BRPI0406265B1 - método para análise por eletroforese capilar, método para pesquisa e tipagem de proteínas monoclonais, método de preparação de anticorpos modificados sobrecarregados negativamente e kit para detecção e tipagem de proteínas monoclonais - Google Patents

Abstract

"método para análise eletroforética capilar, métodos para pesquisa e tipagem de proteínas monoclonais, processo para preparação de anticorpos modificados, anticorpos modificados, kit para detecção e tipagem de proteínas monoclonais e uso de anticorpos". a presente invenção trata de um método para a análise eletroforética capilar de uma amostra biológica que compreende a utilização de anticorpos modificados carregados negativamente de modo tal que eles migrem para uma zona situada fora da zona de migração das proteínas da amostra biológica quando são separadas durante a eletroforese, sendo que os referidos anticorpos possuem uma especificidade antigênica para uma proteína alvo determinada.

Description

“MÉTODO PARA ANÁLISE POR ELETROFORESE CAPILAR, MÉTODO PARA PESQUISA E TIPAGEM DE PROTEÍNAS MONOCLONAIS, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS MODIFICADOS SOBRECARREGADOS NEGATIVAMENTE, KIT PARA DETECÇÃO E TIPAGEM DE PROTEÍNAS MONOCLONAIS E USOS DE ANTICORPOS” Campo da Invenção [001] A presente invenção trata do campo de análise de amostras biológicas por eletroforese capilar e imunodeslaea mento (“ immunodispíacement ’).

[002] A presente invenção se refere, especialmente, a um método de análise de amostras biológicas por eletroforese capilar, na qual a separação eletroforética dos constituintes da amostra é acompanhada de um tratamento da amostra por uma técnica imunológica. De acordo com a presente invenção, o termo imunosubtração'’ designa a supressão do pico de certas proteínas no perfil eletroforético, por ímunodeslocamento desse pico protéico para outra posição do perfiL

[003] A presente invenção se refere, em particular, a um método aplicável em protocolos de diagnósticos, e trata particularmente da pesquisa e da típagem, em amostras biológicas, de proteínas de controle de distúrbios monoclonais, também chamadas gamapatias monoclonais ou paraproteinemias.

Antecedentes da Invehcão [004] O desenvolvimento normal dos linfócites B leva à produção, na superfície dos linfócítos B maturos, de imunoglobulinas de isotípos M e G, que possuem inicial mente idiotipos comuns. Os distúrbios plasmocitários que são a causa das doenças monoclonais resultam de um defeito de controle do processo de maturação celular em direção das células se ereto ras de anticorpos após exposição a um antígeno específico da ímunoglobuiina de superfície.

Nessa situação, imunoglobulinas que possuem uma afinidade com um antígeno ao qual o hospedeiro foi exposto, continuam a ser secretadas após o desaparecimento do antígeno. De modo geral, as imunoglobulinas de uma espécie dada estão distribuídas em diferentes classes de anticorpos, sendo que cada classe é identificada por meio de um isotipo, e os diferentes isotipos identificados dentro de uma espécie são comuns a todos os indivíduos normais dessa espécie. As imunoglobulinas são geralmente formadas por cadeias pesadas (2 cadeias pesadas) e por cadeias leves (2 cadeias leves). Com base nessa estrutura de quatro cadeias, foram identificados cinco isotipos de cadeias pesadas (isotipos M, G, A, D, E) e dois isotipos de cadeias leves (isotipos kappa e lambda). Além de seu isotipo, as imunoglobulinas se caracterizam por determinantes que correspondem às diferenças entre os indivíduos de uma mesma espécie, chamados alotipos bem como por seu idiotipo que corresponde a uma parte da molécula de imunoglobulina que liga o antígeno. Portanto, o idiotipo é característico das moléculas produzidas por um determinado clone de células produtoras de anticorpos.

[005] As doenças plasmocitárias caracterizam-se, portanto, pela alteração da produção de certas imunoglobulinas ou de certas cadeias de imunoglobulinas, e a detecção e caracterização dessa alteração tem um interesse clínico evidente.

[006] A análise de uma amostra biológica por eletroforese permite a identificação das proteínas séricas e a determinação da quantidade dessas proteínas, em particular das imunoglobulinas. Em um campo elétrico, as proteínas migram em função de seu tamanho e de sua carga, formando um perfil de eletroforese que compreende uma série de picos (também chamados frações), e cada um deles corresponde a uma ou mais proteínas. A fração denominada gama é formada em particular por imunoglobulinas, principalmente de tipo G. Em pacientes que sofrem de doenças plasmocitárias que levam à secreção de proteínas monoclonais (também denominadas proteínas Mc), a quantidade de imunoglobulinas que corresponde a um dos isotipos conhecidos pode ser aumentada de modo significativo em relação à média, conduzindo a uma modificação do perfil eletroforético pela modificação de um ou mais picos das proteínas separadas de uma amostra de soro.

[007] A detecção das proteínas monoclonais, em particular a detecção de um aumento da produção de um isotipo particular de imunoglobulina apresenta, portanto, um interesse evidente para a pesquisa de doenças plasmocitárias, e também para o acompanhamento de doentes que sofrem de paraproteinemias. Observou-se, por exemplo, que a quantidade de uma proteína Mc sérica pode, dependendo dos casos e em particular quando há um desenvolvimento tumoral, estar diretamente ligada à progressão da doença. Assim, uma proteína Mc pode constituir um marcador tumoral que, quando está correlacionado com outros sintomas, pode ser levado em conta na elaboração de um diagnóstico.

[008] As doenças plasmocitárias não são as únicas que estão relacionadas com a produção anormal de proteínas Mc; entre os distúrbios patológicos associados com a produção anormal de proteínas Mc, deve-se citar os neoplasmas linfóides tais como a leucemia linfóide crônica ou os linfomas de origem linfocitária B ou T, certas proliferações não linfóides tais como a leucemia mielóide crônica, os cânceres de seio ou de colo.

[009] Proteínas Mc monoclonais podem também ser produzidas em certas patologias não malignas tais como a cirrose, a sarcoidose, parasitoses ou a doença de Gaucher. Foi detectada ainda a produção de proteínas monoclonais em doenças autoimunes, tais como a poliartrite reumatóide, a mioastenia ou a doença da aglutinina a frio.

[010] A eletroforese com gel de agarose e a eletroforese capilar constituem, portanto, os métodos escolhidos de diagnóstico ou de acompanhamento de pacientes, devido ao fato de permitirem detectar a presença de proteínas monoclonais em amostras biológicas e acompanhar ao longo do tempo a evolução das proteínas monoclonais detectadas.

[011] De acordo com as patologias envolvidas, a proteína Mc é de natureza diferente, constituída por uma molécula de anticorpo intacta ou por um fragmento de anticorpo. Assim, cadeias pesadas ou cadeias leves podem ser produzidas sozinhas. É o caso, por exemplo, das proteínas de Bence Jones, secretadas na urina dos pacientes portadores de mielomas e que se apresentam apenas em forma de cadeias leves.

[012] Os isotipos que são determinados para as imunoglobulinas permitem tipificar as proteínas Mc, em função da natureza de sua cadeia pesada e/ou em função da natureza de sua cadeia leve. A técnica utilizada para a tipagem das imunoglobulinas permitirá assim determinar o tipo de cadeias pesadas e/ou leves associadas de cada proteína monoclonal presente em uma amostra biológica.

[013] Além da detecção da presença dessas proteínas Mc, mostrou-se portanto importante tipificá-las, para permitir caracterizar a patologia que está associada a elas. Para isso, já foram propostas diversas abordagens, tais como a cromatografia em coluna, a eletroforese com gel de agarose ou ainda a eletroforese capilar. Em métodos que utilizam a eletroforese com gel de agarose, as proteínas da amostra biológica são separadas por eletroforese sob a forma de um perfil de eletroforese no qual as proteínas, e em particular as globulinas, são reveladas sob a forma de picos ou bandas suscetíveis de incluir uma proteína monoclonal, cuja natureza deve ser confirmada a seguir, por exemplo, pela técnica de imunofixação com gel de agarose. Essa técnica combina duas etapas utilizando uma eletroforese com gel de agarose seguida de imunoprecipitação. Várias aliquotas de uma mesma amostra biológica são depositadas paralelamente sobre um gel de agarose e a aplicação de um campo elétrico feita a seguir permite a separação das proteínas, e em particular das imunoglobulinas. Cada via é depois incubada com um tipo de anticorpo específico dos tipos de imunoglobulinas pesquisadas (IgG, IgA, IgM, kappa e lambda, e eventualmente kappa livre, lamba livre, IgD e IgE) que conduzem à formação de imuncomplexos entre as imunoglobulinas da amostra e os anticorpos. Após uma lavagem do gel que permite eliminar as proteínas que não precipitaram, uma etapa de coloração permite revelar a posição dos imuncomplexos: em caso de ausência de proteínas monoclonais, apenas um fundo colorido difuso aparece (correspondente à multiplicidade de anticorpos monoclonais que constituem o “fundo policlonal”); em caso de presença de proteínas monoclonais, bandas coloridas são reveladas em regiões específicas do gel. Utilizando uma via de referência (sem anti-soro), pode-se assim tipificar cada banda monoclonal visível no gel.

