KR101020680B1 - 4차 켈리도닌 및 알칼로이드 유도체류, 그들의 제조방법 및약제 제조에서의 그들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 알칼로이드 반응 생성물들에 관한 것이며, 상기 알칼로이드 반응 생성물들은 알칼로이드류가 알킬화제, 바람직하게는 티오테파와 반응하고, 그 후 미반응 알킬화제 및 다른 수용성 성분들은 물 또는 적합한 수용성 용매에 의한 세척을 통해 반응 혼합물로부터 제거되고, 그 후 반응 생성물은 강산, 바람직하게는 염산(HCl)에 의한 처리를 거쳐서 반응 생성물들의 수용성 염을 침전시키는 방법으로부터 얻을 수 있다. 침전된 반응 생성물들은 적어도 하나의 4차 알칼로이드 유도체를 포함하고 예방 또는 치료적 응용, 특히, 면역 또는 대사 장애들, 및 암의 치료를 위한 약물로서 적합하다.
알칼로이드, 켈리도닌, 애기똥풀

Description

4차 켈리도닌 및 알칼로이드 유도체류, 그들의 제조방법 및 약제 제조에서의 그들의 용도{QUATERNARY CHELIDONINE AND ALKALOID DERIVATIVES, PROCESS FOR THEIR PREPARATION AND THEIR USE IN MANUFACTURE OF MEDICAMENTS}
본 발명은 약물 개발 및 의료분야에 속하며 알칼로이드 켈리도닌(chelidonine) 및 켈리도닌 분자의 질소가 4차 질소인 그들의 유도체류에 관한 것이다. 본 발명은 또한 그와 같은 화합물들의 제조방법, 그와 같은 화합물들을 포함하는 조성물들 및 다양한 질환들 및 신체 상태들을 치료하기 위한 그들의 응용들에 관한 것이다.
알칼로이드 켈리도닌 및 켈리도닌을 포함하는 조성물들은 대사 장애들 및 종양들을 포함하는 다양한 신체 상태들 및 질환들의 치료에서 켈리도닌 또는 일부 켈리도닌 유도체류의 치료적 응용들에서와 같이, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되어 있다.
DE 2 028 330 및 US 3865 830은 유기 용매 내에서 애기똥풀(Chelidonium majus L.)의 선택된 알칼로이드류를 트리스(1-아지리디닐) 포스핀 술피드와 반응시켜 티오포스포라미드-이소퀴놀린(thiophosphoramide-isoquinoline) 첨가 생성물들(adducts)을 제조하는 방법을 개시한다.
AT 354 644 및 AT 377 988은 염류(salts)로의 전환에 의해 수용성 형태로 제공되는, 제암성(carcinostatic)을 갖는 인 화합물들과의 반응에 의해 알칼로이드류의 인 유도체들을 제조하는 방법을 개시한다. 개시된 방법들의 단점은 반응 생성물들의 수용성 염으로의 전환이 완전하지 않고 반응 생성물들 중 주류가 불수용성으로 남는다는 것이다.
US 5 981 512는 방사능 손상 치료에 대한 AT 377 988 및 AT 354 644에 기술된 물질들의 용도를 개시하고 있다.
전술된 특허들에 개시된 화합물들은 상이한 세포증식 억제제(cytostatic) 및 제암제 활성을 가진다. 알칼로이드류의 혼합물들, 특히 애기똥풀(Chelidonium majus L.)의 전체 알칼로이드류의 혼합물들은 치료학적으로 특히 유망한 것으로 입증되었으며, 그들의 약리학적 활성은 암 치료에 관한 수개의 연구들에서 설명되었다. 반응의 완료 후 미반응 시약은 합성 혼합물로부터 제거된다. 트리스(1-아지리디닐)포스핀 술피드(이후 "티오테파(thiotepa)"로도 표기됨)가 벤젠, 에테르 또는 클로로포름과 같은 유기용매들에 용해성이 있기 때문에, 종래기술에서는 반응 생성물들을 에테르로 세척하여 합성 혼합물로부터 미반응 트리스(1-아지리디닐)포스핀 술피드를 제거하는 방법들이 제안되었다.
약리학적으로 활성을 가지는 켈리도닌 유도체류의 제조에 관한 전술된 종래 기술의 방법들은 인화성 있는 혹은 심지어 폭발성 있는 유기 용매들을 이용한 최종 생성물의 정제를 필요로 한다는 공통점을 가졌으나, 이제 정제가 수용성 용매를 이용하여 수행될 수 있고 보다 좋은 결과들을 가져올 수 있다는 점이 발견되었다.
Zhao Y et al, Chinese Pharmaceutical Bulletin(Yaoxue Tongbao) 16(1981)7-10 및 Database Chemical Abstracts(Online), Database accession no. 1982:173909에서, N-메틸프로토핀 클로라이드가 말라리아를 앓고 있는 환자에 대해 가질 수 있는 가능한 약리학적 효과가 연구되었다.
알칼로이드인 생귀나린 및 그 염들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 다양한 범위의 생물학적 활성들을 보이는 것으로 공지되어 있다. Tanaka S et al, Planta Med 67(2001) 108-113은 생귀나린 클로라이드의 항염증 효과를 기술한다. Schmeller T et al., Phytochemistry 44(1997) 257-266은 식물에서 미생물들, 바이러스들 및 초식동물들에 대한, 생귀나린에 의해 매개되는 화학적 방어의 생화학적 활성을 기술한다. Walterova D et al., Journal of Medicinal Chemistry 24(1981) 1100-1103은 간의 알라닌 아미노기 전이효소의 효소 활성에 대한 생귀나린의 억제 효과를 기술한다. Ishii H et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin 33(1985) 4139-4151 및 Nakanishi T et al., Journal of Natural Products 62 (1999) 864-867은 생귀나린의 항종양 활성을 기술한다. Lombardini JB et al., Biochemical Pharmacology 51(1996) 151-157은 쥐의 심장에서 유래된 미토콘드리아 키나아제의 효소 활성에 대한 생귀나린의 억제 효과를 기술한다. Ulrichova J et al., Toxicology Letter 125(2001) 125-132는 세포 배양에서 간세포들에 대한 생귀나린의 세포독성 효과를 기술한다.
켈리도닌 유도체들과는 다른, 수 종류의 알칼로이드 유도체들의 제조도 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되어 있다. Valpuesta M et al., Tetrahedon 58(2002) 5053-5059는 유기 용매들에서 롬네이아 코울테리(Romneya coulteri)로부터의 주요한 알칼로이드인, 알칼로이드 코울테로핀 (coulteropine)으로부터 수 종류의 알칼로이드 유도체들-시스 및 트랜스형 N-메틸-1-메톡시스틸로피늄 염들(N-methyl-1-methoxystylopinium salts)-의 합성들을 기술한다. Slavik J et. al., Collection of Czechoslowak Chemical Communications 41(1976)285-289는 양귀비(Argemone platyceras LINK et OTTO)의 뿌리들로부터 유래된 요오드화물들 및 과염소산염들의 형태인 알칼로이드 유도체들의 분리를 기술한다. Schmidt E, Archiv der Pharmazie 231(1893) 168-183은 순수한 염기를 과량의 메틸요오드화물과 함께 가열하는 단계 및 알코올로부터의 반응 생성물의 재결정화에 의한 γ-호모켈리도닌-메틸요오드화물의 제조를 기술한다. Takao N et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin 21(1973) 1096-1102는 유기 용매들의 혼합물에서 자주괴불주머니(Corydalis incisa)로부터 유래된 알칼로이드인 11-에피코리놀린과 메틸요오드화물의 반응 및 유기 용매들의 혼합물로부터의 반응 생성물의 재 결정화에 의한 11-에피코리놀린-요오드 메틸레이트의 제조를 개시한다. Danckwortt PW, Archiv der Pharmazie 250(1912) 590-646은 아세톤에 용해된 프로토핀과 과량의 메틸요오드화물의 반응 및 알코올로부터의 반응 생성물의 재결정화에 의한 프로토핀-메틸요오드화물의 제조를 개시한다. Manske RHF et al., Journal of the American Chemical Society 64(1942) 1659-1661은 훈네만니아 푸마리에폴리아 스위트(Hunnemannia fumariaefolia Sweet)로부터 분리된 알칼로이드 훈네마닌(hunnemanine)으로부터 훈네마닌-O-에틸 에테르 메토술페이트를 제조하는 방법을 개시한다. Redemann CE et al., Journal of the American Chemical Society 71(1949) 1030-1034는 알칼로이드 알로크립토핀이 파라가 코코(Faraga coco)로부터 추출되고 상기 반응들은 유기 용매에서 수행되는, 수 종류의 알로크립토핀 유도체들의 제조를 개시한다. Zhang G L et al., Phytochemistry 40(1995) 299-305는 중국산 약용 식물인 닥틸리카프노스 토룰로사(Dactylicapnos torulosa)로부터의 알칼로이드 N-메틸스틸로피움 클로라이드의 추출 및 구조 분석을 개시한다. 켈리도닌 유도체들에 대해, 전술된 공지 기술의 상이한 알칼로이드 유도체들의 제조들은 수용성 용매를 사용한 세척 단계를 포함하지도 암시하지도 않는다.
