NO333672B1 - Kvaterne chelidonin- og alkaloidderivater, fremgangsmate for fremstilling av samme, samt anvendelse av disse for fremstilling av medikamenter - Google Patents

Abstract

2005-12-19 Sammendrag Det beskrives alkaloidreaks jonsprodukter som oppnås i en prosess hvor alkaloider reageres med et alkylerende middel, fortrinnsvis tiotepa, hvoretter ikke-reagert alkylerende middel og andre vannløselige forbindelser fjernes fra reaksjonsblandingen med å vaske med vann eller et egnet vandig middel, hvoretter reaksjonsblandingen underlegges en behandling med sterk syre, fortrinnsvis hydrogenklorid (HCl) for å presipitere et vannløselig salt av reaksjonsproduktene. De presipiterte reaksjonsprodukter omfatter minst ett kvartært alkaloid derivat og er egnet som medikamenter for profylaktiske eller terapeutiske applikasjoner, fortrinnsvis i behandling av immunologiske eller metabolske feilfunksjoner, og kreft.

Description

OMRÅDE FOR OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å fremstille et alkaloid reaksjonsprodukt omfattende minst et alkaloidderivat med et kvaternært nitrogen, samt et vannløselig chelidoninderivat og anvendelse av et vannløselig alkaloidreaksjonsprodukt omfattende minst ett alkaloidderivat som har et kvaternært nitrogen, hvor alkaloidet omfatter chelidonin.

TEKNIKKENS STILLING

Alkaloid chelidonin og materialer inneholdende chelidonin er kjent innen fagfeltet, og likeledes terapeutiske applikasjoner av chelidonin eller noen chelidoninderivater i behandling av forskjellige kroppstilstander og sykdommer, inkluderende metabolsk dysfunksjon og tumorer.

DE 2 028 330 og US 3 865 830 beskriver fremstilling av tiofosforamidisoquinolinaddukter ved å reagere selekterte alkaloider av Chelidonium majus L. med tris(l-aziridinyl)fosfinsulfid i et organisk løsemiddel.

AT 354 644 og AT 377 988 beskriver fremgangsmåter for fremstilling av fosforderivater av alkaloider ved reaksjon med karsinostatiske fosforforbindelser, som er tilveiebrakt i en vannløselig form ved omdanning til deres salter. En ulempe med de beskrevne prosesser er at omdanningen av reaksjonsproduktene til et vannløselig salt ikke er fullstendig, og den vesentlige del av reaksjonsproduktene forblir vannløselige.

US 5 981 512 beskriver anvendelse av substansene i AT 377 988 og AT 354 644 for behandling av bestrålingsskader.

Forbindelsen beskrevet i nevnte patent har forskjellige cytostatiske og karsinostatiske aktiviteter. Blandinger av alkaloider, spesielt av de totale alkaloider av Chelidonium majus L. har vist seg å være terapeutisk spesielt lovende, og den farmakologiske aktivitet av disse har blitt demonstrert i flere studier med cancerbehandling. Ikke-reagert reagens fjernes fra synteseblandingen etter fullføring av reaksjonen. Siden tris(l-aziridinyl)fosfinsulfid (heretter benevnt som "tiotepa") er løselig i organiske løsemidler, så som benzen, eter eller kloroform, er det foreslått innen teknikkens metoder å fjerne det ureagerte tris(l-aziridinyl)fosfinsulfid fra synteseblandingen ved å vaske reaksjonsproduktene med eter.

Idet de ovenfor nevnte fremgangmåter ifølge teknikken for fremstilling av farmakologisk aktive chelidonin derivater har som felles at de krever rensing av det finale produkt til anvendelse av brennbare eller også eksplosive organiske løsemidler, ble det funnet at rensing også kan utføres med bedre resultat ved å benytte en vandig løsning.

Y. Zhao et al., Chinese Pharmaceutical Bulletin, vol. 16, nr. 6, 1981, s. 7-10 beskriver at en mulig farmakologisk effekt av N-metylprotopinklorid på pasienter med malaria er studert.

Alkaloidet sanguinarin og dets salter er kjent innen fagfeltet å oppvise et bredt spekter av biologiske aktiviteter.

Tanaka S et al., Planta Med 67 (2001) 108 - 113 beskriver en anti-inflammatorisk effekt av sanguinarin-klorid.

Schmeller T et al., Phytochemistry 44 (1997) 257 - 266 beskriver en biokjemisk aktivitet av sanguinarin mediert kjemisk forvar mot mikroorganismer, virus og herbivores i planter.

Walterova D et al., Journal of Medicinal Chemistry 24 (1981) 1100 - 1103 beskriver en inhibitorisk effect av sanguinarin på enzymaktiviteten av alanin aminotransferase i lever.

Ishii H et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin 33 (1985) 4139 - 4151 and Nakanishi T et al., Journal of Natural Products 62 (1999) 864 - 867 beskriver en antitumoraktivitet av sanguinarin.

Lombardini JB et al., Biochemical Pharmacology 51 (1996) 151 - 157 beskriver en inhibitorisk effekt av sanguinarin på enzymaktiviteten av en mitokondriell kinase fra rottehjerte.

Ulrichova J et al., Toxicology Letters 125 (2001) 125 - 132 beskriver en cytotoksisk effekt av sanguinarin på hepatocytter i cellekultur.

Fremstilling av flere alkaloidderivater, som er forskjellige fra chelidoninderivatene, er også kjent innen fagfeltet.

Valpuesta M et al., Tetrahedon 58 (2002) 5053 - 5059 beskriver syntese flere alkaloidderivater - cis og trans N-metyl-l-metoksystylopiniumsalter fra alkaloid coulteropin, hovedalkaloidet fra Romneya coulteri, i organiske løsninger.

Slavik J et al., Collection of Czechoslowak Chemical Communications 41 (1976) 285 - 289 beskriver isolering av alkaloidderivater i form av iodider og perklorater fra røttene av Argemone platyceras LINK et

OTTO.

Schmidt E, Achiv der Pharmazie 231 (1893) 168- 183 beskriver fremstilling av y-homochelidonin-metyliodid ved å oppvarme den rene base med et overskudd av metyliodid og rekrystallisering av reaksjonsproduktet fra alkohol.

Takao N et al., Chemical and Pharmaceutical Bulletin 21 (1973) 1096 - 1102 beskriver fremstilling av 11-epicorynolin-iodin metylat ved reaksjon av alkaloidet 11-epicorynolin fra Cordydalis incise med metyliodid i en blanding av organiske løsninger og rekrystallisering av reaksjonsproduktet fra Maningen av organiske løsninger.

Danckwortt PW, Archiv der Pharmazie 250 (1912) 590 - 646 beskriver fremstilling av protopin-metyliodid med reaksjon av protopin oppløst i aceton og et overskudd av metyliodid og rekrystallisering av reaksjonsproduktet fra alkohol.

Manske RHF et al., Journal of the American Chemical Society 64 (1942) 1659 - 1661 beskriver fremstilling av hunnemanin O-etyleter metosulfat fra alkaloidet hunnemanin isolert fra Hunemannia fumariaefolia Sweet.

Redemann CE et al., Journal of the American Chemical Society 71 (1949) 1030 - 1034 beskriver fremstilling av flere allocryptopinderivater hvor alkaloidallocryptopin ble ekstrahert fra Faraga coco, og reaksjonene ble utført i organisk løsning.

Zhang G-L et al., Phytochemistry 40 (1995) 299 - 305 beskriver ekstrahering og strukturanalyse av alkaloidet N-metylstylopiumklorid fra den kinesiske medisinske plante Dactylicapnos torulosa.

