ES2525953B2 - Método de obtención de un extracto rico en ácidos triterpénicos de corteza de eucalipto - Google Patents

Método de obtención de un extracto rico en ácidos triterpénicos de corteza de eucalipto Download PDF

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Abstract

La presente invención se refiere a un método de obtención de extractos que tienen contenidos muy altos (de hasta el 98%) de ácidos triterpénicos, principalmente ácido oleanólico y ácido ursólico, de corteza de eucalipto. El método implica la extracción sólido-líquido de la corteza con disolventes orgánicos, preferentemente hexano, y el fraccionamiento del extracto en bruto por medio de un tratamiento sencillo con una solución alcalina, seguido de la separación de la fase acuosa, su filtración, acidificación y, finalmente, el aislamiento de la fracción enriquecida en ácidos triterpénicos por medio de filtración, centrifugación o extracción con un disolvente orgánico, preferentemente hexano, seguida de la eliminación del disolvente. La presente invención tiene aplicación en las industrias farmacéutica, nutracéutica, cosmética y de alimentos funcionales.

Description

MÉTODO DE OBTENCiÓN DE UN EXTRACTO RICO EN ÁCIDOS TRITERPÉNICOS DE CORTEZA DE EUCALIPTO
DESCRIPCiÓN
Campo de la Invención
5 La presente invención se refiere a un método de obtención de extractos que tienen contenidos muy altos (de hasta el 98 %) de ácidos triterpénicos, principalmente ácido oleanólico y ácido ursólico, de corteza de eucalipto. El método implica la extracción sólido-líquido de la corteza con disolventes orgánicos, preferentemente hexano, y el fraccionamiento del extracto en bruto por medio de un tratamiento sencillo con una
10 solución alcalina, seguido de la separación de la fase acuosa, su filtración, acidificación y, finalmente, el aislamiento de la fracción enriq uecida en acidos triterpénicos por medio de filtración, centrifugación o extracción con un disolvente orgánico, preferentemente hexano, seguida de la eliminación del disolvente.
Estado de la Técnica
15 Los ácidos triterpénicos pentacíclicos con esqueletos de lupano, ursano y oleanano, como el ácido betulínico, ácido ursólico, ácido 3-acetilursólico, ácido oleanólico y ácido 3-acetiloleanólico, tienen una amplia selección de actividades farmacológicas y efectos biológicos únicos y potencialmente utilizables (Yogeeswari y Sriram, 2005).
Es conocido que el ácido betulínico presenta propiedades contra el VIH,
20 antibacterianas, contra la malaria, antiinflamatorias y antioxidantes (Tolstikova el al., 2006, Yogeeswari y Sriram, 2005). El ácido oleanólico y el ácido ursólico también son conocidos por tener actividad antimicrobiana (Horiuchi el al., 2007, Kuete el al., 2007, Sattar el al., 1995) y una importante actividad antitumoral (Li el al., 2002), así como propiedades antiinflamatorias (Singh el al., 1992). Además, el ácido oleanólico reveló
25 actividades antialérgicas y contra el VIH (Sultana y Ata, 2008), y el ácido ursólico es un compuesto supresor útil para el tratamiento de la artritis reumatoide con bajo riesgo de generar problemas gástricos (Kang el al., 2008).
El interés en compuestos naturales bioactivos, para su aplicación en productos farmacéuticos, nutracéuticos, cosméticos y alimentos funcionales, alentó el desarrollo 30 de varios métodos de obtención de extractos vegetales enriquecidos en los ácidos triterpénicos anteriormente mencionados. Se han descrito varias partes morfológicas de las plantas como posibles fuentes de dichos compuestos naturales como, por ejemplo, agujas o corteza de abelo (RU 2108803), hojas de caqui (eN 101538309), piel de manzana (EP 1250852, EP 1161879), hojas de olivo (WO 2005075614), hojas de nispero japonés (US 2009275778) y corteza de abedul (WO 2005047304). Las 5 metodolog ías publicadas para la obtención de extractos enriquecidos en ácidos triterpénicos implican la extracción de los sustratos vegetales con un sistema de disolvente orgánico (por ejemplo, alcohol etílico, acetato de etilo, éter de petróleo, acetona, hexano, cloroformo, metilbutiléter, benceno, xilenos, entre otros), seguida de procedimientos complejos de fraccionamiento basados en extracciones líquido-líquido 10 sucesivas (US 6740778), procedimientos de cromatografía en columna (WO 03011891 , eN 101538309, eN 101759756, US 2009275778), extracción en columna a contracorriente supercrítica (WO 2005075614), cristalización y recristalización (WO 2006088385, RO 122244, WO 2005047304, eN 101759756, EP 1161879) o el tratamiento del extracto orgánico con soluciones alcalinas (RU 2151139, RU 2108803,
