PT1644012E - ALCALËIDE QUELIDONINA QUATERNáRIO E DERIVADOS ALCALËIDES, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÆO E UTILIZAÆO NA PREPARAÆO DE ALIMENTOS - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO

"ALCALOIDE QUELIDONINA QUATERNÁRIO E DERIVADOS ALCALOIDES, PROCESSO PARA A SUA PREPARAÇÃO E UTILIZAÇÃO NA PREPARAÇÃO DE ALIMENTOS"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A invenção presente pertence ao domínio do desenvolvimento de fármacos e dos cuidados de saúde, e diz respeito ao alcaloide quelidonina e aos seus derivados, nos quais o azoto da molécula de quelidonina seja um azoto quaternário. A invenção também diz respeito a um método de fabrico desses compostos, a composições contendo estes compostos e a aplicações deles para o tratamento de diversas doenças e estados do corpo.

ESTADO DA TÉCNICA 0 alcaloide quelidonina e as composições contendo quelidonina são conhecidos na técnica, tal como o são aplicações terapêuticas da quelidonina ou de alguns derivados de quelidonina no tratamento de diversos estados e doenças corporais, incluindo disfunções metabólicas e tumores. A DE 2.028.330 e a US 3.865.830 descrevem a 2 ΡΕ1644012 preparação de compostos de adição de tiofosforamida-isoqui-nolina fazendo reagir alcaloides seleccionados de Cheli-donium majus L. com sulfureto de tris(1-aziridinil)fosfina a titulo de solvente orgânico. A AT 354.644 e a AT 377.988 descrevem processos para a preparação de derivados de fósforo de alcaloides por reacção com compostos de fósforo carcinostáticos, que são proporcionados sob uma forma solúvel em água por transformação nos seus sais. Uma desvantagem dos processos descritos é a de que a transformação dos produtos reaccionais em sais solúveis em água não é completa e a parte predominante dos produtos de reacção permanece solúvel em água. A US 5.981.512 descreve a utilização das substâncias descritas na AT 377.988 e AT 354.644 para o tratamento das lesões provenientes da radiação.

Os compostos descritos nas patentes referidas têm actividade citostática e carcinostática. As misturas de alcaloides, em especial os alcaloides totais de Chelidonium majus L., têm provado ser especialmente prometedoras do ponto de vista terapêutico, cuja actividade farmacológica tem sido demonstrada em diversos estudos acerca de tratamento do cancro. Remove-se o reagente por reagir da mistura sintética uma vez completada a reacção. Uma vez que o sulfureto de tris(1-aziridinil)fosfina (doravante também referido neste documento como "tiotepa") é solúvel em solventes orgânicos, tais como o benzeno, o éter ou o 3 ΡΕ1644012 clorofórmio, propõe-se nos métodos da técnica anterior a remoção do sulfureto de tris(1-aziridinil)fosfina por reagir a partir da mistura sintética, por lavagem dos produtos reaccionais com éter.

Enquanto os métodos da técnica anterior já mencionada para o fabrico de derivados de quelidonina farmacologicamente activos têm em comum eu necessitam de purificação do produto final utilizando solventes inflamáveis ou mesmo explosivos, verificou-se agora que a purificação também poderia ser levado a cabo, e mesmo com melhores resultados, utilizando um solvente aquoso.

Em Zhao Y et al., Chinese Pharmaceutical Bulletin (Yaoxue Tongbao) 16 (1981) 7-10 e a Database Chemical Abstracts (Online), com número de acessão base de dados N°. 1982:173909, estuda-se um efeito farmacológico possivel do cloreto de N-metilprotopina em pacientes que sofrem de malária. O alcaloide sanguinarina e os seus sais são conhecidos na técnica de modo a exibirem um largo espectro de actividades biológicas. Tanaka S et al., Planta Med. 67 (2001) 108 - 113 descreve efeito anti-inflamatório do cloreto de sanguinarina.

Schmeller T et al., Phytochemistry 44 (1997) 257 - 266, descrevem uma actividade bioquímica da sanguinarina mediando uma defesa química contra micro-organismos, vírus e herbívoros em plantas. 4 ΡΕ1644012

Walterova D et al., Journal of Medicinal Chemistry 24 (1981) 1100 - 1103 descrevem um efeito inibidor da sanguinarina sobre a actividade enzimática da actividade da alanina aminotransferase do figado.

Ishii H et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin 33 (1985) 4139 - 4151 e Nakanishi T et al., Journal of Natural Products 62 (1999) 864 - 867, descrevem a actividade antitumoral da sanguinarina.

Lombardini J B et al., Biochemical Pharmacology 51 (1996) 151 - 157, descrevem um efeito inibidor da sanguinarina sobre a actividade enzimática de uma quinase nas mitocôndrias do coração do rato.

Ulrichova J et al., Toxicology Letters 125 (2001) 125 - 132, descrevem um efeito citotóxico da sanguinarina sobre hepatócitos em cultura celular. A preparação de diversos derivados de alcaloides, diferentes dos derivados de quelidonina, também é conhecida na técnica. Valpuesta M et al., Tetrahedon 58 (2002) 5053 -5059 descrevem a sintese de diversos derivados alcaloides -cis e trans de N-metil-l-metoxiestilopínio - a partir do alcaloide coulteropina, principal alcaloide de Romneya coulteri, em solventes orgânicos. Slavik J et al., Collection of Czechoslowak Chemical Commmunications 41 (1976) 285 - 289, descrevem o isolamento de derivados 5 ΡΕ1644012 alcaloides sob a forma de iodetos e de percloratos, a partir de raízes de Argemone platyceras LINK e OTTO.

Schmidt E, Achiv der Pharmazie 231 (1893) 168 -183, descreve a preparação de iodeto de γ-homoquelidonina-metilo por aquecimento da base pura com um excesso de iodeto de metilo e por recristalização do produto da reacção a partir de álcool.

Takao N et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin 21 (1973) 1096 - 1102, descrevem a preparação de metilato de 11-epicorinolina-iodo por reacção do alcaloide 11-epicorinolina de Corydalis incisa com iodeto de metilo numa mistura de solventes orqânicos e recristalização do produto reaccional a partir de uma mistura de solventes orgânicos.

Danckwortt PW, Archiv der Pharmazie 250 (1912) 590 - 646, descreve a preparação do iodeto de protopina-metilo por reacção de protopina dissolvida em acetona com um excesso de iodeto de metilo, e por recristalização do produto da reacção a partir de álcool.

Manske RHF et al., Journal of the American Chemical Society 64 (1942) 1659 - 1661, descrevem a preparação de metossulfato do éter O-etílico da hunemanina a partir do alcaloide hunemanina, isolado a partir de

Hunnemannia fumariaefolia Sweet. 6 ΡΕ1644012

Redemann C E et al., Journal of the American Chemical Society 71 (1949) 1030 - 1034, descrevem a preparação de diversos derivados de alocriptopina, cujo alcaloide alocriptopina foi extraído de Faraga coco, sendo as reacções conduzidas num solvente orgânico.

Zhang G-L et al., Phytochemistry 40 (1995) 299 -305, descrevem a extracção e a análise estrutural do alcaloide cloreto de N-metilestilópio a partir da planta medicinal Chinesa Dactylicapnos torulosa.

No que toca aos derivados de quelidonina, as preparações da técnica anterior mencionadas acima para diversos derivados de alcaloides diferentes não incluem nem sugerem nenhum passo de lavagem recorrendo a um solvente aquoso.

BREVE DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

Num aspecto a invenção diz respeito a um novo processo para a preparação de um produto da reacção de alcaloides, em especial da quelidonina, da oxiquelidonina ou da metoxiquelidonina, com agentes alquilantes adequados, processo este que envolve pelo menos um passo de lavagem com um solvente aquoso, preferivelmente água, depois de se haver completado a reacção de alquilação. 0 processo também inclui um passo em que se transformam os derivados alcaloides em sais solúveis em 7 ΡΕ1644012 água, para se fazerem preparações farmacêuticas injectáveis com pequena toxicidade e possuindo um largo espectro de actividade terapêutica.

