DE1907738A1

DE1907738A1 - Verfahren zur Abtrennung des Trypsin-Plasmin-Inhibitors vom Thrombin-Inhibitor in handelsueblichen Hirudinpraeparaten und in Hirudinrohpraeparaten

Info

Publication number: DE1907738A1
Application number: DE19691907738
Authority: DE
Inventors: Dr Hans Fritz; Dr Dr Eugen Werle
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1969-02-15
Filing date: 1969-02-15
Publication date: 1970-08-13

Description

Verfahren zur Abtrennung des Trypsin-Plasmin-Inhibitors vom Thrombin-Inhibitor in handelsüblichen Hirudinpräparaten und in Hirudinrohprparaten Hirudin ist ein wasserlöslicher Extrakt aus Kopf- und Schlundring von Blutegeln. Nach Markwardt tnoppe-Seylers Z. physiol. Ch., Bd. 508 (1957), Seiten 147 bis 1567 ist Hirudin ein Protein mit relativ niederem Molekulargewicht.
Hirudin bildet eine Verbindung mit Thrombin, wodurch dessen katalytische Wirkung erlischt. Hirlldin ist also ein Thrombin-Inhibitor.
Nach R. Zwilling /Hoppe Seylers Z. physiol. Ch., Bd.
(1968), Seite 17877 hemmt Hirudin nicht nur Thrombin, sondern auch Trypsin und trypsinähnliche Proteasen.
Tatsächlich konnte bestätigt werden, daß handelsübliche Hirudinpräparate nicht nur Thrombin-Inhibitorwirkung, sondern außerdem Trypsin-Plasmin-Inhibitorwirkung besitzen.
Die Ansicht von R. Zwilling ts. o.7, daß alle diese.Inhibitorwirkungen dem Hirudin selbst zukommen, trifft nicht zu.
Überraschenderweise wurde nämlich gefunden, daß man den Trypsin-Plasmin-Inhibitor vom Thrombin-Inhibitor abtrennen und dadurch Hirudin als nur Thrombin hemmenden Inhibitor gewinnen kann, indem man handelsübliche Hirudinpräparate und Hirudinrohpräparate an sich bekannten Trennungsverfahren unterwirft.
Unter "Hirudinrohpräparate" werden hier wäßrige Extrakte aus Kopf- und Schlundring von Blutgeln verstanden.
Ein geeignetes Trennungsverfahren ist z. B. die Gelfiltration über dreidimensional vernetztem Polysaccharid (z. B.
SEPHADEX , eingetragenes Warenzeichen der Aktiebolaget Pharmacia. Uppsala, Schweden), bei der der eigentliche Thrombin-Hemmstoff Hirudin zuerst eluiert wird.
Ein weiteres hier infrage kommendes Trennungsverfahren ist die Einwirkung von wasserunlöslichem Trypsinharz oder Chymotrypsinharz oder Plasminharz auf das Inhibitorgemisch in neutralen Salzlösungen, bei der nur die Trypsin-Plasmin-Inhibitoren komplex gebunden werden, während der Thrombin Inhibitor in Lösung bleibt.
Das erfindungsgemäß erhältliche reine, d. h. Trypsin-Plasmin-Tnhibitor-freie, Hirudin soll als Arzneimittel verwendet werden. Gegenüber den handelsüblichen Hirudinpräparaten hat es den Vorteil, frei von den Wirkungen des Trypsin-Plasmin-Inhibitors zu sein, welche bei den Indikationen des Hirudins unerwünscht sind.
Auch der erfindungsgemäß erhältliche Thrombin-lnhibitor-freie Trypsin-Plasmin-Inhibitor soll als Arzneimittel verwendet werden.
Beispiel: Reagentien und Methoden: Trypure- -Nqvo (vom. Rind, kalziumstabilisiert) und Plasmin Novo (vom Schwein, stabilisiert mit -L--Lysin)-, Novo Industrie; Test-Thrombin, Behringswerke; Kallikrein aus Schweinepankreas. Mit Hilfe des Substrates N-Benzoyl-DL-arginin-p-nitroanilin (BAPNA) wurde die Hemmung der amidspaltenden Aktivitäten von Trypsin, Plasmin und Thrombin bestimmt, mit Hilfe von N-Benzoyl-argininäthylester die Hemmung der esterolytischen Aktivitäten von Kallikrein, Plasmin und Thrombin.
Substrat BAPNA: Die Aktivitäts- und Hemmtest wurden nach der für Trypein beschriebenen Methodik durchgeführt (1 µg Trypsin entspricht- ca. 1 mU), wobei fUr die Plasminbestimmung dem 0,2 M Triäthanolaminpuffer, pH 7,8, statt Kalziumchlorid L-Lysin (0,05 M) -zugesetzt wurde; 2 Novo-Einheiten Plasmin entsprechen dabei ca. 8 mU (Meßzeit: 10 Minuten). Zur Thrombinbestimmung wurde 0,1 M Triäthanolaminpuffer, pH 8,4, verwendet; -das- Test-Throinbin wurde in demselben Puffer gelöst; 40 NIH-Einheiten entsprechen etwa 0,4 mU (Meßzeit: 30 Minuten). 1 mU entspricht der Extinktionsänderung #E405nm von 0,00332 pro Minute; 1 mIU der Verminderung der Extinlctionsänderung um denselben Betrag. Hemmansätze, bei denen die vorgelegte Enzymaktivität um mehr als 50 % vermindert war, wurden bei entsprechend geringerem Inhibitorzusatz wiederholt.
