PT101052B - Proteinas hibridas uteis na preparacao de vacinas e processo para a sua preparacao - Google Patents
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Description
presente invento diz respeito a uma nova proteína compreende um segmento da proteína CS de P. falciparum e de superfície do vírus da Hepatite B.
também referida a utilização desta proteína para fins de
presente invento está relacionado com uma nova proteína híbrida, sua utilização em medicina, particularmente na prevenção de infecções de malária e vacinas contendo-a.
A malária é um dos principais problemas de saúde a nível mundial morrendo por ano 2 a 4 milhões de pessoas. Uma das formas mais agudas da doença é causada pelo parasita protozoário Plasmodium falciparum o qual é responsável pela maior parte da mortalidade atribuída à malária.
ciclo de vida do P. falciparum é complexo requerendo dois hospedeiros, o homem e o mosquito, para se completar. A infecção do homem é iniciada pela inoculação de esporozóitos na saliva do mosquito infectado. Os esporozóitos migram para o fígado e aí infectam hepatócitos onde se diferenciam, via uma fase intracelular exoeritrocítica, para a fase de merozóito a qual infecta os eritrócitos (RBC) para iniciar a replicação cíclica da fase assexuada no sangue. O ciclo é completado pela diferenciação de uma série de merozóitos no RBC para gametócitos na fase sexuada os quais são ingeridos pelo mosquito, onde eles se desenvolvem através de uma série de fases no intestino médio para produzir esporozóitos que migram para a glândula salivar.
A fase de esporozóito do P. falciparum foi identificada como um alvo potencial de uma vacina contra a malária. A principal proteína de superfície do esporozóito é conhecida como a proteína do circunsporozóito (Proteína CS). Esta proteína da estirpe 7GS foi clonada, expressa e sequenciada (Dame et al, Science 225 (1984) p593). A proteína da estirpe 7G8 é caracterizada por ter uma região repetida central imunodominante compreendendo um tetrapeptídeo Asn-Ala-Asn-Pro repetido 37 vezes mas intercalado com quatro repetições menores Asn-Val-Asp-Pro. Noutras estirpes o número de repetições major e minor variam assim como as suas posições relativas. Esta fracção central é flanqueada por uma fracção terminal N e C composta por sequências de aminoácidos não repetitivas designadas como a fracção sem repetições da proteína CS.
Foi demonstrado que os esporozóitos irradiados podem proporcionar protecção significativa contra malária humana experimental (Am, J. Trop. Med, Hyg. 24.:297-402, 1975). No entanto, a dificuldade de produção torna a utilização de esporozóitos irradiados impraticável sob o ponto de vista de produção de uma vacina.
Vários grupos propuseram vacinas de subunidades baseadas na proteína do circunsporozõito. Duas destas vacinas sofreram testes clínicos; uma é um peptídeo sintético, a outra é uma proteína recombinante (Bailou et al. Lancet: i 1277 (1987) e Herrington et al. Nature 328: 257 (1987).
Estas vacinas tiveram êxito resposta anti-esporozóito. No entanto, desapontador, com algumas vacinas não resposta. Ainda, a ausência de reforço na estimulação de o grau da resposta dando qualquer tipo dos níveis de anticorpos uma foi de em injecções subsequentes e resultados de ensaios de proliferação de linfócitos in vitro sugeriram que as células T da maior parte dos voluntários não reconheceram a repetição imunodominante. No entanto, um vacinado em cada estudo não desenvolveu parasitémia.
presente invento proporciona um novo antigénio melhorado para usar em vacinas contra a malária o qual não só produz uma resposta humoral, como também uma resposta imune celular. De preferência o antigénio induz a produção de anticorpos neutralizantes contra a repetição imunodominante. Mais preferencialmente, o antigénio deverá também induzir respostas
imunes mediadas por células T efectoras do tipo linfócito T citotóxico (CTL) CD4+ e CD8+ e do tipo hipersensibilidade do tipo retardado e também, de preferência ser capaz de induzir células de memória T auxiliares (TH).
Assim, o presente invento proporciona uma proteína híbrida compreendendo substancialmente toda a fracção C-terminal da proteína CS, quatro ou mais repetições em tandem da região imunodominante e o antigénio de superfície do vírus d hepatite (HBsAg). De preferência a proteína híbrida compreende uma sequência que contem pelo menos 160 aminoãcidos que é substancialmente homóloga da fracção C-terminal da proteína CS. A proteína Cs pode não ter pelo menos 12 aminoãcidos do extremo C.
Em particular é proporcionada uma proteína que compreende uma fracção da proteína CS de P. falciparum 7G8 fundida na mesma grelha de leitura de um ligante linear ao extremo N de HBsAg. O ligante pode compreender uma fracção de preS2 do HBsAg.
O presente invento também proporciona sequências de DNA codificadoras das proteínas do presente invento.
Uma realização particularmente preferida é a proteína híbrida designada RTS. A sequência de aminoãcidos de RTS está apresentada na figura 5. Este híbrido consiste em:
0 Um resíduo metionina, codificado pelos nucleótidos 1059 a 1061, derivado da sequência do gene TDH3 de Saccharomvces cerevisiae. (Musti A.M. et al. Gene 1983 25 133-143).
° Três aminoãcidos, Met Ala Pro, derivados de uma sequência de nucleótidos (1062 a 1070) criada pelo processo de clonagem usado para construir o gene híbrido.
° Um segmento de 189 aminoácidos, codificado pelos nucleótidos 1071 a 1637 representando os aminoácidos 210 a 398 da proteína do circunsporozóito (CSP) de Plasmodium falcioarum estirpe 7G8 (Dame et al, supra).
° Um aminoácido (Ag) codificado pelos nucleótidos 1638 a 1640, criado pelo processo de clonagem usado para construir o gene híbrido.
° Quatro aminoácidos, Pro Vai Tre Asn, codificados pelos nucleótidos 1641 a 1652 e representando os quatro resíduos do extremo carbonilo da proteína preS2 do vírus da hepatite B (serotipo adw) (9).
0 Um segmento de 226 ainoácidos, codificado pelos nucleótidos 1653 a 2330 e especificando a proteína S do vírus da hepatite (serotipo adw).
Numa realização alternativa é proporcionada uma proteína híbrida designada RTS* a qual foi gerada usando a sequência do gene CSP derivado de P. falciparum NF54 (Mol. Biochem, Parasitol. 35: 185-190, 1989) e que compreende substancialmente toda a região 207 a 395 da proteína CS de P. falciparum NF54.
Em particular RTS* compreende:
0 Uma metionina codificada pelos nucleótidos 1059 a 1061, derivada da sequência do gene TDH3 0 Três aminoácidos, Met Ala Pro, derivados de uma sequência de nucleótidos (1062 a 1070) criados pelo processo de clonagem usado para construir o gene híbrido.
° Um segmento de 189 aminoâcidos, codificado pelos nucleótidos 1071 a 1637 representando os aminoâcidos 207 a 395 da proteína do circunsporozóito (CSP) de Plasmodium falcinarum estirpe NF54 (Mol. Biochem. Parasitol. .35:185-190, 1989).
° Um aminoácido (Gli) codificado pelos nucleótidos 1638 a 1640, criado pelo processo de clonagem usado para construir o gene híbrido.
0 Quatro aminoâcidos, Pro Vai Tre Asn, codificados pelos nucleótidos 1641 a 1652 e representando os quatro resíduos do extremo carbonilo da proteína preS2 do vírus da hepatite B (serotipo adw) (Nature 280:815-819, 1979).
