PL215520B1 - Sposób wytwarzania 4',5,6,7-tetrahydroksyflawanonu oraz 4',5,7,8-tetrahydroksyflawanonu - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania 4',5,6,7-tetrahydroksyflawanonu (kartamidyny), o wzorze 2, oraz 4',5,7,8-tetrahydroksyflawanonu (izo-kartamidyny), o wzorze 3, przedstawionych na rysunku.

Związki te wykazują wysoką aktywność przeciwutleniającą i mogą znaleźć zastosowanie w przemyśle spożywczym oraz farmaceutycznym.

Występują one w niewielkich ilościach między innymi w tarczycy bajkalskiej (Scutellaria baicalensis) [Horvath C. R., Martos P. A., Saxena P. K., 2005, Identification and quantification of eight flavones in root and shoot tissues of the medicinal plant Huang-qin (Scutellaria baicalensis Georgi) using high performance liquid chromatography with diode array and mass spectrometric detection, J. Chromatogr. A, 1062, s 199-207].

Związek 4',5,7,8-tetrahydroksyflawanon został wyizolowany z gatunku Parinari anamense przy użyciu rozpuszczalników organicznych. Wydajność izolowana była bardzo niska - z 4800 g materiału roślinnego wyizolowano 25 mg czystego związku [Werawattanachai N., Kaewamatawong R. (2010) Chemical constituents from Parinari anamense. Biochem. Syst. Ecol. 38, s. 836-838].

Związki te otrzymywano także na drodze chemicznej, poprzez izomeryzację syntetycznego 2',3',4,4',6'-pentahydroksychalkonu [Obara H., Onodera J.I., Kurihara Y.J., Yamamoto F., (1978) Synthesis of 2',3',4,4',6'-pentahydroxychalcone, an aglycone of carheamin, and its isomerization into 4',5,6,7- and 4',5,7,8-tetrahydroxyflavanone, carthamidin and isocarthamidin. Bull. Chem. Soc. Jpn. 51, s. 3627-3630].

Znany jest również sposób ich otrzymywania na drodze transformacji naringiny w hodowli grzybów Aspergillus saitoi [Miyake Y, Minato K, Fukumoto S, Yamamoto K, Oya-Ito T, Kawakishi S, Osawa T (2003) New potent antioxidative hydroxyflavanones produced with Aspergillus saitoi from flavanone glycoside in citrus fruit. Biosci. Biotech. Biochem. 67, s. 1443-1450].

Opisano także proces otrzymywania 4',5,6,7-trahydroksyflawanonu oraz 4‘,5,7,8-tetrahydroksyflawanonu na drodze mikrobiologicznej transformacji naringeniny w hodowli grzybów Aspergillus niger [Xu J., Yang L., Zhao S., Wang Z., Hu B., An efficient way from naringenin to carthamidine and isocarthamidine by Aspergillus niger, World Journal of Microbiology and Biotechnology. DOI 10.1007, /s.11274-011-0934-9].

Wynalazek dotyczy mikrobiologicznego sposobu wytwarzania 4',5,6,7-tetrahydroksyflawanonu (kartamidyny), o wzorze 2, oraz 4',5,7,8-tetrahydroksyflawanonu, o wzorze 3, z substratu, którym jest naringenina, o wzorze 1.

Istota wynalazku polega na tym, że do hodowli drożdży z gatunku Rhodotorula marina, namnożonej na podłożu mikrobiologicznym w temperaturze 292-305 K, dodaje się substrat. Po zakończeniu transformacji mieszaninę reakcyjną ekstrahuje się znanym sposobem octanem etylu.

Korzystnie jest, gdy substrat dodaje się w stężeniu 300 mg/L.

Korzystnie też jest, gdy proces prowadzi się w temperaturze 299-302 K, w świetle dziennym oraz w czasie 10-12 godzin.

Postępując zgodnie z wynalazkiem, w wyniku działania układu enzymatycznego zawartego w żywych komórkach kultury Rhodotorula marina, następuje reakcja hydroksylacji w pozycji 6 lub 8 naringeniny.

Zasadniczą zaletą wynalazku jest możliwość otrzymania, w łagodnych warunkach mieszaniny 4',5,6,7-tetrahydroksyflawanonu oraz 4',5,7,8-tetrahydroksyflawanonu w stosunku 1:8, jako głównych produktów reakcji z wydajnością 51,3%. Proces trwa o 14 godzin krócej, sumaryczny stopień konwersji substratu jest wyższy a wyjściowe stężenie naringeniny jest sześciokrotnie wyższe, w porównaniu z doniesieniami literaturowymi.

