PT106278A

PT106278A - Método para a obtenção de um extrato rico em ácidos triterpénicos a partir da casca de eucalipto

Info

Publication number: PT106278A
Application number: PT106278A
Authority: PT
Inventors: Carlos Pascoal Neto; Carmen Sofia Da Rocha Freire Barros; Armando Jorge Domingues Silvestre; Rui Miguel De Andrade Domingues; Carlos Manuel Santos Silva
Original assignee: Raiz Inst De Investigacao Da Floresta E Papel; Univ Aveiro
Priority date: 2012-04-26
Filing date: 2012-04-26
Publication date: 2013-10-28
Also published as: ES2525953R1; PT106278B; ES2525953B2; WO2013160881A1; ES2525953A2; ES2525953A9

Abstract

A PRESENTE INVENÇÃO REFERE-SE A UM MÉTODO PARA OBTER EXTRATOS COM ELEVADOS TEORES DE ÁCIDOS TRITERPÉNICOS (ATÉ 98 %), MAIORITARIAMENTE CONSTITUÍDOS PELOS ÁCIDOS OLEANÓLICO E URSÓLICO, A PARTIR DA CASCA DE EUCALIPTO. ESTE MÉTODO ENVOLVE A EXTRAÇÃO SÓLIDO¿LÍQUIDO DA CASCA COM SOLVENTES ORGÂNICOS, PREFERENCIALMENTE COM HEXANO, E O FRACIONAMENTO DO EXTRATO BRUTO ATRAVÉS DE UM TRATAMENTO SIMPLES COM UMA SOLUÇÃO ALCALINA, SEGUIDA DA SEPARAÇÃO DA FASE AQUOSA, A SUA FILTRAÇÃO, ACIDIFICAÇÃO E FINALMENTE ISOLAMENTO DA FRACÇÃO ENRIQUECIDA EM ÁCIDOS TRITERPÉNICOS ATRAVÉS DE FILTRAÇÃO, CENTRIFUGAÇÃO OU EXTRAÇÃO COM UM SOLVENTE ORGÂNICO, PREFERENCIALMENTE COM HEXANO, SEGUIDA DE REMOÇÃO DO SOLVENTE. A PRESENTE INVENÇÃO TEM APLICAÇÕES NAS INDÚSTRIAS FARMACÊUTICA, NUTRACÊUTICA, COSMÉTICA E DE ALIMENTOS FUNCIONAIS.

Description

1

DESCRIÇÃO "MÉTODO PARA A OBTENÇÃO DE UM EXTRATO RICO EM ÁCIDOS TRITERPÉNICOS A PARTIR DA CASCA DE EUCALIPTO"

Domínio da invenção A presente invenção refere-se a um método para obter extratos com elevados teores de ácidos triterpénicos (até 98 %), maioritariamente constituídos pelos ácidos oleanólico e ursólico, a partir da casca de eucalipto. Este método envolve a extração sólido-líquido da casca com solventes orgânicos, preferencialmente com hexano, e o fracionamento do extrato bruto através de um tratamento simples com uma solução alcalina, seguida pela separação da fase aquosa, a sua filtração, acidificação e finalmente isolamento da fração enriquecida em ácidos triterpénicos através de filtração, centrifugação ou extração com um solvente orgânico, e preferencialmente com hexano, seguida de remoção do solvente.

Antecedentes da invenção

Os ácidos triterpénicos pentacíclicos com estruturas do tipo lupano, ursano e oleanano, como os ácidos betulínico, ursólico, 3-acetil-ursólico, oleanólico e 3-acetil-oleanólico, apresentam uma vasta gama de efeitos biológicos e actividades farmacológicas únicas e potencialmente suscetíveis de exploração comercial (Yogeeswari e Sriram, 2005). O ácido betulínico é conhecido por apresentar propriedades anti-VIH, anti-bacteriana, anti-malária, anti-inflamatória e antioxidante (Tolstikova et al., 2006, Yogeeswari e Sriram, 2005). 2