Som for de forskjellige chelidoninderivater så beskriver eller omtaler eller antyder de ovenfor nevnte preparater av forskjellige alkaloidderivater ifølge teknikkens stilling ikke et vasketrinn der det anvendes et vandig oppløsningsmiddel.

KORT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

I et aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse en ny fremgangsmåte for fremstilling av et reaksjonsprodukt av alkaloider, fortrinnsvis chelidonin, oksychelidonin eller metoksychelidonin, med egnete alkylerende midler, hvor prosessen omfatter minst ett vasketrinn med en vandig løsning, fortrinnsvis vann, etter full-føring av alkyleringsreaksjonen.

Fremgangsmåten omfatter også et trinn å omdanne alkaloiderivatene til vannløselige salter, for å fremstille injiserbare farmasøytiske preparater av lav toksitet som har et bredt spekter av terapeutisk aktivitet.

I et annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse vannløselige reaksjonsprodukter, for eksempel omfattende chelidoninderivater, hvor det opprinnelige tertiære nitrogen i alkaloidmolekylet har blitt omdannet til et kvartært nitrogen og hvor den fjerde ligand i det kvarternære nitrogen er en lavere alkylenhet, fortrinnsvis en metyl eller en etylenhet eller en substituert metyl eller etyl enhet, så som for eksempel en tiotepa-enhet. I en foretrukket utførelse er de kvartærne chelidoninderivater av en natur slik at de selektivt akkumulerer i målvev, fortrinnsvis cancervev.

I et annet aspekt vedrører foreliggende oppfinnelse farmasøytiske materialer inneholdende minst ett av de kvartærne alkaloidderivater, fortrinnsvis kvartærne chelidoninderivater, som oppnås i en prosess i samsvar med foreliggende oppfinnelse.

Oppfinnelsen vedrører ytterligere anvendelse av reaksjonsproduktene omfattende kvartærne alkaloidderivater av medikamenter for anvendelse i terapeutiske applikasjoner, og anvendelse av nevnte derivater for fremstilling av farmasøytiske materialer for terapeutisk behandling av forskjellige sykdommer eller kroppstilstander.

Ytterligere utførelse av foreliggende oppfinnelse er angitt i medfølgende patentkrav.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Den foreliggende oppfinnelsen omfatter således en fremgangsmåte for å fremstille et alkaloid reaksjonsprodukt omfattende minst et alkaloid derivat med et kvaternært nitrogen, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter:

a) å tilveiebringe en reaksjonsblanding omfattende et organisk oppløsningsmiddel, minst ett alkaloid som foreligger i planten Chelidonium majus L., og fortrinnsvis valgt blant gruppen som består av chelidonin, protopin, stylopin, allokryptopin, homochelidonin, chelamidin, chelamin, L-spartein og oksychelidonin, og et alkylerende middel, og utføre en alkyleringsreaksjon ved å reagere det minst ene alkaloid med det alkylerende middel i nærvær av et organisk løsemiddel, for å muliggjør dannelse av minst ett alkaloidderivat som har et kvaternært nitrogen; b) etter terminering av reaksjonen å underlegge den resulterende reaksjonsblanding til minst ett vasketrinn med et vandig oppløsningsmiddel eller vann, for å fjerne vannløselige forbindelser som foreligger i reaksjonsblandingen; og c) underlegge den vaskete reaksjonsblanding til en behandling med et sterk syre i gassform eller i væskeform, fortrinnsvis med gassformig hydrogenklorid eller en hydrogenkloridløsning, og dermed omdanne

det minst ene kvaternære alkaloidderivat til en vannløselig form, fortrinnsvis et vannløselig salt.

Ytterligere utførelser av fremgangsmåten er angitt i underkravene 2-11.

Vasketrinnet med vann eller et ekvivalent vandig oppløsningsmiddel, for eksempel en mild saltløsning,

fremmer inter alia det påfølgende omdanningstrinn av de svakt vannløselige eller vannuløselige reaksjonsprodukter, det vil si kvaternære alkaloid derivater, til vannløselige forbindelser, for eksempel salter. Det er foretrukket at i tilfelle det alkylerende middel er en cytotoksisk substans er den også vannløselig eller i det minste dekomponerer ved kontakt med vann til vannløselige komponenter for å muliggjøre vesentlig

fjerning av ikke-reagert alkylerende middel eller deler derav fra reaksjonsblandingen med vasketrinnet med vann.

Vasketrinnet med vann muliggjør å vesentlig forenkle fremstillingsprosessen siden kompliserte sikker-hetsforanstaltninger på grunn av risiko for eksplosjon av organiske løsemidler, for eksempel dimetyleter, ikke lenger er nødvendig, og dette gjør prosessen enkelt oppskalerbar. Videre, uønskede vannløselige komponenter foreliggende i reaksjonsblandingen separeres dermed fra reaksjonsproduktene, og fjernes. Overraskende ble det også funnet at væsketrinnet har en positiv påvirkning på strukturen og materialet i reaksjonsproduktene på en måte slik at effektiviteten av påfølgende omdanningstrinn av produktene til en vannløselig form forsterkes med opptil 10 til 15 ganger sammenlignet med en fremgangsmåte hvor vasketrinnet utføres ved anvendelse av et rent organisk løsemiddel, og således forbedre utbyttet betydelig av det ønskede sluttprodukt.

Fremgangsmåte kan anvendes for eksempel for alkyleringsreaksjoner av alkaloider med de karsinostatiske fosforinneholdende forbindelser nevnt i krav 1 i AT 377 988, fosforforbindelsene vist i fig. 3 av foreliggende søknad er spesielt egnet, og spesielt de som har en aziridingruppe.

Termen "chelidonin" som anvendt heri skal angi likeledes for alle medlemmene valgt fra gruppen bestående av chelidonin, oksychelidonin og metoksychelidonin, med mindre annet er angitt eller kan utledes implisitt fra beskrivelsen. Et egnet organisk løsemiddel i samsvar med foreliggende oppfinnelse er ethvert middel hvor alkaloidene tiltenkt for reaksjonen er løselige. Alkaloidene kan for eksempel oppløses i et organisk løsemiddel som fremmer eller bidrar til alkyleringsreaksjon så som et løsemiddel valgt fra gruppen omfattende monoklormetan, diklormetan, triklormetan, monokloretan, dikloretan, trikloretan.

Den alkylerende reaksjon av alkaloider foregår ved forhøyet temperatur, fortrinnsvis ved kokepunktet av løsningen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører således et vannløselig alkaloidreaksjonsprodukt, kjennetegnet ved at det omfatter minst ett alkaloidderivat, som har et kvaternært nitrogen, hvor alkaloidet omfatter chelidonin, for anvendelse som et medikament.

Ytterligere utførelser av dette aspekt er angitt i underkravene 13-17.

Det resulterende reaksjonsprodukt omdannes til en vannløselig form etter vasking med vann. Dette kan utføres i samsvar med fremgangsmåten beskrevet i AT 377 988 og AT 354 644, med omdanning til vannløselige salter, fortrinnsvis til hydrokloridene, for eksempel ved å passere en sterk syre i væske eller gassform, så som HCl-gass eller tilsetning av en HC1-løsning til den organiske løsning av det vaskede reaksjonsprodukt, under eller etter at hydrokloridene er presipitert. Det fremgår at med denne sure behandling vil det meste av det alkylerende middel splittes opp fra en mellomliggende reaksjons-forbindelse dannet mellom alkaloider og det alkylerende middel, og dette gir modifiserte alkaloidderivater, hvor de opprinnelige tertiære nitrogenatomer har blitt omdannet til kvartærne nitrogener, hvor det til nevnte kvaterne nitrogen er bundet en hydrogenenhet eller en enhet opprinnelig fra alkylerings-midler som en fjerde ligand, hvor enheten fortrinnsvis er valgt fra gruppen omfattende en metyl, etyl og tris(l-aziridinyl)fosfin sulfid enhet eller fra en del av tris(l-aziridinyl)fosfin sulfid. For en bedre forståelse illustrerer den påfølgende formel I et typisk kvaternært alkaloidreaksjonsprodukt, eksemplifisert med chelidonin:

Rl= metyl, etyl, tris(l-aziridinyl)fosfin sulfid, metyl-R2, etyl-R2, R2 er en del av tris(l-aziri-dinyl)fosfin sulfid.