Noutro aspecto a invenção presente diz respeito a produtos reaccionais solúveis em água, incluindo por exemplo derivados de quelidonina, em que o azoto inicialmente terciário da molécula de alcaloide foi transformado num azoto quaternário, e em que o quarto ligando do azoto quaternário seja um residuo de alquilo inferior, preferivelmente um residuo metilo ou etilo ou um residuo de metilo ou etilo substituídos, tal como por exemplo um resíduo tiotepa. Numa forma de realização preferida, os derivados quaternários de quelidonina têm uma natureza tal que se acumulam selectivamente nos tecidos alvo, em especial tecidos cancerosos.

Noutro aspecto a invenção diz respeito a composições farmacêuticas contendo pelo menos um dos derivados quaternários do alcaloide, em especial derivados quaternários de quelidonina, que se podem obter de acordo com a invenção presente. A invenção também diz respeito à utilização dos produtos reaccionais incluindo derivados quaternários de alcaloides a título de fármacos para utilização em aplicações terapêuticas, e à utilização dos derivados referidos para o fabrico de composições farmacêuticas para 8 ΡΕ1644012 o tratamento terapêutico de diversas doenças ou estados do corpo.

Estão descritas nas reivindicações outras aplicações da invenção presente.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO 0 processo de acordo com a invenção inclui fazer-se reagir um alcaloide ou uma mistura de alcaloides presentes na planta Chelidonium majus L. e seleccionados de entre o conjunto constituído por quelidonina, protopina, estilopina, alocriptopina, homoquelidonina, quelamidina, quelamina, L-esparteína, oxiquelidonina e metoxiqueli-donina, num solvente orgânico, com um agente alquilante, preferivelmente com um agente alquilante que tenha ele próprio uma actividade terapêutica, tal como por exemplo as fosforamidas citotóxicas ou os derivados de ácido fosfórico contendo pelo menos um grupo aziridina, lavando-se em seguida os produtos da reacção com água. 0 passo de lavagem com água ou com um solvente aquoso equivalente, por exemplo uma solução suavemente salina, facilita, entre outras consequências, o passo subsequente de transformação dos produtos reaccionais pouco solúveis ou mesmo insolúveis em água, isto é, derivados alcaloides quaternários, em compostos solúveis em água, isto é, sais. Prefere-se que no caso do agente alquilante ser uma substância citotóxica ele também seja solúvel em água ou pelo menos se decomponha em contacto com a água dando componentes solúveis em água, 9 ΡΕ1644012 para permitir uma remoção substancial do agente alquilante por reagir ou de partes dele, da mistura reaccional, durante o passo de lavagem com água. 0 passo de lavagem com água permite simplificar substancialmente o processo de fabrico, atentas as precauções de segurança complicadas devido ao risco de explosão devido aos solventes orgânicos por si próprios, por exemplo o éter dimetilico, já não terem que ser observadas, o que torna o processo facilmente capaz de sofrer um aumento de escala. Para além disto, as componentes solúveis em água presentes na mistura reaccional são deste modo separadas dos produtos reaccionais, sendo removidas. De forma surpreendente, também se verificou que o passo de lavagem tem um impacto positivo sobre a estrutura e a composição dos produtos reaccionais de um tal modo que a eficácia do passo subsequente de transformação dos produtos em formas solúveis em água seja aumentada de entre 10 e 15 vezes, em comparação com um processo em que o passo de lavagem seja levado a cabo utilizando apenas um solvente orgânico, aumentando deste modo de uma forma notável o rendimento em produto pretendido. O processo presente pode ser utilizado, por exemplo, para reacções de alquilação de alcaloides com os compostos carcinostáticos contendo fósforo mencionados na Reivindicação 1 da AT 377.988, sendo especialmente adequados os compostos de fósforo ilustrados na Figura 3 do pedido presente, e em especial os que têm um grupo aziridina. 10 ΡΕ1644012 O termo quelidonina, tal como é utilizado neste documento, entender-se-á como referindo de igual modo quer os membros seleccionados de entre o conjunto constituído por quelidonina, oxiquelidonina e metoxiquelidonina, a não ser aonde se afirmar expressamente algo em contrário ou aonde tal for implicitamente derivável a partir da descrição. Um solvente orgânico aceitável de acordo com a invenção presente é qualquer agente no qual sejam solúveis os alcaloides destinados à reacção. Os alcaloides podem, por exemplo, ser dissolvidos no solvente orgânico que facilita ou que contribui para a reacção de alquilação, tal como um solvente seleccionado de entre o conjunto constituído por monoclorometano, diclorometano, triclorometano, monocloroetano, dicloroetano e tricloroetano. A reacção de alquilação dos alcaloides ocorre a temperatura elevada, preferivelmente ao ponto de ebulição do solvente.

Transforma-se o produto da reacção obtido numa sua forma solúvel em água, após lavagem com água. Isto pode ser levado a cabo de acordo com o processo descrito na AT 377.988 e na AT 354.644, por transformação nos seus sais solúveis em água, em especial nos cloridratos, por exemplo passo-o por uma solução liquida ou gasosa de um ácido forte tal como HC1 gasoso ou adicionando uma solução de HC1 à solução orgânica do produto reaccional lavado, e durante esta operação ou depois dela os cloridratos precipitam. 11 ΡΕ1644012

Parece que este tratamento ácido quebra a liqação entre a maior parte do agente alquilante e um composto intermediário da reacção, formado entre os alcaloides e o agente alquilante, deixando os derivados modificados de alcaloides, em que os azotos que inicialmente eram terciários foram transformados em azotos quaternários, aos quais se liga ao azoto quaternário um protão ou um grupo proveniente do agente alquilante, a titulo de quarto ligando, sendo este grupo escolhido preferivelmente de entre o conjunto constituído por um grupo metilo, etilo, e sulfureto de tris(1-aziridinil)fosfina, ou uma parte do grupo sulfureto de tris(1-aziridinil)fosfina. Para que se entenda melhor, a fórmula (I) seguinte ilustra um produto reaccional alcaloide quaternário da invenção presente, exemplificado com a quelidonina:

HO

RI = metilo, etilo, sulfureto de tris(l-aziridinil)fosfina, metil-R2, etil-R2, sendo R2 uma parte do sulfureto de tris(1-aziridinil)fosfina .

De uma análise dos elementos de um dos produtos reaccionais precipitados de acordo com a invenção presente (veja-se o Exemplo 3) parece - sem que isto signifique a 12 ΡΕ1644012 ligação a uma teoria qualquer - que pelo menos uma parte do agente alquilante ou dos produtos de decomposição do agente alquilante, obtidos após o tratamento em meio ácido da mistura reaccional terminada a alquilação, por exemplo uma reacção de quaternização, podem parcialmente estar ocluidos nos cristais do precipitado ou estar de alguma forma fortemente ligados aos cristais, aguentando deste modo a purificação do precipitado por lavagem com solventes orgânicos tal como o éter e o diclorometano. No entanto, foi possivel provar que o produto da reacção ainda é completamente funcional, mesmo na presença destas substâncias que o acompanham. 0 sal solúvel em água do produto da reacção é adequado para se aplicado em soluções injectáveis.