[014] Uma técnica de tipagem utilizada em eletroforese capilar é a imunosubtração tal como descrita na patente US 5,228,960. Essa técnica consiste em incubar alíquotas de uma amostra biológica com anticorpos específicos capazes de subtrair um determinado constituinte (por exemplo, imunoglobulinas) da referida amostra. Esse constituinte é adsorvido na fase sólida na qual o anticorpo foi fixado: ele não está portanto mais presente na amostra analisada por eletroforese capilar. As diferentes alíquotas tratadas das quais foram subtraídas certas imunoglobulinas de acordo com a especificidade dos anticorpos utilizados são então injetadas dentro do capilar, e a seguir as proteínas contidas nas alíquotas são separadas por aplicação de um campo elétrico aos terminais do capilar. Os perfis obtidos são comparados a um perfil de uma alíquota não tratada.

[015] Outras técnicas de identificação das proteínas monoclonais separadas por eletroforese capilar a partir de uma amostra foram propostas, por exemplo, na patente EP 0 690 988 (B1). A patente européia em questão descreve a associação com a separação eletroforétíca capilar, de uma elapa de imunosubtração, com a finalidade de facilitar a classificação das proteínas Mc. De acordo com essa patente, a imunosubtração é realizada “no capilar” (“on-capillary ), de acordo com um método que compreende uma etapa de separação eletroforétíca de uma primeira parte da amostra em seus diferentes constituintes, e a detecção desses constituintes, seguida da mistura de uma segunda parte da amostra com pelo menos um parceiro capaz de ligar especificamente um analito pré-determinado contido na amostra, ficando claro que o parceiro específico para essa ligação possui uma mobilidade eletroforétíca diferente do referido analito. A segunda parte da amostra é separada a seguir em seus diferentes constituintes por eietroforese capilar e os constituintes são detectados. Uma etapa de comparação dos constituintes separados é realizada a seguir com os constituintes separados sem a presença dos parceiros específicos que ligam um analito pesquisado, [016] A patente européia EP 0 690 988 especifica que o parceiro destinado a ligar os analitos é uma molécula modificada, em particular um anticorpo antiproteína Mc, que sofreu uma modificação química de modo que seu tempo de migração em eietroforese capilar o conduza para fora da região gama do perfil eletroforético. Uma modificação química proposta dos anticorpos é aquela que consiste em fazê-os reagir com o anidrido succínico para conferir-lhes funções carboxíiícas adicionais, negativas a pH alcalino. Nas condições de analitos descritos (pH 10), a carga negativa global dos anticorpos fica portanto aumentada.

[017] As condições descritas para realizar a modificação dos anticorpos, de acordo com a patente européia EP 0 690 988, bem como os resultados experimentais relatados, que se referem unicamente à análise e à separação de ímunogiobulínas G purificadas e nâo à análise de um soro, que permitem duvidar da propriedade do método proposto com a finalidade de pesquisar proteínas monoclonais em uma amostra biológica “real”, por exemplo, em um soro.

Descrição Resumida da Invenção [018] A presente invenção propõe, portanto, um método alternativo aplicável efícazmente em uma amostra biológica, que associa a realização de uma eletroforese capilar para a separação dos constituintes de uma amostra biológica e a imunosubt ração para permitir a ti pagem das proteínas Mc eventualmente presentes na amostra biológica analisada.

[019] Uma das vantagens do método da presente invenção é permitir um deslocamento, fora da zona que corresponde ao perfil de migração das proteínas da amostra, em particular fora da zona de migração das globulínas, do pico de eletroforese que corresponde à proteína Mc quando ela está presente em uma amostra biológica e é separada por eletroforese capilar. Esse deslocamento subtrai o pico que representa a proteína Mc separada, de sua posição esperada na saída da etapa de migração sem interferir com a separação das outras proteínas da amostra. Ao contrário do método descrito na patente US 5,228,960, a proteína monoclonal reconhecida pelo anticorpo está presente na amostra injetada para realizar a eletroforese capilar. Ela é simplesmente subtraída do perfil porque é deslocada de sua posição inicial. Consequentemente, este método permite uma leitura confiável dos resultados da análise, dissipando qualquer eventual confusão entre picos vizinhos que correspondem às proteínas separadas da amostra.

[020] A presente invenção trata ainda dos anticorpos modificados quimicamente para conferir funções químicas, adicionais, negativas, a pH alcalino (tais como funções carboxílicas), por reação de certas funções químicas do anticorpo com o agente modificador: cada uma das funções químicas modificadas confere assim uma ou mais cargas negativas adicionais ao anticorpo. Esses anticorpos são depois utilizados para a imunosubtração/imunodeslocamento específico dos picos que correspondem a proteínas Mc de uma amostra biológica.

[021 ] Os anticorpos assim preparados de acordo com a presente invenção apresentam, em relação aos anticorpos de partida já carregados negativamente quando possui um pH alcalino, um suplemento de cargas negativas quando eles possuem um pH negativo, devido à aquisição de funções tais como funções ácido carboxílico adicionais. Esses anticorpos sâo designados a seguir pela expressão “anticorpos modificados sobrecarregados negativamente” ou também pelos termos “anticorpos modificados”.

[022] A presente invenção tem ainda por objeto kits para a realização de uma separação das proteínas de uma amostra biológica por eletroforese capilar e a detecção por imunosubtração a fim de identificá-las e, se for o caso, de quantificã-las, a partir das proteínas monoclonais suscetíveis de estarem contidas na amostra biológica testada.

[023] A presente invenção trata também de um método de preparação de anticorpos modificados quimicamente para inserir neles cargas negativas adicionais a pH alcalino (anticorpos modificados sobrecarregados negativamente) sob condições que permitem seu uso em uma imunosubtração.

Descrição Detalhada da Invenção [024] A presente invenção trata, portanto, de um método para a análise eletroforética capilar de uma amostra biológica, que compreende a utilização de anticorpos sobrecarregados negativamente de modo que eles migrem para uma zona situada fora da zona de migração das proteínas da amostra biológica quando elas sâo separadas na eletroforese, sendo que os referidos anticorpos possuem uma especificidade antigênica para uma proteína monoclonal pre determinada.

[025] Durante a separação das proteínas de uma amostra biológica, em um capilar cheio com um eletrólito, as proteínas migram sob o efeito de um campo elétrico: as proteínas são assim arrastadas em uma migração do ânodo para o cátodo. A diferença entre o seu próprio fluxo eletroforético (ligado à carga da proteína) e fluxo eletroosmótico (ligado à carga da superfície interna do capilar) permite a separação das proteínas a serem detectadas.

[026] As proteínas de uma amostra injetada dentro do capilar definem, portanto, um perfil de migração eletroforética que pode ser dividida em várias zonas, ilustradas nas figuras do presente pedido, e que correspondem às zonas gama (a mais próxima do cátodo), beta-2, beta-1, alfa-2, alfa-1 e albumina (sendo que esta última zona é a mais próxima do ânodo). As imunoglobulinas contidas em uma amostra biológica migram da zona alfa-1 para a zona gama, inclusive as proteínas Mc.

[027] Com a finalidade de permitir em particular a separação eletroforética das proteínas monoclonais contidas em uma amostra biológica bem como sua tipagem confiável, por meio de uma reação de imunosubtração, os inventores desenvolveram condições de realização da imunosubtração que permitem a subtração do pico que corresponde a uma proteína monoclonal, do perfil de migração das proteínas da amostra (e em particular do perfil de migração das globulinas) e seu deslocamento para fora da região compreendida entre zona gama e a zona alfa-1.

[028] Mais precisamente, a proteína monoclonal pesquisada na amostra não é subtraída do meio analisado, mas deslocada sob o efeito de sua ligação com um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente que a reconhece especificamente, sob condições tais que o complexo formado entre a referida proteína monoclonal e o referido anticorpo modificado é deslocado para fora do perfil de migração das globulinas da amostra (As globulinas correspondem às frações eletroforéticas gama, beta-2, beta-1, alfa-2 e alfa-1 no perfil eletroforético).

[029] Mais precisamente ainda, o complexo proteína Mc-anticorpo carregado negativamente a pH alcalino encontra-se, após a etapa de migração eletroforética, na zona mais anódica do perfil das proteínas separadas.

[030] O complexo anticorpo modificado-proteína Mc é portanto visível fora do perfil assim definido pelas imunoglobulinas separadas, em particular está afastado desde a zona gama em direção à albumina, sendo eventualmente visível nas proximidades da albumina e de alfa-1, sem que isso perturbe a eventual detecção de uma proteína monoclonal anódica (ou seja, que migra em alfa-Valfa-2), uma vez que o complexo possui uma mobilidade intermediária entre a da proteína monoclonal e a do anticorpo modificado.

[031] O anticorpo modificado é em princípio aportado em excesso para a reação e a fração de anticorpos que não reagiu é visível em direção ao ânodo para além do pico que corresponde à albumina (ou seja, de migração mais anódica que a albumina).

[032] Um primeiro método, de acordo com a presente invenção para a análise eletroforética capilar de uma amostra biológica e a imunosubtração, compreende as seguintes etapas: (a) separação dos constituintes de uma primeira porção da alíquota da amostra biológica por eletroforese capilar, em presença de anticorpos modificados sobrecarregados negativamente que possuem uma especificidade antigênica determinada e que podem formar um complexo de tipo antígeno-anticorpo com uma proteína monoclonal eventualmente presente na amostra biológica e detecção dos constituintes separados da amostra biológica; (b) comparação do perfil eletroforético obtido na etapa (a) com um perfil eletroforético dos constituintes de uma porção da alíquota da mesma amostra separada por eletroforese capilar na ausência dos referidos anticorpos modificados sobrecarregados negativamente de especificidade antigênica determinada.