Fra en elementanalyse av et av reaksjonsproduktene som er presipitert (se eksempel 11) fremgår det, uten å være bundet av teori, at minst én del av det alkylerende middel eller dekomponeringsforbindelsen av det alkylerende middel, oppnådd med den sure behandling av reaksjonsblandingen etter terminering av alkylering, for eksempel kvartærneringsreaksjon, kan i noen grad innesluttes i krystallene av presipitanter eller i noen grad er sterkere festet til krystallene, og således motstå rensing av presipitatet med vasking med organiske løsninger, så som eter og diklormetan. Allikevel kan det vises at reaksjonsproduktet fremdeles er fullstendig funksjonelt selv i nærvær av slike medfølgende substanser.

Det vannløselige salt av reaksjonsproduktet er egnet for applikasjon i injeksjonsløsninger.

Reaksjonen kan utføres med tris(l-aziridinyl)fosfin sulfid (CAS No. 54-24-4), som i farmakope også er kjent som tiotepa. Ytterligere synonymer er ledertepa, onkotiotepa, TESPA, tespamin, tioforfamid, tioTEPA, trietylenfosforamid, tifosyl, triaziridinylfosfin sulfid, N, N', N"-tri-l,2-etandiylfosfortioin triamid; N, N', N"-tri-l,2-etandiyltiofosforamid, tri-(etylenimin)tiofosforamid; N, N', N"-trietylentiofosforamid, trietylentiofosfortriamid, m-trietylentiofosforamid, m- tris(aziridin-l-yl)fosfin sulfid, trietyltiofosforamid, tris(l-aziridinyl)fosfin svovel, tris(etylenimino)tiofosfat, TSPA og WR 45312.

Et ekstrakt av alkaloider, valgfritt de totale alkaloider av Chelidonium majus L., kan omdannes i et organisk løsemiddel med tris(l-aziridinyl)-fosfin sulfid (tiotepa) og det resulterende reaksjonsprodukt, valgfritt foreliggende som en blanding av forbindelser, vaskes deretter minst én gang med vann. Siden tiotepa dekomponeres i vann, kan den ikke omdannede enhet av tiotepa foreliggende i overskudd etter reaksjonen fjernes fra den organiske fase med denne handling. Fortrinnsvis, den organiske løsning inneholdende mellomreaksjonsprodukter, det vil si forbindelsen dannet mellom alkylerende middel og alkaloid, vaskes flere ganger og hver gang mettes med vann. Spesielt foretrukket repeteres vaskingen inntil overskudd av sterkt toksisk tiotepa har blitt fullstendig fjernet fra reaksjonsproduktet.

I tillegg, noen av de vannløselige toksiske alkaloider som bidrar til skadelige reaksjoner i medisinske applikasjoner og som også kan forårsake skrumplever fjernes med den vandige fase fra synteseblandingen eller deres konsentrasjoner reduseres. Ved hjelp av Ames-testen ble det vist at reaksjonsproduktet av denne utførelse, fremstilt i samsvar med oppfinnelsen, ikke er mutagent.

Idet man starter med et totalt alkaloidekstrakt fra Chelidonium majus L. er det finale reaksjonsprodukt en blanding av alkaloider omfattende høymolekylvekt reaksjonsprodukter av tiotepa med alkaloider, og de-graderingsprodukter av tiotepa. Som et resultat av synteseprosessen vil løseligheten av alkaloidene forandres. Reaksjonsproduktet består av en blanding av 60 til 70 % ikke-reagert chelidonium alkaloider med cirka 30 til 40 % reaksjonsprodukter av tris(l-aziridinyl)fosfin sulfid.

Tertiære alkaloider representerer hoveddelen av utgangskomponentene av et alkaloidekstrakt oppnådd fra Chelidonium majus L. For eksempel, de følgende tertiære alkaloider kan være inneholdt som utgangs-komponenter i synteseblandingen: chelidonin, protopin, styolpin, allocryptopin, a-homo-chelidonin, chelamidin, chelamin, L-spartein, chelidimerin, dihydrosanguinarin, oksysanguarin, oksychelidonin og metoksychelidonin.

Etter terminering av den alkylerende reaksjon blir ikke-reagert kvartærne alkaloider (for eksempel berbirin) vesentlig fjernet fra reaksjonsblandingen med vasketrinnet med vann, mens ikke-reagert vann-uløselige alkaloider og alkylerte alkaloidreaksjonsprodukter forblir i den organiske løsning. Avhengig av naturen av den organiske løsning og/eller av det alkylerende middel anvendt for alkyleringsreaksjonen, kan det resulterende mellomreaksjonsprodukt omfatte tiotepa-koblede forbindelser, hvor etttiotepa-molekyl er koblet til ett, to eller tre chelidonin, oksychelidonin eller metoksychelidonin- molekyler. Videre kan det omfatte alkylerte alkaloid derivater, hvor et alkaloid molekyl, for eksempel et chelidonin, oksychelidonin eller metoksychelidonin molekyl, er koblet ved dets kvartærne nitrogen til en kort kjede lineær alkylenhet, fortrinnsvis til en metyl eller etylgruppe. Ytterligere alkylerte reaksjonsforbindelser kan foreligge i reaksjonsblandingen etter terminering av alkyleringsreaksjonen.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også et vannløselig chelidoninderivat, kjennetegnet ved at det naturlig forekommende chelidonin foreligger i en kvaternær form i samsvar med påfølgende formel (I):

hvor som en fjerde ligand RI til det kvaternære nitrogen foreligger et hydrogen eller et metyl eller etylenhet, for anvendelse som et medikament.

Ytterligere utførelser er angitt i underkravene 19-20.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører også anvendelse av et vannløselig alkaloidreaksjonsprodukt omfattende minst ett alkaloidderivat som har et kvaternært nitrogen, hvor alkaloidet omfatter chelidonin, for fremstilling av et farmasøytisk materiale for profylakse eller behandling av en sykdom eller kroppstilstand valgt blant gruppen som består av virusinfeksjon, cancer, immunologisk dysfunksjon, metabolsk dysfunksjon og bestrålingsskade.

Ytterligere utførelser av dette aspekt er angitt i underkravene 22-25.

Reaksjonsproduktet oppnådd fra reaksjonen av totale alkaloider av Chelidonium majus L. med tiotepa viser et bredere spektrum av terapeutiske aktiviteter enn reaksjonsprodukter oppnådd fra en analog prosess hvor vasketrinnet har blitt utført med en organisk løsning, for eksempel i dimetyl eter. Minst noen forbindelser foreliggende i reaksjonsproduktet, fortrinnsvis de kvartærne chelidonin derivater, akkumuleres selektivt i cancervev og ødelegger cancerceller med apoptose, men, i motsetning til de mest kjente cytostatiske midler, uten å angripe friske celler. Dette resulterer i god toleranse i en terapi med dette preparat og dets generell egnethet for terapeutisk middel, og også profylaktisk bruk i individer med økt risiko for å utvikle cancer på grunn av for eksempel arvelige disposisjoner. Det er enkelt å håndtere og har ingen signifikante skadelige reaksjoner i terapeutiske doseringer.

