CN1054382C - 用反相制备液相色谱法分离纯化紫杉醇的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用多孔高分子填料作固定相的反相液相色谱分离法，从紫衫植物(Taxus.SP)各部分的提取物中，或从红豆衫培养细胞的提取物中，分离和纯化紫衫醇和其它紫杉烷类衍生物。本方法选择性好，回收率高。

Description

用反相制备液相色谱法分离纯化紫杉醇的方法

本发明涉及用红豆杉科植物及其变种的树皮、叶、树杆或根中选择性地提取紫杉醇(Taxol)和其它紫杉烷类衍生物的方法。

紫杉醇和一些紫杉烷类衍生物如Taxotere，具有明显抗癌和抗白血病性，已制成治疗各种癌如乳腺、前列腺、结肠、胃、肾、睾丸癌，尤其是卵巢癌的疗效显著的化疗剂。

许多红豆杉科植物如短叶红豆杉(Taxus brevifolia)、云南红豆杉(T.yun-nanensis)、东北红豆杉(T.cuspidata)、浆果红豆杉(T.baccata)西藏红豆杉(T.wallichiana)、加拿大红豆杉(T.chinenis)和美丽红豆杉(T.floridana)等植物的树皮、枝叶中含有紫杉醇(Taxol)，也含有其它紫杉烷类衍生物，如10-脱乙酰基浆果赤霉素III(10-deacetylbaccatin III)，10-脱乙酰基-7-表-浆果赤霉素III(10-deacetyl-7-epi-baccatin III)、浆果赤霉素III(baccatinIII)、10-脱乙酰基紫杉醇(10-deacetyl taxol)、Cephalomannine，10-脱乙酰基-7-表-紫杉醇等化合物。上述含有紫杉醇和紫杉烷类衍生物的植物在本申请书中称为紫杉植物(Taxus sp.)。

紫杉醇在植物体内含量普遍很低，即使公认含量最高的短叶红豆杉树皮中仅有0.06％。若干植物的枝叶中也含有0.002-0.008％的紫杉醇。其它紫杉烷类衍生物中，10-deacetyl baccatinIII作为半合成法制紫杉醇和Taxotere的原料，也是一种有价值的资源被受重视。

现已报道的从各种植物体中提取紫杉醇的方法需经过十分繁冗的分离程序，不仅费时，且耗费高，回收率低。例如O.C.H Huang等，在J.Nat.prod.49 665(1986)揭示的分离法为用甲醇浸出粉碎后的短叶紫杉树皮，将提取液浓缩，用二氯甲烷萃取浓缩物，再度浓缩后将剩余物分散在己烷-丙酮中，用填充有Florisil硅胶的色谱柱，以正相色谱法将可溶部分提纯得紫杉醇粗制品，用甲醇-水和己烷-丙酮混合物顺序重结晶后再经色谱提纯，再泡结晶，这样提取的紫杉醇量为所用植物部分的0.005-0.017％，其回收率仅为20-40％。EP 0553780A1中揭示的分离法与上法相近，用不同比例的环己烷-乙酸乙酯混合物作洗脱剂，以硅胶为固定相，以正相色谱法分离出紫杉醇。E.R.M.weikremesinhe，R.N.Arteca等，在J.Liq.Chromatogr.16(15)3263(1993)上揭示，用键合有十八烷基的键合硅球作固定相，以不同浓度的甲醇水溶液作洗脱剂，以反相色谱法从浓缩物中分离出含有紫杉醇的粗产品。再用高效键合十八烷基硅球固定相，经反相色谱法在制备高效液相色谱仪上分离出紫杉醇纯品。此法分离效率高，回收率较好。但键合硅球固定相价格昂贵，且其化学稳定性较差，一旦中毒很难再生，不能适应大规模制备的需要。饶畅、刘欣等在药学学报26(7)510(1991)中揭示，在用硅胶作固定相的正相色谱法柱层析和低压柱层析制得含紫杉醇浓缩物后，用高速逆流色谱法进行浓缩物的分离，  但最后结论是Taxol与Cephalomannine和baccatinIII不能完全分开，需要再次进行制备高效液相色谱法分离。