발명의 간단한 설명
일 양태에서, 본 발명은 알칼로이드류, 특히, 켈리도닌, 옥시켈리도닌 또는 메톡시켈리도닌과 적합한 알킬화제들(alkylating agents)과의 반응 생성물의 제조에 관한 새로운 방법에 관한 것으로, 그 방법은 알킬화 반응의 완료 후에, 수용성 용매, 바람직하게는 물에 의한 적어도 하나의 세척 단계를 포함한다.
본 방법은 또한 낮은 독성 및 광범위한 치료 활성 범위를 가지는 주사용 약학적 제제(preparation)의 제조를 위해 알칼로이드 유도체들을 수용성 염류로 전환하는 단계를 포함한다.
또 따른 양태에서, 본 발명은 예를 들면, 켈리도닌 유도체들을 포함하는 수용성 반응 생성물들에 관한 것이고, 상기에서 알칼로이드 분자 내의 초기의 3차 질소(initially tertiary nitrogen)가 4차 질소로 전환되고, 4차 질소에 대한 제4 리간드는 저급 알킬 잔기, 바람직하게는 메틸 또는 에틸 잔기 또는 치환된 메틸 또는 에틸 잔기, 예를 들면 티오테파 잔기이다. 바람직한 실시예에서, 4차 켈리도닌 유도체들은 대상 조직들, 특히, 암성(cancerous) 조직들에 선택적으로 축적되는 것과 같은 속성을 가진다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 4차 알칼로이드 유도체들, 특히, 본 발명에 따른 방법에서 수득가능한 4차 켈리도닌 유도체들을 포함하는 약학적 조성물들에 관한 것이다.
본 발명은 또한 4차 알칼로이드 유도체들을 포함하는 반응 생성물들의 치료적 응용들에서의 약물로서의 용도 및 다양한 질환들 또는 신체 상태들의 치료를 위 한 약학적 조성물들의 제조를 위한 상기 유도체들의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시예들은 청구항들에 기재된다.
본 발명에 따른 방법은 유기 용매에서 알칼로이드 또는 알칼로이드류의 혼합물을 알킬화제, 바람직하게는 그 자체가 치료 활성을 가지는 알킬화제, 예를 들면 세포독성(cytotoxic) 포스포라미드류 또는 적어도 하나의 아지리딘 기를 포함하는 인산 유도체들과 반응시키는 단계를 포함한다. 물 또는 예를 들면 연한 염 용액(mild salt solution)과 같은 물과 동등한 수용액에 의한 세척 단계는 특히, 수용성이 낮거나 불수용성인 반응 생성물들, 즉, 4차 알칼로이드 유도체들의 수용성 성분들, 예를 들면 염들로의 후속 전환 단계를 촉진한다. 알킬화제가 세포독성 물질인 경우 물에 의한 세척 단계를 통해 반응 혼합물로부터 미반응 알킬화제 또는 그들 중 일부의 실질적인 제거를 가능하게 하기 위해 알킬화제는 수용성 또는 적어도 물과 접촉시 수용성 성분들로 분해되는 것이 바람직하다.
디메틸에테르와 같은 순수한 유기 용매들의 폭발 위험에 따른 복잡한 안전 예방책들이 취해지지 않아도 되기 때문에 물에 의한 세척 단계는 제조 공정을 실질적으로 단순화할 수 있게 하고, 따라서 그 공정의 규모를 용이하게 확장할 수 있다. 또한, 반응 혼합물에 존재하는 원하지 않는 수용성 성분들이 이에 따라 반응 생성물들로부터 분리되고 제거된다. 놀랍게도, 세척 단계가 순수한 유기 용매를 이용하여 수행되는 방법과 비교할 때, 생성물들의 수용성 형태로의 후속 전환 단계의 효율이 10 내지 15배까지 개선되므로 세척 단계는 반응 생성물들의 구조 및 조성에 대해 긍정적인 효과를 가지며 이에 따라 원하는 최종 산물의 수율을 크게 개선한다는 것도 발견되었다.
본 방법은 예를 들면, 알칼로이드류와 AT 377 988의 제 1항에 개시된, 제암성의 인 함유 화합물들의 알킬화 반응들에 대해 사용될 수 있고, 인 함유 화합물들은 본 명세서의 도 3에 도시된 인 화합물들이 특히 적합하며, 가장 특별하게는 아지리딘 기들 포함하는 화합물들이 적합하다.
본 명세서에서 사용되는 켈리도닌(chelidonine)이라는 용어는 다르게 기술되거나 설명으로부터 암묵적으로 다르게 유도될 수 있는 경우가 아니라면, 마찬가지로 켈리도닌, 옥시켈리도닌 및 메톡시켈리도닌으로 구성된 군으로부터 선택되는 것들 중 하나를 가리키기 위해 사용될 것이다.
본 발명에 따른 적합한 유기 용매는 반응에 사용될 알칼로이드가 용해될 수 있는 임의의 제제이다. 알칼로이드류는 예를 들면, 모노클로로메탄, 디클로로메탄, 트리클로로메탄, 모노클로로에탄, 디클로로에탄 및 트리클로로에탄으로 구성되는 군으로부터 선택되는 용매와 같은, 알킬화 반응을 촉진하거나 이에 기여하는 유기 용매에 용해될 수 있다.
알칼로이드류의 알킬화 반응은 상승된 온도, 바람직하게는 용매의 비등점에서 수행된다.
결과물인 반응 생성물은 물에 의한 세척 단계 후에 수용성 형태로 전환된다. 이는 AT 377 988 및 AT 354 644에 개시된 방법에 따라, 수용성 염들, 특히, 염산염들로의 전환에 의해 수행될 수 있는데, 예를 들면, 액상이나 HCl 가스와 같은 기체 상태의 강산에 통과시키거나 세척된 반응 생성물의 유기 용액에 HCl 용액을 첨가하고, 그 과정에서 또는 그 후에 염산염들이 침전된다. 이와 같은 산 처리에 의해, 알킬화제의 대부분이 알칼로이드류와 알킬화제 간에 형성된 중간 반응 화합물로부터부터 분리되고, 변형된 알칼로이드 유도체들만 남게 되며, 반응 초기의 3차 질소 원자들이 4차 질소들로 전환되고, 4차 질소에 수소 잔기 또는 알킬화제로부터 유래된 잔기가 제 4 리간드로서 결합되는데, 잔기는 바람직하게는 메틸, 에틸 및 트리스(1-아지리디닐) 포스핀 술피드 잔기로 구성되는 군, 또는 트리스(1-아리지디닐) 포스핀 술피드의 일부로부터 선택된다. 이해를 돕기 위해, 다음의 식 (I)은 켈리도닌으로 예시된, 본 발명의 전형적인 4차 알칼로이드 반응 생성물을 도시하며:
Figure 112005051021020-pct00001
R1 = 메틸, 에틸, 트리스(1-아지리디닐) 포스핀 술피드, 메틸-R2, 에틸-R2이고, R2는 트리스(1-아지리디닐) 포스핀 술피드의 일부분이다.
