PL83490B1 - - Google Patents

Description

Sposób wyodrebniania antytrombiny z plazmy krwi Przedmiotem wynalazku jest sposób wyodrebnia¬ nia antytrombiny z krwi lub substancji krwiopo¬ chodnych przez adsorpcje na zelu zawierajacym weglowodan podstawiony grupami siarczanowymi.Koagulacja krwi jest zlozonym procesem zacho¬ dzacym w ukladzie wieloskladniowym. Powstawa¬ nie skrzepów moze byc wywolywane wieloma róz¬ nymi bodzcami, najczesciej jest to mechaniczne uszkodzenie jednego lub wiekszej liczby naczyn krwionosnych. Zapoczatkowanie koagulacji naste¬ puje wtedy czesciowo przez aktywacje stykowa pewnych czynników w krwi, a czesciowo pod wplywem aktywatorów tkankowych wydostajacych sie z uszkodzonego miejsca. Na inicjacje tego pro¬ cesu wywiera wplyw równiez zachodzaca równo¬ czesnie agregacja skrzepów krwi.Zapoczatkowany zostaje lancuch reakcji prowa¬ dzacy w efekcie koncowym do utworzenia sie skrzepu w uszkodzonym miejscu. Jednym z ostat¬ nich i najwazniejszych etapów w procesie powsta¬ wania skrzepu fibrynowego jest dzialanie trombi- ny, enzymu wytwarzanego w procesie koagulacji, na fibrynogen. Wskutek tego dwie niewielkie frak¬ cje peptydów zostaja odszczepione od fibrynogenu, dajac zmodyfikowany fibrynogen, który ulega na¬ stepnie szybkiej agregacji w strukture siarkowa, tworzac skrzep.Dzialanie regulujace tendencje krwi do koagu¬ lacji i zapobiegajace rozprzestrzenianiu sie proce¬ sów lokalnych, powodujacych calkowita koagula- 10 15 20 25 cje wewnatrznaczyniowa wywierane jest przez sze¬ reg obecnych w krwi substancji opózniajacych proces koagulacji. Jedna z najwazniejszych jest antytrombina, stanowiaca substancje bialkowa wchodzaca w reakcje z trombina i powodujaca jej dezaktywacje. Wskutek tego zdezaktywowana trombina nie moze reagowac z fibrynogenem i w konsekwencji zahamowany zostaje proces powsta¬ wania skrzepów.W praktyce medycznej obserwowano w wielu przypadkach patologicznie niskie poziomy anty¬ trombiny. Konsekwencje tego stanowi zwiekszone niebezpieczenstwo trombosis, na przyklad po po¬ waznych zabiegach chirurgicznych. Istnieja pod¬ stawy do stwierdzenia, ze terapia antytrombinowa moze przynosic cenne wyniki przy leczeniu takich przypadków. Zmniejszone poziomy antytrombiny wykrywane byly równiez w konsekwencji stoso¬ wania niektórych leków z grupy sterydów.W przeszlosci antytrombina byla wyodrebniona jedynie w ilosciach sladowych, wskutek czego jest ona stosunkowo malo znana.Znane sposoby byly niezwykle skomplikowane i charakteryzowaly sie bardzo malymi wydajno- sciami, rzedu 1—2%. Sposób wedlug wynalazku umozliwia ekstrakcje antytrombiny z wydajnoscia powyzej 90°/o.W czasie doswiadczen nad wyodrebnieniem czyn¬ ników powodujacych koagulacje z plazmy krwi droga adsorpcji na zelach zawierajacych weglowo- 83 49083 490 dan podstawiony grupami siarczanowymi, nieocze¬ kiwanie stwierdzono, ze specyficzne czynniki koa- gulujace wiazane sa przez omawiane zele. Dodat¬ kowe rozdzielanie materialu przez odsaczenie zelu pozwala na wyodrebnienie skladnika o ciezarze 5 czasteczkowym okolo 65.000 i silnie zaznaczonym dzialaniu opózniajacym proces koagulacji. Bada¬ nia tej proteiny metodami fizykochemicznymi i immunologicznymi wTykazuja identycznosc z opi¬ sana wczesniej antytrombina III. io Eksperymenty z elucja gradientowa zelu w ko¬ lumnie wykazuja, ze antytrombine mozna otrzy¬ mywac bezposrednio w stanie nalezycie oddzielo¬ nym od innych substancji bialkowych zawartych w materiale wyjsciowym. Dla uzyskania duzych 15 ilosci antytrombiny korzystnie jest adsorbowac ja z IV frakcji Cohna (metoda 6), przez dodanie zelu do roztworu tej frakcji. Po adsorpcji mozna zel odsaczyc, przemyc i poddac elucji. Wyciek poddaje sie filtracji zelowej przez Sephadex G 150 (pro- 20 dukcji firmy Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala.Szwecja) i otrzymuje calkowicie czysta antytrom¬ bine.Przykladowymi zelami nadajacymi sie do stoso¬ wania jako adsorbenty sa: usieciowany siarczan 25 dekstranu, usieciowany siarczan dekstrano-agaro- zowy, usieciowana heparyna, usieciowana hepary- no-agaroza oraz usieciowany siarczan chondryty- no-agarozowy. Pojedyncze usieciowane zele wy¬ mienione w pierwszej i trzeciej kolejnosci wy- 30 twarza sie przez dodanie -bromku cyjanu do roz¬ tworu polisacharydu. Przez skorygowanie war¬ tosci pH do okolo 11 powoduje sie powstawanie mostków sieciujacych miedzy czasteczkami i pow¬ stawaniezelu. 