Ponadto drożdże (Rhodotorula marina) łatwiej jest hodować w większej skali, w bioreaktorach, niż grzyby strzępkowe (Aspergillus niger).

Wynalazek jest bliżej objaśniony w przykładzie.

P r z y k ł a d. Do kolby o pojemności 300 cm³, w której znajduje się 100 cm³ sterylnej pożywki zawierającej 3 g glukozy i 1 g aminobaku, wprowadza się grzyby Rhodotorula marina. Po 3 dniach wzrostu drobnoustrojów w temperaturze 299-302 K i przy ciągłym wstrząsaniu, dodaje się 30 mg na₃ ringeniny, o wzorze 1, rozpuszczonej w 0,5 cm³ metanolu. Transformację prowadzi się przy ciągłym wstrząsaniu przez 10 godzin, w świetle dziennym. Następnie, uzyskany roztwór transformacyjny ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu, osusza siarczanem sodu i odparowuje rozpuszczalnik. OtrzymuPL 215 520 B1 je się 40 mg surowego produktu, który oczyszcza się chromatograficznie, używając jako eluentu mieszaniny chloroform - metanol w stosunku 8:2.

Na tej drodze otrzymuje się 15,4 mg mieszaniny produktów w stosunku: 4',5,6,7-tetrahydroksyflawanon 4',5,7,8-tetrahydroksyflawanon - 1:8, z wydajnością 51,3%.

Stopień konwersji substratu do produktów wynosi 0,85 mg/mg naringeniny (według HPLC). Uzyskane produkty charakteryzują się następującymi danymi spektralnymi: 4‘,5,6,7-tetrahydroksyflawanon (kartamidyna) ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 2,65 (dd, 1H, J = 17,1; 3,0 Hz, H-3eq);

3,22 (dd, 1H, J = 17,1; 12,3 Hz, H-3ax); 5,36 (dd, 1H, J= 12,8; 2,9 Hz, H-2);

5,94 (s, 1H, H-8); 6,79 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H-3', 5'); 7,31 (d, 2H, J = 8,6 Hz, H-2',6');

8,11 (s, 1H, 7-OH); 9,57(s, 1H, 4'-OH); 10,42 (s, 1H, 6-OH);

11,98 (s, 1H, 5-OH).

¹³C NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 42,32 (C-3); 78,50 (C-2); 94,73 (C-8),

101,71 (C-10); 115,16 (C-3', 5'); 126,32 (C-6); 128,30 (C-2', 6'); 129,19 (C-1');

150,19 (C-9); 155,27 (C-5); 155,77 (C-7); 157,65 (C-4'); 196,66 (C-4).

4',5,7,8-tetrahydroksyflawanon (izokartamidyna) ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ (ppm): 2,71 (dd, 1H, J = 17,1; 3,1 Hz, H-3eq);

3,22 (dd, 1H, J = 17,1; 12,3 Hz, H-3ax); 5,42 (dd, 1H, J = 12,3; 2,9 Hz, H-2);

5,93 (s, 1H, H-6); 6,79 (d, 2H, J = 8,5 Hz, H-3', 5^'); 7,35 (d, 2H, J = 8,5 Hz,

H-2', 6'); 8,11 (s, 1H, 7-OH); 9,57 (s, 1H, 4'-OH); 10,42 (s, 1H, 8-OH);

11,75 (s, 1H, 5-OH).

¹³C NMR (DMSO-d6) δ (ppm): 42,28 (C-3); 78,50 (C-2); 95,44 (C-6), 101,71 (C-10); 115,12 (C-3', 5'); 125,61 (C-8); 128,40 (C-2', 6'); 129,19 (C-1');

149,41 (C-9); 156,51 (C-5); 155,81 (C-7); 157,65 (C-4'); 196,62 (C-4).

Claims (5)

1. Sposób wytwarzania 4',5,6,7-tetrahydroksyflawanonu, o wzorze 2 i 4',5,7,8-tetra-hydroksyflawanonu, o wzorze 3, na drodze mikrobiologicznej hydroksylacji w pozycji 6 lub 8 w substracie, którym jest naringenina, o wzorze 1, znamienny tym, że do hodowli drożdży z gatunku Rhodotorula marina, namnożonej na podłożu mikrobiologicznym w temperaturze 292-305 K, dodaje się substrat, po czym po zakończeniu transformacji mieszaninę reakcyjną ekstrahuje się znanym sposobem octanem etylu.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że substrat dodaje się w stężeniu 300 mg/L.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w temperaturze 299-302 K.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w świetle dziennym.

5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że proces prowadzi się w czasie 10-12 godzin.