본 발명(실시예 3 참조)에 따라 침전된 반응 생성물들 중 하나의 원소 분석(elementary analysis)으로부터, 예를 들면, 4차화 반응(quaternating reaction)과 같은 알킬화의 완료 후 반응 혼합물의 산 처리에 의해 얻어지는, 알킬화제 또는 알킬화제의 분해 화합물들의 적어도 일부가 침전물의 결정들에서 어느 정도까지 흡장(occlude)되거나 결정들에 다소 강하게 결합되어, 에테르 및 디클로로메탄과 같은 유기 용매들에 의한 세척을 통한 침전물의 정제 단계를 견뎌내게 되는 것으로 -이론에 의해 제한되지 않고-보인다. 그럼에도 불구하고, 반응 생성물은 그와 같은 수반되는 물질들의 존재 하에서도 여전히 완전히 제 기능을 발휘하는 것으로 입증될 수 있다.
반응 생성물의 수용성 염은 주사 용액들의 응용에 적합하다.
본 발명의 일실시예에서, 반응은 약전에서 티오테파(thiotepa)로도 알려져 있는 트리스(1-아지리디닐) 포스핀 술피드(CAS No. 52-24-4)와 수행된다. 이와 유사한 물질들은 레데르테파(ledertepa), 온코 티오테파(Onco thiotepa), TESPA, 테스파민(tespamine), 티오포스파미드, 티오-TEPA, 티오트리에틸렌포스포라미드, 티포실(tifosyl), 트리아지리디닐포스핀 술피드, N,N',N"-트리-1,2-에탄디일포스포로티오인 트리아미드(N,N',N''-tri-1,2-ethanediylphosphorothioine triamide); N,N',N"-트리-1,2-에탄디일티오포스포라미드, 트리-(에틸렌이미노)티오-포스포라미드; N,N',N"-트리에틸렌티오포스포라미드, 트리에틸렌티오포스포로트리아미드, m-트리에틸렌티오포스포라미드, m-트리스(아지리딘-1-일)포스핀 술피드, 트리에틸렌티오포스포라미드, 트리스(1-아지리디닐)포스핀 설퍼, 트리스(에틸렌이미노) 티오인산, TSPA 및 WR 45312가 있다.
본 발명의 다른 실시예에서, 유기용매에 용해된 애기똥풀(Chelidonium majus L.)의 알칼로이드류, 선택적으로 전체 알칼로이드류의 추출물을 트리스(1-아지리디닐)-포스핀 술피드(티오테파)와 반응시키고, 선택적으로 화합물들의 혼합물로 존재하는 결과물인 반응 생성물은 물을 사용하여 적어도 1회 세척한다. 티오테파는 물에서 분해되기 때문에, 반응 후, 과량으로 존재하는 티오테파의 미전환 잔여물은 이 방법를 통해 유기상으로부터 제거될 수 있다. 바람직하게는, 중간 반응 생성물, 즉 알킬화제와 알칼로이드 간에 형성된 화합물을 포함하는 유기 용액은 수회 세척되고, 매 세척시 물로 포화된다. 특히 바람직하게는, 독성이 강한 티오테파의 과량이 반응 생성물로부터 완전히 제거될 때까지 세척단계가 반복된다.
또한, 의학적 응용들에서 부작용에 기여하고 간경변까지 유발할 수 있는, 일부 수용성의 독성 알칼로이드류는 수성상과 함께 합성 혼합물로부터 제거되거나 그 농도들이 낮아진다. 에임스(Ames) 테스트에 의해, 본 발명에 따라 제조된, 본 실시예의 반응 생성물은 돌연변이성(mutagenic)이 아니라는 것이 입증되었다.
애기똥풀로부터의 전체 알칼로이드 추출물을 개시물질로 하는 경우, 최종 반응 생성믈은 티오테파와 알칼로이드의 보다 고분자량의 반응 생성물들을 포함하는 알칼로이드류 및 티오테파의 분해 생성물들의 혼합물이다. 합성 방법의 결과, 알칼로이드류의 용해도들이 변한다. 반응 생성물은 약 60 내지 70 %의 미반응 애기똥풀 알칼로이드류와 약 30 내지 40 %의 트리스(1-아지리디닐)포스핀 술피드의 혼합물로 구성된다.
3차 알칼로이드류는 애기똥풀로부터 얻은 알칼로이드 추출물의 개시 성분들의 주류를 차지한다. 예를 들면, 다음의 3차 알칼로이드류가 합성 혼합물에 개시 성분들로서 포함될 수 있다: 켈리도닌, 프로토핀(protopin), 스틸로핀(stylopin), 알로크립토핀(allocryptopin), α-호모켈리도닌, 켈라미딘(chelamidine), 켈라민(chelamine), L-스파르테인(L-sparteine), 켈리디메린(chelidimerine), 디히드로생귀나린(dihydrosanguinarine), 옥시생과린(oxysanguarine), 옥시켈리도닌 및 메톡시켈리도닌.
알킬화 반응의 완료 후에, 미반응 4차 알칼로이드류(예를 들면, 베르베린(berberine))는 물에 의한 세척 단계를 통해 반응 혼합물로부터 실질적으로 제거되며, 반면에 미반응 불수용성 알칼로이드류 및 알킬화된 알칼로이드 반응 생성물들은 유기 용매에 남는다. 알킬화 반응에 사용되는 유기 용매 및/또는 알킬화제의 속성에 따라, 결과물인 중간 반응 생성물은 티오테파와 결합된 화합물들(thiotepa-linked compounds)을 포함할 수 있으나, 하나의 티오테파 분자는 한 개, 두 개, 또는 세 개의 켈리도닌, 옥시-켈리도닌 또는 메톡시-켈리도닌 분자들에 결합된다. 또한, 알킬화된 알칼로이드 유도체들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 켈리도닌, 옥시-켈리도닌 또는 메톡시-켈리도닌 분자와 같은 알칼로이드 분자가 4차 질소에서 단사슬 직선형 알킬 잔기, 특히 메틸 또는 에틸기에 결합된다. 또한, 알킬화 반응의 완료 후에 추가적인 알킬화된 반응 화합물들이 반응 혼합물에 존재할 수 있다.
본 발명에 따라 애기똥풀의 전체 알칼로이드들과 티오테파의 반응으로부터 얻어지는 반응 생성물은 세척 단계가 디에틸에테르와 같은 유기 용매에 의해 수행되는 유사한 방법으로부터 얻어지는 반응 생성물보다 더 양호한 치료 활성들의 범위를 가진다. 본 발명에 반응 생성물에 존재하는 적어도 일부 화합물들, 특히 4차 켈리도닌 유도체들은 선택적으로 암성 조직들에 축적되고 가장 널리 공지된 세포증식 억제제들과는 달리, 건강한 세포들은 공격하지 않고 세포자사(apotosis)에 의해 암 세포들을 파괴한다. 이는 유전적 소인 등 때문에 암 발병 위험이 높은 개인들에 대해 본 제제를 통한 치료의 우수한 내용력(tolerance) 및 치료 및 예방적 사용에 대한 일반적인 적합성을 가져온다.
애기똥풀(Chelidonium majus L.)의 전체 알칼로이드류와 티오테파의 반응으로부터 얻어지는 반응 생성물은 신진대사의 조절(regulation)에 생물학적 활성을 가지며 골다공증과 같은 대사질환뿐 아니라 류머티스성 질환, 알레르기, 바이러스성 감염, 전간, 다발성 경화증, 흉터, 피부암 및 수술 후 상처들 및 방사선 조사 손상의 예방 및 치료에 적합하다.
애기똥풀(Chelidonium majus L.)의 건조된 뿌리들의 추출물이 본 합성의 개시물질로 사용될 수 있다. 그 뿌리들은 줄기나 잎들보다 더 높은 함량의 알칼로이드류를 가진다.
놀랍게도, 가장 최근에, 상업적으로 입수 가능한 켈리도닌, 옥시켈리도닌 또는 메톡시켈리도닌을 유일한 알칼로이드 원천(source)으로하여 반응을 개시하는 경우, 본 발명의 방법(예를 들면, 실시예 3 참조)에 따라 얻어지는 결과물인 반응 생성물은 실시예 1에 따라 전체 애기똥풀 알칼로이드류의 알킬화 반응으로부터 얻어지는 반응생성물에 적어도 견줄만한 정도의 치료적 특성들 및 활성들을 가진다는 것이 발견되었다.