[033] Deve-se observar que as amostras biológicas compreendem normalmente uma fração de imunoglobulinas policlonais que constituem um “fundo policlonal” situado na região gama (ou próxima desta última) do perfil eletroforético. Essas imunoglobulinas policlonais aparecem na forma de um pico mais largo que o das imunoglobulinas Mc (pois contêm um grande número de imunoglobulinas de mobilidades muito próximas), sob condições de realização de uma eletroforese capilar que são apropriadas para a separação de proteínas Mc; esse fundo policlonal pode ser diminuído durante a colocação em contato da amostra com os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, de acordo com o tipo de constituintes da imunoglobulina (G, A, M, kappa ou lambda). A distinção entre o pico monoclonal e o fundo policlonal é feito neste caso identificando-se o pico Mc focalizado para detectar em relação ao pico largo policlonal.

[034] Em um modo de realização preferido da presente invenção, realiza-se paralelamente a colocação em contato das porções de alíquota de uma amostra biológica dada com diferentes anticorpos, que formam uma série de anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, sendo que cada tipo de anticorpos dessa série possui uma especificidade antigênica pré-determinada para um isotipo de imunoglobulinas.

[035] Assim, pode-se realizar paralelamente a análise de uma mesma amostra biológica com os referidos anticorpos modificados de especificidade diferente, sendo que a especificidade antigênica desses anticorpos é selecionada em função das proteínas monoclonais pesquisadas que sejam reconhecidas por esses anticorpos e em função do número de capilares em paralelo no aparelho de eletroforese.

[036] De acordo com um modo de realização particular da presente invenção, em um dos métodos descritos acima, a amostra biológica é dividida em pelo menos duas porções de alíquota o método compreende as etapas descritas a seguir, prévias à separação dos constituintes da amostra biológica por eletroforese: (1) colocação em contato de um meio que contém anticorpos modificados sobrecarregados negativamente com uma especificidade antigênica determinada com uma porção da alíquota da amostra biológica, sob condições de incubação que permitem a reação imunológica entre os referidos anticorpos e uma proteína alvo especificamente reconhecida pelos referidos anticorpos, quando ela está presente na amostra biológica, e colocação em contato de outra porção da alíquota da amostra biológica com o referido meio que é, porém, desprovido de anticorpos modificados. (2) injeção, dentro do capilar de eletroforese, das porções de alíquota da amostra biológica incubadas de acordo com a etapa (1).

[037] Em outro modo de realização particular da presente invenção, o método de análise eletroforética capilar compreende as etapas descritas a seguir, prévias à separação dos constituintes da amostra biológica por eletroforese: (1) injeção de um meio, que contém anticorpos modificados sobrecarregados negativamente que possuem uma especificidade antigênica determinada, dentro do capilar de eletroforese, e injeção do referido meio que é, no entanto, desprovido dos referidos anticorpos modificados dentro de outro capilar de eletroforese. (2) injeção da amostra biológica dentro do capilar de eletroforese tratado de acordo com a etapa (1), sob condições que permitem a realização imunológica entre os anticorpos e a(s) proteína(s) alvo quando ela(s) está(ão) presente(s) na amostra biológica.

[038] Para a análise de uma amostra biológica, quando os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente compreenderem n tipos de anticorpos de especificidade diferente pré-determinada, a amostra biológica será separada em pelo menos n + 1 porções de alíquota.

[039] Os anticorpos utilizados para preparar os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente são imunoglobulinas selecionadas a partir dos anticorpos anti-lgG, anti-lgA, anti-lgM, anti-lgE, anti-IgD, ar\t\-kappa, anti-lambda, anti-kappa livres e anti-lambda livres.

[040] De modo preferido, os anticorpos são selecionados a partir dos anticorpos anti-lgG, anti-lgA, anti-lgM, anti-kappa e anti-lambda. De acordo com um modo de realização particular da presente invenção, utiliza-se uma série de anticorpos que compreende esses 5 anticorpos. De acordo com outro modo de realização da presente invenção, utiliza-se uma mistura da totalidade ou de parte desses anticorpos, por exemplo, uma mistura de 5 anticorpos (anti-soro pentavalente) ou uma mistura de 3 anticorpos (anti-soro trivalente), por exemplo, contendo anticorpos anti-cadeias pesadas IgG, IgA, IgM.

[041] Pode-se assim limitar a realização do método da presente invenção ao uso de apenas alguns dos anticorpos acima identificados.

[042] Para obter anticorpos sobrecarregados negativamente úteis de acordo com a presente invenção, realizam-se uma reação dos anticorpos, que possuem uma especificidade antigênica selecionada, com um composto que confere cargas adicionais negativas a pH alcalino, por exemplo, um anidrido carregado negativamente. Faz-se, por exemplo, com que funções aminas dos anticorpos reajam com um anidrido, daí a formação de uma função ácido carboxílico adicional no anticorpo (e portanto de uma carga negativa adicional a pH alcalino) para cada função amina modificada.

[043] Para a produção desses anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, o anidrido utilizado é vantajosamente um anidrido benzenotricarboxílico. Esse anidrido confere duas funções ácido carboxílico (e portanto duas cargas negativas adicionais a pH alcalino) para cada função amina modificada: uma primeira função graças à reação do anidrido com a função amina; uma segunda função devido a sua estrutura. O anidrido de acordo com a presente invenção será assim chamado anidrido carregado negativamente, uma vez que ele é portador de pelo menos uma função ácido carboxílico carregada negativamente a pH alcalino.

[044] Pode-se obter um anticorpo suficientemente modificado, e portanto suficientemente carregado negativamente a pH alcalino efetuando a reação do anticorpo com o anidrido carregado negativamente, por dissolução extemporânea do anidrido, em particular do anidrido benzenotricarboxílico, em dimetilformamida (DMF) e a colocação em contato do anidrido dissolvido com o anticorpo em solução para permitir a inserção de cargas negativas ao anticorpo, sendo que a referido reação é efetuada a 37°C sob condições que permitem a inserção de funções ácido carboxílico no anticorpo.

[045] A eficácia da inserção do anidrido no anticorpo será tanto maior quanto a solução de anidrido na DMF for colocada no último momento em contato com o anticorpo para obter anticorpos com funções ácido carboxílico adicionais (e portanto cargas negativas adicionais a pH alcalino) e de modo a prevenir a alteração do anidrido com a água contida na solução de anticorpo.

[046] Um método de preparação dos anticorpos modificados será descrito mais detalhadamente na continuação do presente pedido.

[047] Para conferir funções ácido carboxílico adicionais (e portanto cargas negativas adicionais a pH alcalino) ao anticorpo, pode-se como variante utilizar um ácido carboxílico (que confira cargas negativas a pH alcalino) ao qual é associado um agente de acoplamento, por exemplo, o EDCI (1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida hidrocloreto). Será possível, por exemplo, utilizar o ácido melítico que reage com as funções aminas dos anticorpos em presença do EDCI.

[048] Os anticorpos modificados utilizados no método de análise eletroforético capilar da presente invenção estão normalmente em excesso em relação à proteína alvo que eles reconhecem quando ela está presente na amostra biológica.

[049] Esse excesso permite não apenas um desaparecimento total da proteína Mc alvo do perfil protéico, mas também uma posição ótima do complexo anticorpo modificado-proteína Mc no perfil: uma relação muito pequena entre os anticorpos modificados com uma especificidade antigênica pré-determinada e as proteínas alvo da amostra, reconhecidas por esse anticorpo não permitiría uma subtração total do pico Mc e daria uma migração mais catódica do complexo do que quanto essa relação for mais elevada.

[050] Em um modo de realização particular da presente invenção, a concentração de anticorpos carregados negativamente de cada especificidade utilizada para a imunosubtração é de cerca de 10 g/l.

[051] A presente invenção tem também por objeto anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, que são o produto da reação de anticorpo com um anidrido que confere pelo menos 2 funções ácido carboxílico, de preferência o anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico.

[052] Os anticorpos utilizados no método de análise por eletroforese capilar e imunosubtração são assim vantajosamente o produto da reação do anticorpo com um anidrido carregado negativamente, sendo que a referida reação compreende a dissolução extemporânea do anidrido em dimetilformamida (DMF) e a colocação em contato do anidrido dissolvido com o anticorpo em solução para permitir a reação do anidrido e do anticorpo, reação essa que é efetuada a 37°C sob condições que permitem a inserção de funções químicas adicionais no anticorpo, em particular das funções ácidos carboxílicos, negativas a pH alcalino.

[053] O método de análise de amostras biológicas pode ser utilizado com diferentes tipos de amostras biológicas, tais como amostras de soro, de plasma, de urina ou de líquido cefalorraquidiano.

