PT1531332E - Análise e tipificação de proteínas monoclonais por electroforèse capilar e imunodeslocamento - Google Patents

Description

1

DESCRIÇÃO "ANÁLISE E TIPIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS MONOCLONAIS POR ELECTROFORÈSE CAPILAR E IMUNODESLOCAMENTO" A presente invenção refere-se ao domínio da análise de amostras biológicas por electroforèse capilar e imunodeslocamento. A invenção tem por objectivo, nomeadamente, um método de análise de amostras biológicas por electroforèse capilar, no qual a separação electroforética dos constituintes da amostra é acompanhada por um tratamento da amostra por uma técnica imunológica. No âmbito do presente pedido de patente, o termo "imuno-subtracção" designa a supressão do pico de determinadas proteínas no perfil electroforético, por imunodeslocamento deste pico proteico para uma outra posição do perfil. A invenção tem por objectivo, em particular, um método aplicável nos protocolos de diagnóstico, e refere-se nomeadamente à pesquisa e à tipificação nas amostras biológicas de proteínas testemunhas de afecções monoclonais, também denominadas gamapatias monoclonais ou paraproteinémias. 0 desenvolvimento normal dos linfócitos B conduz à produção, na superfície dos linfócitos B maduros, de imunoglobulinas de isotipos M e G, tendo inicialmente idiótipos comuns. Os distúrbios plasmocitários que estão na origem das afecções monoclonais resultam de uma deficiência do controle do processo de maturação celular para células secretoras de anticorpos, após a exposição a um antigene específico da imunoglobulina de superfície. Nesta situação, 2 imunoglobulinas que tenham uma afinidade para um antigene ao qual o hospedeiro foi exposto continuam a ser secretadas após o desaparecimento do antigene. De forma geral, as imunoglobulinas de uma dada espécie são repartidas em diferentes classes de anticorpos, sendo cada classe identificada com o auxilio de um isotipo, sendo os diferentes isotipos identificados no seio de uma espécie comuns a todos os indivíduos normais dessa espécie. As imunoglobulinas são formadas geralmente por cadeias pesadas (2 cadeias pesadas) e por cadeias leves (2 cadeias leves). Na base desta estrutura de quatro cadeias identificaram-se cinco isotipos de cadeias pesadas (isotipos M, G, A, D, E) e dois isotipos de cadeias leves (isotipos kapa e lambda). Além do seu isotipo, as imunoglobulinas são caracterizadas por determinantes correspondentes a estas diferenças entre os indivíduos de uma mesma espécie, denominados alótipos, assim como pelo seu idiótipo correspondente a uma parte da molécula da imunoglobulina que liga o antigene. 0 idiótipo é pois característico das moléculas produzidas por um clone dado de células produtoras de anticorpos.

As doenças palsmocitárias são pois caracterizadas, nomeadamente, pela alteração da produção de certas imunoglobulinas ou de certas cadeias de imunoglobulinas, e a detecção e a caracterização desta alteração têm um interesse clínico manifesto. A análise por electroforèse de uma amostra biológica permite a identificação das proteínas séricas e a determinação da quantidades destas proteínas, em particular das imunoglobulinas. Num campo electroforético, as proteínas migram em função do seu tamanho e da sua carga, formando um perfil de electroforèse compreendendo uma série de picos (igualmente denominados fracções), cada um dos 3 quais correspondente a uma ou a várias proteínas. A fracção denominada gama é formada, nomeadamente, por imunoglobulinas, principalmente do tipo G. Nos pacientes que sofrem de doenças plasmocitárias, conducentes à secreção de proteínas monoclonais (igualmente denominadas proteínas Mc) , a quantidade de imunoglobulinas correspondentes a um dos isotipos conhecidos pode ser aumentada de forma significativa relativamente à normal, conduzindo a uma modificação do perfil electroforético pela modificação de um ou de vários picos das proteínas separadas de uma amostra do soro. A detecção das proteínas monoclonais, em particular a detecção de um aumento da produção de um isotipo particular de imunoglobulina, apresenta, pois, um interesse manifesto para a pesquisa de doenças palsmocitárias, mas também para o acompanhamento de pacientes atingidos por para-proteinémias. Observou-se, por exemplo, que a quantidade de uma proteína Mc sérica pode, consoante os casos, nomeadamente aquando do desenvolvimento tumoral, estar directamente ligada à progressão da doença. Assim, uma proteína Mc pode constituir um marcador tumoral que, quando está correlacionado com outros factores, pode ser tido em conta no estabelecimento de um diagnóstico.

As doenças palsmocitárias não são responsáveis somente pela produção anormal de proteínas Mc; entre os distúrbios patológicos associados à produção de proteínas Mc deverão referir-se os neoplasmas linfóides, tais como a leucemia linfóide crónica ou os linfomas de origem linfocitária B ou T, determinadas proliferações não linfóides, tais como a leucemia mielóide crónica, os cancros da mama ou do cólon. 4

Podem ser igualmente produzidas proteínas Mc monoclonais em certas patologias não malignas, tais como a cirrose, a sarcóidose, parasitoses ou a doença de Gaucher. Detecta-se ainda a produção de proteínas monoclonais em afecções autoimunes, tais como a poliartrite reumatóide, a miastenia ou a doença das aglutininas frias.

Uma vez que a electroforèse sobre gel de agarose e a electroforèse capilar permitem detectar a presença de proteínas monoclonais em amostras biológicas e acompanhar, no tempo, a evolução das proteínas monoclonais detectadas, constituem, portanto, métodos de escolha, tendo em vista um estabelecimento de um diagnóstico ou o acompanhamento de pacientes.

De acordo com as patologias envolvidas, a proteína Mc tem natureza diferente, constituída quer por uma molécula de anticorpo intacta, quer por um fragmento de um anticorpo. Assim, podem ser produzidas unicamente cadeias pesadas ou cadeias leves. É o caso, por exemplo, das proteínas de Bence Jones, segregadas nas urinas dos pacientes atacados por mielomas e que se apresentam sob a forma apenas de cadeias leves.

Os isotipos determinados das imunoglobulinas permitem tipificar as proteínas Mc, em função da natureza da sua cadeia pesada e/ou em função da natureza da sua cadeia leve. A técnica utilizada para a tipificação das imunoglobulinas deverá permitir assim determinar o tipo de cadeias pesadas e/ou leves associadas a cada proteína monoclonal presente numa amostra biológica.

Além da detecção da presença destas proteínas Mc, pareceu, pois, importante tipificá-las, para permitir 5 caracterizar a patologia que lhes está associada. Para este efeito, foram já propostas diversas abordagens, tais como a cromatografia por coluna, a electroforèse sobre gel de agarose ou ainda a electroforèse capilar. Em processos que utilizam a electroforèse sobre gel de agarose, as proteínas da amostra biológica são separadas por electroforèse sob a forma de um perfil de electroforèse no qual as proteínas e em particular as globulinas são reveladas sob a forma de picos ou bandas, susceptíveis de incluir uma proteína monoclonal, cuja natureza deverá ser confirmada em seguida, por exemplo, pelas técnicas de imunofixação sobre gel de agarose. Este técnica combina duas fases, utilizando uma electroforèse sobre gel de agarose e em seguida uma imuno-precipitação. Várias partes alíquotas de uma mesma amostra biológica são depositadas em paralelo sobre um gel de agarose, em seguida a aplicação de um campo eléctrico permite a separação das proteínas e, nomeadamente, das imunoglobulinas. Cada pista é incubada em seguida com um tipo de anticorpo específico dos tipos de imunoglobulinas pesquisados (IgG, IgA, IgM, kapa e lambda, e eventualmente kapa livre, lambda livre, IgD e IgE) , conduzindo à formação de imunocomplexos entre as imunoglobulinas da amostra e os anticorpos. Depois de uma lavagem do gel, que permite eliminar as proteínas que não tenham precipitado, uma fase de coloração permite revelar a posição dos imunocomplexos: no caso da ausência de proteínas monoclonais, aparece unicamente um fundo colorido difuso (correspondente à pluralidade de anticorpos monoclonais que constituem o "fundo policlonal"); no caso da presença de proteínas monoclonais, as bandas coloridas são reveladas em regiões específicas do gel. Utilizando-se uma pista de referência (sem anti-soro), pode-se assim tipificar cada banda monoclonal visível sobre o gel. 6

Uma técnica de tipificação utilizada em electroforèse capilar é a imuno-subtracção, tal como é descrita na patente US 5 228 960. Esta técnica consiste em incubar partes alíquotas de uma amostra biológica com anticorpos específicos, capazes de subtrair um constituinte dado (por exemplo, imunoglobulinas) da referida amostra. Este constituinte permanece adsorvido sobre a fase sólida sobre a qual foi fixado o anticorpo; já não está presente, por conseguinte, na amostra analisada por electroforèse capilar. As diferentes partes alíquotas tratadas nas quais foram subtraídas determinadas imunoglobulinas, consoante a especificidade dos anticorpos utilizados, são então injectadas no capilar, em seguida as proteínas contidas nas partes alíquotas são separadas por aplicação de um campo eléctrico aos terminais do capilar. Os perfis obtidos são comparados com o perfil de uma parte alíquota não tratada.

