PT1313832E

PT1313832E - Sistema surfactante

Info

Publication number: PT1313832E
Application number: PT01964733T
Authority: PT
Inventors: Steven Kritzler; Alex Sava
Original assignee: Novapharm Res Australia
Priority date: 2000-09-01
Filing date: 2001-08-30
Publication date: 2007-01-31
Also published as: WO2002018530A9; ES2275718T3; KR20080042943A; JP2012072409A; JP4896355B2; CN1462307A; EP1313832A4; CN1247754C; CA2421035A1; KR100853257B1; KR100894491B1; BR0113783B1; EP1313832B1; JP2004506812A; AU2005100493A4; AUPQ984400A0; BRPI0113783B8; BR0113783A; US20030220222A1; EP1313832A1

Description

1

DESCRIÇÃO "SISTEMA SURFACTANTE"

ÁREA TÉCNICA A invenção refere-se a um sistema surfactante para utilização em composições aquosas e, mais particularmente, a um sistema surfactante para utilização em, ou para além de, preparações aquosas de limpeza à base de enzimas. A invenção é particularmente vantajosa quando empregue em preparações de limpeza à base de enzimas destinadas a serem utilizadas na limpeza de instrumentos médicos.

TÉCNICA ANTERIOR A invenção é aqui descrita com referência particular a composições para limpeza de instrumentos médicos, mas não se limita a essa utilização. Tal como é aqui utilizado, pretende-se que o termo "instrumentos médicos" inclua genericamente instrumentos cirúrgicos tais como bisturis, instrumentos de biopsias, grampos, endoscópios, colonoscópios, laparoscópios e outra parafernália utilizada para investigação ou intervenção cirúrgica, e outros instrumentos utilizados na prática da medicina, cirurgia e medicina dentária que requerem limpeza, desinfecção ou esterilização. Pretende-se que o termo também inclua instrumentos com requisitos de limpeza semelhantes, como os utilizados em cabeleireiros, tratamentos cosméticos, tatuagens e "piercing" corporal, bem como outras aplicações onde é requerida a remoção de sebo humano/animal e/ou de secreções corporais. Muitos instrumentos médicos são feitos de, ou incorporam, uma variedade de materiais de construção, e as composições de limpeza devem ser tais que não ataquem nenhum desses materiais. 2 É prática comum limpar os instrumentos médicos após serem utilizados num paciente e antes do tratamento de outro esfregando para remover sangue, tecido, sujidades proteináceas soltas e outras, e depois embebendo, durante um período de tempo predeterminado, numa preparação enzimática adaptada para digerir ou soltar suplementarmente quaisquer materiais proteináceos remanescentes na superfície do instrumento. Em seguida, os instrumentos são limpos por enxaguamento e são sujeitos a procedimentos suplementares de desinfecção ou esterilização. Para eliminar a possibilidade de infecções cruzadas, os instrumentos utilizados num paciente são desejavelmente limpos separadamente dos utilizados noutro.

As preparações para utilização na limpeza de instrumentos médicos consistem geralmente num concentrado que compreende um ou mais surfactantes em combinação com uma ou mais enzimas proteolíticas. Antes da utilização, o concentrado é diluído para uma potência de operação (normalmente uma diluição de cem vezes). Uma dessas formulações foi descrita pela NOVO NORDISK ("formulação Novo"). Três preparações utilizadas internacionalmente para esta finalidade são EPIZYME®, um produto da 3M, MEDIZYME® (um produto da Whiteley Industries Pty Ltd., Sydney, Austrália) e ENDOZYME® (um produto da Ruholf Corporation, N.I., E.U.A.). Se bem que esses produtos sejam geralmente eficazes e amplamente utilizados, continuam a ser necessários produtos que sejam mais eficientes e especialmente preparações que sejam capazes de atingir um nível predeterminado de eficácia num período de tempo mais curto do que as que estão presentemente disponíveis. 3 0 concentrado deve ser suficientemente estável em trânsito e por armazenamento antes da utilização para satisfazer as necessidades do comércio. A escolha de surfactantes que, na prática, podem ser formulados em soluções aquosas concentradas é limitada. Os surfactantes ou limitam a estabilidade por armazenamento do concentrado, resultando em problemas de formação de espuma por diluição, conferem uma redução insuficiente da tensão superficial, desestabilizam outros componentes do sistema, como enzimas, ou têm outras desvantagens. Essencialmente, os formuladores utilizam surfactantes escolhidos de um pequeno grupo de surfactantes não iónicos convencionais e bem conhecidos que se verificou serem satisfatórios para essas utilizações, mas continua a existir uma necessidade não satisfeita de formulações com eficiência acrescida.

Um objectivo da invenção consiste em fornecer um sistema surfactante aperfeiçoado e, em especificações preferidas da invenção, fornecer uma composição de limpeza à base de enzimas que evite problemas da técnica anterior e/ou que confira desempenho aperfeiçoado.

DESCRIÇÃO DA INVENÇÃO

De acordo com um primeiro aspecto, a invenção fornece uma composição aquosa compreendendo, em combinação, uma alquilpirrolidona e um alquilpolissacárido.

De preferência, a alquilpirrolidona é uma (C8 - C18 alquilo linear)pirrolidona. É altamente preferida a N-dodecilpirrolidona ("N-DP"). Desejavelmente, o alquilpolissacárido é um alquilpoliglucósido ("APG"). 4

De acordo com um segundo aspecto, a invenção proporciona um método para aumentar a eficácia de uma composição contendo enzimas para utilização na limpeza de instrumentos médicos, compreendendo o passo de incluir uma alquilpirrolidona e um alquilpolissacárido.