35 Natomiast mieszane zele wyszczególnione powy¬ zej w drugiej, czwartej i piatej kolejnosci wy¬ twarza sie przez dodanie polisacharydu zawiera¬ jacego grupy siarczanowe do zelu agarozy (Sep- hadex 4B, Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala. 40 Szwecja) i nastepnie dodanie bromku cyjanu przy wartosci pH=ll. Te rodzaje zeli sa latwiejsze w obróbce i pozwalaja na stosowanie wiekszych predkosci przeplywu, niz zele jednorodne.Wynalazek zilustrowany jest nastepujacymi przy- 45 kladami.Przyklad I. Do roztworu 100 ml siarczanu dekstranu o stezeniu 20 mg/ml dodaje sie 5 g BrCN. Odczyn mieszaniny podwyzsza sie nastep¬ nie do wTartosci pH=ll,0 za pomoca 5M roztworu 5° NaOH w ciagu 7 minut i mieszanine miesza do nastepnego dnia. W wyniku reakcji powstaje bia¬ la, granulowana pasta zelowa. Paste te wprowa¬ dza sie do malej kolumny o srednicy 5 mm i dlu¬ gosci 8 cm i doprowadza do stanu równowagi 55 z buforem zlozonym z 0,02M roztworu TRIS, 0,0IM roztworu cytrynianu, 0,15 M roztworu NaCl o od¬ czynie o wartosci pH=8,5. Przez kolumne przepu¬ szcza sie 2 ml plazmy normalnej. Po przejsciu przez kolumne plazma traci zdolnosci koagulacji. 6° Kolumne przemywa sie najpierw oryginalnym buforem, a nastepnie eluuje zwiekszajac stopnio¬ wo stezenie soli do IM roztworu NaCl. Wyciek zawiera material, który po dializie w obecnosci buforu fosforanowego przedluza czas koagulacji *5 plazmy normalnej po ponownym wprowadzeniu wapnia z 3 minut do 45 minut. Analiza immunolo¬ giczna wykazuje obecnosc antytrombiny i niektó¬ rych lipoprotein w wycieku.Przyklad II. Omówiony tu proces polega na adsorpcji z plazmy na zelu usieciowanego siar¬ czanu clekstrano-agarozowTego i elucji gradiento¬ wej.Siarczan dekstranu wytwarza sie przez zmie¬ szanie 30 ml roztworu siarczanu dekstranu o ste¬ zeniu 15 mg/ml, 50 ml 4€/o spolimeryzowanej aga¬ rozy w formie perelek i 1 g BrCN przy utrzyma¬ niu odczynu o wartosci pH=ll. Mieszanine mie¬ sza sie w ciagu 7 minut i utrzymuje wartosc pH na tym samym poziomie przez ciagle doprowadza¬ nie NaOH. Nastepnie dodawanie alkaliów przery¬ wa sie, a odczyn srodowiska spada w ciagu 5 mi¬ nut do wartosci pH=8,5. Mieszanie kontynuuje sie do nastepnego dnia w temperaturze pokojowej, a nastepnie wytworzony zel przemywa sie.Wytworzonym w ten sposób siarczanem dek- strano-agarozowym napelnia sie kolumne. W eta¬ pie adsorpcji przez kolumne przepuszcza sie 3 ml plazmy normalnej zmieszanej w proporcji 1 :1 z buforem zlozonym z 0,02 M TRIS, 0,01 M cytry¬ nianu, 0,15 M NaCl i wykazujacym wartosc pEL=8,5. Po przejsciu przez kolumne wyciekzateza sie do objetosci 3 ml i poddaje próbom dla okre¬ slenia zdolnosci koagulacji. W czasie przechodze¬ nia przez kolumne plazma traci zdolnosc koagula¬ cji i miedzy innymi zostaje pozbawiona czynników koagulacyjnych nr VIII i IX.Zaadsorbowany material desorbuje sie za pomo¬ ca 0,02 M TRIS i 0,01 M cytrynianu, przy odczy¬ nie o wartosci pH=7,3, w gradiencie stezenia soli od 0,15 M NaCl. Wyciek odpowiada okolo 2% ma¬ terialu wyjsciowego i sklada sie w przewazajacej mierze z dwóch skladników, z których jeden sta¬ nowi frakcje lipoproteinowa typu pre-bata, a dru¬ gi antytrombine III. Identyfikacji dokonuje sie metodami immunologicznymi oraz fizykochemicz¬ nymi.Przyklad III. Omówiony ponizej proces po¬ lega na