Foram propostas outras técnicas de identificação das proteínas monoclonais, separadas por electroforèse capilar a partir de uma amostra, por exemplo, na Patente EP 0 690 988 (Bl) . A patente europeia em questão descreve a associação e a separação electroforética capilar de uma fase de imuno-subtracção, com a finalidade de facilitar a classificação das proteínas Mc. De acordo com esta patente, a imuno-subtracção é realizada "no-capilar", segundo um processo que compreende um passo de separação electro- forética de uma primeira parte da amostra nos seus diferentes constituintes, e a detecção destes constituintes, em seguida a mistura de uma segunda parte da amostra com pelo menos um parceiro capaz de ligar especificamente um analito pré-determinado, contido na amostra, entendendo-se que o parceiro específico para a ligação tem uma mobilidade electroforética diferente da do referido analito. A segunda parte da amostra é separada em 7 seguida nos seus diferentes constituintes por electroforèse capilar, e são detectados os constituintes. É realizada em seguida uma fase de comparação dos constituintes separados, com os constituintes separados fora da presença dos parceiros específicos que ligam um analito pesquisado. A Patente Europeia EP 0 690 988 especifica que o parceiro destinado a ligar os analitos é uma molécula modificada, em particular um anticorpo anti-proteína Mc, que sofreu uma modificação química de forma a que o seu tempo de migração em electroforèse capilar o conduza para fora da região gama do perfil electroforético. Uma modificação química proposta dos anticorpos é a que consiste em fazê-los reagir com o anidrido succínico para lhes fornecer funções carboxílicas suplementares, negativas a pH alcalino. Nas condições das análises descritas (pH 10), a carga negativa global dos anticorpos foi, pois, aumentada.

As condições descritas para realizar a modificação dos anticorpos, de acordo com a Patente Europeia 0 690 988, assim como os resultados experimentais relatados, que se referem unicamente à análise e à separação das imunoglobulinas G purificadas e não à análise de um soro, permitem duvidar da pertinência do processo proposto com a finalidade de pesquisar proteínas monoclonais numa amostra biológica "real", por exemplo, num soro. O Documento WO 96/33412 descreve composições, processos e dispositivos para realizar dosagens ultra-rápidas por ligação, preferivelmente por electroforèse capilar. Num modo de realização, um primeiro parceiro de ligação é portador de uma etiqueta detectável e um segundo parceiro de ligação (por exemplo, um anticorpo), é modificado para ser bastante carregado. São dados exemplos de compostos carregados. Alguns de entre eles conferem uma ou várias cargas negativas para cada função quimica modificada do anticorpo. Há entre eles polimeros que possuem várias funções de ácido carboxilico e que estão ligados por um agente de acoplamento. A combinação de uma amostra que contém um analito com o qual os dois parceiros de ligação podem interagir e sobre o qual se podem fixar provoca a formação de um complexo com três elementos. A diferença de mobilidade electroforética entre as formas livre e ligada ao complexo do primeiro parceiro de ligação marcado é tal que permite a electro-separação e a detecção posterior de um analito. As composições, os processos e os dispositivos descritos neste documento permitem determinar, quantitativamente, a concentração de um analito numa amostra. Este analito pode se um anticorpo monoclonal. São assim descritos "kits"/-conjuntos. A presente invenção propõe um processo de alternativa aplicável eficazmente a uma amostra biológica, associando a realização de uma electroforèse capilar, para a separação dos constituintes de uma amostra biológica, e a imuno-subtracção, para permitir a tipificação das proteínas Mc eventualmente presentes na amostra biológica analisada.

Uma das vantagens do processo da invenção é permitir um deslocamento, para fora da zona correspondente ao perfil de migração das proteínas da amostra, em particular para fora da zona de migração das globulinas, do pico de electroforèse correspondente a uma proteína Mc, quando ela 9 está presente numa amostra biológica e quando foi separada por electroforèse capilar. Este deslocamento subtrai o pico que representa a proteina Mc separada, da sua posição esperada na sequência da fase de migração, sem interferir com a separação das outras proteínas da amostra. Contrariamente ao processo descrito na Patente US 5 228 960, a proteina monoclonal reconhecida pelo anticorpo está presente na amostra injectada para realizar a electroforèse capilar. É simplesmente subtraída do perfil, visto que é deslocada da sua posição inicial. Por consequência, este processo permite uma leitura fiável dos resultados da análise, dissipando qualquer eventual confusão entre picos vizinhos correspondentes às proteínas separadas da amostra. A invenção refere-se igualmente a anticorpos modificados quimicamente, para lhes conferir funções quimicas suplementares, negativas a pH alcalino (neste caso funções carboxilicas), por reacção de certas funções quimicas do anticorpo com um agente modificador; cada uma das funções quimicas modificadas fornece, assim, várias cargas negativas suplementares ao anticorpo. Estes anticorpos são em seguida utilizados para a imuno-subtracção/imunodeslocamento especifico dos picos correspondentes a proteínas Mc de uma amostra biológica.

Os anticorpos assim preparados no âmbito da invenção apresentam, em relação aos anticorpos de partida já carregados negativamente quando estão a pH alcalinos, um suplemento de cargas negativas quando estão a pH alcalino, em virtude da aquisição de funções tais como funções ácidos carboxílicos suplementares. Estes anticorpos são designados de ora em diante pela expressão "anticorpos modificados 10 sobrecarregados negativamente" ou também pelos termos "anticorpos modificados". A invenção tem ainda por objecto "kits" [conjuntos] para a realização de uma separação das proteínas de uma amostra biológica por electroforèse capilar e a detecção por imuno-subtracção, a fim de as identificar e, se for o caso, de as quantificar, das proteínas monoclonais susceptíveis de estarem contidas na amostra biológica ensaiada. A invenção refere-se também a um processo para a preparação de anticorpos modificados quimicamente para lhes acrescentar cargas negativas suplementares a pH alcalino (anticorpos modificados sobrecarregados negativamente), em condições que permitam a sua utilização numa imuno-subtracção . A invenção refere-se, por conseguinte, a um processo para a análise electroforética capilar de uma amostra biológica, compreendendo a utilização de anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, de forma tal que migrem para uma zona situada fora da zona de migração das proteínas da amostra biológica quando são separadas por realização da electroforèse, tendo os referidos anticorpos uma especificidade antigénica para uma proteína monoclonal determinada. A invenção é definida pelas reivindicações.

Na separação das proteínas de uma amostra biológica, num capilar cheio de electrólito, as proteínas migram sob o efeito de um campo eléctrico: as proteínas são assim impelidas numa migração do ânodo para o cátodo. A diferença 11 entre a velocidade electroforética própria (ligada à carga da proteina) e o fluxo electro-osmótico (ligado à carga da superfície interna do capilar) permite a separação das proteínas a detectar.

As proteínas de uma amostra injectada no capilar definem, pois, um perfil de migração electroforético que se pode dividir em várias zonas, ilustradas nas figuras do presente pedido de patente, e correspondem às zonas gama (a mais próxima do cátodo), beta-2, beta-1, alfa-2, alfa-1 e albumina (sendo esta última zona a mais próxima do ânodo). As imunoglobulinas contidas numa amostra biológica migram da zona alfa-1 para a zona gama, estando nelas incluídas as proteínas Mc.

Com a finalidade, nomeadamente, de permitir a separação electroforética de proteínas monoclonais contidas numa amostra biológica, assim como a sua tipificação fiável, por meio de uma reacção de imuno-subtracção, os inventores criaram condições de realização da imuno-subtracção que permitem a subtracção do pico correspondente a uma proteína monoclonal, do perfil de migração das proteínas da amostra (e, em particular, do perfil de migração das globulinas) e o seu deslocamento para fora da região compreendida entre a zona gama e a zona alfa-1.

Mais precisamente, a proteína monoclonal pesquisada na amostra não é subtraída do meio analisada, mas sim deslocada, sob o efeito da sua ligação com um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente que a reconhece especificamente, em condições tais que o complexo formado entre a referida proteína monoclonal e o referido anticorpo modificado é deslocado para fora do perfil de migração das globulinas da amostra (as globulinas correspondem às 12 fracções electroforéticas gama, beta-2, beta-1, alfa-2 e alfa-1 no perfil electroforético).

