PT1506235E - Método para produzir anticorpos monoclonais - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA PRODUZIR ANTICORPOS MONOCLONAIS" A presente invenção refere-se a métodos para produzir anticorpos monoclonais. Em particular, a invenção refere-se a métodos de elevada produtividade para produzir anticorpos monoclonais mais rapidamente do que métodos convencionais. 0 desenvolvimento de linhas celulares que produzem anticorpos monoclonais através de fusões somáticas de linfócitos B com células de mieloma foi primeiro descrito por Kohler e Milstein há mais de 25 anos (Kohler & Milstein, 1975) . Desde então, os anticorpos monoclonais desempenharam um papel central no crescimento exponencial do nosso entendimento sobre a fisiologia, bioquímica e genética humanas. Os anticorpos monoclonais são ferramentas versáteis e sensíveis para detectar e localizar moléculas biológicas específicas. Podem ser produzidos anticorpos monoclonais contra qualquer molécula celular, permitindo que a molécula seja identificada, localizada e purificada. Em alguns casos, os anticorpos monoclonais também auxiliam a identificação da função das moléculas às quais se ligam. 0 potencial de diagnóstico e terapêutico dos anticorpos monoclonais também foi rapidamente compreendido após a técnica de hibridoma ter permitido o seu desenvolvimento em meados da década de 1970. Os anticorpos monoclonais tornaram-se componentes chave numa vasta série de testes de diagnóstico em laboratórios clínicos. Adicionalmente, um grande número de 1 fármacos licenciados contêm anticorpos monoclonais e um largo número de fármacos em desenvolvimento são anticorpos monoclonais. A utilização clinica de anticorpos monoclonais foi melhorada pelo desenvolvimento de anticorpos monoclonais quiméricos e totalmente humanizados que minimiza os efeitos colaterais em doentes.
Todavia, apesar do papel central dos anticorpos monoclonais nestes desenvolvimentos na medicina e biologia molecular, o processo para produzir e pesquisar anticorpos monoclonais sofreu poucas alterações desde que foi primeiro desenvolvido por Kohler e Milstein em meados da década de 1970. A abordagem mais frequentemente utilizada para produzir um anticorpo monoclonal contra um antigénio especifico requer uma série de imunizações de murganhos ou ratos com um antigénio ao longo de várias semanas para aumentar a activação e proliferação de células B maduras produzindo anticorpos específicos para o antigénio. São geralmente imunizados vários murganhos e são testados periodicamente quanto à presença de títulos relevantes de imunoglobulina no soro antes da fusão somática. Após a fusão, os sobrenadantes de hibridomas são rastreados utilizando imunoensaios para identificar anticorpos monoclonais com uma especificidade elevada para o antigénio. O intervalo de tempo necessário para desenvolver um anticorpo monoclonal utilizando esta abordagem é geralmente de 3 a 9 meses. 0 documento WO 96/33735 revela um método para produzir um anticorpo humano imunizando um animal transgénico não humano com um antigénio contra o qual é desejável produzir o anticorpo. 0 animal transgénico não humano foi modificado para produzir células B que segregam anticorpos humanos em vez de anticorpos endógenos. Após a imunização, as células B são obtidas a partir 2 do baço do animal e imortalizadas utilizando a técnica de Kohler e Milstein para produzir hibridomas. Pode ser utilizada uma ELISA em sanduíche na qual o anticorpo monoclonal no sobrenadante do hibridoma se liga ao antigénio e a uma região constante anti-humana, para confirmar que o anticorpo é humano. Templin et al., (Trends in Biotechnology, 2002, 20:160) referem-se às vantagens teóricas e limitações dos sistemas da tecnologia de microarray e, em particular, à alteração da utilização de microarrays de proteína em métodos de diagnóstico e pesquisa de genoma e proteoma. O desenvolvimento de RIMMS (estratégia de imunização repetitiva, em múltiplos sítios) permitiu que ocorram fusões somáticas apenas 8-14 dias após a iniciação da imunização (Kilpatrick et al., 1997). Os sobrenadantes dos hibridomas produzidos podem ser então rastreados utilizando imunoensaios convencionais, permitindo que um anticorpo monoclonal contra um antigénio específico seja isolado muito mais rapidamente.
Todavia, mesmo utilizando RIMMS, a produção e rastreio de anticorpos monoclonais contra números elevados de diferentes antigénios requer tempo e recursos consideráveis. À medida que são descobertas mais e mais proteínas novas, há uma necessidade para métodos mais rápidos e mais eficientes para produzir e rastrear anticorpos monoclonais contra essas proteínas, de modo a permitir a sua caracterização posterior.
Sumário da Invenção
Consequentemente, a invenção proporciona um método de elevada produtividade para produzir uma pluralidade de 3 anticorpos monoclonais, cada um dos quais ligando-se a um antigénio candidato diferente, compreendendo o referido método os passos de: a) introduzir uma pluralidade de antigénios candidatos num animal ou animais; b) recuperar células produtoras de anticorpo do referido animal ou animais e colocar essas células numa suspensão de célula única; c) produzir linhas celulares imortalizadas da suspensão de célula única; d) rastrear o sobrenadante das referidas linhas celulares imortalizadas contra um chip de proteínas no qual são apresentados os antigénios candidatos; e e) seleccionar anticorpos monoclonais, que se ligam aos referidos antigénios. 0 método da invenção possui vantagens consideráveis sobre os métodos de produzir anticorpos monoclonais que estão normalmente disponíveis. Como anteriormente discutido, os métodos correntes para produzir anticorpos monoclonais contra mais do que um antigénio envolve imunização laboriosa e protocolos de isolamento para cada antigénio individual. Em contraste, no método da invenção, o animal pode ser injectado com antigénios múltiplos resultando na produção simultânea de anticorpos monoclonais contra antigénios múltiplos e aumentando a
velocidade e eficiência de produção de anticorpos monoclonais. A utilização de um chip de proteínas no método da invenção acelera 4 o processo de rastreio para detectar anticorpos monoclonais que se ligam ao antigénio ou antigénios com que o animal foi injectado. Adicionalmente, o chip de proteína é mais sensível do que os ensaios de rastreio convencionais, tais como ensaios de imunoabsorção com ligação a enzima (ELISA), resultando numa taxa de detecção melhorada para células de hibridoma de secreção lenta que se perderiam utilizando métodos de rastreio convencionais. Adicionalmente, a utilização de um chip de proteínas no método da invenção permite que cada sobrenadante seja rastreado várias vezes contra um antigénio e utiliza apenas uma fracção da quantidade de antigénio necessária para um único rastreio num ensaio convencional, tal como um ELISA. Por exemplo, cada sobrenadante pode ser rastreado em duplicado, triplicado ou quadruplicado contra um antigénio. 0 animal no passo a) do método da invenção pode ser qualquer animal mamífero não humano. De um modo preferido, o animal é um murganho, rato, coelho, hamster ou cobaio. De um modo preferido, o animal é um murganho. 0 antigénio candidato no passo a) é, de um modo preferido, um antigénio candidato purificado. Podem ser introduzidos no animal um antigénio candidato purificado ou uma mistura de antigénios candidatos purificados. Por "antigénio candidato purificado" entende-se que o antigénio é uma preparação homogénea de antigénio que é substancialmente isenta de quaisquer outros componentes. Por "uma mistura de antigénios candidatos purificados" entende-se que mais do que um antigénio purificado está presente na composição utilizada para imunização, mas que a preparação está isenta de componentes contaminantes para os quais não há intenção de desencadear a produção de anticorpos. Por exemplo, embora utilizando processos 5 convencionais, um animal pode ser imunizado com várias antigénios simplesmente por imunização com tecido homogeneizado, essa imunização não representa imunização com antigénios candidatos purificados como é aqui definido, uma vez que os antigénios estariam contaminados com resíduos celulares.
Qualquer número de antigénios candidatos purificados pode ser introduzido no animal. De um modo preferido, mais do que um antigénio candidato purificado são introduzidos no animal. Por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 30, 40, 50 ou mais do que 50 antigénios candidatos purificados podem ser introduzidos no animal. Os antigénios podem ser introduzidos simultaneamente, no sentido em que são todos misturados em conjunto. Alternativamente, os antigénios podem ser introduzidos separadamente um após o outro. A introdução de antigénios diferentes pode ser separada por um período de tempo de dias. De um modo preferido, o período que separa a introdução de antigénios diferentes é inferior a 48 horas, de um modo preferido menos de 24 horas. De um modo preferido, o método de introdução envolve injecção do(s) antigénio (s) no animal.
Pelo termo "antigénio candidato" entende-se qualquer substância capaz de induzir uma resposta imunitária num animal quando esse antigénio candidato é introduzido no animal. O termo inclui, por isso, substâncias proteicas e substâncias não proteicas.