Preferivelmente, a composição é um concentrado que contém surfactante de acordo com o primeiro aspecto como parte da sua formulação, mas o sistema surfactante pode ser adicionado subsequentemente ao concentrado ou à solução de trabalho.

De acordo com um terceiro aspecto, a invenção proporciona um método de limpeza de um instrumento médico, que inclui o passo de tratar o instrumento com uma composição que inclui pelo menos uma enzima, uma alquil-pirrolidona e um alquilpolissacárido. A menos que o contexto requeira claramente de outra forma, ao longo da descrição e das reivindicações, as palavras "compreendem" e "compreendendo" devem ser consideradas num sentido inclusivo, em oposição a um sentido exclusivo ou exaustivo, o mesmo é dizer no sentido de "incluindo mas não se limitando a".

Sabe-se que as alquilpirrolidonas reduzem progressivamente a tensão superficial com concentração crescente em água, atingindo uma tensão superficial mínima (eficácia máxima) a uma concentração de cerca de 0,1% no caso da dodecilpirrolidona e a cerca de 0, 002% no caso da octilpirrolidona, cujas concentrações correspondem à solubilidade máxima das pirrolidonas respectivas em água. No passado, isto inibiu a sua utilização em concentrados, 5 uma vez que a concentração máxima num sistema aquoso é inevitavelmente menos eficaz, relativamente à eficácia total, como surfactante quando diluído numa extensão substancial.

MODOS MELHORES DE IMPLEMENTAR A INVENÇÃO

Um aditivo de acordo com a invenção, consistindo em N-dodecilpirrolidona ("N-DP") em combinação com alquilpoli-glucósido ("APG"), foi adicionado a soluções preparadas a partir de cada um de três concentrados de preparações enzimáticas de limpeza comercialmente disponíveis.

Estes consistiram em MEDIZYME®, ENDOZYME® e EPIZYME®. Também se preparou e testou um quarto concentrado "formulação NOVO", um produto descrito pela NOVO INDUSTRIES em Publicações da Novo Nordisk, Requerimento B-613, "Application of Enzymes in Detergents for Endoscope Cleaning". Nos testes descritos na Tabela 1, o aditivo consistiu em 0,2% p/p de N-dodecilpirrolidona ("N-DP") e 0,1% p/p de alquilpoliglucósido ("APG"), em cada caso com base no peso do concentrado. A Formulação NOVO (Concentrado) é a seguinte:

Componente % p/p

Surfactante não iónico (Teric BL9) 12

Propilenoglicol 22

Trietanolamina 7 Ácido bórico 4

Cloreto de cálcio 0,1

Savinase 16.0L (Protease) 13

Ternamyl (Amilase) 7 Água até 100 pH 7 6 A composição Epizyme (concentrado) é a seguinte:

Componente Água canalizada Teric BL9 (surfactante não iónico) Conservante % p/p 19.010.0 0, 15

Estabilizador enzimático

Soda cáustica 50%

Propilenoglicol 6,0 2,56,0

Protease

Lipase Amilase 10,00,2

Celulase

Essência de perfume Água 1,5 0,5 0,15 até 100,0 A titulo exemplificativo, a protease pode ser subtilisina, a amilase pode ser Alfa-amilase, a celulase pode ser endo-1,4-beta-glucanase e a lipase pode ser Triacilglicerol. No entanto, outras enzimas ou combinações de enzimas podem substituir estas.

Cada um dos concentrados de composição de limpeza foi diluído a uma taxa de 1 parte de concentrado em 100 partes de água dura padrão (0,304 g de cloreto de cálcio e 0,065 g de cloreto de magnésio por 1 1 de água destilada. "Therapeutic Goods Order 54 & Guidelines", 1996, página 17). Em seguida, testou-se a eficácia de cada produto em preparações padrão de sujidade em lâminas de vidro, (1) puro e (2) adicionando um aditivo de acordo com a invenção. Mediu-se a eficiência da preparação (tempo necessário para atingir uma dada pontuação) a várias temperaturas. Os resultados estão apresentados na Tabela 1, em comparação 7 com resultados de composiçoes incluindo o aditivo de acordo com a invenção.

Estão resumidos na Tabela 2 testes de envelhecimento acelerado. Os pormenores da preparação de sujidades padrão estão apresentados na tabela 3 e em "Methods for

Ascertaining the Cleaning Performance of Dishwasher Detergents" (SOFW-Journal, 126. Data 3-2000). TABELA 1