Os ácidos oleanólico e ursólico são também conhecidos por apresentarem atividade antimicrobiana (Horiuchi et ai., 2007, Kuete et ai., 2007, Sattar et al., 1995) anti-tumoral (Li et al. , 2002), assim com propriedades anti-inflamatórias (Singh et al., 1992) . Adicionalmente, o ácido oleanólico revelou atividades antialérgicas e anti-VIH (Sultana e Ata, 2008) e o ácido ursólico é um composto supressivo útil para o tratamento da artrite reumatóide com baixo risco de problemas gástricos (Kang et al., 2008). O interesse em compostos bioactivos naturais para aplicações farmacêuticas, nutracêuticas, cosméticas e em alimentos funcionais promoveu o desenvolvimento de vários métodos para a obtenção de extratos vegetais enriquecidos nos ácidos triterpénicos acima referidos. Diversas partes morfológicas de plantas têm sido descritas como potenciais fontes destes compostos naturais tais como, por exemplo, folhas e casca de abeto (RU 2108803), folhas de diospireiro (CN 101538309), cascas de maçã (EP 1250852, EP 1161879), folhas de oliveira (W02005075614), folhas de nespereira (US 2009275778), e casca de bétula (WO 2005047304). As metodologias referidas para a obtenção de extratos enriquecidos em ácidos triterpénicos envolvem a extração dos substratos vegetais com sistemas de solventes orgânicos (ex. etanol, acetado de etilo, éter de petróleo, acetona, hexano, clorofórmio, éter metilbutilico, benzeno, xilenos, entre outros), seguida por procedimentos complexos de fracionamento baseados em extrações liquido-liquido em série (US 6740778), cromatografia em coluna (WO 03011891, CN 101538309, CN 101759756, US 2009275778), extração supercritica em contracorrente (WO 2005075614), cristalização e recristalização (WO 2006088385, RO 122244, WO 2005047304, CN 101759756, EP 1161879), ou tratamento do 3 extrato orgânico com soluções alcalinas (RU 2151139, RU 2108803, RU 2108107). O uso de solventes orgânicos extremamente perigosos, nomeadamente clorofórmio, benzeno e xilenos, e procedimentos de fracionamento muito complexos, quando se pretendem elevadas purezas, encontram-se entre as principais desvantagens de algumas destas tecnologias. A casca externa de diversas espécies de eucalipto contém elevados teores de vários ácidos triterpénicos, nomeadamente os ácidos betulónico, betulínico, 3-acetil-betulínico, ursólico, 3-acetil-ursólico, oleanólico e 3-acetil-oleanólico, e podem ser exploradas para a obtenção destes compostos bioativos (Domingues et al., 2010,

Domingues et al., 2011, Freire at al., 2002). A novidade da presente invenção assenta no uso dos resíduos de casca de eucalipto (e particularmente Eucalyptus globulus) para a obtenção de extratos com elevados teores (até 98%) de ácidos triterpénicos através da extração sólido-líquido com um solvente orgânico, preferencialmente n-hexano, seguida pelo fracionamento através do tratamento sequencial com soluções alcalinas/ácidas. O método proposto tem a vantagem de ser altamente eficiente e de fácil implementação industrial comparativamente com algumas tecnologias disponíveis.

Sumário da invenção O objecto da presente invenção é um método para obtenção de extratos ricos em ácidos triterpénicos que compreende as seguintes etapas: i) secagem e moagem da casca de eucalipto; ii) extração da casca com um solvente orgânico; 4 iii) fracionamento do extrato bruto por tratamento com uma solução aquosa alcalina; iv) separação da fase aquosa; v) clarificação por filtração; vi) acidificação com um ácido inorgânico ou orgânico; vii) isolamento da fração precipitada de ácidos triterpénicos.

Numa das realizações preferenciais o método compreende ainda uma etapa de cristalização.

Numa outra realização preferencial, a casca de eucalipto é obtida a partir de espécies de Eucalyptus, nomeadamente E. globulus, E. urograndis, E. grandis x globulus, E. maidenii, E. grandis e E. nitens, e a humidade residual e granulometria das amostras de casca encontram-se abaixo de 15% e 60 mesh, respetivamente.

Numa outra realização preferencial, o solvente orgânico usado é o diclorometano, n-heptano, n-hexano ou outro solvente apoiar e a solução aquosa compreende no minimo um dos seguintes componentes: hidróxidos metálicos (KOH ou NaOH) ou carbonatos metálicos (Na2CC>3 ou K2CO3) , assim como os correspondentes hidrogenocarbonatos ou fosfatos (Na3PC>4 ou K3PO4) , e também os correspondentes hidrogenofosfatos e di-hidrogenofosfatos, ou hidróxido de amónio (NH4OH), sendo que o pH da solução alcalina encontra-se entre 8 e 14.

Numa outra realização preferencial, a separação é efetuada por decantação ou centrifugação.

Numa outra realização preferencial, a acidificação da fase aquosa é feita com soluções de ácidos inorgânicos, tais 5 como os ácidos sulfúrico, clorídrico e nítrico, e ácidos orgânicos, tais como os ácidos acético e propiónico, e o pH da solução ácida encontra-se entre 1 e 5.