Substâncias proteicas que são antigénios incluem proteínas e seus derivados, tais como glicoproteínas, lipoproteínas e nucleoproteínas e péptidos. Fragmentos dessas substâncias proteicas são também incluídos no termo "antigénio". De um modo preferido, esses fragmentos consistem ou compreendem 6 determinantes antigénicos. Substâncias não proteicas que são antigénios incluem polissacáridos, lipopolissacáridos e ácidos nucleicos. Em particular, o termo "antigénio" inclui moléculas de ácido nucleico que induzem uma resposta imunitária contra as proteínas que codificam. Fragmentos dessas substâncias não proteicas também são incluídos no termo "antigénio". 0 termo "antigénio" inclui ainda substâncias proteicas ou não proteicas ligadas a um veículo que são capazes de induzir uma resposta imunitária, tais como lípidos ou haptenos sobre os quais é conferida antigenicidade quando eles são ligados a um veículo. Os antigénios da invenção podem ser substâncias que ocorrem naturalmente ou podem ser sintetizados por métodos conhecidos na técnica. 0 antigénio é, de um modo preferido, uma substância proteica ou uma molécula de ácido nucleico. Quando o antigénio purificado é uma substância proteica, pode ser introduzido isoladamente ou na forma de uma proteína de fusão. Em particular, a invenção proporciona que o antigénio possa estar na forma de uma proteína de fusão expressa na superfície de um virião recombinante sendo o animal injectado com o virião recombinante. A produção de tais viriões recombinantes utilizando uma sequência de ácido nucleico codificando o antigénio proteico, é descrita em Lindley et al.f 2000.
Pode ser utilizada qualquer combinação de antigénios purificados. O animal pode ser injectado com apenas antigénios proteicos, apenas antigénios não proteicos, ou uma mistura de ambos. De acordo com uma forma de realização da invenção, os antigénios purificados são todos proteicos. Os antigénios purificados podem ser fragmentos derivados da mesma proteína ou de proteínas diferentes. Os antigénios purificados podem ser 7 viriões recombinantes derivados de uma biblioteca de ADNc, expressando cada virião recombinante uma proteína codificada por um ADNc da biblioteca na sua superfície.
De acordo com uma outra forma de realização, a invenção proporciona para que múltiplos antigénios purificados sejam introduzidos no animal na forma de moléculas de ácido nucleico codificando proteínas contra as quais é desejável produzir anticorpos monoclonais. As moléculas de ácido nucleico podem estar em moléculas de ADN, moléculas de ADNc ou moléculas de ARN. De um modo preferido, neste aspecto da invenção, a biblioteca de ADNc pode ser introduzida no animal. É por isso possível injectar o animal com moléculas de ácido nucleico codificando uma proteína de identidade desconhecida e como descrito abaixo, podem ser utilizados chips de células que podem ser utilizadas para isolar um anticorpo contra a proteína que, por sua vez, permite que a proteína seja purificada.
Quando o antigénio purificado é uma molécula de ácido nucleico, de um modo preferido consiste em, ou compreende, uma sequência de ADN, ADNc ou ARN codificando uma proteína contra a qual é induzida uma resposta imunitária. A molécula de ácido nucleico pode ser uma molécula de ácido nucleico desprotegido ou pode estar na forma de um vector. 0 vector pode ser um vector virai, de um modo preferido um vector de retrovírus, adenovírus, associado a adenovírus (AAV), herpesvírus, alfavírus ou qualquer outro vector adequado, como será óbvio para um leitor especialista. Alternativamente, a molécula de ácido nucleico pode estar na forma de um vector não virai, de um modo preferido um vector plasmídico. Muitos desses vectores são conhecidos e estão documentados na técnica (ver, por exemplo, Fernandez J.M. e Hoeffler J.P. em Gene expression Systems. Usíng nature for the art of expression ed. Academic Press, San Diego, Londres, Boston, Nova Iorque, Sidney, Tóquio, Toronto, 1998). Esses vectores podem incorporar, adicionalmente, sequências reguladoras, tais como intensificadores, promotores, sitios de ligação ao ribossoma e sinais de terminação nas regiões 5' e 3' não traduzidas dos genes, que são necessárias para assegurar que a sequência codificante é propriamente transcrita e traduzida.
Alternativamente, a molécula de ácido nucleico pode estar na forma de ADN policatiónico condensada, ligada ou não ligada a adenovirus morto isolado, por exemplo, ver Curiel (1992) Hum Gene Ther 3:14 7-154, ou ADN ligado ao ligando, por exemplo, ver Wu (1989) J Biol Chem 264: 16985-16987. A molécula de ácido nucleico também pode estar na forma de esferas de látex revestidas com ADN. Alternativamente, a molécula de ácido nucleico pode ser encapsulada em lipossomas como descrito, por exemplo, nos documentos W095/13796, W094/23697, W091/14445 e EP-524 968. SA 91 (24):11581-11585. 0 antigénio pode ser introduzido no animal através de qualquer meio adequado. De um modo preferido, o método de introdução envolve injecção. Os animais podem ser imunizados intraesplenicamente, intravenosamente, intraperitonealmente, intradermicamente ou subcutaneamente ou através de qualquer outro meio adequado, com o antigénio ou antigénios purificados. Os animais podem ser imunizados com o antigénio ou antigénios purificados através de mais do que uma destas vias. Por exemplo, alguns do antigénio ou antigénios purificados podem ser injectados intraperitonealmente e o resto subcutaneamente. 0 meio de injecção dependerá do antigénio ou antigénios a serem 9 injectados. Por exemplo, no caso de injecção com uma molécula de ácido nucleico pode ser utilizada uma pistola de partículas de transferência de genes operada manualmente, como descrito no documento US 5149655, para injectar a molécula de ácido nucleico.
No caso de um antigénio proteico, a dose de cada antigénio deve estar, de um modo preferido, no intervalo entre 0,01 e 1000 microgramas.
De um modo preferido, o método da invenção compreende o passo adicional de fornecer o animal com uma dose de reforço de alguns ou todos os antigénios que são introduzidos no animal antes da recuperação das células produtoras de anticorpo. Os animais podem ser administrados com um reforço 1-365 dias após a primeira injecção. De um modo preferido, os animais são administrados com reforço 1 a 20 vezes.
De um modo preferido, os protocolos de imunização utilizados na metodologia da presente invenção são curtos quando mais do que um antigénio é utilizado, de modo a prevenir que um antigénio se torne imunodominante. De um modo preferido, quando o animal é imunizado com mais do que um antigénio, é injectado com um reforço de cada antigénio ou reforço combinado de mais do que um antigénio 3 dias após a primeira injecção e um outro reforço 5 dias após a injecção inicial com tecido de baço ou nódulos linfáticos a serem removidos entre o dia 6 e o dia 15. Quando é desejado um protocolo de imunização mais longo, o animal pode ser injectado, por exemplo, com um reforço de cada antigénio ou reforço combinado de mais do que um antigénio 21 dias após a primeira injecção, com o tecido do baço ou nódulos linfáticos a serem removidos no dia 26. 10 A imunização do animal pode ser realizada com ou sem veículos farmacêuticos. Veículos adequados são macromoléculas tipicamente grandes, metabolizadas lentamente, tais como proteínas, polissacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, agregados de lípidos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas), e partículas de vírus inactivas. Esses veículos são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Adicionalmente, esses veículos podem funcionar como agentes imunoestimulantes ("adjuvantes"). A imunização do animal pode ser realizada com ou sem adjuvantes adicionalmente aos veículos farmacêuticos.