Numa forma de realização da invenção, leva-se a cabo a reacção com sulfureto de tris (1-aziridinil)fosfina (N° no CAS: 52-24-4), o qual na farmacopeia é também denominado tiotepa. São sinónimos adicionais ledertepa, Onco tiotepa, TESPA, tespamina, tiofosfamida, tio-TEPA, tiotrietilenofosforamida, tifosilo, sulfureto de triaziri-dinilfosfina, fosforotioina-triamida de N,N',N"-tri-l,2-etanodi-ilo; tiofosforamida de N,N',N"-tri-l,2-etanodi-ilo, tri-(etilenoimino)tiofosforamida; N,N',N"-trietilenotio-fosforamida, trietilenotiofosforotriamida, m-trietilenotio-fosforamida, sulfureto de m-tris(aziridin-l-il)fosfina, trietilenotiofosforamida, tris(1-aziridinil)fosfina-sulfor, tris(etilenoimino)tiofosfato, TSPA e WR 45312. 13 ΡΕ1644012

Numa forma de realização adicional da invenção, faz-se reagir um extracto de alcaloides, opcionalmente os alcaloides totais de Chelidonium majus L., num solvente orgânico, com sulfureto de tris (1-aziridinil)fosfina (tio-tepa), e lava-se o produto reaccional resultante, opcionalmente presente como uma mistura de compostos, pelo menos uma vez com água. Uma vez que o tiotepa de decompõe em água, pode remover-se o resíduo de tiotepa por reagir presente em excesso na fase orgânica após a reacção por este processo. Preferivelmente, lava-se diversas vezes a solução orgânica contendo o produto intermediário da reacção, isto é, o composto formado entre o agente alquilante e o alcaloide, saturando-se de cada vez com água. É especialmente preferível que se repita a lavagem até o excesso do tiotepa fortemente tóxico ter sido completamente removido do produto reaccional.

Para além disto, alguns alcaloides solúveis em água que são tóxicos e que contribuem para reacções adversas aquando das aplicações medicinais, podendo mesmo provocar cirrose do fígado, são removidos da mistura reaccional com a fase aquosa, ou as suas concentrações resultam diminuídas. Recorrendo ao teste de Ames, demonstrou-se que o produto da reacção nesta forma de realização, preparado de acordo com a invenção, era não mutagénico.

Quando se parte de um extracto dos alcaloides totais de Chelidonium majus L., o produto final da reacção 14 ΡΕ1644012 é uma mistura de alcaloides incluindo produtos com massas moleculares maiores provenientes da reacção do tiotepa com alcaloides, e produtos de degradação do tiotepa. Em resultado do processo de sintese, as solubilidades dos alcaloides alteram-se. 0 produto da reacção é constituído por uma mistura de cerca de 60 a 70% de alcaloides de Chelidonium por reagir, com cerca de 30 a 40% de produtos da reacção com sulfureto de tris(1-aziridinil)fosfina.

Os alcaloides terciários representam a parte principal das componentes de partida num extracto de alcaloides obtido a partir de Chelidonium majus L.. Por exemplo, podem existir os seguintes alcaloides terciários a título de componentes de partida na mistura para síntese: quelidonina, protopina, estilopina, alocriptopina, cx-homo-quelidonina, quelamidina, quelamina, L-esparteína, queli-dimerina, oxiquelidonina e metoxiquelidonina.

Terminada a reacção de alquilação, os alcaloides quaternários que não reagiram (por exemplo a berberina) são substancialmente removidos da mistura reaccional no passo de lavagem com água, enquanto os alcaloides insolúveis em água que não reagiram e os alcaloides alquilados produtos da reacção permanecem no solvente orgânico. Consoante a natureza do solvente orgânico e/ou do agente alquilante utilizado para a reacção de alquilação, o produto reaccional intermediário resultante pode conter compostos com ligações a tiotepa, nos quais uma molécula de titepa esteja ligada a uma, duas ou três moléculas de quelidonina, oxi- 15 ΡΕ1644012 quelidonina ou metoxi-quelidonina. Para além disto, também pode conter derivados alcaloides alquilados, em que uma molécula de alcaloide, por exemplo uma molécula de quelidonina, de oxiquelidonina ou de metoxi-quelidonina, esteja ligada pelo seu átomo de azoto quaternário a um grupo alquilo linear com uma cadeia curta, em especial a um grupo metilo ou etilo. Podem ainda estar presentes na mistura reaccional outros produtos reaccionais alquilados, após o termo da reacção de alquilação. 0 produto reaccional obtido da reacção dos alcaloides totais de Chelidonium majus L. com tiotepa de acordo com a invenção presente demonstra um melhor espectro de actividades terapêuticas do que o produto reaccional obtido por um processo análogo em que o passo de lavagem tenha sido levado a cabo com um solvente orgânico, por exemplo com éter dietilico. Pelo menos alguns dos compostos presentes no produto reaccional da invenção presente, em especial os derivados quaternários da quelidonina, acumulam-se selectivamente nos tecidos cancerosos e destroem as células cancerosas por apoptose mas - em contraste com a maior parte dos agentes citostáticos conhecidos - sem atacarem também as células saudáveis. Deste modo resulta uma boa tolerância de uma terapia com este preparação e a adequabilidade dela, em geral, para utilização terapêutica e mesmo profilática em individuos com um risco aumentado de desenvolver cancro devido a, por exemplo, uma predisposição hereditária. É simples de manipular e não apresenta reacções adversas significativas, nas doses terapêuticas. 16 ΡΕ1644012 0 produto reaccional obtido por reacção dos alcaloides totais de Chelidonium majus L. com tiotepa exibe actividade biológica ao regular o metabolismo e é adequado para a prevenção e a terapia das doenças metabólicas, tais como a osteoporose, mas também em doenças reumáticas, alergias, infecções virais, epilepsia, esclerose múltipla, cicatrizes, tumores da pele, feridas após as operações e lesões da irradiação.

Um extracto das raizes secas de Chelidonium majus L. pode ser utilizado a titulo de matéria-prima na sintese. As raizes têm um conteúdo mais elevado em alcaloides, em relação ás folhas ou aos caules.

Foi muito recentemente verificado, de forma surpreendente, que quando se parte da quelidonina, da oxiquelidonina ou da metoxiquelidonina comercialmente disponíveis a titulo de única fonte de alcaloides, o produto reaccional obtido de acordo com o método da invenção presente (veja-se por exemplo o Exemplo 3, acima) exibe qualidades terapêuticas e actividades que são pelo menos comparáveis com as do produto da reacção resultante da reacção de alquilação dos alcaloides totais de Chelidonium de acordo com o Exemplo 1. São adequados para fármacos que contenham os produtos reaccionais preparados de acordo com a invenção, 17 ΡΕ1644012 os excipientes farmacêuticos habituais, em especial para soluções, por exemplo soluções para injecção ou infusão, ou para unguentos, compressas ou bases em suspensão.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Fig.l mostra um diagrama de um HPLC com uma composição total caracteristica de alcaloides de raiz de Chelidonium majus L. A Fig.2 mostra a impressão digital em HPLC de uma preparação de acordo com o Exemplo 1. A Fig.3 mostra derivados fosforados seleccio-nados adequados a titulo de reagentes. A Fig.4 mostra um espectro de ressonância magnética nuclear do produto de reacção U-KRS. A Fig.5 mostra um espectro UV do produto reaccional U-KRS. A Fig.6 mostra um espectro UV do cloridrato de quelidonina. A Fig.7 mostra a primeira secção de um espectro de massa do produto reaccional U-KRS. ΡΕ1644012 18 A Fig.8 mostra uma segunda secção de um espectro de massa do produto reaccional U-KRS com uma resolução melhor. A Fig.9 mostra um espectro de massa do cloridrato de quelidonina. ilustrar

Os exemplos seguintes estão incluídos para a invenção.

Exemplo 1 A) Extracção dos alcaloides: a. Suspendem-se em água 25 g de uma mistura de sais de alcaloides e transfere-se a suspensão para uma ampola de decantação. Depois de se adicionarem 100 ml de diclorometano, agita-se a ampola de decantação. Separa-se então a fase orgânica que se filtra para um frasco em vidro. b. Adiciona-se NaOH 1 N (pH 8-9) à fase aquosa até ocorrer uma turvação. Depois de se adicionarem 100 mL de diclorometano, agita-se a mistura. Separa-se então a fase orgânica e combina-se com a fase de diclorometano do passo a. Repete-se este processo, por exemplo 3 vezes. Filtram-se as fases orgânicas e combinam-se. 19 ΡΕ1644012 c. Ajusta-se o pH da fase aquosa a 10 adicionando NaOH. Depois de se adicionar dicloro-metano, agita-se a mistura. Separa-se então a fase orgânica, filtra-se e mistura-se com as outras fases orgânicas. Ajusta-se agora o pH da fase aquosa a 13 com NaOH e repete-se a extracção com diclorometano. d. Evapora-se o conjunto das fases orgânicas para se obter um material oleoso castanho. B) Reacção com sulfureto de tris(l- aziridinil)fosfina:

Dissolve-se o residuo alcaloide em diclorometano, e adiciona-se-lhe sulfureto de tris(1-aziridi-nil)fosfina. Aquece-se a mistura ao refluxo a 80°C durante 2 horas. Depois de se arrefecer até à temperatura ambiente, clarifica-se a mistura reaccional. Leva-se então a cabo uma filtração, e lava-se o filtrado diversas vezes, por exemplo 3 vezes ou mais, com 250 mL de água, numa ampola de decantação. C) Reacção com HC1

Transfere-se a solução lavada para um recipiente em vidro, agita-se e satura-se com HC1 gasoso, precipitando um cloridrato complexo. Separa-se o produto que precipitou 20 ΡΕ1644012 e lava-se com éter dietilico, seca-se e depois dissolve-se em água.