Transportador de sujidade: Lâminas de vidro de microscópio Carne picada queimada. Tempo de contacto (minutos) necessário para atmsji a pontuação 8 F omiuiaç â o NOVO EPIZYME MEDIZYME ENDQZYME Pura Com APG +-N-DP Pura Com APG + N-DP Pura Com APG + N-DP Pura Com APG + N-DP 25 °G 95 63 67 47 1:20 93 >480 241: 40'C m 46 52 37 87 71 212 157 50 °G 42 33 30 19 05 53 170 140 Leite em micro-ondas. Tempo de contacto (em minutos) necessário para atingir a pontuação 10 (remoção completa) MOVO-formuteSon EPIZYME MEDIZYME ENDOZYME Pura Com APG + N-DP Pura Com APG + N-DP Pura Com APG + N-DP Pura Com APG + N-DP 25°C 53 38 35 25 39 30 69 51 40°C 39 31 24 IS 29 23 50 35 50°C 27 22 12 10 19 16 31 28 Sujidade Edimburgo. Tempo de contacto (em minutos) necessário para atingir a pontuação 10 (remoção completa) Formulação NOVO EPIZYME MEDfZYME ENDOZYME Pura Com APG + N-DP Pura Com APG + N-DP Pura Com APG + N-DP Pura Com APG + N-DP 25¾ 23 25 21 1B 28 23 32 28 40'C 21 20 11 10 17 11.5 25 35 50':€ 18 15 S 9 11 10 18 16 N-DP: N-dodecilpirrolidona (Surfadone LP 300 da International Speciality Products), APG: Alquilpoliglucósido (ALKADET 15 daHuntsman Corporation Australia) Taxa de adição: 0,2% p/p de N-DP e 0,1% p/p de APG ao concentrado Taxa de diluição: 1 parte de concentrado em 100 partes de água dura padrão

Como é evidente da Tabela 1, a adição do aditivo reduz o tempo necessário para a composição atingir uma dada pontuação, e isto acontece a cada temperatura. O aditivo é especialmente eficaz a temperaturas mais baixas. 8

Apesar dos resultados apresentados na Tabela 1 terem sido obtidos utilizando 0,2% p/p de N-DP e 0,1% p/p de APG adicionados ao concentrado, a razão de N-DP para APG pode variar. É preferido que a razão se situe entre 1 parte por peso de alquilpirrolidona para 3 partes por peso de alquil-poliglucósido e 3 partes por peso de alquilpirrolidona para 1 parte por peso de alquilpoliglucósido, mais preferivelmente entre 3 partes por peso de alquilpirrolidona para 1 parte por peso de alquilpoliglucósido e 1 parte por peso de alquilpirrolidona para 1 parte por peso de alquilpoliglucósido. A concentração de cada um dos N-DP e APG é preferivelmente inferior a 7,5% p/p do concentrado (isto é, inferior a cerca de 0, 0075% no concentrado na diluição de 1 parte de concentrado:100 partes de água) e, mais preferivelmente, é inferior a 3% p/p. As concentrações reais empregues dependerão das propriedades de tensão superficial requeridas, da hidrofilicidade dos alquilpoliglucósidos e do grau de hidrotropia conferido por outros excipientes presentes na formulação ao alquilpoliglucósido, bem como outros factores que possam ocorrer relativamente a formulações individuais. A Tabela 2 mostra o efeito do aditivo em testes de envelhecimento acelerado. Os resultados demonstram que o aditivo melhora ligeiramente a estabilidade por armazenamento ou, pelo menos, não a afecta adversamente. 9 TABELA 2

Actividade Remanescente de Protease em% para formulações concentradas após 21 dias de armazenamento (100% no dia 0) Formulação NOVO EPÍZYME MEDÍZYME EIMDOZYME Pura Com APG + M4>P Pura Com APG + N-QP Pura Com APQ-e-W-DP Pura Com ΑΡβ + N-DP 25'C 95 95 98 88 85 95 93 93 4CrC 89 m 91 81 85 85 80 83 47"C 77 84 85 87 69 74 73 78

Avaliado utilizando o método de teste B 863b da NOVO NORDISK (aqui adjunto como Anexo 1) . O aditivo de acordo com a invenção e a diluição foram iguais aos da Tabela 1. A Tabela 3 mostra os efeitos da variação da concentração e da razão alquilpirrolidona para alquilpoli-glucósido. Pode observar-se que a composição é eficaz na redução dos tempos de contacto para a limpeza numa gama ampla de razões entre alquilpirrolidona e alquilpoli-glucósido. 10 TABELA 3

Transportador de sujidade: lâminas de vidro de microscópio Carne picada queimada. Tempo de contacto (minutos) necessário para atingir a pontuação 8. Formulação NOVO Epízyme Pura Com .APG + SURF Pura Com APG + SURF 25 X 95 66 87 48 40 °C Θ0 49 52 39 .50 X 42 32 30 22 Leite em micro-ondas. Tempo de contacto (em minutos) necessário para atingir a pontuação 10 tremoção completai Formulação NOVO Epizynie Pura ComAPG+SURF Neat Com APG + SURF 25 X 53 34 35 21 40 X 39 29 24 17 50 X 27 20 12 8 Suiidade Edimburgo. T empo de contacto (em minutos) necessário para atingir a pontuação 10 (remoção completai Formulação NOVO Eptzyme Pura Com .APG + SURF Pura Com APG+SURF 25 °C .28 22 21 19 40 X 21 16 11 9 50 X 18 19 9 8 SlIRP: N-dodecilpirrolidona (Surfadone LP 300 da International Speciality Products), APG: Alquilpoliglucósido (ALKADET 15 daHuntsman Corporation Australia) Taxa de adição: 0,2% p/p de STJBlF e 1% p/p de APG ao concentrado Taxa de diluição: 1 parte de concentrado em 100 partes de água dura padrão 11

Resultados .

Transportador de sujidade: lâminas de vidro de microscópio Carne picada queimada. Tempo de contacto (minutos) necessário para atingir a pontuação 8.

