PT100401A - Processo e composicoes para a obtencao de taxanos a partir de plantas por tratamento com dissolventes - Google Patents

Description

L í DOMÍNIO TÉCNICO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a métodos e composições para a obtenção de misturas de taxanos bruta a partir de fontes, renováveis de matéria vegetal e a um método para a purificação dessas misturas de taxanos e composições para se obterem taxanos específicos. Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um método para o tratamento de matéria vegetal de maneira a preservar o teor de taxanos. A presente invenção refere-se também a um método para a extracção de taxanos a partir de matéria vegetal, com dissolventes, para produzir uma mistura bruta de taxanos em que a mistura de taxanos bruta se encontra presente num dissolvente aquoso. Adicionalmente, a presente invenção refere-se a um método para a purificação de taxanos específicos a partir de uma mistura de taxanos bruta, usando cromatografia em fase normal.

DOMÍNIO DA INVENÇÃO

Os taxanos são alcaloides que possuem um núcleo de taxano. 0 núcleo de taxano compreende a estrutura de três anéis mostrada abaixo, que também é identificada comc 4,8,12,15,15-pentametil-triciclo [9.3.1.O3,8] pentadecano.

Pelo menos 56 taxanos diferentes foram identificadas na literatura. Por exemplo, em 1980, R.W. Miller assinou um artigo que analisava alcaloides taxus conhecidos e outros derivados de taxanos e referiu para estas fórmulas de i compostos, dados de HRMN, de MS e de raio-x. 0 artigo de R.W. Miller, que aparece em Nat. Prod, 43(4): 425-437 (1980), é aqui incorporado por referência. As publicações seguintes, que são também aqui incorporadas por referência, identificam e descrevem taxanos. M.G. Begley, E.A. Freeknall e G. Patten-den, Acta Crvstallogr. 40; 1745 (1984); D.P. Delia Casa de Marcano e T.G. Halsall, Chem. Comm. 1382 (1970); D.G.I. Kingston, D.A. Hawkins e L. Ovington, J\_ Nat. Prod. 45; 466 (1982); F. Guéritte-Voeglein, D. Guénard e P. Potter. Jj_ Nat. Prod. 50.:(1)- 9-11 (1987); B. Lythgoe em "The Alkaloids" Ed. por R.H.F. Manske, Vol. 10, Academic Press, New York 1968, pp. 597-626; D.P. Delia Casa de Marcano e T.G. Halsall, Chem.

Commun. 1381 (1970); V. Senilh, S. Blechert, M. Colin, D.

Guenard, F. Picot, P. Pbtier e P. Varenne, J_j_ Nat. Prod. 47(1) pp. 131-137 (1984); J.L. McLaughlin, R.W. Miller, R.G. Powell e C.R. Smith, Jr,, Jj_ Nat. Prod. 44: 312-19 (1981); D.P. Delia Casa de Marcano e T.G. Halsall, Chem. Comm. 365 (1975); C.H. Oliver Huang, David G.I. Kingston, Neal F. Magri, G*. Samaranayake e F.E. Boetner, J\. Nat. Prod. 49.(4): 665-669 (1986).

As séries de moléculas de taxano possuem uma potente actividade anti-tumor. Em geral, os taxanos que foram estudados relativamente à sua actividade anti-tumor, encontrou-se-lhes uso no tratamento do cancro dos ovários e da leucemia (W.P. MacGuire et al., Annals of Internai Medicine. vol. 111, pag. 273 (1989)). Crê-se que os taxanos exercem a sua actividade anti-tumor induzindo a polimerização de tubulina e a formação extremamente estável e não funcional de microtúbulos que têm um efeito antiproliferativo nas células sensíveis dos taxanos. (Eric K. Rowinsky et al. , Journal of the National Câncer Institute, Vol. 82, Ns 15, pp. 1247-1259 (1990)). De entre as moléculas de taxano que foram estudadas, a m^tior parte das quais relativamente à sua actividade anti--tumor, são o taxol, cefalomanina, desacetilcefalomanina, bacatina III, 10-desacetil-bacatina III e 10-desacetiltaxol.

As estruturas destes taxanos são mostradas abaixo:

ÔCOCjHy

R1 = AC Bacatina III Rx = OH 10-Desacetil-Bacatina III

fó,/< R1 = Ac' R2 = C6H5 Taxol EC O li I—) R2 = C6H5 10-Desacetil Taxol = Ac, r2 = ch3ch = C(CH3) Cefalomanina R1 - OH, r2 = CH3CH = C(CH3) 10-Desacetil

Cefalomanina 0

' II

Ac = CCHj Acetato 0 composto de taxano conhecido como taxol, foi pela primeira vez referido ter sido isolado da casca do tronco do teixo do ocidente Taxus brevifolia. uma conífera de crescimento lento. A sua estrutura foi explicada por M.C, Wani et al., Journal of the American Chemical Societv. Vol. 93, pp. 2325-2327, (1971).

Os taxanos são normalmente isolados da casca da T. brevifolia recolhida nos ermos. Devido ao facto de a concentração de taxanos específicos na T^_ brevifolia ser i extremamente baixa (por exemplo, o taxol encontra-se presente numa concentração compreendida entre cerca de 0,004% até cerca de 0,02% com base no peso seco da casca), têm que se cortar grandes quantidades de árvores e processar-se, para produzirem mesmo pequenas quantidades de taxanos, necessárias

para fins de pesquisa. Além disso, as árvores selvagens crescem em condições muito diferentes, o que resulta em níveis altamente variáveis de taxanos produzidos na casca. Além disso, as populações de árvores selvagens são uma fonte em que não se pode confiar para os taxanos, uma vez que são envolvidás de muitas incertezas e riscos, tais como os fogos das florestas, as variações climatéricas anuais, as variações naturais no teor de taxol nos diferentes tipos químicos das populações selvagens. A crítica cada vez maior dos defensores do ambiente relativamente ao corte de plantas selvagens ameaça também a disponibilidade da 1\_ brevifolia como uma fonte adequada de taxanos. A Ί\_ brevif olia. por isso, representa uma fonte de taxanos não renovável e inconsistente.

Ainda mais crítico é o facto de que o corte extenso de árvores selvagens põe em risco a destruição do plasma das células germinativas, essencial para a cultura futura da T. brevifolia. Tal corte poderia resultar na perda genes selva-gens que codificam as proteínas que proporcionam as características, tais como a resistência à doença e às pestes, resistência ao frio, elevadas taxas de crescimento e de tolerância à luz do sol e aos excessos de seca e inundação e elevado teor de taxol/taxano. A preservação destes genes selvagens será crítica para o desenvolvimento a longo prazo de taxol de custo eficaz e para outras produções de taxanos, quer sejam produzidos a partir de plantas cultivadas, cultura de tecidos ou de microrganismos geneticamente modificados. Devido ab papel crítico que o plasma germinativo selvagem servirá nas estratégias de produção futuras, a preservação das populações selvagens deveria ser considerada como uma componente essencial da estratégia de desenvolvimento para a produção de taxol e de outros taxanos.

Uma vez que a colheita de populações selvagens de T. brevifolia proporciona um fornecimento tão limitado de taxol, as experiências clínicas do taxol foram restringidas apenas a algumas aplicações quimioterapeuticas específicas. A falta de uma fonte estável e fiável de taxol a um custo previsível, também impedirá de forma significativa a utilização clínica do agente. Torna-se imperativo o desenvolvimento de uma fonte sustentável, económica e segura para taxanos. 0 potencial de taxol como agente quimioterapêutico do cancro e a complexidade estrutural da molécula de taxol induziu a um grande esforço em direcção à sua de novo

sínt,ese. Contudo, a complexidade molecular do taxol sugere que não é economicamente factível uma síntese total do taxol a partir de matérias primas facilmente obtíveia.

Uma síntese da estrutura do anel de taxano é referida por R.A.Holton et al. , em Journal of the American Chemical' Societv. 106 5731 (1984), e ibid. Vol. 110, pag. 6558-6560 (1988). Contudo, estas sínteses são deficientes no sentido de que o produto final não possui uma actividade farmacológica suficiente para servir como agente anti-tumor eficaz. A semi-síntese do taxol usando 10-desacetil-bacati-na III, um precursor maia abundante isolado a partir das folhas de baccata (1 g/kg de folhas verdes), foi referida por trabalhadores franceses. Adicionalmente, V. Senilh et al., C.R. Seances Acad. Sei. Ser. 2, Vol. 299, pp. 1039-1043 (1984); F. Gueritte-Voegelin, Tetrahedron. Vol. 42, pp. 4451-4460 (1986); Colin et al., pedido de Patente Europeia 0 253 278 e Colin et al,, pedido de Patente Europeia 0 253 739 referem-se à semi-síntese de taxol a partir de 10-desacetil--bacatina III. Estes métodos usam derivados de taxano como materiais de partida e, por isso, sofrem da desvantagem de que a tentativa requer o isolamento e purificação de taxanos a partir de uma fonte vegetal, seguido pela conversão do taxano purificado em taxol; esta preparação em operações múltiplas do taxol é mais dispendiosa do que o isolamento do taxol, directamente a partir do material vegetal.

Tem havido esforços no sentido de desenvolver novas técnicas'para o isolamento de taxanos, tais como taxol, a partir de matéria vegetal. Contudo, nenhum dos métodos referidos até à data proporciona a extracção adequada de taxanos a partir de uma fonte renovável. Por exemplo, M.C. Wani et al., Journal of the American Chemical Society, Vol. 93, pp. 2325-2327 (1971), refere-se à purificação de taxanos a pdrtir de casca do tronco da Taxus brevifolia usando protocolos de cromatografia em coluna em fase normal. A cromatografia em coluna em fase normal requere o uso de uma coluna polar cheia, para efectuar a separação molecular. 0 documento do National Câncer Institute Products Branch, NSC #125973, de 15 de Julho de 1983 refere-se também à purificação do taxol a partir também da casca, da madeira sem casca, dos ramos, das vergônteas, das agulhas, das sementes/frutos e das raizes da Taxus brevifolia.

Uma desvantagem do método para isolar taxol descrito no documento NSC #125973 e outras publicações, consiste na dependência do uso de cloreto de metileno no processo de extracção. 0 cloreto de metileno e outros hidrocarbonetos clorados, tais como o clorofórmio, são reconhecidos como sendo tóxicos e potencialmente carcinogénicos. Por isso, é desejável evitar a utilização destes dissolventes na extracção e purificação de taxanos a partir de matéria vegetal, quer do ponto de vista da exposição destes químicos ao pessoal que efectua estes processos, quer do ponto de vista da exposição potencial dos pacientes a estes químicos, através das pequenas quantidades não removidas dos taxanos purificados na forma de dosagem final da medicação com taxanos. V. Senilh et al., Journal of Natural Products. Vol. 46, N9 1, pp. 131-137 (1984) refere-se à purificação de taxol e de cefalomanina a partir do tronco de Taxus baccata L. 0 método de purificação que é referido por Senilh et al. é deficiente no sentido de que é requerida uma ulterior purificação de taxanos específicos usando HPLC ou cristalização, mesmo depois de se terem efectuado eluições múltiplas de taxanos, numa variedade de colunas de cromatografia em fase normal.

Tem havido tentativas para isolar taxanos a partir

de matéria vegetal usando protocolos de cromatografia em coluna em fase invertida. Veja-se, e.g., Keith M. Witherup et al., Journal of Natural Products, Vol. 53, Ns 5, pp. 1249--1253 (1990); Keith M. Witherup et al., Journal of Liguid Chromatographv, Vol. 12, N2 11, PP· 2117-2132 (1989). Estas tentativas são indesejáveis no sentido de que os taxanos são isolados com um rendimento relativamente baixo, aproximada-mente de 50% com base no rendimento teórico dos taxanos. ' A cromatografia em coluna em fase invertida obriga ao uso de uma coluna não-polar cheia para efectuar a separação molecular. Uma outra desvantagem da cromatografia em fase invertida é a dificuldade de separar os taxanos do meio de eluição aquoso. A evaporação de um meio aquoso é di,spendiosa e morosa. Além disso, o uso de um meio aquoso hidroliza ligações lãbeis, diminuindo deste modo o rendimento dos taxanos. Também o meio aquoso usado na operação de cromatografia em fase invertida epimeriza parcialmente o estéreocentro C-7, Os epímeros assim produzidos são indesejáveis, no sentido de que possuem propriedades farmacológicas diminuídas. Além disso, estes epímeros indesejáveis são separados dos taxanos farmacologicamente úteis apenas com dispêndio e dificuldade adicionais.

A separação é ainda complicada, porque os produtos de taxanos desejados co-eluem durante a operação de cromatografia em fase invertida. Têm, por isso, de ser realizadas operações de cromatografia adicionais para separar completamente os taxanos, o que resulta num aumento de despesa e esforço.

Uma outra desvantagem dos métodos conhecidos para isolar taxanos a partir de matéria vegetal é de que os métodos requerem que a matéria vegetal esteja substancialmente na forma seca. Os métodos presentes de secagem da matéria vegetal aumentam a degradação dos taxanos contidos dentro da matéria vegetal. A secagem da matéria vegetal, por isso, contribui para rendimentos menores de taxano.

SUMARIO DA INVENÇÃO

De acordo com a presente invenção, proporcionam-se novas fontes renováveis de taxanos a partir de variedades cultivadas de plantas Taxus. em contraste com as plantas \ selvagens, que são uma fonte limitada. De preferência, as plantas a serem processadas para a extracção de taxanos são fornecidas sob a forma de aparas intactas, em que uma

quantidade substancial de folhagem se encontra presa aos troncos. A matéria vegetal é depois tratada com um ou mais dissolventes para se obter uma composição rica em taxanos. A presente invenção proporciona também uma composição rica em taxanos, que é preparada a partir de uma ou mais variantes cultivadas ("cultivars") de plantas Taxus ornamentais. A composição rica em taxanos é preparada por meio do tratamento da matéria vegetal de uma ou mais variantes cultivadas ("cultivars"), fornecidas como aparas intactas, com um ou mais dissolventes, para se obter o produto rico em taxanos. Antes do tratamento com dissolvente, a matéria vegetal pode ser opcionalmente submetida a uma operação de secagem ou pode ser moída.

Adicionalmente, a presente invenção proporciona um processo para a preparação de material vegetal que pode ser usado como fonte para a extracção subsequente de taxanos, processo esse que conserva o teor de taxanos e aumenta a acessibilidade dos taxanos para a extracção. Este processo compreende proporcionarem-se aparas intactas, em que uma quantidade substancial de folhagem está ligada aos troncos da matéria vegetal que contem os taxanos, secarem-se as aparas intactas para reduzir o conteúdo volátil das aparas, para produzir aparas substancialmente secas e recuperarem-se as aparas substancialmente secas. De/ preferência, o processo de preparação da matéria vegetal é realizado a uma temperatura inferior a cerca de 70' Ce não é realizada sob a luz do sol directa não obstruída.

As matérias vegetais que podem ser usadas como fonte para os taxanos, preparadas de acordo com o método da presente invenção, método esse que compreende proporcionar-se aparas intactas, secarem-se as aparas intactas para reduzir os componentes voláteis para produzir aparas substancialmente secas e recuperar-se as aparas substancialmente secas, fazem também parte da invenção. A presente invenção refere-se também a um processo para a obtenção de uma mistura de taxanos impura, a partir de plantas que contêm taxanos. O processo compreende um tratamento com dissolvente inicial que compreende as seguintes i fases: A, extracção de taxanos a partir de matéria vegetal, fazendo contactar a matéria vegetal com um dissolvente orgânico e obtendo-se um primeiro resíduo substancialmente livre de dissolvente, rico em taxanos; B. distribuição do primeiro resíduo entre um

I disaolvente orgânico capaz de dissolver os taxanos e um dissolvente aquoso que não dissolve quantidades significativas de taxanos, para produzir uma fase orgânica e uma fase aquosa; C. separação da fase orgânica a partir da fase aquosa e recuperação da fase orgânica substancialmente livre da fase aquosa; e D. formação de um segundo resíduo a partir da segunda fase orgânica; e submeter-se o referido segundo resíduo a um tratamento de acabamento.

Os taxanos presentes no segundo resíduo são ainda purificados através de um tratamento de acabamento seleccionado de um dos tratamentos E ou F. 0 tratamento de acabamento E compreende as operações seguintes: dissolução do segundo resíduo num dissolvente que permite a ligação reversível dos taxanos a um suporte sólido, introdução de um suporte sólido no dissolvente que compreende o segundo resíduo dissolvido e permite que os taxanos do segundo resíduo se liguem ao referido suporte sólido, separação do referido suporte sólido do dissol- L 1 vente, contactar-se sequencialmente o suporte sólido com taxanos ligados com uma série de dissolventes, dissolventes esses que têm propriedades de eluição de taxanos diferentes, e eluição de uma fracção rica em taxanos a partir do suporte sólido, sob a forma de uma mistura de taxanos impura. 0 tratamento de acabamento F compreende a distribuição do segundo resíduo entre uma mistura aquosa e um dissolvente orgânico, não-miscível, não-polar, em que a mistura aquosa compreende uma única fase aquosa e um dissolvente orgânico polar miscível com água, dissolvente orgânico polar esse que se encontra presente na mistura aquosa, numa quantidade suficiente para permitir que os taxanos presentes no segundo resíduo entrem na mistura aquosa e se recuperar a mistura de taxanos impura da mistura aquosa.