Mais precisamente ainda, o complexo proteína Mc-anticorpo carregado negativamente a pH alcalino encontra-se, depois da fase de migração electroforética, na zona mais anódica do perfil das proteínas separadas. 0 complexo anticorpo modificado-proteína Mc é, pois, visível fora do perfil assim definido pelas imunoglobulinas separadas, nomeadamente está deslocado da zona gama para a albumina, sendo eventualmente visível na vizinhança da albumina e de alfa-1, sem que isso impeça a eventual detecção de uma proteína monoclonal anódica (isto é, migrante em alfa-1/alfa-2), visto que o complexo tem uma mobilidade intermediária entre a da proteína monoclonal e a do anticorpo modificado. 0 anticorpo modificado é, em princípio, fornecido em excesso para a reacção, e a fracção de anticorpo que não tiver reagido é visível mais próxima do ânodo, para além do pico correspondente à albumina (isto é, de migração mais anódica do que a albumina).

Um primeiro processo de acordo com a invenção para a análise electroforética capilar de uma amostra biológica e imuno-subtracção, compreende os seguintes passos: a) a separação dos constituintes de uma primeira parte alíquota da amostra biológica por electroforèse capilar, na presença de anticorpos modificados sobrecarregados negativamente que tenham uma especificidade antigénica determinada e susceptíveis de formar um complexo do tipo antigene-anticorpo com uma 13 proteína monoclonal eventualmente presente na amostra biológica, e a detecção dos constituintes separados da amostra biológica; b) a comparação do perfil electroforético obtido no passo a) com um perfil electroforético dos constituintes de uma outra parte alíquota da mesma amostra, separada por electroforèse capilar na ausência dos referidos anticorpos modificados sobrecarregados negativamente de especificidade antigénica determinada. É de notar que as amostras biológicas compreendem normalmente uma fracção de imunoglobulinas policlonais que constituem um "fundo policlonal" situado na região gama (ou próximo desta última) do perfil electroforético. Estas imunoglobulinas policlonais aparecem sob a forma de um pico mais largo que o das imunoglobulinas Mc (em virtude de conterem um grande número de imunoglobulinas de mobilidades muito próximas), nas condições de realização de uma electroforèse capilar próprias para a separação das proteínas Mc; este fundo policlonal pode ser diminuído aquando da entrada em contacto da amostra com os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, consoante o tipo de imunoglobulinas que o constituem (G, A, M, kapa ou lambda). A distinção entre pico monoclonal e fundo policlonal faz-se, neste caso referenciando o pico Mc focalizado a detectar em relação ao pico largo policlonal.

Num modo de realização preferido da invenção, realizam-se paralelamente a entrada em contacto de partes alíquotas de uma amostra biológica dada com diferentes anticorpos, formando uma gama de anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, tendo cada tipo de anticorpos desta gama uma especificidade antigénica determinada para um isotipo de imunoglobulinas. 14

Assim, pode-se realizar paralelamente a análise de uma mesma amostra biológica com os referidos anticorpos modificados com especificidade diferente, sendo a especificidade antigénica destes anticorpos escolhida em função das proteínas monoclonais pesquisadas que seriam reconhecidas por estes anticorpos e em função do número de capilares em paralelo no aparelho de electroforèse.

Ainda de acordo com um modo de realização particular da invenção, num dos processos descritos acima, a amostra biológica é dividida em pelo menos duas partes aliquotas e o processo compreende os passos seguintes, anteriores à separação dos constituintes da amostra biológicas por electroforèse: 1) a colocação em contacto de um meio contendo anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, que têm uma especificidade antigénica determinada, com uma parte aliquota da amostra biológica, em condições de incubação que permitam a reacção imunológica entre os referidos anticorpos e uma proteina alvo especificamente reconhecida pelos referidos anticorpos, quando ela se encontra presente na amostra biológica, e a colocação em contacto de uma outra parte aliquota da amostra biológica com o meio acima referido, entretanto desprovido dos anticorpos modificados, 2) a injecção no capilar de electroforèse das partes aliquotas da amostra biológica incubadas de acordo com o passo 1).

Num outro modo de realização particular da invenção, o processo de análise electroforética capilar compreende os passos seguintes, anteriormente à separação dos constituintes da amostra biológica por electroforèse: 15 1) a injecção de um meio contendo anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, que têm uma especificidade antigénica determinada, no capilar de electroforèse, e a injecção do referido meio, entretanto desprovido dos anticorpos modificados, num outro capilar de electroforèse; 2) a injecção da amostra biológica nos capilares de electroforèse tratados de acordo com o passo 1), em condições que permitam a reacção imunológica entre os anticorpos e a ou as proteínas alvo, quando esta ou estas está ou estão presentes na amostra biológica.

Para a análise de uma amostra biológica, quando a gama dos anticorpos modificados sobrecarregados negativamente compreende n tipos de anticorpos com especificidade diferente determinada, separa-se a amostra biológica em pelo menos η + 1 partes alíquotas.

Os anticorpos utilizados para preparar os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente são imuno-globulinas escolhidas entre anticorpos anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-IgE, anti-IgD, anti-kapa, anti-lambda, anti-kapa livre e anti-lambda livre.

Os anticorpos são escolhidos, de forma preferida, entre os anticorpos anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-kapa e anti-lambda. De acordo com um modo de realização particular da invenção, utiliza-se uma gama de anticorpos compreendendo estes 5 anticorpos. De acordo com um outro modo de realização da invenção, utiliza-se uma mistura de todos ou de parte destes anticorpos, por exemplo, uma mistura de 5 anticorpos (anti-soro pentavalente) ou uma 16 mistura de 3 anticorpos (anti-soro trivalente), contendo, por exemplo, anticorpos anti-cadeias pesadas IgG, IgA, IgM.

Pode-se também limitar a utilização do processo da invenção somente à utilização de alguns dos anticorpos identificados acima.

Para obter anticorpos sobrecarregados negativamente, realiza-se uma reacção dos anticorpos que têm a especificidade antigénica escolhida com um composto que forneça cargas suplementares negativas a pH alcalino, por exemplo, um anidrido carregado negativamente. Fazem-se reagir, por exemplo, funções aminas dos anticorpos com um anidrido, de onde resulta a formação de uma função ácido carboxilico suplementar sobre o anticorpo (e, portanto, de uma carga negativa suplementar a pH alcalino) para cada função amina modificada.

No âmbito da presente invenção, o anidrido compreende pelo menos uma função de ácido carboxilico.

Para a realização destes anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, o anidrido utilizado é, vantajosamente, um anidrido benzeno-tricarboxílico. Este anidrido fornece duas funções de ácido carboxilico (e, portanto, duas cargas negativas suplementares a pH alcalino) para cada função amina modificada: uma primeira função graças à reacção do anidrido com a função amina, uma segunda função da parte da sua estrutura. 0 anidrido será assim denominado anidrido carregado negativamente, visto ser portador de pelo menos uma função ácido carboxilico carregada negativamente a pH alcalino. 17

Pode-se obter um anticorpo suficientemente modificado, por conseguinte suficientemente carregado negativamente a pH alcalino, efectuando a reacção do anticorpo com o anidrido carregado negativamente, por dissolução extemporânea do anidrido, nomeadamente do anidrido benzeno-tricarboxílico, em dimetilformamida (DMF) e a colocação em contacto do anidrido dissolvido com o anticorpo em solução, para permitir o fornecimento de cargas negativas ao anticorpo, sendo a referida reacção realizada a 37°C, em condições que permitam o enxerto de funções ácido carboxilico sobre o anticorpo. 0 enxerto do anidrido sobre o anticorpo faz-se com tanta mais eficácia, quanto mais solução do anidrido em DMF for posta em contacto, no último momento, com o anticorpo, para se obterem anticorpos com funções ácido carboxilico suplementares (e, portanto, cargas negativas suplementares a pH alcalino) , e isto de forma a prevenir a alteração do anidrido com a água contida na solução do anticorpo. É descrito mais pormenorizadamente, na sequência do pedido de patente, um processo de preparação dos anticorpos modificados.

Para fornecer funções ácido carboxilico suplementares (e, portanto, cargas negativas suplementares a pH alcalino) ao anticorpo, pode-se, como variante, utilizar o ácido melitico (fornecedor de cargas negativas a pH alcalino), ao qual se associa o agente de acoplamento EDC1 (ou cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida). 0 ácido melitico reage com as funções aminas dos anticorpos na presença do EDC1. 18

Os anticorpos modificados utilizados no processo de análise electroforética capilar de acordo com a invenção estão normalmente em excesso em relação à proteína alvo que reconhecem, quando aquela está presente na amostra biológica.

Este excesso permite não apenas um desaparecimento total da proteína Mc alvo do perfil proteico, mas também uma posição óptima do complexo anticorpo modificado-proteína Mc sobre o perfil: uma relação demasiado fraca entre os anticorpos modificados que têm uma especificidade antigénica determinada, e as proteínas alvo da amostra reconhecidas por este anticorpo não permitiria uma subtracção total do pico Mc e daria uma migração mais catódica do complexo do que quando esta relação é mais elevada.