Adjuvantes preferidos para aumentar a eficiência da composição incluem, mas não estão limitados a: (1) sais de alumínio (alúmen), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de alumínio, etc.; (2) formulações de emulsão óleo-em-água (com ou sem outros agentes de imunoestimulação específicos, tais como péptidos de muramilo (ver abaixo) ou componentes de parede celular bacteriana), tais como, por exemplo (a) MF59™ (documento WO90/14837; Capítulo 10 em Vaccine design: the subunit and adjuvant approach, eds. Powell e Newman, Plenum Press 1995), contendo Esqualeno a 5%, Tween 80 a 0,5%, e Span 85 a 0,5% (contendo opcionalmente MTP-PE) formulado em partículas de submicrones utilizando um microfluidizador, (b) SAF, contendo Esqualeno a 10%, Tween 80 a 0,4%, polímero L121 bloqueado com pluronic a 5%, e thr-MDP microfluidizado numa emulsão submicrone ou sujeito a vórtice para gerar uma emulsão de tamanho de partícula maior, e (c) sistema de adjuvante de Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem, Hamilton, MT) contendo Esqualeno a 2%, Tween 80 a 0,2% e um ou mais componentes de parede celular bacteriana do grupo consistindo em monofosforil-lípido A (MPL), 11 dimicolato de trealose (TDM), e esqueleto da parede celular (CWS), de um modo preferido MPL + CWS (Detox™); (3) podem ser utilizados adjuvantes de saponina, tais como QS21 ou Stimulon™ (Cambridge Bioscience, Worcester, MA) ou partículas geradas a partir destes, tais como ISCOMs (complexos imunoestimuladores), cujos ISCOMS podem ser desprovidos de detergente adicional, e. g. documento WO00/07621; (4) Adjuvante de Freund Completo (CFA) e Adjuvante de Freund Incompleto (IFA); (5) citocinas, tais como interleucinas (e. g. IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 (documento W099/44636) etc.), interferões (e. g. interferão gama), factor de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF), factor de necrose tumoral (TNF), etc.; (6) monofosforil lípido A (MPL) ou MPL 3-0-desacilado (3dMPL) e. g. documentos GB-2220221, EP-A-0689454, opcionalmente na ausência substancial de alúmen quando utilizado com sacáridos de pneumococos, e. g. documento WOOO/56358; (7) combinações de 3dMPL com, por exemplo, QS21 e/ou emulsões óleo-em-água, e. g. documentos EP-A-0835318, EP-A-0735898, EP-A-0761231; (8) oligonucleótidos compreendendo motivos CpG (Roman et al., Nat. Med., 1997, 3, 849-854; Weiner et al., PNAS USA, 1997, 94, 10833-10837; Davis et al., J. Immunol., 1998, 160, 870-876; Chu et al., J Exp. Med., 1997, 186, 1623-1631; Lipford et al., Eur. J. Immunol., 1997, 27, 2340-2344; Moldoveanu et al., Vaccine, 1988, 16, 1216-1224, Krieg et al., Nature, 1995, 374, 546-549;
Klinman et al., PNAS USA, 1996, 93, 2879-2883; Bailas et al., J. Immunol., 1996, 157, 1840-1845; Cowdery et al., J Immunol., 1996, 156, 4570-4575; Halpern et al., Cell. Immunol., 1996, 167, 72-78; Yamamoto et al., Jpn. J. Câncer Res., 1988, 79, 866-873; Stacey et al., J Immunol., 1996, 157, 2116-2122; Messina et al., J. Immunol., 1991, 147, 1759-1764; Yi et al., J Immunol., 1996, 157, 4918-4925; Yi et al., J. Immunol., 1996, 157, 5394-5402; Yi et al., J. Immunol., 1998, 160, 4755-4761; e Yi et al., J. 12
Immunol., 1998, 160, 5898-5906; Pedidos de Patente Internacional WO96/02555, W098/16247, WO98/18810, W098/40100, W098/55495, W098/37919 e W098/52581) i. e. contendo pelo menos um dinucleótido CG, sendo 5-metilcitosina utilizada opcionalmente em vez de citosina; (9) um éter de polioxietileno ou um éster de polioxietileno e. g. documento W099/52549; (10) um tensioactivo de éster de polioxietileno sorbitano em combinação com um octoxinol (documento W001/21207) ou um tensioactivo de éter ou éster de alquilo de polioxietileno em combinação com pelo menos um tensioactivo não iónico adicional, tal como um octoxinol (documento WO01/21152); (11) uma saponina e um oligonucleótido imunoestimulador (e. g. um oligonucleótido CpG) (documento WO00/62800); (12) um imunoestimulante e uma partícula de sal de metal, e. g., documento WO00/23105; (13) uma saponina e uma emulsão óleo-em-água, e. g., documento W099/11241; (14) uma saponina (e. g. QS21) + 3dMPL + IL-12 (opcionalmente + um esterol), e. g., documento W098/57659; (15) outras substâncias que actuam como agentes imunoestimulantes para aumentar a eficácia da composição. Exemplos de adjuvantes adicionais que podem ser utilizados incluem os Adjuvantes Montanide ISA 50, Hunter's TiterMax, e Gerbu. Células produtoras de anticorpo preferidas para utilização na invenção incluem células B, células T e células estaminais. Estas células produtoras de anticorpo para utilização na invenção podem ser recuperadas por remoção de quaisquer componentes celulares adequados do sistema imunitário do animal. De um modo preferido, as células produtoras de anticorpo são recuperadas do animal por remoção do baço, nódulos linfáticos ou medula óssea, ou porções destes. Estes podem ser apresentados numa suspensão de célula única de acordo com o passo b) do método da invenção através de qualquer meio adequado. De um modo 13 preferido, tecido de baço, nódulos linfáticos ou medula óssea removidos do animal são apresentados numa suspensão de célula única por rebentamento mecânico ou digestão enzimática com proteases. Os glóbulos vermelhos podem ser removidos da suspensão celular por lise hipotónica.
De um modo preferido, a linha celular imortalizada especificada no passo c) do método da invenção é uma linha celular de hibridoma produzida por fusão somática das células na suspensão de células únicas com células de mieloma. As células na suspensão de células únicas são fundidas com células de mieloma com um fusogénio. Exemplos de células de mieloma que podem ser utilizadas incluem SP2, NS1 e NSO. De um modo preferido, o fusogénio é PEG, um vírus ou um método de electrofusão (Zimmermann et al. 1990).
As células de hibridoma produzidas pela fusão da suspensão de células únicas com as células de mieloma devem ser cultivadas. De um modo preferido, as células de hibridoma são inicialmente cultivadas num meio selectivo, tais como Azaserina hipoxantina ou Hipoxantina aminopterina timidina, e são então transferidos para um meio não selectivo. De um modo preferido, as células de hibridoma são cultivados em meio selectivo durante 7 dias e são então transferidas para um meio não selectivo durante 3 dias. Isto assegura que a taxa de crescimento das células aumenta antes do passo de rastreio De um modo preferido, os passos envolvidos na produção de hibridoma são realizados roboticamente de modo a acelerar o processo. Os Exemplos apresentam um modo de realizar os passos envolvidos na produção de hibridomas roboticamente. 14
Alternativamente, a linha celular imortalizada pode ser uma linha celular criada por infecção das células na suspensão de células únicas com um vírus imortalizante. De um modo preferido, o vírus imortalizante é o vírus Epstein-Bar (ver, por exemplo, Epstein Barr Virus Protocols, Eds. Wilson e May, Humana Press; ISBN: 0896036901). O passo d) do método da invenção compreende rastrear o sobrenadante da linha celular imortalizada, de um modo preferido uma linha celular de hibridoma, contra um chip de proteínas compreendendo um antigénio candidato com o qual o animal foi imunizado. Como aqui utilizado, o termo "chip de proteína" é utilizado para compreender qualquer microarray constituído por um meio de suporte ao qual um antigénio candidato foi ancorado.
Quando mais do que um antigénio purificado foi introduzido no animal, cada antigénio purificado pode ser apresentado numa posição diferente no chip de proteína, de um modo preferido numa posição pré-determinada. Cada posição no chip de proteína pode, assim, apresentar um antigénio diferente. Alternativamente, o mesmo antigénio pode ser ancorado a cada posição numa linha ou coluna de um chip de proteínas com um antigénio diferente a ser apresentado em cada linha ou coluna. Em alguns casos, pode ser desejável, mesmo quando o animal foi imunizado com mais do que um antigénio purificado, possuir um chip diferente para cada antigénio. Um chip de proteínas pode possuir um número grande, tal como entre 1 e 1000 antigénios purificados, ancorados em posições pré-determinadas num chip.
Qualquer tipo de chip de proteína conhecido na técnica pode ser utilizado no método da invenção. Por exemplo, o chip de proteína pode ser uma lâmina de vidro à qual o antigénio ou 15 antigénios purificados são ancorados. Quando apenas um antigénio é testado, uma tal lâmina pode ser preparado simplesmente revestindo lâminas de vidro de microscópio com aminossilano (Ansorge, Faulstich), adicionando uma solução contendo antigénio à lâmina e secando. As lâminas revestidas com aminossilano podem ser obtidas de Telechem e Pierce para revestimento com o antigénio purificado. De um modo preferido, uma tal lâmina de vidro pode ser revestida com (6-amino-hexil)aminossilano.