综上所述，已报道的从浸出物中分离提取紫杉醇的色谱方法均有所不足，最通用的以硅胶为固定相的正相色谱法，因硅胶的不可逆吸附使样品损失大，且硅胶固定相通常只能使用一次，操作十分不便，以键合硅球为固定相的反相色谱法，虽然分离选择性好，柱效率高，但固定相昂贵，易中毒，不能适应大规模分离的要求。现有的高速逆流色谱法，分离提取紫杉醇的选择性较差，不能满足提取和纯化的要求。

作为本发明的主题，本发明者发现了可以用廉价的、效率高、化学稳定性好，可以反复使用的多孔高分子填料作固定相，以反相色谱方法，从紫杉植物的各部分，尤其是从树皮、叶、枝中，以极高的选择性和优异的回收率提取和纯化紫杉醇和其它的紫杉烷类衍生物。

本发明的方法包括：

1.用乙醇或甲醇或甲醇和二氯甲烷混合液或乙醇、丙酮和氯仿的混合液来浸出研磨后的紫杉植物体，得到的浸出液浓缩至干，用二氯甲烷或氯仿溶解残余物，加入水与二氯甲烷(或氯仿)进行相分配。分出二氯甲烷层(或氯仿层)，加入硅藻土或多孔高分子填料，将此混合物减压蒸馏，除去溶剂，得到固定有浸出物的固体吸附剂。

2.将固定有浸出物的固体吸附剂置于填充有多孔高分子填料作固定相的色谱柱顶端，分步地用不同浓度的含有适当的有机溶剂的水溶液对色谱柱进行洗脱、即用反相液相色谱法进行分离。最先是有色杂质从柱出口馏出，接着10-deacetylbaccatin III，10-deacetyl-7-epi-baccatinIII，baccatinIII，10-deacetyltaxol，cephalomannine，10-deacetyl-7-epi-taxol和taxol顺次馏出，分别收集馏出的紫杉醇及其它的紫杉烷类衍生物馏分，进行减压浓缩、干燥后得到富集有紫杉醇和富集有其它紫杉烷类衍生物的浓缩物。

3.再用填充有多孔高分子填料作固定相的反相色谱法，分别对得到的紫杉醇浓缩物，或其它紫杉烷类衍生物浓缩物进行分离纯化，可得到纯度较高的紫杉醇或纯度较高的其它紫杉烷类衍生物。

4.可用适当的有机溶剂体系对得到的紫杉醇制品或其它紫杉烷类衍生物制品分别进行选择性结晶，获得紫杉醇纯品，或其它紫杉烷衍生物的纯品。

本发明可用各类紫杉植物的任何适宜部分，如树皮、叶、枝、根部来制备紫杉醇和其它紫杉烷类衍生物。由于本发明操作较简单，回收率高，可以实现从含紫杉醇仅0.002％的叶中，高回收率地制备紫杉醇。这种提取方法不会破坏紫杉植物资源，其叶在每一生长循环后又可再利用。本法亦适用于从红豆杉培养细胞中制取紫杉醇。

本发明方法的特征在于用多孔高分子填料作固定相的反相液相色谱方法来提取和纯化紫杉醇及其它的紫杉烷类衍生物。本发明方法与以相同粒度键合硅胶球为固定相的反相液相色谱法的选择性和柱效率相当，但多孔高分子填料容易制备，化学稳定性好、柱寿命长、价格低廉，产品回收率高，更宜用于大规模制备。本发明方法克服了正相液相色谱法中硅胶填料对样品的不可逆吸附造成的回收率低，硅胶柱寿命短等缺点。