Reaksjonsprodukter oppnådd fra reaksjonen av de totale alkaloider av Chelidonium majus L. med tiotepa oppviser biologisk aktivitet i regulering av metabolismen og er egnet for prevensjon og terapi av metabolske forstyrrelser, så som osteoporose, men også reumatismesykdommer, allergier, virusinfeksjoner, epilepsi, multippel sklerose, sår, hudtumorer, postoperative sår og bestrålingsskader.

Et ekstrakt av de tørkede røtter av Chelidonium majus L. kan anvendes som et utgangsmateriale for syntesen. Røttene har et høyere innhold av alkaloider enn bladene eller stammen.

Overraskende ble det nylig funnet at når man startet med kommersiell tilgjengelig chelidonin, oksychelidonin eller metoksychelidonin som eneste alkaloidkilde, oppviste det resulterende reaksjonsprodukt oppnådd i samsvar med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen (se feks. eksempel 3, supra) terapeutiske kvaliteter og aktiviteter som i det minste er sammenlignbar med de for reaksjonsprodukt som resulterer fra alkyleringsreaksjonen av total chelidonium alkaloider i samsvar med eksempel 1.

De vanlige farmasøytiske eksipienter, fortrinnsvis for løsninger, for eksempel injeksjon eller infusjons - løsninger, eller for salver, kompresser eller suspensorium baser, er egnet for medikamenter som inneholder reaksjonsproduktene fremstilt i samsvar med oppfinnelsen.

KORT BESKRIVELSE AV FIGURENE

Fig. 1 viser et UPLC- diagram med en karakteristisk total alkaloid sammensetning av røttene av Chelidonium majus L.

Fig. 2 viser HPLC fingerprint av en fremstilling i samsvar med eksempel 1.

Fig. 3 viser selekterte fosforderivater egnet som reagenser.

Fig. 4 viser kjernemagnetisk resonans spektrum av reaksjonsproduktet U-KRS.

Fig. 5 viser et UV- spektrum av reaksjonsproduktet U-KRS.

Fig. 6 viser et UV- spektrum chelidonin hydroklorid.

Fig. 7 viser en første seksjon av et massespektrum av reaksjonsproduktet U-KRS.

Fig. 8 viser en andre seksjon av et massespektrum av reaksjonsproduktet U-KRS ved en høyere oppløsning.

Fig. 9 viser et massespektrum av chelidonin hydroklorid.

I følgende eksempler er angitt for ytterligere å illustrere oppfinnelsen.

Eksempel 1

a) Ekstrahering av alkaloidene

a. 25 g av en alkaloid saltblanding suspenderes i vann og overføres til en separasjonstrakt. Etter tilsetning

av 100 ml diklormetan ristes separasjonstrakten. Den organiske fase separeres deretter av, og filtreres til en glassflaske.

b. 1 N NaOH (pH 8-9) tilsettes til den vandige fase inntil turbiditet forekommer. Etter tilsetning av 100 ml diklormetan ristes blandingen. Den organiske fase separeres deretter av, og kombineres med diklormetan-fasen fra trinn a. Denne prosess repeteres, for eksempel 3 ganger. De organiske faser filtreres og kombineres. c. Den vandige fase justeres til en pH av 10 ved tilsetning av NaOH. Etter tilsetning av diklormetan ristes blandingen. Den organiske fase separeres deretter av, filtreres og blandes med de andre organiske faser. Den vandige fase justeres nå til en pH av 13 med NaOH og ekstraheringen repeteres med diklormetan.

d. De kombinerte organiske faser evaporeres for å gi et oljeaktig, brunt materiale.

B) Reaksjon med tris(l-aziridinyl)fosfin sulfid:

Alkaloidenheten oppløses i diklormetan, og tris(l-aziridinyl)fosfin sulfid tilsettes. Blandingen reflukseres ved 80 °C i 2 timer. Etter avkjøling til romtemperatur klares reaksjonsblandingen. Filtrering utføres deretter, og filtratet vaskes flere ganger for eksempel 3 timer eller mer med 250 ml vann i en separeringstrakt.

C) Reaksjon med HC1

Den vaskede løsning overføres til et glasskår, omrøres og mettes med HCl-gass, og et hydroklorid-kompleks presipiteres. Det presipiterte produkt filtreres av og vaskes med dimetyleter, tørkes og oppløses deretter i vann.

I rotter ble en LD50-verdi på 485 mg/kg bestemt fra reaksjonsproduktet i samsvar med eksempel 1. Studier i mus og rotter viste at produktet i samsvar med oppfinnelsen modulerer hormonregulering av thymus og induserer syntese av substanser som har thymosinlignende aktivitet i dyr hvis thymus har blitt fjernet. Denne effekt er doseavhengig. Fremstillingen øker antallet T-lymfosytter i perifert blod med opptil 50 %

(4,04 ± 0,43 x IO<9>/1 før behandling, 6,24 ± 0,73 x IO<9>/1 etter behandling), modulerer den humorale immunrespons til penetrerende antigen og den naturlige drepecelleaktivitet av miltceller (198,20 ± 17,69 % sammenlignet med 71,50 ± 9,10 % i kontrollgruppen) og forsterker interferon frigjøringspotensialet i hvite blod korpuskler i dyreeksperimenter. Resultatene av dyreeksperimentene er bekreftet med kliniske observasjoner. Således, forbedringen i immunparametere ble også observert i cancer pasienter.

Doser på cirka 5 mg av preparatet fra eksempel 1 per 70 kg kroppsvekt kan anvendes for profylaktisk og immunologiske applikasjoner. For cancerbehandling administreres fortrinnsvis 5 mg av preparatet per 20 kg kroppsvekt.

Eksempel 2: HPLC fingerprints

Bestemmelsen ble utført med ionepar reversfase kromatografi i gradientmodus og med spektral måler ved anvendelse av en DAD-detektor med 285 nm. Samtidig ble kromatogrammer fremstilt ved anvendelse av referansealkaloider. I tillegg, en HPLC-MSD-analyse ble utført, som viste at det var ingen topper i tillegg til alkaloidene. HPLC-diagrammet i figurer 1 og 2 ble oppnådd på basis av følgende eksperimentelle data:

Kromatografiparametere:

Kolonne: LiCrospher 60 RP Select B, 5 um, 125 x 24 mm ID

Elueringsmiddel: A) 200 ml acetonitril + 800 ml vann + 1,5 g heksansulfonisk syre + 0,3 ml 85 % fosforsyre

B) 900 ml acetonitril + 100 ml vann + 1,5 g heksansulfonisk syre + 0,3 ml 85 % svovelsyre

Gradient: 5 min isokratisk 100 % A;

opptil 40 % B i 24 min

opptil 100 % B i 1 min

5 min 100 % B;

5 min ekvilibrering med 100 % A

Deteksjon: UV-lys ved 285 nm

Elueringsstrømningsrate: 1 ml/ min, stopp etter 35 min.

Injisert volum: 10 ul

Prøvepreparering:

Ekstrakt før reaksjon (fig. 1): 25 mg av alkaloider oppløses i 40 ml metanol med ultrasonisk behandling uttynnes til 50 ml og filtreres gjennom et membranfilter.

Reaksjonsprodukt (fig. 2): Reaksjonsprodukt omdannes til hydroklorsaltet, oppløses i vann i en konsentrasjon på 1 mg/ ml og justeres til en pH på mellom 2,5 og 6,5.

