한 아토피 피부염 효력 시험
앞선 실험을 통해 뽑아낸 target peptide를 사용하여 T lymphocyte에서 실험을 진행하였다. 양성 대조군(Pos)과 비교하였을 때, 모든 올리고 펩타이드(Z20mer-1, Z20mer-2, Z20mer-3, Z15mer-1, Z15mer-2, Z15mer-3, Z15mer-4)에서 처리 시 IL-4가 감소하였다 (도 2-e)
5가지 세포주를 통해 아토피 피부염 효력 시험을 진행한 Total peptide에 대한 효력 비교 분석은 실험 결과, 양성 대조군과의 비교를 통해 통계적인 유의성이 있어 효력이 있다고 판단되며, 아토피 피부염에 도움이 되는 물질임을 확인하였다. (표 5)
ZAG 단백질 유래 펩타이드의 효력시험 결과
Cell line RAW 264.7 (mouse) RBL - 2H3 (rat) HaCaT (human) B lymphocyte (human) T lymphocyte (human)
target IL-6 Histamine CCL17 / TARC IgE IL-4
Z20mer -1 ● ● ● ●
Z20mer -2 ● ● ●
Z20mer -3 ● ● ● ●
Z15mer -1 ● ● ● ●
Z15mer -2 ● ● ● ●
Z15mer -3 ● ● ● ● ●
Z15mer -4 ● ● ● ● ●

Claims (20)

  1. ZAG (Zinc-alpha-2-glycoprotein) 단백질 유래 펩타이드를 포함하는 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 이상의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  2. 제1항에 있어서, ZAG 단백질 유래 펩타이드는 ZAG 단백질의 단편을 포함하는 10-mer 이상 50-mer 이하의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 이상의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  3. 제2항에 있어서, ZAG 단백질의 단편은 ZAG 단백질을 이루고 있는 아미노산 서열 중 10-mer 내지 30-mer의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 것인 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 이상의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  4. 제2항에 있어서, ZAG 단백질의 단편은 서열번호 1 내지 19로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 이상의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  5. 제1항에 있어서, ZAG 단백질의 단편은 서열번호 20 내지 26으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 이상의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
  6. ZAG (Zinc-alpha-2-glycoprotein) 단백질 유래 펩타이드를 포함하는 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 개선용 화장료 조성물.
  7. 제6항에 있어서, ZAG 단백질 유래 펩타이드는 ZAG 단백질의 단편을 포함하는 10-mer 이상 50-mer 이하의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 개선용 화장료 조성물.
  8. 제7항에 있어서, ZAG 단백질의 단편은 ZAG 단백질을 이루고 있는 아미노산 서열 중 10-mer 내지 30-mer의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 것인 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 개선용 화장료 조성물.
  9. 제7항에 있어서, ZAG 단백질의 단편은 서열번호 1 내지 19로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 개선용 화장료 조성물.
  10. 제7항에 있어서, ZAG 단백질의 단편은 서열번호 20 내지 26으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인 피부 건조증 또는 피부 장벽 기능 개선용 화장료 조성물.
  11. ZAG (Zinc-alpha-2-glycoprotein) 단백질 유래 펩타이드를 포함하는 항알러지용 조성물.
  12. 제11항에 있어서, ZAG 단백질 유래 펩타이드는 ZAG 단백질의 단편을 포함하는 10-mer 이상 50-mer 이하의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 항알러지용 조성물.
  13. 제12항에 있어서, ZAG 단백질의 단편은 ZAG 단백질을 이루고 있는 아미노산 서열 중 10-mer 내지 30-mer의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 항알러지용 조성물.
  14. 제12항에 있어서, ZAG 단백질의 단편은 서열번호 1 내지 19로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인 항알러지용 조성물.
  15. 제12항에 있어서, ZAG 단백질의 단편은 서열번호 20 내지 26으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인 항알러지용 조성물.
  16. ZAG (Zinc-alpha-2-glycoprotein) 단백질 유래 펩타이드를 포함하는 항알러지용 조성물.
  17. 제16항에 있어서, ZAG 단백질 유래 펩타이드는 ZAG 단백질의 단편을 포함하는 10-mer 이상 50-mer 이하의 아미노산 서열로 이루어진 펩타이드인 항알러지용 조성물.
  18. 제17항에 있어서, ZAG 단백질의 단편은 ZAG 단백질을 이루고 있는 아미노산 서열 중 10-mer 내지 30-mer의 연속된 아미노산 서열로 이루어진 항알러지용 조성물.
  19. 제17항에 있어서, ZAG 단백질의 단편은 서열번호 1 내지 19로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인 항알러지용 조성물.
  20. 제17항에 있어서, ZAG 단백질의 단편은 서열번호 20 내지 26으로부터 선택되는 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어진 것인 항알러지용 조성물.
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