Em adição ao processo de preparação de uma mistura de taxanos impura, a presente invenção inclui também as composições da mistura de taxanos impura, preparados de acordo com o método aqui descrito. A presente invenção proporciona também um processo para a separação de dois ou mais taxanos, incluindo taxol e cefalomanina, que compreende as operações seguintes: proporcionar-se uma mistura que compreende dois ou mais taxanos num dissolvente apropriado para serem carregados numa coluna de cromatografia em fase normal, carregar-se a mistura que compreende os taxanos, numa coluna de cromatografia em fase noral equipada com um suporte sólido, num dissolvente apropriado como fase móvel, e separarem-se os taxanos eluindo a coluna de cromatografia em fase normal com uma fase móvel tendo uma polaridade suficiente para eluir separadamente o taxol e a cefalomanina.

Adicionalmente, a presente invenção proporciona um processo para a separação de taxol da cefalomanina, usando cromatograf ia em fase normal, em que é usada uma mistura de acetato de etilo e cloreto de metileno como fase móvel.

Um processo para a obtenção de taxanos a partir de matéria vegetal contendo taxanos e a separação dos taxanos faz também parte da presente invenção. Este processo compreende: proporcionar-se aparas intactas em que uma quantidade substancial de folhagem está ligada aos troncos da matéria vegetal contendo os taxanos, secarem-se as aparas intactas para reduzir o seu conteúdo volátil, para produzir

aparas substancialmente secas e recuperarem-se as referidas aparas substancialmente secas, V- extrairêi-se T.taxanos a partir das aparas substancialmente secas referidas, de acordo com as operações seguintes, que compreendem: A. fazer-se contactar a matéria vegetal com um dissolvente orgânico e obter-se um primeiro resíduo substancialmente livre de dissolvente, rico em taxanos; B. distribuir-se o primeiro resíduo entre um dissolvente orgânico capaz de dissolver os taxanos e um dissolvente aquoso que não dissolve quantidades significativas de taxanos, para produzir uma fase orgânica e uma fase aquosa; C. separar-se a fase orgânica da fase aquosa e \ recuperar-se a fase orgânica substancialmente livre da fase aquosa; D. formar-se um segundo resíduo a partir da segunda fase orgânica; submeter-se a referida fase orgânica a um tratamento de acabamento escolhido de um dos dois conjuntos de operações que consistem em ou E. dissolver-se o segundo resíduo num dissolvente que permite realizar a ligação reversível dos taxanos a um suporte sólido, i introduzir-se um suporte sólido no dissolvente, que compreende o segundo resíduo dissolvido e permitir que os taxanos do segundo resíduo se liguem ao referido suporte sólido, separar o referido suporte sólido a partir do dissolvente, fazer contactar sequencialmente o suporte sólido com os taxanos ligados com uma série de dissolventes, dissolventes esses que têm propriedades de eluição dos taxanos diferentes, e eluir uma fracção rica em taxanos a partir do suporte sólido, sob a forma de uma mistura de taxanos bruta, ou F. distribuir-se o segundo resíduo entre uma mistura aquosa e um dissolvente orgânico não-polar não--miscível, em que a mistura aquosa compreende uma única fase constituída por água e um dissolvente polar orgânico miscível com água, dissolvente orgânico polar esse que está presente na referida mistura, numa quantidade suficiente para permitir que os taxanos presentes no segundo resíduo entrem para a mistura aquosa, e recuperar-se a mistura de taxanos bruta a partir da segunda mistura aquosa, proporcionar-se a mistura de taxanos bruta obtida a partir dos tratamentos E ou F, em que a referida mistura de taxanos bruta compreende dois ou mais taxanos, num dissolvente apropriado para ser carregado numa coluna de cromatografia em fase normal; carregar a mistura que compreende os taxanos numa coluna de cromatografia em fase normal cheia com um suporte sólido, num dissolvente apropriado como fase móvel;

Separar os taxanos eluindo a coluna de cromatograf ia em fase normal com uma fase móvel, tendo uma polaridade suficiente para eluir separadamente o taxol e a cefalomanina.

Deste modo, constitui um objecto da presente invenção proporcionar-se uma fonte consistente e renovável de taxanos e um método para recuperar de forma eficaz os taxanos .

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção proporcionar um método para o isolamento de taxanos a partir de matéria vegetal que reduza a necessidade de

eluições múltiplas, numa variedade de colunas de cromatografia em fase normal.

Constitui um objecto adicional da presente invenção, proporcionar um método para o isolamento de taxa-nos, método esse que evite ou minimize o uso de certos hidrocarbonetos clorados, tais como cloreto de metileno e clorofórmio.

Constitui também um objecto da presente invenção proporcionar-se um método para o isolamento de taxanos a partir de matéria vegetal, que produza taxanos em rendimentos elevados.

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção proporcionar-se um método para a secagem de matéria vegetal contendo taxanos, que minimize a perda de taxanos. Um outro objecto da presente invenção consiste em se proporcionar matérias vegetais substancialmente secas, que possam ser usadas como fonte para taxanos.

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção proporcionar-se um método para o isolamento de taxanos a partir de matéria vegetal, que permita o uso de uma agitação simples para remover os componentes orgânicos da matéria vegetal.

I

Constitui também um objecto da presente invenção proporcionar um método para o isolamento de taxanos, a partir de matéria vegetal, que elimine a necessidade de operações de filtração.

Constitui ainda um objecto adicional da presente i invenção proporcionar um método para o isolamento de taxanos a partir de matéria vegetal, que não requeira o uso de meios de eluição aquosos, conforme se verifica na cromatografia em fase invertida,

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção proporcionar-se um método para o isolamento de taxanos a partir de matéria vegetal, que evite a epimerização do estéreocentro C-7.

Constitui ainda um outro objecto adicional da presente invenção proporcionar um método para o isolamento de taxanos a partir de matéria vegetal, em que todos os taxanos possuem tempos de retenção substancialmente distintos na cromatografia em fase normal.

Constitui ainda um outro objecto da presente invenção proporcionar um método para a obtenção de uma mistura de taxanos bruta.

Constitui ainda um outro objecto da presente

invenção proporcionar uma composição que compreende uma mistura de taxanos bruta.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Qualquer matéria vegetal que contenha taxanos é útil nos métodos da presente invenção. Além disso, a matéria vegetal usada pode ser de origem genética pura, genética mista ou de origem híbrida, ou de origem genética desconhecida. A matéria vegetal colhida das plantas que crescem no mato, pode ser usada como uma fonte para os taxanos. Exemplos disso incluem a 1\_ brevifolia. a 1\_ baccata. a Ί\_ cuspidata e a T^. wallachiana. De preferência, a matéria vegetal das variantes cultivadas ("cultivars") de plantas pertencentes ao género Taxus é usada como fonte para taxanos e, em particular, certas variedades ou espécies de Taxus ornamental cultivado. Tal como aqui é usada, "variantes cultivadas ("cultivars")" significa um conjunto de plantas cultivadas, que se distingue claramente por qualquer característica (morfológica, fisiológica, citológica, química ou outras) e que, quando reproduzida (sexual ou assexualmente), retém as suas características distintivas. Hortus Third: A Concise Dictionary of Plants Cultivated in the United States. (Um Dicionário Conciso de Plantas Cultivadas nos Estados Unidos) MacMillan Publishing Co., Inc., 1976.

Surpreendentemente, descobriu-se que várias varie-

I xl dades de variantes cultivadas ("cultivara") Taxus ornamentais foram identificadas com um teor de taxol nas folhas verdes, comparável a ou superior ao da casca seca do tronco da T. brevifolia. De entre as variedades identificadas, estão: Ί\_ X media "Henryi", Ί\. X media Runyan", Τ\_ cuspidataf T. X media "Halloran", T_._ X media "Hatfield", L X media "Hicksii", Τ_^ X media "Nigra", T\ X media "Tauntonii", Ί\. X media "Dark Green Sreader" e a T_j_ cuspidata "Brevifolia", T\_ cuspidata "Spreader" cultivadas. Outras variedades com teor de taxol nas folhas secas comparável ao da casca seca do tronco da T. brevifolia incluem a T_i X media "Wardii" , T_:_ X media "Brownii" e TL X media "Densiformis".

As variantes cultivadas ("cultivars") preferidas i podem ser seleccionadas do grupo que consiste ei L X media "Densiformis", X media " Hicksii", Ί\_ X media "Dark Green Spreader", T\ X media "Runyan", L X media "Brownii", Ί\ X media "Wardii", T\_ X media "Halloran", T\. X media "Hatfield", T. X media "Nigra", 1\_ X media "Tauntonii", Ί\_ cuspidata "Brevifolia" e Ί\_ cuspidata. Mais preferencialmente, contudo, são as variantes cultivadas ("cultivars") cujas folhas possuem um teor de taxanos maior do que a casca do caule seca da Tj. brevifolia que são usadas como fontes para os taxanos.

As variantes cultivadas ("cultivars") mais preferidas podem ser seleccionadas do grupo que consiste em cuspidata: T. X media "Halloran"; Τ\. X media "Hatfield"; T^. X media "Nigra"; T. X media "Tauntonii"; Ί\ X media "Dark Green Spreader"; e T.. X media "Hicksii". As "cultivars" acima referidas encontram-se à disposição nas casas comerciais da especialidade. A matéria vegetal usada nos métodos da presente invenção pode ser qualquer porção de variante cultivada que contenha taxanos e pode compreender as folhas, os troncos, ramos, casca, raízes ou suas misturas. Na forma de realização preferida da presente invenção, as folhas são secas nos pequenos troncos como aparas intactas, antes de se separarem a fim de preservar o seu teor de taxol. Tal como aqui é usado, "aparas intactas" significa incluir qualquer apara em que uma quantidade substancial da folhagem original ou das folhas permanece ligada aos troncos. Uma apara é também referida pelos peritos na matéria como uma "poda" ("trimming"). Adicionalmente, o teor de taxol dos pequenos caules que seguram as folhas é aproximadamente de 60-70% do das folhas. A matéria vegetal a ser extraída, de acordo com os η métodos da presente invenção, é usada quer na forma fresca ou seca. Tal como aqui é usada, "fresca" significa que inclui matéria vegetal que retém substancialmente todo o seu conteúdo volátil. De preferencia, a matéria vegetal é seca a uma temperatura inferior a cerca de 70’C, quer sob condições de total exposição à luz, à sombra ou na escuridão, de forma a que a secagem não seja realizada sob a luz do sol directa não-obstruída. Tal como aqui é usado, "total exposição à luz" significa que inclui qualquer condição em que a luz do ambiente visível, tal como a luz do sol ou a que se encontra i nas estufas de plantas ou na iluminação artificial dos edifícios, não e substancialmente bloqueada, reflectida ou, de qualquer outra forma impedida de atingir a matéria vegetal. Mais preferencialmente, a matéria vegetal é seca a uma temperatura compreendida entre cerca de 65'C e cerca de 20'C, à sombra ou em condições de escuridão. 0 ar seco ou a baixa humidade são condições preferíveis para a secagem. De preferência, a humidade relativa não é superior a cerca de 80%; mais preferencialmente não superior a cerca de 50% de humidade relativa. Tal como aqui é usada, "condições de sombra" entende-se que inclui um ambiente em que é bloqueada cerca de 40% e cerca de 70% da luz do sol, exterior, visível,

não obstruída, reflectida ou de outra forma impedida de at.ingir a matéria vegetal que está a ser seca. Alternativamente, deverá ser evitada a exposição da matéria vegetal à luz, luz essa que é absorvida pela planta e convertida em calor, causando o aumento da temperatura da planta acima de cerca de 70'C. De preferência, obtem-se pelo menos uma redução de 25% no peso da matéria vegetal, durante a fase de secagem. De acordo com uma forma de realização mais preferida, a matéria vegetal é seca até se obter entre cerca de 40% e cerca de 70% de perda de peso.

Apesar de não querermos estar ligados por teoria, pensa-se que a secagem da matéria vegetal, nas condições da presente invenção, preserva de forma substancial o conteúdo de taxano da matéria vegetal, limitando a sua decomposição. Adicionalmente, crê-se também, apesar de não se querer estar ligado por qualquer teoria, que o método de secagem da matéria vegetal, de acordo com a presente invenção, aumenta a acessibilidade do taxol e de outros taxanos à extracção.

Os peritos na matéria reconhecerão que existe uma relação entre temperatura de secagem e a duração da secagem. Por .exemplo, a secagem a uma temperatura relativamente elevada necessitará de um período de tempo mais curto do que a 1 secagem a uma temperatura relativamente mais baixa. Qualquer método de secagem da matéria vegetal para levar a uma perda de peso tal como descrito acima, desde que deixe o teor de taxano da matéria vegetal substancialmente não-afectado, se encontra dentro do âmbito da presente invenção. Esses métodos podem incluir a secagem por congelação e secagem com micro--ondas.

Apesar da pressão a que a matéria vegetal é seca não seja considerada crítica, entende-se que o uso de uma pressão atmosférica baixa pode aumentar a secagem a temperaturas mais baixas ou em períodos de tempo mais curtos. 0 profissional pode, por isso, fazer uma selecção entre as várias temperaturas e pressões atmosféricas de secagem, sem sair do âmbito da invenção. A matéria vegetal, preparada de acordo com o processo da presente invenção, que compreende aparas intactas substancialmente secas, proporciona um material vegetal, que também faz parte da presente invenção, que pode ser usado como fonte para taxanos. A seguir à fase de secagem, as aparas são recuperadas para uso subsequente, como uma fonte de taxanos.

Apesar de o material vegetal a ser extraído poder ií ser usado na forma substancialmente intacta, é, de preferência, manipulado para aumentar a área superficial da matéria vegetal e, deste modo, aumentar a taxa de extracção de taxanos. Mais preferencialmente, a matéria vegetal é cortada, esmagada ou manipulada para formar um pó. Mais preferencialmente, a matéria vegetal é moída ou à mão ou através de meios mecânicos. Os métodos apropriados para a moagem incluem o uso de um misturador, um moinho de bolas, um Moinho de Wiley ou um Moinho de Fritz. Podem ser usados outros aparelhos e métodos de moagem sem sair do âmbito e do espírito da invenção.

De preferência, a matéria vegetal é moída para uma granulometria compreendida entre cerca de 40-80 malhas. Mais preferencialmente, a matéria vegetal é moída para uma granulometria de cerca de 60 malhas.

Para extrair os taxanos a matéria vegetal fresca ou seca a ser extraída, em qualquer forma física acima descrita, é submetida a um ou mais tratamentos iniciais com \ dissolvente, que compreendem fazer-se contactar a matéria vegetal com um dissolvente orgânico para formar um extracto a partir do qual pode ser obtido um primeiro resíduo substancialmente livre de dissolvente, rico em taxanos.

Extracções múltiplas da matéria vegetal com o dissolvente orgânico podem aumentar a extracção de taxanos. De preferência, a proporção pesoivolume da matéria vegetal para o dissolvente orgânico varia entre cerca de 1:8 e 1:12. Uma proporção de peso:volume mais preferida é de cerca de 1:10. Uma proporção de peso:volume da matéria vegetal para o volume total do dissolvente orgânico usado para extrair a matéria vegetal varia entre cerca de 1:10 e cerca de 1:150. Uma proporção peso:volume mais preferida da matéria vegetal para o yolume total do dissolvente orgânico é de cerca de 1:40.

De preferência, o contacto da matéria vegetal com o dissolvente orgânico é promovido por percolação ou extracção em extractor de Soxhlet. Mais preferencialmente, o contacto é promovido por agitação com sacudimento. Mais preferencialmente, o contacto é levado a cabo por agitação da matéria vegetal à medida que é embebido pelo dissolvente orgânico. Nesta fase, substancialmente toda a matéria orgânica extractível, incluindo os taxanos, é removida da matéria vegetal e transportada para dentro do dissolvente orgânico. 0 dissolvente orgânico que é feito contactar com a matéria vegetal é, de preferência, um dissolvente normalmente usado com os químicos orgânicos de extracção a partir de Λ matéria vegetal. Os dissolventes orgânicos preferidos incluem etanol, acetona, acetato de etilo, cloreto de metileno, metanol, metil-etil-cetona, metil-isobutil-cetona, éter metil-t-butílico ou suas misturas. De preferência, o disssol-vente orgânico é etanol. Além disso, descobriu-se que entre cerca de três a cerca de seis volumes de cerca de 40 ml e cerca de 200 ml do dissolvente orgânico, aplicados sequencialmente durante um período de cerca de 8 horas a cerca de 48 horas, são suficientes para remover essencialmente 100% de todos os taxanos de cerca de 10 gramas de matéria vegetal. Descobriu-se também que entre cerca de três a cerca de seis volumes de entre cerca de 2 litros e cerca de 5 litros do dissolvente orgânico, aplicados sequencialmente durante um período de cerca de 8 horas a cerca de 48 horas, são suficientes para remover essencialmente 100% de todos os taxanos i de cerca de 1000 g de matéria vegetal.

Numa forma de realização preferida separada, a matéria vegetal é, opcionalmente, primeiro desengordurada com hexano, hexanos, pentano, éter de petróleo, isooctano ou suas misturas, seguido pelo contacto da matéria vegetal com o dissolvente orgânico. Por exemplo, descobriu-se que o uso de dois volumes de aproximadamente 100 ml de hexano é suficiente para desengordurar cerca de 10 gramas de matéria vegetal moída seca, durante um período compreendido entre cerca de oito horas e cerca de dois dias.

Numa outra forma de realização preferida, o material vegetal é primeiro desengordurado com hexano, depois extraído’ agitando-se com sacudimento com dissolvente orgânico, etanol, acetona ou acetato de etilo, durante um período de 24 horas, mudando o dissolvente quatro vezes durante este período.