Eksempel 3

Kommersielt tilgjengelig, renset chelidonin (Sigma) ble underlagt reaksjon med tris(l-aziridinyl)fosfin sulfid (= tiotepa) i samsvar med betingelsene beskrevet i eksempel 1. Etter terminering av alkyleringsreaksjonen, det påfølgende vasketrinn og omdanningstrinnet ved anvendelse av HC1- gass, ble det finale produkt ytterligere prosessert som følger: 340 g av det HCl-behandlede og således vannløselige reaksjonsprodukt ble oppløst i vann og konsentrert nær metning og fikk stå til henstand i et kjøleskap ved 8 °C. Etter noen timer forekom spontan presipi-tering og 264 mg presitat (heretter benevnt U-KRS) ble samlet. Presitatet omfattet svakt gulaktige hygro-skopiske krystaller som har et relativt smalt smeltepunkt på 205-207 °C (indikerende et ganske godt krystalliseringsprodukt) og oppviste lysblå fluoressens ved bestråling ved bestråling med UV-lys ved 366 nm. Spor av gul, oransje og rød fluoressensbånd var også synlige. Produktet bevegde seg ikke idet det ble underlagt tynnsjikt kromatografi, men forble ved utgangsposisjon (Rf = O), med unntak av spor som i det minste beveger seg for å gi en Rf > 0,1. Fra nukleær magnetisk resonans (NMR) spektrum (fig. 4) er det klart at U-KRS inneholder aromatiske ringer sammenlignbare til de som inneholdes i chelidonin molekyler. UV-spektrum (fig. 5) oppviser absorpsjons maksimum ved 148, 155, 160, 205, 230 og 282 nm, svært lik UV-spektrum av chelidonin (fig. 6), som avviker derfra kun i at topp ved 230 nm av U-KRS forekommer ved 240 nm med chelidonin. Dette indikerer at nitrogenet i U- KRS er kvarternært, mens chelidoninet er tertiært.

Ytterligere analytiske detaljer kan avledes fra massespektrogrammene presentert i fig. 7 og fig. 8 (U-KRS) og fig. 9 (chelidonin), og fra resultatene av en elementanalyse av U-KRS som ga følgende sammensetning av materien (tab. 1):

De følgende eksempler viser forskjellige applikasjoner av forbindelsen U-KRS resulterende fra prose-dyren beskrevet i eksempel 3.

Eksempel 4: Selektiv inhibering av in vitro cellevekt med antitumor medikamentet U-KRS.

Materialer og metoder

Cellekultur ble utført i Roux flasker ved 37-37,5 °C i en humidifisert atmosfære inneholdende 8 % C02. Konfluente kulturer ble løsnet med en løsning av 0,01 % trypsin og 0,2 % EDTA in fosfat bufret salt-løsning (PBS), og splittet i et forhold i området fra 1:5 til 1:25.

Humane endotelceller ble isolert fra umbilikale vener med kollagenasebehandling. Kulturmedium for endotelceller var Ml99 tilsatt 15 % varme- inaktivert fetalt kalveserum, 200 ug/ ml endotel cellevekst-faktor og 90 ug/ ml heparin.

Fluoressens mikroskopi

Cellene vil vokse i 35 mm skåler og bli innkubert med 100 ug/ ml U-KRS i 30 -60 min. Dyrkningsmedium ble aspirert, og cellene ble vasket to ganger med PBS. Preparatglass ble montert på cellene og fluoressens ble eksitert ved anvendelse av en konfukal laserskanningsmikroskop utstyrt med en argon laserkilde. Det utsendte lys ble detektert i en fotomultiplisererkanal. Signalene ble vist på en videomonitor ved anvendelse av MRC 600 image prosesserings programvare.

Resultater

1.1 et område fra 20 til 40 ug/ ml U-KRS ble cirka 55 % inhibering av cellevekst med endotelceller målt. Denne konsentrasjonen drepte den humane osteosarkoma cellelinje. Hybrider av de to celletyper viste omtrent samme sensitivitet som normale celler. 2. På grunn av dets autofluoressens kan U-KRS detekteres intracellulært. Et laserskanningsmikroskop viste et høyt opptak av U-KRS i nærliggende celler.

Eksempel 5: U-KRS som anticancermiddel - oksygenforbruk

Materialer og metoder

In v/vo eksperimenter i mus. To til fem kontrolldyr ble hver injisert med 50 ul av en Ehrlich mus askite tumor suspensjon i.p. som var 8 dager gammel, som var tatt fersk fra et fullt voksent donordyr. Kontrollgruppen ble ikke videre behandlet. Testgruppen ble injisert med 10 mg U-KRS/ kg vekt av dyr i det abdominale området umiddelbart etter tumor implantering.

Resultater

Mus implantert med askitestumorene, enten etter intraperiotenal eller etter subkutanøs administrering av U-KRS viste en lenger overlevelsestid enn de implanterte dyr som ikke var behandlet.

Målingene av oksygenforbruk av en askites tumorsuspensjon ved hjelp av en elektrode in vitro ga en hurtig økning i forbruk etter tilsetning av U-KRS, etterfulgt imidlertid av et hurtig fall forskjellig fra kontrollsuspensjon ikke blandet med U-KRS.

Eksempel 6: Modifisering av antinosiseptisk virkning av morfin med U-KRS i gnagere.

Materialer og metoder

Dyr: Eksperimenter ble utført på hannkjønn albino Swiss mus og hannkjønn Wistar rotter.

Behandling: U-KRS ble gitt i.p. i doseringer startende fra 20 mg/kg for mus og 25 mg/kg for rotter.

Eksperimentelle prosedyrer: I hvert eksperiment ble de fire grupper av dyr injisert med 1) placebo, 2) morfin, 3) U-KRS, 4) U-KRS og morfin.

Resultater:

Resultatene indikerte at samtidig administrering av U-KRS og morfin modifiserte virkningen av det narkotiske analgesiske middel. De produserte antinosiseptiv virkning i halebevegelsestesten i rotter, noe som er blitt bevist på en økning i latenstid.

De foreliggende resultater viste at U-KRS gitt simultant med morfin forandrer mottakelighet i eksperi-mentdyrene til nociceptiv reaksjon i de beskrevne tester. Foreliggende resultater antyder at U-KRS kan interreagere med analgesiske medikamenter som anvendes i cancer.

Eksempel 7: Induksjon av bimodalt programmert celledød i maligne celler med derivate U-KRS.

Materialer og metoder:

K562 erytroleukemi cellelinje ble anvendt, og U-KRS produsert i ren krystallisert form og oppløst i vann ved en konsentrasjon av 1,2 mg/ ml.

DNA-innholdet av K562-cellene eksponert til forskjellige konsentrasjoner av U-KRS ble analysert ved anvendelse av propidium iodid og flow sytometri.

Resultater:

Resultatene av dette forsøk viste at U-KRS induserer bimodal celledød programmer, og hvor den første, apoptose, er mediert av quinidin sensitiv Ca<2+->avhengig K<+->kanaler; den andre modalitet, blister celledød, er mediert ved å hindre dannelse av mikrotubuly, og således indusering av polyploiditet.

Eksempel 8: Påvirkning av U-KRS på DNA, RNA og protein syntese i maligne celler.

Materialer og metoder

<3>H-merket thymidin, 0,5uCi i 20ul medium; uridin, 0,5uCi i 20ul medium og leucin, l,0uCi i 20ul medium ble plassert i 2-4 timer i fire brønner med forskjellige U-KRS- konsentrasjon. Før dette hadde

cellelinjen marsvin hepatocyder, C1L hepatocyder, humane tonsill celler, murine lymfomaer, murine myelomaer, Yoshida celler, to HeLa- stammer, EsB-, EB, lymfomaer, ZAC/1, P815 fått vokse 24 timer ved 37 °C i 96 mikrotiter brønner.

