PL212113B1 - Wariant polipeptydu, kompozycja zawierająca wariant tego polipeptydu, sposób rozkładu lub modyfikowania roślinnej ściany komórkowej, sposób obróbki materiału roślinnego, sekwencja nukleotydowa, konstrukt zawierający tą sekwencję nukleotydową i zastosowania wariantu polipeptydu - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest wariant polipeptydu, kompozycja zawierająca wariant tego polipeptydu, sposób rozkładu lub modyfikowania roślinnej ściany komórkowej, sposób obróbki materiału roślinnego, sekwencja nukleotydowa, konstrukt zawierający tą sekwencję nukleotydową i zastosowania wariantu polipeptydu.

Wariant polipeptydu ma aktywność enzymów ksylanazy o zmienionej wrażliwości na inhibitory ksylanazy.

Tło wynalazku

Przez wiele lat, endo-β-1,4-ksylanazy (EC 3.2.1.8) (przytaczane w niniejszym opisie jako ksylanazy) stosowano do modyfikacji węglowodanów złożonych pochodzących ze ściany komórkowej materiału roślinnego. Dobrze wiadomo w stanie techniki, że funkcjonalność różnych ksylanaz (pochodzących od różnych drobnoustrojów lub roślin) jest bardzo różna.

Przeprowadzono szerokie badania charakteryzujące funkcjonalność kasylanaz, na dobrze scharakteryzowanych i czystych substratach (Kormelink i inni, 1992). Badania te ukazują, że różne ksylanazy mają różne specyficzne wymagania odnośnie podstawienia szkieletu ksylozowego arabinoksylanu (AX). Niektóre ksylanazy wymagają trzech niepodstawionych reszt ksylozowych do hydrolizowania szkieletu ksylozowego; inne wymagają tylko jednej lub dwóch. Jako powód tych różnic specyficzności, uważa się trójwymiarową strukturę ksylanazy, czyli sekwencję aminokwasową. Jednak przełożenie tych różnic w sekwencji aminokwasowej na różnice funkcjonalności ksylanaz, gdy ksylanaza działa w złożonym środowisku takim jak materiał roślinny nie została udokumentowana aż do dzisiaj.

Substraty ksylanazy znajdujące się w pszenicy (mące pszennej), tradycyjnie dzieli się dwie frakcje: AX nie możliwą do ekstrakcji wodą (WU-AX) oraz AX możliwą do ekstrakcji wodą (WE-AX). Stosunek WU-AX:WE-AX w mące pszennej wynosi w przybliżeniu 70:30. Istnieją liczne wytłumaczenia, dlaczego istnieją dwie różne frakcje AX. Starsza literatura (D'Appolonia i MacArthur (1976) oraz Montgomery i Smith (1955)) opisuje całkiem duże różnice stopnia podstawienia między WE-AX i WU-AX. Najwyższy stopień podstawienia znaleziono w WE-ΑΧ. Wykorzystano go przy tłumaczeniu, dlaczego niektóre z AX są możliwe do ekstrakcji. Wysoki stopień podstawienia czyni polimer rozpuszczalnym w porównaniu z niższym stopniem podstawienia, który powodowałby wytworzenie wiązania wodorowego między polimerami i w konsekwencji wytrącenie.

Uważa się, że różnica między funkcjonalnością różnych ksylanaz jest spowodowana różnicami specyficzności ksylanazy, a przez to ich preferencji wobec substratów WU- AX lub WE-AX.

W pewnych zastosowaniach (np. piekarnictwie) pożądane jest wytwarzanie rozpuszczalnych polimerów o wysokim ciężarze cząsteczkowym (HMW) z frakcji WU-AX. Takie polimery koreluje się ze zwiększaniem objętości przy robieniu chleba (Rouau, 1993; Rouau i inni, 1994 i Courtin i inni, 1999).

W innych zastosowaniach, pożądana jest modyfikacja WU-AX HMW, obniżając ciężar cząsteczkowy, redukując efekt hydrokoloidowy i skutkiem tego wiązanie wody w produkcie (suchary, oddzielanie mąki, itd.).

Te różne zastosowania wymagają różnej funkcjonalności ksylanaz stosowanych w pracy. Jak wymieniono powyżej, różnicę funkcjonalności tłumaczy się przez różną specyficzność substratowe ksylanaz.