Os peritos na matéria reconhecerão que usos múltiplos de volumes relativamente mais pequenos de dissolvente é mais eficaz na extracção dos materiais do que um único uso de um maior volume de dissolvente. Deste modo, o técnico pode partir dos volumes de dissolventes usados em cada uma das fases que envolvem a extracção, distribuindo ou, de outra forma, removendo os materiais orgânicos aqui descritos, bem como o número de interacções de extracção, sem sair do âmbito da invenção.

As partes hidrofílicas extraídas da matéria vegetal pelo dissolvente orgânico, são depois separadas dos taxanos e removidas distribuindo a matéria vegetal extraída, obtida do dissolvente orgânico, entre um par apropriado de dissolventes

orgânicos e aquosos, de tal forma que os taxanos permaneçam num dissolvente orgânico e as partes hidrofílicas sejam removidas num dissolvente aquoso. São apropriados os dissolventes orgânico e aquoso, que sejam imisciveis um com o outro e possam ser separados um do outro, a seguir à distribuição, desde que a pureza de uma fase não seja substancialmente contaminada pela outra, desde que os taxanos tenham uma solubilidade suficiente no dissolvente orgânico para permanecerem no dissolvente orgânico. Além disso, os dissolventes aquosos apropriados não deverão dissolver quantidades significativas de taxanos. Deste modo, nesta e em qualquer outra operação subsequente que envolva a distribuição dos taxanos * entre duas operações diferentes ou a sua posterior purificação, qualquer dissolvente de uma fase anterior que permaneça com os taxanos a serem purificados, e que interfira com a acção dos dissolventes numa fase subsequente, é removido. Por exemplo, um dissolvente de uma fase que interfira com a distribuição de um dissolvente orgânico e um dissolvente aquoso, numa fase subsequente, aumentando a miscibilidade dos dissolventes orgânico e aquoso, é removido antes de se contactarem os taxanos com os dissolventes orgânico e aquoso a serem distribuídos.

ÍOLía^uc»

De preferência, a seguir à extracção da matéria vegetal com o dissolvente orgânico, o extracto é evaporado até à secura, formando um primeiro resíduo, com ou sem aquecimento, para promover a taxa de evaporação do dissolvente. Se se usar aquecimento, deverão ser evitadas as temperaturas que promovem a epimerização dos taxanos. De preferência, as temperaturas não deverão exceder cerca de 35‘C a cerca de 40' C.

Uma vez evaporado o dissolvente, o material que fica como primeiro resíduo é dissolvido num dissolvente orgânico, tal como cloreto de metileno ou, mais preferencialmente, acetato de etilo, para formar um segundo extracto. É preferida uma proporção de peso:volume do primeiro resíduo para o dissolvente orgânico, de cerca de 1 a cerca de 10 a 20. Por exemplo, um grama de resíduo seria dissolvido em cerca de 10 a 20 ml de dissolvente orgânico. 0 segundo extracto é lavado, distribuindo-o com um componente de dissolvente aquoso que não dissolva quantidades significativas de taxanos, para remover quaisquer partes hidrofílicas que possam permanecer no segundo extracto. São apropriados como dissolvente aquoso a água, dissolventes polares semelhantes ou suas misturas, De preferência, o dissolvente aquoso é

água. É geralmente suficiente para lavar o segundo extracto um volume de dissolvente aquoso de cerca de metade do volume do dissolvente orgânico. 0 dissolvente aquoso é depois separado do segundo extracto. 0 dissolvente aquoso pode ser excluído. 0 segundo extracto contem os taxanos. 0 segundo extracto é opcionalmente tratado com um agente de secagem para remover a água encontrada no extracto, seguido pela remoção do agente de secagem e do agente de evaporação para \ formar um segundo resíduo. Os agentes de secagem preferidos • são o sulfato de magnésio anidro, peneiros moleculares 4 A, cloreto de cálcio ou suas misturas. Um agente de secagem mais preferido é o sulfato de sódio anidro. 0 técnico pode achar ser vantajoso adicionar um pequeno volume de um dissolvente orgânico ao agente de secagem antes de combinar o segundo extracto que contém o taxano e o agente de secagem. A adição de um dissolvente orgânico ao agente de secagem tende a impedir que os taxanos adiram ao agente de secagem e, deste modo, aumenta os rendimentos. 0 agente de secagem pode ser removido por filtração com gravidade, filtração em vácuo ou por decantação do dissolvente do agente de secagem. Um outro método para remover a água residual do segundo extracto,

consiste em arrefecer o segundo extracto para uma temperatura na qual a água no segundo extracto está no estado congelado, sem congelar o dissolvente orgânico. 0 material liquido não--aquoso pode depois ser decantado separando-o do material aquoso. ‘ A purificação posterior dos taxanos é realizada de acordo com a invenção, submetendo o segundo resíduo a um tratamento de acabamento. De acordo com o método de um tratamento de acabamento, o segundo resíduo é dissolvido num dissolvente que permite a ligação reversível dos taxanos num suporte sólido. Um suporte sólido é depois introduzido no dissolvente que compreende o segundo resíduo dissolvido e deixam-se ligar ao suporte sólido os componentes do segundo resíduo, incluindo os taxanos. A seguir à separação do suporte sólido do dissolvente, de preferência por evaporação do dissolvente, de forma a deixar um resíduo na celite, resíduo esse que forma um revestimento que compreende os taxanos, o suporte sólido é sequencialmente eluido com uma série de dissolventes que resulta na eluição de uma fracção rica em taxanos. Um exemplo de um suporte sólido apropriado é a i celite. De preferência, a celite é revestida com componentes do segundo resíduo, que foram dissolvidos num dissolvente orgânico compreendendo uma mistura de metanol e acetato de etilo, evaporando o dissolvente da mistura de dissolvente do segundo resíduo e da celite. De preferência, o metanol e o acetato de etilo encontram-se presentes numa proporção de volume:volume de 1:3. A celite revestida é, de preferência, eluida primeiro com hexano, que não elui significativamente os taxanos, mas elui outras moléculas menos polares. Uma mistura de taxanos bruta da presente invenção á depois eluida da celite, de preferência com cloreto de metileno ou outro dissolvente igualmente polar.

Uma outra operação de acabamento para purificar mais os taxanos presentes no segundo resíduo compreende a distribuição do segundo resíduo entre uma mistura aquosa e um dissolvente orgânico não-miscível não-polar. De preferência, o segundo resíduo é primeiro dissolvido na mistura aquosa, que é depois combinada com o dissolvente orgânico não-polar não-miscível. Os dissolventes orgânicos não-miscíveis não--polares são dissolventes tais como hexano, pentano, petróleo, éter, heptano, iso-octano e suas misturas. De preferência, o dissolvente orgânico não-polar não-miscível é o hexano. Uma proporção preferida de dissolvente orgânico ϊί não-polar não-miscível para a mistura aquosa, é de 2 para 1. A mistura aquosa é uma mistura aquosa de fase única que compreende água e um dissolvente orgânico polar miscível com água. 0 dissolvente orgânico polar encontra-se presente na mistura aquosa numa quantidade suficiente para permitir que os taxanos presentes no segundo resíduo entrem na mistura aquosa. De preferência, a mistura aquosa compreende mais do que cerca de 50% de dissolvente orgânico polar e o contrapeso de água. Mais preferencialmente, a mistura aquosa compreende cerca de 9 partes de dissolvente orgânico polar e cerca de uma parte de água. Numa forma de realização preferida, o dissolvente orgânico polar é acetonitrilo. Numa forma de realização mais preferida, o dissolvente orgânico polar é metanol. A mistura aquosa que compreende a mistura de taxa- nos bruta da presente invenção é separada do dissolvente orgânico não-miscível não-polar. A mistura aquosa pode ser \ evaporada para remover o componente orgânico polar e a mistura de taxanos bruta pode ser combinada com um dissolvente orgânico para depois purificar os taxanos. Uma vez que a mistura aquosa tem uma composição predominantemente de ace-tonitrilo ou de metanol, é, de preferência evaporada directa- mente para formar um terceiro resíduo que compreende a mistura de taxanos bruta. Podem ser usados calor, vácuo e suas combinações, para promover a evaporação, desde que a temperatura* da mistura aquosa não exceda cerca de 40'C. A evaporação directa da mistura aquosa evita a possibilidade de que alguns taxanos se possam perder em fases de extracção desnecessárias.

Qualquer das operações de tratamento com dissolvente inicial anteriores ou das fases de tratamento de acabamento do processo para se obter a mistura de taxanos bruta, pode ser repetida uma ou mais vezes. Por exemplo, qualquer das operações anteriores pode ser repetida pelo menos, uma, duas, três ou quatro vezes.

Podem puri£icar-se taxanos específicos das misturas de taxanos brutas da presente invenção, por meio de quaisquer protocolos de purificação normalmente usados, tais como cristalização ou trituração. Os taxanos preferidos que podem encontrar-se presentes na mistura de taxanos bruta e podem ainda ser purificados de acordo com os métodos da presente invenção, incluem taxol, cefalomanina, desacetilcefalomanina, bacatina III, 10-desacetil-bacatina III e 10-desacetitaxol. A cristalização pode ser levada a cabo permitindo a formação de cristais de uma solução substancialmente saturada da mistura de taxanos bruta. Alternativamente, pode-se deixar crescer os cristais, adicionando um cristal semente do produto dos taxanos desejado a uma solução substancialmente saturada de taxanos brutos. Idealmentb, é usado um único dissolvente como dissolvente de cristalização, embora o uso de misturas de dissolventes esteja contemplado pela invenção. A temperatura do dissolvente ou dissolventes de cristalização não é crítica, desde que resulte em taxanos substancialmente puros.

De acordo com a presente invenção, podem também ser purificados taxanos específicos a partir da mistura de taxanos bruta, usando uma série de colunas de cromatografia em fase normal. Os taxanos específicos são eluidos fazendo passar misturas de dissolvente com um poder elutrópico pro- i gressivamente aumentado através das colunas. Em geral, na cromatografia em coluna em fase normal, a fase móvel compreende um sistema de dois componentes. 0 primeiro componente é um dissolvente orgânico não-polar que controla a taxa de eluição do composto. 0 segundo componente é um dissolvente orgânico polar que elui os compostos a serem separados. Aumentando quantidades maiores do segundo componente na fase móvel, diminui em geral o tempo de contacto dos compostos em eluição com o enchimento da coluna. Concentrações mais elevadas do segundo componente têm, por isso, o efeito de diminuir o tempo de eluição. A separação dos taxanos pode ser melhorada usando uma fase móvel que segue um gradiente de força elutrópica aumentado, embora a eluição isocrática seja também contemplada pela presente invenção. Os materiais de enchimento da cro-matografia em coluna em fase normal preferidos para uma ou mais das colunas de cromatografia podem ser seleccionados do grupo que consiste em gel de sílica, florisil, alumina e celite. Um material de enchimento da cromatografia em coluna em fase normal especificamente preferido, é o gel de sílica 60, 230-400 malhas, fabricado por E. Merck e vendido pela Brinkman Instrument Co., Westbury, N.Y.

Para preparar a mistura de taxanos bruta, o terceiro resíduo, para levar a cabo numa coluna de cromatografia, o terceiro resíduo pode ser triturado (digerido) repetidamente (1-5 vezes) com um dissolvente orgânico que dissolve os taxanos. O referido dissolvente orgânico pode ser selecciona-do do grupo que consiste em éter, cloreto de metileno, metanol, clorofórmio, acetato de etilo e acetona. 0 dissolvente orgânico preferido é o cloreto de metileno. 0 terceiro

resíduo dissolvido no dissolvente orgânico é combinado com um suporte sólido, tal como terra de diatomãceas ou celite e evaporado até à secura, aderindo deste modo os taxanos ao suporte sólido. 0 suporte sólido que contem os taxanos é depois carregado directamente no topo de uma coluna de cromatografia em fase normal cheia.

Uma vez colocado directamente o suporte sólido no topo da coluna de cromatografia em fase normal cheia, faz-se passar uma fase móvel capaz de separar os taxanos uns dos outros e de outros componentes vegetais, através da coluna de i cromatografia. A fase móvel compreende (1) um componente não--polar seleccionado do grupo que consiste em hexano, éter de petróleo, iso-octano e dissolventes tendo polaridades semelhantes, e (2) um componente polar seleccionado de acetona, acetato de etilo, éter, éter metil-t-butílico, clorofórmio e dissolventes tendo polaridades semelhantes. De preferência, a fase móvel compreende hexano e acetona.

Numa forma de realização preferida, a fase móvel compreende inicialmente entre cerca de 60% a 85% de hexano e entre cerca de 15% a 40% de acetona e segue um gradiente de força elutrópica crescente. A fase móvel pode ter qualquer I*

composição final, desde que seja realizada a separação eficaz dos taxanos. Mais preferencialmente, contudo, a fase móvel tem uma concentração inicial de cerca de 75% de hexano e cerca de 25% de acetona e uma concentração final de cerca de 0% de hexano e cerca de 100% de acetona. No caso de uma mistura de hexano/acetona, é o hexano que controla a taxa de eluição e a acetona que elui os taxanos. Os taxanos desejados são eluidos de fracções que compreendem cerca de 60% de hexano e cerca de 40% de acetona, e cerca de 0% de hexano e cerca de 100% de acetona. Alternativamente, quaisquer outras séries de misturas de dissolventes que tenham polaridades semelhantes às das misturas de hexano/acetona, descritas acima, são apropriadas para eluir as moléculas de taxano da primeira coluna de cromatografia em fase normal.

De preferência, a coluna de cromatografia em fase normal é levada a cabo sob pressão. Para uma coluna de 5 X 16 cm contendo 160 g de gel de sílica 60, o de caudal é, de preferência, de cerca de 100 ml/5 min. A presença de taxanos nas fracções recolhidas das colunas pode ser detectada por cromatografia em camada fina ("TLC") usando gel de sílica G UV254 (Machery Nagel, Duren) usando 5% de metanol/clorofórmio como sistema de desenvolvi- \ ί mento e g-anisaldeído/ácido sulfúrico como reagente de visualização. 0 taxol e a cefalomanina aparecem como uma mancha cinzento-azulada com um valor R^ de 0,62 nas fracções eluidas com proporções de hexano/acetona de 60:40 e 55:45. A Baccatina III aparece sob a forma de uma mancha azul com um valor Rf de 0,55 nas fracções eluidas com hexano/acetona 50:50 e 45:55. 0 taxano 10-desacetil-bacatina III aparece sob a forma de uma mancha avermelhada com um valor R^ de 0,28 na frac'ção eluída com hexano/acetona 0:100. 0 dissolvente de hexano/acetona das fracções ricas em taxanos é evaporado até à secura para formar um produto rico em taxano. A posterior purificação de taxanos do taxol dos taxanos e da cefalomanina pode ser levada a cabo carregando o produto rico em taxanos, compreendendo o taxol e a cefalomanina, noutra coluna de clomatografia em fase normal, compreendendo gel de sílica 60 ou material semelhante cheia com cerca de 11 de metanol e 99% de cloreto de metileno. A força elutrópica da fase móvel é aumentada, aumentando a concentração de metanol em incrementos de cerca de 0,5% de metanol, até a fase móvel ter uma composição de cerca de 2,5% de metanol e 97,5% de cloreto de metileno. A fase móvel que (ΑΛΛΑΖΑ.'lyí passa através de uma coluna de 2 cm X 40 cm tem, de preferência, um caudal de cerca de 8 ml/min. Os taxanos, o taxol e a cefalomanina, são recolhidos das fracções eluídas com cerca de 2,5% de metanol e 97,5% de cloreto de metileno. Alternativamente, qualquer outra série de misturas de dissolventes com polaridades semelhantes às das misturas do dissolvente de metanol/cloreto de metileno é apropriada para eluir os taxanos da segunda coluna de cromatografia em fase normal. As fracções ricas em taxol-cefalomanina da coluna de metanol/cloreto de metileno são evaporadas até à secura para formar outro produto rico em taxanos.

Surpreendentemente, o taxol pode ser separado da cefalomanina, de acordo com o método da presente invenção, proporcionando uma mistura que compreende dois ou mais taxanos num dissolvente apropriado para o carregamento numa coluna de cromatografia em fase normal. A mistura que compreende os taxanos é depois carregada numa coluna de cromatografia em fase normal cheia com um suporte sólido num dissolvente apropriado como fase móvel. Os taxanos, incluindo o i taxol e a cefalomanina, são depois separadamente eluídos com uma fase móvel tendo uma polaridade suficiente para eluir e separadamente o taxol e a cefalomanina. De preferência, usada como fase móvel uma mistura de acetato de etilo e cloreto de metileno. De acordo com uma forma de realização preferida da presente invenção, o segundo produto rico em taxanos é dissolvido numa mistura de cerca de 20% de acetato de etilo e 80% de cloreto de metileno e carregado numa coluna de eromatografia em fase normal cheia com gel de sílica 60, ou um suporte sólido semelhante, tal como se descreveu acima, na presença de uma fase móvel que compreende cerca de 20% de acetato de etilo e 80% de cloreto de metileno. A força elutrópica da fase móvel é aumentada, aumentando a concentração de acetato de etilo em incrementos de cerca de 5% de acetato de etilo, até a fase móvel ter uma composição de cerca de 50% de acetato de etilo e 50% de cloreto de metileno. Um caudal de cerca de 8 ml/min é preferido para uma coluna de 1 cm X 32 cm. É recolhido taxol substancialmente puro das fracçóes eluídas com cerca de 45% de acetato de etilo e 55% de cloreto de metileno. É recolhida cefalomanina substancialmente pura das fracções eluídas com uma fase móvel compreendendo cerca de 50% de acetato de etilo e 50% de cloreto de metileno. Alternativamente, quaisquer outras séries de misturas de dissolventes tendo polaridades semelhantes às das misturas de acetato de etilo/cloreto de me- t Ί Α~·'\ I j/1ιΑΛ^Μλ· tileno, acima descritas, são apropriadas para eluir as moléculas de taxano, taxol e cefalomanina, da coluna de cromatografia em fase normal.