[054] De acordo com a natureza da amostra biológica utilizada e/ou de sua origem (ou seja, de acordo com o prontuário médico do paciente), a interpretação dos resultados provenientes da separação eletroforética deve eventualmente levar em conta interferências que podem ocorrer entre os anticorpos sobrecarregados negativamente e as proteínas da amostra. Essas interferências são perceptíveis e analisáveis pelo técnico no assunto e foram observadas nas amostras que contêm fibrinogênio, ou seja, as amostras de plasma ou os soros de certos pacientes tratados com compostos anticoagulantes. Os inventores observaram que o fibrinogênio pode reagir por uma reação não específica (ou seja, uma reação que não é do tipo antígeno-anticorpo) com os anticorpos sobrecarregados negativamente da presente invenção. Nesse caso, quando o fibrinogênio estiver presente, o que se traduz em um perfil eletroforético pela presença de um pico entre as zonas β e γ, esse pico é eliminado de sua zona normal de migração depois que a amostra tiver sido tratada com os anticorpos sobrecarregados negativamente da presente invenção, supressão essa que se manifesta qualquer que seja a especificidade dos anticorpos sobrecarregados negativamente colocados em contato. Em outras palavras, o pico que marca a presença de fibrinogênio na amostra é revelado unicamente no perfil eletroforético de controle (ELP) e desaparece do perfil das proteínas submetidas às reações imunológicas com os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente (por imunodeslocamento para uma zona fora desse perfil).

[055] As condições de realização da eletroforese capilar no modo líquido são condições habitualmente utilizadas pelo técnico no assunto para as etapas de injeção da amostra no tubo capilar, de separação dos constituintes da amostra por migração eletroforética sob o efeito de uma corrente de eletroendosmose. Essas etapas compreendem em particular o uso de tampões de eletroforese tais como os descritos nos pedidos de patentes WO 02/057736 e WO 02/557737, ficando entendido que os tampões de eletroforese são selecionados para permitir a separação de proteínas Mc na forma de picos. Condições de realização de uma eletroforese capilar são, por exemplo, as condições apropriadas para utilizar a máquina automatizada Capillarys (Sebia), inclusive os tampões vendidos com o nome de Sebia Capillarys Β1 B2+ e Capillarys Protein(e) 6 e Capillarys Protein(e) 5.

[056] Por exemplo, o tampão de análise utilizado na migração eletroforética é vantajosamente um tampão alcalino, cujo pH está compreendido no intervalo 9 a 11, de preferência em torno de 10, compreendendo em particular um composto tampão e pelo menos um aditivo suscetível de aumentar a força iônica do tampão de análise.

[057] O método de análise eletroforético capilar descrito acima permite, sob o efeito da modificação química da mobilidade dos anticorpos utilizados para realizar a etapa de imunosubtração, corrigir as conseqüências que possam resultar da co-migração das proteínas monoclonais com os constituintes protéicos da amostra durante a etapa de separação eletroforética. Assim, o método da presente invenção permite evitar as interferências entre as proteínas monoclonais reconhecidas pelos anticorpos modificados sobrecarregados negativamente e as outras proteínas que constituem a amostra biológica. Essa vantagem essencial para a detecção confiável das proteínas monoclonais de uma amostra biológica resulta em particular do fato dos complexos proteína Mc-anticorpo modificado migram depois das globulinas e permitem portanto a tipagem da proteína Mc reconhecida pelo anticorpo modificado sobrecarregado negativamente qualquer que seja a posição da proteína monoclonal durante a migração eletroforética.

[058] Além disso, a imunosubtração do pico que corresponde ao complexo proteína Mc-anticorpo carregado negativamente é total no sentido do pico que correspondería à proteína monoclonal não ser mais detectável na zona que corresponde ao perfil de migração das globulinas da amostra biológica.

[059] Conseqüentemente, o método da presente invenção é vantajosamente aplicável à detecção e à tipagem de todos os tipos de imunoglobulinas monoclonais IgG, IgA, IgM, IgD, IgE e cadeias livres qualquer que seja sua mobilidade pelo fato das zonas gamas, betas e alfas do perfil de migração não terem interferência com a zona de migração do anticorpo modificado sobrecarregado negativamente e do complexo que ele forma com as proteínas Mc quando elas estão presentes na amostra biológica.

[060] O método, de acordo com a presente invenção, é portanto aplicável para a análise eletroforética capilar de proteínas monoclonais em uma amostra biológica.

[061] Para a detecção e a tipagem de proteínas monoclonais em uma amostra biológica, efetuam-se vantajosamente várias análises capilares em paralelo, sendo que a amostra biológica é dividida em diferentes porções de alíquota, e pelo menos em um número de porções de alíquota igual ou superior ao número de tipos de imunoglobulinas utilizadas para a pesquisa das proteínas Mc.

[062] Para a realização da tipagem das proteínas Mc em uma amostra biológica, serão realizadas normalmente pelo menos 6 análises capilares paralelas.

[063] Vantajosamente, os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente são imunoglobulinas cuja especificidade antigênica é selecionada a partir das imunoglobulinas anti-lgG, anti-lgA, anti-IgM, anti-kappa e anti-lambda e/ou ar\t\-kappa livres e/ou anti-lambda livres.

[064] Pode-se acrescentar a essa lista as imunoglobulinas anti-IgD, e/ou anti-lgE.

[065] Além do fato da proteína Mc eventualmente presente na amostra biológica poder ser tipificada pelo método da presente invenção, a referida proteína Mc, quando estiver presente, pode ser quantificada. Para isso, determina-se a superfície do pico que corresponde à proteína Mc que foi subtraída do perfil.

[066] O método da presente invenção pode também ser utilizado para identificar outras proteínas (além das imunoglobulinas) visíveis no perfil eletroforético; pode-se, por exemplo, utilizar anticorpos modificados de especificidade anti-human-haptoglobina, -alfa 1 antitripsina, -complemento C3, -complemento C4, -transferrina, -RBP, p2-microglobulina, -a1-microglobulina ou anticorpos de outras especificidades. Graças a esses anticorpos, seria assim possível identificar as proteínas que constituem uma fração do perfil eletroforético, ou então localizar um fenótipo particular dessas proteínas com uma mobilidade diferente da média.

[067] As condições de realização da presente invenção descritas no presente pedido, a fim de detectar proteínas diferentes das imunoglobulinas aplicam-se por analogia.

[068] A presente invenção tem também por objeto um processo para a preparação de anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, que compreende as etapas de: - dissolução extemporânea de um anidrido que compreende pelo menos uma função ácido carboxílico em dimetilformamida (DMF), - colocação em contato dos anticorpos com o anidrido dissolvido sob condições que permitam a reação do anidrido com o anticorpo a fim de obter um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente a um pH alcalino.

[069] O anidrido selecionado para conferir cargas adicionais negativas a pH alcalino ao anticorpo é um anidrido que possui pelo menos uma função ácido carboxílico.

[070] O anidrido selecionado para conferir cargas adicionais negativas a pH alcalino ao anticorpo é de preferência o anidrido benzenotricarboxílico.

[071] A preparação dos anticorpos modificados sobrecarregados negativamente está descrita detalhadamente na parte experimental.

[072] Deve-se ressaltar que para serem eficazes em relação ao fornecimento de cargas negativas, as etapas descritas acima compreendem vantajosamente a dissolução do anidrido em dimetilformamida pura, seguida da mistura dessa solução de anidrido no momento que são inseridas com o anticorpo, ou seja, tardiamente.

[073] A observação dessas condições permite evitar uma destruição do anidrido pela água contida na solução de anticorpo, pois a referida destruição alteraria a eficácia da preparação dos anticorpos carregados diminuindo a inserção de cargas negativas a pH alcalino.

[074] De modo preferido, a reação entre o anidrido e o anticorpo, em particular entre o anidrido benzenotricarboxílico e o anticorpo é efetuada a uma temperatura de 37°C, ou a uma temperatura apropriada que permita aumentar o número de moléculas de anidridos inseridas no anticorpo, por exemplo, por um tempo de cerca de uma hora.

[075] Antes de ser colocado em contato com o anidrido, o anti-soro a ser inserido é vantajosamente dialisado contra uma solução de tampão PBS ou de tampão fosfato. Além disso, quando o anticorpo é colocado em contato com a solução de anidrido na DMF, adiciona-se de preferência soda, o que permite tamponar melhor as funções ácido carboxílico do anidrido benzenotricarboxílico já presentes bem como as que se formam à medida que ocorre a reação do anidrido com o anticorpo (de modo que o meio reacional conserve um pH neutro, o que permite que as reações do anidrido com as funções aminas do anticorpo continuem).

[076] De acordo com um modo de realização particularmente preferido da presente invenção, quando o anidrido é colocado em contato com a DMF, o anticorpo previamente dialisado contra um tampão PBS ou um tampão fosfato a pH 7,4 é posto em contato com soda 5N, e adicionam-se de preferência tantos equivalentes de soda quantas forem as funções ácido carboxílico (1) formadas durante a reação e (2) trazidas pelo anidrido. Os anticorpos modificados são dialisados a seguir em um meio que permita a conservação dos anticorpos, e depois essas soluções são trazidas à concentração adequada de trabalho (cerca de 10 g/L) a fim de se colocar em condições em que a relação anticorpo/antígeno seja ótima.

[077] A presente invenção tem também por objeto anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, caracterizados pelo fato de compreenderem funções ácido carboxílico inseridas de modo a lhes conferir uma capacidade de migração eletroforética para fora do perfil de migração das imunoglobulinas de uma amostra biológica separadas nas mesmas condições de separação por eletroforese capilar. Esses anticorpos modificados sobrecarregados negativamente são de preferência o produto da utilização de um dos métodos descritos acima.