本发明所述的多孔高分子填料其化学结构特征是一类多孔型聚苯乙烯一二乙烯基苯高分子微粒，或多孔型交联聚丙烯酸酯型或聚甲基丙烯酸酯型高分子微粒，或多孔型交联聚丙烯腈型高分子微粒，或多孔型交联聚丙烯酰胺型高分子微粒，或多孔型交联聚醋酸乙烯酯型高分子微粒等；其孔特征为：1.在湿态下外观多呈乳白色；2.比孔体积大于0.1ml/g；3.比表面积大于0.5m²/g；4.平均孔径大于30；其粒度特征为在粒径范围为250μm至5μm内，一窄粒度分布范围的颗粒群，粒度分布的分散度愈小愈好，在粒度分布范围窄的条件下，粒径愈小，分离的柱效率愈高。

本发明所述的反相液相色谱方法其特征是采用含有适当有机溶剂的水溶液作洗脱剂。所述的洗脱剂是指去离子水与有机溶剂的混合溶液，或是含有盐类的水缓冲溶液与有机溶剂混合得到的溶液，有机溶剂与水的体积比为5-95％，其中以40-85％较佳。本发明所述的有机溶剂可以是低碳醇类，如甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇；也可以是低碳酮类，如丙酮、丁酮、甲基乙基酮，也可以是乙腈、丙腈、四氢呋喃；也可以是两种以上有机溶剂可溶于水的混合物。

本发明所述的以多孔高分子填料为固定相的反相液相色谱方法，可以在5-60℃之间进行。在20-35℃之间进行较适宜。

本发明所述的方法适用于分离毫克级至公斤级的物料。

以下实施例详述本发明

实例1

取10kg云南红豆杉树皮粉碎至粒径小于20目，加入20L95％7醇，在室温下强烈搅拌16小时，过滤、收集滤液。再加入20L95％乙醇，搅拌浸出16小时，过滤、收集滤液。合并滤液，在45℃下，减压蒸出溶剂。用5L二氯甲烷溶解残余物，加入5L水与二氯甲烷液进行萃取，收集二氯甲烷层。在此有机相中加入500g硅藻土(100-200目)，将悬浮液在40℃减压蒸发去除溶剂，得到负载有浸出物的硅藻土。

将此负载有浸出物的硅藻土加至填充多孔聚苯乙烯一二乙烯基苯高分子微球(核工业北京化冶院产品，粒径150-100μm，比表面积450m²/g，平均孔径71)的色谱柱柱头，色谱柱直径50mm，固定相层高1780mm。先后用40％，50％，60％，70％(v/v)的甲醇——水溶液来洗脱柱子。流速为20ml/min，定时对流出液取样进行HPLC(高效液相色谱)分析，测定馏出液中化学成分。有色杂质、10-deacetylbaccatinIII，10-deacetyl-7-epi-baccatinIII，10-deacetyltaxol，cephalomannin，紫杉醇等成分，夹杂一些未知成分先后馏出。分别收集富10-deacetyl bacattinIII馏分(含10-deacetyl baccatinIII约40％，其余为未知成分)；减压蒸馏，干燥得残余物2g，富baccatinIII馏分(含bacattin III约30％，其余为cephalomannine及未知成分)；减压蒸馏、干燥得残余物富Cephalomannine馏分(含Cephalomannine60％，Taxol 10％，其余为其它杂质)；减压蒸馏、干燥得残余物2g；富紫杉醇馏分3克(含Taxol约68％，Cephalomannine约10％，其余为未知物)，减压蒸馏、干燥得富紫杉醇的浓缩物3.8克。

富10-deacetyl bacattin III浓缩物在丙酮-水中重结晶，得10-deacetylbacattin III制品0.8克(含量76％)。

实例2

取实例1所得到的富紫杉醇浓缩物，用20毫升甲醇溶解，分二次用注射针注入填充有多孔聚苯乙烯一二乙烯基苯高分子微球作固定相的色谱柱柱头，色谱柱尺寸为Φ40×300mm，填料为核工业北京化工冶金研究院产品，粒径为20-25μm，填料的其余性质与实例1中的相同。洗脱剂为70％甲醇-水溶液，采用的紫外光度检测器的检测波长为227μm，收集Taxol峰出现时的馏分，蒸发出溶剂，用在甲醇-水中重结晶，得到2.3g紫杉醇纯品，经HPLC分析纯度＞98％。