WiDr-cellene ble inkubert på et noe forskjellig skjema i 6 og 24 timer ved U-KRS- konsentrasjoner av 1, 4, 8 og 14 ug/ml U-KRS.

Resultater

Fluormetriske vurderinger viste sterkere affinitet av U-KRS til elementet av cancercelle nukleus enn til andre cancercelleområder. Fluoressensfenomen kan klart vise den sterke og den sterke og raske affinitet utvist av U-KRS i tumor og metastaseområder. Ingen toksiske effekter ses i normale celler behandlet i doseringer som er 100 % vekst inhibitoriske til cancercellelinjer testet til i dag.

Eksempel 9: Påvirkning av U-KRS på human xenografer

Material og metoder

Tumorceller ble tatt fra humane tumor xenografer og serielt transplantert i naken mus. Disse celler ble anvendt i en koloniformende analyse in vitro. Tumorcellene ble inkubert kontinuerlig i minst én uke i forskjellige konsentrasjoner av medikamentet U-KRS. Dette ble utført med seks forskjellige typer, og kolonidannelse ble skåret for hver tumor. Medikamenteffektene ble rapportert som prosent T/C (test/- kontroll).

Resultater

Mange forskjellige typer tumorer er sensitive til U-KRS korrelerende til mangfoldet testet med U-KRS. Der den tumorisidale effekter synes å være avhengig av regenereringsevnen til immunapparater, hvis stimulering og modulering kan utføres av U-KRS.

Eksempel 10: Effekt av U-KRS på humane maligne cellelinjer

Materialer og metoder

Fire forskjellige maligne cellelinjer ble anvendt: 1) musesarkom; 2) hunnkjønn bryst karsinom; 3) human tarm karsinom; 4) human melanom.

U-KRS og PP9AA02 derivater ble tilsatt til dyrkningsmedium.

Etter bestråling ble 200 celler utplatet per preparatglass og inkubert i én uke, deretter farget og talt.

Resultater

Resultatene presentert her indikerte at U-KRS og PP9AA02 derivatene virker på humane maligne cellelinjer synergistisk som cytotoksiske substanser.

Eksempel 11: Indusert G2/M tilbakeholdelse og apoptose i humane epidermoide karsinoma cellelinjer med U-KRS.

Materialer og metoder

Primære humane kreatinocytter ble isolert fra neonatale hudformer. Epidermale sjikt ble trypsinert og enkeltcellesuspensjoner samlet ved sentrifugering.

Resultater

U-KRS inhiberer cellesyklusprogresjon på en doseavhengig måte.

U-KRS behandling påvirker cellesyklusdistribusjon og induserer apoptose i A431 og ME 180 celler.

Ekspresjon av sykliner, CDKer og CDK- inhibitor p27 forandres etter behandling med U-KRS.

Eksempel 12: Antimetastatisk effekt av U-KRS og dets påvirkning på oksygen- og energimetabolisme i mus med melanom B-16.

Materialer og metoder

Eksperimentene ble utført på 133 C57B/6 hannkjønn mus. Metastatiserende melanom B-16 ble transportert til den høyre skinnbeinsmuskel i hver mus. På den tiende dag etter tumortransplantasjon ble dyrene delt i to grupper. Den første gruppe ble gitt U-KRS til sinusvener i øye i en dose av 1 mg/ kg i volum av 0,05 ml: 5 injeksjoner én gang i to dager. Den andre gruppe ble gitt steril fysiologisk løsning til sinusvener på samme regime.

Resultater

Forsøket viste at etter den første intravenøse injeksjon av U-KRS ble tegn på oksygenregime i muskelvev betydelig forbedret. Raten av p02-nivå økte opptil maksimum under oksygeninhalering og raten av p02ble redusert ved maksimum til innledende nivå etter avslutning av inhalering. I dyrene i eksperiment- gruppen var visse tegn på oksidativ fosforylering av levermitokondrier også forbedret én dag etter administrering av preparatet. Det er kjent at under progresjon av den maligne prosess så inhiberes oksygen og metabolisme. I mus som var gitt 5 injeksjoner av U-KRS så er slik inhibering mindre uttalt. I dyrene i kontrollgruppen var nivået av oksygentensjon i muskulære vev og raten av 02-avgivelse til disse statistisk høyere. Generalisering av dataene oppnådd gjør det mulig å konkludere at U-KRS i mus med B/16 melanom forbedrer avgivelse av oksygen til vevene og likeledes inhiberer de ødeleggende effekter av den maligne prosess på organismens bioenergitikk.

De påfølgende eksempler illustrerer immunomodulerende og metabolismeregulerende egenskaper av U-KRS, noe som gjør at U-KRS er spesielt egnet for terapeutisk behandling av allergiske reaksjoner, virus-sykdommer (HIV, Hepatitt A, B og C, E.coli, influensa), osteoporose, polyartritt, psoriasis og andre sykdommer med legemlige tilstander.

Eksempel 13: Forbedring av makrofag tumorisidal aktivitet med U-KRS.

Materialer og metoder

BALB/c mus ble holdt med bror/søster paring i laboratoriet. Tumor Dl DMBA/3 ble rutinemessig transplantert i BALB/c med s.c. injeksjon. Tumoren ble synlig fem dager etter implantering.

In vivo behandling med U-KRS ble initiert fem dager etter subkutanøs tumorimplantering. Tre administra-sjonsruterble benyttet, det vil si intravenøs, intraperitoneal og subkutanøs. Alle tre eksperimentgrupper, med minst 10 mus i hver, mottok 5,0 uU-KRS i 0,15 ml PBS. Doseringen ble valgt basert på preliminære eksperimenter.

Resultater

Hastigheten av tumorvekst i behandlet mus var signifikant redusert. Mus som mottok U-KRS viste ingen skadelige medikamentrelaterte bi-effekter.

Eksempel 14: In vitro effekter av U-KRS på fenotypen for normale humane lymfocytter.

Materialer og metoder

Forsøket ble utført på lymfocytter isolert fra perifert blod på 10 friske frivillige. Cellene ble isolert på Ficoll-Paque tetthetsgradientsentrifugering. Levedyktighet av celler ble bestemt med 0,1 % trypan blåfarging, og funnet å være 95 %.

Lymfocytt subpopulasjon ble kvantifisert med immunofluoressens ved anvendelse av monoklonale antistoff mot totale T-celler, T-hjelpeceller og T-supressorceller. Deretter ble cellene behandlet med FITC/ konjugert kanin F/ab/2 fragmenter antimus IgG, vasket i PBS og montert på preparatglass ved anvendelse av polyvinylalkohol og glyserol. I kontrollpreparatene ble PBS eller normalt museserum anvendt i stedet for monoklonale antistoff.

Resultater

Det foreliggende forsøk indikerer muligheten for direkte påvirkning av U-KRS på T-celle-subpopula-sjoner og bekreftet de tidligere observasjoner at U-KRS kan være en god immunostimulator av cellulær immunitet i cancerpasienter.

Eksempel 15: Mitogene egenskaper av U-KRS på humane perifere blodmonosytter.

Materialer og metoder

Perifere blodmononukleære celler. Blod blir fortynnet med et likt volum av PBS inneholdende ImM EDTA, pH 7,5, og ble applisert over Ffistopaque 1077. Rørene ble sentrifugert ved 2000 rpm i 30 min. Grensesnittsjiktene inneholdende lymfocytter ble samlet og vasket tre ganger med RPMI vevskultur-medium.