Carne picada queimada. Tempo de contacto (minutos) necessário para atingir a pontuação 8. Formulação NOVO Epizyme Pura Com APG + SURF Pura Com APG + SURF 25 X 95 64 67 44 40 X 60 47 52 37 50X 42 31 30 •7 ·7 »· »· Leite em micro-ondas. Tempo de contacto (em minutos) necessário para atingir a pontuação 1U (remoção completa) Formulação NOVO Epizyme Pura Com APG + SURF Pura Com APG + SURF 25 X 53 34 35 21 40 X 39 28 24 16 50 X 27 .20 12 7 Suiidade Edimburso. Tempo de contacto (em minutos) necessário para atingir a pontuação 10 (remoção completa) Formulação NOVO Epizyme Pura ComAPG+SURF Pura Com APG + SURF 25X 28 .21 21 19 40X 21 15 11 9 50'C 18 14 9 7 SURF: N-dodecilpirrolidona(Surfadone LP 300 da International Speciality Products), APG: Alquilpoliglucósido (ALKADET 15 da Huntsman Corporation Australia) Taxa de adição: 0,2% p/p de SURF e 7,5% de APG ao concentrado Taxa de diluição: 1 parte de concentrado em 100 partes de água dura padrão 12

Resultados .

Transportador de sujidade: lâminas de vidro de microscópio

Carne picada queimada. Tempo de contacto (minutos) necessário para atingir a pontuação 8. Formulação NOVO Epizyme Pura Com APG + SURF Pura Com APG + SURF 25 *c 95 67 87 44 40 °C 80 44 52 41 5Q “G 42 30 m 20 Leite em micro-ondas. Tempo de contacto (em minutos) necessário para atingir a pontuação 10 (remoção completa) Formulação NOVO Epizyme Pura Com APG + SURF Pura Com APG + SURF 25 "C 53 37 35 24 40 °C 39 26 24 15 50 *C 27 18 12 12 Sujidade Edimburgo. Tempo de contacto (em minutos) necessário para atingir a pontuação 10 (remoção completa Formulação NOVO Epizyme Pura Com APG + SURF Pura Com APG + SURF 25'C 28 18 21 19 4D*C 21 15 11 12 so*c 18 12 9 7 SIIRP: N-dodecilpirrolidona (Surfadone LP 300 da International Speciality Products), APG: Alquilpoliglucósido (ALKADET 15 daHuntsman Corporation Àustralia) Taxa de adição: 1% p/p de SIIRP e 0,1% de APG ao concentrado Taxa de diluição: 1 parte de concentrado em 100 partes de água dura padrão 13

Resultados .

Transportador de sujidade: lâminas de vidro de microscópio

Came picada queimada. Tempo de contacto (minutos) necessário para atingir a pontuação 8. Formulação NOVO Epizyme Pura Com APG + SURF Pura Com APG + SURF 25 "C 95 63 87 43 40 "C 60 52 52 37 50 C'C 42 35 30 23 Leite em micro-ondas. Tempo de contacto (em minutos) necessário para atingir a pontuação 10 (remoção completa) Formulação NOVO Epizyme Pura Com APG + SURF Pura Com APG * SURF 25 °C 53 35 35 24 40 a C 39 27 24 16 50 ° G 27 24 12 9 Sujidade Edimburgo. Tempo de contacto (em minutos) necessário para atingir a pontuação 10 (remoção completa) Formulação NOVO Epizyme Pura Com APG + SURF Pura Com APG + SURF 25 *C 2S 23 21 20 40 aC 21 17 11 9 50 *C 18 12 9 7 SURF: N-dodecilpirrolidona(Sutfadone LP 300 da International Speciality Products), APG: Alquilpoliglucósido (ALKADET 15 da Huntsman Corporation Australia) Taxa de adição: 7,5% p/p de SURF e 0,1% de APG ao concentrado Taxa de diluição: 1 parte de concentrado em 100 partes de água dura padrão Avaliado utilizando o método de teste B 863B da NOVO NORDISK(em anexo) 14 TABELA 4

COMPOSIÇÃO DA SUJIDADE & TESTE DE ACTIVIDADE ENZIMÁTICA DE DETERGENTES

Leite em Micro-ondas: - 60 ml de leite - 6 copos

- um micro-ondas ajustado para 450 W

- um aquecedor de forno ajustado para 80 °C O micro-ondas foi pré-aquecido colocando 6 copos cheios de água, num circulo, na bandeja de vidro rotativa e deixando-o na posição "high" (900 W) durante 10 minutos. Em seguida, os copos com água foram substituídos por copos com 10 ml de leite. O leite foi aquecido durante 10 minutos a 450 W e depois deixou-se arrefecer, formando uma película, e foi colocado num forno durante 2 horas a 80 °C.

Carne picada: - 20 gramas de carne picada - 7,5 gramas de gema e clara de ovo - 8,0 gramas de água substrato polar 30x30 mm (mosaicos de cerâmica) A carne picada foi misturada com a gema de ovo e água utilizando um misturador manual. Colocou-se, com uma colher, 1 g de mistura homogeneizada em mosaicos de cerâmica 3x3 cm, no lado macio. Em seguida, deixaram-se os mosaicos num forno durante 10 minutos.