0 Um segmento de 226 aminoâcidos, codificados pelos nucleótidos 1653 a 2330 e especificando a proteína S do vírus da hepatite B (serotipo adw) (Nature 280: 815-819, 1979).
A sequência de aminoâcidos de RTS* está descrita na Figura 9.
Construiu-se uma cassete de expressão contendo RTS* a qual possui as seguintes características:
° Uma sequência de promotor indo desde o nucleótidos 1 a 1058, derivada do gene TDH3 de S. cerevisiae.
° Uma grelha de leitura aberta começando no nucleótido 1059 e prolongando-se até ao nucleótido 2330. Esta grelha de leitura aberta é seguida imediatamente de um codão de paragem da tradução, TAA (nucleótidos 2331 a 2333). A grelha de leitura aberta codifica os aminoâcidos que especificam a proteína RTS*.
° Uma sequência de terminação da transcrição contida dentro da sequência que se prolonga desde o par de bases 2334 a 3504, derivado do gene ARG3 de S. cerevisiae.
A sequência de nucleótidos está descrita na figura 10.
As sequências de DNA codificadoras das proteínas do presente invento são, numa realização preferida, flanqueadas por elementos de controle da transcrição, de preferência derivados de genes de leveduras e incorporados num vector de expressão.
Tais vectores são ainda uma aspecto do presente invento. Um promotor preferido é o promotor do gene TDH3 de S. cerevisiae (Musti et al. supra).
O invento também está relacionado com uma célula hospedeira transformada com um vector de acordo com o invento. As células hospedeiras podem ser procarióticas ou eucarióticas mas preferencialmente, são de levedura, como seja S. cerevisiae. Em tal hospedeiro, a proteína híbrida, por exemplo RTS, será expressa como partícula lipoproteica. A estirpe de levedura recipiente escolhida preferencialmente já possui no. seu genoma várias cópias integradas de uma cassete de expressão de S da hepatite B. A estirpe resultante sintetisa dois polipeptídeos, S e RTS (ou outra proteína híbrida do invento), que espontaneamente são associadas em partículas lipoproteicas mistas (por exemplo RTS, S ou RTS*, S). Estas partículas, com vantagem apresentam as sequências CSP do híbrido na sua superfície. Estas partículas mistas também fazem parte do presente invento. Com vantagem nestas partículas mistas a proporção de RTS:S ou RTS*:S será de 1:4.
presente invento também está relacionado com vacinas compreendendo uma quantidade imunoprotectora de uma proteína ou
partícula de acordo com o invento misturado com um diluente ou veículo adequado.
Na vacina do invento, uma solução aquosa do híbrido pode ser usada directamente. Como alternativa, a proteína com ou sem liofilização prévia pode ser misturada ou absorvida com qualquer um dos adjuvantes conhecidos que incluem mas não estão limitados a alum, muramildipeptídeo, saponinas como seja Quil A.
Como alternativa ou em adição pode ser incluído um imuno-estimulador. Numa realização preferida este imuno-estimulador será monofosforil-lipido A 3 desacilado (3D-MPL).
O monofosforil-lipido A é conhecido da patente US N2 4,912,094 e pedido de patente UK N2 2,220,211 (Ribi) e está disponível na Ribi Immunochem, Montana, USA.
A proteína do presente invento pode também ser encapsulada em micropartículas tais como lipossomas.
A preparação de vacinas está descrita de um modo geral em New Trends and Developments in Vaccines, editado por Voller et al., University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A., 1978. A encapsulação em lipossomas está descrita por exemplo por Fullerton, Patente U.S. 4,235,877.
Podem ser usados adjuvantes convencionais mas um imuno-estimulante preferido é monofosforil-lipido A 3-desacilado (3D-MPL).
Tipicamente quando se usa 3D-MPL o antigénio e 3D-MPL são libertados com alum ou apresentados como uma emulsão de óleo em água ou múltiplas emulsões de óleo em áua. A incorporação de
3D-MPL é vantajosa pois é um estimulador das respostas de células T efectoras.
Assim, uma realização preferida do presente invento proporciona uma vacina compreendendo uma proteína híbrida como aqui descrito, de preferência RTS ou RTS* em combinação com 3D-MPL e um veículo. Tipicamente o veículo será uma emulsão de óleo em água ou alum.
Numa realização preferida a proteína híbrida é apresentada como uma partícula ou mistura de partículas como aqui descrito.
A quantidade da proteína do presente invento presente em cada uma das doses de vacina é seleccionada como uma quantidade que induz uma resposta imunoprotectora sem efeitos secundários significativos das vacinas típicas. Tal quantidade variará dependendo do imunogénio específico empregue e se a vacina tem ou não adjuvante. De um modo geral espera-se que cada uma doses compreenda 1-1000 μg de proteína, de preferência 1-200 μgf mais preferencialmente 10-100 μg. Uma quantidade facultativa para uma vacina particular pode ser determinada por estudos convencionais envolvendo a observação dos títulos de anticorpos e outras respostas em indíviduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos receberão preferencialmente um reforço em cerca de 4 semanas, seguido de reforços reptidos de seis em seis meses desde que haja risco de infecção. A resposta imune à proteína deste invento é aumentada pela utilização de adjuvante e/ou um imuno-estimulante.
As proteínas do presente invento são preferencialmente expressas em levedura e especialmente as pertencentes ao género Saccharomyces.
Um outro aspecto do presente invento é proporcionar um processo para a preparação . de proteína híbrida do invento, processo esse que se caracteriza pela expressão da sequência de DNA codificadora da proteína, num hospedeiro adequado, preferencialmente uma levedura e recuperação do produto.
Ê particularmente preferido expressar a proteína do invento numa estirpe de Saccharomyces. Quando RTS, por exemplo é expressa em tais estirpes dá origem espontaneamente a partículas lipoproteicas multiméricas.
Estas partículas são altamente imunogénicas e induzem uma forte resposta humoral, assim como memória imunológica e são também capazes de induzir células T efectoras dos tipos CTL e DTH.
Um outro aspecto do invento baseia-se num método de tratamento de um doente susceptível às infecções por plasmódio através da administração de uma quantidade eficaz de uma vacina como aqui descrito anteriormente.
Exemplo 1
1. CONSTRUÇÃO DE RTS,S estirpe RIT4383
A estirpe RIT4383 de S. cerevisiae usada para a produção de partículas contendo os polipeptídeos S e RTS, é portadora de cassetes de expressão separadas para cada proteína. A cassete de expressão do gene S foi integrada em 5 a 6 cópias pelo menos dois sítios no genoma usando um vector de integração linear com homologia relativamente aos retrotransposões Ty residentes. A cassete de expressão do gene RTS foi integrada em 2 a 3 cópias num ou em dois sítios no genoma, usando um vector de integração
linear semelhante ao empregue para a integração da cassete do gene S. A expressão a partir de ambos os tipos de cassete é conduzida por um promotor derivado do gene de levedura TDH3.
1.1 CONSTRUÇÃO DA CASSETE DE EXPRESSÃO S E VECTOR DE INTEGRAÇÃO ÍORIT13034)
A cassete de expressão do gene S (Figura IA) idêntica à encontrada na estirpe RIT4376 (1) consiste no fragmento promotor de tdh3 de 1058 pb, uma sequência do gene S de 681 pb, um espaçador de 6 pb contendo um adaptador EcoRI e um fragmento de 1165 pb portador do terminador da transcrição de Arq3. A sequência codificadora de S derivou da subclonagem de um clone genómico completo (pRIT10616) de um vírus do serotipo adw.