예를 들면 주사 용액 또는 주입용액과 같은 용액들, 또는 연고, 습포(compress) 또는 현수 베이스(suspensory base)를 위한 통상의 약학적 부형제들은 본 발명에 따라 제조된 반응 생성물을 포함하는 약물들에 적합하다.
도 1은 애기똥풀(Chelidonium majus L.) 뿌리들의 특징적인 전체 알칼로이드 조성물의 HPLC 다이어그램을 도시한다.
도 2는 실시예 1에 따른 제제의 HPLC 핑거프린트를 도시한다.
도 3은 적합한 시약들로서 선택된 인 유도체들을 도시한다.
도 4는 반응 생성물 U-KRS의 NMR(핵자기공명) 스펙트럼을 도시한다.
도 5는 반응 생성물 U-KRS의 UV 스펙트럼을 도시한다.
도 6은 켈리도닌 염산염의 UV 스펙트럼을 도시한다.
도 7은 반응 생성물 U-KRS의 질량 스펙트럼의 제 1 부분(first section)을 도시한다.
도 8은 보다 높은 해상도에서 반응 생성물 U-KRS의 질량 스펙트럼의 제 2 부분(second section)을 도시한다.
도 9는 켈리도닌 염산염의 질량 스펙트럼을 도시한다.
다음 실시예들은 본 발명을 더 설명하기 위해 제공된다.
실시예 1
A) 알칼로이드류의 추출:
a. 25 g의 알칼로이드 염 혼합물을 물에 현탁시키고 분별 깔대기로 옮긴다. 100 ml의 디클로로메탄을 첨가한 뒤, 분별 깔대기를 흔들어준다. 그 후, 유기상을 분리해내고 유리병으로 여과시킨다.
b. 1 N의 NaOH(pH 8 내지 9)을 수성상이 흐려져 탁하게 될 때까지 수성상에 첨가한다. 100 ml의 디클로로메탄을 첨가한 뒤에, 혼합물을 흔들어준다. 그 후, 유기상을 분리하고 a 단계의 디클로로메탄 상과 결합시킨다. 이 방법의 수행은 예를 들어, 3회 반복한다. 유기상들을 여과시키고 결합한다.
c. 수성상은 NaOH를 첨가하여 pH를 10으로 조절한다. 디클로로메탄을 첨가한 뒤에, 혼합물을 흔들어준다. 그 후, 유기상을 분리하고, 여과하여 다른 유기상들과 혼합한다. 수성상은 NaOH로 pH를 13까지 조절하고, 디클로로메탄에 의한 추출을 반복한다.
d. 결합된 유기상들을 증발시켜 오일성의 갈색 물질을 얻는다.
B) 트리스(1-아지리디닐)포스핀 술피드와의 반응:
알칼로이드계 잔여물을 디클로로메탄에 용해시키고, 트리스(1-아지리디닐) 포스핀 술피드를 첨가한다. 혼합물을 80 ℃에서 2시간 동안 환류(reflux)한다. 실온으로 냉각시킨 후에, 반응 혼합물은 맑게 되었다. 그 후 여과를 수행하고 여과물은 분별 깔대기에서 250 ml의 물로 수차례, 예를 들면 3회 이상 세척한다,
C) HCl과의 반응
세척된 용액을 유리 비커로 옮겨 교반하고 HCl 가스로 포화시켜, 염산염 착물(hydrochloride complex)을 침전시킨다. 침전된 생성물을 여과하고, 디에틸 에테르로 세척하고, 건조시켜 물에 용해시킨다.
쥐(rat)들에서, 485 mg/kg의 LD50 수치는 실시예 1에 따른 반응 생성물로부터 결정되었다. 생쥐들(mice) 및 쥐들(rats)에 대한 연구들은 본 발명에 따른 생성물 은 흉선(thymus)의 호르몬 조절을 변화시키고 흉선이 제거된 동물들에서 티모신-유사 활성을 갖는 물질들의 합성을 유도한다는 것을 보여주었다. 이와 같은 효과는 투여량-의존성이 있다(dose-dependent). 본 제제는 말초혈에서 T-림프구의 수를 50 %(처리 전에는 4.04 ± 0.43 × 109/l, 처리 후에는 6.24 ± 0.73 × 109/l)까지 증가시키고, 침투 항원에 대한 체액면역반응 및 비장 세포들의 자연살세포(natural killer cell) 활성을 변화시키며(제어군에서 71.50 ± 9.10 %와 비교하여 198.20 ± 17.69 %), 동물 실험들에서 백혈구의 인터페론 유리 가능성(interferon liberation potential)을 증강시킨다. 동물 실험들의 결과들은 임상 관찰들에 의해 확인된다. 따라서, 암환자들에서 면역 파라미터들의 향상도 관찰되었다.
체중 70 kg 당, 실시예 1의 제제를 약 5 mg의 투여량들로 예방 및 면역학적 응용들에 사용할 수 있다. 암치료에서, 체중 20 kg 당 본 제제를 5 mg 투여하는 것이 바람직하다.
실시예 2: HPLC 핑거프린트
구배 모드(gradient mode) 및 285 nm에서 DAD 검출기를 이용한 스펙트럼 측정을 통한 이온쌍 역-상 크로마토그래피(ion pair reverse-phase chromatography)로 측정이 수행되었다. 동시에, 크로마토그램들은 기준(reference) 알칼로이드류를 이용하여 준비되었다. 또한, HPLC-MSD 분석이 수행되었고, 이 분석은 알칼로이드류의 피크들과 떨어져서 존재하는 피크들이 없다는 것을 보여주었다. 도 1 및 2 의 HPLC 다이어그램들은 다음의 실험 데이터를 기초로 작성되었다:
크로마토그래피 파라미터들:
컬럼 : LiChrospher 60 RP Select B, 5㎛, 125 x 24 mm ID
용리제 : A) 200 ml(아세토니트릴) + 800 ml(물) + 1.5 g(헥산술폰산) + 0.3 ml(85% 인산)
B) 900ml (아세토니트릴) + 100 ml (물) + 1. 5 g(헥산술폰산) + 0.3 ml(85% 인산)
구배: 5 분 등가적으로 100% A;
24 분 40%까지의 B
1 분 100%까지의 B
5 분 100% B;
5 분 100% A와 평형
검출: 285 nm에서 UV광
용출액 유량: 1 ml/분, 35분 뒤 중단.
주입량 : 10 ㎕
표본 준비:
반응 전 추출액(도 1): 25 mg의 알칼로이드류를 40 ml의 메탄올에 초음파를 사용하여 용해시키고, 50 ml까지 만들어 막 필터를 통해 여과한다.
반응 생성물(도 2): 반응 생성물은 염산염(hydrochloride salt)으로 전환시키고, 1 mg/ml의 농도로 물에 용해시키며, pH 를 2.5 내지 6.5로 조절한다.
실시예 3
구매 가능한, 정제된 켈리도닌(시그마사)을 실시예 1에서 기술된 조건들에 따라 트리스(1-아지리디닐)포스핀 술피드(=티오테파)와 반응시켰다. 알킬화 반응, 후속 세척 단계 및 HCl 가스를 이용한 전환 단계의 완료 후에, 최종 생성물을 추가적으로 다음과 같이 처리했다:
340 g의 HCI-처리되어 수용성이 된 반응 생성물을 물에 용해시키고 포화상태에 가까운 정도까지 농축한 후 8℃에서 냉장고에 방치했다. 수시간 경과 후, 자발적인 침전이 일어났으며 264 mg의 침전물(이후 U-KRS로 칭함)을 회수했다. 침전물은 205-207℃의 비교적 좁은 용융점 범위를 가지며(상당히 잘 결정화된 생성물을 의미함) 366 nm의 UV-광 조사시 엷은 파란색의 형광을 보이는 약간 노란빛을 띠는 흡습제 결정들을 포함했다. 노란색, 오렌지색 및 빨간색 형광 밴드들의 흔적들도 관찰할 수 있었다. 생성물은 박막 크로마토그래피에서 이동되지 않았으나, Rf > 0.1 정도까지 최소한 이동된 흔적들을 제외하고는 출발점(Rf=0)에 남아있었다. 핵자기공명(NMR) 스펙트럼(도 4)에서, U-KRS가 켈리도닌 분자에 포함되어 있는 것들에 유사한 방향족 고리들을 포함한다는 것이 명백해진다. UV 스펙트럼(도 5)은 148, 155, 160, 205, 230 및 282 nm에서 최대 흡광도를 보여주며, 이는 켈리도닌의 UV 스펙트럼(도 6)과 매우 유사하고, 다만, U-KRS의 230 nm에서의 피크가 켈리도닌에서는 240 nm에서 나타난다는 점만 다르다. 이는 U-KRS의 질소는 4차이며, 반면에 켈리도 닌에서는 그 질소가 3차임을 의미한다.