Sujidade Edimburgo - 20 g de gema de ovo - 20 g de água - 0,5 g de colesterol - 3 g de gelatina de carne - 0,45 de mucina de suíno 15 A gelatina de carne e a água foram misturadas e aquecidas até a mistura ter adquirido uma consistência homogénea. 0 colesterol, mucina de suíno e gema de ovo foram aí misturadas depois da gelatina ter arrefecido para 30 °C. Nas superfícies das lâminas de microscópio depositaram-se 0,1 g de sujidade. Para cada conjunto de lâminas, as manchas foram produzidas com uma espessura uniforme; a espessura foi regulada por uma orla de fita adesiva ao longo de cada extremidade do instrumento de deposição de manchas. Para simular as condições de limpeza de um endoscópio, deixaram-se as lâminas secar ao ar livre a 20 °C durante 20 minutos.

Sem pretender ficar restringido pela teoria, o polissacárido parece estabilizar a pirrolidona, sendo a combinação mais solúvel no concentrado e resultando numa diminuição substancialmente melhorada da tensão superficial na diluição de trabalho.

Apesar dos resultados dos testes utilizarem N-dodecil-pirrolidona, outras alquilpirrolidonas podem substituir aquela, especialmente C8 até C18 alquilpirrolidonas. A quantidade a ser adicionada pode ser determinada por experimentação simples, mas, em geral, aumentar a concentração significativamente acima dos níveis aqui empregues tende a ser menos vantajoso. De modo semelhante, outros alquilpolissacáridos podem substituir o APG. Por exemplo, outras unidades de açúcares e derivados de unidades de açúcares podem substituir unidades de glucose. Mais uma vez, há uma concentração óptima para além da qual aumentar a concentração é relativamente pouco benéfico. Se bem que a combinação de N-alquilpirrolidona e APG seja altamente preferida, podem obter-se efeitos benéficos em 16 pelo menos alguns tipos de sujidade adicionando-os isoladamente. A razão óptima entre N-DP e APG pode ser determinada por experimentação simples para um dado concentrado. A combinação da invenção fornece um sistema surfactante aperfeiçoado que se espera ter aplicação em muitas utilizações finais. Na área dos agentes de limpeza para instrumentos médicos, o sistema surfactante da invenção pode ser simplesmente adicionado a produtos de limpeza enzimáticos comercialmente disponíveis, quer ao concentrado quer a uma diluição apropriada da solução de trabalho antes da utilização. No entanto e preferivelmente, os aditivos são incorporados num concentrado na altura do fabrico do concentrado, que então é meramente diluído antes da utilização.

Os aditivos de acordo com a invenção podem ser adicionados a composições de limpeza de superfícies de lavagem de loiça, lavagem de mãos e outras.

As especificações da invenção podem ser alteradas e podem ter outros agentes químicos adicionados ou substituídos, numa extensão que será clara para os experimentados na área a partir do seu ensinamento aqui apresentado, sem sair do conceito inventivo aqui revelado. ANEXO 1.

B 863b-GB DA NOVO NORDISK 17 PROCEDIMENTO MANUAL PARA A DETERMINAÇÃO DA ACTIVIDADE PROTEOLÍTICA EM PREPARAÇÕES ENZIMÁTICAS E DETERGENTES (SUBSTRATO AZOCASEÍNA)

Apresenta-se na figura 1 uma representação em diagrama deste método.

Principio

Permite-se que uma protease hidrólise a azocaseina durante 30 minutos a 40 °C. A proteína não digerida é precipitada com ácido tricloroacético, e a quantidade de produto digerido é determinada por espectrofotometria.

Definição de Unidade Enzimática Não está definida nenhuma unidade separada. Determina-se a actividade relativamente a um padrão de actividade conhecida, e o resultado é apresentado nas mesmas unidades utilizadas para o padrão.

Condições do Ensaio 8,5 (tampão Tris-SC>4 0,2 M) 40 °C 0,5% (na mistura reaccional) 30 minutos pH:

Temperatura:

Substrato: azocaseina Tempo Reaccional:

Aparato

Espectrofotómetro para ler a absorvância a 390 nm Medidor de pH

Banho de água a 40 °C · 0,5 °C Temporizador com dois ponteiros Misturador de vórtice Tubos de teste 16 · 125 mm Distribuidor repetidor, capacidade 5 ml 18

Funis pequenos e papel de filtro, Whatman n° 3 ou equivalente

Reagentes

1. Solução-mãe de tampão Tris 2,0 M

Dissolver 242 g de tris-hidroximetilaminometano ("Trizma Base" T-1503 da Sigma ou equivalente) em 700-800 ml de água desionizada.

Ajustar o pH para 8,5 com H2SO4 10 N.

Ajustar o volume para 1 litro.

Este concentrado deve ser utilizado a 10 ml/100 ml de volume para todas as diluições finais com tampão Tris 0,2 M. 2. Solução de ureia a 50%

Dissolver 50 g de ureia (qualidade analítica) em 50 ml de água desionizada morna.

Ajustar o volume para 1 litro. 3. Solução de ácido tricloroacético a 10% (reagente de terminação)

Dissolver 100 g de ácido tricloroacético (TCA) em 200 ml de água desionizada.

Ajustar o volume para 1 litro. 4. Azocaseína (solução de substrato)

Preparar diariamente de fresco - deitar fora qualquer substrato não utilizado Num copo de 250 ml:

Pesar 0,6 g de azocaseína (A-2765 da Sigma).

Adicionar 10 ml da solução de ureia a 50% e misturar até à dissolução. 19

Adicionar 10 ml de soluçao-mãe de tampão Tris 2,0 M.