A estrutura do vector Ty, pRIT13034, usado na integração da cassete de expressão de s no genoma de levedura, eestã apresentada na Figura 2. A construção e a utilização deste tipo de vector para a integração das cassetes de expressão no genoma de levedura está descrito em Jacobs et al. (2). pRIT13034 contem a cassete do gene S, o gene URA e o gene CUP1 inserido dentro de uma cópia de um elemento Ty clonado em pUC9. O gene URA3 e o gene CUP1 ambos proporcionam marcas selectivas que permitem distinguir colónias de levedura transformadas de entre as colónias não transformadas. pUC9foi descrito por Vieira & Messing (3), o fragmento URA3 deriva do pFL44 (F. Lacroute, CNRS, Strasbourg), o fragmento CUP1 deriva de pUCPS (T. Butt, SKF Labs, Philadelphia), o elemento Ty veio de Juniaux et al., (4) e a cassete do gene S deriva do pRIT12353. A digestão do pRIT13034 com a endonuclease Xhol liberta o dragmento linear de 8500 pb apresentado na Figura 3 o qual pode integrar-se no genoma por recombinação homóloga dos extremos livres com elementos Ty residentes.
Exemplo 2
2. CONSTRUÇÃO DA ESTIRPE Y1295
A estirpe recipiente, EJ cuplD-3d (trpl. leu2. ura3. cupl. qallD, MAToó foi usada para a introdução inicial por transformação do fragmento vector linear derivado de pRIT13034. Esta estirpe contem um único locus cupl interrompido.
Após transformação com o fragmento linear Xhol, isolaram-se colónias Ura+ e fez-se o despiste por resistência ao cobre. Os transformantes mais resistentes integraram duas a cinco cópias do vector conforme determinado por análise de transferência Southern. Guardaram-se duas cópias de colónias transformantes, MS9 com 3a 4 cópias e MS23 com 4 a 5 cópias do vector linear integrado. A estirpe MS23 foi então cruzada com a estirpe EJ cuplD-7b (trpl, ura3, cupl, gallD. MATa) e recuperado um ascósporo haplóide para dar a estirpe MS23-2a.
A estirpe foi então cruzada com a estirpe parental MS9 e obtido um segregante haplóide Leu”,Trp (MS54-2c) contendo 5 a 6 cópias da cassete de expressão integrada. A transferência Southern mostrou que MS54-2C continha 4 a 5 cópias em tandem do vector de integração num locus e ainda uma cópia simples integrada num locus diferente. As 5 a 6 cópias da cassete de expressão estavam intactas pois a digestão do DNA celular total de levedura com a endonuclease HindIII liberta o fragmento da cassete e a transferência Southern com uma sonda específica do gene S deu uma só banda de 3 Kb conforme esperado. Obteve-se um revertente espontâneo Trp+ desta estirpe, MS54-2C-T e dado o número de acesso de laboratório Y1295.
Exemplo 3 CONSTRUÇÃO DA CASSETE DE' EXPRESSÃO RTS
A cassete de expressão para a proteína híbrida RTS foi construída por um processo de clonagem envolvendo vários passos e foi clonado no vector vai-vem E. coli-levedura Yepl3(6) dando um plasmídeo Yepl3RTS (Fig.4). A estrutura da cassete está apresentada na figura 1B. Toda a sua sequência de nucleótidos foi determinada por sequenciação directa (como para a sequência codificadora e partes das sequências flanqueantes de controle) ou por consulta d aliteratura importante (como para as partes do promotor e sequências de terminador). A sequência de DNA está ilustrada na figura 5. Ela contem os elementos que se seguem:
Uma sequência de promotor, estendendo-se desde o nucleótido 1 até ao 1058, derivado do gene de TDH3 de S. cerevisiae.
Uma grelha de leitura aberta começando no nucleótido 1059 e prolongando-se até ao nucleótido 2330. Esta grelha de leitura aberta ê imediatamente seguida de um codão de paragem da tradução, TAA (nucleótidos 2331 a 2333). A grelha de leitura aberta codifica os aminoácidos que especificam a proteína híbrida RTS.
Uma sequência de terminação da transcrição contida dentro da sequência que se estende entre os pares de bases 2334 e 3504, derivada do gene ARG3 de S. cerevisiae (Crabeel et al. EMBO J. 1983 2: 205-212).
A sequência de aminoácidos da proteína híbrida RTS, codificada pelos nucleótidos 1059 a 2330 está indicada na figura 5 e contem os seguintes elementos:
Um resíduo metionina, codificado pelos nucleótidos 1059 a 1061, derivado da sequência do gene TDH3.
Três aminoácidos, Met AlaPro, derivados de uma seuência de nucleótidos (1062 a 1070) criada pelo processo de clonagem usado para construir o gene híbrido.
Um segmento de 189 aminoácidos, codificados pelos nucleótidos 1071 a 1637 representando os aminoácidos 210 a 398 da proteína do circunsporozóito (CSP) do Plasmodium falciparum estirpe 7G8 (8).
Um aminoácido (Arg) codificado pelos nucleótidos 1638 a 1640, criado pelo processo de clonagem usado para construir o gene híbrido.
Quatro aminoácidos, Pro Vai Tre Asn, codificados pelos nucleótidos 1641 a 1652 e representando os quatro resíduos do extremo carbonilo da proteína preS2 do vírus da hepatite B (serotipo adw) (9) .
Um segmento de 226 aminoácidos, codificado pelos nucleótidos 1653 a 2330, especificando a proteína S do vírus da hepatite B (serotipo adw).
Exemplo 4 CONSTRUÇÃO DO VECTOR PRIT13539 INTEGRADOR DA CASSETE RTS
A construção do vector pRIT13539 integrador da cassete RTS está apresentada na figura 6.
A cassete de expressão de RTS foi inserida no vector integrador baseado em Ty pRIT13144. Este vector é um derivado de
pRIT12927 (2) no qual foi inserido o gene LEU2 no sítio Sall do elemento Ty como um fragmento Sall-Xhol isolado a partir do cvector pCV9 (7). Assim, após inserção da cassete de expressão RTS em pRIT13144, o plasmídeo resultante , pRIT13539, contem para além da cassete de expressão, o gene LEU2 de levedura como marca selectiva (figura 5). A digestão de pRIT13539 com a endonuclease BglII liberta um fragmento linear de 6800 pb apresentado na figura 7 o qual pode integrar-se no genoma por recombinação homóloga dos extremos livres com elementos residentes Ty.
Exemplo 5 TRANSFORMAÇÃO DA ESTIRPE Y1295 E GERAÇÃO DA
ESTIRPE RIT4383 (Y1530)
Para se obter uma estirpe que expressa ambas as proteínas S e RTS, Y1295 foi transformada com o fragmento linear BglII de 6800 pb (figura 7) com selecção de colónias Leu+. Obtiveram-se vários integrantes contendo séries de ambas as cassetes de expressão presentes no genoma em várias proporções. Um transformante seleccionado, expressando as proteínas RTS e S numa proporção de aproximadamente 1:4, recebeu a designação oficial de RIT4383 (o número de acesso do laboratório é Y1530).