Determina-se em ratos um valor de LD5o de 485 mg/kg para o produto reaccional de acordo com o Exemplo 1. Os estudos em ratinhos e em ratos mostraram que o produto de acordo com a invenção modula a regulação hormonal do timo e induz a sintese de substâncias com uma actividade semelhantes à da timosina em animais cujos timos haviam sido removidos. Este efeito depende da dose. A preparação aumenta o número de linfócitos T no sangue periférico de até 50% (4,04 ± 0,43 x 109/1 antes do tratamento, 6,24 ± 0,73 x 109/L após o tratamento), modula a reacção imunológica humoral a antigénios penetrantes e a actividade natural das células assassinas do baço (198,20 ± 17,69% em comparação com 71,50 ± 9,10% no grupo de controlo) e aumenta o potencial de libertação de interferão dos corpúsculos brancos do sangue em experiências em animais. Os resultados das experiências em animais são confirmados por observações clinicas. Assim, a melhoria dos parâmetros imunológicos também é observada em pacientes cancerosos.

Podem utilizar-se para aplicações profiláticas e imunológicas doses de cerca de 5 mg da preparação do Exemplo 1 por 70 kg de peso corporal. Para o tratamento do cancro, administra-se de preferência 5 mg da preparação por 20 kg de peso corporal. 21 ΡΕ1644012

Exemplo 2: Impressões digitais por HPLC

Levou-se a cabo a determinação por cromatografia de fase reversa de pares iónicos no modo de gradiente e com medição espectral utilizando um detector DAD a 285 nm. Ao mesmo tempo, prepararam-se cromatogramas utilizando alcaloides de referência. Para além disto, levou-se a cabo uma análise por HPLC-MSD, a qual mostrou que não existiam picos para além dos picos dos alcaloides. Os diagramas de HPLC das Figuras 1 e 2 foram obtidos com base nos seguintes dados experimentais:

Parâmetros cromatográficos:

Coluna: LiChrospher 60 RP Select B, 5 ym, 125 x 24 mm de diâmetro interno

Eluente: A) 200 mL (de acetonitrilo) + 800 mL (de água) + 1,5 g (de ácido hexanossulfónico) + 0,3 ml (de ácido fosfórico a 85%) B) 900 mL (de acetonitrilo) + 100 mL (de água) + 1,5 g (de ácido hexanossulfónico) + 0,3 ml (de ácido fosfórico a 85%)

Gradiente: 5 minutos isocraticamente a 100% de A; até 40% de B ao longo de 24 minutos até 100% de B em 1 minuto 5 minutos a 100% de B;

5 minutos em equilibração com 100% de A 22 ΡΕ1644012

Detecção: luz UV a 285 nm

Caudal de eluído: 1 mL/minuto, paragem aos 35 minutos.

Volume injectado: 10 yL Preparação da amostra:

Extracto antes da reacção (Figura 1) : dissolveram-se 25 mg de alcaloides em 40 mL de metanol usando ultra-sons, perfaz-se o volume de 50 mL e filtra-se através de um filtro membrana. Produto reaccional (Figura 2): Transforma-se o produto reaccional no sal cloridrato, dissolve-se em água a uma concentração de 1 mg/mL, e ajusta-se o pH a entre 2,5 e 6,5.

Exemplo 3.

Submeteu-se quelidonina purificada comercialmente disponível (Sigma) a uma reacção com sulfureto de tris(l-aziridinil)fosfina (= tiotepa) segundo as condições descritas no Exemplo 1. Terminada a reacção de alquilação, o passo de lavagem subsequente, e o passo de transformação utilizando HC1 gasoso, processou-se em seguida o produto final como se segue:

Dissolveram-se em água 340 g do produto reaccional tratado com HC1 e portanto solúvel em água, e concentrou-se até quase à saturação deixando-se repousar num frigorífico a 8°C. Após algumas horas, ocorreu uma 23 ΡΕ1644012 precipitação espontânea e recolheram-se 264 mg de precipitado (doravante denominado U-KRS). 0 precipitado incluia cristais higroscópicos ligeiramente amarelados que apresentavam um intervalo de fusão razoavelmente estreito de 205 - 207 °C (indicando que se tratava de um produto razoavelmente bem cristalizado) e exibiam uma fluorescência azul clara após irradiação com luz UV a 366 nm. Também eram aparentes vestígios de bandas fluorescentes amarela, cor-de-laranja e vermelha. O produto não migrava quando submetido a uma cromatografia em camada fina, permanecendo na posição de deposição (Rf=0), excepto vestígios que migravam para dar um Rf > 0,1. A partir do espectro de ressonância magnética nuclear (RMN) (Figura 4) torna-se claro que o U-KRS contém anéis aromáticos comparáveis aos contidos na molécula de quelidonina. 0 espectro no UV (Figura 5) exibe máximos de absorção a 148, 155, 160, 205, 230 e 282 nm, muito semelhante ao espectro de UV da quelidonina (Figura 6), que difere deste apenas pelo facto de o pico de 230 nm de U-KRS ocorrer a 240 nm na quelidonina. Isto indica que o azoto no U-KRS é quaternário, enquanto na quelidonina ele é terciário.

Podem derivar-se mais pormenores analíticos dos espectros de massa apresentados na Figura 7 e na Figura 8 (U-KRS), bem como na Figura 9 (quelidonina), e do resultado de uma análise elementar do U-KRS que revelou a seguinte composição material (Tab. 1): 24 ΡΕ1644012

Tabela 1: Composição elementar de U-KRS em% da massa total

Elemento % da massa total C 45,70 45, 05 H 5, 84 N 6, 56 6, 37 0 22,25 19, 6 P 3,27 3,27 S 2,78 3,06 Cl 17,29

Os exemplos seguintes mostram diversas aplicações do composto U-KRS que resulta do processo descrito no Exemplo 3.

Exemplo 4: Inibição selectiva do crescimento celular in vitro pelo fármaco antitumoral U-KRS

Materiais e métodos

Fez-se uma cultura de células em frascos de Roux a 37-37,5°C sob uma atmosfera humidificada contendo 8% de C02. Soltaram-se as culturas confluentes com uma solução de 25 ΡΕ1644012 tripsina a 0,01% e EDTA a 0,2% em soro salino tamponizado com fosfato (PBS) e repartiram-se em razões de entre 1:5 e 1:25.

Isolaram-se células endoteliais humanas a partir das veias umbilicais por tratamento com colagenase. O meio de cultura para as células endoteliais era M 199 suplementado com 15% de soro de vitelo termicamente inactivado, 200 pg/mL de factor de crescimento de células endoteliais e 90 pg/mL de heparina.

Microscopia de fluorescência

Cultivaram-se as células em placas de 35 mm e incubaram-se com 100 pg/mL de U-KRS durante 30-60 minutos. Aspirou-se o meio de cultura, lavaram-se as células por duas vezes com PBS. Montaram-se sobre as placas folhas de cobertura e excitou-se a fluorescência com um microscópio de varrimento confocal por laser equipado com uma fonte de laser de árgon. Detectou-se a luz emitida num canal fotomultiplicador. Observaram-se imagens dos sinais num monitor de video utilizando o programa MRC 600 de processamento de imagem.