Dependendo do grau de separação dos taxanos presentes na mistura de taxanos bruta, obtida como resultado da etapa de cromatografia em fase normal inicial, a cromatogra-fia adicional dos taxanos usando acetato de etilo e cloreto de metileno como fase móvel, surpreendentemente, pode separar e purificar os taxanos, incluindo a separação de taxol da cefalomanina, obviando a necessidade de uma cromatografia intermediária usando metanol-cloreto de metileno.

Qualquer das operações de cromatografia anteriores pode ser repetida uma ou mais vezes, por exemplo, uma, duas, três ou quatro vezes, para purificar ainda ou separar os taxanos numa operação particular.

Embora a cromatografia em coluna seja um método i preferido, qualquer outra configuração cromatográfica, tal como a cromatografia em fase normal radial, conforme efectua-do num "cromatotron", são úteis nos métodos da presente invenção. Também podem ser usados outros meios de detecção apropriados para identificar os taxanos, sem sair do âmbito da' invenção.

EXEMPLOS:

Exemplo 1QuantJ.ficação do teor de taxol. de variedades diferentes de Taxus ornamental cultivado.

Analisaram-se folhas verdes de aparas de várias variedades cultivadas de Taxus ornamental relativamente ao seu teor de taxol seguindo o processo abaixo delineadolsl

Extracção a. Misturaram-se e pesaram-se bem folhas que tinham sido recolhidas das aparas. b. Misturaram-se amostras de dez gramas de cada variedade de Taxus ornamental cultivado num misturador com 100 ml de 951 de etanol e transferiu-se a mistura quantitativamente para dentro de um frasco Erlenmeyer de 250 ml. Deixaram-se extrair as folhas e o etanol por percolação, durante 24 horas, e depois filtraram-se com enchaguamento (1 X 25 ml). Repetiu-se o processo de percolação durante mais três vezes. c. Combinaram-se os filtrados (500 ml) e evaporaram-se até à secura, sob vácuo, a uma temperatura não superior a 40'C. 0 peso do extracto de etanol, ou primeiro resíduo, foi registado.

(aAsíaMj*

Preparação do extracto de etanol para análise de HPLC (Croma-toqrafia em Camada de Pressão Elevada) a. Passaram-se aproximadamente 100 mg dos extrac-tos em frascos de tampa com rosca. As tampas foram niveladas com um pedaço de folha de alumínio, para evitar o contacto do extracto com a cobertura, durante a distribuição. b. Os extracts foram distribuídos entre água (1 ml) e cloreto de metileno (2 ml X 5), ou até o cloreto de metileno se tornar incolor. As lavagens de cloreto de metileno combinadas foram pipetadas para dentro de frascos de Erlenmeyer de 25 ml e evaporadas até à secura, para produzirem um segundo resíduo. Registou-se o peso do segundo resíduo. c. Dissolveu-se o segundo resíduo em acetato de etilo (5 ml) e metanol (2 ml) com sonicação. Introduziu-se celite (200 mg a 650 mg) e deixou-se revestir com o material extraído. Evaporou-se o dissolvente até à secura, em vácuo, para produzir um material de celite revestido com o segundo resíduo. d. A celite revestida com o resíduo foi quantitativamente transferida- para uma placa de petri. A placa foi deixada sob uma coberta ate terem sido removidos os últimos 7 I, | vestígios de dissolvente (10 minutos). 0 produto final foi triturado, até se obter um pó uniforme de escorregamento livre. 0 pó resultante foi carregado para dentro de uma pipeta de Pasteur, que serviu como coluna. e. Eluiu-se a coluna com hexano (7 ml, ou até o eluente ficar incolor), seguido por cloreto de metileno (5-6 ml) . f. 0 eluente de cloreto de metileno foi evaporado em vácuo e registou-se o peso do resíduo restante. g. 0 resíduo restante foi dissolvido com sonicação, em 1 ml de metanol (grau HPLC). A solução foi retirada numa seringa de 1 ml e filtrada através de uma unidade de filtração de Millex (0,45 u) para dentro de um frasco de Wheaton, e tapada.

Condições de HPLC

Coluna: u Bondapak C-18 (10 μ, Waters Associates)

Fase Móvel: metanol/água (65:35)

Caudal: 1,2 ml/minuto

Deteccão: U.V. a 227 nm AUFS: 0,1

Quantidade iniectada: 10 μΐ

Os resultados destas análises são mostrados na Tabela 1. i

Tabela 1 - Conteúdo de Taxol em folhas verdes de certas

Cultivadas ("Cultivars") Taxus

Variante Cultivada |% ("Cultivars") | 1 1 de Extracções de Etanol |% Média de | Taxol | +S.D.1 1 X media "Henryi" 17,63 0,00272 Ί\ x media "Densiformis" 18,93 0,00342 Ti. X media "Hicksii" 15,43 0,01042 Ί\ x media "Dark Green Spreader" 15,32 0,00962 Ti. X media "Runyan" 17,04 0,00572 Ti. X media "Brownii" 19,55 0,00272 Ti. X media "Wardii" 14,89 0,00522 T. cuspidata "Brevifolia" 14,10+0,36 0,0097+0,0037 C.V.=38% \ L X media "Brownii" 16,07+0,93 0,00465+0,00096 C.V.=20,6% 5 T. cuspidata 14,73+0,46 0,0141+0,00226 C.V.=16% Ti. X media "Densiformis" 13,53+1,36 0,00594+0,00039 C.V,=6,51 T\ X media "Halloran" 14,79+0,18 0,01183+0,00057 C.V,=4,8% Ti. X media "Hatfield" 12,83+0,29 0,0121+0,00042 C.V.=3,5% L X media "Hicksii" 15,67+0,29 0,0152+0,0023 C.V.=15% Ti. X media "Nigra"4 15,13+0,23 0,0291+0,0057 C.V.=19,6%

(jJsíaMS- !·. ba.cc.ata "Repandens" 12,83 + 0,57 0,00178 + 0,00074 C.V.=41,5%

Tabela 1 Conteúdo de Taxol em folhas verdes de certas

Cultivadas {"Cultivars") Taxus ------- , Variante Cultivada |% ("Cultivars") | 1 1 de Extracções de Etanol “1 |% Média de | Taxol j +S.D.1 1 T. X media "Henryi" 17,63 0,00272 T. X ,media "Densiformis" 18,93 0,00342 T. X media "Hicksii" 15,43 0,01042 T. X media "Dark Green Spreader" 15,32 0,00962 T. X media "Runyan" 17,04 0,00572 T. X media "Brownii" 19,55 0,00272 T. X media "Wardii" 14,89 0,00522 T. cusoidata "Brevifolia" 14,10+0,36 0,0097+0,0037 C.V.=38% T. X media "Brownii" 16,07+0,93 0,00465+0,00096 C.V.=20,6% T. cuspidata5 14,73+0,46 0,014110,00226 C.V.=16% T. X media "Densiformis" 13,53+1,36 0,00594+0,00039 C.V.=6,51 T. X media "Halloran" 14,79+0,18 0,01183+0,00057 C.V.=4,8% T. X media "Hatfield" 12,83+0,29 0,0121+0,00042 C.V,=3,5% T. X media "Hicksii" 15,67±0,29 0,0152+0,0023 C.V.=15% T. X media "Nigra"^ 15,13+0,23 0,0291+0,0057 C.V.=19,6% Ιβ(ΐΜΐΜ*· ί

Exemplo 2: Efeito na recuperação de Taxol de folhas descascadas dos caules. antes da secagem das folhas,

Analisaram-se folhas verdes (100 g) des aparas que constituiam amostras representativas a partir de grandes colecções (1,36-2,72 Kg) de certas variantes cultivadas ("cultivara"), relativamente ao seu teor de taxol, usando o método descrito no Exemplo 1. A Tabela 2 mostra a percentagem de taxol extraído das folhas verdes, em comparação com o extraído de folhas secas. 0 teor de taxol calculado consiste na % de taxol esperada no material vegetal seco com base na % do teor de taxol determinada para o material fresco e a % de humidade da matéria vegetal. A percentagem de Taxol (calculada) = % de Taxol fresco /[!-(% de humidade/100)]. A percentagem de humidade é determinada a partir da diferença de peso da matéria vegetal antes e depois da secagem.

Calculou-se depois uma proporção de % do teor de taxol seco descoberto para a % do teor de taxol seco calculado (F/C). De acordo com este cálculo, um número inferior a 1,00 indica uma perda de taxol no processo de secagem (e.g., 0,90 indica uma perda de 10%) e um número superior a 1,00 indica que o método de secagem origina uma quantidade de taxol superior à que é encontrada pela extracção de aparas ! verdes (e.g., 1,20 indica um aumento de 20%). 2(a) Separaram-se aparas verdes das mesmas variantes cultivadas ("cultivars"), em folhas e pequenos troncos. Uma porção (10 g) das folhas de cada variante cultivada ("cultivar") foi extraída e analisada tal como se descreve no Exemplo 1. Os resultados são referidos na Tabela 2(a). Uma outra porção das folhas de cada variante cultivada ("cultivar") foi deixada secar à temperatura ambiente, até não ser observada mais perda de peso. Moeu-se uma amostra das folhas secas num moinho de Wiley e extraíu-se uma porção de 10 g e analisou-se tal como se descreveu no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela 2(a). 2(b) Alternativamente, secaram-se aparas de T. X media "Dark Green Spreader" intactas (í.e., sem separar as folhas dos seus troncos) à temperatura ambiente até não ser observada mais perda de peso. As folhas secas foram depois separadas dos seus caules, moídas num moinho de Wiley e extraíu-se uma porção de 10 g e analisou-se, tal como se descreveu no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela 2(b).

Os dados da Tabela 2(b) foram obtidos por análise de 10 réplicas de uma grande amostra de matéria vegetal. É

reproduzível a retenção de 131% de teor de taxol obtido de acordo com o método em 2(b), em comparação com uma retenção média de 33% de teor de taxol obtido de acordo com o método em 2(a). Surpreendentemente a secagem deo com o médoto de retenção das aparas intactas aumenta a recuperação de taxol, em comparação com as extracções com etanol de folhas secas depois de terem sido separadas dos seus caules. Ocorre um aumento de quase 4 vezes na retenção de taxol secando as aparas intactas, em comparação com a secagem depois de separar as folhas.

1

Exemplo 3; Determinação do teor de taxol de troncos frescos e de troncos secos descascados

Analisou-se a percentagem do teor de taxol de troncos frescos (100 g) de aparas de certas variantes cultivadas ("cultivara") e comparou-se com a percentagem do teor de taxol dos troncos (10 g) que foram secos e moídos, tal como se descreveu no Exemplo 2(a). Os troncos frescos e moídos foram extraídos e analisados tal como se descreveu no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela 3. Determinou-se a % de taxol calculada, conforme descrito no Exemplo 2. Também se determinou a proporção da % do teor de taxol seco descoberta, com a % do teor de taxol seco calculado (F/C), conforme se descreveu no Exemplo 2. - 61 - 61

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Exemplo 4: (a) Determinação do teor de taxol de folhas de aparas não descascadas secas em barracão. - Colocaram-se aparas intactas verdes (troncos + folhas) de Tj_ X media "Densiformis" (Tabela 4(A)) e X media "Dark Green Spreader" (Tabela 4(B) ) em tecido de rede de alumínio (45,72 x 40,64 cm, rede para janelas do tamanho nominal 0,010) ligado a uma armação de madeira. As armações foram colocadas num barracão de secagem em suportes de 30" acima do chão. Deixou-se secar a matéria vegetal no escuro, sem qualquer calor adicional. Colocou-se uma ventoinha para proporcionar movimentação de ar. 0 aparelho de secagem usado é um Bulb Curing Barn 7,5-I-G, modelo estilo "Roanoke" (Gregory Manufacturing Company, Inc., Lewistown, Woodville, NC 27849). A temperatura variava entre 30"C às 8,00 horas, a 40’C às 15,30 horas. A secagem durou 2 dias. Determinou-se que a humidade das folhas antes da secagem era de 64,5% (Ί\_ X media "Densiformis") e 66% (3L. X media "Dark Green Spreader") com base na diferença de peso das folhas, antes e depois da secagem. Imediatamente antes da análise, recuperaram-se as folhas secas (10 g) e descascaram-se dos seus caules, moeram--se usando um moinho de Wiley e extraíram-se por percolação com etanol, acetona ou acetato de etilo. Realizou-se a I h ίίΜΛΜΛ análise tal como se descreveu no Exemplo 1.

0 teor de taxol das folhas secas foi comparado com as fQlhas verdes da mesma variedade, que foram processadas imediatamente depois de se descascarem, misturando-as com o dissolvente de extracção. Os resultados são mostrados na Tabela 4. Determinou-se a % do teor de taxol seco calculado de acordo com o método descrito no Exemplo 2. Calculou-se depois uma proporção da % do teor de taxol seco encontrado para a % do teor de taxol seco calculado (F/C). de acordo com I

Exemplo 4: (a) Determinação do teor de taxol de folhas de aparas não descascadas secas em barracão.

Colocaram-se aparas intactas verdes (troncos + folhas) de X media "Densif ormis" (Tabela 4 (A) ) e T^_ X media "Dark Green Spreader" (Tabela 4(B)) em tecido de rede de alumínio (45,72 x 40,64 cm, rede para janelas do tamanho nominal 0,010) ligado a uma armação de madeira. As armações foram colocadas num barracão de secagem em suportes de 30" acima do chão. Deixou-se secar a matéria vegetal no escuro, sem qualquer calor adicional. Colocou-se uma ventoinha para proporcionar movimentação de ar. O aparelho de secagem usado é um Bulb Curing Barn 7,5-I-G, modelo estilo "Roanoke" (Gregory Manufacturing Company, Inc., Lewistown, Woodville, NC 27849). A temperatura variava entre 30*C às 8,00 horas, a de ar Arvin, ventoinha apenas, sem adicionar água às almofadas de arrefecimento. A temperatura variou entre 15,5'C às 8,00 horas, até 44*C às 15,30 horas. A secagem durou 6 dias. Determinou-se a humidade das folhas antes da secagem como sendo de 62% (T\_ X media "Densiformis") e 66% (Τ\_ X media "Dark Green Spreader") com base na diferença de peso das folhas, antes e depois da secagem. Recuperaram-se as folhas secas e processaram-se tal como no Exemplo 4(a) e analisaram--se tal como se descreveu no Exemplo 1. Os resultados são comparados com as folhas verdes da mesma variante cultivada ("cultivar") e são mostrados na Tabela 4. (c) Determinação do teor de taxol de folhas de aparas não descascadas, secas ao ar livre. em condições de sombra.

Colocaram-se aparas intactas verdes (caules + \ folhas) de L X media "Densiformis" e X media "Dark Green Spreader" em tecido de rede de alumínio (45,72 x 40,64 cm, rede para janelas do tamanho nominal 0,010) ligadas a uma armação de madeira. Colocaram-se as armações sob uma estrutura à sombra, fora de casa, em suportes de 30" acima do solo. Deixou-se secar a matéria vegetal sob uma estrutura construída colocando um tecido escuro sobre uma estrutura de

2" x 6", aproximadamente 2,13 metros acima do solo. 0 tecido escuro reduziu a luz do sol do ambiente para cerca de 80%. Não foi usada qualquer ventoinha. A temperatura variou entre cerca de 22'C às 8,00 horas e uma média de 46’C às 15,00 horas. A secagem durou 10 dias. Determinou-se a humidade das folhas antes da secagem como sendo de 63,3% (T_j_ X media "Densiformis") e 64% (3L·. X media "Dark Green Spreader") com base na diferença de peso das folhas antes e depois da secagem. Recuperaram-se as folhas secas e processaram-se tal como se descreveu no Exemplo 4(a) e analisaram-se tal como se descreveu no Exemplo 1. Os resultados são comparados com as folhas verdes da mesma variante cultivada ("cultivar") e são mostrados na Tabela 4. i (d) Determinação do teor de taxol de folhas de aparas não descascadas. secas dentro de casa, à temperatura ambiente.

Colocaram-se aparas intactas verdes (caules + folhas) de Ti X media "Densiformis" e L X media "Dark Green Spreader" em tecido de rede de alumínio (45,72 x 40,64 cm, rede para janelas do tamanho nominal 0,010) ligado a uma armação de madeira e secaram-se de acordo com o processo descrito no Exemplo 2(b). Determinou-se a humidade das folhas

(χΜΛΜΛ Λ i antes da secagem como sendo de 63,3% (T^ X media "Densifor-mi8") e 65% (T._ X media "Dark Green Spreader") com base na diferença de peso das folhas, antes e depois da secagem. Recuperaram-se as folhas e processaram-se de acordo com o processo descrito no Exemplo 4(a) e analisaram-se de acordo com o processo descrito no Exemplo 1. Os resultados são comparados com as folhas verdes da mesma variante cultivada ("cultivar") e são mostrados na Tabela 4.

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Exemplo 5: Dissolvente de extraecão.

Separaram-se aparas verdes de X media "Hicksii" em folhas e pequenos troncos que depois se deixaram a secar à temperatura ambiente, nas condições descritas no Exemplo 2(a). Para análise, moeu-se uma porção de folhas secas (10 g) e depois extraiu-se por percolação (4 x 100 ml) com um dos vários dissolventes orgânicos, utilizando o processo do Exemplo 1. O teor de humidade das folhas verdes era de 63%. Levou-se a cabo a análise tal como se descreveu no Exemplo 1. Os resultados são referidos na Tabela 5.