15 RU 2108107). El uso de disolventes orgánicos sumamente peligrosos, en concreto, cloroformo, benceno y xilenos, y de procedimientos de fraccionamiento muy complejos, cuando se desean altas purezas, constituye los principales inconvenientes de algunas de dichas tecnologías.
La corteza exterior de varias especies de eucalipto contiene altas cantidades de varios
20 ácidos triterpénicos, en concreto, ácido betulónico, ácido betulínico, ácido 3acetilbetulínico, ácido ursólico, ácido 3-acetilursólico, ácido oleanólico y ácido 3acetiloleanólico, y se puede estudiar para la obtención de dichos compuestos bioaClivos (Domingues el al. , 2010, Domíngues el al. , 2011 , Freire el al., 2002).
La novedad de la presente invención reside en el uso de residuos de corteza de
25 eucalipto (y, particularmente, de Euca/yptus globulus) para la obtención de extractos con altas cantidades (de hasta el 98 %) de ácidos triterpénicos por medio de la extracción sólido-líquido con un disolvente orgánico, preferentemente n-hexano, seguida del fraccionamiento a través del tratamiento secuencial con soluciones alcalinas/ácidas. El método propuesto tiene la ventaja de ser muy eficaz y de
30 industrializarse fácilmente en comparación con algunas de las tecnologías disponibles.
Resumen de la Invención
El objeto de la presente invención es un método de obtención de extractos ricos en ácidos triterpénicos que comprende las siguientes etapas:
i) secar y moler la corteza de eucalipto; ii) extraer la corteza con un disolvente organico; ¡ii) fraccionar el extracto en bruto mediante el tratamiento con una solución acuosa alcalina;
5 iv) separar la fase acuosa; v) aclarar mediante filtración ; vi) acidificar con un ácido inorgánico u orgánico; vii) aislar la fracción precipitada de ácidos triterpénicos. En una realización preferida, el método comprende además una etapa de
10 cristalización. En otra realización preferida, la corteza de eucalipto se obtiene de especies de eucalipto, en concreto, de E. globulus, E. urograndis, E. grandis x globulus, E. maidenii
E. grandis y E. nitens, y la humedad residual y la granulometría de las muestras de corteza es inferior al 15 % Y de malla 60, respectivamente.
15 En otra realización preferida, el disolvente orgánico usado es diclorometano, nheptano, n-hexano u otro disolvente no polar, y la solución acuosa comprende al menos uno entre: hidróxido de metal (KOH o NaOH) o carbonato de metal (Na2C03 o K2C03), así como los correspondientes hídrogenocarbonatos, o fosfato (Na3P04 o K3P04), así como los correspondíentes hidrogenofosfatos y dihidrogenofosfatos, o
20 hidróxido de amonio (NH40H), de modo que el pH de la solución acuosa alcalina sea de entre 8 y 14.
En otra realización preferida, la separación se realiza por decantación o centrifugación.
En otra realización preferida, la acidificación de la fase acuosa se realiza con soluciones de ácidos inorgánicos tales como ácido sulfúrico, ácido clorhídrico y ácido 25 nítrico, y soluciones de ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido propiónico, y el pH de la solución de ácido es de entre 1 y 5.
Otro objeto de la presente invención son los extractos obtenidos mediante el método descrito anteriormente, en que el contenido de ácidos triterpénicos está en el intervalo del 93-98 %.
Otro objeto de la presente invención es el uso de los extractos descritos anteriormente, que se usan en las industrias farmacéutica, nutracéutica, cosmética y de alimentos funcionales.
Descripción de las Figuras
Figura 1: etapas del método de obtención de extractos enriquecidos en ácidos triterpénicos de corteza de especies de eucalipto.
Figura 2: cromatograma típico de GC-MS de los extractos enriquecidos en ácidos triterpénicos obtenidos usando la presente metodología. (PI: patrón interno)
Descripción Detallada de la Invención
La presente invención se refiere a un método de obtención de extractos enriquecidos en ácidos triterpénicos de corteza de especies de eucalipto, explicado resumidamente en la Fig. 1.
El método comprende cuatro etapas principales:
(1 ) secar y moler la corteza;
(2)
realizar la extracción sólido-liquido de los residuos de corteza con un disolvente orgánico, preferentemente con n-hexano;
(3)
fraccionar dicho extracto en bruto mediante el tratamiento con una solución acuosa alcalina, seguido de la separación de la fase acuosa, su filtración y acidificación; y, por último,
(4)
aislar la fracción sólida enriquecida en ácidos triterpénicos por medio de filtración, centrifugación o extracción con un disolvente orgánico no polar, preferentemente hexano, seguido de la eliminación del disolvente.
Por último, dicho proceso también puede comprender una etapa de cristalización.
El resultado de dicho proceso es un polvo blanquecino con un contenido de ácidos triterpénicos del aproximadamente 93-98 %.