추가적인 분석 세부사항들은 도 7 및 도 8(U-KRS) 및 도 9(켈리도닌)에 도시된 질량 스펙트로그램들 및 물질의 다음과 같은 조성을 보여주는 U-KRS의 원소 분석의 결과로부터 유추될 수 있다(표 1):
표 1: U-KRS의 원소 조성들(총 질량 대비 %)
원소 총 질량 대비 %
C 45.70
45.05
H 5.84
N 6.56
6.37
O 22.25
19.6
P 3.27
3.27
S 2.78
3.06
Cl 17.29
다음의 실시예들은 실시예 3에 기술된 절차로부터 얻어지는 화합물 U- KRS의 다양한 응용들을 보여준다.
실시예 4: 항종양제 U-KRS에 의한 체외(in vitro) 세포 성장의 선택적 억제
재료 및 방법
세포 배양은 8% CO2를 포함하는 습화된(humidified) 대기 및 37-37.5℃에서 Roux 병(bottle)들에서 수행되었다. 융합성 배양주(confluent culture)들은 인산 완충 식염수(PBS)에 용해된 0.01% 트립신 및 0.2% EDTA 용액에 의해 분리되고 1:5 내지 1:25의 비율로 나뉘었다.
사람의 내피 세포들은 콜라겐 분해효소 처리에 의해 제대 정맥들로부터 분리되었다. 내피 세포들의 배양 배지는 15%의 열에 의해 불활성화된 소 태아 혈청(fetal calf serum), 200㎍/ml의 내피 세포 성장 인자 및 90㎍/ml의 헤파린으로 보강된 M199였다.
형광 현미경 관찰
35mm 디쉬(dish)들에서 세포들을 키우고 30-60분간 100㎍/ml의 U-KRS와 함께 배양하였다. 배양 배지는 흡인기로 제거하고 세포들은 PBS로 2회 세척되었다. 커버 슬립(cover slip)을 세포들 위에 덮고 아르곤 레이저 광원을 갖춘 공초점 레이저 주사 현미경(confocal laser scanning microscope)을 이용하여 형광을 여기시켰다. 방사된 빛은 광전자 증배관(photomultiplier) 채널에서 검출되었다. MRC 600 이미지 프로세싱 소프트웨어를 이용하여 비디오 모니터 상에 신호들의 상이 형성되게 하였다.
결과
1. 20-40 ㎍/ml의 U-KRS 범위에서 내피 세포들의 세포 성장의 약 55% 억제가 측정되었다. 이 농도는 사람의 골육종 세포주를 사멸시켰다. 두 종류의 세포들의 하이브리드는 정상적인 세포들과 거의 동일한 민감도를 보였다.
2. 자체의 자가형광(autofluorescence) 때문에, U-KRS는 세포 내부에서 검출될 수 있다. 레이저 주사 현미경은 악성 세포들에서 U-KRS의 높은 흡수(uptake)을 보여주었다.
실시예 5: 항암제로서의 U-KRS - 산소 소비
재료 및 방법
생쥐들에 대한 체내 실험들. 2 마리 내지 5 마리 대조군 동물들에게 각각 완전히 성숙된 도너(donor) 동물로부터 새롭게 취해지고 8일된, Ehrlich 생쥐 복수 종양 현탁액 (Ehrlich mouse ascites tumour suspension)을 복강 내에 주사하였다. 대조군에 대한 추가적인 처리는 없었다. 실험군에 종양 이식 직후 복부 부분에 동물 무게 1 kg당 10mg의 U-KRS를 주사하였다.
결과
복수 종양이 이식된 생쥐들은 U-KRS의 복강 내 또는 피하 투여 후, 처리되지 않았던 이식 동물들보다 긴 생존 시간을 보였다.
체외에서 전극에 의해 복수 종양 현탁액의 산소 소비량의 측정은 U-KRS이 ㅊ첨가 후 소비량의 짧은 증가를 가져왔으나, U-KRS와 혼합되지 않은 대조 현탁액의 경우와 달리 급속한 감소로 이어졌다.
실시예 6: 설치류에서 U-KRS에 의한 몰핀의 통증 억제(antinociceptive) 활성 조절
재료 및 방법
동물들: 수컷 알비노 스위스(Albino Swiss) 생쥐들 및 수컷인 위스타(Wistar) 쥐들을 대상으로 실험들을 수행하였다.
처리: U-KRS은 생쥐들에 대해서는 20 mg/kg, 쥐들에 대해서는 25 mg/kg로부터 개시되는 투여량들로 복강내(i.p.) 투여하였다.
실험 절차: 각 실험에서, 4개의 동물군들에게 1)위약, 2)몰핀, 3)U-KRS, 4) U-KRS 및 몰핀을 주사하였다.
결과:
결과들은 U-KRS와 몰핀의 동시 투여는 마약성 진통제의 작용을 변형시켰다. 그들은 쥐들에 대한 꼬리치기 시험(tail-flick test)에서 통증 억제제 작용(antinociceptive action)을 가져왔으며, 이는 잠복기의 증가로서 입증되었다.
본 결과들은 몰핀과 동시에 투여되는 U-KRS는 전술된 테스트들에서 실험 동물들의 통증 반응(nociceptive reaction)에 대한 감수성(susceptibility)을 변화시킨다는 것을 보여준다. 본 결과들은 U-KRS가 암에서 사용되는 진통제 약물들과 상호작용할 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 7: 악성 세포들에서 유도체 U-KRS에 의한 양봉적으로 프로그램된 세포 사망(bimodal programmed cell death)의 유도.
재료 및 방법
K562 적백혈병(erythroleukaemia) 세포주를 사용하였고 U-KRS는 순수한 결정화된 형태로 제조하여 1.2 mg/ml의 농도로 물에 용해시켰다.
프로피디움 요오드화물 및 유세포분류기(Flow Cytometry)를 이용하여 U- KRS의 다양한 농도들에 노출된 K562 세포들의 DNA 함량을 분석하였다.
결과
본 연구의 결과들은 U-KRS가 양봉적(bimodal) 세포 사멸 프로그램들을 유도하여, 제1 사멸인 세포자사(apotosis)는 퀴니딘에 민감한 Ca2 +-의존적인 K+ 채널들에 의해 이루어졌고; 제 2 양식인, 블르스터(blister) 세포 사멸은 미세소관(microtubule) 형성을 억제하여 이에 의해 배수성을 유도하여 이루어졌다.
실시예 8: 악성 세포들에서 DNA, RNA 및 단백질 합성에 대한 U-KRS의 영향
재료 및 방법
20 ㎕ 배지에 포함된, 3H로 표지된 티미딘 0.5μCi; 20 ㎕ 배지에 포함된 우리딘 0.5μCi 및 20 ㎕ 배지에 포함된 루이신 1.0 μCi를 상이한 U-KRS 농도를 가진 4개의 웰(well)에 2-4 시간 동안 방치하였다. 그 전에, 기니어 피그 간세포, C1L 간세포, 사람의 편도선 세포들, 쥐의 림프종, 쥐의 골수종, 요시다 세포들, 2 개의 HeLa 종들인 EsB-, EB, 림프종들, ZAC/1, P815 세포주들을 96개의 미세 적정량 웰(microtiter well)들에서 37℃ 에서 24시간 동안 배양하였다.
1, 4, 8 및 14 ㎍/ml의 U-KRS 농도들에서 6 및 24시간 동안 약간 다른 방식으로 WiDr 세포들을 배양하였다.