Resultados 1. Numa gama de 20-40 pg/mL de U-KRS, mediu-se cerca de 55% de inibição do crescimento das células com células endoteliais. Esta concen- 26 ΡΕ1644012 tração matava a linha de células de osteo-sarco-ma humano. Os híbridos dos dois tipos de células demonstravam quase a mesma sensibilidade das células normais. 2. Uma vez que é autofluorescente, pode detec-tar-se o U-KRS intracelularmente. Um microscópio de varrimento por laser permitiu demonstrar uma absorção elevada de U-KRS nas células maliqnas.

Exemplo 5: U-KRS a título de Agente Contra o Cancro - Consumo de Oxigénio

Materiais e métodos

Experiências in vivo em ratinhos. Injectou-se em cada um de dois a cinco animais de controlo 50 pL de uma suspensão de áscitos de um tumor de Ehrlich por via i.p., a qual tinha 8 dias de idade, obtida fresca de um animal doador que era adulto. Não se tratou mais o grupo de controlo. Injectou-se nos animais do grupo em teste 10 mg de U-KRS/kg de peso do animal, na área abdominal, imediatamente após a implantação do tumor.

Resultados

Dos ratinhos a que se havia implantado o tumor de áscitos, aqueles aos quais se havia administrado, quer por 27 ΡΕ1644012 via intraperitoneal, quer subcutânea, o U-KRS, manifestaram um periodo de sobrevivência mais longo do que os animais com o tumor implantado e que não haviam recebido qualquer tratamento.

Quando se mediu o consumo de oxigénio por uma suspensão de tumor de áscitos usando um eléctrodo in vitro, verificou-se um breve aumento do consumo após a adição do U-KRS, seguido no entanto por uma diminuição rápida, diferente da observada na suspensão de controlo com a qual não se misturara U-KRS

Exemplo 6: Modificação da acção antinociceptiva da morfina pelo U-KRS, em roedores.

Materiais e métodos

Animais: As experiências foram conduzidas em ratinhos Swiss albinos machos e em ratos Wistar machos.

Tratamento: Administrou-se o U-KRS por via i.p. em doses a partir de 20 mg/kg para os ratinhos, e a partir 25 mg/kg para ratos.

Procedimentos experimentais: Em cada experiência injectou-se nos quatro grupos de animais 1) placebo, 2) morfina, 3) U-KRS, 4) U-KRS e morfina. 28 ΡΕ1644012

Resultados;

Os resultados indicavam que a administração em simultâneo do U-KRS e de morfina modificava a acção do fármaco narcótico analgésico. Observava-se uma acção antinociceptiva no teste da agitação da cauda em ratos, evidente tal como um aumento do período de latência.

Os resultados presentes mostram que o U-KRS administrado em simultâneo com a morfina altera a susceptibilidade dos animais experimentais à reacção nociceptiva nos testes descritos. Os resultados presentes sugerem que o U-KRS pode interactuar com os fármacos analgésicos que são utilizados no cancro.

Exemplo 7: Indução de morte celular programada bimodal de células malignas pelo derivado U-KRS.

Materials e métodos

Utilizou-se a linha de células K562 de eritro-leucémia, e também o U-KRS produzido sob forma cristalina pura e dissolvido em água a uma concentração de 1,2 mg/mL.

Analisaram-se os conteúdos em ADN das células K562 expostas a diversas concentrações de U-KRS utilizando iodeto de propídio e citometria de fluxo. 29 ΡΕ1644012

Resultados

Os resultados deste estudo mostram que o U-KRS induz programas de morte celular bimodal, o primeiro dos quais, a apoptose, é mediado pelos canais de K+ dependentes de Ca2+ e sensíveis a quinidina; a segunda modalidade, morte celular blister, é mediada impedindo a formação de microtúbulos e induzindo portanto a poliploidia.

Exemplo 8: Influência do U-KRS sobre a síntese de AND, ARN e proteína em células malignas

Materiais e métodos

Colocaram-se 0,5 pCi de timidina marcada com 3H em 20 pL de meio; 0,5 pCi de uridina em 20 pL de meio e 1,0 pCi de leucina em 20 pL de meio, durante 2-4 h em quatro poços contendo concentrações diferentes de U-KRS. Antes disto, haviam-se cultivado as linhas de células, hepató-citos de cobaia, hepatócitos C1L, células de amígdalas humanas, células de linfoma murino, células de mieloma murino, células de Yoshida, dias estirpes de HeLa, EsB-, EB, linfomas, ZAC/1, P815, durante 24 horas a 37°C em placas de 9 poços de microtitulação.

Incubaram-se células WiDr num esquema de certa forma diferente durante 6 e 24 h a concentrações de U-KRS de 1, 4, 8 e 14 pg/mL de U-KRS. 30 ΡΕ1644012

Resultados

As avaliações fluorométricas mostram que o U-KRS tem maior afinidade para elementos do núcleo da célula cancerosa do que para outras áreas da célula cancerosa. Os fenómenos de fluorescência podem mostrar a afinidade forte e rápida que o U-KRS demonstra para tumores e metástases. Não se observaram efeitos tóxicos em células normais em sujeitos tratados com doses de que resulta uma inibição de 100 por cento do crescimento das linhas de células cancerosas que se testaram até à data.

Exemplo 9: Influência do U-KRS sobre xenoenxertos em seres humanos

Materiais e métodos

Obtiveram-se células de tumores humanos a partir de xenoenxertos de e transplantaram-se em série em ratinhos nus. Utilizaram-se estas células num ensaio de formação de colónias in vitro. Incubaram-se as células de tumor continuamente ao longo de pelo menos uma semana, com diversas concentrações do fármaco U-KRS. Isto foi feito com seis tipos diferentes, e classificou-se a formação de colónias para cada tumor. Reportaram-se os efeitos do fármaco sob a forma de percentagem de T/C (Teste/Controlo). 31 ΡΕ1644012

Resultados

Muitos tipos diferentes de tumor são sensiveis ao U-KRS, correlacionando-se com a variedade testada com o U-KRS. Os efeitos tumoricidas parecem depender da capacidade de regeneração do sistema imunológico, cuja estimulação e modulação podem ser conseguidas com o U-KRS.

Exemplo 10: Influência do U-KRS sobre linhas de células malignas humanas

Materiais e métodos

Utilizaram-se quatro linhas de células malignas diferentes: 1) sarcoma de ratinho; 2) carcinoma mamário humano; 3) carcinoma do cólon humano; 4) melanoma humano.

Adicionaram-se aos meios de cultura os derivados U-KRS e PP9AA02.

Após irradiação, plaquearam-se 200 células por poço e incubou-se durante uma semana, em seguida contrastou-se e contou-se.

Resultados

Os resultados apresentados neste documento indicam que os derivados U-KRS e PP9AA02 actuam sobre as 32 ΡΕ1644012 células malignas humanas de uma forma sinergística, como substâncias citotóxicas.

Exemplo 11: Paragem e Apoptose induzida de G2/M por U-KRS em Linhas de Células de Carcinoma Epidermóide

Materiais e métodos

Isolaram-se queratinócitos primários humanos a partir de especímenes de pele neonatal. Tripsinizaram-se folhas de epiderme e recolheram-se por centrifugação suspensões de unicelulares.

Resultados 0 U-KRS inibe a progressão do ciclo celular de uma forma dependente da dose. 0 tratamento com U-KRS afecta a distribuição do ciclo celular e induz apoptose em células A431 e ME180.

A expressão das ciclinas, de CDK e do inibidor de CDK, p27, altera-se após tratamento com U-KRS

Exemplo 12: Efeito Antimetastásico do U-KRS e a sua influência no oxigénio e na energia do metabolismo de ratinhos com melanoma B-16. 33 ΡΕ1644012

Materiais e métodos A experiência foi conduzida sobre ratinhos machos 133 C57B/6. Transplantou-se melanoma metastásico B-16 para o músculo da canela direita de cada ratinho. No 10° dia após o transplante do tumor, repartiram-se os animais por dois grupos. Ao primeiro grupo foi administrado U-KRS no sinus venosus do olho, a uma dose de 1 mg/kg num volume de 0,05 mL: 5 injecções uma vez em dois dias. Ao segundo grupo foram administradas injecções de solução fisiológica estéril no sinus venosus com o mesmo regimen.