[078] Os anticorpos carregados negativamente podem ser anticorpos monoclonais. Pode-se tratar alternativamente de anticorpos policlonais.

[079] O contato entre o anticorpo e as proteínas antigênicas da amostra pode ser efetuado de duas maneiras: uma mistura da solução de anticorpo modificado com a amostra biológica, de preferência diluída, no suporte de amostra, por exemplo, no aparelho Gapíllarys, antes de sua injeção dentro do capilar, ou a Itern ativam ente as injeções sucessivas da solução de anticorpo modificado e, a seguir, da amostra diluída, dentro do capilar. Esse segundo modo de realização da etapa de colocação em contato permite uma reação antígeno/anticorpo no interior do capilar (Ίη-capillary) tão eficaz quanto o modo clássico de mistura das 2 soluções no aparelho ou outro suporte de amostras, e torna-se possível devido às diferenças de mobilidade dos anticorpos modificados em relação às proteínas da amostra e da ordem de injeção das 2 soluções: como os anticorpos modificados possuem uma mobilidade muito menor que as proteínas da amostra (devido a sua carga negativa elevada) e são injetados em primeiro lugar, a injeção da amostra depois da injeção dos anticorpos modificados provoca a passagem da amostra através da zona de anticorpos, e permite portanto a subtração do perfil protéico dos antígenos reconhecidos pelos anticorpos, [080] A presente invenção trata também de um kit de detecção de proteínas monoclonais em uma amostra biológica, que compreende anticorpos de acordo com a presente invenção e outros componentes, por exemplo, o meio destinado a conter os anticorpos, porém sem os anticorpos (que permitem obter o perfil de referência) e/ou tampões de eletroforese e/ou soluções de lavagem dos capilares e/ou dos aparelhos de diluição específicos com volumes reduzidos e/ou um diluente da amostra a ser analisada, que permitem, por exemplo, uma boa superposição das diferentes curvas obtidas durante as diferentes análises. Esse kit compreende eventualmente indicações de uso para realizar a análise eletroforética e o imunodesiocamento de modo a revelar e tipificar as proteínas Mc, [081] De modo preferido, esse kit contém uma série de anticorpos de especificidade anti-lgG, anti-lgA, anti-lgM, ar\t\-kappa e antilambda.

[082] Outro tipo de kit pode conter uma mistura de anticorpos de especificidade anti-lgG, anti-lgA, anti-lgM, ar\t\-kappa e ant\-lambda. Essa mistura, que pode ser chamada de anti-soro pentavalente, permite confirmar a natureza monoclonal de um pico surgido no perfil eletroforético ou de uma deformação de uma fração desse perfil. Esse kit é particularmente interessante uma vez que as imunoglobulinas Mc podem aparecer não apenas na zona gama, mas também nas zonas beta e alfa, e podem ser eventualmente mascaradas pelas proteínas habituais dessas zonas no perfil obtido de eletroforese capilar. Nesse modo de realização da presente invenção, a amostra é testada em 2 vias: uma via de referência (que contém apenas o meio dos anticorpos, sem os anticorpos) e uma via que permite revelar a presença de um pico monoclonal no perfil eletroforético (por meio do anti-soro pentavalente).

[083] Outro tipo de kit pode conter uma mistura de anticorpos de especificidade anti-cadeias pesadas (γ, α e μ, anti-lgG, anti-lgA, anti-lgM que pode ser chamado de anti-soro trivalente), e/ou anticorpos de especificidades anti-cadeias leves kappa e lambda (livres e ligadas). Esse kit permitira a detecção e a identificação de proteínas de Bence Jones ou cadeias leves livres Mc (kappa ou lambda) na urina ou o soro humano por eletroforese capilar. Nesse modo de realização, quando esses anti-soros são utilizados, a amostra é testada em 6 vias: uma via de referência (que contém apenas o meio dos anticorpos, sem os anticorpos), 5 vias que permitem caracterizar a ou as bandas Mc: presença de cadeias pesadas por meio do anti-soro trivalente, e tipo de cadeia leve (kappa ou lambda; livre ou ligada).

[084] As misturas de anticorpos modificados podem ser obtidas por modificação de uma mistura de anticorpos bruta, ou por mistura de anticorpos previamente modificados por tipo de anticorpos. De acordo com a presente invenção, a realização de uma mistura de anticorpos previamente modificados para serem sobrecarregados negativamente é preferida.

[085] No âmbito da realização da presente invenção, a apresentação dos resultados da separação eletroforética pode ser feita da maneira ilustrada nos exemplos, na forma de perfis eletroforéticos cujo pico correspondente à proteína identificada por uma reação imunológica específica com os anticorpos sobrecarregados negativamente desapareceu do perfil.

[086] Alternativamente, esses resultados podem ser apresentados em forma de perfis eletroforéticos que só mostram o pico correspondente à proteína identificada por uma reação imunológica específica com os anticorpos sobrecarregados negativamente. No âmbito da realização do processo da presente invenção, esse pico desaparece do perfil das proteínas separadas. Os resultados são, porém tratados para mostrar apenas esse pico.

[087] Para fazer isso, por técnicas apropriadas de processamento de dados, subtrai-se de cada perfil eletroforético uma porção da alíquota da amostra considerada tratada por um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente, do perfil de uma porção da alíquota não tratada, da mesma amostra. A subtração de todos os perfis das porções de alíquota tratadas conduz a uma imagem de tipo das que são obtidas por imunofixação.

[088] Outras característica e vantagens da presente invenção aparecem nos exemplos dados a seguir bem como nas figuras que ilustram a realização da presente invenção.

[089] As figuras 1 a 13 ilustram exemplos de detecção de proteínas monoclonaís em diferentes amostras biológicas e a tipagem dessas proteínas monoclonaís» e melhoram assim o prognóstico e o tratamento dessas patologias. Nas figuras 2 a 13, a superfície sombreada do perfil representa as proteínas sérícas separadas em presença dos anticorpos da presente invenção; o perfil das proteínas sérícas separadas na presente invenção dos anticorpos aparece também em um traço mais fino. O perfil das proteínas separadas não tratadas com os anticorpos da presente invenção aparece também sozinho em cada figura, sob a designação ELP.

Breve Descrição das Figuras [090] A figura (1 a) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas sérícas: anti IgG DAKO; janela 105-350 segundos; 122 segundos.

[091 ] A figura (1 b) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas sérícas: anti IgG modificado; janela 105-350 segundos; 267 segundos.

[092] A figura (2) mostra um gráfico de eletroforese: soro com A lambda em beta-2 - ELP, [093] A figura (2a) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas sérícas: anti IgG.

[094] A figura (2b) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas sérícas: anti IgA.

[095] A figura (2c) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas sérícas: anti IgM.

[096] A figura (2d) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas sérícas: anti kappa.

[097] A figura (2e) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas sérícas: anti lambda.

[098] A figura (3) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas sérícas: soro com G lambda em befa-1 - ELP.

[099] A figura (3a) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgG.

[0100] A figura (3b) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgA.

[0101] A figura (3c) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgM.

[0102] A figura (3d) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti kappa.

[0103] A figura (3e) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti lambda.

[0104] A figura (4) mostra um gráfico de eletroforese: soro com A kappa em alfa-2lbetaA - ELP.

[0105] A figura (4a) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgG.

[0106] A figura (4b) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgA.

[0107] A figura (4c) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgM.

[0108] A figura (4d) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti kappa.

[0109] A figura (4e) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti lambda.

[0110] A figura (5) mostra um gráfico de eletroforese: soro com G lambda - ELP.

[0111] A figura (5a) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgG.

[0112] A figura (5b) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgA.

[0113] A figura (5c) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgM.

[0114] A figura (5d) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti kappa.

[0115] A figura (5e) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti lambda.

[0116] A figura (6) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: soro com A lambda em beta-Mbeta-2 - ELP.

[0117] A figura (6a) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgG.

[0118] A figura (6b) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgA.

[0119] A figura (6c) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgM.

[0120] A figura (6d) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti kappa.

[0121] A figura (6e) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti lambda.

[0122] A figura (7) mostra um gráfico de eletroforese: soro com M kappa - ELP.

[0123] A figura (7a) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgG.

[0124] A figura (7b) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgA.

[0125] A figura (7c) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgM.

[0126] A figura (7d) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti kappa.

[0127] A figura (7e) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti lambda.

[0128] A figura (8) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: soro com lambda livre em gama - ELP.

[0129] A figura (8a) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgG.

[0130] A figura (8b) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgA.

[0131] A figura (8c) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgM.

[0132] A figura (8d) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti kappa.

[0133] A figura (8e) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti lambda.

[0134] A figura (8f) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti kappa livre.

[0135] A figura (8g) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti lambda livre.

[0136] A figura (9) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: soro com G lambda em gama - ELP.

[0137] A figura (9a) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgG inserido com anidrido tricarboxílico.

[0138] A figura (9b) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgG inserido com ácido melítico.

[0139] A figura (10) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: soro com G kappa em gama; método no interior do capilar - ELP.

[0140] A figura (10a) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgG.

[0141] A figura (10b) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgA.

[0142] A figura (10c) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgM.