Num modo de realização particular da invenção, a concentração de anticorpos carregados negativamente de cada especificidade utilizada para a imuno-subtracção é de cerca de 10 g/L. A invenção tem também por objecto anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, que são o produto da reacção de anticorpos com um anidrido fornecedor de pelo menos duas funções ácido carboxílico, de preferência o anidrido 1,2,4-benzeno-tricarboxílico.

Os anticorpos utilizados no processo de análise por electroforèse capilar e imuno-subtracção, são assim, vantajosamente, o produto da reacção do anticorpo com um anidrido carregado negativamente, compreendendo a referida reacção a dissolução extemporânea do anidrido em dimetil-formamida (DMF) e a colocação em contacto do anidrido 19 dissolvido com o anticorpo em solução, para permitir a reacção do anidrido e do anticorpo, sendo a referida reacção realizada a 37°C, em condições que permitam o enxerto de funções químicas suplementares sobre o anticorpo, nomeadamente funções de ácidos carboxílicos, negativas a pH alcalino. 0 processo de análise de amostras biológicas pode ser realizado sobre diferentes tipos de amostras biológicas, tais como amostras de soro, de plasma, de urina ou de líquido céfalo-raquidiano.

Consoante a natureza da amostra biológica utilizada e/ou a sua origem (isto é, consoante o processo médico do doente), a interpretação dos resultados provenientes da separação electroforética deve eventualmente ter em conta interferências que se possam produzir entre os anticorpos sobrecarregados negativamente e as proteínas da amostra. Estas interferências são perceptíveis e susceptíveis de análise pelos peritos na técnica e foram observadas para as amostras que continham fibrinogénio, designadamente as amostras de plasma ou os soros de certos pacientes tratados com compostos anticoagulantes. Os inventores observaram que o fibrinogénio pode reagir, por uma reacção não específica, isto é, uma reacção que não é do tipo antigene-anticorpo, com os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente de acordo com a invenção. Neste caso, quando está presente fibrinogénio, o que se traduz, num perfil electroforético, pela presença de um pico entre as zonas β e γ, este pico é suprimido da sua zona normal de migração depois de a amostra ter sido tratada com os anticorpos sobrecarregados negativamente de acordo com a invenção, manifestando-se esta supressão qualquer que seja a especificidade dos anticorpos sobrecarregados negativamente utilizados. Por 20 outras palavras, o pico que marca a presença do fibrinogénio na amostra é revelado unicamente no perfil electroforético testemunha (ELP) e desaparece do perfil das proteinas submetidas às reacções imunológicas com os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente (por imunodeslocamento para uma zona fora deste perfil).

As condições de realização da electroforèse capilar em veia liquida são as condições habitualmente utilizadas pelos peritos na técnica para os passos da injecção da amostra no tubo capilar, de separação dos constituintes da amostra por migração electroforética sob o efeito de uma corrente de electroendosmose. Estes passos compreendem, nomeadamente, a utilização de tampões de electroforèse, tais como os que são descritos nos pedidos de patentes WO 02/057736 e WO 02/057737, entendendo-se que os tampões de electroforèse são escolhidos para permitirem a separação de proteinas Mc sob a forma de picos. São condições de realização de uma electroforèse capilar, por exemplo, as condições apropriadas para utilizar o autómato Capillarys (SEBIA), estando aqui incluidos os tampões vendidos sob a denominação SEBIA CAPILLARYS Bl B2 + e CAPILLARYS PROTEIN(E) 6 e CAPILLARYS PROTEIN(E) 5.

Por exemplo, o tampão de análise utilizado para a migração electroforética é, vantajosamente, um tampão alcalino, cujo pH está compreendido no intervalo de 9 a 11, preferivelmente em torno de 10, compreendendo em particular um composto tampão e pelo menos um aditivo susceptivel de aumentar a força iónica do tampão de análise. O processo de análise electroforética capilar descrito anteriormente permite, por efeito da modificação química da mobilidade dos anticorpos utilizados para realizar o passo 21 da imuno-subtracção, remediar as consequências que poderiam resultar da co-migração das proteínas monoclonais com os constituintes proteicos da amostra, aquando do passo da separação electroforética. Assim, o processo da invenção permite evitar as interferências entre as proteínas monoclonais reconhecidas pelos anticorpos modificados sobrecarregados negativamente e as outras proteínas que constituem a amostra biológica. Esta vantagem essencial para a detecção fiável das proteínas monoclonais de uma amostra biológica resulta, nomeadamente, do facto de o complexo proteína Mc-anticorpo modificado migrar depois das proteínas e permitir, por conseguinte, a tipificação da proteína Mc reconhecida pelo anticorpo modificado sobrecarregado negativamente, qualquer que seja a posição da proteína monoclonal aquando da migração electroforética.

Por outro lado, a imuno-subtracção do pico correspondente ao complexo proteína Mc-anticorpo carregado negativamente é total, no sentido em que o pico que corresponderia à proteína monoclonal já não é detectável na zona correspondente ao perfil de migração das globulinas da amostra biológica.

Por consequência, o processo da invenção é aplicável, vantajosamente, à detecção e à tipificação de todos os tipos de imunoglobulinas monoclonais IgG, IgA, IgM, IgD, IgE e cadeias livres, qualquer que seja a sua mobilidade, na medida em que as zonas gamas, betas e alfas do perfil de migração sejam não interferentes com a zona de migração do anticorpo modificado sobrecarregado negativamente e do complexo que ele forma com as proteínas Mc, quando estas estão presentes na amostra biológica. 22 0 processo da invenção é, pois, aplicável para a análise electroforética capilar de proteinas monoclonais numa amostra biológica.

Para a detecção e a tipificação de proteinas monoclonais numa amostra biológica, realizam-se vantajosamente diversas análises capilares em paralelo, sendo a amostra biológica dividida em diferentes partes aliguotas, e pelo menos num número de partes aliguotas igual ou superior ao número de tipos de imunoglobulinas utilizadas para a pesguisa das proteinas Mc.

Para a realização da tipificação das proteinas Mc numa amostra biológica deverão ser realizadas normalmente pelo menos 6 análises capilares paralelas.

Os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente são, vantajosamente, imunoglobulinas cuja especificidade antigénica é escolhida entre as imunoglobulinas anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-kapa e anti-lambda e/ou anti-kapa livre, e/ou anti-lambda livre.

Podem adicionar-se-lhes as imunoglobulinas anti-IgD ou/e anti-IgE.

Além do facto de a proteina Mc eventualmente presente na amostra biológica poder ser tipificada pelo processo de acordo com a invenção, a referida proteina Mc, guando está presente, pode ser guantifiçada. Para este efeito, determina-se a superficie do pico correspondente à proteina Mc gue tenha sido subtraida do perfil. 0 processo de acordo com a invenção pode ser utilizado igualmente para identificar outras proteinas (além das 23 imunoglobulinas) visíveis sobre o perfil de electroforèse; poder-se-ão utilizar, por exemplo, anticorpos modificados de especificidade anti-haptoglobina humana, -alfa-1 anti-tripsina, -complemento C3, -complemento C4, -transferrina, -RBP,β2-microglobulina, -al-microglobulina, ou anticorpos com outras especificidades. Graças a estes anticorpos, seria assim possível identificar as proteínas que constituem uma fracção de um perfil electroforético, ou então localizar um fenótipo particular destas proteínas que tenha uma mobilidade diferente da normal.

As condições de realização da invenção, descritas no presente pedido de patente, com vista a detectar proteínas que não sejam imunoglobulinas, aplicam-se por analogia.

Por outro lado, a invenção tem por objecto um processo para a preparação de anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, compreendendo os passos de: - a dissolução extemporânea de um anidrido, que compreende pelo menos uma função ácido carboxílico, em dimetil-formamida (DMF), - a colocação em contacto dos anticorpos com o anidrido dissolvido, em condições que permitam a reacção do anidrido e do anticorpo, a fim de se obter um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente a pH alcalino. 0 anidrido escolhido para fornecer ao anticorpo as cargas suplementares negativas a pH alcalino é um anidrido que possua pelo menos uma função ácido carboxílico. 0 anidrido escolhido para fornecer ao anticorpo as cargas suplementares negativas a pH alcalino é, de preferência, o anidrido benzeno-tricarboxílico. 24 A preparação dos anticorpos modificados sobrecarregados negativamente é descrita pormenorizadamente na parte experimental.

Sublinha-se que, para serem eficazes, tratando-se do fornecimento de cargas negativas, os passos anteriormente definidos compreendem vantajosamente a dissolução do anidrido em dimetilformamida pura, e em seguida a mistura desta solução do anidrido no momento do enxerto com o anticorpo, isto é, tardiamente. 0 respeito por estas condições permite evitar uma destruição do anidrido pela água contida na solução do anticorpo, visto que a referida destruição alteraria a eficácia da preparação dos anticorpos carregados, diminuindo o fornecimento de cargas negativas a pH alcalino.