Resultados O estudo mostrou que um dia depois das primeiras injecções endovenosas de U-KRS, os indices de regimen de oxigénio no tecido muscular melhoraram notavelmente. A taxa do nivel de pC>2 aumentou até ao máximo durante a inalação de oxigénio e a taxa de decréscimo da pC>2 diminuiu desde o máximo até ao valor inicial depois de cessar a inalação. Nos animais do grupo experimental, alguns indices da fosforilação oxidativa das mitocôndrias do figado também melhoraram no dia após o da administração da preparação. Sabe-se que quando existe progressão do processo maligno, o oxigénio e o metabolismo estão inibidos. Nos ratinhos a que se administraram 5 injecções de U-KRS, essa inibição é menos pronunciada. Nos animais do grupo de controlo, o nivel da tensão de oxigénio no tecido muscular e a taxa de entrega de O2 a ele eram estatisticamente maiores. 34 ΡΕ1644012

Generalizando os dados obtidos é possível concluir que o U-KRS melhora a entrega de oxigénio aos tecidos nos ratinhos com melanoma B/16, e além disso inibe o efeito de destruição do processo maligno sobre a bioenergética do organismo.

Os Exemplos subsequentes ilustram as propriedades de imunomodulação e de regulação do metabolismo do U-KRS, que tornam o U-KRS especialmente adequado para o tratamento terapêutico das reacções alérgicas, de doenças provocadas por vírus (HIV, Hepatites A, B e C, por E. coli, Gripe) , osteoporose, poliartrite, psoríase, e outras doenças ou estados corporais.

Exemplo 13: Aumento da actividade tumoricida dos macrófagos pelo U-KRS

Materiais e métodos

Mantiveram-se ratinhos BALB/c no laboratório emparelhando irmão com irmã. Transplantou-se rotineiramente o tumor Dl DMBA/3 nos BALB/c por injecção s.c.. 0 tumor tornou-se aparente cinco dias após a implantação.

Iniciou-se o tratamento in vivo com U-KRS cinco dias após a implantação subcutânea do tumor. Empregaram-se três vias de administração, isto é, endovenosa, intrape-ritoneal e subcutânea. Todos os três grupos experimentais, com pelo menos 10 ratinhos cada, foram tratados com 5,0 pg 35 ΡΕ1644012 de U-KRS em 0,15 mL de PBS. Esta dosagem foi seleccionada com base em experiências preliminares.

Resultados A taxa de crescimento dos tumores nos ratinhos tratados diminuiu significativamente.

Os animais a que se administrou o U-KRS não demonstraram quaisquer efeitos colaterais nocivos por parte do fármaco.

Exemplo 14: Efeito in vitro do U-KRS sobre o fenótipo de linfócitos humanos normais

Materiais e métodos

Levou-se a cabo o estudo em linfócitos isolados do sangue periférico de 10 voluntários saudáveis. Isolaram-se as células por centrifugação de gradiente de densidade sobre Ficoll-Paque. Determinou-se a viabilidade das células contrastando com azul de tripano a 0,1%, verificando-se ser de 95%.

Contou-se a subpopulação de linfócitos por imunofluorescência utilizando anticorpos monoclonais contra células T totais, células T ajudantes e células T supressoras. Subsequentemente trataram-se as células com fragmentos F/ab/2 de IgG anti ratinho, de coelho conjugados ΡΕ1644012 com FITC, lavou-se com PBS e montou-se sobre lâminas de vidro utilizando poli(álcool vinilico) e glicerol. Nas preparações de controlo, utilizou-se PBS ou soro de ratinho normal em vez dos anticorpos monoclonais.

Resultados 0 estudo presente, indicando a possibilidade de uma influência directa do U-KRS sobre subpopulações de células T, confirmou as observações anteriores de que o U-KRS poderia ser um bom imunoestimulador da imunidade celular em pacientes cancerosos.

Exemplo 15: Propriedades mitogénicas do U-KRS em monócitos do sangue periférico humano

Materiais e métodos

Utilizaram-se células mononucleares do sangue periférico. Diluiu-se o sangue com igual volume de PBS contendo EDTA 1 mM, a pH 7,5, depositando-se uma camada sobre Histopaque 1077. Centrifugaram-se os tubos a 2.000 rpm durante 30 minutos. Recolheram-se as camadas de interface contendo linfócitos e lavou-se três vezes com meio RPMI de cultura de tecidos.

Resultados

Verificou-se que mesmo um periodo curto de 37 ΡΕ1644012 tratamento prévio das células com U—KRS revelava um efeito sinergistico potente sobre a mitogénese de PHA, originando indices de estimulação das células significativamente maiores do que os obtidos apenas com PHA. Para além disto verificou-se que um período curto de tratamento das células com PHA é quase obrigatório para que o U-KRS exerça os seus efeitos mitogénicos.

Este estudo mostra um aumento significativo dos linfócitos circulantes em pacientes com lesões malignas em estados avançados, tratados com U-KRS.

Exemplo 16: Modulação da actividade citolitica de células imunológicas efectivadoras e inibição do crescimento de tumores in vivo, pelo U-KRS

Materiais e métodos Células tumorais: mantiveram-se as linhas de células de mastocitoma P815 e AKIL de leucémia AKR em meio DMEM suplementado com 9,0% de soro fetal de vitelo de bovinos contendo penicilina e estreptomicina.

Resultados 0 estudo presente in vitro demonstra que o U-KRS é um agente eficaz de modificação da resposta biológica aumentando, até 48 vezes, a actividade de lise dos linfócitos do baço obtidos de ratinhos aloimunizados. As 38 ΡΕ1644012 actividades de lise das células de baço tratadas com IL-2 e de linfócitos do exsudado peritoneal também sofreram aumentos significativos após adição de U-KRS ao meio de ensaio de lise mediada por células.

Os resultados, tomados em conjunto com o facto de o U-KRS também aumentar a actividade citolitica dos linfócitos do baço, indicam que o efeito terapêutico do U-KRS, observado in vivo, é mediado pela estimulação da actividade citolitica de células efectivadoras.

Exemplo 17: Influência do ϋ-KRS sobre os parâmetros imunológicos do sangue in vitro e in vivo

Materiais e métodos

Utilizaram-se neste estudo 96 ratos Wistar. A idade inicial era de 16 semanas tanto para os ratos do sexo masculino como do sexo feminino.

Testaram-se o U-KRS e o PHA num teste com timidina-3H sobre linfócitos T, para se avaliar o indice de estimulação a doses de entre 0,01 e 20 yg/mL.

Resultados O U-KRS estimula subconjuntos diferentes dos sistemas hematopoiético e imunológico. Nesta experiência induz-se a reticulocitose como sinal possível de estimu- 39 ΡΕ1644012 lação de determinadas células estaminais ou da activação geral do sistema eritropoiético. Uma vez que não se conseguiram demonstrar alterações das contagens absolutas de leucócitos, pode ser postulado que pela acção do U-KRS apenas se verificaram nesta experiência as propriedades moduladoras fortes, por exemplo uma deslocação dos diferentes subconjuntos.

Foi observada uma estimulação comparável à que se ganhou nestas experiências, in vitro, incluindo a apoptose de células cancerosas.