Podem ser utilizados outros tipos de chip de proteínas cujo método da invenção incluem uma pilha de gel 3D (Arkenov et al., 2000) e chips de micropoços. Como será óbvio para o leitor especialista, tipos de chip de proteínas que ainda não foram concebidas, mas que são prováveis no futuro podem provar serem adequadas para utilização de acordo com a presente invenção. O termo "chip de proteína" inclui também microarrays de células que expressam ADNc definidos (Ziauddin et al., 2001) aqui referidos como "chips de células". Nesta técnica, células de mamífero são cultivados numa lâmina de vidro impressa numa localização definida com diferentes ADNc. As células que crescem nas localizações impressas incorporam e expressam os ADNc. Os chips de células são particularmente úteis quando o animal foi injectado com um ADNc ou uma biblioteca de ADNc ou com um virião recombinante ou viriões produzidos de uma biblioteca de ADNc, como descrito acima. Nesses casos, as proteínas codificadas pelas sequências de ADNc podem não ter sido isoladas. Injectando o animal com ADNc codificando as proteínas ou viriões recombinantes expressando os ADNc, é possível produzir anticorpos monoclonais contra as proteínas expressas pelos ADNc. Se os mesmos ADNc são expressos utilizando um chip de células, estes anticorpos irão ligar-se e a ligação pode ser detectada 16 como descrito abaixo. Desde que esteja disponível uma sequência de ácido nucleico codificando a proteína, a invenção permite, deste modo, a detecção e o isolamento de um anticorpo monoclonal contra essa proteína que pode ser utilizado para purificar a própria proteína.
Para a selecção de anticorpos, ou selecção de linhas celulares imortalizadas que produzem esses anticorpos, o sobrenadante da linha celular ou linhas celulares imortalizadas é colocado no chip de proteína ou chip de proteínas em posições definidas no chip. A colocação dos sobrenadantes é, de um modo preferido, realizada roboticamente, por exemplo com um dispositivo de aplicação de arrays Genemachines Ominigrid, utilizando pinos Telechem. De um modo preferido, os sobrenadantes colocados no chip de proteína ou chip de proteínas contêm glicerol para minimizar a secagem e fixação dos anticorpos na lâmina. Por exemplo, pode ser utilizado 0 a 99,9% de glicerol. 0 chip é então lavado para remover qualquer sobrenadante não ligado. Nesta fase, qualquer anticorpo monoclonal produzido pela linha celular imortalizada e desse modo no sobrenadante pode ser ligado a um antigénio no chip.
Utilizando condições de eluição diferentes, o método permite a quantificação aproximada da afinidade de ligação do anticorpo monoclonal ao seu parceiro de ligação. Agentes de eluição que podem ser utilizados incluem agentes caotrópicos, tais como cloridrato de guanidina ou ureia a concentrações entre 10 pmolar e 8 molar ou etilenoglicol numa solução aquosa de 0,01% até 100% p/v. Também podem ser realizadas eluições utilizando soluções aquosas ou não aquosas de glicina a concentrações entre 0,01 molar e uma solução saturada (de um modo preferido 200 mM), a um pH entre pH 9 e pH 1, de um modo preferido pH 3,2. Podem 17 ser realizadas eluições a pH elevado utilizando soluções aquosas ou não aquosas de trietilamina entre 1 pmolar e uma solução saturada, de um modo preferido 100 mM, a um pH entre pH 8 e pH 13, de um modo preferido pH 11,5. O passo e) do método da invenção envolve a selecção de um anticorpo monoclonal que se liga ao antigénio. De um modo preferido, este passo incorpora um passo de detecção, tal como por adição de um marcador que se irá ligar ao anticorpo monoclonal ligado e indicar a sua presença. De um modo preferido, o marcador é marcado com um marcador, tal como um marcador enzimático ou fluorescente que permite que a sua presença seja detectada. Por exemplo, o marcador pode ser proteina A marcada ou proteína G marcada. A proteína A ou proteína G pode ser marcada com um marcador fluorescente, tal como Cy3 ou Cy5. Alternativamente, a proteína A ou proteína G pode ser marcada com um marcador enzimático, tal como biotina, cuja presença pode ser detectada ligando a estreptavidina o avidina marcada.
De um modo preferido, o marcador é um anticorpo que se irá ligar ao primeiro anticorpo. De um modo preferido, este anticorpo é marcado com um marcador, tais como um marcador enzimático ou fluorescente. De um modo preferido, este anticorpo é marcado com marcadores fluorescentes, na medida em que estes permitem que seja utilizado equipamento desenvolvido para rastreio de chips de ADN, para detecção.
De um modo preferido, o passo de detectar um anticorpo monoclonal ligado ao antigénio compreende ainda determinar o isotipo dos anticorpos monoclonais. De um modo preferido, este passo de detectar e determinar o isotipo dos anticorpos 18 monoclonais compreende adicionar anticorpos anti-imunoglobulina específicos para o isotipo ao referido chip de proteína, em que cada anticorpo anti-imunoglobulina possuindo uma especificidade de isotipo diferente possui um marcador diferente, e detectar a presença dos referidos marcadores. Este método permite a detecção simultânea do anticorpo monoclonal e a determinação do seu isotipo.
Será entendido que o método pode empregar tantos anticorpos anti-imunoglobulina específicos para o isotipo diferentes, cada um com um marcador diferente, quantos isotipos do anticorpo existem no animal que foi imunizado. Por exemplo, se um mamífero, tal como um murganho, foi injectado com um antigénio, o passo de detectar e determinar o isotipo dos anticorpos monoclonais ligados ao antigénio pode compreender adicionar um anticorpo anti-IgA marcado com um primeiro marcador, e/ou um anticorpo anti-IgD marcado com um segundo marcador, e/ou um anticorpo anti-IgE marcado com um terceiro marcador, e/ou um anticorpo anti-IgGl marcado com um quarto marcador, e/ou um anticorpo anti-IgG2a marcado com um quinto marcador, e/ou um anticorpo anti-IgG2b marcado com um sexto marcador, e/ou um anticorpo anti-IgG3 marcado com um sétimo marcador, e/ou um anticorpo anti-IgG4 marcado com um oitavo marcador, e/ou um anticorpo anti-IgM marcado com um nono marcador.
Alternativamente, o passo de detectar e determinar o isotipo dos anticorpos monoclonais ligados ao antigénio pode compreender adicionar anticorpos anti-imunoglobulina específicos para o isotipo que se ligam a um subconjunto dos isotipos possíveis. De um modo preferido, os anticorpos anti-imunoglobulina específicos para o isotipo compreendem um anticorpo anti-IgM marcado com um primeiro marcador e um anticorpo anti-IgG marcado com um segundo 19 marcador. De um modo preferido, os marcadores são marcadores fluorescentes. A detecção do marcador indica a presença de um anticorpo monoclonal ligado a um antigénio e é, de um modo preferido, realizada roboticamente. Embora o marcador seja um marcador fluorescente, a detecção do marcador e, desse modo, a presença do anticorpo monoclonal pode ser realizada utilizando equipamento disponível para rastrear o chip de proteínas. Por exemplo, o rastreio dos chips pode ser realizado com um GenePix 4000B scanner (Axon Instruments, Inc.) ou com um Tecan LS200 ou LS400 scanner. O rastreio pode ser realizado com 1 a 4 lasers e combinações de filtros para permitir a visualização de múltiplos marcadores de fluorescência. De um modo preferido, a visualização de múltiplos marcadores de fluorescência é realizada simultaneamente, embora possa ser realizada sequencialmente.
As imagens podem ser obtidas e analisadas utilizando software apropriado, tal como o software GenePix Pro (Axon Instruments, Inc.), software Chipskipper (Schwager, Ansorge) ou software Tecan LS200 ou LS400.
De modo a assegurar que a detecção de um anticorpo monoclonal é fiável, o método de rastreio, de um modo preferido, emprega vários controlos. Por exemplo, no caso de um chip de proteínas revestido com um antigénio, não serão apenas os sobrenadantes das linhas celulares imortalizadas produzidas pelo método da invenção a serem identificados no chip de proteína mas também o serão os controlos positivos e negativos. 20
Os controlos positivos podem estar na forma de anticorpos monoclonais ou policlonais previamente testados ou disponíveis comercialmente. Alternativamente, os controlos positivos podem consistir em soro diluído ou não diluído previamente recolhido do murganho imunizado num período adequado após o reforço ou no momento em que o animal é sacrificado para a recolha da fonte de células B.
Os controlos negativos podem estar na forma de sobrenadantes simulados em posições definidas. Outro nível de controlo é determinado pelo facto de cada sobrenadante ser rastreado contra vários antigénios. Os sinais obtidos contra apenas um antigénio são considerados como sobrenadantes contendo anticorpo monoclonal potencial positivo.