결과
형광 분석 형광법의 측정값들(fluorometric evaluations)은 암세포의 다른 영역들 대비 암세포 핵들에 대한 U-KRS의 강한 친화도를 보여준다. 형광 현상들은 명확하게 종양 및 전이된 영역들에서 U-KRS에 의해 발휘되는 강하고 신속한 친화도를 보여줄 수 있다. 현재까지 테스트되었던 암세포주들에서 100% 성장 억제적인 투여량들로 처리된 정상 세포들에서 독성 효과들이 관찰되지 않는다.
실시예 9: 사람의 이종이식(xenografts)에 대한 U-KRS의 영향
재료 및 방법
종양 세포들을 사람의 종양 이종이식으로부터 취하여 순차적으로 누드 생쥐들에게 이식하였다. 이 세포들을 체외에서 집락 형성 분석법(colony-forming assay)에 사용하였다. 종양 세포들을 수 종류의 농도들의 U-KRS와 함께 적어도 1주일간 연속적으로 배양하였다. 이는 6가지 상이한 유형들과 함께 수행되었으며 각 종양에 대해 집락 형성을 평가하였다. 약물 효과들은 퍼센트 T/C(실험군/대조군)로 기록되었다.
결과
다수의 종류의 종양들은 U-KRS에 민감했으며, U-KRS에 의해 테스트된 변종들과 상관관계를 가진다. 종양사멸(tumouricidal) 효과들은 면역 기구(immune apparatus)의 재생력에 의존적인 것으로 보이며, 면역 기구의 자극 및 조정은 U-KRS에 의해 달성될 수 있다.
실시예 10: 사람의 악성 세포주(human malignant cell line)들에 대한 U-KRS의 영향
재료 및 방법
4 종류의 상이한 악성 세포주들을 사용하였다: 1) 생쥐의 육종(mouse sarcoma); 2) 여성의 유방암(female mammary carcinoma); 3) 사람의 결장암(human colon carcinoma); 4) 사람의 흑색종(human melanoma).
U-KRS 및 PP9AA02 유도체들을 배양 배지에 첨가하였다.
조사(irradiation) 후, 슬라이드당 200개의 세포들을 넣고 1주일간 배양한 후 염색해서 세포수를 측정하였다.
결과
제시된 결과들은 U-KRS 및 PP9AA02 유도체들이 세포독성 물질들로서 상승적으로 사람의 악성 세포주들에 대해 작용한다는 것을 시사했다.
실시예 11: 사람의 표피 종양 세포주(Human Epidermoid Carcinoma Cell Line)들에서 U-KRS에 의해 유도된 G2/M 정체(arrest) 및 세포자사(Apoptosis)
재료 및 방법
사람의 일차 (배양) 각화상피세포들(primary human keratinocytes)을 신생아의 피부 시편들(speciment)로부터 분리하였다. 표피판들(epidermal sheets)을 트립신으로 처리하고 원심분리에 의해 단일 세포 현탁액들을 회수하였다.
결과
U-KRS는 투여량-의존적인 방식으로 세포 주기 진행을 억제한다.
U-KRS 처리는 세포 주기 분포에 영향을 미치고 A431 및 ME 180 세포들에서 세포자사를 유도한다.
사이클린류, CDK류 및 CDK 억제제 p27의 발현은 U-KRS 처리 후에 변한다.
실시예 12: U-KRS의 항전이(antimetastatic) 효과 및 흑색종(melanoma) B-16을 가진 생쥐들의 산소 및 에너지 대사에 대한 영향
재료 및 방법
본 실험은 133 C57B/6 수컷 생쥐들을 대상으로 수행하였다. 전이되는 멜라노마 B-16을 각 생쥐의 우측 정강이 근육으로 이식하였다. 종양 이식 후 제 10일차에, 동물들을 두 개의 군들로 분리하였다. 제 1군은 U-KRS를 0.05ml의 용량에 포함된 1 mg/kg의 투여량으로 눈의 정맥동에 투여하고; 2일에 1회씩 5회 투여하였다. 제 2 군은 동일한 투약 계획으로 멸균된 생리 용액을 정맥동에 투여하였다.
결과
본 연구는 U-KRS의 제 1 정맥 주사 후 다음날, 근육 조직에서 산소 섭생(regime)의 지표들이 두드러지게 개선되었다는 것을 보여주었다. pO2 수준의 속도는 산소 흡입 동안 최대 수준까지 증가되고, 흡입 중단 후 pO2 의 속도가 최대 수준에서 초기 수준까지 감소되었다. 실험군의 동물들에서 간 미토콘드리아의 산화적 인산화의 지표들도 제제 투여 다음날 개선되었다. 악성화 과정의 진행 하에서 산소 및 대사가 억제된다는 것이 알려져 있다. 5회의 U-KRS 투여를 받은 생쥐들에서, 그와 같은 억제는 덜 두드러졌다. 제어군의 동물들에서, 근육 조직에서 산소 분압의 수준 및 근육조직으로의 O2 전달 속도는 통계학적으로 더 높았다. 얻어진 데이터를 일반화하면, B/16 멜라노마를 가진 생쥐들에서 U-KRS는 조직으로의 산소의 전달을 개선할 뿐 아니라 개체의 생체 에너지 영역(bioenergetics)에 대한 악성화 과정의 파괴적 효과를 억제한다고 결론지을 수 있다.
다음의 실시예들은 U-KRS를 특히 알레르기 반응들, 바이러스성 질환들(HIV, 헤파타이티스 A, B, 및 C, 대장균, 인플루엔자), 골다공증, 다발 관절염, 건선, 및 기타 질환들 또는 신체 상태들의 치료적 처리에 특히 적합하게 만드는 U-KRS의 면역-조정(immuno-modulating) 및 대사-조절적(metabolism-regulating) 특성들을 설명한다.
실시예 13: U- KRS에 의한 대식 세포의 종양파괴(tumoricidal) 활성의 증강
재료 및 방법
실험실에서 형매교배(brother/sister mating)들에 의해 BALB/c 생쥐들을 유지하였다. 종양 D1 DMBA/3를 피하 주사에 의해 BALB/c에 정기적으로(routinely) 이식하였다. 이식 5일 후 종양이 뚜렷해졌다.
U-KRS의 체내 처리는 피하 종양 이식 5일 후 개시하였다. 3가지 투여 경로,즉, 정맥, 복강내 및 피하 투여를 사용하였다. 각각 최소한 10마리의 생쥐들을 가지는 3개의 실험군들 모두에 PBS 0.15ml에 포함된 5.0μ U-KRS를 투여하였다. 이 투여량은 사전 실험들에 근거하여 선택되었다.
결과
처리된 생쥐들에서 종양 성장 속도는 상당히 감소되었다. U-KRS를 투여받은 쥐들은 유독한 약물관련 부작용들을 보이지 않았다.
실시예 14: U-KRS의 정상적인 사람의 림프구들의 표현형에 대한 체외 효과들
재료 및 방법
본 연구는 10명의 건강한 자원자들의 말초혈로부터 분리된 림프구들에 대해 수행하였다. 세포들을 Ficoll-Paque 밀도 구배 원심분리 상에서 분리하였다. 세포들의 생존력(viability)을 0.1% 트립판 블루 염색에 의해 결정하였고 95%로 파악되었다.
전체 T-세포들, 보조 T-세포들(T-helper cells) 및 억제 T-세포들(T- suppressor cells)에 대한 단일클론 항체들을 이용한 면역 형광법(immunofluorescence)에 의해 림프구 부차집단(subpopulation)의 양을 측정하였다. 그 후, 세포들을 FITC/복합 래빗 F/ab/2 단편들 항-마우스 IgG로 처리하고 PBS로 세척하고 폴리비닐 알코올 및 글리세롤을 이용하여 슬라이드들 상에 올렸다. 제어군 준비에서는, PBS 또는 정상적인 생쥐 혈청을 단일클론 항체들 대신에 사용하였다.
결과
U-KRS의 T-세포 부차집단들에 대한 직접적인 영향의 가능성을 시사하는 본 연구는 U-KRS가 암 환자들에서 세포성 면역의 양호한 면역 자극제(immunostimulator)가 될 수 있다는 종전의 발견사항들을 확인했다.