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Exemplo 6: Método de Extracção.

Compararam-se três métodos de extracção usando duas réplicas em cada caso. Separaram-se folhas de 3L. X media "Hicksii" das aparas verdes e deixaram-se a secar à temperatura ambiente, nas condições descritas no Exemplo 2(a). Em seguida, moeram-se as folhas secas (10 g) e extraíram-se usando acetona por percolação, em condições de Soxhlet ou agitando-se com sacudimento (embebimento com agitação). A extracção por percolação foi levada a cabo de acordo com o processo descrito no Exemplo 1. A extracção nas condições de Soxhlet foi levada a cabo usando uma porção (100 ml) de dissolvente durante 12 horas, seguida por permutas com dissolvente fresco em intervalos de quatro horas; usou-se um total de 400 ml de dissolvente por cada amostra de 10 g de material vegetal durante um período de extracção de 24 horas. A extracção por agitação com sacudimento (embebimento com agitação) foi levada a cabo usando a mesma escala de permuta de dissolvente, tal como se descreveu nas condições de Soxhlet. Os extractos foram depois processados e analisados tal como se descreveu no Exemplo 1. Os extractos obtidos pelo métodb de extracção por percolação foram combinados e analisados; os extractos obtidos pelos outros dois métodos de extracção foram analisados em cada fase do processo extracção. Os resultados são descritos na Tabela 6.

ΕΑΒΕ1Α β - Avaliação do uso de Erês Métodos de extracção na eficiência de ração de Eaxol das folhas secas de Eaxus Σ Média ''Hicksii·' CD o P tí o> ω OÍ OR 0R *rl •H ca cO o u * *k cá o ca o «H ► H CM 0) o 0) o «d +1 +1 +1 LT\ LO\ 00 CO cá • H ia o VO iα •ri fi H o rH o CM o nd • O o o o o o VD co. fc-J +! O o o o o o φ o co ca ΓΟ co Ό 02 co ta ia co o CM CD H Η r-l |—í ca CM H H ft O o o o o o (d o ·* k *k *k •k Vk P W tiO O o o o o o o tá ^ EH EH ^ ! 'Φ 1 1 c- <T> CO in 1 1 o o CM H Ρ» 1 i o o o o <D 1 1 o o o o P 1 i •k •k •k Vk tn 1 1 o o o o ΓΛ 1 1 CO ca <T\ 1 i o H ca ca ft 1 1 o o o o O <D l 1 o o o o O •P 1 1 *k •k •k Vk ω ca I 1 o o o o H ta o CM 1 1 CO CO ta K o 1 1 H H m •M- <á 02 Pi 1 1 o o o o EH 0) CD 1 1 o o o o Pí P 1 1 Λ *k Vk Vk íjO ca 1 1 o o o o H 1 1 H o La co 'èA ' 1 1 CM ca co CM V—^ Pc 1 1 rri H r-Í H Φ 1 1 o o o o P i 1 •k *> Vk Vk <D ca 1 1 o o o o m •ri H H CM H CM H CM <i| ω 1 Ό O cá ca CO o o o ta O ή CM ca LTV σ\ co ta -P «k Vk Ok Vk Vk Vk CD Pi O r—i i—í H I—i H r—S Ph CD -P o ω O 2CkJ 1 nd 2cá a» o P o> oí P Jcá o o O o Γ-Ι 0) o» cS P Ό eâ o H cá ca tí o U o Λ P (D P -p u M •ri S S VD K1 ω o o ω Ph ca < o

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Exemplo 7; Distribuição do primeiro resíduo entre, água e cloreto de metileno.

Secaram-se aparas verdes de X media "Nigra" num celeiro de cura de tabaco a granel, de acordo com o método descrito no Exemplo 4(a). Triturou-se uma porção das aparas usando um"moinho de Wiley, depois extra^u-se por percolação usando um dissolvente seleccionado de etanol, acetona e acetato de etilo e usando o processo descrito no Exemplo 1.

Separou-se uma outra porção de aparas entre folhas e caules, e moeram-se as duas porções separadamente usando um moinho de Wiley. Cada porção moída foi depois extraída por percolação usando um dissolvente seleccionado de etanol, acetona e acetato de etilo e usando o processo descrito no Exemplo 1. (a) Distribuição do primeiro resíduo do extracto de etanol entre água e cloreto de metileno.

Distribuiu-se um peso conhecido do resíduo do extracto de etanol entre água (1 ml) e cloreto de metileno (2 ml x 5). Preparou-se então a fase de cloreto de metileno e analisou-se por HPLC (Cromatografia em camada fina sob pressão elevada), de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Os resultados são referidos na Tabela 7a. (b) Distribuição do primeiro resíduo do extracto de acetona entre água e cloreto de metileno.

Distribuiu-se um peso conhecido do resíduo do extracto de acetona entre água (1 ml) e cloreto de metileno (2 ml x 5). Preparou-se então a fase de cloreto de metileno e analisou-se por HPLC, de acordo com os método descrito no Exemplo 1. Os resultados são referidos na Tabela 7b. (c) Distribuiu-se do primeiro resíduo do extracto de acetato de etilo entre água e cloreto de metileno . *

Distribuiu-se um peso conhecido do primeiro resíduo do extracto de acetato de etilo entre água (1 ml) e cloreto de metileno (2 ml x 5). Preparou-se então a fase do cloreto de metileno e analisou-se por HPLC, de acordo com o método descrito no Exemplo 1, Os resultados são referidos na Tabela 7c.

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Exemplo 8; Distribuição do primeiro resíduo entre água e acetato de etilo seguido por uma segunda distribuição do dissolvente entre hexano e uma mistura aguosa.

Secaram-se aparas intactas verdes de T_j_ X media "Nigra" num barracão de cura de tabaco a granel, de acordo com o método descrito no Exemplo 4(a). Triturou-se uma porção das aparas usando um moinho de Wiley, depois extraíu-se por percolação usando um dissolvente seleccionado de etanol, acetona e acetato de etilo e usando o processo descrito no Exemplo 1. Separou-se uma outra porção de aparas entre folhas e caules, e trituraram-se as duas porções separadamente, usando um moinho de Wiley. Cada porção triturada foi depois extraída por percolação, usando um dissolvente seleccionado de etanol, acetona e acetato de etilo e usando o processo descrito no Exemplo 1. (a) Distribuição do primeiro resíduo do extracto de etanol entre água e acetato de etilo seguido por uma segunda distribuição do dissolvente, entre hexano e uma mistura aguosa (metanol;água).

Distribui-se um peso conhecido do resíduo do extracto de etanol entre água (1 ml) e acetato de etilo (2 ml x 6) . d 1

Evaporou-se a fase de acetato de etilo e, depois, o segundo resíduo foi então distribuído entre duas partes de hexano e uma parte de metanol:água (9:1). Evaporou-se a fase de metanol: água até à secura, em vácuo. Dissolveu-se o resíduo com sonicação em 1 ml de metanol (grau HPLC) e retirou-se a solução núma seringa de 1 ml e filtrou-se através de uma unidade de filtração de Millex (0,45 u) para dentro de um frascp de Wheaton, e tapou-se. Realizou-se então a análise de HPLC, tal como se descreveu no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela 8a. (b) Distribuição do primeiro resíduo do extracto de acetona entre água e acetato de etilo. seguido pelá segunda distribuição do dissolvente entre hexano e uma mistura aquosa (metanol:água).

Distribuiu-se um peso conhecido do resíduo do extracto de acetona entre água (1 ml) e acetato de etilo (2 ml x 6). Evaporou-se a fase de acetato de etilo e, então, distribuiu-se o segundo resíduo em duas partes de hexano e uma parte de metanol:água (9:1). Evaporou-se a fase de metanol: água até à secura, em vácuo. Dissolveu-se o resíduo com sonicação, em 1 ml de metanol (grau HPLC) e retirou-se a

! Η) solução numa seringa de 1 ml e filtrou-se através de uma unidade de filtração Millex (0,45 v) , para dentro de um frasco de Wheaton, e tapou-se. Realizou-se então a análise de HPLC, tal como se descreveu no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela 8b. (c) Distribuição do primeiro resíduo do extracto de acetato de etilo entre água e acetato de etilo, seguido por uma segunda distribuição do dissolvente entre hexano e uma mistura aguosa (metanol:água).

Distribuiu-se um peso conhecido do resíduo do extracto de acetato de etilo entre água (1 ml) e acetato de etilo (2 ml x 6). Evaporou-se a fase de acetato de etilo e, então, distribui-se o segundo resíduo entre duas partes de hexano e uma parte de metanol:água (9:1). Evaporou-se a fase de metanol:água até à secura, em vácuo. Dissolveu-se o resíduo com sonicação, em 1 ml de metanol (grau HPLC) e retirou-se a solução numa seringa de 1 ml e filtrou-se através de uma unidade de filtragem Millex (0,45 u) para 1 dentro de um frasco de Wheaton e tapou-se. Em seguida realizou-se então a análise HPLC, tal como se descreveu no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na Tabela 8c.

I)iJsísiMA. A comparação das Tabelas 7 e 8 indica que a purificação por distribuição produz rendimentos comparáveis de taxol, quando comparados com o método de purificação mais dispendioso (em materiais e trabalho) que usa a celite. «η f; - - 82' ί. - - lC· ' ) 02 ω-ρ d > Γ—jο 02 02 •Η ti 02 <α> S-: -Ρ Ο Οο &3 0> •Η d ,Ω Η d -Ρ •Η ti d Ο Ρ) ο íoá Ο 03 Ο •Η ‘Pi •Η d d Pt ω ti ο ti ο -Ρ VD a ω ti Η ei φ tiο ?cá Ο ο3 d ω ο ti Ο +3 •Η Φ 0-1 R I 00 ο φ d ω ti Ú Φ SD οί -Ρ d φ ο 14 Φ Ρ) sá d φ -Ρ d φ > Η Ο 02 ca •Η tí â d φ ω a> +3 d φ u φ ρι •Η ti

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Exemplo 9: Eluição da coluna de celite com acetato ,je etilo em vez de cloreto de metileno.

Separaram-se aparas verdes de L X media "Hicksii" em folhas e caules e deixaram-se secar à temperatura ambiente, até não se verificar mais perda de peso. Moeram-se i então as folhas verdes usando um moinho de Wiley e extraíram-se por percolação com acetona. Realizou-se a análise em duplicado usando 10 g de folhas. Tratou-se o extracto de acetona e analisou-se, tal como se descreveu no Exemplo 7(b), com excepção de se ter substituído o acetato de etilo por cloreto de metileno. Os resultados são referidos na Tabela 9.

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Exemplo 10; (a) Desenaorduramento do material vegetal antes da extracção por percolação. usando acetona.

Secou-se uma amostra de folhas de Ί\_ X media "Hicksii" e moeu-se usando o método descrito no Exemplo 9. Desengorduraram-se folhas secas, moidas (10 g) com hexano, por percolação, durante 2 dias, mudando o dissolvente cada 24 horas (2 x 100 ml). Evaporaram-se os extractos de hexano combinados até à secura (200 mg em média de resíduo, que representa 21% do total de substâncias extraíveis com hexano e acetona). Transferiu-se a marca (resíduo restante) quantitativamente para um frasco de Erlenmeyer de 250 ml e extraiu--se com acetona por percolação, mudando o dissolvente cada 24 horas, durante 4 dias (4 x 100 ml). Evaporaram-se os extractos de acetona combinados até ã secura. Distribuiu-se um peso conhecido do resíduo de acetona entre água (1 ml) e cloreto de metileno (2 ml x 5). Evaporou-se a fase de cloreto de i metileno até à secura em vácuo e reconstituiu-se o resíduo em metanol (1 ml). Filtrou-se a solução metanólica através de uma unidade de filtração de Millex, diluiu-se em 1:1 com metanol e usou-se para análise de HPLC, de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Os resultados são mostrados na

Tabela 10. ) (b) Desenqorduramento do material vegetal antes da extraccão por embebimento com agitação (com sacudi-mento). usando acetona.

Desengorduraram-se folhas moídas secas (10 g) tal como referido em (a), com hexano, embebendo com agitação, durante 8 horas, mudando o dissolvente de 4 em 4 horas (100 ml x 2). A média das substâncias extraíveis com hexano era de 194 mg ou 12% do total de substâncias extraíveis com hexano e acetona. Transferiu-se a marca quantitativamente para um frasco de Erlenmeyer de 250 ml e extraiu-se com acetona (4 x 100 ml) mergulhando com agitação durante um período de 24 horas, mudando o dissolvente ao fim de 12, 16, 20 e 24 horas. Os extractos, recolhidos em cada ponto, foram combinados, evaporados até à secura em vácuo e distribuiu-se uma porção conhecida do resíduo resultante entre água (1 ml) e cloreto de metileno (2 ml x 5). Evaporou-se a fase de cloreto de metileno até à secura e reconstitui-se o resíduo em metanol (1 ml). Filtrou-se a solução metanólica através de uma unidade de filtração de Millex, diluiu-se em 1:1 com metanol e usou-se para análise de HPLC. Os resultados são mostrados na

Tabela 10. (c) Desenqorduramento do material vegetal antes da extraccão com extractor de Soxhlet. usando acetona.

Desengorduraram-se folhas moídas secas (10 g), tal como referido em (a), com hexano por extracção em extractor de Soxhlet, durante oito horas, mudando o dissolvente cada quatro horas (100 ml x 2). A média de substâncias extraíveis com hexano foi de 297 mg ou 26% do total de substâncias ex-traxveis com hexano e acetona. Extraiu-se depois a marca no extractor de Soxhlet com acetona (4 x 100 ml), de acordo com o método descrito no Exemplo 6. A extracção, distribuição e análise são tal como se descreve no Exemplo 10(b) e os resultados são mostrados na Tabela 10. /ΑD, * 83,·-'.,?/41 - ν/" ύ

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Exemplo 11; Distribuição do extracto de acetona do material vegetal desengordurado entre água e acetato de etilo

Secou-se uma amostra de folhas de Ί\_ X media "Hicksii" e moeu-se usando o método descrito no Exemplo 9. Desengorduraram-se folhas secas moídas (10 g) com hexano e extraíram-se por percolação, usando acetona, utilizando o método descrito no Exemplo 10(a). Distribuiu-se um peso conhecido do resíduo de acetona entre água (1 ml) e acetato de etilo (2ml x 5). Evaporou-se a fase de acetato de etilo até à secura em vácuo e reconstituiu-se o resíduo em metanol (1 ml). Filtrou-se a solução metanólica, diluiu-se e analisou-se tal como se descreveu no Exemplo 10(a). Os resultados são referidos na Tabela 11. ω ol 1 •Η CQ CD ο 02 Pi cá ω ri 02 d cá !> MJ tá O ο3 H fi c— ^ · ri © O o Cd ο tá • o O ca o 'á* © H 02 H •Y Ο •H Cá O +1 o. 1! P ri +1 tá cá Cá cd • d tá tá -ri kO ο CD o d H • ο d M YD O O cá d «Y ο O tá O fcá -P ο> cá 0) ο -P d cá CD -—s ·- ri O H ©I o <4 cá tá o 00 co k/i ΓΊ ri H Φ ÍT\ vo ω o •ri O EU) m H tá d tá « O O cá ri cá ^¾. o «\ «Y Η cá O ε-ί © O O ω 02 <|a3 Pi ri CD •H <ο c3 â •ri •rij d ri •ri cál -P •ri o d .k*>] r*l o O -P © 3' -P ri O d ri © CO cd ÓjD CD CD •ri d o © fd tá d) O ri M · O M d *Y r» 02 <5 02 © LTi kO CD CD © © o o kO kO Ο CD 03 tá ri d -P H -P d O •ri ri íÕ3 d ω O c» YD ω 1 1 cá © £2 -P o d d o cá ri m H 00 cá o cá cá © cá •ri C- c- ri cá ri lyí PS o ri ri tá tá 5lD •k ri ri tá CQ -P Yá d LT\ cn d -P • CD o o ri s—· O O ri M cá tál tá © -p d cá H tá o CD d «0 cá ω s o o d ril ril ol Φ d CD © 02 <D ω a o © -—* (D o d cá •ri o -P o fciQ O tá- d íeá o d d o <aj s_/ U3 I—I CJi O CD ri cá CT\ CTi ω •r! 02 m CD o ri © cá « d ri ω tá -P 4a d ri O o tá Pi 02 o •H cá •P ri o d /-N •ri -P Cá © O 0) 01 CD ri d o ril 1 -P tá •ri ri cá ri © ri ri kO IT\ tá d rQ Pi O cá $0 02 *CJ& © σ\ CJi Ώ H a © ri a H tá 1 Φ Φ d o cá tá h-* H-I :¾) ri H H CD © tá •ri tá rri H CM pq \á t <lj ri tá - <4

Exemplo 12: Determinação dos níveis de taxano na T. X media "Nictra" usando um tratamento de acabamento em fase sólida.

Separaram-se dos seus caules folhas verdes de T_j_ X media "Nigra" (Rhode Island Nurseries, Newport, Rhode Island) e levaram-se a cabo os processos seguintes, usando três réplicas. Colocaram-se as folhas verdes separadas (10 gms) num misturador de Waring juntamente com 100 ml de etanol a 95%, para macerar as folhas. Moeram-se as folhas durante 2 minutos.