La corteza usada como materia prima se puede obtener de diferentes especies de eucalipto, en concreto, de E. globulus, E. urograndis, E. grandis x globulus, E. maidenii
E. grandis y E. nitens, entre otras. Se puede usar biomasa fresca o en descomposición, pero preferentemente se debe secar y moler antes de la extracción con disolvente. Las etapas de secado y molienda incluyen metodologías conocidas tales como liofilización, secado al aire, secado por aire caliente y cualquier molienda mecánica tal como, por ejemplo, molienda con cuchilla, cuchillo o martillo, respectivamente. La humedad residual y la granulometría de la corteza usada en dicho proceso es inferior al1 5 % y de malla 60, respectivamente.
El disolvente usado para la extracción incluye disolventes orgánicos no polares, preferentemente n-hexano. Dicha operación se puede realizar usando procedimientos convencionales tales como la maceración, extracción bajo reflujo, Soxtec, Soxhlet, extracción acelerada con disolvente o cualquier otra técnica de extracción sólido
liquido.
A continuación, se trata el extracto orgánico en bruto con una solución acuosa alcalina, hasta un pH de entre 8 y 14, preferentemente NaOH o KOH, o carbonato (Na2C03 o K2C03), así como los correspondientes hidrogenocarbonatos, o fosfato (Na3P04 o K03P04), así como los correspondientes hidrogenofosfatos y dihidrogenofosfatos, o hidróxido de amonio (NH40H), para promover la conversión de los ácidos triterpénicos en las sales correspondientes y su migración a la fase acuosa. La separación de la fase orgánica se realiza por decantación o por cualquier otra técnica de separación líquido-líquido, tal como centrifugación.
La fase acuosa se filtra, por medio de métodos convencionales, y se acidifica hasta un pH < 3, preferentemente con un ácido inorgánico tal como ácido sulfúrico, ácido clorhídrico y ácido nítrico, y soluciones de ácidos orgánicos tales como ácido acético y ácido propiónico.
Por último, los ácidos triterpénicos precipitados se pueden aislar por extracción con un disolvente orgánico, filtración o centrifugación.
Ejemplos De aquí en adelante, la presente invención se describe con más detalle y específicamente con referencia a los ejemplos, que, sin embargo, no pretenden limitar la presente invención.
Extracción sólido-líquido de corteza exterior
Se secaron al aire aproximadamente 100 9 de corteza exterior de Eucalyptus globulus, a temperatura ambiente, produciéndose aproximadamente 70 9 de corteza seca con menos del 10 % en peso de humedad, y luego se molieron para hacerlos pasar a través de un tamiz de 2 mm.
La extracción de la corteza molida seca se realizó en un aparato de extracción Soxhlet con 1 I de n-hexano como disolvente, a la temperatura de reflujo. La extracción duró 6 horas.
La evaporación, en un evaporador de rotación al vacío, y el secado del anterior extracto de n-hexano en bruto proporcionó 1,1 9 (rendimiento del 1 ,8 % en peso) de un residuo seco verde en bruto. El contenido total de triterpenoides de dicho residuo era del 49,1 % en peso, y contenía el 14,4 % de ácido ursólico, el 12,8 % de ácido 3acetilursólico, el 5,7 % de ácido oleanólico, el 5,3 % de ácido betulínico, el 5,1 % de ácido betulónico y el 3,5 % de 3 ácido 3-acetiloleanólico, siendo el 2,4 % restante de otros compuestos triterpénicos.
Fraccionamiento del extracto de corteza externa
Se extrajo el extracto de 1 I de n-hexano en bruto con 1 I de solución acuosa de hidróxido de sodio 0,1 M (NaOH). Se separó la fase acuosa de la fase de n-hexano por decantación, y se filtró al vacío a través de discos de membrana de nylon de
porosidad de 0,45 11m, obteniéndose una solución transparente. Se acidificó dicha solución hasta pH < 3 con ácido sulfúrico 2 M (H2S04), generándose una suspensión de precipitado blanquecino. Se filtró el precipitado al vacío, se lavó con 1 I de agua destilada hasta pH neutro y se secó a 105 oC durante 3 h.
Se obtuvieron 407 mg de un polvo blanquecino, que consistía en una suma de ácidos triterpénicos, con un contenido mínimo del 97,8 % en peso compuesto de: el 52,4 % de ácido ursólico, el 17,3 % de ácido oleanólico, el 13,2 % de ácido betulónico, el 9,7 % de ácido betulínico y el 5,2 % de otros ácidos triterpénicos (Fig. 2).
La caracterización cualitativa y cuantitativa del extracto de n-hexano en bruto y de las
fracciones enriquecidas en ácidos triterpénicos, producidas de acuerdo con la invención, se realizó mediante la aplicación de cromatografía de gases acoplada a espectrometría de masas (GC-MS).
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Las siguientes reivindicaciones exponen una realización particular de la invención.