Os sinais positivos no chip de proteína podem ser rastreados até uma linha celular imortalizada particular permitindo que o anticorpo monoclonal seja isolado de acordo com o passo e) do método da invenção. Pode ser realizada uma caracterização posterior dos anticorpos identificados. Métodos para realizar a caracterização posterior do anticorpo podem incluir, por exemplo, o passo posterior de determinar a especificidade dos anticorpos monoclonais identificados. Por exemplo, um anticorpo monoclonal identificado pelo método da invenção pode ser utilizado para rastrear um segundo chip de proteína possuindo um número grande de proteínas diferentes ancoradas à sua superfície, para estabelecer se o anticorpo monoclonal se liga especificamente a um antigénio. Os métodos de rastreio descritos acima na identificação inicial da proteína podem ser utilizados para rastrear a sua especificidade. A especificidade e afinidade de ligação dos 21 anticorpos monoclonais produzidos pelo método da invenção podem ser, ainda, caracterizadas alterando as concentrações do antigénio no chip de proteínas ou alterando a restringência de condições de eluição, como descrito acima.
De acordo com outra forma de realização do primeiro aspecto da invenção, é proporcionado um método para produzir um banco de linhas celulares imortalizadas que produzem uma pluralidade de anticorpos monoclonais de interesse, compreendendo o referido método os passos de: a) introduzir uma pluralidade de antigénios candidatos num animal ou animais; b) recuperar células produtoras de anticorpo do referido animal ou animais e colocar essas células numa suspensão de célula única; c) produzir linhas celulares imortalizadas da suspensão de célula única; d) rastrear o sobrenadante das referidas linhas celulares imortalizadas contra um chip de proteínas no qual são apresentados os antigénios candidatos; e e) seleccionar linhas celulares imortalizadas, que produzem sobrenadantes contendo anticorpos que se ligam aos referidos antigénios.
As linhas celulares imortalizadas produzidas por esse método são de imensa utilidade na criação de anticorpos com especificidades de construção à medida das necessidades. 22
Os antigénios candidatos são, de um modo preferido, antigénios candidatos purificados, como descrito acima. Processos adequados para introduzir os antigénios candidatos no animal, recuperar células de produção de anticorpo, produzir linhas celulares imortalizadas e rastrear o sobrenadantes das linhas celulares imortalizadas são descritos acima.
Métodos da técnica anterior envolvem processos laboriosos e demorados para criar e rastrear um anticorpo monoclonal contra um único antigénio. Em contraste, este método permite a criação e rastreio de elevada produtividade de anticorpos monoclonais contra uma pluralidade de antigénios simultaneamente. A utilização de um chip de proteínas para realizar rastreio de elevada produtividade dos anticorpos é mais eficiente e mais rigorosa do que a utilização de ensaios convencionais e requer menos antigénio candidato.
De um modo preferido, o passo e) desta forma de realização compreende ainda determinar o isotipo dos anticorpos monoclonais, como descrito acima. Isto proporciona uma vantagem adicional sobre os métodos da técnica anterior que não revelam a detecção e isotipagem simultâneas de anticorpos monoclonais. A invenção proporciona anticorpos monoclonais. A invenção pode também ser utilizada para criar um banco de anticorpos, por exemplo, com especificidades compreendendo um proteoma do organismo inteiro. Um tal banco de anticorpos representa um outro aspecto da invenção. A invenção também proporciona linhas celulares imortalizadas; de um modo preferido linhas celulares de 23 hibridoma, que produzem anticorpos monoclonais. A invenção também proporciona um banco de linhas celulares imortalizadas, de um modo preferido, um banco de linhas celulares de hibridoma. A invenção pode também ser utilizada para criar um banco de linhas celulares de hibridoma, por exemplo, que produzem anticorpos compreendendo um proteoma do orqanismo inteiro.
De acordo com um quarto aspecto da invenção, é proporcionado um método para produzir uma pluralidade de anticorpos monoclonais, cada um dos quais se liga a um antigénio candidato purificado diferente, compreendendo introduzir uma pluralidade de antigénios candidatos purificados num animal.
De um modo preferido, cada antigénio candidato é derivado de uma fonte diferente. Por isto, entende-se que cada antigénio é derivado de uma proteína diferente, um ácido nucleico diferente e assim por diante. Entende-se que métodos de produção de anticorpo que envolvem injectar um animal com fragmentos diferentes da mesma proteína são excluídos do âmbito deste aspecto da invenção. Por exemplo, os antigénios candidatos purificados podem ser todos substâncias proteicas desde que não sejam todos fragmentos da mesma proteína.
Este método possui uma vantagem em relação aos métodos revelados na técnica anterior, na medida em que permite a produção simultânea de mais do que um anticorpo monoclonal, cada um dos quais se liga a um antigénio candidato purificado diferente. 0 animal pode ser injectado com os antigénios candidatos purificados utilizando qualquer uma das técnicas aqui descritas.
Por exemplo, o método deste aspecto da invenção pode ainda 24 compreender os passos de recuperar células produtoras de anticorpo tais como células B, células T e células estaminais de um animal imunizado, tais como por remoção do tecido do baço, nódulos linfáticos ou medula óssea, e tornando-os numa suspensão de célula única. 0 método pode ainda compreender criar linhas celulares imortalizadas, de um modo preferido, linhas celulares de hibridoma, a parir das células da suspensão de células únicas. De um modo preferido, o método deste aspecto da invenção compreende estes passos e adicionalmente compreende os passos de rastrear o sobrenadantes das linhas celulares imortalizadas, de um modo preferido, linhas celulares de hibridoma, contra um chip de proteínas ou chips de proteínas no qual são apresentados os antigénios candidatos; e seleccionar anticorpos monoclonais que se ligam aos antigénios e, de um modo preferido, isolar estes e/ou as linhas celulares imortalizadas que produzem os anticorpos monoclonais. Processos adequados para criar as linhas celulares imortalizadas e subsequente rastreio dos sobrenadantes são iguais aos descritos acima em relação ao método do primeiro aspecto da invenção. Em particular, o passo de detectar os anticorpos monoclonais pode envolver a detecção simultânea dos anticorpos monoclonais e a determinação deste isotipo, como descrito acima. Adicionalmente, o método pode compreender a caracterização posterior dos anticorpos monoclonais, como descrito acima. A invenção também proporciona um anticorpo monoclonal produzido por um método deste aspecto da invenção. Novamente, Este aspecto da invenção pode ser utilizado para criar um banco de anticorpos, por exemplo, compreendendo anticorpos com especificidade para proteína num proteoma de um organismo inteiro. Um tal banco de anticorpos representa a outro aspecto da invenção. 25 A invenção também proporciona uma linha celular imortalizada, de um modo preferido uma linha celular de hibridoma, que produz um anticorpo monoclonal como descrito acima. A invenção pode também ser utilizada para criar um banco de linhas celulares imortalizadas, de um modo preferido um banco de linhas celulares de hibridoma, por exemplo, que produzem anticorpos compreendendo um proteoma do organismo inteiro.
De acordo com um quinto aspecto da invenção, podem ser criados anticorpos anti-idiotipo que se ligam a um anticorpo monoclonal de acordo com o segundo aspecto da invenção. Os anticorpos anti-idiotipo são úteis, na medida em que possuem uma região variável que mimetiza a forma da molécula para a qual o anticorpo original foi criado. Os anticorpos anti-idiotipo podem, por isso, ser úteis em terapia como substituintes para as moléculas contra as quais o anticorpo original foi criado. Um anticorpo anti-idiotipo pode ser produzido empregando o método do primeiro aspecto da invenção ou o quarto aspecto da invenção utilizando um anticorpo monoclonal, de acordo com o segundo aspecto da invenção, como o antigénio candidato purificado.
Consequentemente, este aspecto da invenção proporciona um método de produzir um anticorpo anti-idiotipo que se liga a um anticorpo monoclonal de acordo com o segundo aspecto da invenção, compreendendo o método utilizar um anticorpo monoclonal de acordo com o segundo aspecto da invenção como o antigénio candidato purificado num método do primeiro aspecto da invenção ou o quarto aspecto da invenção. A invenção também inclui anticorpos anti-idiotipo criados por esses métodos. 26
De acordo com um sexto aspecto da invenção, pode ser criados anticorpos anti-anti-idiotipo que se ligam a um anticorpo anti-idiotipo produzido de acordo com o quinto aspecto da invenção. Esses anticorpos anti-anti-idiotipo podem ser produzidos empregando o método do primeiro aspecto da invenção ou o quarto aspecto da invenção utilizando um anticorpo anti-idiotipo como descrito acima como o antigénio candidato purificado. Este aspecto da invenção proporciona assim um método de produzir um anticorpo anti-anti-idiotipo que se liga a um anticorpo anti-idiotipo criado de acordo com o quinto aspecto da invenção, compreendendo o método utilizar um anticorpo anti-idiotipo como descrito acima como o antigénio candidato purificado num método do primeiro aspecto da invenção ou o quarto aspecto da invenção. Vários aspectos e formas de realização da presente invenção serão agora descritos em mais detalhe a titulo de exemplo. Será entendido que a modificação de detalhes pode ser realizada sem se afastar do âmbito da invenção.