De forma preferida, a reacção a reacção entre o anidrido e o anticorpo, nomeadamente entre o anidrido benzeno-tricarboxóilico e o anticorpo, é realizada a uma temperatura de 37°C, ou a uma temperatura apropriada que permita aumentar o número de moléculas de anidridos enxertadas no anticorpo, por exemplo, durante uma duração de cerca de uma hora.

Antes de ser posto em contacto com o anidrido, o anti-soro a enxertar é vantajosamente dialisado contra uma solução de tampão PBS ou de tampão fosfato. Por outro lado, quando o anticorpo é posto em contacto com a solução de anidrido em DMF, adiciona-se preferivelmente soda, o que permite tamponizar melhor as funções ácido carboxilico do anidrido benzeno-tricarboxilico já presentes, assim como as que se formam à medida que prossegue a reacção do anidrido 25 com o anticorpo (de forma a conservar um pH neutro no meio reactivo, o que permite que prossiga a reacção do anidrido com as funções aminas do anticorpo).

De acordo com um modo de realização particularmente preferido da invenção, aquando da entrada em contacto com o anidrido em DMF, o anticorpo previamente dialisado contra um tampão PBS ou um tampão fosfato a pH 7,4, é posto em contacto com soda 5N, e adicionam-se preferivelmente tantos equivalentes de soda quantas as funções ácido carboxilico (1) formadas aquando da reacção, e (2) fornecidas pelo anidrido. Os anticorpos modificados são em seguida dialisados num meio que permita a conservação dos anticorpos, em seguida estas soluções são levadas à adequada concentração de trabalho (cerca de 10 g/L), a fim de se colocar nas condições em que a relação anticorpo/-antigene será óptima. A invenção tem também por objecto anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, caracterizados pelo facto de compreenderem funções ácido carboxilico enxertadas de forma a conferir-lhes uma capacidade de migração electroforética para fora do perfil de migração das imunoglobulinas de uma amostra biológica, separadas nas mesmas condições de separação por electroforèse capilar.

Os anticorpos carregados negativamente podem ser anticorpos monoclonais. Pode tratar-se, em alternativa, de anticorpos policlonais. O contacto entre o anticorpo e as proteínas antigénicas da amostra pode ser realizado de duas maneiras: uma mistura da solução de anticorpo modificado com a amostra biológica, preferivelmente diluida, no suporte de 26 amostras, por exemplo, na barra Capillarys, previamente à sua injecção no capilar, ou, em alternativa, as injecções sucessivas da solução de anticorpo modificado e, em seguida, da amostra diluida, no capilar. Este segundo modo de realização do passo de colocação em contacto permite uma reacção antigene/anticorpo no interior do capilar (" in-capilar”) , tão eficaz como o modo clássico de mistura das duas soluções na barra ou outro suporte de amostras, e é possibilitado em virtude das diferenças de mobilidade dos anticorpos modificados em relação às proteínas da amostra e da ordem da injecção das duas soluções; tendo os anticorpos modificados uma mobilidade muito mais fraca do que as proteínas da amostra (em virtude da sua carga negativa elevada) e sendo injectados em primeiro lugar, a injecção da amostra depois da dos anticorpos modificados provoca a passagem da amostra através da zona do anticorpo, e permite, portanto, a subtracção do perfil proteico dos antigenes reconhecidos pelos anticorpos. A invenção refere-se também a um "kit” [conjunto] de detecção de proteínas monoclonais numa amostra biológica, compreendendo anticorpos de acordo com a invenção e outros componentes, por exemplo, o meio destinado a conter os anticorpos, no entanto, sem os anticorpos (permitindo obter o perfil de referência) e/ou tampões de electroforèse e/ou soluções de lavagem dos capilares e/ou barras de diluição especificas a volumes reduzidos e/ou um diluente da amostra a analisar, permitindo, por exemplo, uma boa sobreposição das diferentes curvas obtidas durante as diferentes análises. Este "kit” compreende eventualmente indicações de utilização para realizar a análise electroforética e o imunodeslocamento, de forma a revelar e tipificar as proteínas Mc. 27

Este "kit” contém, preferivelmente, uma gama de anticorpos com especificidade anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-kapa e anti-lambda.

Um outro tipo de "kit" pode conter uma mistura de anticorpos com especificidades anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-kapa e anti-lambda. Esta mistura, que se poderá designar por anti-soro pentavalente, permite confirmar a natureza monoclonal de um pico surgido no perfil electroforético ou de uma deformação de uma fracção deste perfil. Este "kit" é particularmente interessante, visto que as imunoglobulinas Mc podem aparecer não somente na zona gama, mas igualmente nas zonas beta e alfa, e podem eventualmente estar mascaradas pelas proteínas habituais destas zonas no perfil obtido em electroforèse capilar. Neste modo de realização da invenção, a amostra é ensaiada em duas pistas: uma pista de referência (contendo somente o meio dos anticorpos, sem os anticorpos) e uma pista que permita revelar a presença de um pico monoclonal no perfil electroforético (com o auxilio do anti-soro pentavalente).

Um outro tipo de "kit" pode conter uma mistura de anticorpos com especificidades anti-cadeias pesadas (γ, α e μ, anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, que se pode denominar anti-soro trivalente), e/ou anticorpos com especificidades anti-cadeias leves kapa e lambda (livres e ligadas), e/ou anticorpos com especificidade anti-cadeias leves livres kapa e lambda. Este "kit" permitiria a detecção e a identificação de proteínas de Bence Jones ou cadeias leves livres Mc (kapa ou lambda) na urina ou no soro humanos por electroforèse capilar. Neste modo de realização, quando estes anti-soros são utilizados, a amostra é ensaiada em 6 pistas: uma pista de referência (contendo somente o meio dos anticorpos, sem o anticorpo), 5 pistas que permitem 28 caracterizar a ou as bandas Mc: presença de cadeias pesadas com o auxilio do anti-soro trivalente, e tipo de cadeia leve (kapa e lambda; livre ou ligada).

As misturas de anticorpos modificados podem ser obtidas por modificação de uma mistura de anticorpo bruta, ou por mistura de anticorpos previamente modificados por tipo de anticorpo. No âmbito da invenção, é preferida a realização de uma mistura de anticorpos previamente modificados para serem sobrecarregados negativamente.

No âmbito da realização da invenção, a apresentação dos resultados da separação electroforética pode ser feita como é ilustrado nos exemplos, sob a forma de perfis electroforéticos, cujo pico correspondente à proteina identificada por uma reacção imunológica especifica com os anticorpos sobrecarregados negativamente desapareceu do perfil.

Em alternativa, estes resultado podem ser apresentados sob a forma de perfis electroforéticos que não fazem aparecer senão o pico correspondente à proteina identificada por uma reacção imunológica especifica com os anticorpos sobrecarregados negativamente. No âmbito da realização do processo da invenção, este pico desaparece do perfil das proteínas separadas. No entanto, os resultados são tratados para não deixarem aparecer senão este pico.

Para este efeito, por técnicas apropriadas de tratamento de dados, subtrai-se cada perfil electroforético de uma parte alíquota da amostra considerada tratada por um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente, do perfil de uma parte alíquota não tratada, da mesma amostra. A subtracção de todos os perfis das partes alíquotas 29 tratadas conduz a uma imagem do tipo das que são obtidas numa imunofixação.

EXEMPLOS E FIGURAS

As figuras 1 a 13 ilustram exemplos de detecção de proteínas monoclonais em diferentes amostras biológicas e a tipificação destas proteínas monoclonais, e melhoram, por consequência, o prognóstico e o tratamento destas patologias. Nas figuras 2 a 13 a superfície sombreada do perfil representa as proteínas do soro separadas na presença dos anticorpos da invenção; o perfil das proteínas séricas separadas fora da presença dos anticorpos aparece igualmente segundo um traçado mais fino. 0 perfil das proteínas separadas não tratadas com os anticorpos de acordo com a invenção aparece igualmente isolado em cada figura, sob a designação ELP.

ELECTROFORÈSE CAPILAR A electroforèse capilar de amostras clínicas é realizada num aparelho de EC equipado com 8 capilares de sílica fundida, de diâmetro interno 25 mícrones (CAPILLARYS, Sebia) . A detecção é realizada a 200 nm. As amostras são colocadas no suporte de amostras do aparelho e injectadas automaticamente por injecção hidrodinâmica. A separação das amostras é realizada em menos de 5 minutos, por aplicação de um campo eléctrico de 400 V/cm. O capilar é lavado antes de cada análise com soda 0,25 M, e em seguida com o tampão de análise.