Outro objeto da presente invenção são extratos obtidos através do método descrito acima, em que o teor em ácidos triterpénicos está compreendido na gama de 93-98%.

Outro objeto da presente invenção é a utilização dos extratos descritos acima, em que são utilizados na indústria de produtos farmacêuticos, de nutracêuticos, de cosméticos e de alimentos funcionais.

Descrição das figuras

Figura 1 - Etapas do método para a obtenção de extratos enriquecidos em ácidos triterpénicos, a partir das cascas de espécies de Eucalyptus.

Figura 2 - Cromatograma de GC-MS do extrato enriquecido em ácidos triterpénicos obtido usando a presente metodologia. (IS: padrão interno).

Descrição detalhada da invenção A presente invenção refere-se a um método para obtenção de extratos enriquecidos em ácidos triterpénicos a partir da casca de espécies de Eucalyptus, delineado na Fig. 1. 0 método compreende quatro etapas principais: (1) secagem e moagem da casca; (2) extração sólido-líquido dos resíduos de casca com um solvente orgânico, preferencialmente com n-hexano; 6 (3) fracionamento deste extrato bruto por tratamento com uma solução aquosa alcalina, seguida pela separação da fase aquosa, a sua filtração e acidificação e, finalmente, (4) isolamento da fracção sólida enriquecida em ácidos triterpénicos através de filtração, centrifugação ou extração com solventes orgânicos apoiares, preferencialmente hexano, seguida de remoção do solvente.

Por fim, este processo pode ainda compreender uma etapa de cristalização. 0 resultado deste processo é um pó esbranquiçado com um teor em ácidos triterpénicos de cerca de 93-98%. A casca usada como matéria-prima pode ser obtida a partir de diferentes espécies de Eucalyptus, nomeadamente, E. globulus, E. urograndis, E. grandis x globulus, E. maidenii, E. grandis e E. nitens, entre outros. Pode ser usada biomassa fresca ou caduca, mas deve ser preferencialmente seca e moida antes da extração com solvente. As etapas de secagem e moagem incluem metodologias conhecidas tais como liofilização, secagem ao ar, secagem com ar quente, e quaisquer moagens mecânicas tais como, por exemplo, moagens com lâminas, facas ou martelos, respetivamente. A humidade residual e granulometria das amostras de casca utilizadas neste processo encontram-se abaixo de 15% e 60 mesh, respetivamente. 7 0 solvente usado para a extração inclui solventes apoiares, preferencialmente n-hexano. Esta operação pode ser executada por procedimentos convencionais tais como maceração, extração sob refluxo, Soxtec, Soxhlet, extração acelerada por solvente, ou qualquer outra técnica de extração sólido-líquido. 0 extrato bruto orgânico é seguidamente tratado com uma solução aquosa alcalina, até pH entre 8 e 14, preferencialmente de NaOH ou KOH, ou carbonatos (Na2CC>3 ou K2CO3) assim como os correspondentes hidrogenofosfatos, ou fosfatos (Na3PC>4 ou K3PO4) e também os correspondentes hidrogenofosfatos e di-hidrogenofosfatos, ou o hidróxido de amónio (NH4OH), para promover a conversão dos ácidos triterpénicos nos correspondentes sais e a sua respetiva migração para a fase aquosa. A separação da fase orgânica é efetuada por decantação ou por qualquer outra técnica de separação líquido-líquido, tal como por centrifugação. A fase aquosa é filtrada por métodos convencionais e acidificada até pH<3, preferencialmente com ácidos inorgânicos tais como os ácidos sulfúrico, clorídrico e nítrico, e soluções de ácidos orgânicos, tais como os ácidos acético e propiónico.

Os ácidos triterpénicos precipitados podem finalmente ser isolados por extração com um solvente orgânico, filtração ou centrifugação.

Exemplos

Daqui em diante, a presente invenção é descrita em mais detalhe e especificamente com referência aos Exemplos, que todavia não pretendem limitar a presente invenção.