Breve descrição das Figuras:
Figura 1: Imagem total do chip digitalizado, onde os pontos verdes e vermelhos representam sobrenadantes produzindo IgG e IgM positivos, respectivamente. As ampliações servem para apresentar detalhes de áreas especificas do chip em que se encontram pontos bons.
Figura 2: Comparação entre análise por chip e rastreio por ELISA. A primeira imagem é uma amostra negativa (Ia <0,5), enquanto que as outras são positivas. Ic Média: Intensidade 27 media total do ponto em 3 chips. Ia: Contribuição média do ponto para a soma das intensidades nos três chips (%).
Figura 3: Comparação da contribuição para a intensidade total (%) dos sobrenadantes da cultura rastreados por ELISA () ou por análise com chip (□) para ligação ao antigénio B5 (Figura 3A). Os valores de fundo são apresentados na Figura 3B. São apresentados vários sobrenadantes positivos identificados por análise com chip e/ou ELISA.
Figura 4: Comparação da contribuição para a intensidade total (%) dos sobrenadantes da cultura rastreados por ELISA () ou por análise com chip (□) para ligação ao antigénio B5 (Figura 4A). Os valores de fundo são apresentados na Figura 4B. É apresentado um único sobrenadante positivo identificado por análise com chip e ELISA.
Figura 5: Comparação da contribuição para a intensidade total (%) dos sobrenadantes da cultura rastreados por ELISA () ou por análise com chip (□) para ligação ao antigénio Ket94/95 (Figura 5A) . Os valores de fundo são apresentados na Figura 5B. São apresentados vários sobrenadantes positivos identificados por análise com chip e/ou ELISA.
Figura 6: Comparação da contribuição para a intensidade total (%)dos sobrenadantes da cultura rastreados por ELISA () ou por análise com chip (D)para ligação ao antigénio Ket94/95 (Figura 6A) . Os valores de fundo são apresentados na Figura 6B. Não foram identificados sobrenadantes positivos nem por ELISA nem por análise com chip. 28
Exemplos
Exemplo 1: Imunização com 10 antigénios de proteína Imunização
Um murganho Balb/c fêmea de 8 semanas de idade foi injectado intraesplenicamente com 10 pg de cada um de 10 antigénios de proteína em 100 pL de soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS). No terceiro dia (dia 3) após o murganho ter sido injectado intraperitonealmente com 1 pg de cada um dos mesmos 10 antigénios de proteína em 100 pL de PBS. No dia 5, o mesmo murganho foi injectado intravenosamente com 0,1 pg de cada um dos mesmos 10 antigénios de proteína. No dia 8, o murganho foi morto por deslocamento cervical e o baço foi removido e recolhido para meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM: Life Technologies Inc.).
Fusão
Todos os passos são realizados em condições de esterilidade ou assepsia numa câmara de fluxo laminar. O baço foi colocado numa suspensão de células únicas por rebentamento mecânico entre duas lâminas de microscópio de vidro com as extremidades foscas. A suspensão foi filtrada para um tubo de fundo cónico, de 50 mL, com código de barras (BD Falcon) através de um coador de células de nylon de 70 pm (BD Falcon) e transferido para o sistema robótico. 29
Separadamente, foram cultivados parceiros de fusão de mieloma SP2 (ATCC) durante cinco dias antes da fusão em HM20 (DMEM, soro de bovino fetal definido a 20% (Hyclone Defined), L-Glutamina a 10 mM, Gentamicina a 50 μΜ) e no dia da fusão foram transferidos para HM20/HCF/2xOPI (HM20 contendo Factor 10% de Clonagem de Hibridoma (Origen) e suplemento de clonagem de OPI a 2% (Sigma) ) durante pelo menos uma hora a 37 °C numa incubadora de C02 a 5%.
Os códigos de barras foram lidos por um leitor de código de barras e o tubo Falcon de 50 mL foi colocado no rotor pelo braço RoMa no sistema genesis Freedom (Tecan). O rotor foi colocado na centrífuga através da plataforma de trabalho. 0 tubo foi centrifugado a 100 g durante 10 min à temperatura ambiente (TA) e o rotor foi retirado da centrífuga. O tubo foi retirado do rotor e o código de barras foi novamente lido para distinguir do tubo de equilíbrio. As células foram ressuspensas em 5 mL de Tampão de Lise de Eritrócitos (Sigma) durante 9 minutos à TA. Foi adicionado HM20 até 50 mL e o tubo foi novamente centrifugado durante 10 min à TA sem travão. A solução de sobrenadante foi removida por aspiração e as células foram ressuspensas em DMEM pré-aquecido a 37 °C. As células foram lavadas mais duas vezes por passos de centrifugação e ressuspensão. Foram pipetados roboticamente 50 pL da suspensão de células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. As células foram contadas utilizando uma câmara de contagem de hemacitómetro.
Simultaneamente, as células de SP2 foram lavadas três vezes de um modo semelhante e uma aliquota semelhante (50 pL) foi 30 "distribuído manualmente" para um tubo de 1,5 mL para contagem hemacitométrica. Foram misturados mielomas SP2 e células do baço numa proporção de 1:5 (SP2:Baço) e novamente centrifugadas a 100 g for durante 10 min sem travão. A solução de sobrenadante foi totalmente removida por aspiração e foi pipetada roboticamente por Poletilenoglicol 1500 em HEPES a 50% (PEG: Roche Molecular Biochemicals) , pré-aquecido a 37 °C, suavemente e progressivamente durante 1 min, com rotação a 450 rpm num agitador Te-shake (Tecan AG), para assegurar uma mistura homogénea. A mistura células/PEG foi incubada durante 1 min a 37 °C com agitação moderada. Foi adicionado, de modo semelhante, 1 mL de DMEM durante 1 min a 37 °C com agitação semelhante. A mistura foi incubada durante 1 min a 37 °C com agitação moderada. Foi adicionado roboticamente mais 1 mL de DMEM durante 1 min a 37 °C com agitação moderada e incubado de modo semelhante durante mais um minuto. Foram adicionados roboticamente mais 7 mL de HM20 durante 3 min a 37 °C com agitação moderada. O tubo foi, então, centrifugado a 90 g durante 5 min, com travão. O sobrenadante foi removido por aspiração e o sedimento foi ressuspenso em 20 mL de HM20/HCF/OPI/AH (HM20/HCF/OPI mais Azaserine Hipoxantina a 10% (Sigma). O tubo cónico foi novamente colocado na plataforma de trabalho do robot e a mistura celular pastosa de pós-fusão foi aspirada por cada uma das oito pontas de pipeta de abertura larga, do braço de manipulação de líquidos do robot. Foi, então, pipetado 200 pL da pasta celular para cada poço de uma placa de poços fundos de 96 poços (Greiner Masterblock). 31 A placa de poços fundos foi então transferida roboticamente para um robot de pipetagem de 96 poços TeMo integrada na plataforma de trabalho do Genesis e utilizada como uma fonte de placas para plaquear em 20 placas estéreis de cultura de tecidos de 96 poços. A mistura de pós-fusão foi então plaqueada roboticamente para 20 placas estéreis de 96 poços (Nunc) a partir de um carrossel ligado e integrado no robot a 100 pL/poço e transferida roboticamente para uma incubadora integrada a 37 °C com CO2 a 10% através da câmara-de-ar integrada. As placas foram armazenadas num carrossel contido na incubadora.
Cultura Celular
No terceiro dia após a fusão, as células foram transportadas roboticamente da incubadora para a plataforma de trabalho e foram adicionados mais 100 pL de HM20/HCF/OPI/AH roboticamente. As placas foram então roboticamente colocadas de volta na incubadora.
No dia 7, as placas foram transportadas uma vez mais, de modo semelhante, da incubadora para a plataforma de trabalho e foi removido por aspiração 200 pL/poço de sobrenadantes de cultura e substituído com 150 pL de HM20/HCF fresco.
No dia 11, as placas foram novamente transportadas roboticamente para a plataforma de trabalho e foi recolhido 30 pL do sobrenadante de cada poço (Temo head: Tecan Inc.) e transferido para placas de 384 poços fornecidas à plataforma de trabalho por um empilhador de placas em carrossel (Tecan Inc) . 32
Rastreio de microarray Lâminas de vidro revestidas com aminossilano foram revestidas homogeneamente com antigénio purificado adicionando gota-a-gota 40 pL de ddH20 contendo 1-5 pg de antigénio e cobrindo com uma lamela de 22*60 mm durante 60 min numa câmara húmida à TA.