Exemplo 18: Efeito inibidor do U-KRS sobre a antigenicidade da ovalbumina e a resposta do anticorpo IgE de antiovalbumina em ratinhos

Materiais e métodos

Testou-se a capacidade do U-KRS para inibir a sensibilização induzida por ovalbumina, em ratinhos BALB/c e F1 (BALB/c x C57BI/6J). 0 U-KRS introduzido nos ratinhos misturado com antigénio (ovalbumina) e adjuvante (alúmen) inibiu a sensibilização dos ratinhos, tal como se reflectia por uma resposta menor com anticorpos IgE anti-OA e uma menor libertação de histamina induzida pelo antigénio a partir de células mastro isoladas das cavidades peritoneais dos ratinhos sensibilizados. Testou-se o efeito do U-KRS sobre a antigenicidade da ovalbumina (OA) na anafilaxia, numa reacção anafilática cutânea passiva heteróloga (PCA) em ratos. 40 ΡΕ1644012

Resultados

Os resultados mostram que a OA preparada em mistura com o U-KRS evidenciava uma menor capacidade para reagir com os anticorpos IgE anti-OA que se desenvolvem contra OA nativa em ratinhos, fixada à superfície de células mastro de ratos em reacções PCA heterólogas. Os resultados sugerem que um tratamento prévio da OA com U-KRS pode afectar as suas propriedades antigénicas e a sua capacidade de reagir com os anticorpos IgE anti-OA gerados contra moléculas nativas de IgE.

Exemplo 19: Efeito do tratamento com U-KRS numa fase inicial da osteoporose

Materiais e métodos

Administrou-se U-KRS por via intraperitoneal numa dose de 30 mg/kg diariamente ao longo de seis meses a ratos fêmea com início de osteoporose induzida por ovariectomia. A administração do U-KRS iniciou-se no segundo dia após a operação cirúrgica. No final deste tratamento de longo termo com U-KRS testou-se em cada rato a resistência de cada húmero e mediram-se alguns parâmetros do fémur de cada rato. 41 ΡΕ1644012

Resultados

Os resultados mostram que o decréscimo da resistência mecânica dos húmeros e as alterações do fémur, provocadas pela ovariectomia, eram impedidas pelo tratamento com U-KRS durante seis meses.

Exemplo 20: Influência da preparação de U-KRS sobre virus da gripe e sobre as bactérias E. coli e S. aureus

Materiais e métodos

Cultivaram-se virus da gripe da estirpe APRB/HON1/34 em embriões de galinha com 10 dias de idade.

Utilizaram-se bactérias E. coli derivadas de material clinico corrente e a estirpe 209P de S. aureus. Utilizou-se a preparação de U-KRS da série 290614.

Resultados

Este estudo confirma que existe uma acção anti-infecciosa da preparação de U-KRS no macro-organismo infectado. Esta influência é exercida através da estimulação de alguns elementos do sistema imunitário do hospedeiro devido a uma destruição secundária de micro-organismos ou células infectadas por estes micro-organismos . 42 ΡΕ1644012

Exemplo 21: Actividade biológica do U-KRS no que toca aos vírus da gripe

Materiais e métodos

Utilizou-se uma cultura do virus do tipo A, Port-Chalmers 1/73, da variedade antigénica H3N2.

Inj ectou-se o virus a 1, 10 e 100 EIDso por embrião. 0 U-KRS foi dissolvido de novo em solução de

Hanks.

Resultados

Confirmou-se que o U-KRS tem uma acção contra o desenvolvimento do processo infeccioso.

Exemplo 22: Acção do U-KRS sobre os efeitos da irradiação

Materiais e métodos

Utilizaram-se ratos CBA/J macho com peso corporal de 16/20 g.

Levou-se a cabo uma irradiação de curta duração sobre o corpo inteiro de ratinhos com radiação gama a doses de entre 6,0 Gy e 7,5 Gy. Levou-se a cabo irradiação de ΡΕ1644012 longo termo com a dose acumulada de 8,75 Gy utilizando o dispositivo CEGO.

Administrou-se o U-KRS por via intraperitonial a doses de 0,1, 1,4 e 12 mg/kg de peso corporal.

Resultados

Estudou-se a capacidade do U-KRS para modificar os efeitos da irradiação em ratinhos CBA/J, utilizando uma dosagem de fármaco de entre 0,1 e 12 mg/kg. Verificou-se que o U-KRS aumentava as taxas de sobrevivência dos ratinhos em 50-60% a uma dose de irradiação de entre 5,00 e 7 Gy, sem qualquer efeito à dose de 7,5 Gy. A variação da dosagem de fármaco não influenciava os resultados da irradiação. O principal resultado do estudo presente é ter-se verificado que o U-KRS é capaz de modificar os efeitos da irradiação quando aplicada quer em regímenes profiláticos, quer curativos.

Exemplo 23: Efeitos do U-KRS contra a radiação ionizante

Materiais e métodos

Utilizaram-se linhas de células de carcinoma da mama, adenocarcinomas colo-rectais, glioblastoma e adenocarcinomas do pâncreas e uma preparação de U-KRS. 44 ΡΕ1644012 0 efeito do U-KRS sobre a sobrevivência das células foi testado a concentrações a partir 0,2 yg/mL. Os periodos de exposição foram de 1, 3 e 24 h, após os quais as células foram lavadas com soro salino tamponizado com fosfato e se lhes adicionou meio fresco.

Resultados O tratamento com U-KRS provocou uma alteração diferencial dependente do tempo e da dose sobre a sobrevivência das células clonogénicas. Todas as quatro linhas de células tumorais humanas que se testaram revelaram sensibilidades diferentes em relação ao U-KRS sendo aparente uma redução da sobrevivência clonogénica de até 100 vezes em comparação com fibroblastos humanos, para uma incubação de 24 horas.

Lisboa, 22 de Julho de 2010

Claims (2)