Adicionar 30-50 ml de água desionizada e continuar a agitação até deixar de ter partículas.

Ajustar o pH para 8,5 utilizando H2SO4 diluido. Ajustar o volume para 100 ml e misturar vigorosamente. Manter a baixa temperatura até estar pronto para começar o ensaio. 5. Amostras e padrões enzimáticos

Ver Apêndice I quanto à Alcalase®, Apêndice II quanto à Esperase® e Savinase® e Apêndice III quanto à Durazym®.

Depois de dissolver uma amostra de detergente para o ensaio de protease, recomenda-se fortemente que o pH desta solução seja verificado e, se necessário, ajustado para 8,5 · 0,1 unidades.

Se se desejar conhecer os níveis exactos da actividade da proteinase num detergente, as bases do detergente devem ser incluídas nas soluções padrão, a menos que já se saiba que a formulação particular a ser utilizada não exerce nenhum efeito na actividade da protease. A concentração do detergente de base deve ser igual à utilizada na solução amostra do detergente contendo protease. A presença em solução de quelantes fortes, como NTA ou EDTA, pode resultar em desactivação da protease ao longo do periodo de tempo necessário para a preparação dos vários materiais a serem utilizados no ensaio. Esta causa da desactivação pode ser ultrapassada adicionando às soluções de amostra cálcio em excesso. 20

Procedimento 1. Pré-aquecer o banho de água para 40 °C ± 0,5 °C (aproximadamente 1 hora). 2. Aproximadamente 10 minutos antes do inicio do ensaio, colocar a solução de substrato no banho de água a 40 °C, para equilibrar. 3. Para tubos de teste apropriadamente etiquetados pipetar 1 ml de amostra ou padrão enzimático e equilibrar para 40 °C no banho de água (aproximadamente 1 minuto). 4. Iniciar a reacção:

Em intervalos de tempo medidos de forma precisa, adicionar 5 ml de solução de substrato a cada tubo contendo amostra ou padrão, submeter a vórtice e colocar novamente no banho de água durante 30 minutos.

Ensaio em branco da amostra:

Ao ensaio em branco da amostra adicionar 5 ml de TCA 10% e submeter a vórtice; depois adicionar 5 ml de solução de substrato, submeter a vórtice e deixar repousar à temperatura ambiente até estar pronto para ser filtrado. 5. Reacção de terminação:

Passados exactamente 30 minutos, nos mesmos intervalos de tempo já descritos, adicionar 5 ml de TCA 10% a cada tubo de amostra ou padrão, submeter a vórtice e deixar repousar à temperatura ambiente. 21 6. Passados 15-20 minutos, filtrar todos os tubos com filtração por gravidade, através de papéis de filtro, para tubos de teste limpos, secos e apropriadamente etiquetados. 7. Ler as absorvâncias a 390 nm versus ensaio em branco de água desionizada. Cálculos 1. Curva padrão: a) Se o ensaio em branco padrão (Ao, Eo ou So) > 0,16, o ensaio deve ser efectuado novamente com substrato fresco. b) Se o ensaio em branco padrão < 0,16, subtrair as suas leituras de A390 dos padrões, para obter · absorvância. c) Desenhar uma curva de · absorvância versus actividade proteolitica (AU ou KNPU/tubo = AU ou KNPU/ml da diluição final). 2. Tubos de amostra: • absorvância — Aamostra — Aensaio em branco

Utilizando a curva padrão, determinar a actividade da amostra/tubo:

AetMdade/grainas = (actividade/hibo).(fuctor de diluição) gramas de amostra APENDICE 1 Alcalase®

Definição de unidades: Unidades Anson (AU) 22 1 Unidade Anson = a quantidade da enzima* que digere hemoglobina A com uma velocidade inicial tal que é libertada, por minuto, uma quantidade de produto solúvel em TCA que origina a mesma cor com reagente de fenol de um miliequivalente de tirosina. * Nas condições reaccionais apresentadas no método da NNAS AF4/5-GB: Método Modificado de Hemoglobina de Anson para a Determinação da Actividade Proteolitica ("Modified Anson Haemoglobin Method for the Determination of Proteolytic Activity").

Prepara-se uma curva padrão utilizando uma enzima cuja actividade seja conhecida em Unidades de Anson. Em seguida, as amostras desconhecidas são comparadas com esta curva.

Tampão: Tris 0,2 M, pH 8,5

Gama de actividade da amostra: 5·10“5 - 15·10“5 AU/ml Ensaio em branco padrão: 1 ml de tampão Tris 0,2 M pH 8,5 =

Ao

Substrato: Solução de azocaseina, 0,5%, pH 8,5 Preparação da amostra:

Dissolver uma quantidade de amostra pesada rigorosamente num volume rigorosamente conhecido de tampão Tris 0,2 M de modo que a solução contenha entre 5 · 10~5 e 15 · 10~5 AU/ml e que tenha um pH de 8,5. N.B. Para cada amostra desconhecida preparar um ensaio em branco da amostra e um ou mais duplicados (consoante o necessário). 23

Manter as soluções em gelo até estar pronto para o ensaio. Curva padrão

Solução-mãe do padrão enzimático: Dissolver padrão de Alcalase rigorosamente pesado em 100 ml de tampão Tris 0,2 M (pH 8,5) para dar origem a 2,6 · 10~1 2 3 4 AU/ml.