[0143] A figura (10d) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti kappa.

[0144] A figura (10e) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti lambda.

[0145] A figura (11) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: soro com o pico apoiado sobre beta-1 - ELP.

[0146] A figura (11a) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: soro com o pico apoiado sobre beta-1 - pentavalente.

[0147] A figura (12) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: soro com lambda livre em gama - ELP.

[0148] A figura (12a) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: soro com lambda livre em gama -trivalente.

[0149] A figura (12b) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: soro com lambda livre em gama - anW-kappa.

[0150] A figura (12c) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: soro com lambda livre em gama - ar\t\-lambda.

[0151] A figura (12d) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: soro com lambda livre em gama - anW-kappa livre.

[0152] A figura (12e) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: soro com lambda livre em gama - ar\t\-lambda livre.

[0153] A figura (13) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: soro com M kappa em gama; tampão de proteína - ELP.

[0154] A figura (13a) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgG.

[0155] A fígura (13b) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: antí IgA.

[0156] A figura (13c) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti IgM.

[0157] A figura (13d) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti kappa.

[0158] A figura < 13e) mostra um gráfico de eletroforese de proteínas séricas: anti lambda.

Eletroforese Capilar [0159] A eletroforese capilar de amostras clínicas é realizada com um aparelho de EC dotado de 8 capilares de sílíca fundida com um diâmetro interno de 25 mícrons (Capillarys, Sebia). A detecção é realizada a 200 nm. As amostras são colocadas no trocador de amostras do aparelho e injetadas automaticamente por injeção hidrodinâmica. A separação das amostras é realizada em menos de 5 minutos aplicando-se um campo elétrico de cerca de 400 V/cm. O capilar é lavado antes de cada análise pela soda 0,25 M, e a seguir pelo tampão de análise.

Protocolo para a Modificação dos Anticorpos pelo Anidrido Tricarboxílico (a) 10 mL de anti-soro a ser inserido (anti-human IgG, A, M, anti kappa ou lambda Dako Dinamarca) a 10 g/L foram dialisados contra uma solução tampão fosfato 100 rmM pH 7,4. (b) Uma solução de anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico a 100 mM na DMF foi preparada, (c) A solução dialisada de anticorpos foi então misturada com a soda 5N e a solução de anidrido na DMF (213 μΙ de soda 5N + 10 ml de solução de anticorpo + 5,33 ml de anidrido na DMF), (d) O meio reacional foi então colocado em agitação suave em um balancim durante uma hora a 37°C. (e) A mistura foi então dialisada contra a solução tampão de fosfato 100 mM pH 7,4 com várias mudanças do banho de diálise, (f) Depois de terminada a diálise, o tubo de diálise foi colocado em PEG 6000 em pó durante 1 hora. (g) Depois de terminada a concentração, este último foi então dialisado contra fosfato 100 mM pH 7,4 + 1 g/L de azoteto de sódio. (h) O volume do tubo é trazido a 10 mL por uma solução de fosfato 100 mM pH 7,4 + 1 g/L de azoteto de sódio. (i) A solução obtida foi então filtrada em uma membrana de porosidade 0,45 pm e conservada a seguir a 4*G. Qualquer outro meio de conservação pode ser utilizado desde que sua força iônica seja suficiente para assegurar a conservação dos anticorpos (ou seja, próxima daquela da água fisiológica).

Protocolo para a Modificação dos Anticorpos pelo Ácido Metílico (a) 10 ml de anti-soro a ser inserido (anti-human IgG, A, M, antí kappa ou lambda Dako Dinamarca) a 10 g/L, foram dialísados contra uma solução tampão PBS 40 mM pH 7,4. (b) Adicionar 50 μΙ/ml de soda 5N. (c) Adicionar (18 rrtg/m! de ácido melítico e, a seguir, 50 mg/ml de EDCI). (d) O meio reacional foi então colocado em agitação suave em um balancim durante uma hora a 37°C. (e) A mistura foi então dialisada contra a solução tampão de fosfato 100 mM pH 7,4 com várias mudanças do banho de diálise. (f) Depois de terminada a diálise, o tubo de diálise foi colocado em PEG 6000 em pó durante 1 hora. (g) Depois de terminada a concentração, este último foi então dialisado contra fosfato 100 mM pH 7,4 + 1 g/L de azoteto de sódio. (h) O volume do tubo é trazido a 10 mL por uma solução de fosfato 100 mM pH 7,4 + 1 g/L de azoteto de sódio. (i) A solução obtida foi então filtrada em uma membrana de porosidade 0,45 μιτι e conservada a seguir a 4°C.

Protocolo para a Imunotipagem de um Soro [0160] O Capillarys (Sebia) é um aparelho que efetua 8 análises capilares. A barra imunológica é uma barra 100 mM pH 7,4 + 1 g/L de azoteto de sódio, específica da tipagem constituída de 6 cavidades de 100 μΙ e de uma cavidade dupla de 400 μΙ. Ela contém 60 μί de fosfato 100 mM na cavidade 1, 60 μί de anti-lgG modificado na cavidade 2, de anti-lgA modificado na cavidade 3, de anti-lgM modificado na cavidade 4, de anti-kapa modificado na cavidade 5, de anti-Lamba modificado na cavidade 6, sendo que a cavidade dupla 7/8 contém 380 μί de diluente de imunotipagem (álcool benzílico 0,02 M no tampão de análise utilizado pela Sebia). (a) O tubo de soro a ser tipificado foi colocado em posição 1 no suporte Capillarys no qual foi colocada uma barra “imunotipagem”. (b) O suporte foi introduzido no aparelho: a máquina automatizada realizou então uma diluição 1/20 do soro na cavidade dupla 7/6, a cavidade dupla foi homogeneizada e 40 μί foram distribuídos em cada uma das cavidades 1 a 6 homogeneizando-se cada um desses poços. (c) Depois, foi efetuada a análise capilar nas seguintes condições: [0161] O tampão de análise pode ser o tampão Sebia Capillarys Β1B2+ ou o tampão Sebia Capillarys Protein;

[0162] Tampão B1B2+: Temperatura 32°C, tensão de migração 7 kV, janela de aquisição 100-235s, injeção 250 mbars * 5s;

[0163] Tampão Sebia Capillarys Protein(e): Temperatura 37°C, tensão de migração 6,5 kV, janela de aquisição 100-275s, injeção 250 mbars * 5s; (d) A análise capilar obtida na cavidade 1 foi comparada com a das cinco cavidades seguintes a fim de tipificar o soro analisado.

Estabelecimento das Condições Operatórias para Soros Particulares [0164] Se o soro possuir uma fração gama baixa, a diluição no diiuente em (b) é de 1/10. A fração gama será considerada fraca se sua análise com o Capillarys em tampão B1B2+ der um valor inferior às médias definidas para essa fração com esse tampão* ou seja* aproximadamente inferior a 10 % (ou < 7,5 g/l).

[0165] Se o soro possuir uma fração gama superior a aproximadamente 20 g/L, a diluição no diiuente em (b) é de 1/40.

Variante do Protocolo para a Imunotipagem de um Soro: Imunosubtracão NO INTERIOR DO CAPILAR

[0166] Neste caso» são utilizadas 2 barras: [0167] 1 barra constituída de 6 cavidades contendo: 100 μΙ de fosfato 100 mM na cavidade, 100 μΙ de anti-lgG modificado na cavidade 2, de anti-lgA modificado na cavidade 3, de anti-lgM modificado na cavidade 4, de anti-kappa modificado na cavidade 5, de anti-íambda modificado na cavidade 6;

[0168] 1 barra para a diluição do soro constituída de 7 cavidades contendo: 300 μΙ de diiuente de imunotipagem (álcool benzílico 0,02 M no tampão Sebia Capillarys B1B2+) na cavidade dupla 7/8; (a) Um primeiro suporte contendo a barra de anti-soros foi introduzida no aparelho: a máquina automatizada efetuou então uma injeção desses anticorpos dentro dos capilares (250 mbars* 5s). (b) Um segundo suporte contendo a barra para a diluição de soro e um tubo de soro em posição 1 foi introduzido a seguir no aparelho: a máquina automatizada realizou então uma diluição 1/20 na cavidade dupla 7/8, a cavidade dupla foi homogeneizada e distribuída nas cavidades 1 a 6 (40 μΙ de 1/20 de soro + 60 μΙ de tampão de análise por cavidade); os soros diluídos foram então injetados dentro dos capilares (250 mbars * 5s). (c) O tampão de análise pode ser o tampão Sebia Capillarys Β1B2+ ou o tampão Sebia Capillarys Protein(e): [0169] Tampão B1B2+: Temperatura 32°C, tensão de migração 7 kV, janela de aquisição 100-235s;

[0170] Tampão Sebia Capillarys Protein(e): Temperatura 37°C, tensão de migração 6,5 kV, janela de aquisição 100-275s; (d) a análise capilar obtida na cavidade 1 foi comparada com a das cinco cavidades seguintes a fim de tipificar o soro.

Resultados Exemplos [0171] Exemplo 1: a análise de um anti-human IgG Dako antes e depois de modificação pelo anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico com Capillarys com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 105-350 s); a modificação do anticorpo permite atrasar muito sua migração: seu tempo de migração passa de 122 para 267 s (Figuras 1a e 1b).