Extração Sólido-Líquido da casca externa

Aproximadamente 100 g de casca externa de Eucalyptus globulus foram secos ao ar, à temperatura ambiente, para produzir aproximadamente 70 g de casca seca com menos de 10% de humidade em peso, e de seguida moídos de forma a passar por um crivo de 2 mm. A extração da casca moída seca foi efetuada num sistema Soxhlet com 1 L de n-hexano como solvente, à temperatura de refluxo. A extração durou seis horas. A evaporação, num evaporador rotativo sob vácuo, e a secagem do extrato bruto em n-hexano acima referido rendeu 1.1 g (rendimento de 1.8%, m/m) de um resíduo bruto seco e verde. O teor total em triterpenóides deste resíduo foi de 49.1% em massa, contendo 14.4% de ácido ursólico, 12.8% de ácido 3-acetil-ursólico, 5.7% de ácido oleanólico, 5.3% de ácido betulínico, 5.1% de ácido betulónico e 3.5% de ácido 3-acetil-oleanólico, sendo os remanescentes 2.4% outros compostos triterpénicos.

Fracionamento dos extratos da casca externa O extrato bruto em 1 L de n-hexano foi extraído com 1 L de solução aquosa de hidróxido de sódio (NaOH) 0.1 Μ. A fase aquosa foi separada da fase do n-hexano por decantação, e filtrada sob vácuo através de discos de membranas de nylon com porosidade 0.45 pm, sendo obtida uma solução límpida. A referida solução foi acidificada com uma solução aquosa com ácido sulfúrico (H2SO4) 2 M até pH<3, resultando numa suspensão de precipitado esbranquiçado. O precipitado foi filtrado sob vácuo, lavado com 1 L de água destilada até pH neutro, e seco a 105 °C durante 3 h. 9

Foram obtidos 407 mg de um pó esbranquiçado, que consiste numa soma de ácidos triterpénicos, com um teor minimo de 97,8% em massa composto por: 52.4% de ácido ursólico, 17.3% de ácido oleanólico, 13.2% de ácido betulónico, 9.7% de ácido betulinico, e 5.2% de outros ácidos triterpénicos (Fig. 2) . A caracterização qualitativa e quantitativa do extrato bruto em n-hexano e das frações enriquecidas em ácidos triterpénicos, produzidos de acordo com a invenção, foi realizada através da aplicação da cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (GC-MS).

Referências

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As reivindicações seguintes definem uma forma de realização particular da invenção.

Lisboa, 09 de Agosto de 2013

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método para a obtenção de um extrato rico em ácidos triterpénicos, caracterizado por compreender as etapas seguintes: i) secagem e moagem da casca de eucalipto; ii) extração da casca com um solvente orgânico; iii) fracionamento do extrato bruto por tratamento com uma solução aquosa alcalina; iv) separação da fase aquosa; v) clarificação por filtração; vi) acidificação com um ácido inorgânico ou orgânico; vii) isolamento da fracção precipitada de ácidos triterpénicos.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por compreender ainda uma etapa de cristalização.
3. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a casca de eucalipto ser obtida a partir de espécies de Eucalyptus, nomeadamente, E. globulus, E. urograndis, E. grandis x globulus, E. maidenii, E. grandis e E. nitens.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por na etapa i) a humidade residual e a granulometria das amostras de casca serem inferiores a 15% e 60 mesh, respetivamente.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por na etapa ii) o solvente orgânico ser diclorometano, n-heptano, n-hexano ou outros solventes apoiares. 1
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a solução alcalina da etapa iii) poder ser uma solução aquosa compreendendo no minimo um dos: hidróxidos metálicos (KOH ou NaOH) ou carbonatos (Na2CC>3 ou K2CO3) , assim como os correspondentes hidrogenocarbonatos ou fosfatos (Na3P04 ou K3PO4) , e também os correspondentes hidrogenofosfatos e di-hidrogenofosfatos, ou o hidróxido de amónio (NH4OH).
7. Método de acordo com a reivindicação anterior, caracterizado por o pH da solução alcalina na etapa iii) estar compreendido entre 8 e 14.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a separação na etapa iv) ser efetuada por decantação ou centrifugação.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por a acidificação da fase aquosa na etapa vi) ser feita com soluções de ácidos inorgânicos, tais como os ácidos sulfúrico, clorídrico e nítrico, e soluções de ácidos orgânicos, tais como os ácidos acético e propiónico.
10. Método de acordo com a reivindicação anterior caracterizado por o pH da solução ácida estar compreendido entre 1 e 5.
11. Extratos obtidos através do método descrito nas reivindicações anteriores, caracterizados por a pureza da fração de ácidos triterpénicos purificados estar compreendida na gama de 93-98%. 2
12. Utilização dos extratos descritos na anterior, caracterizada por aplicações farmacêuticos, nutracêuticos, cosméticos funcionais. Lisboa, 06 de Setembro de 2013 reivindicação em produtos e alimentos 3