As folhas moídas e o etanol foram quantitativamente transferidos para um recipiente de Erlenmeyer de 250 ml e deixaram-se embeber as folhas durante 24 horas. Filtrou-se o etanol com enxaguamento (25 ml de etanol) e colocaram-se novamente as folhas moídas no frasco de Erlenmeyer, ao qual se adicionou mais um volume de 100 ml de etanol a 95%. Repetiu-se este processo três vezes mais, até se obter um volume de 500 ml de extracto de etanol.

Evaporou-se o extracto de etanol até à secura, em vácuo, a uma temperatura não superior a 40’C, para deixar um resíduo ("primeiro resíduo"). O peso deste resíduo era de 1,47 g í 0,059 (C.V. = 4%).

Transferiram-se cerca de 100 mg do primeiro resíduo para um tubo de tampa de rosca de 4 ml. Nivelou-se a tampa do frasco com folha de alumínio, para evitar o contacto da tampa do frasco com o resíduo, durante as fases de divisão subsquentes.

Distribuiu-se o primeiro resíduo entre cerca de 1 ml de água e cerca de cinco volumes de 2 ml de cloreto de metileno. Transferiu-se então o cloreto de metileno para um frasco de Erlenmeyer de 25 ml e evaporou-se o dissolvente em vácuo, para formar um segundo resíduo. 0 resíduo da camada de cloreto de metileno foi então dissolvido em cerca de 5 ml de acetato de etilo e cerca de 2 ml de metanol. Para ajudar na dissolução do resíduo, o frasco foi preparado por sonicação. Quando o resíduo estava completamente dissolvido, adicionaram-se cerca de 650 mg de celite, 0 resíduo aderiu à celite, deixando evaporar o dissolvente sob pressão reduzida, para produzir um material de celite revestido.

Transferiu-se a celite revestida para um disco de petri, depois triturou-se até se obter um pó de escorregamento livre. Encheu-se depois uma pipeta de Pasteur com o pó triturado.

Lavou-se o hexano através da coluna, até o eluente parecer incolor (7 ml). Usou-se então cloreto de metileno (5-6 ml) para eluir os taxanos. Evaporou-se então em vácuo o cloreto de metileno, para produzir a mistura de taxano bruta. i 0 peso desta mistura era de 39,1 mg í 7,43 (C.V. = 19%). ’ Dissolveram-se os taxanos brutos em 1 ml de metanol de grau HPLC. Usou-se a sonicação para ajudar na dissolução dos taxanos brutos. Filtrou-se a solução através de uma unidade de filtração de Millex (0,45u) e recolheu-se num frasco.

Determinou-se a identidade e a quantidade de taxanos específicos na solução, usando análise de HPLC de uma amostra de 10 g. Usou-se uma coluna de u de Bondapak C-18 (lOy), obtida de Waters Associates, para a análise de HPLC.

Usou-se como fase móvel uma mistura de metanol (65%) e água (35%) num caudal de 1,2 ml por minuto. Detecta-ram-se os taxanos com um detector de U.V. posto num comprimento de onda de 227 nm.

Os tempos de retenção e a percentagem de composição da solução são mostrados abaixo na Tabela 12.

Tabela 12. Valores de Rt e Percentagem de Composição de Taxanos Específicos Isolados da Ί\_ X media "Nigra"

Taxano Valor Rt (min.) % de Composição Taxol 11,5 0,291 cefalomanina 10,5 - bacatina III 4,7 - 10-desacetiltaxol - - 10-desacetilcefalomanina - - 10-desacetil-bacatina III 4,2 -

Exemplo 13. Percentagem de Taxol obtido das folhas Secas em Barracão extraído de acordo com o método do Exemplo 12.

Colocaram-se aparas intactas verdes de folhas de T. X media "Nigra", ainda ligadas aos seus caules, num revestimento de rede de alumínio (45,72 cm por 40,64 cm, rede para janelas do tamanho nominal 0,10) ligado a uma armação de i madeira dentro de um barracão de secagem do estilo "Roanoak", Bulk Curing Barn modelo 7,5-1-G obtido da Gregory Manufactur-ing Company, Inc., de Woodville, North Carolina. Colocaram-se as armações em suportes de cerca de 76,2 cm acima do nível do solo. Secou-se a matéria vegetal num barracão ventilado às escuras.

Durante a fase de secagem, a temperatura variou k ÍCíMaM* í entre cerca de 30’C às 8 horas, a cerca de 40‘C às 15,30 horas. Continuou-se a secagem durante dois dias. Analisaram--se as aparas relativamente ao teor de taxanos, seguindo o processo descrito no Exemplo 12. Detectaram-se os taxanos seguintes: taxol; cefalomanina; bacatina III; 10-desacetil taxol; 10*-desacetilcefalomanina; e 10-desacetil-bacatina III. A percentagem de taxol presente no composição era de 0,034.

Exemplo 14: Isolamento do taxol das folhas de L X media 11 Dark Green Spreader", usando um tratamento de acabamento em fase sólida.

Separaram-se aparas verdes de L X media "Dark Green Spreader" em folhas e pequenos caules e, depois, deixaram-se a secar à temperatura ambiente, de acordo com o método descrito no Exemplo 2(a). Moeram-se as folhas secas (500 g, que revelavam um teor de taxol de 0,0074%, conforme determinado pelo método descrito no Exemplo 1) num Moinho de Wiley para um tamanho de malhas de cerca de 60 e extrairam-se por percolação com 95% de etanol, mudando o dissolvente cada 24 horas (1,5 L x 5).Evaporaram-se os extractos de etanol combinados num evaporador rotativo de Buchi, sob pressão reduzida, a uma temperatura não superior a cerca de 40‘C. ! f (Χ&4ΛΜΑ i

Distribuiu-se o resíduo de etanol (112 g, resíduo A) entre água (cerca de 500 ml) e os volumes seguintes de cloreto de metileno: um volume de cerca de 1 litro e três volumes de cerca de 500 ml cada. Separaram-se as camadas de cloreto de metileno, combinaram-se e secaram-se sobre sulfato de sódio anidro. Removeu-se o agente de secagem do cloreto de metileno usando filtração em vácuo. Evaporou-se o dissolvente de cloreto de metileno usando um evaporador rotativo de Buchi, sob pressão reduzida, para produzir um segundo resíduo (27,8 g, resíduo B).

Dissolveu-se o segundo resíduo (27,8 g) numa mistura de acetato de etilo/metanol (3:1, 600 ml) e dividiu-se a solução resultante em duas porções de 300 ml. Revestiu-se uniformemente cada porção com cerca de 200 g de celite 545 (Fisher), tal como se descreve no Exemplo 1. Encheu-se a celite revestida com o segundo resíduo, Resíduo B, para dentro de duas colunas (5 x 32 cm cada) e lavou-se cada uma sucessivamente, sob pressão, com hexano (2,2 L) seguido por cloreto de metileno (1,2 L) . A evaporação das lavagens com o hexano e o cloreto de metileno em vácuo originou resíduos combinados pesando 19,25 g (Resíduo C) e 6,35 g (Resíduo D), respectivamente. Π L^a 0 resíduo D, que compreendia a mistura de taxanos bruta (6,35 g), foi dissolvido em 250 ml de acetato de etilo e adsorvido em celite (50 g), de acordo com o método descrito no Exemplo 1. Aplicou-se o material resultante numa coluna flash de gel de silica 60 (160 g, 5 x 16 cm, 230-400 malhas, E. Merck," 1 coluna volume = 500 ml) cheia de hexano/acetona (75:25). A polaridade da fase móvel foi gradualmente aumentada para hexano/acetona (55:45), aumentando a percentagem de acetona em incrementos de 5%. Recolheram-se as fracções, sob pressão, num caudal de 100 ml/5 minutos. Eluiu--se a coluna com um volume de coluna de hexano/acetona (75:25) recolhida como uma fracção de 500 ml, seguido por dois volumes de coluna de hexano/acetona (70:30) recolhidos como 4 fracções de 250 ml cada, dois volumes de coluna de hexano/acetona (65:35) como 4 fracções de 250 ml cada, um volume de coluna de hexano/acetona (60:40) como 2 fracções de 250 ml cada, um volume de coluna de hexano:acetona (55:45) como 10 fracções de 50 ml cada. As fracções recolhidas foram examinadas por cromatografia em camada fina em G UV254 pré--revestido com gel de silica (Machinery Nagel, Duren). As fracções eluidas com hexano/acetona (60:40, 500 ml) e hexano/acetona (55:45, 150 ml) foram combinadas e evaporadas (J (χΑλα,ΜΛ \ até à secura em vácuo (Fracção E, 0,427 g) , Nesta fracção, foram identificados 8 componentes por cromotografia em camada fina usando metanol a 5% em clorofórmio, como sistema de desenvolvimento e p-anisaldeído/ácido sulfúrico como agente de visualisação. A mistura de taxol-cefalomanina apareceu sob a forma de uma mancha cinzento-azulada, com um valor Rf de 0,62, A fracção E foi depois fraccionada numa coluna flash de gel de silica 60. 0 material (427 mg) foi dissolvido em 1% de metanol/cloreto de metileno (2 ml) e aplicado numa coluna de gel de silica 60 (55 g, 2 x 40 cm, 230-400 malhas, E. Merck, 1 volume de coluna = 120 ml), embalada em 1% de metanol/cloreto de metileno. Eluiu-se a coluna, a baixa pressão, para proporcionar um caudal de 8 ml/min., sucessivamente com 1% de metanol/cloreto de metileno (2 volumes de coluna na forma de 20 fracções de 12 ml cada), 1,5% de metanol/cloreto de metileno (1 volume de coluna na forma de 10 fracções de 12 ml cada), 2% de metanol/cloreto de metileno (1 volume de coluna na forma de 10 fracções de 12 ml cada) e 2,5% de metanol/cloreto de metileno (3 volumes de coluna na forma de 74 fracções de 5 ml cada). Controlaram-se as fracções por cromatografia em camada fina usando os mesmos 100

sistemas reagentes de desenvolvimento e vifli,ai descritos acima. A mistura de taxol-cefalomanina foi identificada nas fracções 78-86, eluidas com 2 5% de metanol/cloreto de metileno. Estas foram combinadas e evaporadas até à secura em vácuo, para dar um resíduo (40,35 mg, Fracção F) . Esta fracção, quando examinada por HPLC, indicou a presença de taxol juntamente com cefalomanina.

Separou-se o taxol da cefalomanina dissolvendo a Fracção F (40,35 mg) em 1 ml de uma mistura de dissolvente de 20% de acetato de etilo em cloreto de metileno e aplicando a fracção F solubilizada numa coluna flash de gel de silica 60 (10 g, 1 x 32 cm, 230-400 malhas E. Merck, 1 volume de coluna = 21 ml) cheia da na mistura de dissolvente de 20% de acetato de etilo/cloreto de metileno. Eluiu-se a coluna, a baixa pressão, para proporcionar um caudal de 8 ml/min., sucessivamente com 20% de acetato de etilo/cloreto de metileno (2 volumes de coluna na forma de 4 fracções de 11 ml cada), 25% de acetato de etilo/cloreto de metileno (1 volume de coluna na forma de 2 fracções de 10 ml cada), 30% de acetato de etilo/cloreto de metileno (1 volume de coluna na forma de 5 fracções de 4 ml cada), 35% de acetato de etilo/cloreto de metileno (2 volumes de coluna na forma de 9 (jJsVLMS* fracções de 4,5 ml cada), 40% de acetato de etilo/cloreto de metileno (1 volume de coluna na forma de 7 fracções de 3 ml cada) e 45% de acetato de etilo/cloreto de metileno (2 volumes de coluna na forma de 20 fracções de 2 ml cada). As fracções foram controladas por cromatografia em camada fina em G UV254 de gel de silica, usando acetato de etilo/cloreto de metileno (1:1) como dissolvente de desenvolvimento e p-anisaldeído/ácido sulfúrico como agente de visualização. Obteve-se taxol (26 mg) numa forma pura, conforme determinado por análise de HPLC, nas fracções 35-50 eluidas com 45% acetato de etilo em cloreto de metileno.

Exemplo 15: Isolamento do taxol das folhas de T. X media "Nicrra11 usando uma operação de distribuição com tratamento de acabamento.

Secaram-se em celeiro aparas intactas de L X media "Nigra", conforme se descreveu no Exemplo 4(a). Moeram-se as folhas obtidas das aparas intactas secas num celeiro (500 g, revelando um teor de taxol de 0,043% de peso seco, conforme determinado pelo método do Exemplo 1) num Moinho de Wiley para um tamanho de malhas de cerca de 60 e trataram-se por per'colação com 95% de etanol (8 L). Evaporaram-se os extrac-

(jJslA.MJ· tos de etanol combinados até à secura, num evaporador rotativo de Buchi, sob pressão reduzida, a uma temperatura não superior a 40*C.

Distribuiu-se o resíduo de etanol (134,4 g, primeiro resíduo, resíduo A) entre água (cerca de 600 ml) e os volumes seguintes de acetato de etilo: dois volumes de cerca de 1,2 L e três volumes de cerca de 600 ml cada. Separaram-se as camadas de acetato de etilo, combinaram-se e secaram-se sobre sulfato de sódio anidro. Removeu-se o agente de secagem do acetato de etilo usando filtração em vácuo. Evaporou-se o dissolvente de acetato de etilo usando um evaporador rotativo de Buchi, sob pressão reduzida, para produzir um segundo resíduo (44 g, Resíduo B). Dividiu-se o resíduo B entre uma mistura bifásica de cerca de 1 parte de água, 9 partes de metanol (500 ml) e dois volumes de hexano (1000 ml). Subsequentemente, cada fase foi lavada com o dissolvente oposto (100 ml x 5) e as lavagens combinadas com as suas fases respectivas. Evaporaram-se as camadas de hexano combinadas, até à secura, para proporcionarem um resíduo (17,7 g, resíduo C) e evaporaram-se as camadas combinadas de água/metanol, em vácuo. para produzirem um resíduo de uma mistura de taxanos bruta (31,1 g, resíduo D).

Lavou-se o resíduo D (31,1 g) com sonicação usando cloreto de metileno (300 ml x 4). Combinaram-se as lavagens de cloreto de metileno e evaporaram-se em vácuo. para originar uma porção solúvel de cloreto de metileno do Resíduo D (17,3 g, Resíduo E, revelando um teor de taxol de 167 mg, conforme determinado pelo método do Exemplo (1)). 0 peso da porção insolúvel de cloreto de metileno do Resíduo D foi de 13,8 g e revelava um teor de taxol de 20 mg, conforme determinado pelo método do Exemplo 1. 0 resíduo E (17,3 g) foi dissolvido em 250 ml de acetato de etilo e advorvido para celite (30 g). Aplicou-se o material resultante sobre uma coluna flash de gel de silica 60 (315 g, 5 x 32 cm, 230-400 malhas, E. Merck, 1 volume de coluna = 600 ml) cheia de hexano/acetona (70:30). A polaridade da fase móvel foi gradualmente aumentada para hexano/acetona (45:55) aumentando o teor de acetona em incrementos de 5% e depois lavou-se a coluna com acetona a 100%. Recolheram-se as fracções, sob pressão, a uma taxa de 100 ml/5 min.. Eluiu-se a coluna com dois volumes de coluna de hexano/acetona (70:30), recolhido na forma de oito fracções: 300 ml, 100 ml, 125 ml, 200 ml, 160 ml, 190 ml e 210 ml, seguido por um volume de coluna de hexano/acetona (65:35) 104

recolhido na forma de: 175 ml e 300 ml, um volume de coluna de hexano: acetona (60:40) na forma de uma fracção de 500 ml fracção, um volume de coluna de hexano/acetona (50:50) na forma de 7 fracções de 100 ml cada, um volume de coluna de i hexano/acetona (45:55) na forma de 6 fracções: 100 ml cada e 3 volumes de coluna de acetona a 100% na forma de 4 fracções: 450 ml cada. Examinaram-se as fracções recolhidas por croma-tografia em camada fina em G UV254 de gel de silica pré--revestida (Machery Nagel, Duren) usando 5% de metanol em clorofórmio como um sistema de desenvolvimento e j>-anisaldeído/ácido sulfúrico como reagente de visualização.

As fracções eluidas com hexano/acetona (55:45, 100 ml) e hexano/acetona (50:50, 450 ml) foram combinadas e evaporadas até à secura, em vácuo (Fracção F, 1,61 g).

Nesta fracção, foram identificados 8 componentes usando metanol a 5% em clorofórmio, como sistema de desenvolvimento e £-anisaldeído/ácido sulfúrico como reagente de visualização. A mistura de taxol-cefalomanina apareceu sob a forma de uma mancha cinzento-azulada, com um valor Rf de 0,62.

1.05

Apesar de termos atrás descrito várias formas de realização da presente invenção, é evidente que as construções básicas podem ser alteradas para proporcionar outras formas de realização que utilizem os métodos da presente invenção. Por isso, deverá ser notado que o âmbito da presente invenção é definido pelas reivindicações anexas, mais do que pelas formas de realização específicas que foram apresentadas anteriormente sob a forma de exemplo.