Streszczenie wynalazku

Przeciwnie do wcześniejszych badań, wykazaliśmy obecnie, że przy określaniu funkcjonalności ksylanazy istotne są czynniki inne niż specyficzność substratowa ksylanaz określona na czystych, dobrze scharakteryzowanych substratach. Dane przedstawione w niniejszym opisie ukazują, że endogeniczne inhibitory ksylanazy narzucają funkcjonalność ksylanaz aktualnie stosowanych np. w układach mąki pszennej. Oznacza to, że ksylanaza, która normalnie modyfikuje WU-AX dając zwiększoną lepkość płynnego ciasta w układzie mąki pszennej, ma inną funkcjonalność jeśli brak jest endogenicznego inhibitora ksylanazy w mące pszennej. Tak więc, spostrzeżenia te wskazują, że plan i zastosowanie nieinhibitowanych ksylanaz, np. przy użyciu miejscowo skierowanej mutagenezy, mogłoby być sposobem do naśladowania braku inhibitorów ksylanazy w różnych materiałach roślinnych, dając nowym ksylanazom całkowicie nową funkcjonalność. Takie ksylanazy byłyby bardzo skuteczne w zastosowaniach, w których konieczne jest zmniejszenie lepkości. Nieinhibitowane ksylanazy działałyby szybko na AX i podlegały w pierwszym rzędzie raczej wpływowi swej specyficznej aktywności, niż endogenicznym inhibitorom. Z naszych badań wynika, że wpływ inhibitorowy jest prawdopodobnie

PL 212 113 B1 daleko bardziej istotny niż specyficzna aktywność. W rzeczywistości, niniejsze wyniki pokazują po raz pierwszy, że istnieje 10-50-krotna różnica poziomu inhibicji wśród ksylanaz rodziny 11.

Ponadto, zaplanowano i przetestowano szereg ksylanaz modyfikowanych przez miejscowo skierowaną mutagenezę, aby wykazać, że mogą być wytwarzane ksylanazy, które posiadają zmniejszoną wrażliwość wobec inhibitorów ksylanazy obecnych w materiale roślinnym. W szczególności, zidentyfikowano liczne reszty w ksylanazach rodziny 11, które wpływają na stopień inhibicji ksylanazy.

Tak więc będzie możliwe wytworzenie wariantów ksylanaz mających zmniejszoną wrażliwość wobec inhibitorów ksylanazowych, a przez to zmienioną funkcjonalność. Pozwoli to np. na zmniejszenie ilości ksylanazy koniecznej w wielu zastosowaniach, takich jak pasze zwierzęce, produkcja skrobi, piekarnictwo, oddzielanie mąki (mielenie na mokro) oraz wytwarzanie papieru i miazgi.

W związku z tym, niniejszy wynalazek opisuje wariant polipeptydu ksylanazy lub jego fragment, mający aktywność ksylanazy, obejmujący jedną lub więcej modyfikacji aminokwasowych takich, że polipeptyd lub jego fragment ma zmienioną wrażliwość wobec inhibitora ksylanazy, w porównaniu z enzymem pierwotnym.

Przedmiotem wynalazku jest wariant polipeptydu lub jego fragment posiadający aktywność ksylanazy zawierający mutację wybraną spośród: D11Y, D11F, D11K, D11F/R122D i D11F/G34D w odniesieniu do sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1, lub równoważnej(ych) pozycji(ach) w innych ksylanazach rodziny 11 tak, że wariant polipeptydu lub jego fragmentu ma zredukowaną wrażliwość na inhibitor ksylanazy w porównaniu z polipeptydem o sekwencji aminokwasowej ukazanej jako SEQ ID Nr 1.

W korzystnym wykonaniu polipeptydu według wynalazku zawiera on mutację D11F.

W bardziej korzystnym rozwiązaniu wariant polipeptydu zawiera mutację D11F/R122D.

Według wynalazku, korzystnie wspomnianym inhibitorem jest inhibitor naturalnie znajdujący się w tkankach roślinnych.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja, charakteryzująca się tym, że zawiera wariant polipeptydu zdefiniowanego powyżej.

Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób rozkładu lub modyfikowania roślinnej ściany komórkowej, polegający na tym, że kontaktuje się wspomnianą roślinną ścianę komórkową z polipeptydem zdefiniowanym powyżej lub z kompozycją według wynalazku zawierająca ten polipeptyd.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób obróbki materiału roślinnego, polegający na tym, że kontaktuje się ten materiał roślinny z polipeptydem według wynalazku zdefiniowanym powyżej lub z kompozycją według wynalazku zawierająca ten polipeptyd.

Przedmiotem wynalazku jest również sekwencja nukleotydowa, charakteryzująca się tym, że koduje wariant polipeptydu według wynalazku jak zdefiniowano powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest także konstrukt, który zawiera sekwencję nukleotydową zdefiniowaną powyżej.

Przedmiotem wynalazku jest także zastosowanie wariantu polipeptydu według wynalazku zdefiniowanego powyżej w sposobie modyfikowania materiału roślinnego.

Następnie, przedmiotem wynalazku jest zastosowanie wariantu polipeptydu według wynalazku zdefiniowanego powyżej w jednym lub więcej spośród: pieczenia, pasz dla zwierząt, wytwarzania skrobi, oddzielania mąki (mielenie na mokro) oraz wytwarzania papieru i miazgi drzewnej.

Wynalazek dotyczy również zastosowania wariantu polipeptydu zdefiniowanego powyżej w jednym lub więcej spośród: obróbki zbóż, w obróbce drewna i we wzmacnianiu procesu bielenia miazgi drzewnej.

Tutaj, „enzym macierzysty” oznacza enzym ksylanazę, z którego otrzymuje się lub można otrzymać wariant enzymu ksylanazy. Jeśli chodzi o określenie „dający się otrzymać”, wariant nie koniecznie pochodzi od enzymu pierwotnego. Zamiast tego, wariant można otrzymać np. przez stosowanie technik rekombinacji DNA, które wykorzystują sekwencję (sekwencje) nukleotydową kodującą wymieniony wariant sekwencji ksylanazy, czyli tutaj sekwencja (sekwencje) nukleotydowa jest podobna do zmutowanej (zmutowanych) sekwencji nukleotydowej, lecz nie są one wytworzone przez mutację macierzystej sekwencji nukleotydowej (nukleotydowych). Wariant można nawet wytworzyć przez chemiczną modyfikację enzymu macierzystego.

Dla pewnych postaci realizacji, enzymem macierzystym jest enzym dzikiego typu. Określenie „dzikiego typu” jest terminem technicznym rozumianym przez fachowców i obejmuje fenotyp, który jest charakterystyczny dla większości członków rodzajów występujących naturalnie i kontrastujących fenotypem mutanta. Tak więc, w niniejszym kontekście, enzym typu dzikiego może oznaczać postać

PL 212 113 B1 enzymu naturalnie występującego w większości istotnych rodzajów. Generalnie, istotny enzym dzikiego typu w stosunku do wariantów polipeptydów według wynalazku, oznacza najściślej spokrewniony odpowiadający enzym dzikiego typu, w kategoriach homologii sekwencji. Przykładowo, dla poszczególnych zmutowanych ksylanaz opisanych w przykładach, odpowiadającą ksylanazą A dzikiego typu B.subtilis, konkretniej dzikiego typu ksylanazą A B.subtilis opisaną przez Paice i innych, 1986 i pokazaną jako SEQ ID 1. Jednakże, jeśli poszczególną sekwencję dzikiego typu użyto jako podstawę do wytworzenia wariantu polipeptydu według wynalazku, będzie to odpowiadająca sekwencja dzikiego typu, bez względu na istnienie innej sekwencji dzikiego typu, która jest ściślej spokrewniona w kategoriach homologii sekwencji aminokwasowej.

Dla pewnych postaci realizacji, wariant polipeptydu korzystnie pochodzi od ksylanazy z rodziny 11.

Jednym z naszych zaskakujących spostrzeżeń jest to, że jak dotąd w naszych badaniach, mutacja w miejscu aktywnym ksylanazy nie ma mierzalnego wpływu na inhibicję przeciwko inhibitorowi ksylanazy. Jest to bezpośrednie przeciwieństwo w stosunku do mutacji, które są wykonywane poza miejscem aktywnym - które to mutacje są omówione poniżej bardziej szczegółowo.

W zalecanym aspekcie, modyfikacją aminokwasową jest modyfikacja jednej lub więcej powierzchniowych reszt aminokwasowych.