Resultater

Det ble funnet at selv en kort periode av forbehandling av celler med U-KRS hadde en potent synergistisk effekt på OFJA-mitagonese resulterende i signifikant cellestimuleringstegn enn for PFfA alene. Videre ble det funnet at en kort periode av PFfA- behandling av cellene er omtrent imperativ for U-KRS for at det skal utvise dets mitogene effekter.

Dette forsøk viser en signifikant økning i sirkulerende lymfocytter i pasienter i avanserte trinn av malignisitet behandlet med U-KRS.

Eksempel 16: Modulering av immun effektorcelle cytolytisk aktivitet og tumor vekst inhibering in v/vo ved hjelp av U-KRS.

Materialer og metoder

Tumor celler: mastocytoma P815 og AKR leukemi AKIL cellelinjer ble holdt i DMEM- medium tilsatt 9,0 % bovint fetalt kalveserum inneholdende penicillin og streptomycin.

Resultater

Det foreliggende in vitro forsøk viser at U-KRS er en effektiv biologisk respons modifiserer som øker, opptil 48 ganger, den lytiske aktivitet av milt lymfocytter oppnådd fra alloimmunisert mus. De lyriske aktiviteter av IL-2 behandlede miltceller og peritonealt eksodatlymfosytter ble også signifikant økt ved tilsetning av U-KRS til analysemedium for cellemediert lysering.

Resultatene, indikerer sammen at U-KRS forsterker den cytolytiske aktivitet av miltlymfocytter, noe som indikerer at den terapeutiske effekt av U-KRS observert in vivo medieres ved å stimulere immuneffektor-celle cytolytisk aktivitet.

Eksempel 17: Effekt av U-KRS på immunologiske blodparametere in vitro og in vivo.

Materialer og metoder

96 Wistar rotter ble anvendt for dette forsøk. Den innledende alder var 16 uker for både hannkjønn og hunkjønn rotter.

U-KRS og PHA ble testet i et #Hthymidin test for T-lymfocytter for å evaluere stimuleringsindeks i doseringer fra 0,01 til 20 uh/ ml.

Resultater

U-KRS stimulerer forskjellige subset av hematopoietiske og immunologiske systemer. I dette eksperiment induseres retikulocytter som et mulig tegn på stimulering av visse stamceller eller av generell aktivering av erytropoetisk system. Idet ingen forandring i det absolutte leukocytt-tall kunne vises, ble det postulert at kun sterke modulerende egenskaper ble effektuert av virkning av U-KRS, for eksempel en viss lokalisa-sjon av forskjellige subset, i dette eksperiment.

Stimulering sammenlignbare til det som oppnås i disse eksperimenter fremkom in vitro, inkluderende apoptose i cancerceller.

Eksempel 18: Inhibitorisk effekt av U-KRS på ovalbumin antigenisitet og antiovalbumin IgE antistoff respons i mus.

Materialer og metoder

Evnen til U-KRS til å inhibere ovalbumin indusert sensitisering ble testet i BALB/c og Fl (BALB/c x C57BI/6J) mus. U-KRS ble introdusert i musene i blanding med antigen (ovalbumin) og adjuvans (alum) inhiberte sentisiteringen av mus, noe som reflekteres i lavere anti-OA IgE antistoffrespons og redusert antigen-indusert histaminfrigjøring fra mastceller isolert fra peritoneale rom i sentisitert mus. Effekten av U-KRS på antigenisiteten av ovalbumin (OA) i anafylakse ble testet i heterolog passiv kutanøs anafylaktisk (PCA) reaksjon på rotter.

Resultater

Resultatene viser at OA som er fremstilt i blandingen med U-KRS hadde en redusert evne til å reagere med anti-OA IgE antistoff rettet mot nativ OA i mus og fiksert på overflaten av rotte mastceller i hetero-loge PCA- reaksjoner. Resultatene antyder at U-KRS pre-behandling med OA kan påvirke dets anti-geniske egenskaper og evne til å reagere med anti-OA IgE antistoff rettet mot native IgE molekyler.

Eksempel 19: Effekt av behandling med U-KRS på tidlig osteoporose.

Materialer og metoder

U-KRS ble administrert intraperitonealt i en dosering av 30 mg/ kg annen hver dag i seks måneder til hunnkjønn rotter med ovariektom-indusert tidlig osteoporose. Administrering av U-KRS startet på den andre dag etter det kirurgiske inngrep. Ved slutten av langtidsbehandlingen med U-KRS ble hver rotte testet for styrken av både humeri og parametere av rotte femur ble også målt.

Resultater

Resultatene viste at nedgangen i mekanisk styrke i humorale ben og noen forandringer i femur forårsaket av ovariektomi ble hindret med seks måneders behandling med U-KRS.

Eksempel 20: Påvirknin<g>av U-KRS preparat på influensavirus og bakterien E. coli og S. aureus.

Materialer og metoder

Influensavirus av APR8/HON1/34- stammen ble dyrket på 10 dagers gamle hønseembryoer;

E.coli bakterier avledet fra gjeldende klinisk materiale og stammen 209P av S.aureus ble benyttet. U-KRS preparat av seriene 290614.

Resultater

Dette forsøk bekrefter de eksisterende av anti-infektiøse virkning av U-KRS preparatet i infiserte makro-organismer. Påvirkningen utvises gjennom stimulering av noen elementer av hvert immunsystem på grunn av en sekundær ødeleggelse av mikroorganismer eller celler infisert av disse mikroorganismer.

Eksempel 21: Biologisk aktivitet av U-KRS med hensyn til influensavirus.

Material og metoder

Virus av A type, Port-Chalmers 1/73- kultur, antigenisk H3N2 varietet.

Virus ble injisert ved 1, 10 og 100 EID50per embryo. U-KRS ble oppløst de novo i Hanks løsning.

Resultater

Det ble bekreftet at U-KRS har en dempende virkning på utvikling av den infektive prosess.

Eksempel 22: Virkning av U-KRS på effekter av bestråling.

Materialer og metoder

CBA/J hannkjønn mus med 16/20 g kroppsvekt.

Korttids helkropps gammastråling av mus i doseringer i området fra 6,0 Gy til 7,5 Gy ble utført. Langtids-bestråling med kumulative doseringer av 8,75 Gy ble utført ved anvendelse av CEGO- anordning.

U-KRS ble administrert intraperitonealt i doseringer av 0,1, 1,4 og 12 mg/ kg kroppsvekt.

Resultater

Evnen av U-KRS til å modifisere effektene av bestråling ble studert i CBA/J mus ved anvendelse av dosering av medikament fra 0,1 til 12 mg/ kg. U-KRS ble funnet å øke overlevelsesraten i mus med 50 til 60 % med bestrålingsdoser fra 5,00 til 7 Gy, men ingen effekt ved dosering av 7,5 Gy. Variering av doser av medikament påvirket ikke utbyttet av bestrålingen.

Hovedutbyttet av foreliggende forsøk er funnet at U-KRS er i stand til å modifisere effekten av bestråling idet den appliseres i både profylaktiske og helbredende regimer.

Eksempel 23: Effekter av U-KRS mot ioniserende bestråling.

Materialer og metoder

Brystkarsinom, kolorektal adenokarsinomer, glioblastom og pankreas adenokarsinom cellelinjer. U-KRS-preparat.

Effektene av U-KRS på celleoverlevelser ble testet ved konsentrasjoner i området fra 0,2 uG ML. Eksponeringstid var 1, 3 og 241, hvoretter cellene ble vasket med fosfat/ bufret saltløsning og ferskt medium ble tilsatt.

Resultater

U-KRS behandling resulterte i differensiert tids og doseavhengig reduksjon i klonogene celleoverlevelse. Alle fire humane tumor cellelinjer som ble testet viste forskjellig sensitivitet mot U-KRS med en opptil 100 gangers høyere reduksjon i klonogenisk overlevelse sammenlignet med humane fibroblaster ved 24 timers innkubering.