Claims (1)

106

REIVINDICAÇÕES: la. Processo para a obtenção de taxanos a partir de plantas por tratamento com dissolventes, caracterizado pelo facto de se arranjar uma fonte renovável de matéria vegetal de uma ou mais variantes cultivadas ("Cultivar") de plantas ornamentais do género TAXUS em que a referida matéria vegetal se encontra sob a forma de aparas intactas e em que uma parte substancial da folhagem se encontra ligada aos ramos e se tratar a referida matéria vegetal com um ou mais dissolventes para se obter um produto rico em Taxano. 2a. Processo de acordo dom a reivindicação 1, caracterizadoi pelo facto de a fonte renovável de matéria vegetal ser uma variante cultivada ("cultivar") do género Taxus escolhida do grupo que consiste em T. X media "Henryi", T. X media "Densiformis", T. X media "Hicksii", T. media "Dark Green Spreader", T. X media "Runyan", T. X media "Brownii", T. X media "Wardii", T. X media "Halloran", T. X media "Hatfield", T. X media "Nigra", T. X media "Tauntonia", T. X media "Fairview", T. cuspidata "Brevifolia", T. cuspidata e T. cuspidata "Spreader". 107

3a. Processo de acordo dom a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a fonte renovável de matéria vegetal ser uma variante cultivada ("cultivar") do género Taxus escolhida do grupo que consiste em T. X media "Densiformis", T. X media "Hicksii", T. X media "Dark Green Spreader", T. X media "Runyan", T. X media "Brownii", T. X media "Wardii", T. X media "Halloran", T. X media "Hatfield", T. X media "Nigra", T. X media "Tauntonii", T. cuspidata "Brevifolia", e T. cuspidata. 4a. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo facto de a fonte renovável de matéria vegetal ser uma variante cultivada ("cultivar") do género Taxus escolhida do grupo que consiste em T. cuspidata, T. X media "Halloran", T. X media "Tatfield", T. X media "Tauntonii", T. X "Nigra", T. X media "Dark Green Spreader" e τ. X media "Hicksii. ; 5a. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de o material vegetal ser submetido a uma operação de secagem antes do tratamento com dissolvente. 108 6a. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo facto de a operação de secagem não se realizar sob a acção directa da luz do sol não obstruída. 7a. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a matéria vegetal ser moída antes de ser submetida ao tratamento com dissolvente. 8a. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de a' matéria vegetal que é submetida ao tratamento com dissolvente conservar uma parte substancial dos seus constituintes voláteis originais. 9a. Composição rica em taxanos, caracterizada pelo facto de ser preparada arranjando uma fonte renovável de matéria vegetal de uma ou mais variantes cultivadas ("cultivares") de plantas ornamentais do género Taxus;em que a referida matéria vegetal se encontra sob a forma de aparas intactas e em que uma quantidade substanciai de folhagem está ligada aos ramos e tratando a matéria vegetal com um ou mais dissolventes para se obter o referido produto ricos em toxanos. 10a. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo facto de a fonte renovável de matéria

luUU^\S- 109 vegetal ser uma variante cultivada ("cultivar") de uma variedade de Taxus escolhida do grupo que consiste em T. X media "Henryi", T. X media "Densiíormis", T. X media "Hicksii", T. media ”Dark Green Spreader", T. X media "Runyan", T. X media "Brownii”, τ. χ media "Wardii", T. X media "Halloran”, T. X media "Hatfield", τ. X media "Nigra", Τ. X media "Tauntonia", Τ. X media "Fairview", T. cuspidata "Brevifolia", T. cuspidata e T. cuspidata "Spreader". 11a. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo facto de a fonte renovável de matéria vegetal ser uma variante cultivada ("cultivar") do género Taxus escolhida do grupo que consiste em Τ. X media "Densiformis", Τ. X media "Hicksii", Τ. X media "Dark Green Spreader", Τ·. X media "Runyan", Τ. X media "Brownii", Τ. X media "Wardii", Τ. X media "Halloran", T. X media "Hatfield", Τ. X media "Nigra", Τ. X media "Tauntonii", T. cuspidata "Brevifolia", e T. cuspidata. 12a. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo facto de a fonte renovável de matéria vegetal ser uma variante cultivada ("cultivar") do género Taxus escolhida do grupo que consiste em T. cuspidata, T. X media "Halloran", Τ. X media "Tatfield", Τ. X media

(jJSAM/* 110 "Tauntonii", T. X media "Nigra", T. X "Dark Green Spreader" e T. X media "Hicksii. 13a. Composição 'de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo facto de a matéria vegetal ser moída antes do tratamento com dissolvente. 14a. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo facto de a' matéria vegetal que é submetida a tratamento com o dissolvente conservar uma parte substancial do seu teor original de componentes voláteis. 15a. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo facto de a matéria vegetal ser submetida a uma operação de secagem antes do tratamento com dissolvente. 16a. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracterizada pelo facto de a operação de secagem não se realizar sob a acção directa da luz solar não obstruída. 17a Processo para a preparação de um material vegetal que pode ser utilizado como uma fonte para taxanos,

\Λ 111 caracterizado pelo facto de se arranjar aparas intactas, em que uma quantidade substancial de folhagem se encontra ligada aos ramos da matéria vegetal que contém taxanos, se secar as aparas intactas para diminuir o seu teor de matérias voláteis e se obter aparas substancialmente secas e se recuperar as mencionadas aparas substancialmente secas· 18a. Processo para a preparação de um material vegetal, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de a operação de secagem se efectuar a uma temperatura inferior a cerca de 70°C. 19a. Processo para a preparação de um material vegetal, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de a operação de secagem se realizar a uma temperatura compreendida entre cerca de 20°C e cerca de 65°C. 20a. Processo para a preparação de um material vegetal, de acordo com a .reivindicação 17, caracterizado pelo facto de a operação de secagem não se realizar sob a acção da luz do sol directa não obstruída. 21a Processo para a preparação de um material vegetal, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo facto de, durante a operação de secagem, se evitar que entre

ΟμλΜ/' 112 cerca de 40% e cerca de 80% da luz do sol visivel atinja o material vegetal. 22a. Processo para a preparação de um material vegetal, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de, durante a operação de secagem, se obter pelo menos 25% de diminuição do peso da matéria vegetal. 23a. Processo para a preparação de um material vegetal, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo facto de, durante a operação de secagem, se secar a matéria orgânica até uma perda de peso compreendida entre cerca de 40% e cerca de 70% da matéria vegetal. 24a. Processo para a preparação de um material vegetal, de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo facto de se escolher a matéria vegetal de uma ou mais variantes cultivadas ("cultivares") de plantas ornamentais do género Taxus. 25a. Processo para a preparação de uma matéria vegetal de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo facto de se escolher a matéria vegetal de uma ou mais espécies de Taxus escolhidos do grupo que consiste em T. X media "Henryi", T. X media "Densiformis", T. X media "Hicksii", 113 T. media "Dark Green Spreader", T. X media "Runyan", T. X media "Brownii", T. X media "Wardii", T. X media "Halloran", τ. X media "Hatfield", T. X media "Nigra", T. X media "Tauntonii", Τ. X media "Fairview", T. cuspidata "Brevifolia", T. cuspidata e T. cuspidata "Spreader". 26a. Processo para a preparação de um material vegetal, de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo facto de matéria vegetal ser uma ou mais espécies de Taxus escolhidas do grupo que consiste em T. cuspidata, Τ. X media "Halloran", Τ. X media "Hatfield", Τ, X media "Nigra", Τ. X media "Tauntonii", Τ. X media Dark Green Spreader" e Τ. X media "Hicksii". 27a. Processo para a preparação de um material vegetal, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo facto de se submeter a matéria vegetal a uma operação de secagem a uma temperatura inferior a cerca de 70^C e a operação de secagem não se efectuar sob a acção directa da luz do sol não obstruída. 28a. Matéria vegetal que pode ser usada como uma fonte para taxanos, caracterizada pelo facto de ser preparada de acordo com um processo que compreende proporcionar aparas intactas em que se liga uma quantidade substancial de 114

folhagem aos ramos de matéria vegetal contendo taxanos, secar as aparas intactas para reduzir os componentes voláteis e produzir aparas substancialmente secas e recuperar as citadas aparas substancialmente secas. 29a. Matéria vegetal de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo facto de se realizar a operação de secagem a uma temperatura inferior a cerca de 70°C. 30a. Matéria vegetal de acordo' com a reivindicação 29, caracterizada pelo facto de se realizar a operação de secagem a uma temperatura compreendida entre cerca de 20°C e cerca de 65°C. 31a. Matéria vegetal de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo facto de a operação de secagem não se efectuar sob a acção da luz do sol directa não obstruída. 32a. Material vegetal, de acordo com a reivindicação 31, caracterizada. pelo facto de se evitar que entre cerca de 40% e cerca de 80% de luz do sol atinja a matéria vegetal durante a operação de secagem. 33a. Material vegetal, de acordo com a reivindicação 28', caracterizada pelo facto de se obter pelo menos uma diminuição de 25% do peso da matéria vegetal durante a operáçãõ de secagem. - .............'.............. ...... 34a. Matéria vegetal, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo facto de se secar até atingir entre cerca de 40% e cerca de 70% de perda de peso de matéria vegetal durante a operação de secagem. 35a. Matéria vegetal, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo facto de ser proveniente de uma ou mais espécies de Taxus ornamentais cultivadas. 36a. Matéria vegetal, de acordo com a reivindicação 28, caracterizada pelo facto de ser escolhida de uma ou mais espécies de Taxus escolhidas do grupo que consiste em T. X media "Henryi", T. X media "Densiformis", T. X media "Hicksii", T. media "Dark Green Spreader", T. X media "Runyan", T. X media "Brownii", T. X media "Wardii", T. X media "Halloran", ΐ. X media "Hatfield", T. X media "Nigra", T. X media "Tauntonii", T. X media "Fairview", T. cuspidata "Brevifolia", T. cuspidata e T. cuspidata "Spreader". 37a. Matéria vegetal de acordo com a reivindicação 36', caracterizada pelo facto de a matéria vegetal ser 116

escolhida do grupo que consiste em T. cuspidata, T. X media "Halloran", T. X media "Hatfield", T. X media "Nigra" τ. X media "Tauntonii", T. X "Dark Green Spreader" e T. X media "Hicksii". 38a. Matéria vegetal de acordo com a reivindicação 37, caracterizada pelo facto de se submeter a uma operação de secagem a uma temperatura inferior a cerca de 70°C e a operação de secagem não se efectuar sob a acção directa da luz do sol não obstruída. 39a. Processo para a obtenção de uma mistura bruta de taxanos a partir de matéria vegetal que contém taxanos, caracterizado pelo facto de compreender um tratamento inicial com dissolvente compreendendo as operações que consistem em A. extrair-se os taxanos da matéria vegetal fazendo contactar esta com um dissolvente orgâpico e obter-se um primeiro resíduo rico em taxanos substancialmente isento de dissolventes; B. distribuir-se o primeiro resíduo entre um dissolvente orgânico capaz de dissolver os taxanos e um dissolvente aquoso que não dissolve quantidades significativas de taxanos para se obter uma fase orgânica e uma fase aquosa'; C. separar-se a fase orgânica da fase. aquosa e recuperar-se· a fase orgânica substancialmente isenta da fase aquosa; 117 D. formar-se um segundo resíduo a partir da segunda fase orgânica; e submeter-se o referido segundo resíduo a um tratamento de acabamento escolhido ou do conjunto de operações que consiste em E. dissolver-se o segundo resíduo num dissolvente que permite a ligação reversível dos taxanos a ura suporte sólido, introduzir-se um suporte sólido no dissolvente que compreende o segundo residuo dissolvido e deixar-se que os taxanos do segundo resíduo se liguem ao mencionado suporte sólido, separar-se o citado suporte sólido do dissolvente, fazer-se contactar sequencialmente o suporte sólido contendo os taxanos com uma série de dissolventes que têm diferentes propriedades de eluição dos taxanos e eluir-se uma fracção rica em taxanos do suporte sólido sob a forma de mistura de taxanos bruta; ou τ F. distribuir-se o segundo residuo entre uma mistura aquosa e um dissolvente orgânico não polar não miscível em que a mistura aquosa compreende uma única fase de água e um dissolvente orgânico miscível com água e em que este dissolvente orgânico polar se encontra presente na referida mistura numa quantidade suficiente para que os taxanos presentes no segundo resíduo entrem para a mistura aquosa e recuperar-se a mistura de taxanos bruta a partir da segunda mistura aquosa. 40a. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo facto de se repetir uma ou mais vezes qualquer das fases operacionais A, B, C, D, EouF. 41a. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo facto de, na operação A, se fazer contactar a matéria vegetal com' um dissolvente orgânico escolhido do grupo que consiste em etanol, acetona, acetato de etilo, cloreto de metileno, clorofórmio, tetracloreto de carbono, metil-etil-cetona, metil-isobutil-cetona, éter metil-tércio butílico, metanol ou as suas misturas. 42a. Processo de acordo com a reivindicação 41, caracterizado pelo facto de, na operação A, se fazer contactar a matéria vegetal com um dissolvente orgânico escolhido do. grupo que consiste em acetona, etanol e acetato de etilo. 43a. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo facto de, na operação A, se fazer contactar a matéria vegetal com'etanol. 119 r». 44a. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo facto de, na operação A, se promover o contacto da matéria vegetal com o dissolvente por um processo escolhido do grupo que consiste na embebição, percolação, extracção em extractor de Soxhlet, agitação ou uma combinação destes processos. 45a. Processo de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo facto de, na operação A, se promover o contacto da matéria vegetal com o dissolvente orgânico por agitação com sacudimento. 46a. Processo de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo facto de, na operação A, se promover o contacto da matéria vegetal com o dissolvente orgânico por embebição e agitação da matéria vegetal no dissolvente orgânico. 47a. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo facto de, na operação A, antes de se fazer contactar a matéria orgânica com o dissolvente orgânico, se desengordurar a ' matéria orgânica com um 120

dissolvente escolhido do grupo que consiste em hexano, hexanos, pentano, éter de petróleo, iso-octano ou as suas misturas. 48a. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo facto de se escolher o dissolvente orgânico usado na operação B no grupo que consiste em cloreto de metileno e acetato de etilo. 49a. Processo de acordo com a reivindicação 48, caracterizado pelo facto de o dissolvente orgânico usado na operação B ser acetato de etilo. 50a. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo facto de o dissolvente aquoso usado na operação B ser água. 51a. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo facto de se tratar o dissolvente orgânico utilizado na operação C ser tratado com um agente desidratante .ou por um processo de desidratação a seguir à separação do dissolvente orgânico do dissolvente aquoso. 52a. Processo de acordo com a reivindicação 5Γ, caracterizado pelo facto de ò agente desidratante ser 121 LJu^ - 1 escolhido do grupo que consiste em sulfato de magnésio anidro, sulfato de sódio anidro, peneiros moleculares 4A, cloreto de cálcio ou as suas misturas e o processo de desidratação compreender o arrefecimento do dissolvente orgânico até uma temperatura igual ou menor do que aquela a qual a água congela e a separação do dissolvente orgânico líquido da água congelada. 53a. Processo de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo facto de o agente desidratante ser sulfato de sódio anidro. 54a. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo facto de a matéria vegetal ser escolhida de uma ou mais variantes cultivadas ("cultivares”) de espécies Taxus ornamentais. 55a. Processo de acordo com a reivindicação 54, caracterizado. pelo facto de a matéria vegetal ser obtida a partir duma variante cultivada ("Cultivar") do género Taxus escolhida do grupo que consiste em T. X media "Henryi", T. X media "Densiformis", T. X media "Hicksii", T. media "Dark Green Spreader", T. X media "Runyan", T. X media "Brownii", T. X media "Wardii", T. X media 122

"Halloran", T. X media "Hatfield", T. X media "Nigra", T. X media "Tauntonii", T. X media “Fairview", T. cuspidata "Brevifolia", T. cuspidata e T. cuspidata "Spreader". 56a. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo facto de a matéria vegetal a ser extraída ser submetida a uma operação de secagem antes de se efectuar a extracção. 57a. Processo de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo facto de a matéria vegetal submetida à operação de secagem ser fornecida sob a forma de aparas intactas em que uma quantidade substancial da folhagem está ligada aos ramos·. 58a. Processo de acordo com a reivindicação 57, caracterizado pelo facto de a operação de secagem se realizar a uma temperatura inferior a cerca de 70°C. 59a. Processo de acordo com a reivindicação 58, caracterizado pelo facto de a operação de secagem se efectuar a uma temperatura compreendida entre cerca de 20°C e cerca de65°C. 123 123

60a. Processo de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo facto de a operação de secagem não se efectuar sob a acção directa da luz do sol não obstruída. 61a. Processo de acordo com a ' reivindicação 60, caracterizado pelo facto de se evitar que entre cerca de 40% e cerca de 80% do espectro visível da luz do sol atinja a matéria vegetal durante a operação de secagem. 62a. Processo de acordo com a reivindicação 56, caracterizado pelo facto de, durante a operação de secagem, se obter uma redução do peso da matéria vegetal pelo menos iguel a 25%. 63a. Processo de acordo com a reivindicação 62, caracterizado pelo facto de, durante a operação de secagem, se secar a matéria vegetal até se obter uma perda de peso compreendida entre cerca de 40% e cerca de 70%. 64a. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo facto de a mistura de taxanos compreender os taxanos escolhidos do grupo que consiste em taxol, cefalomanina, desacetil-cefalomanina, bacatina III, 10-desacetil-bacatina III e 10-desacetil-taxol. 124 *·*>' 65a. Processo de acordo cora a reivindicação 39, caracterizado pelo facto de se submeter o segundo resíduo ao tratamento de acabamento da fase operacional E. 66a. Processo para a obtenção de uma mistura bruta de taxanos, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo facto de o dissolvente empregado na fase operacional E para dissolver o segundo resíduo da operação D ser uma mistura de acetato de etilo e metanol. 67a. Processo para a obtenção de uma mistura bruta de taxanos, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo facto de o dissolvente usado na fase operacional E para dissolver o segundo resíduo da operação D ser acetato de etilo. 68a. Processo para a obtenção de uma; mistura bruta de taxanos, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo facto · de o suporte sólido empregado na fase operacional E ser celite. 69a. Processo para a obtenção de uma mistura bruta de taxanos, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo facto de os taxanos serem reversivelmente ligados ao suporte sólido utilizado na fasé operacional E adicionando 125

o referido suporte sólido ao mencionado dissolvente da fase operacional E em que se dissolveu o segundo resíduo e fazendo evaporar o citado dissolvente de forma a que os componentes do referido segundo resíduo se liguem ao mencionado suporte sólido. 70a. Processo para a obtenção de uma mistura bruta de taxanos, de acordo com a reivindicação 65, caracterizado pelo facto de se eluir em primeiro lugar o suporte sólido empregado na fase operacional E ao qual se ligaram os componentes do segundo resíduo com um dissolvente que não remove quantidades substanciais de taxano do suporte sólido e, em segundo lugar, se eluir com um segundo dissolvente que ê mais polar do que o dissolvente utilizado para a primeira eluição, o qual elui do suporte sólido uma fracção mais rica em taxanos do que a mistura bruta de taxanos. 71a. Processo para a obtenção de uma mistura bruta de taxanos, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo facto de o dissolvente utilizado para a primeira eluição ser hexano. 126