Protocolo para a modificação dos anticorpos com o anidrido tricarboxílico a) 10 mL do anti-soro a enxertar (IgG anti-humano, A, M, anti-kapa ou lambda DAKO, Dinamarca, a 10 g/L foram 30 dialisados contra uma solução tampão de fosfato 100 mM pH 7,4. b) foi preparada uma solução de anidrido 1,2,4-benzeno-tricarboxílico a 100 mM em DMF. c) a solução dialisada de anticorpos foi então misturada com soda 5 N e em seguida a solução de anidrido em DMF (213 pL de soda 5 N + 10 mL de solução de anticorpos + 5,33 mL de anidrido em DMF). d) o meio reactivo foi então colocado em agitação suave num agitador de balanço durante uma hora, a 37°C. e) a mistura foi então dialisada contra a solução tampão de fosfato 100 mM pH 7,4, com diversas mudanças do banho de diálise. f) uma vez terminada a diálise, o cordão foi colocado em PEG 6000 em pó durante 1 hora. g) uma vez terminada a concentração, este último foi então dialisado contra fosfato 100 mM pH 7,4+1 g/L de nitreto de sódio. h) o volume do cordão foi completado a 10 mL com uma solução de fosfato 100 mM pH 7,4 + 1 g/L de nitreto de sódio. i) a solução obtida foi filtrada por uma membrana de porosidade 0,45 pm e em seguida é conservada a 4°C. Pode ser utilizado qualquer outro meio de conservação, na condição de que a sua força iónica seja suficiente para assegurar a conservação dos anticorpos (isto é, próxima da da água fisiológica).

Protocolo para a modificação dos anticorpos com o ácido melítico a) 10 mL do anti-soro a enxertar (IgG anti-humano, A, M, anti-kapa ou lambda DAKO, Dinamarca, a 10 g/L foram dialisados contra uma solução tampão PBS 40 mM pH 7,4. b) adicionar 50 pL/mL de soda 5N; 31 c) adicionar (18 mg/mL de ácido melitico e em seguida 50 mg/mL de EDC1); d) o meio reactivo foi então colocado em agitação suave num agitador de balanço durante uma hora, a 37°C. e) a mistura foi então dialisada contra a solução tampão de fosfato 100 mM pH 7,4, com diversas mudanças do banho de diálise. f) uma vez terminada a diálise, o cordão foi colocado em PEG 6000 em pó durante 1 hora. g) uma vez terminada a concentração, este último foi então dialisado contra fosfato 100 mM pH 7,4+1 g/L de nitreto de sódio. h) o volume do cordão foi completado a 10 mL com uma solução de fosfato 100 mM pH 7,4 + 1 g/L de nitreto de sódio. i) a solução obtida foi filtrada por uma membrana de porosidade 0,45 ym e o todo foi conservado a 4°C.

Protocolo para a imunotipificação de um soro O Capillarys (SEBIA) é um aparelho que realiza 8 análises capilares em paralelo. A barra de imunotipificação é uma barra CAPILLARYS especifica da tipificação, constituída por 6 cavidades de 100 yL e por uma cavidade de dupla de 400 yL. Contém 60 mL de fosfato 100 mM na cavidade 1, 60 yL de anti-IgG modificado na cavidade 2, de anti-IgA modificado na cavidade 3, de anti-IgM modificado na cavidade 4, de anti-kapa modificado na cavidade 5, de anti-lambda modificado na cavidade 6, contendo a dupla cavidade 7/8 380 yL de diluente de imunotipif icação (álcool benzilico 0,02 M no tampão de análise Sebia utilizado). a) o tubo de soro a tipificar foi colocado em posição 1 no suporte CAPILLARYS sobre o qual foi colocada uma barra de "imunotipificação". 32 b) o suporte foi introduzido no aparelho: o autómato realizou então uma diluição a 1/20 do soro na cavidade dupla 7/8, a cavidade dupla foi então homogeneizada e foram repartidos 40 yL em cada uma das cavidades 1 a 6, homogeneizando-se cada uma destas cavidades. c) a análise capilar foi realizada em seguida nas seguintes condições: o tampão de análise pode ser o tampão Sebia Capillarys B1B2+ ou o tampão Sebia Capillarys Protein; tampão B1B2+: temperatura 32°C, tensão de migração 7 kV, janela de aquisição 100-235 s, injecção 250 mbars * 5 s; tampão Sebia Capillarys Protein (e) : temperatura 37°C, tensão de migração 6,5 kV, janela de aquisição 110-275 s, injecção 250 mbars * 5 s; d) a análise capilar obtida na cavidade 1 foi comparada com a das cinco cavidades seguintes, a fim de tipificar o soro analisado.

Ajustamento das condições operatórias para soros particulares:

Se o soro possuir uma fracção gama fraca, a diluição no diluente em b) é de 1/10. A fracção gama será considerada fraca se a sua análise no Capillarys em tampão B1B2+ der um valor inferior aos normais definidos para esta fracção com este tampão, ou seja, aproximadamente inferior a 10% (ou < 7,5 g/L).

Se o soro possuir uma fracção gama superior a cerca de 20 g/L, a diluição no diluente em b) é de 1140a.

Variante do protocolo para a imunotipificação de um soro: imuno-subtracção em-capilar 33

Neste caso são utilizadas duas barras: 1 barra constituída por 6 cavidades, contendo: 100 pL de fosfato 100 mM na cavidade 1, 100 pL de anti-IgG modificado na cavidade 2, de anti-IgA modificado na cavidade 3, de anti-IgM modificado na cavidade 4, de anti-kapa modificado na cavidade 5, de anti-lambda modificado na cavidade 6; 1 barra para a diluição do soro, constituída por 7 cavidades, contendo: 380 pL de diluente de imunotipificação (álcool benzílico 0,02 M no tampão Sebia Capillarys B1B2+) na dupla cavidade 7/8; a) foi introduzido no aparelho um primeiro suporte contendo a barra de anti-soros: o autómato realizou então uma injecção destes anticorpos nos capilares (250 mbars * 5 s). b) foi em seguida introduzido no aparelho um segundo suporte, contendo a barra para a diluição do soro e um tubo de soro na posição 1: o autómato realizou então uma diluição a 1/20 do soro na cavidade dupla 7/8, a cavidade dupla foi então homogeneizada e repartida nas cavidades 1 a 6 (40 pL de soro a 1/20 + 60 pL de tampão de análise por cavidade); os soros diluídos foram então injectados nos capilares (250 mbars * 5 s). c) o tampão de análise pode ser o tampão Sebia Capillarys B1B2+ ou o tampão Sebia Capillarys Protein(e): tampão B1B2+: temperatura 32°C, tensão de migração 7 kV, janela de aquisição 100-235 s; tampão Sebia Capillarys Protein (e): temperatura 37°C, tensão de migração 6,5 kV, janela de aquisição 110-275 s; d) a análise capilar obtida na cavidade 1 foi comparada com a das cinco cavidades seguintes, a fim de se tipificar o soro. 34