[0172] Exemplo 2: imunotipagem de um soro que contém uma proteína monoclonal de tipo A lambda que migra para beta-2 com Capillarys com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 105-235 s): 6 alíquotas desse soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados pelo anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico (anti-lgG, - IgA, -IgM, -kappa, -lambda) e com o meio desses anticorpos (sem anticorpo; via ELP). Por comparação com a via ELP (em preto; Figura 2), observa-se claramente o desaparecimento do pico monoclonal em beta-2 nas alíquotas tratadas com os anti-lgA e antilambda. Nas outras vias, foi observada apenas a diminuição do fundo policlonal. Deve-se notar também a ausência de interferência dos imuncomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes dos gamas é um marcador de injeção que facilita a superposição dos perfis.

[0173] Exemplo 3: imunotipagem de um soro que contém uma proteína monoclonal de tipo G lambda que migra para beta-1 com Capillarys com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 105-235 s): 6 alíquotas desse soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados pelo anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico (anti-lgG, - IgA, -IgM, -kappa, -lambda) e com o meio desses anticorpos (sem anticorpo; via ELP). Por comparação com a via ELP (em preto; Figura 3), observa-se claramente o desaparecimento do pico monoclonal em beta-1 nas alíquotas tratadas com os anti-lgG e antilambda. Nas outras vias, foi observada apenas a diminuição do fundo policlonal. Deve-se notar também a ausência de interferência dos imuncomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes dos gamas é um marcador de injeção que facilita a superposição dos perfis.

[0174] Exemplo 4: imunotipagem de um soro que contém uma proteína monoclonal de tipo A kappa que migra entre beta-1 e alfa-2 com Capillarys com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 105-235 s): 6 alíquotas desse soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados pelo anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico (anti-lgG, - IgA, -IgM, -kappa, -lambda) e com o meio desses anticorpos (sem anticorpo; via ELP). Por comparação com a via ELP (em preto; Figura 4), observa-se claramente o desaparecimento do pico monoclonal em beta-Valfa-2 nas alíquotas tratadas com os anti-lgA e antikappa. Nas outras vias, foi observada apenas a diminuição do fundo policlonal. Deve-se notar também a ausência de interferência dos imuncomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes dos gamas é um marcador de injeção que facilita a superposição dos perfis.

[0175] Exemplo 5: imunotipagem de um soro que contém uma proteína monoclonal de tipo G lambda que migra para gama com Capillarys com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 105-235 s): 6 alíquotas desse soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados pelo anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico (anti-lgG, - IgA, -IgM, -kappa, -lambda) e com o meio desses anticorpos (sem anticorpo; via ELP). Por comparação com a via ELP (em preto; Figura 5), observa-se claramente o desaparecimento do pico monoclonal em gama nas alíquotas tratadas com os anti-lgG e antilambda. Nas outras vias, foi observada apenas a diminuição do fundo policlonal. Deve-se notar também a ausência de interferência dos imuncomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes dos gamas é um marcador de injeção que facilita a superposição dos perfis.

[0176] Exemplo 6: imunotipagem de um soro que contém uma proteína monoclonal de tipo A lambda que migra entre beta-2 e beta-1 com Capillarys com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 105-235 s): 6 alíquotas desse soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados pelo anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico (anti-lgG, - IgA, -IgM, -kappa, -lambda) e com o meio desses anticorpos (sem anticorpo; via ELP). Por comparação com a via ELP (em preto; Figura 6), observa-se claramente o desaparecimento do pico monoclonal em beta-λI beta-2 nas alíquotas tratadas com os anti-lgA e ant\-lambda. Nas outras vias, foi observada apenas a diminuição do fundo policlonal. Deve-se notar também a ausência de interferência dos imuncomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes dos gamas é um marcador de injeção que facilita a superposição dos perfis.

[0177] Exemplo 7: imunotipagem de um soro que contém uma proteína monoclonal de tipo M kappa que migra para gama com Capillarys com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 105-235 s): 6 alíquotas desse soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados pelo anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico (anti-lgG, - IgA, -IgM, -kappa, -lambda) e com o meio desses anticorpos (sem anticorpo; via ELP). Por comparação com a via ELP (em preto; Figura 7), observa-se claramente o desaparecimento do pico monoclonal em gama nas alíquotas tratadas com os anti-lgM e ant\-kappa. Nas outras vias, foi observada apenas a diminuição do fundo policlonal. Deve-se notar também a ausência de interferência dos imuncomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes dos gamas é um marcador de injeção que facilita a superposição dos perfis.

[0178] Exemplo 8: imunotipagem de um soro que contém uma proteína monoclonal de tipo lambda livre que migra para gama com Capillarys com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 105-235 s): 8 alíquotas desse soro foram misturadas com 7 anticorpos modificados pelo anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico (anti-lgG, - IgA, -IgM, -kappa, -lambda, -kappa livre, -lambda livre) e com o meio desses anticorpos (sem anticorpo; via ELP). Por comparação com a via ELP (em preto; Figura 8), observa-se claramente o desaparecimento do pico monoclonal em gama nas alíquotas tratadas com os ar\t\-lambda e anti-lambda livre. Nas outras vias, foi observada apenas a diminuição do fundo policlonal. Deve-se notar também a ausência de interferência dos imuncomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes dos gamas é um marcador de injeção que facilita a superposição dos perfis.

[0179] Exemplo 9: comparação da imunotipagem obtida com um anticorpo anti-human modificado pelo anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico ou pelo ácido melítico/EDCI em um soro que contém uma proteína monoclonal de tipo G kappa que migra para gama com Capillarys com o tampão Sebia Capillarys Β1B2+ (janela de aquisição 105-235 s); 3 alíquotas desse soro foram misturadas com 2 anti-human IgG modificados pelo anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico e pelo ácido melítico/EDCI e com o meio desses anticorpos (sem anticorpo; via ELP). Por comparação com a via ELP (em preto; Figura 9), observa-se claramente o desaparecimento do pico monoclonal em beta-1 para as alíquotas tratadas com os 2 anticorpos modificados. Devem-se notar também nos 2 casos a ausência de interferência dos imunocomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes dos gamas é um marcador de injeção que facilita a superposição dos perfis.

[0180] Exemplo 10: imunotipagem no interior do capilar de um soro que contém uma proteína monoclonal de tipo G kappa que migra para gama com_Capillarys com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 100-235 s);

[0181] o meio dos anticorpos (sem os anticorpos) e 5 anticorpos modificados pelo anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílco (anti-lgG, -IgA, -IgM, -kappa, -lambda) foram colocados em uma primeira barra, 6 alíquotas desse soro foram diluídas no tampão Sebia Capillarys Β1B2+ que contém o marcador de injeção (barra 2). Os anticorpos e, a seguir, as alíquotas de soro diluído foram injetados e as 6 migrações realizadas. Por comparação com a via ELP (em preto; Figura 10), observa-se claramente o desaparecimento do pico monoclonal em gama nas alíquotas tratadas com os anti-lgG e anti-kappa. Nas outras vias, foi observada apenas a diminuição do fundo policlonal. Deve-se notar também a ausência de interferência dos imuncomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes dos gamas é um marcador de injeção que facilita a superposição dos perfis.

[0182] Exemplo 11: Uso do anti-soro pentavalente (mistura de anticorpos anti-lgG, -IgA, -IgM, -kappa e -lambda modificados pelo anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico) a fim de verificar a natureza Mc do pico apoiado sobre beta-1 em um soro por análise com Capillarys com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição: 100-235 s): 2 alíquotas desse soro foram misturadas com o anti-soro pentavalente e com o meio desses anticorpos (sem anticorpo; via ELP). A comparação com a via ELP (em preto; Figura 11), pode-se claramente observar o desaparecimento do pico apoiado sobre beta-1 na via tratada com o anti-soro pentavalente, indicando a natureza Mc desse pico (proteína Mc de tipo M kappa). Deve-se notar também o desaparecimento do fundo policlonal, a ausência de fração beta-2 nesse soro, bem como a ausência de interferência dos imuncomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes dos gamas é um marcador de injeção que facilita a superposição dos perfis.

[0183] Exemplo 12: Imunotipagem de um soro que contém uma proteína Mc de tipo lambda livre que migra para gama com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 100-235s): 6 alíquotas desse soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados pelo anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico (anti-soro Trivalente (mistura de anticorpos anti-lgG, -IgA, -IgM), ar\t\-kappa, anti-lambda, anW-kappa livres, anti-lambda livres) e com o meio desses anticorpos (sem anticorpo; via ELP). Por comparação com a via ELP (em preto; Figura 12), observa-se claramente o desaparecimento do fundo policlonal, mas não do pico Mc na via tratada com o anti-soro trivalente. Observa-se paralelamente o desaparecimento do pico Mc nas vias anti-lambda e ant\-lambda livre. Nas vias anti-kappa e anti-kappa livre, observou-se apenas a diminuição do fundo policlonal. Deve-se notar também a ausência de fração beta-2 nesse soro bem como a ausência de interferência dos imuncomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes dos gamas é um marcador de injeção que facilita a superposição dos perfis.