As lâminas revestidas foram lavadas brevemente em PBS e bloqueadas durante 60' em leite a 5% em PBS, Tween a 0,1%, depois lavadas durante 10' em PBS. Os chips foram então secos por centrifugação, 10" a 2000 rpm.
Os sobrenadantes da cultura foram consolidados em placas de 384 poços utilizando um robot Beckman Biomek FX.
Os sobrenadantes da cultura foram impressos individualmente em três lâminas revestidas com antigénio idênticas a uma densidade de 9600 pontos por chip e um tamanho de ponto de ~120 pm utilizando uma impressora de microarrays GeneMachines OmniGrid.
Os chips de microarray foram incubados numa câmara húmida durante 60', à TA e depois lavados 5x5' em PBS-Tween a 0,1% (PBST).
Foram diluídos 1:1000 em PBST 40 pL de anticorpos específicos para IgG anti-murganho de cabra conjugados com Cy3 e específicos para IgM anti-murganho de cabra conjugados com Cy5, 33 misturados e aplicados uniformemente aos chips e cobertos com lamelas de 22x60 mm e incubadas numa câmara húmida, durante 30' à TA. Os chips foram então lavados 2 x 10' em PBST, 2 x 10' em PBS e 1 x 10' em ddtbO. Os chips foram secos por centrifugação a 2000 rpm durante 10".
Recolha de pontos positivos
Os chips foram rastreados com um digitalizador GenePix 4000B (Axon Instruments), a uma resolução de 10 pm.pixel-1. As voltagens de PMT foram 540 V e 610 V, para os canais Cy3 e Cy5, respectivamente. Ambos os lasers foram colocados numa intensidade de 100%. A cada chip rastreado foi atribuída e ajustada uma grelha, e todos os pontos foram analisados pelo GenePix Pro 3.0 (Axon Instruments).
Todos os chips foram analisados pelo software GenePix Pro 3.0 e foi recolhida, para cada chip, a informação relativa à intensidade corrigida (Ic) de cada ponto (Mediana de intensidades - Fundo), para os canais Cy3 e Cy5. Destes resultados, foi obtido, para cada chip, a contribuição de cada ponto para a
Os
Intensidade Corrigida total de cada canal três valores de cada canal foram ponderados para a média de cada ponto, e esta Intensidade Corrigida Média (Ia) foi utilizada para a análise final do conjunto de dados. Considerou-se como "provavelmente positivas" as amostras daqueles que possuem um valor acima de 0,5% e como "seguramente positivas", todas as amostras que apresentam um valor superior a 1,5%. 34
Processamento Pós-Rastreio
As células de poços positivos foram ressuspensas no poço e foram transferidos 20 pL para uma placa de 96 poços profundos previamente cheios com 1,5 mL de HM20/HCF e devolvidos para a incubadora durante 48 h a 37 °C, C02 a 5%.
Foi transferido 1,4 mL de sobrenadante de cada cultura para outra placa de poços fundos e os 100 pL restantes foram utilizados para ressuspender as células que foram então transferidas para um frasco de congelação contendo soro de bovino fetal a 90%/DMSO a 10% (Sigma) e transferido para -80 °C durante 2 h e dai para armazenamento em azoto liquido. O sobrenadante da cultura foi então utilizado para avaliação e posterior caracterização do anticorpo monoclonal criado.
Resultados:
Os resultados do rastreio de microarray são apresentados na Figura 1. Esta Figura demonstra que foram detectados vários anticorpos monoclonais positivos como ligados a antigénios candidatos na lâmina. Os pontos verdes são anticorpos monoclonais IgG que se ligam aos antigénios candidatos, enquanto que os pontos vermelhos são anticorpos monoclonais IgM que se ligam aos antigénios candidatos. A Figura 1 demonstra assim que o método da invenção pode ser utilizado para identificar simultaneamente anticorpos monoclonais que se ligam aos 35 antigénios candidatos e aos isotipos destes anticorpos monoclonais.
Quando uma experiência comparativa foi realizada utilizando ELISA em vez de um chip de proteínas, vários anticorpos monoclonais identificados como ligados aos antigénios candidatos no rastreio de microarray não foram identificados como ligados aos antigénios candidatos utilizando ELISA, como apresentado na Figura 2 (ver comparação de resultados de microarray com os resultados de ELISA). Um sobrenadante que se observou ser negativo utilizando rastreio de microarray (Ia:0,234) também se verificou ser negativo utilizando ELISA. Todavia, dos quatro sobrenadantes que se determinaram serem positivos utilizando rastreio de microarray (Ia: 5,18, 1,96, 3,64 e 2,02), apenas dois se determinaram serem positivos utilizando ELISA (ver Figura 2) . É importante notar como os sobrenadantes que foram negativos na experiência de ELISA podem ser, na verdade, amostras positivas quando detectadas pela abordagem mais precisa e sensível dos microarrays.
Exemplo 2: Imunização com nove antigénios Imunização:
Um murganho foi injectado com 25 pg de nove antigénios, incluindo 25 pg de uma fusão dos antigénios B5 e Ket94/95, sendo cada antigénio misturado com 10 pg de ADN de CpG e adsorvido a outro adjuvante de alúmen (Imject Alum da Pierce) . Metade de cada antigénio foi administrado intraperitonealmente e metade subcutaneamente. 36 0 murganho foi reforçado 21 dias mais tarde com 10 pg de cada antigénio misturado com 10 μg de ADN de CpG e adsorvido a adjuvante de alúmen, metade do qual foi administrado intraperitonealmente e metade subcutaneamente.
Cinco dias após o reforço, o baço foi removido.
Fusão e cultura celular
As fusões e cultura celular foram realizadas como descrito no Exemplo 1.
Rastreio de microarray de anticorpos contra B5 e Ket94/95
Uma lâmina de vidro de aminossilano foi homogeneamente revestida com B5 purificado adicionando gota-a-gota 40 pL de ddíbO contendo 5 pg de B5 purificado e cobrindo com uma lamela de 22*60 mm durante 60 min à temperatura ambiente. O mesmo processo foi utilizado para produzir uma lâmina de vidro de aminossilano homogeneamente revestida com Ket94/95 purificado.
As lâminas revestidas foram enxaguadas, bloqueadas, lavadas e secas, como descrito no Exemplo 1, excepto que foi utilizada BSA a 3% em PBS em vez de leite a 5% em PBS para bloquear a lâmina.
Os sobrenadantes da cultura foram consolidados para placas de 384 poços, como descrito no Exemplo 1 e foram impressos em triplicado para a lâmina revestida com B5 e a lâmina revestida com Ket94/95 a uma densidade de cerca de 16000 pontos por chip e 37 um tamanho de ponto de ~150 μπι utilizando uma impressora de microarray Microgrid II 610 (ApogentDiscoveries).
Os chips de microarray foram incubados e foram aplicados anticorpos IgG anti-murganho de cabra conjugado com Cy3 e especifico para IgM anti-murganho de cabra conjugado com Cy5 aos chips como descrito no Exemplo 1.
Recolha de pontos positivos
Os chips foram rastreados utilizando o mesmo processo que no Exemplo 1. Foi calculada uma Intensidade Média Corrigida (Ia) para cada conjunto de sobrenadantes da cultura em triplicado.
Comparação de rastreio de microarray e ELISA
Foi realizada uma experiência comparativa em que cada sobrenadante da cultura foi verificado por ELISA. Cada sobrenadante de cultura foi adicionado a um poço contendo 200 ng de antigénio B5 ou Ket94/95 e a presença de um anticorpo monoclonal que se liga ao antigénio no sobrenadante da cultura foi detectada utilizando uma ELISA convencional.
Foi necessária uma semana para rastrear 5376 sobrenadantes de cultura utilizando ELISA, produzindo 5376 resultados, um para cada sobrenadante. Em contraste, demorou menos de 48 horas para rastrear os mesmos 5376 sobrenadantes de cultura em triplicado utilizando um chip de microarray, produzindo 16128 resultados, demonstrando a eficiência do rastreio de microarray comparado com ELISA. 38
Para além disso, foi necessário apenas 5 pg de antigénio B5 e 5 pg de Ket94/95 para realizar o rastreio de microarray, 5 pg de antigénio por chip. Em contraste, foi necessário 96 pg de antigénio para cada placa de ELISA e foram necessárias cinco placas de ELISA para o rastreio de cada antigénio. 0 rastreio por ELISA foi, por isso, significativamente mais dispendioso e demorado que o rastreio de microarray.
Os resultados obtidos para cada placa de ELISA foram normalizados para proporcionar uma contribuição em percentagem para a intensidade total para cada sobrenadante de cultura. As intensidades ponderadas para a média das réplicas para os mesmos sobrenadantes de cultura obtidos por rastreio de microarray também foram normalizadas de modo a permitir a comparação com os resultados de ELISA.