W bardziej zalecanym aspekcie, modyfikacją aminokwasową jest modyfikacja jednej lub więcej reszt dostępnych dla rozpuszczalnika. Tutaj, rozpuszczalnikiem jest woda.

W bardziej zalecanym aspekcie, modyfikacją aminokwasową jest modyfikacja jednej lub więcej reszt powierzchniowych poza miejscem aktywnym.

W bardzo zalecanym aspekcie, modyfikacją aminokwasową jest modyfikacja jednej lub więcej reszt powierzchniowych poza miejscem aktywnym i która jest/są dostępne dla rozpuszczalnika co najmniej w 8%. Tutaj, rozpuszczalnikiem jest woda.

W bardzo zalecanym aspekcie, modyfikacją aminokwasową jest modyfikacja jednej lub więcej reszt powierzchniowych poza miejscem aktywnym i która jest/są dostępne dla rozpuszczalnika co najmniej w 10%. Tutaj, rozpuszczalnikiem jest woda.

Dostępność dla rozpuszczalnika można określić przy użyciu Swiss-Pdb Viewer (wersja 3,5b1), którą można zlokalizować przez internet na stronie http:///www.expasy.ch/spdbv/mainpage.html. Swiss-Pdb Viewer jest prezentowana przez Glaxo Wellcome Experimental Research.

Aminokwasy powierzchniowe enzymów ksylanazowych może określać fachowiec.

Przykładowo, sekwencja aminokwasowa ksylanazy A B.subtilis, jest pokazana jako SEQ ID/nr 1. Pod względem tej sekwencji, reszty aminokwasów powierzchniowych to:

Ala1-Trp6, Asn8, Thr10-Gly23, Asn25, Ser27, Asn29, Ser31-Asn32, Gly34, Thr43-Thr44, Ser46-Thr50, Asn52, Asn54, Gly56-Asn61, Asn63, Arg73-Leu76, Thr87-Arg89, Thr91-Lys95, Thr97, Lys99, Asp101-Gly102, Thr104, Thr109-Thr111, Tyr113-Asn114, Asp119-Thr124, Thr126,

Gln133-Asn141, Thr143, Thr145, Thr147-Asn148, Asn151, Lys154-Gly157, Asn159-Leu160, Ser162-Trp164, Gln175, Ser177, Ser179, Asn181, Thr183, Trp185.

Jak zaznaczono, aminokwasy powierzchniowe enzymów ksylanazowych (takich jak ksylanaza A Thermomyces lanuginosus, którego kodująca sekwencja nukleotydowa jest przedstawiona jako SEQ ID nr 9) są możliwe do określenia przez fachowca.

Skutkiem tego, dla pewnych aspektów, niniejszy opis obejmuje wariant polipeptydu ksylanazy lub jego fragment mający aktywność ksylanazy, który to wariant polipeptydu ksylanazy lub fragment obejmuje jedną lub więcej modyfikacji aminokwasowych w którejkolwiek z reszt aminokwasowych:

Ala1-Trp6, Asn8, Thr10-Gly23, Asn25, Ser27, Asn29, Ser31-Asn32, Gly34, Thr43-Thr44, Ser46-Thr50, Asn52, Asn54, Gly56-Asn61, Asn63, Arg73-Leu76, Thr87-Arg89, Thr91-Lys95, Thr97, Lys99, Asp101-Gly102, Thr104, Thr109-Thr111, Tyr113-Asn114, Asp119-Thr124, Thr126,

Gln133-Asn141, Thr143, Thr145, Thr147-Asn148, Asn151, Lys154-Gly157, Asn159-Leu160, Ser162-Trp164, Gln175, Ser177, Ser179, Asn181, Thr183, Trp185 sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej/ich równoważnych pozycji w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych.

Tak więc w jednej postaci realizacji, niniejszy opis omawia wariant polipeptydu ksylanazy lub jego fragment mający aktywność ksylanazową, obejmujący jedną lub więcej modyfikacji aminokwasowych przy którejkolwiek reszcie aminokwasowej numer:

PL 212 113 B1

11, 12, 13, 15, 17, 29, 31, 32, 34, 113, 114, 119, 120, 121, 122, 123, 124 i 175 sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej równoważnych pozycji w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych.