[0184] Exemplo 13: Imunotipagem de um soro que contém uma proteína Mc de tipo kappa que migra para gama com o tampão Sebia Capillarys B1B2+ (janela de aquisição 100-235s): 6 alíquotas desse soro foram misturadas com 5 anticorpos modificados pelo anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico (anti-lgG, -IgA, -IgM, -kappa, -lambda) e com o meio desses anticorpos (sem anticorpo; via ELP). Por comparação com a via ELP (em preto; Figura 13), observa-se claramente o desaparecimento do pico Mc nas alíquotas tratadas com os anti-lgM e ant\-kappa. Nas outras vias, foi observada apenas a diminuição do fundo policlonal. Deve-se observar também a ausência de interferência dos imuncomplexos e dos anticorpos modificados com a migração das globulinas. O pico que migra antes dos gamas é um marcador de injeção que facilita a superposição dos perfis.

Reivindicações

Claims (26)

1. MÉTODO PARA ANÁLISE POR ELETROFORESE CAPILAR, de uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende a etapa de separação dos constituintes de uma primeira porção da alíquota da amostra biológica por eletroforese capilar, na presença de pelo menos um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente que possui uma especificidade antigêníca determinada para um isotipo de imunoglobulina e que pode formar um complexo do tipo antígeno-anticorpo com uma proteína monoclonal que pode estar presente na amostra biológica, e detecção dos constituintes separados da amostra biológica; em que o pelo menos um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente migra para uma zona situada fora da zona de migração das globulínas da amostra biológica quando separadas durante a eletroforese, em que o referido anticorpo possui uma especificidade antigêníca para proteínas moooclonais alvo pré-determinadas, sendo obtido pela reação com (i) ácido melítico, na presença de EDCI (1 -{3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida hidrocloreto), ou {ii) um anidrido que compreende pelo menos uma função ácido carboxílico.

2. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa de comparar o perfil eletroforético obtido pela separação realizada na primeira porção da alíquota da amostra biológica com um perfil eletroforético dos constituintes de uma outra porção da alíquota da mesma amostra separada por eletroforese capilar na ausência dos referidos pelo menos um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente com uma especificidade antigêníca pré-determinada.

3. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que são utilizados vários anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, que formam uma série de anticorpos que possuem especificidades antigênícas diferentes, a série sendo colocada em contato com uma mesma porção da alíquota da amostra biológica para separar os constituintes da amostra por eletroforese capilar, em que cada tipo de anticorpo, na série de anticorpos é para um isotipo de imunoglobulina.

4. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 2 a 3, para análise eletroforética capilar de uma amostra biológica dividida em pelo menos 2 porções de alíquota, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas, prévias à separação dos constituintes da amostra biológica por eletroforese: (1) colocação em contato de um meio, que contém pelo menos um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente que possui uma especificidade antigênica determinada, com uma porção da alíquota da amostra biológica sob condições de incubação que permitem a reação imunológica entre os referidos anticorpos e uma proteína monoclonal alvo especificamente reconhecida pelos referidos pelo menos um anticorpo, quando ela está presente na amostra biológica, e colocação em contato de outra porção da alíquota da amostra biológica com o referido meio que é, no entanto, desprovido dos anticorpos modificados; (2) injeção das porções de alíquota da amostra biológica incubadas na etapa (1) dentro do capilar de eletroforese.

5. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, para análise eletroforética capilar de uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende as seguintes etapas, prévias à separação dos constituintes da amostra biológica por eletroforese: (1) injeção de um meio, que contém pelo menos um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente que possui uma especificidade antigênica determinada, dentro do capilar de eletroforese, e injeção do referido meio que é, no entanto, desprovido dos referidos anticorpos modificados dentro de outro capilar de eletroforese; (2) injeção da amostra biológica dentro do capilar de eletroforese tratado de acordo com a etapa (1), sob condições que permitem a reação imunológica entre os anticorpos e a(s) proteína(s) monoclonal(is) alvo(s) quando ela(s) está(estão) presente(s) na amostra biológica.

6. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica está dividida em pelo menos n+1 porções de alíquota quando a série de anticorpos modificados sobrecarregados negativamente compreende n tipos de anticorpos com diferentes especificidades pré-determinadas.

7. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato que os anticorpos são selecionados a partir dos anticorpos anti-lgG, anti-lgA, anti-lgM, anti-kappa e anti-lambda.

8. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que utiliza os anticorpos anti-lgG, anticorpos anti-lgA, anticorpos anti-lgM, anticorpos anti-kappa, anticorpos anti-lambda, anticorpos ar\t\-kappa livres e anticorpos anti-lambda livres.

9. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente está em excesso em relação à(s) proteína(s) monoclonal(is) alvo(s) que ele reconhece quando ela(s) está(ão) presente(s) na amostra biológica.

10. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente é(são) o produto de uma reação com o anidrido 1,2,4-benzenotricarboxílico.

11. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o pelo menos um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente é o produto de reação do anticorpo com um anidrido que compreende pelo menos uma função ácido carboxílico, em que a referida reação compreende a dissolução extemporânea do anidrido em dimetilformamida (DMF) e a colocação em contato do anidrido dissolvido com o anticorpo em solução para permitir a reação do anidrido e do anticorpo, sendo que a referida reação é realizada a 37 °C sob condições que permitem a inserção das cargas negativas no anticorpo.

12. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que a eletroforese capilar é realizada em um tampão alcalino, a um pH compreendido entre 9 e 11, que contém um composto tampão e pelo menos um aditivo que pode aumentar a força iônica do tampão de análise.

13. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é selecionada a partir de amostras de plasma, de urina ou de líquido cefalorraquidiano.

14. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é uma amostra de soro.

15. MÉTODO PARA PESQUISA E TIPAGEM DE PROTEÍNAS MONOCLONAIS, chamadas proteínas Mc, em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende a análise eletroforética capilar, conforme descrita em uma das reivindicações 1 a 14, das diferentes porções de alíquota da amostra biológica, em que cada porção da alíquota é colocada em contato com um anticorpo selecionado respectivamente a partir das imunoglobulinas anti-lgG, anti-lgA, anti-lgM, ar\t\-kappa, anti-lambda, antikappa livre e anti-lambda livre, que foi modificada para ser sobrecarregada negativamente, referido anticorpo sobrecarregado negativamente sendo obtido a partir da reação com (i) ácido melítico, na presença de EDCI (1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida hidrocloreto), ou (ii) um anidrido que compreende pelo menos uma função ácido carboxílico.

16. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE ANTICORPOS MODIFICADOS SOBRECARREGADOS NEGATIVAMENTE, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: - dissolução extemporânea de um anidrido que compreende pelo menos uma função ácido carboxílico, em dimetilformamida (DMF); - colocação em contato dos anticorpos com o anidrido dissolvido sob condições que permitam a reação do anidrido com o anticorpo a fim de obter um anticorpo modificado sobrecarregado negativamente, a um pH alcalino.

17. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o anidrido é o anidrido benzenotricarboxílico.

18. MÉTODO, de acordo a reivindicação 16 ou 17, caracterizado pelo fato de que o anidrido é dissolvido extemporaneamente em DMF puro.

19. KIT PARA DETECÇÃO E TIPAGEM DE PROTEÍNAS MONOCLONAIS em uma amostra biológica, caracterizado pelo fato de que compreende anticorpos modificados sobrecarregados negativamente, em que as funções ácidos estão inseridas nos anticorpos de modo a lhes conferir uma capacidade de migração eletroforética para fora do perfil de migração das imunoglobulinas de tipo IgG, IgA, IgM, IgE e IgD separadas sob as mesmas condições de separação por eletroforese capilar, em que as referidas funções ácido são inseridas nos anticorpos por reação do referido anticorpo com (i) ácido melítico na presença de EDCI (1-(3-dimetilaminopropil)-3-etilcarbodiimida hidrocloreto) ou (ii) um anidrido que compreende pelo menos uma função ácido carboxílico, o kit ainda compreende um diluente adequado.

20. KIT, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente são obtidos pela realização de um método, conforme descrito em uma das reivindicações 16 a 18.

21. KIT, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizados pelo fato de que os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente são selecionados a partir das imunoglobulinas anti-lgG, anti-IgA, anti-lgM, anW-kappa, anti-lambda, anti-kappa livre e anti-lambda livre.

22. KIT, de acordo com a reivindicação 19 ou 20, caracterizados pelo fato de que os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente são misturados na forma de um anti-soro pentavalente que contém os referidos anticorpos anti-lgG, anti-lgA, anti-lgM, anti-kappa e anti-lambda, modificados sobrecarregados negativamente, ou na forma de um anti-soro trivalente que contém os referidos anticorpos anti-lgG, anti-lgA e anti-lgM sobrecarregados negativamente.

23. KIT, de acordo com uma das reivindicações 19 a 22, caracterizados pelo fato de que os anticorpos modificados sobrecarregados negativamente são anticorpos policlonais.

24. USO DE ANTICORPOS, conforme descritos em uma das reivindicações 19 a 23, caracterizado pelo fato de que é para a detecção de proteínas monoclonais, presentes em uma amostra biológica, por eletroforese capilar e imunodeslocamento.

25. USO DE ANTICORPOS, conforme descritos em uma das reivindicações 19 a 23, caracterizado pelo fato de que é para a tipagem de proteínas monoclonais presentes em uma amostra biológica.

26. USO, de acordo com uma das reivindicações 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que é em um método, conforme definido em uma das reivindicações 1 a 15.