Substrat BARE: Die Aktivitäts- und Hemmtests wurden nach der für das Kallikrein beschriebenen Methodik durchgeführt. 1 mU entspricht der Extinktionsänderung #E366nm von 0,0011; 1 mIU der Verminderung der Extinktionsänderung um denselben Betrag. Es wurden nur solche Hemmansätze ausgewertet bei denen die vorgelegte Enzymaktivität zu 15 bis 25 % vermindert war; bei höheren Hemmgraden wurde der Test mit entsprechend geringerem Inhibitorzusatz wiederholt.
Das Verhältnis, mit dem die Aktivitäten von Trypsin, Plasmin und Thrombin durch die käuflichen Hirudinpräparate gehemmt werden, beträgt - bezogen auf den Gehalt an mIU für Trypsin (Substrat: BAPNA) - 1 : - 0,08 : 0,004 (Substrat:-BAPNA) bzw. 1 : 2,5 : 2,6 (Substrat: BAEE). Wir berechneten daraus, daß 1 mg der Hirudinpräparate die Aktivität von 1 mg Trypsin oder 50 (Substrat: BAEE) bzw. 200 Novo-Einheiten (Substrat: BAPMA) Plasmin und 26C NIH-Einheiten Thrombin (Substrat: BAEE) zu hemmen vermag. Die proteolytische Aktivität des Plasmins wird danach deutlich stärker gehemmt als seine esterolytische.
Nach den in der Figur dargestellten Ergebnissen liegt in den Hirudinpräparaten ein Gemisch von Inhibitoren vor. Der eingentliche Thrombinhemmstoff Hirudin wird bei der Gelfiltration über SEPHADEX-G-50 zuerst eluiert. In den folgenden Fraktionen verläuft die Plasminhemmung weitgehend parallel zur Trypsinhemmung, wobei zwei nahe beieinander liegende Maxima zu erkennen sind. Es ist deshalb die Annahme berechtigt, daß die Hirudinpräparate außer dem Thrombinhemmstoff noch weitere Trypsin-Plasmin-Inhibitoren enthalten, deren Molekulargewicht unter 9060 (Thrombinhemmstoff) liegt. Durch Rechromatographie unter denselben Bedingungen konnte die Trypsin-Plasmin-hemmende Fraktion quantitativ vom Thrombinhemmstoff abgetrennt werden.
Bei der Einwirkung von wasserunlöslichem Trypsinharz auf das Inhibitorgemisch in neutralen Salzlösungen werden nur die Trypsin-Plasmin-Inhibitoren komplex gebunden, während der Thrombin-Inhibitor in Lösung bleibt. Die nach Dissoziation des wasserunlöslichen Komplexes erhaltene Inhlbitorlösung hemmt die Aktivitäten Xon Trypsin und Plasmin in demselben Verhältnis wie die Lösungen der Ausgangspräparate. Da die plasminhemmende Wirkung demnach an die.trypsinhemmende gebunden ist, kann das Vorliegen von spezifischen Trypsin- und Plasmin-Inhibitoren in den Hirudinpräparaten ausgeschlossen werden.
Die Figur zeigt die Fraktionierung von Hirudin (270 NIH-Einheiten pro mg) über SEPHADEX-G-50: 50 mg des Präparates wurden, in wenig Puffer gelöst, auf die mit Salz-Pufferlösung (0,1 M NaCl und 0,05 M Triäthanolamin, pH 8) äquilibrierte SEPHADEX-G-50-Säule (2,5 x 132 cm) aufgetragen. Die Fraktionierung erfolgte in 7 ml Portionen bei einer Elutionsgeschwindigkeit von 0,7 ml pro Minute.
In der Figur bedeuten: Abszisse: ml Eluat, gesammelt ab Beginn der Auftragung.
Linke Ordinate: mIU für Thrombin (Substrat: BAEE) Rechte Ordinate: mIU für Plasmin (Substrat: BAER) und Trypsin (Substrat: BAPNA). (Zur Berechnung der mIU vgl. Text).

Claims

Patentansprüche

1. - Verfahren zur Abtrennung des Trypsin-Plasmin-Inhibitors vom Thrombin-Inhibitor in handelsüblichen Hirudinpräparaten und in Hirudinrohpräparaten, dadurch gekennzeichnet, daß man diese handelsüblichen Hirudinpräparate und Hirudinrohpräparate an sich bekannten Trennungsverfahren unterwirft.

2. Verfahren zur Gewinnung des reinen, nur Thrombin hemmenden Hirudins nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man handelsübliche Hirudinpräparate und Hirudinrohpräparate an sich bekannten Trennungsverfahren unterwirft.

3. Verfahren zur Gewinnung eines Thrombin-Inhibitorfreien Trypsin-Plasmin-Inhibitors nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man handelsübliche Hirudinpräparate und Hirudinrohpräparate an sich bekannten Trennungsverfahren unterwirft.