Claims (25)

1. Fremgangsmåte for å fremstille et alkaloidreaksjonsprodukt omfattende minst et alkaloidderivat med et kvaternært nitrogen,karakterisert vedat fremgangsmåten omfatter: a) å tilveiebringe en reaksjonsblanding omfattende et organisk oppløsningsmiddel, minst ett alkaloid som foreligger i planten Chelidonium majus L., og fortrinnsvis valgt blant gruppen som består av chelidonin, protopin, stylopin, allokryptopin, homochelidonin, chelamidin, chelamin, L-spartein og oksychelidonin, og et alkylerende middel, og utføre en alkyleringsreaksjon ved å reagere det minst ene alkaloid med det alkylerende middel i nærvær av et organisk løsemiddel, for å muliggjør dannelse av minst ett alkaloidderivat som har et kvaternært nitrogen; b) etter terminering av reaksjonen, å underlegge den resulterende reaksjonsblanding til minst ett vasketrinn med et vandig oppløsningsmiddel eller vann, for å fjerne vannløselige forbindelser som foreligger i reaksjonsblandingen; og c) underlegge den vaskete reaksjonsblanding til en behandling med et sterk syre i gassform eller i væskeform, fortrinnsvis med gassformig hydrogenklorid eller en hydrogenkloridløsning, og dermed omdanne det minst ene kvaternære alkaloidderivat til en vannløselig form, fortrinnsvis et vannløselig salt.

2. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1,karakterisert vedat, i trinn c), presipiteres et reaksjonsprodukt under eller etter behandling med syre, hvoretter presipitatet separeres fra det organiske løsemiddel, og valgfritt ytterligere renses ved anvendelse av organiske oppløsningsmidler.

3. Fremgangsmåte i samsvar med krav 1 eller 2,karakterisert vedat alkyleringsreaksjonen utføres ved forhøyet temperatur, fortrinnsvis ved kokepunktet til oppløsningsmidlet.

4. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-3, k a r akt e rt e r i s e rt ved aten blanding av flere eller alle alkaloider av Chelidonium majus L., anvendes som en alkaloidkilde.

5. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-4,karakterisert vedat chelidonin, oksychelidonin eller metoksychelidonin appliseres som eneste alkaloidkilde.

6. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-5,karakterisert vedat det alkylerende middel er et fysiologisk aktivt middel, fortrinnsvis et cytotoksisk middel.

7. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-6,karakterisert vedat det alkylerende middel er vannløselig eller dekomponerer til vannløselige komponenter ved kontakt med vann.

8. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-7,karakterisert vedat den organiske løsning er valgt blant gruppen omfattende monoklormetan, diklormetan, triklormetan, monokloretan, dikloretan og trikloretan.

9. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-8,karakterisert vedat det alkylerende middel ertris(l-aziridinyl)fosfinsulfid (CAS 52-24^).

10. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-9,karakterisert vedatalkaloid-derivatet har et kvaternært nitrogenatom hvortil, som en fjerde ligand, en hydrogenenhet eller en enhet opprinnelig fra det alkylerende middel bindes, hvor enheten fortrinnsvis er valgt blant gruppen omfattende et metyl, etyl og en tris(l-aziridinyl)fosfinsulifdenhet.

11. Fremgangsmåte i samsvar med et av kravene 1-9,karakterisert vedat alkaloid-derivatet har et kvaternært nitrogenatom og som en fjerde ligand av nevnte nitrogen er dekomponerings-produkt dannet på grunn av behandling med syre.

12. Vannløselig alkaloidreaksjonsprodukt,karakterisert vedat det omfatter minst ett alkaloidderivat, som har et kvaternært nitrogen, hvor alkaloidet omfatter chelidonin, for anvendelse som et medikament.

13. Alkaloidreaksjonsprodukt i samsvar med krav 12,karakterisert vedat det oppnås i samsvar med en fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-11.

14. Alkaloidreaksjonsprodukt i samsvar med krav 13,karakterisert vedat det oppnås gjennom reaksjon med et alkylerende middel, hvor, i derivatet, et opprinnelig tertiært nitrogen foreligger i kvaternær form hvortil, som en fjerde ligand, en hydrogenenhet eller en enhet opprinnelig fra det alkylerende middel bindes, hvor resten fortrinnsvis er selektert fra gruppen bestående av et metyl, etyl, og tris(l-aziridinyl)fosfinsulifdenhet, eller fra en del av tris(l-aziridinyl)fosfinsulfid.

15. Alkaloidreaksjonsprodukt i samsvar med krav 13 eller 14,karakterisert vedalkaloid-derivatet foreligger i form av et vannløselig salt, fortrinnsvis i form av et hydroklorid.

16. Alkaloidreaksjonsprodukt i samsvar md et av kravene 13-15,karakterisert vedat chelidonin foreligger som den eneste alkaloidkilde.

17. Alkaloidreaksj onsprodukt i samsvar med et av kravene 13-16,karakterisert vedat produktet ytterligere omfatter minst én forbindelse valgt blant gruppen omfattende ikke-reagert tertiært alkaloider, ikke-reagert alkylerende middel, og dekomponeringsprodukter av det alkylerende middel.

18. Vannløselig chelidoninderivat,karakterisert vedat det naturlig forekommende chelidonin foreligger i en kvaternær form i samsvar med påfølgende formel (I):

hvor som en fjerde ligand RI til det kvaternære nitrogen foreligger et hydrogen eller et metyl eller etylenhet, for anvendelse som et medikament.

19. Chelidoninderivat i samsvar med krav 18,karakterisert vedat det er som et salt med en sterk syre, mer fortrinnsvis i form av et hydroklorid.

20. Chelidoninderivat i samsvar med krav 18 eller 19,karakterisert vedat det erkarakterisertmed NMR-spektrum i fig. 4, UV-spektrum i fig. 5, massespektrum i fig. 7 og 8, og elementanalyse i tabell 1.

21. Anvendelse av et vannløselig alkaloidreaksjonsprodukt omfattende minst ett alkaloidderivat som har et kvaternært nitrogen, hvor alkaloidet omfatter chelidonin, for fremstilling av et farmasøytisk materiale for profylakse eller behandling av en sykdom eller kroppstilstand valgt blant gruppen som består av virusinfeksjon, cancer, immunologisk dysfunksjon, metabolsk dysfunksjon og bestrålingsskade.

22. Anvendelse i samsvar med krav 21, hvor sykdommen er valgt blant gruppen omfattende allergier, osteoporose, hudtumorer, influensavirusinfeksjoner, reumatiske sykdommer, sår, postoperative arr, epilepsi og multippel sklerose.

23. Anvendelse i samsvar med krav 21 eller 22, hvor det eneste alkaloid er chelidonin og alkaloid-reaksjonsproduktet er karakteriser med NMR-spektrum i fig. 4, UV-spektrum i fig. 5, massespektrum i fig.

7 og 8, og elementanalyse i tabell 1.

24. Anvendelse av det vannløselige chelidoninderivat i samsvar med krav 18-20 for fremstilling av et farmasøytisk materiale for profylakse eller behandling av en sykdom eller kroppstilstand valgt blant gruppen omfattende virusinfeksjon, cancer, immunologisk dysfunksjon, metabolsk dysfunksjon og bestrålingsskade.

25. Anvendelse i samsvar med krav 24, hvor sykdommen er valgt blant gruppen omfattende allergier, osteoporose, hudtumorer, influensavirusinfeksjoner, reumatiske sykdommer, sår, postoperative arr, epilepsi og multippel sklerose.