Resultados : o Exemplo 1: análise de um IgG anti-humano DAKO antes e depois da modificação com o anidrido 1,2,4-benzeno--tricarboxílico sobre Capillarys, com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 105-350 s) ; a modificação do anticorpo permite retardar acentuadamente a sua migração: o seu tempo de migração passa de 122 para 267 s (figuras 1 a e 1 b). o Exemplo 2: imunotipificação de um soro contendo uma proteina monoclonal de tipo A lambda, migrando em beta-2 sobre Capillarys, com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 100-235 s) : 6 partes aliquotas deste soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados com o anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico (anti-IgG, -IgA, -IgM, -kapa, -lambda) e com o meio destes anticorpos (sem anticorpo; pista ELP). Por comparação com a pista ELP (a preto; figura 2) , observa-se nitidamente o desaparecimento do pico monoclonal em beta-2 para as partes aliquotas tratadas com os anti-IgA e anti-lambda. Nas outras pistas é observada unicamente a diminuição do fundo policlonal. Note-se igualmente a ausência de interferência dos imunocomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes das gamas é um marcador de injecção, para facilitar a sobreposição dos perfis. o Exemplo 3: imunotipificação de um soro contendo uma proteina monoclonal de tipo G lambda, migrando em beta-1 sobre Capillarys, com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 100-235 s) : 6 partes aliquotas deste soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados com o anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico (anti-IgG, -IgA, -IgM, -kapa, -lambda) e com o meio destes anticorpos (sem 35 anticorpo; pista ELP). Por comparação com a pista ELP (a preto; figura 3) , observa-se nitidamente o desaparecimento do pico monoclonal em beta-1 para as partes alíquotas tratadas com os anti-IgG e anti-lambda. Nas outras pistas é observada unicamente a diminuição do fundo policlonal. Note-se igualmente a ausência de interferência dos imunocomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes das gamas é um marcador de injecção, para facilitar a sobreposição dos perfis, o Exemplo 4: imunotipificação de um soro contendo uma proteína monoclonal de tipo A kapa, migrando entre beta-1 e alfa-2 sobre Capillarys, com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 100-235 s) : 6 partes alíquotas deste soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados com o anidrido 1,2,4-benzeno-tricarboxílico (anti-IgG, -IgA, -IgM, -kapa, -lambda) e com o meio destes anticorpos (sem anticorpos; pista ELP). Por comparação com a pista ELP (a preto; figura 4), observa-se nitidamente o desaparecimento do pico monoclonal em beta-l/alfa-2 para as partes alíquotas tratadas com os anti-IgA e anti-kapa. Nas outras pistas é observada unicamente a diminuição do fundo policlonal. Note-se igualmente a ausência de interferência dos imunocomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes dos gamas é um marcador de injecção, para facilitar a sobreposição dos perfis, o Exemplo 5: imunotipificação de um soro contendo uma proteina monoclonal de tipo G lambda, migrando em gama sobre Capillarys, com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 100-235 s): 6 partes aliquotas deste soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados com o anidrido 1,2,4- 36 benzenotricarboxílico (anti-IgG, -IgA, -IgM, -kapa, -lambda) e com o meio destes anticorpos (sem anticorpo; pista ELP). Por comparação com a pista ELP (a preto; figura 5), observa-se nitidamente o desaparecimento do pico monoclonal em gama para as partes alíquotas tratadas com os anti-IgG e anti-lambda. Nas outras pistas é observada unicamente a diminuição do fundo policlonal. Note-se igualmente a ausência de interferência dos imunocomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. 0 pico que migra antes das gamas é um marcador de injecção, para facilitar a sobreposição dos perfis, o Exemplo 6: imunotipificação de um soro contendo uma proteina monoclonal de tipo A lambda, migrando entre beta-2 e beta-1 sobre Capillarys, com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 100-235 s) : 6 partes aliquotas deste soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados com o anidrido 1,2,4-benzeno-tricarboxílico (anti-IgG, -IgA, -IgM, -kapa, -lambda) e com o meio destes anticorpos (sem anticorpo; pista ELP). Por comparação com a pista ELP (a preto; figura 6), observa-se nitidamente o desaparecimento do pico monoclonal em beta-l/beta-2 para as partes aliquotas tratadas com os anti-IgA e anti-lambda. Nas outras pistas é observada unicamente a diminuição do fundo policlonal. Note-se igualmente a ausência de interferência dos imunocomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes das gamas é um marcador de injecção, para facilitar a sobreposição dos perfis, o Exemplo 7: imunotipificação de um soro contendo uma proteina monoclonal de tipo M kapa, migrando em gama sobre Capillarys, com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 100-235 s) : 6 partes aliquotas 37 deste soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados com o anidrido 1,2,4- benzenotricarboxílico (anti-IgG, -IgA, -IgM, -kapa, -lambda) e com o meio destes anticorpos (sem anticorpo; pista ELP). Por comparação com a pista ELP (a preto; figura 7), observa-se nitidamente o desaparecimento do pico monoclonal em gama para as partes aliquotas tratadas com os anti-IgM e anti-kapa. Nas outras pistas é observada unicamente a diminuição do fundo policlonal. Note-se igualmente a ausência de interferência dos imunocomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. 0 pico que migra antes das gamas é um marcador de injecção, para facilitar a sobreposição dos perfis, o Exemplo 8: imunotipificação de um soro contendo uma proteina monoclonal de tipo lambda livre, migrando em gama sobre Capillarys, com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 100-235 s): 6 partes aliquotas deste soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados com o anidrido 1,2,4- benzenotricarboxílico (anti-IgG, -IgA, -IgM, -kapa, -lambda, -kapa livre, -lambda livre) e com o meio destes anticorpos (sem anticorpo; pista ELP). Por comparação com a pista ELP (a preto; figura 8), observa-se nitidamente o desaparecimento do pico monoclonal em gama para as partes aliquotas tratadas com os anti-lambda e anti-lambda livre. Nas outras pistas é observada unicamente a diminuição do fundo policlonal. Note-se igualmente a ausência de interferência dos imunocomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes das gamas é um marcador de injecção, para facilitar a sobreposição dos perfis. 38 o Exemplo 9: comparação da imunotipificação obtida com um anticorpo IgG antihumano modificado com o anidrido 1,2,4-benzeno-rtricarboxílico ou com o ácido melitico/-EDCl sobre um soro que contém uma proteína monoclonal de tipo G kapa, migrando em gama sobre Capillarys, com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 100-235 s) : 3 partes alíquotas deste soro foram misturadas com 2 IgG anti-humanos modificados com o anidrido 1,2,4-benzeno-tricarboxílico e com o ácido melítico/EDCl e com o meio destes anticorpos (sem anticorpo; pista ELP) . Por comparação com a pista ELP (a preto; figura 9) , observa-se nitidamente o desaparecimento do pico monoclonal em gama para as partes alíquotas tratadas com os 2 anticorpos modificados. Note-se igualmente, nos dois casos, a ausência de interferência dos imunocomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes dos gamas é um marcador de injecção, para facilitar a sobreposição dos perfis. o Exemplo 10: imunotipificação em-capilar de um soro contendo uma proteína monoclonal de tipo G kapa, migrando em gama sobre Capillarys, com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 100-235 s) : o meio dos anticorpos (sem os anticorpos) e 5 anticorpos modificados com o anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico (anti-IgG, -IgA, -IgM, -kapa, -lambda) foram colocados numa primeira barra, 6 partes alíquotas deste soro foram diluídas no tampão Sebia Capillarys B1B2+ contendo o marcador de injecção (barra 2) . Foram injectados os anticorpos e mais as partes alíquotas do soro diluído e foram realizadas as 6 migrações. Por comparação com a pista ELP (a preto; figura 10), observa-se nitidamente o 39 desaparecimento do pico monoclonal em gama para as partes aliquotas tratadas com os anti-IgG e anti-kapa. Nas outras pistas é observada unicamente a diminuição do fundo policlonal. Note-se igualmente a ausência de interferência dos imunocomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. 0 pico que migra antes dos gamas é um marcador de injecção, para facilitar a sobreposição dos perfis, o Exemplo 11: utilização do anti-soro pentavalente (mistura de anticorpos anti-IgG, -IgA, -IgM, -kapa e -lambda modificados com o anidrido 1,2,4-benzeno-tricarboxilico) a fim de verificar a natureza Mc de um pico curvo em beta-1 num soro, por análise com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 100-235 s): 2 partes aliquotas deste soro foram misturadas com o anti-soro pentavalente e com o meio destes anticorpos (sem anticorpo; pista ELP). Por comparação com a pista ELP (a preto; figura 11) , observa-se nitidamente o desaparecimento do pico curvo em beta-1 na pista tratada com o anti-soro pentavalente, indicando a natureza Mc deste pico (proteína Mc de tipo M kapa). Note-se igualmente o desaparecimento do fundo policlonal, a ausência da fracção beta-2 para este soro, assim como a ausência de interferência dos imunocomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes das gamas é um marcador de injecção, para facilitar a sobreposição dos perfis, o Exemplo 12: imunotipificação de um soro contendo uma proteína Mc de tipo lambda livre, migrando em gama sobre Capillarys, com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 100-235 s) : 6 partes aliquotas deste soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados com o anidrido 1,2,4- 40 benzenotricarboxílico (anti-soro trivalente (mistura de anticorpos anti-IgG, -IgA, -IgM), anti-kapa, anti-lambda, anti-kapa livre, anti-lambda livre) e com o meio destes anticorpos (sem anticorpo; pista ELP) . Por comparação com a pista ELP (a preto; figura 12), observa-se nitidamente o desaparecimento do pico monoclonal, mas não do pico Mc na pista tratada com o anti-soro trivalente. Observa-se em paralelo o desaparecimento do pico Mc nas pistas anti-lambda e anti-lambda livre. Nas pistas anti-kapa e anti-kapa livre, é observada unicamente a diminuição do fundo policlonal. Note-se igualmente a ausência da fracção beta-2 para este soro, assim como a ausência de interferência dos imunocomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes das gamas é um marcador de injecção, para facilitar a sobreposição dos perfis, o Exemplo 13: imunotipificação de um soro contendo uma proteina Mc de tipo M kapa, migrando em gama sobre Capillarys, com o tampão Sebia Capillarys Protein(e) (janela de aquisição 110-275 s) : 6 partes aliquotas deste soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados com o anidrido 1,2,4- benzenotricarboxílico (anti-IgG, -IgA, -IgM, -kapa, -lambda) e com o meio destes anticorpos (sem anticorpo; pista ELP). Por comparação com a pista ELP (a preto; figura 13), observa-se nitidamente o desaparecimento do pico Mc em gama nas partes aliquotas tratadas com os anti-IgM e anti-kapa. Nas outras pistas é observada unicamente a diminuição do fundo policlonal. Note-se igualmente a ausência de interferência dos imunocomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que 41 41 para migra antes das gamas é um marcador de injecção, facilitar a sobreposição dos perfis.