Exemplo 5b Transformação da Estirpe Y1295 e Geração da estirpe Y1631
Uma construção semelhante (a RTS) foi gerada usando a sequência do gene CSP derivada de P. falciparum estirpe NF54 (Mol. Biochem. Parasitol. 35:185-190, 1989). A proteína de fusão obtida será designada RTS* para distingui-la da construção obtida com CSP derivada de P. falciparum 7G8.
A sequência da cassete de expressão está apresentada na Figura 9. Ela contem os seguintes elementos:
° Uma sequência de promotor, estendendo-se desde o nucleótido 1 até 1058, derivada do gene TDH3 de s. cerevisae.
0 Uma grelha de leitura aberta começando no nucleótido
1059 e estendendo-se até ao nucleótido 2330. Esta grelha de leitura aberta é imediatamente seguida de um codão de paragem da tradução, TAA (nucleótidos 2331 a 2333). A grelha de leitura aberta codifica os aminoácidos que especificam a proteína híbrida RTS*.
0 Uma sequência de terminação da transcrição contida dentro da sequência que se estende entre o par de bases 2334 e 3504, derivada do gene ARG3 de S. cerevisiae.
Esta cassete de expressão codificadora desta proteína de fusão RTS* foi usada para transformar e integrada no genoma da estirpe de levedura Y1295, usando a mesma abordagem descrita atrás para a construção de RTS. Obtiveram-se clones transformados expressando as proteínas S e RTS*. Foi seleccionado um transformante expressando as duas proteínas numa proporção de aproximadamente 4S:1RTS*. Ao clone foi dado o número de acesso do laboratório Y1631.
Exemplo 6
CARACTERIZAÇÃO PRELIMINAR DA ESTIRPE RIT4383
6.1 Análise por Imunotransferência
Extractos acelulares preparados a partir de RIT 4383 foram analisados por imunotransferência usando vários anticorpos:
° um anticorpo monoclonal dirigido contra a proteína S (Mab HBS1) ° um anticorpo monoclonal dirigido a parte repetida da proteína RTS (Mab 167) 0 um soro de coelho dirigido contra as sequências sem repetições da proteína RTS (soro de coelho ns 20).
Na estirpe de levedura RIT4383, dois produtos expressos foram reconhecidos pelo anticorpo monoclonal HBS1: uma proteína de 24 KD correspondendo à proteína S e uma proteína híbrida RTS de 4 6KD. A proteína híbrida RTS é também detectada pelos anticorpos dirigidos contra os epítopos repetidos e não repetidos da CSP. Estes resultados indicam claramente que a estirpe RIT4383 expressa simultaneamente os dois antigénios RTS e S numa proporção de RTS/S de aproximadamente 1:4.
6.2 Centrifugação em gradientes de densidade de CsCl
A formação de partículas na estirpe RIT4383 foi analisada por centrifugação em gradientes de densidade de cloreto de césio. O extracto bruto (± 15 mg de proteína total) foi analisado num gradiente de 10 ml de CsCl 1,5 M (68 horas a 40000 rpm, +8°C num rotor Beckman 50 Ti). Colheram-se fracções (0,5 ml) e analisaram-se por um radio-imunoensaio específico de HBsAg (AUSRIA), por uma ELISA específica de RTS e por imunotransferência usando um anticorpo monoclonal anti-HBsAg.
Como se mostra na Figura 8, ELISA, RIA e transferência Western surgem na mesma fracção (ns 13) do gradiente correspondendo a uma densidade de rho=l,21 sugerindo que partículas mistas contendo monómeros de S e RTS, são formadas nesta estirpe.
Exemplo 7
PREPARAÇÃO DE LOTES DE SEMENTEIRA
Processo de produção do lote de sementeira mãe
A estirpe Y1530 (RIT4383) é primeiro crescida durante 48 horas a 30°C em placas de Petri contendo 20 ml de YNB (Difco) esétril suplementado com dextrose (0,1%) e 1,8% (p/v) de agar YNB (Difco) estéril suplementado com dextrose (1%) e glicerol (10%). Esta suspensão foi distribuída em condições assépticas por frascos de polipropileno estéreis rolhados (1 ml por tubo) e guardada a -70°C.
Processo de produção de lotes de sementeira para trabalho
Um tubo de sementeira mãe foi rapidamente descongelado e o seu conteúdo foi espelhado com uma ansa de platina em placas de Petri preparadas como descrito atrás. Após incubação a 30°C durante 63 horas, parte da superfície de crescimento foi transferida para um frasco cónico de 2 1 contendo 400 ml de ciado YNB estéril (Difco) suplementado com dextrose (2%). A cultura foi incubada a 30°C durante 24 horas antes de ser centrifugada (15 minutos a 6300 xg) em condições assépticas. O sedimento foi ressuspenso em caldo YNB estéril (Difco) suplementado com dextrose (1%) e glicerol (10%). Esta foi distribuída em condições assépticas em tubos estéreis de vidro rolhados de 2ml (0,5 ml por tubo) e guardado a -70°C.
Exemplo 8: FERMENTAÇÃO
Preparação do inoculo (a) Crescimento em meio sólido
Uma ampola do lote de sementeira para trabalho foi rapidamente descongelado e espalhado sobre placas de Petri contendo caldo YNB estéril (Difco) suplementado com dextrose (1%) e 1,8% (p/v) de agar (Difco). As placas de Petri foram incubadas durante 48 horas a 300°C.
(b) Crescimento do inoculo crescimento de superfície de uma placa de Petri foi ressuspenso em caldo YNB estéril (Difco) suplementado com dextrose (2%) e distribuído igualmente por dois frascos cónicos (2 L, 400 ml de líquido por frasco). Os frascos foram incubados durante 24 horas a 30°C num agitador rotativo.
Fermentação vaso do fermentador (20 L de volume total) contendo 5L de água desionizada suplementada com (NH^J^SO^ (40 g) foi esterilizado in situ a 121°C durante 30 minutos usando vapor limpo pré-filtrado a 2 bar g de pressão. Após arrefecimento até à temperatura ambiente, o volume de líquido no fermentador foi ajustado a 4L e adicionado 1L de solução de HB4 esterilizado por filtração. A fermentação começou pela adição do inoculo (800 ml) derivado dos dois frascos cónicos.
A fermentação correu usando a técnica alimentação do lote pelo qual a cultura é continuamente alimentada com uma solução da composição que se segue.
- 5L de solução de HB4;
- 4L de dextrose a 80% (esterilizado a 121°C).
Os aumentos de densidade da cultura por crescimento aeróbico a 30°C e pH 5 (mantido pela adição de NH^OH) . 0 oxigénio dissolvido foi mantido a cerca de 50% de saturação por ajustamento do fluxo de ar e velocidade de agitação. A velocidade de adição da alimentação foi predeterminada para tornar máxima, a velocidade de crescimento e minimizar a formação do subproduto etanol.
A fermentação foi parada após 40-90 horas. No final da fermentação, o volume total de cultura é de 10-80 L e o peso seco de células é entre 30 e 100 g/L. A cultura foi rapidamente arrefecida até 15-25°C e as células de levedura foram recuperadas a partir do caldo por centrifugação. As células de levedura concnetradas foram lavadas uma vez com tampão de fosfatos (50 mM) antes de ser novamente centrifugado e subsequentemente guardado a -70°C em sacos de polietileno.