Diluir a solução-mãe do modo seguinte:

Solução-mãe do

Etiqueta do tubo 1 Solução-mãe tampão Tris 2 M Volume final Actividade 0 m! 10 mi 100 mi 0.0*10-s AU/mi A1 1 mi 10 mi 100 mi 2.6*10^ AU/mi a2 2 mi 10 mí 100 mi 5,2*10" AU/mi a3 3 mi 10 mi 100 mi 7.8*10® AU/mi a4 4 mi 10 mi 100 m i 104*10-5 AU/mi A5 5 mi 10 mi 100 mi 13.0*10-s AU/mi A, 8 mi 10 mi 100 mi 15.6*1G-5 AU/mi

APÊNDICE II

Savinase®/Esperase®

Definição das unidades: Milhar de Unidades de Protease da Novo ("Kilo Novo Protease Unit") (KNPU)

1 KNPU = 1000 NIPU 1

Unidade de Protease da Novo ("Novo Protease Unit") (NPU) 2 = a quantidade de enzima* que hidrolisa a caseína numa 3 velocidade tal que a velocidade inicial da formação de 4 péptidos/minuto corresponde a 1 micromole de 5 glicina/minuto. 24 * Condições padrão apresentadas no método da NNAS 162/3-GB: Método de DMC Manual para a Determinação da Actividade Proteolitica ("Manual DMC Method for the Determination of Proteolytic Activity").

Prepara-se uma curva padrão utilizando uma enzima cuja actividade em KNPU seja conhecida. Em seguida, as amostras desconhecidas são comparadas com esta curva.

Tampão: Tris 0,2 M, pH 8,5

Gama de actividade da amostra: 2·10~4 - β·10“4 KNPU/ml Ensaio em branco padrão: 1 ml de tampão Tris 0,2 M pH 8,5 = E0 ou S0

Substrato: Solução de azocaseina, 0,5%, pH 8,5 Preparação da amostra:

Dissolver uma quantidade de amostra pesada rigorosamente num volume rigorosamente conhecido de tampão Tris 0,2 M de modo que a solução contenha entre 2·10~4 - 6·10~4 KNPU/ml e que tenha um pH de 8,5. N.B. Para cada amostra desconhecida preparar um ensaio em branco da amostra e um ou mais duplicados (consoante o necessário).

Manter as soluções em gelo até estar pronto para o ensaio. Curva padrão

Solução-mãe do padrão enzimático: Dissolver padrão de Savinase ou Esperase rigorosamente pesado em 100 ml de tampão Tris 0,2 M (pH 8,5) para dar origem a 1*10”2 KNPU/ml. 25

Diluir a solução-mae do modo seguinte:

Tubo Solução-mãe Solução-mãe do tampão Tris 2 M Volume final Actividade Eo or Sr. 0 ml 10 ml 100 m! 0.0*1 o-4 KNPU/ml E ; Qf S-f 1 ml 10 ml 100 mi 1.0-1 o-4 KNPU/ml E? or S? 2 ml 10 ml 100 mi 2.0* 10'4 KNPU/ml Erj or S, 3 ml 10 ml lOOmi 3.0»1CH KNPU/mí E4 or S4 4 ml 10 ml 100 mi 4. .0*10-4 KNPU/ml Ες: Of 5 ml 10 ml 100 mi 5.0*10'4 KNPU/ml Es or Sg 6 ml 10 ml 100 mi e.0-10-4 KNPU/ml E = Esperase, S = Savinase APÊNDICE III Durazym®

Definição de unidades: Unidades de Protease Durazym ("Durazym Protease Unit") (DPU)

Mede-se a actividade relativamente a um padrão de Durazym com as mesmas unidades da amostra, isto é, DPU.

Prepara-se uma curva padrão utilizando uma enzima cuja actividade seja conhecida em DPU. Em seguida, as amostras desconhecidas são comparadas com esta curva.

Tampão: Tris 0,2 M, pH 8,5

Gama de actividade da amostra: 6*1CT4 - 18·10“4 DPU/ml Ensaio em branco padrão: 1 ml de tampão Tris 0,2 M pH 8,5 = Do

Substrato: Solução de azocaseina, 0,5%, pH 8,5 Preparação da amostra: 26

Dissolver uma quantidade de amostra pesada rigorosamente num volume rigorosamente conhecido de tampão Tris 0,2 M de modo que a solução contenha entre 6·10~4 - 18·10“4 DPU/ml e que tenha um pH de 8,5. N.B. Para cada amostra desconhecida preparar um ensaio em branco da amostra e um ou mais duplicados (consoante o necessário).

Manter as soluções em gelo até estar pronto para o ensaio. Curva padrão

Solução-mãe do padrão enzimático: Dissolver padrão de Durazym rigorosamente pesado em 100 ml de tampão Tris 0,2 M (pH 8,5) para dar origem a 1·10~2 DPU/ml.

Diluir a solução-mãe do modo seguinte:

Etiqueta do tubo Solução-mãe Solução-mãe do tampão Tiis 2 M Volume fínal Aclividade 0 ml 10 ml 100 raí 0.0-104 DPU/rnt D-t 3 ml 10 ml 100 ral 3.O-104 DPU/mf O2 6 ml IDmi lOOml e.OIO·4 DPU/rnt 03 9 ml 10 ml 100 ml 9.0-104 QPU/mí D4 12 ml 10 mi 100 mi 12.0-1CH DPU/ml 05 15mí 10 mi 100 ral 15.0-10-4 DFUtômf d6 IS mi 10 mi 100 mi 18.0-104 DPU/ml .sboa, 9 de Janeiro de 2007

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Composição aquosa compreendendo, em combinação, uma alquilpirrolidona e um alquilpolissacárido.