W jednej postaci realizacji, niniejszy opis omawia wariant polipeptydu ksylanazy lub jego fragment mających aktywność ksylanazową, obejmujący jedną lub więcej modyfikacji aminokwasowych przy którejkolwiek reszcie aminokwasowej numer 11, 12 i 13 sekwencji aminokwasowej B. subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej równoważnych pozycji w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych.

Konkretne zalecane przykłady wykonywanych modyfikacji są przedstawione w niniejszym, w sekwencji przykładów.

Dla pewnych postaci realizacji, korzystnie wariant polipeptyd ksylanazowego lub jego fragment mający aktywność ksylanazy, obejmuje jedną lub więcej modyfikacji aminokwasowych przy jakiejkolwiek reszcie aminokwasowej numer: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 61, 62, 63, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 173, 174, 175, 176, 177, 178 sekwencji aminokwasowej B. subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej pozycjach równoważnych w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych.

Dla wygody, czasami przytaczamy reszty aminokwasowe numer: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 61, 62, 63, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 173, 174, 175, 176, 177, 178 jako „prążek 1.

Fig. 1 ukazuje strukturę 3-D ksylanazy B.subtilis, mającą sekwencję aminokwasową pokazaną jako SEQ ID nr 1. Prążek 1 jest opisany w fig. 1 jako górna warstwa cząsteczki i rozciąga się około 13 angstremów od góry cząsteczki, gdy cząsteczka jest zorientowana jak ukazano w fig. 1. Prążek 1 kończy się na reszcie Phe125 po lewej stronie patrząc na fig. 1 i na reszcie Asn61 po prawej stronie oglądając fig. 1.

Poza tym, albo alternatywnie dla pewnych postaci realizacji, korzystnie wariant polipeptydu ksylanazowego lub jego fragment mający aktywność ksylanazy, obejmuje jedną lub więcej modyfikacji aminokwasowych przy którejkolwiek innej reszcie aminokwasowej.

Korzystnie wymienione inne modyfikacje mogą występować przy którejkolwiek jednej lub więcej reszt aminokwasowych numer: 3, 4, 5, 6, 7, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 108, 109, 110, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167 , 168, 169, 170, 171, 172, 179, 180, 181, 182, 183 sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1, lub jej równoważnych pozycjach w innych homologicznych polipeptydach ksylanazy.

Dla wygody, czasem przytaczamy reszty aminokwasowe numer: 3, 4, 5, 6, 7, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 108, 109, 110, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 179, 180, 181, 182, 183 sekwencji aminokwasowej B.subtilis jako „prążek 2.

Korzystnie, wymienione inne modyfikacje mogą wystąpić przy którejkolwiek jednej lub więcej powierzchniowych reszt aminokwasowych numer: 3, 4, 5, 6, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 43, 44, 56, 57, 58, 59, 60, 73, 74, 75, 76, 87, 91, 92, 93, 94, 109, 110, 126, 159, 160, 162, 163, 164, 179, 181, 183 sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej równoważnych pozycjach w innych homologicznych polipeptydach ksylanazy.

Korzystnie, niniejszy opis obejmuje wariant polipeptydu ksylanazowego lub jego fragment mających aktywność ksylanazy, który obejmuje jedną lub więcej modyfikacji aminokwasowych w prążku 1 i ewentualnie/lub prążku 2 sekwencji aminokwasowej B.subtilis lub jej równoważnych pozycji (prążków) w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych. Skutkiem tego, modyfikacja występuje w co najmniej prążku 1; lecz może występować tylko w samym prążku 2.

Wariant polipeptydu ksylanazowego może obejmować inne modyfikacje w innych resztach aminokwasowych, takich jak modyfikacje przy którejkolwiek z reszt aminokwasowych: 1,2, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 144, 1465, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 184, 185 sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej równoważnych pozycjach w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych.

PL 212 113 B1

Wariant polipeptydu ksylanazowego może obejmować inne modyfikacje w innych resztach aminokwasów powierzchniowych: 1, 2, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 95, 97, 99, 101, 102, 104, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 143, 145, 147, 148, 151, 154, 155, 156, 157, 185 sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej równoważnych pozycjach w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych.

Korzystnie, inhibitorem jest inhibitor znajdujący się naturalnie w tkankach roślinnych. Korzystnie wrażliwość wariantu enzymu ksylanazowego wobec inhibitora jest mniejsza w porównaniu z pierwotnym enzymem ksylanazowym.