실시예 15: 사람의 말초혈 백혈구들에 대한 U-KRS의 분열 유도(mitogenic) 특성들
재료 및 방법
말초혈 단핵 세포들. 혈액을 pH 7.5의 1 mM EDTA를 포함하는 동량의 PBS로 희석하고 Histopaque 1077 상에 층을 이루도록 적용하였다. 튜브들을 2000rpm에서 30분간 원심분리하였다. 림프구들을 포함하는 인터페이스 층들을 모아서 RPMI 조직 배양 배지로 3회 세척하였다.
결과
U-KRS에 의한 세포의 단시간의 예비처리라도 PHA의 체세포분열에 T-세포분열(mitogenesis)에 대한 강력한 상승 효과를 가져서, PHA 단독의 경우보다 상당히 높은 세포 자극 지표들을 가져온다는 것이 발견되었다. 또한, 세포들에 대한 PHA 처리의 단시간이 U-KRS가 분열 유발 효과들을 발휘하는 데 거의 필수적이라는 점이 발견되었다.
본 연구는 U-KRS로 처리된 악성 종양들의 진행된 단계들에 있는 환자들에서 혈액 내 림프구들의 상당한 증가를 보여준다.
실시예 16 : U-KRS에 의한 면역 주효 세포(immune effector cell) 세포융해 활성의 조절 및 체내에서의 종양 성장 억제
재료 및 방법
종양 세포들: 비만세포종(mastocytoma) P815 및 AKR 백혈병(leukaemia) AKIL 세포주들을 페닐실린 및 스트렙토마이신을 포함하는 9.0% 우태혈청(bovine fetal calf serum)을 첨가한 DMEM 배지에서 유지하였다.
결과
본 체외 연구는 U-KRS는 동종 면역된(alloimmunized) 생쥐들로부터 얻어진 비장 림프구들의 용해 활성을 48배까지 증가시키는 효과적인 생물학적 반응 변형자라는 것을 보여준다. IL-2 처리된 비장 세포들 및 복막 삼출(peritoneal exudate) 림프구들의 용해 활성들도 세포에 의한 용해 분석용 배지(cell-mediated lysis assay medium)에 U-KRS를 첨가하는 것에 의해 상당히 증가되었다.
U-KRS도 비장 림프구(lyphocyte)들의 세포용해성 활성을 증강시킨다는 점과 함께 고려할 때, 본 결과들은 체내에서 얻어진 U-KRS의 치료적 효과가 면역 주효 세포의 세포용해 활성을 자극하여 이루어진다는 것을 시사한다.
실시예 17: 체외 및 체내에서 면역학적 혈액 파라미터들에 대한 U-KRS의 영향
재료 및 방법
본 연구를 위해 96 마리의 Wistar 쥐들을 사용하였다. 수컷 및 암컷 쥐들 모두 초기 연령은 16주였다.
0.01 내지 20 ㎍/ml의 투여량들에서 자극 지표를 평가하기 위해 T 림프구들에 대한 #Hthymidine 테스트에서 U-KRS 및 PHA를 테스트하였다.
결과
U-KRS는 조혈(haematopoietic) 및 면역계들의 상이한 서브세트들을 자극한다. 본 실험에서 일부 줄기 세포들의 자극 또는 적혈구 조혈계(erythropoietic system)의 전반적인 활성화의 가능한 징후로서 용혈성 빈혈이 유도된다. 백혈구의 절대적 수효의 변화가 입증될 수 없기 때문에, U-KRS의 작용에 의해 강력한 조절 특성들, 예를 들면, 상이한 서브세트들의 전위(dislocation)만이 본 실험에서 일어났다고 주장될 수 있다.
암세포들에서의 세포자사를 포함하는, 본 실험들에서 얻어진 자극에 견줄만한 자극이 체외에서 관찰되었다.
실시예 18: 생쥐들에서 난백 알부민(ovalbumin)의 항원성 및 항 난백 알부민 IgE 항체 반응에 대한 U-KRS의 효과
재료 및 방법
U-KRS가 난백 알부민-유도 증감화(sensitization)를 억제하는 능력을 BALB/c 및 F1 (BALB/c x C57BI/6J) 생쥐들에서 테스트하였다. U-KRS를 항원(난백 알부민)과의 혼합물로 생쥐들에 투여하였고 보조제(백반)는 생쥐들의 증감화를 억제하였으며 이는 보다 낮은 항-OA IgE 항체 반응 및 증감화된 생쥐들의 복강으로부터 분리된 비만 세포들로부터의 항원-유도 히스타민 분비의 감소로 나타났다. 과민증(anaphylaxis)에서 오드(od) 난백 알부민(OA)의 항원성에 대한 U-KRS의 효과는 쥐들에 대한 외생 피동형 피부 아나필락시스(heterologous passive cutaneus anaphylactic (PCA)) 반응에서 테스트되었다.
결과
결과들은 U-KRS를 포함하는 혼합물로 준비된 OA는 이종 조직 PCA 반응들에서 생쥐들의 내생(native) OA 에 대해 형성되고 쥐의 비만 세포들의 표면 상에 고정된 항-OA IgE와 반응하는 감소된 능력을 가진다는 것을 보여준다. 결과들은 OA의 U-KRS 예비-처리가 그의 항원성 특성 및 내생 IgE 분자들에 대해 형성된 항-OA IgE 항체들과 반응하는 능력에 영향을 미칠 수 있다는 것을 시사한다.
실시예 19: 초기 골다공증에 대한 U-KRS 치료의 효과
재료 및 방법
U-KRS를 6개월간 격일로 난소절제술(ovariectomy)-유도된 조기 골다공증을 가진 암컷 쥐들에게 30mg/kg의 투여량으로 복강 내에(intraperitoneally) 투여하였다. U-KRS의 투여는 외과 수술 후 제 2일차에 개시되었다. U-KRS의 장기 처리의 종료시, 각 쥐에 대해 양 상완골(humeri)의 강도를 테스트하고 쥐 대퇴골(femur)의 일부 파라미터들을 측정하였다.
결과
결과들은 상완골의 기계적 강도의 감소 및 난소절제술에 의해 유발된 대퇴골의 일부 변화들이 6개월의 U-KRS 처리에 의해 예방되었다는 것을 보여준다.
실시예 20: 인플루엔자 바이러스 및 대장균(E. coli) 및 S. aureus에 대한 U-KRS 제제의 영향
재료 및 방법
APR8/HON1/34 종의 인플루엔자 바이러스들은 10일된 암탉 배아들에서 배양되었다;
당시 임상 물질(current clinical materila)로부터 유래한 E. coli 및 S. aureus의 종 209P가 사용되었다. 290614 시리즈의 U-KRS 준비.
결과
본 연구는 감염된 비현미적 미생물(macro organism)에서 U-KRS 제제의 항-전 염제 활성의 존재를 확인한다. 이 영향력은 이 미생물들에 의해 감염된 미생물들 또는 세포들의 2차적 파괴에 따른 숙주 면역계의 일부 요소들의 자극을 통해 발휘된다.
실시예 21: 인플루엔자 바이러스에 대한 U-KRS의 생물학적 활성
재료 및 방법
A형 바이러스, Port-Chalmers 1/73 배양, 항원 H3N2 변종. 본 바이러스를 배아당 1, 10, 및 100 EID50으로 투여하였다. U-KRS는 핸크 용액(Hanks solution)에 다시 용해시켰다.
결과
U-KRS는 감염 프로세스의 진행시 방해 작용(hampering action)을 가진다는 것이 확인되었다.
실시예 22: 방사선 조사(irradiation)의 효과들에 대한 U-KRS의 작용
재료 및 방법
체중 16/20g의 CBA/J 수컷 생쥐들.
6.0Gy 내지 7.5Gy 범위의 투여량들에서 생쥐들의 단기 전신 감마선-조사( short-term whole-body gamma-irradiation)를 수행하였다. CEGO 장치를 이용하여, 8.75 Gy의 누적 투여량의 장기 조사를 수행하였다.
0.1, 1.4 및 12 mg/체중 kg의 투여량들로 U-KRS를 복강 내로 투여하였다.
결과
U-KRS가 방사선 조사의 효과들을 변형하는 능력이 0.1 내지 12 mg/kg의 약물 투여량들을 이용하여 CBA/J 생쥐들에서 연구되었다. U-KRS는 5.00 내지 7Gy의 조사량에서 생쥐들의 생존율을 50-60%까지 증가시키고 7.5Gy의 투여량에서는 효과가 없다는 것이 발견되었다.