ΡΕ1644012 1 REIVINDICAÇÕES 1. Um processo para o fabrico de um produto reaccional alcaloide que inclua pelo menos um derivado alcaloide diferente da sanguinarina e do cloreto de N-metilprotopina, possuindo este derivado um azoto quaternário, e incluindo o processo: a) proporcionar-se uma mistura reaccional que contenha um solvente orgânico, pelo menos um alcaloide presente na planta Chelidonium majus L. e seleccionado de entre o conjunto constituído por quelidonina, protopina, estilopina, alocriptopina, homoquelidonina, quelamidina, quelamina, L-esparteína, metoxiquelidonina e oxiquelidonina, e um agente alquilante, e levando a cabo a reacção de alquilação fazendo reagir pelo menos um alcaloide com o agente alquilante na presença do solvente orgânico, para permitir a formação de pelo menos um derivado alcaloide com um azoto quaternário; b) terminada a reacção submeter-se a mistura reaccional resultante a pelo menos um passo de lavagem com um solvente aquoso ou com água, para se removerem os compostos solúveis em água presentes na mistura reaccional; e 2 ΡΕ1644012 c) submeter-se a mistura reaccional lavada a um tratamento com um ácido forte sob forma gasosa ou liquida, preferivelmente ácido clorídrico gasoso ou uma solução de ácido clorídrico, transformando-se deste modo pelo menos um derivado alcaloide quaternário numa forma solúvel em água, em especial num sal solúvel em água. 2. 0 processo da reivindicação 1, no qual no passo c) precipite um produto reaccional durante ou depois do tratamento com ácido, no qual em seguida se separe o precipitado do solvente orgânico, e opcionalmente se purifique mais utilizando solventes orgânicos. 3. 0 processo das reivindicações 1 ou 2, no qual a reacção de alquilação seja levada a cabo a uma temperatura elevada, em especial à temperatura de ebulição do solvente. 4. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, no qual se utilize a título de fonte de alcaloides uma mistura de vários ou de todos os alcaloides da Chelidonium majus L., seleccionados de entre os elementos do conjunto constituído por quelidonina, protopina, estilopina, alocriptopina, homoquelidonina, quelamidina, quelamina, L-esparteína, metoxiquelidonina e oxiquelidonina. 3 ΡΕ1644012 5. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, no qual se utilize quelidonina, oxiquelidonina, ou metoxiquelidonina a titulo de única fonte de alcaloides. 6. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, no qual o agente alquilante seja um agente fisiologicamente activo, preferivelmente um agente citotóxico. 7. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, no qual o agente alquilante seja solúvel em água ou se decomponha em componentes solúveis em água, quando entra em contacto com água. 8. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, no qual o solvente orgânico seja seleccionado de entre os elementos do conjunto constituído por monoclorometano, diclorometano, triclorometano, monocloroetano, dicloroetano e tricloroetano. 9. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, no qual o agente alquilante seja o sulfureto de tris(1-aziridinil)fosfina (N° no CAS 52-24-4). 10. O processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, no qual o derivado de alcaloide referido tenha um átomo de azoto quaternário ao qual, a título de quarto ligando, se ligue um átomo de hidrogénio 4 ΡΕ1644012 ou um grupo proveniente do agente alquilante, sendo este grupo seleccionado preferivelmente de entre os elementos do conjunto constituído pelos grupos metilo, etilo e sulfureto de tris(1-aziridinil)fosfina. 11. 0 processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, no qual o derivado de alcaloide referido tenha um átomo de azoto quaternário, e a título de quarto ligando deste átomo, se encontre um produto de decomposição formado através do tratamento com ácido. 12. Um produto reaccional alcaloide que inclua pelo menos um derivado alcaloide diferente da sanguinarina e do cloreto de N-metilprotopina, possuindo este derivado um azoto quaternário e sendo o alcaloide seleccionado de entre os alcaloides quelidonina, protopina, estilopina, alocriptopina, homoquelidonina, quelamidina, quelamina, L-esparteína, metoxiquelidonina e oxiquelidonina, presentes na planta Chelidonium majus L., para utilização a título de fármaco ou medicamento. 13. 0 produto reaccional alcaloide de acordo com a reivindicação 12, que se possa obter por um processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11. 14. 0 produto reaccional alcaloide de acordo com a reivindicação 13, obtido por reacção de um ou mais alcaloides com um agente alquilante, em que no derivado esteja presente um azoto, inicialmente terciário, sob a 5 ΡΕ1644012 forma de azoto quaternário, ao qual, a título de quarto ligando, se ligue um átomo de hidrogénio ou um grupo proveniente do agente alquilante, sendo este grupo seleccionado preferivelmente de entre os elementos do conjunto constituído pelos grupos metilo, etilo, e sulfureto de tris(1-aziridinil)fosfina, ou por uma parte do sulfureto de tris(1-aziridinil)fosfina. 15. 0 produto reaccional alcaloide de acordo com as reivindicações 13 ou 14, no qual esteja presente pelo menos um derivado de alcaloide sob a forma de um sal solúvel em água, preferivelmente sob a forma de um cloridrato. 16. 0 produto reaccional alcaloide de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 15, no qual esteja presente a título de única fonte alcaloide a quelidonina, a oxiquelidonina, ou a metoxiquelidonina. 17. 0 produto reaccional alcaloide de acordo com qualquer uma das reivindicações 13 a 16, em que o produto inclua também pelo menos um composto seleccionado de entre o conjunto constituído por alcaloides terciário que não reagiram, agente alquilante por reagir, e produtos de decomposição do agente alquilante. 18. Um derivado de quelidonina, em que a quelidonina com ocorrência natural esteja presente sob uma forma quaternarizada de acordo com a seguinte fórmula (I), 6 ΡΕ1644012 na qual a título de quarto ligando RI do azoto quaternário esteja presente um hidrogénio ou um grupo metilo ou etilo, para utilização a título de fármaco ou de medicamento. 19. 0 derivado de quelidonina da reivindicação 18 sob uma forma solúvel em água, preferivelmente como um sal de um ácido forte, de preferência sob a forma de u cloridrato. 20. A utilização de um produto reaccional alcaloide reivindicado em qualquer uma das reivindicações 12 a 17, no fabrico de uma composição farmacêutica para a profilaxia ou para o tratamento de uma doença ou de um estado corporal seleccionados de entre o conjunto constituído por uma infecção virai, um cancro, uma disfunção imunológica, uma disfunção metabólica e lesões da irradiação . 21. A utilização de acordo com a reivindicação 20, na qual a doença seja seleccionada de entre o conjunto constituído por alergias, osteoporose, tumores da pele, 7 ΡΕ1644012 infecções pelo vírus da gripe, doenças reumáticas, cicatrizes, feridas pós-operatórias, epilepsia e esclerose múltipla. 22. A utilização de acordo com as reivindicações 20 ou 21, na qual o único alcaloide seja a quelidonina. 23. A utilização do derivado de quelidonina reivindicado nas reivindicações 18 ou 19 no fabrico de uma composição farmacêutica para a profilaxia ou o tratamento de uma doença ou de um estado corporal seleccionados de entre os elementos do conjunto constituído por infecções virais, cancros, disfunções imunológicas, disfunções metabólicas e lesões por irradiação. 24. A utilização de acordo com a reivindicação 23, na qual a doença seja seleccionada de entre o conjunto constituído por alergias, osteoporose, tumores da pele, infecções com o vírus da gripe, doenças reumáticas, cicatrizes, feridas pós-operatórias, epilepsia e esclerose múltipla. Lisboa, 22 de Julho de 2010 ΡΕ1644012 1/11 2/11 ΡΕ1644012 ] l | 1 "1 1 $ %v..^v.y ift V §· j ".· 1 V . V 1 } ‘t* I d «· i 8 8 i m g Ϊ3 or fcL ΡΕ1644012 3/11 LV CHnCIl·. (| ^XH2 | N—-P—N\J CÍhCH? | CH2 N /\ H->C—CPL O CH^CHiOCNH-p- -n; XHj 'ch2 LVI o N /\ H,C—CEIo FIG. 3 (a) o CPI-, rn.nrMW- «- O LVII 'ch2 N /\ H,C—CH2 / \ -NH- O II -P- ~Ny N /\ h2c—c.h3 .CPI, 'CHo Λ CH\ f HaC N-P—N | \ / CH2 CPb—CH2 n /\ h2c—ch2 ch2—ch2 9 / \ II o N-P-N. \ / I CH2—CP12 N /\ H->C-CHi ,ÇH2 ch2 LVII I LIX LX 4/11 ΡΕ1644012 h2c„ HoC" CHo CH-. 0 cm2- -ch2 o HzÇv. 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1 ΡΕ1644012 REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO Esta lista de referências citadas pelo requerente é apenas para conveniência do leitor. A mesma não faz parte do documento da patente Europeia. Ainda que tenha sido tomado o devido cuidado ao compilar as referências, podem não estar excluídos erros ou omissões e o IEP declina quaisquer responsabilidades a esse respeito. Documentos de patentes citadas na Descrição * BE 2028330 1

2 AT 377SSS « US 3S65830A 1 US 5SS1512 A * AT 354644 Literatura que não é de patentes citada na Descrição * ZheoY ei1924, ....... . Va^uests M st ai. S&StSÔSS! ♦ Siav & J'áA CvSecêxi Cbsmm .CMmmniaaSBmc 1976> voi. 41, 225-269 ♦ SclíBíSíft £..Achfvcfr.fthama0#.-%sL.23ÍÍf 1SS-163 ♦ Tafeati hí et aí. Cfi&ntcai awf Pmmsstè&àiàà^Siâfch íin 1373, s^cs 2Í, 1095-1102 ♦ OsívcfcBFStlS PW Af&W íter PtetimsOei 250 SSO-645 ♦ Mtanste RHF st ai. Journal ¢4 Ame$sá«' hsi S ocisíy, 1942. vos 64 1259-16©! ♦ Rerfemam CE atai, axí^sia me ATtssca^ bsiSocsty. 1946. voi, 71 1OJO-1034 ♦ Ziuae ©1L st aí. P^&vrc-rííSííy, 59âS. vtá:. :40i 299-305 1 TbrbIçs. S «t a(. Pímts 2001 v&W, 706-413 * Ssj3«ísitôF T &i ai, ·«& 514, 257-2S6 " * ws««fovs o et si. msmm/. 1881; voi. 24,1ÍS9-Í1S3 * i&híi H st-si. €:mfiwcsí $ na! Bwmdm^ssfí IMMm nm. voi, 33, 4130-4^51 *: Kaitaniehi T «t aS, Jíkírn® 189®, 62. 66--267 « Lotntwsrdira JB et al. S^hess^ssí Pfimm&skigy. 59S6. v:o5. Si. 131-127 2 UMchovaJslaí. t25-132