Quando os sobrenadantes de cultura foram rastreados utilizando ELISA para anticorpos monoclonais que se ligam a B5, foram identificados 53 sobrenadantes positivos em cinco placas de ELISA. 0 rastreio dos mesmos sobrenadantes de cultura utilizando rastreio de microarray identificou 48 sobrenadantes positivos, 90,57% dos sobrenadantes identificados por ELISA. O rastreio de microarray também identificou 4 novos positivos que não foram identificados por ELISA.
Quando os sobrenadantes de cultura foram rastreados utilizando ELISA para ligação de anticorpos monoclonais a Ket94/95, foram identificados 15 sobrenadantes positivos numa única placa de ELISA. O rastreio dos mesmos sobrenadantes de cultura utilizando rastreio de microarray identificou 13 sobrenadantes positivos, 88,66% dos sobrenadantes positivos identificados por ELISA. O rastreio de microarray também 39 identificou 8 novos positivos que não foram identificados por ELISA. É claro, a partir destes resultados, que o rastreio de microarray é, pelo menos, tão eficaz quanto a ELISA na identificação de anticorpos monoclonais que se liqam a um antiqénio especifico. Na verdade, a identificação de sobrenadantes positivos não identificados por ELISA sugere que o rastreio de microarray é mais sensível do que ELISA. 0 rastreio de microarray possuía ainda uma vantagem significativa que é ter permitido a determinação simultânea do isotipo IG ou IgM dos anticorpos monoclonais identificados.
Figura 3A apresenta os valores normalizados da contribuição em percentagem para a intensidade total para cada sobrenadante de cultura numa placa de ELISA () contendo amostras positivas que se ligam a B5, em comparação com os valores normalizados de contribuição em percentagem para os mesmos sobrenadantes de cultura obtidos por rastreio de microarray de uma lâmina revestida com B5 (□) . A Figura 3B apresenta o nível de ruído de fundo nestas experiências. Pode ser observado que os sobrenadantes positivos apresentaram uma maior contribuição em percentagem para a intensidade total, utilizando rastreio de microarray em comparação com ELISA. Como resultado, existiu uma diferença maior entre o ruído de fundo e um sobrenadante positivo no rastreio de microarray em comparação com ELISA, permitindo que os sobrenadantes positivos sejam identificados mais facilmente e com mais precisão. A Figura 4A compara os valores normalizados da contribuição em percentagem para a intensidade total para cada sobrenadante de cultura numa placa de ELISA () contendo uma única amostra positiva que se liga a B5, em comparação com os valores 40 normalizados da contribuição em percentagem para os mesmos sobrenadantes de cultura obtidos por rastreio de microarray numa lâmina revestida com B5 (□) . 0 nivel de ruido de fundo é apresentado na Figura 4B e pode ser observado que a amostra positiva foi mais rapidamente detectável acima do ruido de fundo utilizando o rastreio de microarray, em comparação com ELISA. A Figura 5A compara os valores normalizados da contribuição em percentagem para a intensidade total para cada sobrenadante de cultura na placa de ELISA que se observou conter sobrenadantes positivos que se ligam a KET94/95 (), em comparação com os valores normalizados da contribuição em percentagem para os mesmos sobrenadantes de cultura obtidos por rastreio de microarray numa lâmina revestida com KET94/95- (□) . Os sobrenadantes positivos foram detectáveis mais rapidamente acima do ruido de fundo utilizando o rastreio de microarray, em comparação com ELISA, como apresentado na Figura 5B. A Figura 6A compara os resultados obtidos a partir de uma placa de ELISA () em que não existiam sobrenadantes positivos com os resultados obtidos utilizando o rastreio de microarray (□) dos mesmos sobrenadantes de cultura. Como apresentado na Figura 6B, as leituras em ambos os casos foram devidas ao ruido de fundo.
Estes resultados demonstram que o método da invenção pode ser utilizado para identificar simultaneamente anticorpos monoclonais contra mais do que um antigénio. A utilização de rastreio de microarray no método da invenção é mais rápido, mais barato e mais preciso do que a utilização de métodos de rastreio de anticorpo convencionais, tal como ELISA. 41
Referências
Kilpatrick et al (1997) Hibridoma 16: 381-389 Kohler G, Milstein C (1975) Nature 7: 256:485-7 Lindley et al (2000) J Immunol Methods 234:123-135 Ziaudin J, Sabatini D (2001) Nature 411: 107-110 Zimmermann U. (1990) J Immunol Methods Nov 6; 134(1):43-50
Lisboa, 17 de Agosto de 2007 42
Claims (14)
- REIVINDICAÇÕES 1. Método de elevada produtividade para produzir uma pluralidade de anticorpos monoclonais, cada um dos quais ligando-se a um antigénio candidato diferente, compreendendo o referido método os passos de: a) introduzir uma pluralidade de antigénios candidatos purificados num animal não humano ou animais não humanos; b) recuperar células produtoras de anticorpo do referido animal ou animais e colocar essas células numa suspensão de célula única; c) produzir linhas celulares imortalizadas da suspensão de célula única; d) rastrear o sobrenadantes das referidas linhas celulares imortalizadas contra um chip de proteínas no qual são apresentados os antigénios candidatos; e e) seleccionar anticorpos monoclonais que se ligam aos referidos antigénios.
- 2. Método da reivindicação 1, em que o referido animal é um murganho, um rato, um cobaio ou um coelho.
- 3. Método da reivindicação 1 ou reivindicação 2, em que entre dois e cinquenta antigénios candidatos diferentes purificados são introduzidos no animal ou animais. 1
- 4. Método da reivindicação 3, em que entre 0,001 e 1000 microgramas de cada antigénio é introduzido no animal ou animais.
- 5. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 4, compreendendo o passo adicional de fornecer ao animal ou animais uma dose de reforço de alguns ou todos os antigénios que foram introduzidos no animal ou animais antes da remoção das células que produzem o anticorpo.
- 6. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que as células produtoras de anticorpo são células B, células T ou células estaminais.
- 7. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que as células produtoras de anticorpo são recuperadas por remoção de tecido do baço, nódulos linfáticos ou medula óssea do animal ou animais.
- 8. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que a linha celular imortalizada é uma linha celular de hibridoma produzida por fusão somática das células na suspensão de células únicas com células de mieloma.
- 9. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que o referido chip de proteína é uma lâmina de vidro plana, um chip de pilha de gel em 3D, um chip de micropoços ou um chip de células.
- 10. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que o passo de detectar os anticorpos monoclonais ligados aos 2 antigénios compreende ainda determinar o isotipo dos anticorpos monoclonais.
- 11. Método da reivindicação 10 em que o referido passo de detectar e determinar o isotipo dos anticorpos monoclonais compreende adicionar anticorpos anti-imunoglobulina específicos para o isotipo ao referido chip de proteína, em que cada anticorpo anti-imunoglobulina possuindo uma especificidade para o isotipo diferente possui um marcador diferente, e detectar a presença dos referidos marcadores.
- 12. Método de qualquer uma das reivindicações 1 a 11, compreendendo ainda avaliar a especificidade com a qual cada anticorpo monoclonal isolado se liga a um antigénio utilizando um chip de proteína compreendendo o referido antigénio.
- 13. Método de identificação de uma pluralidade de anticorpos monoclonais, cada um dos quais ligando-se a um antigénio candidato diferente, compreendendo o referido método os passos de: a) rastrear o sobrenadante de linhas celulares imortalizadas contra um ou mais chips de proteína no qual são apresentados os antigénios candidatos; e b) seleccionar os referidos anticorpos monoclonais, anticorpos que se ligam aos referidos antigénios candidatos, sendo o referido método caracterizado por as referidas linhas celulares imortalizadas serem criadas a partir de 3 uma suspensão de célula única produtora de anticorpo que produzem anticorpos contra uma pluralidade de antigénios.
- 14. Método de produzir um banco de linhas celulares imortalizadas que produzem uma pluralidade de anticorpos monoclonais de interesse, cada um dos quais ligando-se a um antigénio candidato diferente, compreendendo o referido método os passos de: a) introduzir uma pluralidade de antigénios diferentes num animal não humano ou animais não humanos; b) recuperar as células produtoras de anticorpo do referido animal ou animais e colocar essas células numa suspensão de célula única; c) produzir linhas celulares imortalizadas da suspensão de célula única; d) rastrear o sobrenadante das referidas linhas celulares imortalizadas contra um chip de proteína no qual são apresentados os antigénios candidatos; e e) seleccionar como linhas celulares imortalizadas, aquelas que produzem sobrenadantes contendo anticorpos que se ligam aos referidos antigénios candidatos. Lisboa, 17 de Agosto de 2007 4
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