Lisboa, 22 de Janeiro de 2009

Claims (28)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Processo para a análise electroforética capilar de uma amostra biológica, compreendendo a utilização de anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, de tal forma que estes migrem para uma zona situada fora da zona de migração das proteínas da amostra biológica quando são separadas por realização da electroforèse, tendo os referidos anticorpos uma especificidade antigénica para proteínas alvo monoclonais determinadas, e sendo obtidos por reacção com (i) o ácido melítico, na presença de EDC1 (cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodi-imida) ou (ii) um anidrido compreendendo pelo menos uma função ácido carboxílico.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, para a análise electroforética capilar de uma amostra biológica, compreendendo os passos seguintes: a) a separação dos constituintes de uma primeira parte alíquota da amostra biológica por electroforèse capilar, na presença de anticorpos modificados sobrecarregados negativamente que tenham uma especificidade antigénica determinada e susceptíveis de formar um complexo do tipo antigene-anticorpo com uma proteína monoclonal eventualmente presente na amostra biológica, e a detecção dos constituintes separados da amostra biológica; b) a comparação do perfil electroforético obtido no passo a) com um perfil electroforético dos constituintes de uma outra parte alíquota da mesma amostra separada por electroforèse capilar na ausência 2 dos referidos anticorpos modificados sobrecarregados negativamente de especificidade antigénica determinada.

3. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, no qual se utilizam anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, formando uma gama de anticorpos que possuem especificidades antigénicas diferentes, postos em contacto com uma mesma parte aliquota da amostra biológica, para realizar a separação por electroforèse capilar dos constituintes da amostra.

4. Processo de acordo com a reivindicação 3, no qual cada tipo de anticorpos da referida gama de anticorpos tem uma especificidade antigénica determinada para um isotipo de imunoglobulinas.

5. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 2 a 4, para a análise electroforética capilar de uma amostra biológica dividida em pelos menos duas partes aliquotas, compreendendo os passos seguintes, previamente à separação dos constituintes da amostra biológica por electroforèse 1) colocação em contacto de um meio contendo anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, que têm uma especificidade antigénica determinada, com uma parte aliquota da amostra biológica, em condições de incubação que permitam a reacção imunológica entre os referidos anticorpos e uma proteina alvo especificamente reconhecida pelos referidos anticorpos, quando ela se encontra presente na amostra biológica, e a colocação em contacto de uma outra parte aliquota da 3 amostra biológica com o meio acima referido, entretanto desprovido dos anticorpos modificados, 2) injecção no capilar de electroforèse das partes alíquotas da amostra biológica incubadas de acordo com o passo 1).

6. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2, para a análise electroforética capilar de uma amostra biológica, compreendendo os passos seguintes, previamente à separação dos constituintes da amostra biológica por electroforèse 1) injecção de um meio contendo anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, que têm uma especificidade antigénica determinada, no capilar de electroforèse, e injecção do referido meio, entretanto desprovido dos anticorpos modificados, num outro capilar de electroforèse; 2) injecção da amostra biológica nos capilares de electroforèse tratados de acordo com o passo 1) , em condições que permitam a reacção imunológica entre os anticorpos e a ou as proteínas alvo, quando esta ou estas está ou estão presentes na amostra biológica.

7. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 6, no qual a amostra biológica é dividida em pelos menos η + 1 partes alíquotas quando a gama de anticorpos modificados sobrecarregados negativamente compreende n tipos de anticorpos com especificidades diferentes determinadas.

8. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 7, caracterizado por os anticorpos serem escolhidos 4 entre os anticorpos anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-kapa e anti-lambda.

9. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 8, caracterizado por se utilizarem anticorpos anti-IgG, anticorpos anti-IgA, anticorpos anti-IgM, anticorpos anti-kapa, anticorpos anti-lambda, anticorpos anti-kapa livre e anticorpos anti-lambda livre.

10. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 9, no qual o anticorpo modificado sobrecarregado negativamente se encontra em excesso em relação à ou às proteínas monoclonais alvo que reconheçe quando esta ou estas está ou estão presentes na amostra biológica.

11. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 10, no qual os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente são o produto da reacção com o anidrido 1,2,4-benzeno-tricarboxílico.

12. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 11, no qual o anticorpo sobrecarregado negativamente é o produto da reacção do anticorpo com um anidrido que possui pelo menos uma função ácido carboxílico, compreendendo a referida reacção a dissolução extemporânea do anidrido em dimetilformamida (DMF) e a colo+cação em contacto do anidrido dissolvido com o anticorpo em solução, para permitir a reacção do anidrido e do anticorpo, sendo a referida reacção realizada a 37°C, em condições que permitam o enxerto de cargas negativas sobre o anticorpo.

13. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 12, no qual a electrof orèse capilar é realizada num 5 tampão alcalino, a um pH compreendido entre 9 e 11, contendo um composto tampão e pelo menos um aditivo susceptivel de aumentar a força iónica do tampão de análise.

14. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, no qual a amostra biológica é escolhida entre amostras de plasma, de urina ou de liquido céfalo-raquidiano.

15. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 13, no qual a amostra biológica é uma amostra de soro.

16. Processo para a pesquisa e a tipificação de proteínas monoclonais, ditas proteínas Mc, numa amostra biológica, compreendendo a análise electroforética capilar, de acordo com qualquer das reivindicações 1 a 15, de diferentes partes alíquotas da amostra biológica, sendo cada uma das partes alíquotas posta em contacto com anticorpos escolhidos, respectivamente, entre as imunoglobulinas anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-kapa, anti-lambda, anti-kapa livre e anti-lambda livre modificadas para serem sobrecarregadas negativamente.

17. Processo para a pesquisa e a tipificação de proteínas monoclonais (proteínas Mc) numa amostra biológica, no qual a presença de uma proteína Mc na amostra biológica é detectada por imuno-subtracção do pico correspondente à referida proteína Mc, no perfil electroforético das proteínas da amostra biológica, realizando-se a migração do complexo anticorpo modificado sobrecarregado negativamente-proteína Mc para fora do perfil electroforético das globulinas da amostra 6 biológica, sendo o referido anticorpo sobrecarregado negativamente obtido por reacção com (i) o ácido melitico, na presença de EDC1 (cloridrato de 1 - (3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodiimida) ou (ii) um anidrido compreendendo pelo menos uma função ácido carboxilico.

18. Processo para a preparação de anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, compreendendo os passos de: - dissolução extemporânea de um anidrido que possui pelo menos uma função ácido carboxilico, em dimetil-formamida (DMF), - colocação em contacto dos anticorpos com o anidrido dissolvido em condições que permitam a reacção do anidrido e do anticorpo, a fim de se obter um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente a pH alcalino.

19. Processo de acordo com a reivindicação 18, no qual o anidrido é o anidrido benzeno-tricarboxílico.

20. Processo de acordo com qualquer das reivindicações 18 ou 19, no qual o anidrido é extemporaneamente dissolvido em DMF pura.

21. Anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, caracterizados por serem enxertadas funções ácido nos anticorpos, de forma a conferir-lhes uma capacidade de migração electroforética para fora do perfil de migração das imunoglobulinas de tipo IgG, IgA, IgM, IgE e IgD, separadas nas mesmas condições de separação por electroforèse capilar, sendo as referidas funções ácido 7 enxertadas nos referidos anticorpos por reacção com (i) o ácido melítico, na presença de EDC1 (cloridrato de 1-(3-dimetilaminopropil)-3-etil-carbodi-imida) ou (ii) um anidrido compreendendo pelo menos uma função ácido carboxilico.

22. Anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, de acordo com a reivindicação 21, tal como são obtidos por realização de um processo de acordo com qualquer das reivindicações 18 a 20.

23. Anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, de acordo com qualquer das reivindicações 21 ou 22, escolhidos entre as imunoglobulinas anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-kapa, anti-lambda, anti-kapa livre e anti-lambda livre.

24. Anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, de acordo com qualquer das reivindicações 21 ou 22, misturadas sob a forma de um anti-soro pentavalente contendo os referidos anticorpos modificados sobrecarregados negativamente anti-IgG, anti-IgA, anti-IgM, anti-kapa e anti-lambda, ou sob a forma de um soro trivalente contendo os referidos anticorpos sobrecarregados negativamente anti-IgG, anti-IgA e anti-IgM.

25. Anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, de acordo com qualquer das reivindicações 21 a 24, caracterizados por se tratar de anticorpos policlonais.

26. Conjunto para a detecção e a tipificação de proteínas monoclonais numa amostra biológica, compreendendo anticorpos modificados sobrecarregados negativamente de 8 acordo com qualquer das reivindicações 21 a 25, e um diluente apropriado.

27. Utilização de anticorpos de acordo com qualquer das reivindicações 21 a 25, para a detecção por electroforèse capilar e imunodeslocamento de proteínas monoclonais presentes numa amostra biológica.

28. Utilização de anticorpos de acordo com qualquer das reivindicações 21 a 25, para a tipificação de proteínas monoclonais presentes numa amostra biológica. Lisboa, 22 de Janeiro de 2009