Componente | Quantidade | |
KH2PO4 | 41,00 | g |
MgSO4.7H 0 | 23,50 | g |
CaCl2.2H2O | 4,70 | g |
NaCl | 0,30 | g |
FeCl3.6H2O | 50,00 | mg |
H3BO3 | 28,00 | mg |
MnSO4.H2O | 22,40 | mg |
ZnSO4.7H2O | 22,40 | mg |
Na2MO4*H2° | 11,20 | mg |
Kl | 5,60 | mg |
CaCl .6H 0 | 5,10 | mg |
CuSO4.5H2O | 2,24 | mg |
Biotina | 2,70 | mg |
Ácido fólico | 2,70 | mg |
Inositol | 2,70 | mg |
Ca Pantotenato | 0,54 | mg |
Piridoxina.HC1 | 0,54 | mg |
Tiamina.HCl | 0,54 | mg |
Niacina | 1,20 | mg |
Ácido p-aminobenzóico | 0,60 | mg |
Riboflavina | 0,60 | mg |
HC1 (37°C) | 5,00 | ml |
Água desionizada (até) | 1,00 | litro |
Exemplo 9: Extracção e Purificação de RTS/S
PROCESSO DE EXTRACÇÃO
9.1 Preparação da suspensão de células
As células de levedura concentradas congeladas (a -70°C) foram descongeladas para -30°C durante a noite e subsequentemente descongeladas até 5-15°C colocando os sacos de polietileno contendo as células em água (10-20°C). Fez-se uma suspensão de células de levedura com uma solução de tampão de fosfatos (pH 8,0) contendo os seguintes ingredientes: ácido etilenodiaminatetracético (EDTA), fluoreto de p-metilsulfonilo (PMSF), isopropanol e tween 20.
9.2 Rebentamento das Células
As células foram rebentadas num moinho de esferas contendo esferas de vidro sem chumbo (0,49-0,70 mm de diâmetro). A câmara de trituração foi arrefecida por circulação de líquido de refrigeração a -20°C, de forma a que a temperatura do homogenato da saída da câmara de trituração não exceda 15°C. O fluxo de líquido foi de 6L/hora e a velocidade de agitação foi de 3000 rpm. Este processo foi realizado duas vezes. 0 pH do homogenato resultante é 6,7 a 7,5.
9.3 Clarificação com polietilenoçlicol
Adicionou-se polietilenoglicol 400 (PEG 400) à suspensão de células rebentadas para dar uma concentração final de 10% (30 minutos abaixo de 10°C, pH 6,1) e um sobrenadante parcialmente clarificado foi recuperado por centrifugação (centrífuga Beckman J21B, rotor JA10 a 17000 g durante 1 hora).
9.4 Clarificação com metanol
Adicionou-se metanol a pH 7 ao antigénio clarificado com PEG para dar a proporção de 1 volume de metanol para 5 volumes de antigénio clarificado com PEG. 0 antigénio clarificado foi obtido a 17000 g durante 20 minutos por centrifugação (centrífuga Beckman J21B, rotor JA10).
9.5 Adsorção/desadsorcão em silica coloidal antigénio bruto foi adsorvido durante a noite a 1,5% (p/v) de silica coloidal (Aerosil 380, Degussa) a 4°C.
Após lavagem (3 vezes) do sedimento por centrifugação sucessiva e ressuspensão em 0,9% de NaCl (p/v), o antigénio foi desabsorvido usando um tampão de pirofosfatp 10 mM, pH 9,5, contendo 1% TWEEN 20.
volume de tampão de desabsorção corresponde a 1/8 da solução de antigénio clarificada com metanol. A solução de antigénio desabsorvido foi recuperada por ultracentrifugação num rotor R19 da ultracentrífuhga Beckman L 8.70 a 50000 g durante 60 minutos.
Diafiltração
Antes dos passos de purificação, o antigénio desabsorvido foi lavado por ultrafiltração com 5 volumes de ureia 6M, NaCl 500 mM, TRIS-HC1 20 mM a pH 8,5 de forma a eliminar a maior parte dos contaminantes proteicos e lipídicos.
Em seguida o tampão foi trocado no mesmo sistema (Ultrasette, FILTRON adaptado com membranas de polissulfona com
um peso molecular de exclusão de 3 00 KD) com 5 volumes de TRIS-HC1 10 mM (pH 8,1).
9.7 Cromatografia de permuta iónica em DEAE-TSK 650 (M)
A solução clarificada foi aplicada numa coluna de permuta aniónica (DEAE-TSK 650 (M)) equilibrada num tampão TRIS 10 mM, pH 8,1. Após lavagem sucessivamente com 2 volumes de tampão 10 mM TRIS-HC1 pH 8,1 e 3 volumes de tampão 10 mM TRIS-HC1 pH 8,1 suplementado com 40 mM NaCl, o antigénio foi desabsorvido com menos de um volume de tampão 10 mM TRIS-HC1 pH 8,1 contendo 150 mM NaCl. Reuniram-se as fracções contendo antigénio.
9.8 Cromatografia de interaccão hidrofóbica em
Butil-TSK 650 (M)
Após adição de NaCl até mM NaCl, a solução de antigénio Butil.TSK 650 (M) equilibrada com mM NaCl (pH 8,1). A maior parte uma concentração final de 650 foi aplicada numa coluna de um tampão 20 mM TRIS-HC1, 600 do antigénio passa através da coluna enquanto que as impurezas se ligam ao gel.
9.9 Concentração por ultrafiltracao
O conjunto de HIC foi concentrado por ultrafiltração num sistema Ultrasette (FILTRON) adaptado com membranas de polissulfona com uma exclusão de 300 KDa.
9.10 Ultracentrifugacão num gradiente de CsCl
Adicionou-se CsCl ao conjunto de fracções de Butil-TSK para dar uma concentração final de 1,5 M.
Após 65 horas num rotor Beckman Ti 50.2 a 270000 g, as fracções contendo antigénio foram colhidas.
9.11 Cromatografia de exclusão por tamanho em Sephacrvl S300 (Tipo HR)
Para mudar o tampão e para eliminar os contaminantes de baixo peso molecular, a solução de antigénio foi aplicada numa coluna de SEPHACRYL S300 HR. O tampão de eluição é de fosfatos 10 mM, contendo 150 mM NaCl (pH 7,4).
FILTRAÇÃO ESTÉRIL
Após diluição para entre 150 e 400 Lowry/ml e ajustamento do pH a 6,8, o antigénio purificado foi esterilizado por filtração através de um filtro estéril de 0,22 μιη. A solução resultante contem partículas RTS/S purificadas.
Exemplo 10: CARACTERIZAÇÃO IMUNOLÔGICA DE RTS/S
10.1 Antiqenicidade
Para testar a antigenicidade das partículas RTS/S, realizaram-se uma série de ELISAs, combinando anticorpos monoclonais dirigidos contra os diferentes epítopos.
Os anticorpos monoclonais (MoAbs) usados são:
- MoAb R10: 0 específicos para a sequência repetida (NANP) da região CSP.
0 isotipo IgM.
° específicos para a sequência não repetida da região CSP.
-MoAb RF1:
-MoAb RF1: ° específica da sequência S do HBsAg.
0 isotipo IgGl.
MoAbs RIO e RL117 foram preparados no laboratório por fusão das células de mieloma Sp2/OAg 14 com células do baço de murganhos Balb/C imunizados com partículas tipo RTS parcialmente puras contendo as regiões repetidas e não repetidas da sequência CSP.