实例3

按实例1的方法用40L甲醇浸出10kg经粉碎后的东北红豆杉的针叶，经二氯甲烷溶解后与500g硅藻土混合，蒸出溶剂后，得到负载有浸出物的硅藻土。将此硅藻土置于实例1所述的色谱柱柱头。顺序用50％，60％，70％(v/v)乙醇-水溶液洗脱柱子。按实例1的方法得到富10-deacetyl baccatinIII浓缩物1.8克，富cephalomannine浓缩物0.4g，富紫杉醇的浓缩物0.6g(含Taxol 50％)。

实例4

取实例3所得的富紫杉醇浓缩物，溶于5ml甲醇中，用注射针注入用多孔交联聚丙烯酸甲酯型高分填料为固定相的色谱柱中，色谱柱尺寸为Φ40×300mm，填料为核工业北京化工冶金研究院产品，粒径为20-30μm，表面积120m²/g，平均孔径180，其余色谱条件与实例2同。收集Taxol馏分，蒸去溶剂后，在甲醇-水中重结晶得紫杉醇纯品0.28g，HPLC分析纯度＞98％。

Claims (8)

1.一种用反相制备液相色谱法分离纯化紫杉醇的方法，包括以下步骤：

(a)将紫杉植物各部分的浸出物固化在硅澡土或多孔高分子填料上，得到固定有浸出物的固体吸附剂，

(b)将固定有浸出物的固体吸附剂，置于填充有多孔高分子填料作固定相的色谱柱上，采用反相液相色谱法进行分离，用洗脱剂对色谱柱进行洗脱，紫杉醇和其它紫杉烷类衍生物按一定顺序随洗脱剂从柱口馏出，分别收集紫杉醇及其它的紫杉烷类衍生物馏分，进行减压浓缩、干燥后得到富集有紫杉醇和其它紫杉烷类衍生物的浓缩物，其中作固定相的多孔高分子填料选自多孔型聚苯乙烯一二乙烯基苯高分子微粒、或多孔型交联聚丙烯酸酯型、或聚甲基丙烯酸酯型高分子微粒、或多孔型交联聚丙烯腈型高分子微粒、或多孔型交联聚丙烯酰胺型高分子微粒、或多孔型交联聚醋酸乙烯酯型高分子微粒等，其微粒的粒径范围为5-250μm，孔特征为(1)比孔体积大于0.1ml/g，(2)比表面积大于0.5m²/g，(3)平均孔径大于30A，

(c)再用填充有多孔高分子填料作固定相的反相色谱法，分别对得到的紫杉醇浓缩物或其它紫杉烷类衍生物浓缩物进行分离纯化，可得到纯度较高的紫杉醇或其它紫杉烷类衍生物，

(d)用有机溶剂体系对得到的纯度较高的紫杉醇或其它紫杉烷类衍生物，分别进行选择性结晶，获得紫杉醇纯品或其它紫杉烷类衍生物纯品。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的洗脱剂是指去离子水与有机溶剂的混合溶液，或是含有盐类的水缓冲溶液与有机溶剂混合得到的溶液，所述的有机溶剂选自低碳醇类、低碳酮类、乙腈、丙腈、四氢呋喃、或者是两种以上有机溶剂可溶于水的混合物，有机溶剂与水的体积比为5-95％，采用等度洗脱或梯度洗脱方式。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于低碳醇类选自甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇；低碳酮类选自丙酮、丁酮、甲基乙基酮。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述的洗脱剂中的有机溶剂与水的体积比为40-85％。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述的紫杉植物各部分的浸出物溶解后，加入硅澡土或多孔高分子填料，经减压蒸馏，除去溶剂，得到固定有浸出物的固体吸附剂。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于分离在5-60℃之间进行。

7.如权利要求1或6所述的方法，其特征在于分离在20--35℃之间进行。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于(d)所述的有机溶剂体系为甲醇-水溶液，或丙酮-水溶液。