Niniejszy wynalazek dostarcza także cząsteczkę kwasu nukleinowego (sekwencję nukleotydową) kodującą polipeptyd według wynalazku. Dostarcza także wektor zawierający kwas nukleinowy opisany w wynalazku, ewentualnie operacyjnie połączony z sekwencją regulatorową zdolną do bezpośredniej ekspresji wymienionego kwasu nukleinowego, w odpowiedniej komórce gospodarza. Podaje się także komórkę gospodarza obejmującą kwas nukleinowy lub wektor opisany w wynalazku.

W innym aspekcie opis dostarcza sposób wytworzenia polipeptydu według wynalazku, obejmujący transformowanie komórki gospodarza kwasem nukleinowym kodującym wymieniony polipeptyd, hodowlę transformowanej komórki i ekspresję wymienionego polipeptydu.

Nasze wyniki pokazują, że te warianty polipeptydów mają ulepszone właściwości, które czynią je odpowiednimi dla wielu zastosowań, takich jak pieczywo, pasze zwierzęce wytwarzanie skrobi, oddzielanie mąki (mielenie na mokro) oraz wytwarzanie papieru i miazgi.

W związku z tym, niniejszy wynalazek podaje także zastosowanie wariantu polipeptydu według wynalazku i sposób modyfikowania materiałów roślinnych.

Podaje się także zastosowanie wariantu polipeptydu według wynalazku, w pieczeniu. Wynalazek dodatkowo podaje zastosowanie wariantu polieptydu według wynalazku przy obrabianiu zbóż, wytwarzaniu skrobi i pasz zwierzęcych oraz zastosowanie wariantu polipeptydu według wynalazku w obrabianiu drewna np. wzmacnianiu wybielania miazgi drzewnej.

W dodatkowym aspekcie, niniejszy opis podaje sposób zmieniania wrażliwości polipeptydu ksylanazowego wobec inhibitora, który to sposób obejmuje modyfikację jednej lub więcej reszt aminokwasowych wymienionego enzymu wybranej spośród aminokwasów numer: 11, 12, 13, 15, 17, 29, 31, 32, 34, 113, 114, 119, 120, 121, 122, 123, 124 i 175 na podstawie numeracji aminokwasów ksylanazy B. subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1 lub jej równoważnych reszt w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych. Korzystnie, wrażliwość jest zmniejszona.

Co istotne, nasze wyniki pokazują także, po raz pierwszy, że inhibitory ksylanazy odgrywają istotną rolę w określaniu funkcjonalności enzymów ksylanazowych w kompleksowym układzie, takim jak materiał roślinny. Przez określenie „funkcjonalność, rozumiemy właściwości biochemiczne ksylanazy w danym układzie. Właściwości te obejmują specyficzność substratową, parametry kinetyczne Km i Vmax (tam gdzie trzeba) oraz charakter produktów reakcji otrzymanych przez działanie ksylanazy w tym układzie. Funkcjonalność można także w konsekwencji opisać w kategoriach wpływu na właściwości fizyczne i/lub chemiczne materiału roślinnego, na który oddziałuje ksylanaza, np. rozmiar, do którego zmienia się lepkość materiału.

W taki sam sposób, w jaki można wykorzystywać warianty ksylanazy w różnych zastosowaniach przy obrabianiu, można wykorzystywać inhibitory ksylanazy w różnych zastosowaniach przy obrabianiu, takich jak pieczywo, obróbka miazgi drzewnej i obróbka zbóż.

Szczegółowy opis wynalazku

Chociaż ogólnie wszystkie techniki molekularne wymienione w niniejszym są dobrze znane w technice, można się odnieść w szczególności do Sambrook i inni, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) oraz Ausubel i inni, Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4-te wydanie, John Wiley & Sons, Inc.

A. Warianty polipeptydów ksylanazy

Enzymy ksylanazowe opisywano u blisko 100 różnych organizmów, łącznie z roślinami, grzybami i bakteriami. Enzymy ksylanazowe klasyfikuje się w kilka z ponad 40 rodzin enzymów glikozylohydrolaz.

Enzymy glikozylohydrolazowe, które obejmują ksylanazy, mannazy, amylazy, β-glukanazy, celulazy i inne karbohydrazy, klasyfikuje się na podstawie takich właściwości jak sekwencja aminokwasów, struktura trójwymiarowa i geometria miejsca katalitycznego (Gilkes i inni, 1991, Microbiol. Reviews 55: 303-315).