본 연구의 주 결과는 U-KRS가 예방 및 치료 목적으로 적용될 때 방사선 조사의 효과들을 변형시킬 수 있다는 발견이다.
실시예 23: 전리 방사선에 대한 U-KRS의 효과들
재료 및 방법
유방암(Brest carcinoma), 직장 선종(colorectal adenocarcinoma), 교아종(glioblastoma) 및 췌장 선종 세포주들. U-KRS 제제.
U-KRS의 세포 생존에 대한 효과를 0.2μG ML 범위의 농도에서 테스트하였다. 노출 시간들은 1, 3, 및 24시간이었고, 그 후 세포들을 인산/완충 식염수로 세척하 고 새로운 배지를 첨가하였다.
결과
U-KRS 처리는 클론원성(clonogenic) 세포 생존의 차별적인 시간- 및 투여량-의존적인 감소를 가져왔다. 테스트된 4개의 사람 종양 세포주들은 모두 U-KRS에 대해 상이한 민감도들을 보였고, 24시간 배양된 사람의 섬유아세포들과 비교할 때, 100배까지 더 높은 클론원성 생존의 감소를 보였다.

Claims (34)

  1. 알킬화된 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 또는 이들의 혼합물을 포함하는 켈리도닌 또는 케리도닌 유도체 반응 생성물을 제조하는 방법으로서:
    a) 유기 용매, 약용식물인 애기똥풀(Chelidonium majus L.) 유래의 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 또는 이들의 혼합물, 및 알킬화제를 포함하는 반응 혼합물을 제공하고, 4차 질소를 가지는 알킬화된 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체를 생성하기 위해, 상기 유기 용매의 존재 하에 상기 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 또는 이들의 혼합물을 상기 알킬화제와 함께 반응시키는 단계;
    b) 상기 반응의 종료 후에, 상기 반응 혼합물에 존재하는 수용성 성분들을 제거하기 위해 상기 결과적으로 얻어진 반응 혼합물을 수용성 용매 또는 물에 의한 적어도 하나의 세척 단계를 거치게 하는 단계; 및
    c) 상기 세척된 반응 혼합물을 기체 또는 액체 형태인 강산에 의한 처리를 거치게 하여 상기 알킬화된 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체를 수용성 형태로 전환하는 단계;
    를 포함하며,
    여기에서 상기 알킬화제는 세포독성인 포스포라미드류 또는 적어도 하나의 아지리딘기를 포함하는 인산 유도체인 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 반응 생성물을 제조하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 단계 c)에서 반응 생성물은 산에 의한 처리 동안 또는 그 후에 침전되고, 그 후 상기 침전물은 상기 유기 용매로부터 분리되고, 선택적으로 유기 용매들을 사용하여 더 정제되는, 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 반응 생성물을 제조하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 알킬화 반응은 상기 용매의 비등점에서 수행되는 것인, 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 반응 생성물을 제조하는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 알킬화제는 수용성이거나 물과의 접촉시 수용성 성분들로 분해되는 것인, 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 반응 생성물을 제조하는 방법.
  8. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 유기 용매는 모노클로로메탄, 디클로로메탄, 트리클로로메탄, 모노클로로에탄, 디클로로에탄 및 트리클로로에탄으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 반응 생성물을 제조하는 방법.
  9. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 알킬화제는 트리스(1-아지리디닐) 포스핀 술피드(CAS 52-24-4)인, 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 반응 생성물을 제조하는 방법.
  10. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 알킬화된 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체는 4차 질소 원자를 가지며, 상기 4차 질소원자는 제 4 리간드와 결합하고 있고, 제4 리간드는 수소 잔기 또는 상기 알킬화제의 산분해 결과에서 유래되는 잔기인, 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 반응 생성물을 제조하는 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 알킬화제의 산분해 결과에서 유래되는 잔기는 메틸기, 에틸기, 치환된 메틸기, 치환된 에틸기, 및 트리스(1-아지리디닐) 포스핀 술피드 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 반응 생성물을 제조하는 방법.
  12. 삭제
  13. 제1항에 따른 방법에서 수득 가능한 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 반응 생성물로서 상기 알킬화된 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체는 4차 질소 원자를 가지며, 상기 4차 질소원자는 제 4 리간드와 결합하고 있고, 제4 리간드는 수소 잔기 또는 상기 알킬화제의 산분해 결과에서 유래되는 잔기인, 켈리도닌 유도체 반응 생성물.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 알킬화제의 산분해 결과에서 유래되는 잔기는 메틸기, 에틸기, 치환된 메틸기, 치환된 에틸기, 및 트리스(1-아지리디닐) 포스핀 술피드 잔기로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인, 켈리도닌 유도체 반응 생성물.
  15. 제 13항 또는 제 14항에 있어서,
    상기 알킬화된 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체는 수용성 염의 형태로 존재하는, 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 반응 생성물.
  16. 삭제
  17. 제 13항 또는 제 14항에 있어서,
    상기 반응 생성물은 미반응 4차 켈리도닌, 미반응 알킬화제 및 상기 알킬화제의 산분해 생성물들로 구성되는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물을 더 포함하는 것인, 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 반응 생성물.
  18. 켈리도닌 유도체로서, 상기 자연적으로 존재하는 켈리도닌은 다음의 식 (I)에 따른 4차화된(quaternated) 형태로 존재하며,
    Figure 112009018662691-pct00014
    상기 4차 질소에 대한 제 4 리간드 R1으로서, 수소 또는 메틸 또는 에틸 잔기가 존재하는, 약물 또는 약제로서의 사용을 위한 켈리도닌 유도체.
  19. 제 18항에 있어서,
    수용성 형태인, 켈리도닌 유도체.
  20. 제 18항 또는 제 19항에 있어서,
    상기 켈리도닌 유도체는 148nm, 155nm, 160nm, 205nm, 230nm 및 282nm에서 최대 흡광도를 갖는 UV 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는, 켈리도닌 유도체.
  21. 제13항에 따른 반응 생성물을 유효 성분으로 포함하는, 바이러스 감염, 암, 면역 장애(immunological dysfunction), 대사 장애 및 방사선 조사 손상으로 구성되는 군으로부터 선택되는 질환 또는 신체 상태의 예방 또는 치료를 위한 약학적 조성물.
  22. 제 21항에 있어서,
    상기 질환은 알레르기류, 골다공증, 피부암류, 인플루엔자 바이러스 감염들, 류마티스성 질환들, 흉터들, 수술 후 상처들, 전간(epilepsy) 및 다발성 경화증(multiple sclerosis)으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  23. 제 21항 또는 제 22항에 있어서,
    상기 반응 생성물은 148nm, 155nm, 160nm, 205nm, 230nm 및 282nm에서 최대 흡광도를 갖는 UV 스펙트럼을 갖는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
  24. 바이러스 감염, 암, 면역 장애, 대사 장애 및 방사선 조사 손상으로 구성되는 군으로부터 선택되는 질환 또는 신체 상태의 예방 또는 치료를 위한, 제 18항 또는 제 19항에 따른 켈리도닌 유도체를 포함하는 약학적 조성물.
  25. 제 24항에 있어서,
    상기 질환은 알레르기, 골다공증, 피부암류, 인플루엔자 바이러스 감염들, 류마티스성 질환들, 흉터들, 수술 후 상처들, 전간 및 다발성 경화증으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 약학적 조성물.
  26. 삭제
  27. 제 1항에 있어서,
    상기 기체 또는 액체 형태인 강산은 기체 형태의 염산 또는 염산 용액인 것인, 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 반응 생성물을 제조하는 방법.
  28. 제 1항에 있어서,
    상기 수용성 형태는 수용성 염인, 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 반응 생성물을 제조하는 방법.
  29. 삭제
  30. 삭제
  31. 제 15항에 있어서,
    수용성 염은 염산염(hydrochloride)인 것인, 켈리도닌 또는 켈리도닌 유도체 반응 생성물.
  32. 제 19항에 있어서,
    상기 수용성 형태는 강산의 염의 형태인, 켈리도닌 유도체.
  33. 제 32항에 있어서,
    상기 강산의 염의 형태는 염산염의 형태인, 켈리도닌 유도체.
  34. 삭제
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