72a. Processo para a obtenção de uma mistura bruta de taxanos, ^ãe ~ãcõrdo com a reivindicação 70, caracterizado pelo facto de o dissolvente utilizado para eluir os taxanos do suporte sólido ser escolhido do grupo que consiste em acetato de etilo e cloreto de metileno. 73a. Processo para a obtenção de uma mistura bruta de taxanos, de acordo com a reivindicação 70, caracterizado pelo facto de se utilizar hexano para a primeira eluição e se empregar acetato de etilo para eluir os taxanos. 74a. Processo de acordo com a reivindicação 39, caracterizado pelo facto de se submeter o segundo resíduo ao tratamento de acabamento de acordo com a fase operacional F. 75a. Processo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo facto de a mistura aquosa empregada na fase operacional F compreender mais do que cerca de 50% de dissolvente orgânico polar, sendo a parte restante constituída por água. 76a. Processo de acordo com a . reivindicação 75, caracterizado pelo facto de a mistura aquosa empregada na 127

fase operacional F compreender cerca de 9 partes de dissolvente orgânico polar e cerca de 1 parte de água. 77a. Processo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo' facto de o dissolvente orgânico polar da fase operacional F ser escolhido do grupo que consiste em acetonitrilo e metanol. 78a. Processo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo facto de o dissolvente orgânico polar da mistura aquosa da fase operacional F ser metanol. 79a. Processo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo facto de a mistura aquosa da fase operacional F compreender mais do que cerca de 50% de metanol e o restante ser água. 80a. Processo de acordo com a çeivindicação 79, caracterizado pelo facto de a mistura aquosa da fase operacional F compreender cerca de 9 partes de metanol e cerca de 1 parte de água. 81a. Processo de acordo com a reivindicação 74', caracterizado pelo facto de se escolher o dissolvente 128

orgânico da fase operacional F do grupo que consiste em hêxano, pentano, éter de petróleo, heptano, iso-octano e as suas misturas. 82a. Processo para a obtenção de uma mistura bruta de taxanos, de acordo com a reivindicação 81, caracterizado pelo facto de o dissolvente orgânico da fase operacional F ser hexano. 83a. Processo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo facto de o segundo resíduo ser distribuído entre um dissolvente orgânico não polar não miscível que compreende hexano e uma mistura aquosa que compreende metanol e água. 84a. Processo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo facto de se distribuir o segundo resíduo entre um maior volume de dissolvente orgânico não polar não miscível do que a mistura aquosa. 85a. Processo de acordo com a reivindicação 84, caracterizado pelo facto de se distribuir o segundo * resíduo entre cerca de 1 parte da segunda mistura aquosa e cerca de 2 partes de dissolvente orgânico não polar não miscível. 129

86a. Processo de acordo com a reivindicação 74, caracterizado pelo facto de a mistura bruta de texanos compreender os taxanos escolhidos do grupo que consiste em taxol, cefalomanina, desacetil-cefalomanina, bacatina III, 10-desacetil-bacatina III e 10-desacetil-taxol. 87a. Mistura bruta de taxanos de matéria vegetal que contém taxanos, preparada de acordo com as operações que consistem em A. extrair taxanos a partir de matéria vegetal fazendo contactar matéria vegetal com um dissolvente orgânico e obter-se um primeiro resíduo substancialmente isento de dissolvente rico em taxanos; B. distribuir o primeiro resíduo entre um dissolvente orgânico capaz de dissolver os taxanos e um dissolvente aquoso que não dissolva quantidades significativas de taxanos para originar uma fase orgânica e uma fase aquosa; C. separar a fase orgânica da fase aquosa e recuperar a fase orgânica substancialmente isenta da fase aquosa; D. obter um segundo resíduo a partir da segunda fase orgânica? e submeter a referida fase orgânica a um tratamento de acabamento escolhido dum dos dois conjuntos de operações que consiste em ou 130 E. dissolver o segundo resíduo num dissolvente que permite realizar a ligação reversível dos taxanos a um suporte sólido, introduzir um suporte sólido no dissolvente que compreende o segundo residuo dissolvido e permitir que os taxanos do segundo resíduo se liguem ao mencionado suporte sólido, separar o citado suporte sólido do dissolvente, fazer contactar sequencialmente o suporte sólido com os taxanos ligados com uma série de dissolventes que têm propriedades de eluição dos taxanos diferentes; e eluir uma fracção rica em taxanos a partir do suporte sólido õob a forma de mistura de taxanos bruta; ou F. distribuir o segundo residuo entre uma mistura aquosa e um dissolvente orgânico não miscível não polar, em que a mistura aquosa compreende uma única fase constituída por água e um dissolvente orgânico polar miscível com água o qual se encontra presente na referida mistura numa quantidade suficiente para permitir t que os taxanos presentes no segundo resíduo entrem para a mistura aquosa; e recuperar a mistura bruta de taxanos da mistura aquosa. 88a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com a reivindicação 87, caracterizada pelo facto de a matéria vegetal ser fornecida por uma ou mais espécies dê variedades cultivadas ("cultivares") do género ornamental Taxus. 131

89a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com a reivindicação 87, caracterizada pelo facto de a matéria vegetal a ser extraída ser fornecida sob a forma de aparas intactas em que uma quantidade substancial de folhagem está ligada aos ramos e ser submetida a uma operação de secagem antes da extracção. 90a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com a reivindicação 87, caracterizada pelo facto de o segundo resíduo ser submetido ao tratamento de acabamento formado pelo conjunto de operações E. 91a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com a reivindicação 87, caracterizada pelo facto de o segundo resíduo ser submetido ao tratamento de acabamento formado pelo conjunto de operações F. 92a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com a reivindicação 91, caracterizada pelo facto de a mistura aquosa do conjunto de operações F compreender mais que cerca de 50% de dissolvente orgânico polar e a parte restante de água. 93a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com a reivindicação 92, caracterizado pelo. facto de a mistura 132 1 I aquosa do conjunto de operações F compreender cerca de 9 partes de dissolvente orgânico polar e cerca de 1 parte de água. 94a.Mistura de taxanos bruta, de acordo com a reivindicação 91, caracterizada pelo facto de o dissolvente orgânico polar da mistura aquosa do conjunto de operações F ser escolhido do grupo que consiste em acetonitrilo e metanol. 95a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com a reivindicação 94, caracterizada pelo facto de o dissolvente orgânico polar da mistura aquosa do conjunto de operações F ser metanol. 96a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com a reivindicação 95, caracterizada pelo facto de a mistura aquosa do conjunto de operações F compreender mais do que cerca de 50% de metanol e a parte restante de água. 97a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com a reivindicação 96, caracterizada pelo facto de a mistura aquosa do conjunto de operações F compreender cerca de 9 partes de metanol e cerca de 1 parte de água. 133 98a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com reivindicação 91, caracterizada pelo facto de dissolvente orgânico do conjunto de operações F ser escolhido do grupo' que consiste em hexano, pentano, éter de petróleo, heptano, iso-octano e as suas misturas. 99a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com reivindicação 98, caracterizada pelo facto de dissolvente orgânico do conjunto de operações F ser hexano. 100a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com a reivindicação 91, caracterizada pelo facto de se distribuir o segundo resíduo entre um dissolvente orgânico não miscível não polar que compreende hexano e uma mistura aquosa que compreende metanol e água. 101a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com a reivindicação 91, caracterizada pelo facto de se distribuir o·segundo resíduo entre um maior volume de um dissolvente orgânico não miscível não polar do que mistura aquosa. 102a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo facto de se 134

distribuir o segundo resíduo entre cerca de 1 parte da segunda mistura aquosa écerca de 2 partes de dissolvènté orgânico não miscível não polar. 103a. Mistura de taxanos bruta, de acordo com a reivindicação 87, caracterizada pelo facto de compreender os taxanos escolhidos do grupo que consiste em taxol, cefalomanina, desacetil-cefalomanina, bacatina III, 10-desacetil-bacatina III e 10-desacetil-taxol. 104a Processo para a separação de dois ou mais taxanos que incluem taxol e cefalomanina, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consiste em arranjar uma mistura que compreendem dois ou mais taxanos num dissolvente apropriado para carregar numa coluna de cromatografia em fase líquida normal; carregar a mistura compreendendo taxanos numa coluna de cromatografia em fase líquida normal cheia com um suporte sólido dissolvida num dissolvente apropriado como fase móvel; e separar os taxanos eluindo a coluna de cromatografia com fase móvel tendo uma polaridade para eluir separadamente o taxol e a cefalomanina. 105a. Processo de acordo com a . reivindicação 104, caracterizado 104, caracterizado pelo facto de a fase 135 135

I'ιΜ móvel ser uma mistura de acetato de etilo e cloreto de mètileiió. 106a. Processo de acordo com a reivindicação 105, caracterizado pelo facto de a mistura de taxanos ser carregada para a coluna de cromatografia no seio duma mistura com cerca de 20% de acetato de etilo em cloreto de metileno. 107a. Processo de acordo com a reivindicação 104, caracterizado pelo facto de se colectar taxol substancialmente puro a partir de fracções eluidas com cerca de 45% de acetato de etilo e cerca de 50% de cloreto de metileno. 108a. Processo de acordo com a reivindicação 104, caracterizado pelo facto de se colectar cefalomanina substancialmente pura a partir de fracções eluidas com cerca de 50% de acetato de etilo e cerca de 50% de cloreto de metileno. . 109a. Processo para se obter e separar os taxanos taxol e cefalomanina a partir de matéria vegetal que contém taxanos, caracterizado pelo facto de compreender as operações que consistem em 136

arranjar aparas intactas em que uma quantidade substancial de folhagem está ligada aos ramos de matéria vegetal contendo taxano, secar as aparas intactas para reduzir o seu teor de matérias voláteis e produzir aparas substancialmente secas e recuperar as citadas aparas substancialmente secas e extrair os taxanos das referidas aparas secas de acordo com as seguintes operações que conpreendem: A. fazer-se contactar a matéria vegetal com um dissolvente orgânico e obter-se um primeiro resíduo substancialmente isento de dissolvente rico em taxanos; B. dividir o primeiro resíduo entre um dissolvente orgânico capaz de dissolver os taxanos e um dissolvente aquoso que não dissolve quantidades significativas de taxanos para produzir uma fase orgânica e uma fase aquosa; C. separar-se a fase orgânica da fase aquosa e recuperar -se a fase orgânica substancialmente isenta da fase aquosa; D. formar-se um segundo resíduo a partir da segunda fase orgânica; e submeter-se a mencionada fase orgânica a um tratamento de acabamento escolhido de um dos dois conjuntos de operações que consiste em ou E. dissolver-se o segundo resíduo num dissolvente que permite a efectuar a ligação reversível dos taxanos a um suporte sólido, 137

introduzir-se um suporte sólido no dissolvente que compreende o segundo resíduo dissolvido e permitir-se que os taxanos do segundo resíduo se liguem ao citado suporte sólido, separar-se o referido suporte sólido do dissolvente; fazer-se contactar sêquencialmente o suporte sólido com os taxanos ligados com uma série de dissolventes que têm propriedades de eluigão dos taxanos diferentes; e eluir-se uma fracção rica em taxanos a partir do suporte sólido sob a forma de mistura de taxanos bruta; ou F. distribuir-se o segundo resíduo entre uma mistura aquosa e um dissolvente orgânico não miscível não polar, em que a mistura aquosa compreende uma única fase formada por água e um dissolvente orgânico polar miscível com água, encontrando citado dissolvente orgânico polar na referida mistura numa quantidade suficiente para permitir que os taxanos presentes no segundo resíduo entrem para a mistura aquosa; e ; recuperar-se a mistura de texanos bruta a partir da segunda mistura aquosa, fornecendo-se a mistura de taxanos bruta obtida a partir de qualquer dos conjuntos de operações de tratamento E ou F, a qual compreende dois ou mais taxanos, no seio de um dissolvente apropriado para carregar para uma coluna de cromatografia em fase liquida apropriada; 138 u carregando-se a mistura que compreende os taxanos numa coluna de cromâtografia em fase líquida normal cheia com um suporte sólido num dissolvente apropriado como fase móvel; e separando-se os taxanos mediante eluição da coluna de cromatografia em fase líquida com uma fase móvel que tem uma polaridade suficiente para eluir separadamente o taxol e a cefalomanina. 110a. Processo de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo facto de se realizar a operação de secagem a uma temperatura inferior a cerca de 70°C. 111a. Processo de acordo com a reivindicação 110, caracterizado pelo facto de se efectuar a operação de secagem a uma temperatura compreendida entre cerca de 20°C e 65°C. 112a. Processo de acordo com a reivindicação 109, caracterizado. pelo facto de se efectuar a operação de secagem não se efectuar sob a acção directa da luz do sol não obstruída. 113a. Processo de acordo com a reivindicação 112, caracterizado pelo facto de se evitar que entre cerca de 139

40% e cerca de 80% da luz visível do sol atinja a matéria vegetal durante a operação de secagem. 114a. Processo de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo facto de, durante a operação de secagem, se obter pelo menos 25% de diminuição de peso da matéria vegetal. 115a. Processo de acordo com a reivindicação 114, caracterizado pelo facto de, durante a operação de secagem, se secar a matéria vegetal até se obter uma perda de peso compreendida entre cerca de 40% e cerca de 70% de perda de peso da matéria vegetal. 116a. Processo de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo 'facto de a matéria vegetal ser escolhida do grupo que consiste em T. cuspidata, T. X media "Halloran", T. X media "Hatfield", T. X media "Nigra" T. X media "Tauntonii", T. X média "Dark Green Spreader" e Τ·. X media "Hicksii". 117a. Processo de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo facto de se submeter o segundo resíduo ao tratamento de acabamento que consiste no conjunto de operações F. 118a. Processo de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo facto de a mistura aquosa do conjunto de operações F compreender mais do que 50% de dissolvente orgânico polar e a parte restante de água. 119a. Processo de acordo com a reivindicação 118, caracterizado pelo facto de a mistura aquosa do conjunto de operações F compreender cerca de 9 partes de dissolvente orgânico polar e cerca de 1 parte de água. 120a. Processo de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo facto de o dissolvente orgânico polar da mistura aquosa do conjunto de operações F ser escolhido do grupo que consiste em acetonitrilo e metanol. 121a. Processo de acordo com a reivindicação 120, caracterizado pelo facto de o dissolvente orgânico polar da mistura aquosa do conjunto de operações F ser metanol. 122a. Processo de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo facto de a mistura aquosa do conjunto de operações F compreender mais do que cerca de 50% dé metanol.

ΗΛ 141 123a. Processo de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo facto de a mistura aquosa do conjunto de operações F compreender cerca de 9 partes de metanol e cerca de 1 parte de água. 124a. Processo de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo facto de o dissolvente orgânico do conjunto de operações F ser escolhido do grupo que consiste em hexano, pentano, éter de petróleo, heptano, iso-octano e as suas misturas. 125a. Processo de acordo com a reivindicação 124, caracterizado pelo facto de o dissolvente orgânico do conjunto de operações F ser hexano. 126a. Processo de · acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo facto de se distribuir o segundo resíduo entre um dissolvente orgânico ^ não miscível não polar e uma mistura aquosa que compreende metanol e água. 127a. Processo de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo facto de se distribuir o segundo resíduo entre um volume de dissolvente orgânico não miscível não polar maior do que o volume da mistura aquosa. 142

V 128a. Processo âe acordo com a reivindicação 127, caracterizado pelo facto de se distribuir o segundo resíduo entre cerca de 1 parte da segunda mistura aquosa e cerca de 2 partes de dissolvente orgânico não miscivel não polar. 129a. Processo de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo facto de a mistura bruta de taxanos compreender os taxanos escolhidos do grupo que consiste em taxol, cefalomanina, desacetil-cefalomanina, bacatina III, 10-desacetil-bacatina III e 10-desacetil-taxol. 130a. Processo de ' acordo com a reivindicação 129, caracterizado pelo facto de o taxano obtido e separado ser taxol. 131a. Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado· pelo facto de se repetir uma, duas, três ou quatro· vezes qualquer das operações A, B, C, D, E ou F. 132a. Processo de acordo com a reivindicação 104, caracterizado pelo facto de se repetir uma ou mais vezes qualquer das operações para separar dois ou mais taxanos. 143 133a. Processo de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pelo facto de se repetir uma, duas, três ou quatro vezes qualquer das operações. Lisboa, 0 Agente Oficial da propriedade Industrial Amõrieod&SílvaCmalfce Agonia Ofioial is Progradado Indúcipisl Rua Marnuss dn Frcntairs, N.0127 - 2.® ir>nn" . TU- ?'’7737<J-C.''' i9 1— (U- U, jt