Analizaram-se três lotes da vacina candidata RTR/S: lotes N9 24M31, 24M32 e 24M34.
10.2 Reacção com o anticorpo monoclonal RIO (anti-repeticão)
O MoAb RIO anti-repetição foi usado numa ELISA sanduíche. As amostras a serem testadas foram incubadas em placas de microtitulação previamente revestidas com o MoAb RIO. O mesmo MoAb acoplado a peroxidase foi então adicionado. Após uma hora de incubação a 37°c e lavagem, a cor foi revelada pela adição de Ortofenileno-diamina-H^O^. A absorvância foi medida a 490 nm e representada em função da concentração de antigénio.
Resultados
Os três lotes: 24M31, 24M32 e 24M34 reagiram positivamente e consistentemente com MoAb RIO, confirmando assim a presença e a acessibilidade dos epítopos repetidos nas partículas RTS/S. A quantidade de antigénio necessária para atingir 50% da ligação máxima foi de 51,2, 38,2 e 60,6 ng para os lotes 24M31, 24M31 e 24M34 respectivamente.
10.3 Reacção com o anticorpo monoclonal RL117 (anti-sem repetições
A reactividade do MoAb RL117 com partículas RTS/S foi analisado num teste de ELISA em ”sanduíche. O MoAb RL117 foi acoplado a peroxidase e usado para a detecção das part+ículas RTS/S, enquanto que o MoAb RIO, específico para a região repetida, foi usado na captura das partículas.
Resumidamente, as amostras a serem testadas foram incubadas em placas de microtitulação previamente revestidas com o MoAb RIO. RL117 acoplado a peroxidase foi então adicionado e após uma hora de incubação a 37°C e lavagem, a coloração foi revelada pela adição de ortofenileno-diamina-H202. A absorvância foi medida a 490 nm e representada em função da concentração de antigénio.
Resultados
Os três lotes: 24M31, 24M32 e 24M34 reagiram positivamente e consistentemente com os MoAbs RL117 e RIO, confirmando assim a presença e acessibilidade dos epítopos repetidos e não repetidos nas mesmas partículas RTS/S. A quantidade de antigénio necessária para atingir 50% da ligação máxima foi de 169,2, 117,6 e 181,1 ng para os lotes 24M31, 24M32 e 24M34 respectivamente.
10.4 Reacção com o anticorpo monoclonal RF1 fanti-S)
A presença de epítopos s nas partículas RTS/S foi mostrada por um teste de ELISA tipo sanduíche, usando o MoAb RF1 acoplado a peroxidase para detecção. O MoAb RIO foi usado directamente nas placas de microtitulação para capturar as partículas RTS/S.
Em resumo, as amostras a serem testadas foram incubadas em placas de microtitulação previamente revestidas com MoAb RIO. Adicionou-se então MoAb RF1 acoplado a peroxidase. Após incubação a 37°C durante 1 hora e lavagem, o desenvolvimento de cor surgiu pela adição de ortofenileno-diamina-H2O2. A absorvância foi medida a 490 nm e representada em função da concentração de antigénio.
Resultados
Os três lotes: 24M31, 24M32 e 24M34 reagiram positiva, . , . . ___ RIO, confirmando assim a mente e consistentemente com MoAbs RF1 e presença e acesso dos epítopos S nas mesmas partículas RTS/S. A quantidade de antigénio necessária para atingir 50% da ligação máxima foi de 52,3, 55,2 e 106,2 ng para os lotes 24M31, 24M32 e 24M34 respectivamente.
Exemplo 11: IMUNOGENICIDADE IN VIVO DAS PARTÍCULAS
RTS/S
11.1 Estudos de imunogenicidade
Os estudos sobre a imunogenicidade das partículas (RTS/S) foram realizados em murganhos e em macacos Cercopithecus aethiop.
Em murganhos, os anticorpos anti-CSP foram analisados por ELISA usando o antigénio R32tet32 para a detecção dos anticorpos anti-repetições. R32tet32 consiste em 32 cópias da repetição NANP (major)fundidas com uma fracção de 32 aminoácidos do gene de resistência à tetraciclina do plasmídeo pBR322. O antigénio recombinante é produzido em Escherichia coli. Os anticorpos (Abs) dirigidos contra a sequência não repetida da proteína CS foram medidos por ELISA relativamente ao antigénio RLF. 0 antigénio RLF consiste na região flanqueante completa da proteína CS sem a repetição fundida com os primeiros 81 aminoãcidos da proteína NS1 do vírus da influenza. O antigénio RLF foi produzido em E. coli. Os soros de murganho foram diluídos seriadamente, começando a 1:100 e os títulos foram expressos como o inverso da diluição correspondente a uma densidade óptica de 1,0 no teste de ELISA (1). As medições dos Abs anti-CSP foram feitas em soros individuais e calculada a média geométrica do título (GMT).
Para analisar a resposta anti-veículo, os títulos de anticorpos anti-HBS foram também medidos (soro reunido apenas). Em experiências com murganhos, murganhos Balb/C (haplótipo H-2d) normalmente usados para a imunogenicidade de HBsAg foram também usados para avaliar a imunogenicidade das partículas RTS/S. Comparam-se as vias de imunização intraperitoneal (i.p.) e subcutânea (s.c.) e foi também testado o efeito do imunoestimulador monofosforil-lipido A 3-deacilado (3D-MPL) na resposta imune.
A imunogenicidade da , vacina RTS/S foi também testada numa via semelhante em macacos Cercopithecus aethiops.
Soros individuais seleccionados ou reunidos foram também testados quanto à sua capacidade para inibir a invasão in vitro de uma linha de células de hepatoma humano (HepG2) por esporozóitos de P. falciparum (ensaio ISI (2)) .
11.2 Imunogenicidade em murganhos
EXPERIÊNCIA 1; Imunogenicidade dos lotes clínicos (RTS/S) adsorvidos em A1(OH)3
Método
Imunização:
Grupos de 10 murganhos Balb/Cforam injectados duas vezes intraperitonealmente com intervalos de um mês com 1 de cada um dos três lotes de RTS/S previamente adsorvidos a A1(OH)3 (lotes 24M/31, 24M/32 e 24M/34). Os murganhos testemunha foram injectados com HBsAg (Engerix-B, lote ENG611B4). Nos dias 30 e 45, os murganhos foram sangrados e os títulos de anticorpos medidos em soros individuais.
Métodos serológicos:
Os títulos anti-R32tet32 e os títulos anti-RLF foram medidos por ELISA usando respectivamente R32tet32 e RLF como antigénios de revestimento. As microplacas foram incubadas com a amostra do soro (doze diluições seriadas começando em 1:100) a ser testado. Os Abs de murganho reagiram com anti-Ig de murganho biotinilado seguido do complexo estreptavidina:peroxidase de rábano silvestre biotinilada^ e ortofenilenodiamina/H202. A densidade óptica foi medida a 490 nm. Os títulos foram expressos como o inverso da diluição correspondente a uma densidade óptica de 1,0 (50% da ligação máxima). Calculou-se para cada grupo de murganhos a média geométrica dos títulos (GMT). 0 título de anticorpos anti-HBs foi calculado de acordo com a fórmula de Hollinger (3) e expresso em mIU/ml.
Resultados
Resposta anti-CSP:
Observaram-se respostas fortes anti-R32tet32 e anti-RLF para cada um dos lotes (RTS/S) testados. Não se observou diferenças significativas entre os lotes. Observou-se um notável efeito de reforço após a segunda dose. Os murganhos imunizados com HBsAg (Engerix-B) foram usados como controle negativo nesta experiência .