Claims (8)

  1. REIVINDICACIONES
    1.-Método de obtención de extractos ricos en ácidos triterpénicos, caracterizado por
    que comprende las siguientes etapas: i) secar y moler la corteza de eucalipto hasta una granulometría de malla inferior a 60 y una humedad residual inferior al 15 %;
    ii) extraer la corteza con un disolvente orgánico no polar seleccionado de entre diclorometano, n-heptano o n-hexano; ¡ii) fraccionar el extracto bruto por tratamiento con una solución acuosa alcalina; iv) separar la fase acuosa; v) aclarar mediante filtración; vi) acidificar con un ácido inorgánico u orgánico;
    vii) aislar la fracción precipitada de ácidos triterpénicos. 2.-Método según la reivindicación 1, caracterizado por que comprende además una etapa de cristalización.
  2. 3.-Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que dicho eucalipto es E. globulus, E. urograndis, E. granáis x globulus, E. maidenií E. gradis y E. nitens.
  3. 4.-Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la solución alcalina de la etapa iii) es una solución acuosa que comprende al menos una de entre: hidróxido de sodio o potasio, o carbonato de sodio o potasio, así como los correspondientes hidrogenocarbonatos, o fosfato de sodio o potasio, así como los correspondientes hidrogenofosfatos y dihidrogenofosfatos, o hidróxido de amonio.
  4. 5.
    Método según la reivindicación anterior, caracterizado por que el pH de la solución acuosa alcalina de la etapa iii) es de entre 8 y 14.
  5. 6.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la separación de la etapa iv) se realiza por decantación o centrifugación.
  6. 7.
    Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la acidificación de la fase acuosa de la etapa vi) se realiza con soluciones de ácido sulfúrico, ácido clorhídrico, ácido nítrico, ácido acético o ácido propiónico.
    11
    ES 2 525 953 82
    5 8. Método según la reivindicación anterior, caracterizado por que el pH de la solución de ácido es de entre 1 y 5.
  7. 9. Extractos obtenidos por el método descrito en las reivindicaciones anteriores, caracterizados por que la pureza de la fracción de ácidos triterpénicos está en el intervalo del 93-98 %.
    10
  8. 10. Uso de los extractos descritos en la reivindicación anterior en las industrias farmacéutica, nutracéutica, cosmética o de alimentos funcionales.
    15
    12
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