2. Composição de acordo com a Reivindicação 1, em que a alquilpirrolidona é uma (C8-C18 alquilo linear) pirrolidona.

3. Composição de acordo com a Reivindicação 1 ou 2, em que o alquilpolissacárido é um alquilpoliglucósido ("APG").

4. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a alquilpirrolidona é N-dodecilpirrolidona ("N-DP").

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a razão de alquilpirrolidona para alquilpolissacárido se situa entre uma razão de 1 parte por peso de alquilpirrolidona para 3 partes por peso de alquilpoliglucósido e 3 partes por peso de alquilpirrolidona para 1 parte por peso de alquilpoliglucósido. 1 parte por

6. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, em que a razão de alquilpirrolidona para alquilpolissacárido se situa entre uma razão de 1 parte por peso de alquilpirrolidona para 3 partes por peso de alquilpoliglucósido e 1 parte por peso de alquilpirrolidona para 1 parte por peso de alquilpoliglucósido. 2

7. Composição de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, compreendendo 1 parte por peso de N-dodecilpirrolidona para 1 parte por peso de alquilpoliglucósido.

8. Método para aumentar a eficácia de uma composição contendo enzimas para utilização na limpeza de instrumentos médicos, compreendendo o passo de incluir nessa composição uma alquilpirrolidona e um alquilpolissacárido.

9. Método de acordo com a Reivindicação 8, em que uma combinação de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 6 é adicionada a uma composição contendo enzimas.

10. Método de acordo com a Reivindicação 9, em que uma alquilpirrolidona e um alquilpolissacárido são adicionados separadamente a uma composição contendo enzimas.

11. Método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 9 até 10, em que a composição contendo enzimas é um concentrado e em que a alquilpirrolidona e o alquilpolissacárido são adicionados ao concentrado antes da sua diluição para uma potência de operação.

12. Método de acordo com a Reivindicação 8, em que uma alquilpirrolidona e um alquilpolissacárido são, cada um, formulados em combinação com uma ou mais enzimas para produzir um concentrado adequado para diluição com a finalidade de fornecer uma solução de limpeza enzimática.

13. Método de limpeza de um instrumento médico, incluindo o passo de tratar o instrumento com uma composição que inclui 3 pelo menos uma enzima, uma alquilpirrolidona e um alquilpolissacárido.

14. Método de acordo com a Reivindicação 13, em que a alquilpirrolidona é uma (C8-C18 alquilo linear) pirrolidona.

15. Método de acordo com a Reivindicação 13 ou 14, em que o alquilpolissacárido é um alquilpoliglucósido ("APG").

16. Método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 13 até 15, em que a alquilpirrolidona é N-dodecil-pirrolidona ("N-DP").

17. Método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 13 até 16, em que a razão de alquilpirrolidona para alquilpolissacárido se situa entre uma razão de 1 parte por peso de alquilpirrolidona para 3 partes por peso de alquilpoliglucósido e 3 partes por peso de alquilpirrolidona para 1 parte por peso de alquilpoli-glucósido.

18. Método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 13 até 17, em que a razão de alquilpirrolidona para alquilpolissacárido se situa entre uma razão de 1 parte por peso de alquilpirrolidona para 3 partes por peso de alquilpoliglucósido e 1 parte por peso de alquilpirrolidona para 1 parte por peso de alquilpoli-glucósido.

19. Método de acordo com qualquer uma das Reivindicações 13 até 18, compreendendo 1 parte por peso de N-dodecil-pirrolidona para 1 parte por peso de alquilpoli-glucósido. 4

20. Composição de acordo com qualquer uma das Reivindicações 1 até 7, incluindo suplementarmente pelo menos uma enzima.

21. Composição de acordo com a Reivindicação 20, incluindo pelo menos uma enzima seleccionada do grupo que consiste em proteases, lipases, amilases e celulases.

22. Composição de acordo com a Reivindicação 21, incluindo pelo menos duas enzimas diferentes, cada uma seleccionada do grupo que consiste em proteases, lipases, amilases e celulases.

23. Composição de acordo com qualquer uma das Reivindicações 20 até 22, compreendendo suplementarmente propilenoglicol.

24. Composição de acordo com qualquer uma das Reivindicações 20 até 23, compreendendo suplementarmente um surfactante não iónico.

25. Composição de acordo com qualquer uma das Reivindicações 20 até 24, em que o APG está presente numa concentração inferior a 7,5% p/p.

26. Composição de acordo com qualquer uma das Reivindicações 20 até 25, em que a N-DP está presente numa concentração inferior a 7,5% p/p.

27. Composição de acordo com qualquer uma das numa Reivindicações 20 até 26, em que o APG está presente concentração inferior a 0,3% p/p. 5 5 das numa com

28. Composição de acordo com qualquer uma Reivindicações 20 até 27, em que a N-DP está presente concentração inferior a 0,3% p/p.

29. Composição substancialmente como descrita aqui referência a qualquer um dos exemplos. Lisboa, 9 de Janeiro de 2007