Resposta anti-HBs:
Os lotes de (RTS/S) induziram anticorpos dirigidos contra a proteína veículo HBsAg. 0 ensaio foi realizado apenas em soros reunidos.
EXPERIÊNCIA 2: Efeito do imuno-estimulador 3D-MPL na imunogenicidade das partículas (RTS/S) em murganhos Balb/C.
Analisámos o efeito do 3D-MPL na imunogenicidade da vacina (RTS,S) em murganhos. Foram testadas tanto a via de imunização intraperitoneal (i.p.) como a subcutânea (s.c.).
A. Imunização pela via ip
Método
Imunização:
Grupos de 10 murganhos Balb/C foram injectados duas vezes intraperitonealmente com intervalo de um mês com 1 gg de (RTS,S) (lote 24M/34) adsorvido a A1(OH)3 sozinho ou a A1(OH)3 +
3D-MPL (50 Mg/dose). Murganhos testemunha foram injectados duas vezes intraperitonealmente com intervalo de um mês com 1 Mg de (RTS,S) (lote 24M/34) adsorvidoa A1(OH)3 sozinho ou a A1(OH)3 + 3D-MPL (50 /xg/dose) . Murganhos testemunha foram injectados com NaCl 150 mM. Nos dias 30 e 45, os murganhos foram sangrados e os títulos de anticorpos medidos em soros individuais.
Método serológico:
Os métodos serológicos foram os mesmos da primeira experiência descrita atrás.
Resultados
Resposta anti-CSP:
O lote da vacina (RTS/S) induz fortes respostas anti-R32tet32 e anti-RLF em ambas as formulações. Em todos os casos, foi observado um efeito de reforço significativo após a segunda imunização. Os títulos obtidos com a formulação contendo 3D-MPL são em todos os casos superiores aos da formulação com alumínio sozinho e foi observado um aumento estatisticamente significativo na resposta primária anti-R32tet32 (p=0,02). Um grupo de murganhos injectados com NaCl 150 mM foi usado como testemunha negativa nesta experiência.
Resposta anti-HBs:
Ambas as formulações da vacina (RTS,S), injectadas pela via i.p., induziram uma forte resposta anti-HBs. Um efeito de reforço significativo foi observado após a segunda imunização com qualquer uma das formulações.
B. Imunização nor via s.c
Método
Imunização:
Grupos de 10 murganhos Balb/C foram injectados duas vezes subcutaneamente com um mês de intervalo com 1 yg de (RTS,S), (lote 24M/34) adsorvido a A1(OH)3 sozinho ou em Al(OH)3+3D-MPL (50Mg/dose). Murganhos testemunha foram injectados com NaCl 150 mM. Nos dias 30 e 45, os murganhos foram sangrados e os títulos de anticorpos medidos em soros individuais.
Os métodos serológicos foram os mesmos da primeira experiência descrita atrás.
Resultados
Resposta anti-CSP:
lote de vacina (RTS,S) induziu resposta positiva contra R32tet32 e RLF em ambas as formulações. Em todos os casos, foi observado um efeito de reforço significativo após a segunda imunização. Observaram-se títulos estatisticamente superiores com a formulação 3D-MPL no dia 45, tanto para as respostas anti-R32tet32 como para a resposta anti-RLF (p=0,18 e p=2,9, respectivamente). No entanto, em geral os títulos foram mais baixos do que os obtidos com a via i.p.. Um grupo de murganhos injectado com NaCl 150 mM foi usado como testemunha negativa nesta experiência.
Resposta anti-HBs:
Ambas as formulações da vacina (RTS,S), injectadas pela via s.c. induziu uma boa resposta anti-HBs. Um efeito de reforço significativo foi observado para as respostas anti-CSP, a resposta anti-HBs foi mais baixa por esta via de imunização comparado com a via i.p.
11.3 Imunogenicidade em Cercopithecus aethiops
A imunogenicidade foi avaliada em macacos Cercopithecus aethiops com o lote clínico 24M/32 adsorvido a A1(OH)3·
Métodos
Imunização:
Cinco macacos foram injectados intramuscularmente nos dias 0, 28 e 84 com 24 Mg de partículas (RTS,S) adsorvidas em A1(OH)3 (0,5 mg A1+++). Os animais foram sangrados nos dias 0,14, 28, 42, 56, 66 e 98. Mediram-se os anticorpos dirigidos contra R32tet32, RLF e antigénio HBs.
Métodos serológicos:
Mediram-se os títulos de anticorpos anti-R32tet32 e anti-RLF por ELISA usando respectivamente os antigénios R32tet32 e RLFpara revestir microplacas. As placas foram então incubadas com a amostra de soro a ser testado (12 diluições seriadas de duas vezes começando em 1:10). Os anticorpos de macaco foram detectados por anti-Ig humana biotinilada seguido de do complexo estrepatavidin/ peroxidase de rábano silvestre biotinilado e ortofenilenodiamina/H202. A densidade ótica foi medida a 490 nm.
Os títulos foram expressos como o inverso da diluição correspondente a uma densidade óptica de 1,0 (50% da ligação máxima). Para cada grupo, foi calculada a média geométrica do título (GMT). Os títulos de anticorpos anti-HBs foram calculados de acordo com a fórmula de Hollinger (Hollinger et al., 1982) e expresso em mIU/ml.
Resultados
Resposta anti-CSP:
A vacina (RTS,S) induziu uma resposta positiva contra os antigénios R32tet32 e RLF nos cinco macacos. Observou-se um efeito de reforço significativo 14 dias após a segunda 2munização (dia 42). Um decréscimo lento dos títulos de anticorpos foi então observado até à terceira imunização. Os títulos aumentaram novamente 14 dias após a terceira imunização (dia 98), excepto no caso da resposta anti-RFL do macaco Jo 352.
Os títulos anti-R32tet32 atingidos após a terceira imunização (dia 98) não são no entanto superiores aos títulos observados após a segunda imunização (dia 42).
No caso da resposta anti-RLF (com excepção do macaco Jo 353), observou-se um aumento dos títulos após a terceira imunização (dia 98) relativamente aos níveis após a segunda imunização (dia 42) .
Resposta anti-HBs:
Todos os macacos induziram uma resposta anti-HBs com efeitos de reforço superiores após a segunda (42) assim como após a terceira imunização (dia 98).
Actividade biológica dos anticorpos induzidos contra a partícula (RTS,S)
Como medida da função biológica dos anticorpos induzidos pela vacina (RTS,S), conjuntos de soros de murganhos e soros individuais de macacos foram testados pelo ensaio da Inibição da Invasão de Esporozóitos (ISI) (Hollingdale et al. , 1984). Este ensaio mediu a capacidade dos anticorpos anti-CSP para inibir a invasão in vitro de uma linha de células de hepatoma humano (HepG2) por esporozóitos de P. falciparum.
Resultados
Os resultados desta experiência estão apresentados nas Tabelas 1 e 2. Os dados de ISI são expressos como % da inibição relativamente à actividade de um soro testemunha pré-imune tomado como 0% de inibição. Para referência, estão incluídas os títulos de anticorpos anti-R32tet32 e RLF dos soros testados.A tabela 1 mostra que todos os soros de murganho testados têm actividade ISI muito alta. A tabela 2 mostra que os 5 macacos também possuem uma actividade ISI elevada no dia 98 comparado com o correspondente soro imune.