adsorpcji z plazmy na zelu usieciowanego siarczanu dekstrano-agarozowego i elucji stopnio¬ wej oraz przesaczania przez zel.Proces adsorpcji na zelu siarczanu dekstrano-aga¬ rozowego przeprowadza sie tym samym sposobem, jaki omówiony jest w przykladzie II. Desorpcje prowadzi sie w jednym etapie za pomoca 0,02 M TRIS, 0,01 M cytrynianu sodu, 1 M NaCl przy wartosci pH=7,3. Desorbat zateza sie i poddaje filtracji przez Sephadex G150 w obecnosci fizjolo^ gicznego buforu fosforanowego. Czysta antytrombw ne otrzymuje sie we frakcji dobrze oddzielonej od frakcji lipoproteinowej.Przyklad IV. Proces adsorpcji z plazmy na usieciowanym zelu heparyno-agarozowynu Heparyno-agaroze wytwarza sie takim samym sposobem, jaki omówiony jest w przykladzie II dla siarczanu dekstrano-agarozowego. Zamiast siarcza¬ nu dekstranu stosuje sie 30 ml roztworu hepary¬ ny o stezeniu 5000 jednostek miedzynarodowych/ml.Zel umieszcza sie w kolumnie i przeprowadza do¬ swiadczenia, tak jak to omówione jest w przykla-5 83 490 6 dzle II. Wyniki sa analogiczne do cytowanych w przykladzie II.Przyklad V. Adsorpcja na zelu siarczanu dekstrano-agarozowego materialu bialkowego plaz¬ my z frakcji IV Cohna (metoda 6). Elucja stop¬ niowa. Saczenie przez zel.Badaniami immunologicznymi mozna wykazac, ze antytrombina jest obecna w IV frakcji Cohna (metoda 6). 135 g frakcji IV w postaci pasty roz¬ puszcza sie w 4 ml buforu adsorpcyjnego i dodaje 500 ml zelu siarczanu dekstrano-agarozowego. Mie¬ szanine miesza sie z niewielka predkoscia w cia¬ gu 1 godziny oziebiajac, a nastepnie dekantuje roztwór i przemywa zel buforem adsorpcyjnym.Zel umieszcza sie w kolumnie jonitowej i eluuje zwiekszajac stopniowo stezenie NaCl w buforze TRIS posiadajacym odczyn o -wartosci pH = 7,2 z 0,5 M do 1 M i 1,5 M. Wyciek zawierajacy lipo- proteine i antytrombine zateza sie droga ultrafil- tracji i nastepnie oczyszcza sie przez filtracje zelu na Sephadex-ie G 150. Identyfikacje i badania czystosci przeprowadza sie metodami immunolo¬ gicznymi i fizyko-chemicznymi.Przyklad VI. Przez zmieszanie 250 mg siar¬ czanu chondrytyny VI, 40 ml spolimeryzowanej 4Vo agarozy w postaci perelek i 1 g BrCN przy zachowaniu odczynu srodowiska o wartosci pH=ll otrzymuje sie zel siarczanu chondrytyno-agarozy.Mieszanine pozostawia sie w ciagu 7 minut utrzy¬ mujac te wartosc pH przez dodawanie w sposób ciagly roztworu NaOH.Potrzeba do tego bardzo malych ilosci wodoro¬ tlenku. Po uplywie 7 minut wartosc pH ostroznie nastawia sie na 8,5 przez dodanie kwasu cytryno¬ wego.Mieszanie przy odczynie mieszaniny o wartosci pH=8,5 kontynuuje sie do nastepnego dnia, a na¬ stepnie zel przemywa. Zel stosuje sie do wypelnia¬ nia kolumny i w warunkach takich samych jak okreslono powyzej przepuszcza przez kolumne 3 ml normalnej plazmy, rozcienczonej w stosunku 1 :1. Nastepnie stosujac taki sam bufor elucyjny, jak okreslony jest w przykladzie, mozna z zelu wyeluowac antytrombine. PL PL

Claims (4)

1. Zastrzezenia patentowe 1. Sposób wyodrebniania antytrombiny z plazmy krwi, znamienny tym, ze w charakterze adsorben- ta stosuje sie weglowodan podstawiony grupami siarczanowymi

2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie zawierajacy grupy siarczanowe weglo¬ wodan, polaczony mostkiem sieciujacym z sub¬ stancja podloza lub przeprowadzony w nierozpu¬ szczalna postac innymi sposobami

3. Sposób wedlug zastrz. 2, znamienny tym, ze w charakterze adsorbenta stosuje sie polisacharyd zawierajacy grupy siarczanowe.

4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny tym, ze jako adsorbenty stosuje sie sieciowane bromkiem cyjanu polisacharydy zawierajace grupy siarcza¬ nowe, takie jak siarczan dekstranu, dekstrano- -agaroza lub heparyno-agaroza. 10 15 20 2583 490 Errata Lam 6, 12 wiersz od góry Jest: przykladzie Powinno byc: przykladzie I Druk. Nar. Z.-3, zam. 1974/76 Cena 10 zl PL PL