Conclusão
As partículas (RTS,S) induziram, tanto em murganhos como em macacos, uma resposta de anticorpos elevada dirigida contra os epítopos repetidos e não repetidos da CSP e contra a proteína S do veículo HBSAg.
A resposta de anticorpos primária em murganhos foi aumentada pela presença de 3D-MPL.
Os títulos de anticorpos obtidos após injecção intraperitoneal foram superiores aos obtidos após imunização pela via subcutânea.
Os anticorpos induziram nas duas espécies animais evitaram eficazmente a invasão das células de hepatoma humanas em cultura pelos esporozóitos de P. falciparum.
Tabela 1: Actividade ISI do soros de murganhos Balb/C imunizados com TS,S
Conjunto de soros de murganho | Título A-R32tet32 | Título A-RLF | ISI (%) |
Conjunto i.p. Al+eD-MPL Dia 45 | 606544 | 242408 | 100% |
Conjunto i.p. Apenas alum Dia 45 | 87005 | 160284 | 98% |
Conjunto s.c. A1+3D-MPL Dia 45 | 15333 | 20453 | 94% |
Conjunto s.c. A1+3D-MPL Dia 45 | 5102 | 20453 | 86% |
Conjunto de Testemunhas Negativas | 205 | 205 | 0% |
Tabela 2: Actividade ISI de soros individuais de macacos imunizados com RTS,S
Macaco # | Soro | Título A-R32tet32 | Título A-RLF | ISI (%) |
JO 352 | DIA 0 DIA 98 | <50 1762 | <50 1250 | 0% 98% |
JO 353 | DIA 0 DIA 98 | <50 1574 | <50 32218 | 0% 90% |
JO 354 | DIA 0 DIA 98 | <50 3751 | <50 31034 | 0% 98% |
JO 356 | DIA 0 DIA 98 | <50 1495 | <50 18544 | 0% 95% |
JO 357 | DIA 0 DIA 98 | <50 1420 | <50 30727 | 0% 98% |
Referências (1) Harford N, Cabezon T, Colau B, et al.. Construction and Characterization of a Saccharomyces Cerevisiae Strain (RIT4376) Expressing Hepatitis B Surface Antigen, Postarad Med J 63, Supp. 2: 65-70, 1987.
(2) Jacobs E, Rutgers T, Voet P, et al.. Simultaneous Synthesis and Assembly of Various Hepatitis B Surface Proteins in Saccharomyces cerevisiae, Gene 80: 279-291, 1989.
(3) Vieira J and Messing J, The pUC plasmids, an M13mp7-Derived System for Insertion Mutagenesis and Sequencing with Synthetic Universal Primers, *_Gene 19: 259-268, 1982.
(4) Juniaux Embo J 1: 1125-1131, 1982.
(5) Hinnen A, Hicks JB, and Fink GR, Transformation of Yeast, Proc Natl Acad Sei USA 75: 1929-1933,1980.
(6) Broach JR, Strathem JN, and Hicks JB, Transformation in Yeast Development of a Hybrid Cloning Vector and Isolation of the CAN1 Gene. Gene 8: 121-133, 1979.
(7) Zhang H, et al.. Double Stranded SDNA Sequencing as a Choice for DNA Sequencing, Nucleic Acids Research 16:1220,1988.
(8) Dame JB, Williams JL. Mc Cutchan TF, et al.. Structure of the Gene Encoding the Immunodominant Surface Antigen on the Sporozoites of the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum, Science 225: 593-599,1984.
(9) Valenzuela P, Gray P, Quiroga M, et al.. Nucleotide Sequences of the Gene Coding for the Major Protein of Hepatitis B Virus Surface Antigen, Nature 280: 815-819,1979.
Claims (1)
- REIVINDICAÇÕES13. - Proteína híbrida, caracterizada por compreender substancialmente toda a fracção C-terminal da proteína CS de Plasmódio, quatro ou mais repetições em tandem da região imunodominante da proteína CS e o antigénio de superfície do vírus da Hepatite B (HBsAg).23. - Proteína híbrida, caracterizada por compreender uma sequência da proteína CS de P. falciparum substancialmente correspondendo aos aminoácidos 210-398 da proteína CS de P. falciparum 7G8 ou 207-395 da proteína CS de P. falciparum NF54 fundida na mesma grelha de leitura através de um ligando linear à fracção N-terminal de HBsAg.33. - Proteína híbrida de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada por a proteína CS ser fundida ao HBsAg.43. - Proteína híbrida, caracterizada por compreender as seguintes sequências de aminoácidos:a) um resíduo de metionina N-terminalb) Met Ala Proc) um segmento de 189 aminoácidos correspondendo aos aminoácidos 210 a 398 da proteína CS de P. falciparum 7G8 ou 207-395 da proteína CS de P. falciparum NF54d) Arge) Pro Vai Tre Asn derivada da proteína Pre S da hepatitef) um segmento de 226 aminoãcidos especificando a proteína S do vírus da hepatite B
59. - Proteína híbrida, caracterizada por ser designada por RTS. 69. - Proteína híbrida, caracterizada por ser designada por RTS*. 79. - Sequência de DNA, caracterizada por ser codifica- dora de uma proteína híbrida de acordo com as reivindicações 1 a6.8a. - Vector, caracterizado por conter uma sequência de DNA de acordo com a reivindicação 7, em que a referida sequência está ligada a elementos de controle da transcrição.99. - Hospedeiro, caracterizado por ter sido transformado com um vector de acordo com a reivindicação 8.10s. - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 9, caracterizado por ser S. cerevisiae.11a. - Hospedeiro de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por ter sido transformado ainda com um gene codificador do antigénio de superfície da Hepatite B.12a. - Partícula lipoproteica multimérica, caracterizada por compreender uma proteína híbrida de acordo com as reivindicações 1 a 6.13a. - Partícula lipoproteica multimérica mista, caracterizada por compreender uma proteína híbrida de acordo com as reivindicações 1 a 6 e o antigénio de superfície da HepatiteB.143. - Lipoproteína multimérica mista de acordo com a reivindicação 13, caracterizada por compreender RTS ou RTS* e o antigénio de superfície do vírus da Hepatite B.153. - Partícula de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizado por a proporção de proteína híbrida para antigénio de superfície ser de 1:4.163. - Vacina, caracterizada por compreender uma quantidade imunoprotectora de uma partícula ou proteína de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6 ou reivindicações 12 a 15 misturada com um diluente ou veículo adequado.173. - Vacina de acordo com a reivindicação 16, caracterizada por compreender 3-monofosforil-lípido A desacilado.183. - vacina de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por compreendendo ainda alúmen.19a. - Vacina de acordo com a reivindicação 17, caracterizada por se apresentar numa emulsão de óleo em água.203. - Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 19, caracterizada por se destinar ao tratamento de um doente susceptível ao infecções por plasmódio.213. - processo para a produção de uma proteína híbrida de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por compreender a expressão de uma sequência de DNA codificadora da proteína num hospedeiro adequado e e recuperação do produto.22^. - Processo para a produção de partículas de acordo com as reivindicações 12 a 15, caracterizado por compreender a expressão de uma sequência de DNA codificadora de uma proteína de acordo com as reivindicações 1 a 6 e o antigénio de superfície da hepatite B numa estirpe de Saccharomyces.
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