Szczególnie interesujące dla zastosowań w piekarnictwie są enzymy klasyfikowane w rodzinie 11. Wszystkie one są ksylanazami i są znane jako „ksylanazy rodziny 11. Niektóre publikacje przytaczają

PL 212 113 B1 je synonimowo jako ksylanazy rodziny G, lecz określenie „ksylanazy rodziny 11” będzie stosowane w niniejszym do określenia zarówno ksylanaz rodziny G jak i rodziny 11.

Tablica A wymienia kilka znanych ksylanaz z rodziny 11. Większość z nich ma ciężar cząsteczkowy wynoszący około 21000 Da. Trzy z ksylanaz rodziny 11 (Clostridium stercorarium XynA, Streptomyces Iividans XynB i Thermomonospora fusca XynA) mają wyższy ciężar cząsteczkowy wynoszący 31000 do 50000 Da. Jednakże te ksylanazy mają sekwencję rdzenia katalitycznego wynoszącą około 21000 Da podobnie jak inne ksylanazy rodziny 11. Sekwencje aminokwasowe ksylanaz rodziny 11 (lub dla większych enzymów, rdzeń katalityczny) wykazują wyższy stopień podobieństwa, zwykle wynoszący ponad 40% aminokwasów identycznych w prawidłowym uszeregowaniu aminokwasów. Ksylanazy rodziny 11, które pochodzą od bakterii, drożdży lub grzybów, dzielą tę samą ogólną strukturę cząsteczkową.

Fig. 22 ukazuje dane uszeregowania sekwencji aminokwasowej dla 51 ksylanaz rodziny 11.

T a b e l a A - Ksylanazy rodziny 11

Aspergillus niger Xyn A	Aspergillus kawachii Xyn C
Aspergillus tubigensis Xyn A	Bacillus circulans Xyn A
Bacillus pumilus Xyn A	Bacillus subtilis Xyn A
Cellulomonas fimi Xyn D	Chainia spp Xyn
Clostridium acetobutylicum Xyn B	Clostridium stercorarium Xyn A
Fibrobacter succinogenes Xyn C	Neocallimastix patriciarum Xyn A
Nocardiopsis dassonvillei Xyn II	Ruminococcus flacefaciens Xyn A
Streptomyces Iividans Xyn C	Streptomyces lividans Xyn B
Streptomyces thermoviolaceus Xyn II	Streptomyces sp. nr 36a Xyn
Trichoderma harzianum Xyn	Trichoderma reesei Xyn I
Trichoderma reesei Xyn II	T richoderma viride Xyn

Wariant ksylanazy według wynalazku

Wariant polipeptydu ksylanazy według wynalazku otrzymuje się zwykle przez modyfikację polipeptydu ksylanazowego, przez substytucję, delecję lub addycję jednej lub więcej reszt aminokwasowych wewnątrz sekwencji aminokwasowej polipeptydu ksylanazowego. Korzystnie, modyfikacje obejmują jedną lub dwie substytucje aminokwasowe. Modyfikacje sekwencji polipeptydowych można przeprowadzić przy użyciu standardowych technik, takich jak mutageneza skierowana miejscowo. Modyfikacja może także nastąpić w wyniku stosowania technik chemicznych, takich jak modyfikacja chemiczna jednej lub więcej reszt aminokwasowych.

Sekwencją wyjściową może być sekwencja dzikiego typu lub sekwencja nie występująca naturalnie, np. pochodna, którą poddano inżynierii białka. Modyfikowana sekwencja ksylanazy może pochodzić z jakiegokolwiek źródła, np. bakteryjnego, grzybowego lub roślinnego. Korzystnie, modyfikowana sekwencja ksylanazowa jest ksylanazą rodziny 11, korzystnie ksylanazą rodziny 11 wybraną spośród ksylanazy I Trichoderma reesei, ksylanazy II Trichoderma reesei, ksylanazy Trichoderma harzianum, ksylanazy Trichoderma viride, ksylanazy A Bacillus circulans, ksylanazy A Bacillus subtilis, ksylanazy A Aspergillus niger, ksylanazy C Aspergillus kawachii, ksylanazy A Aspergillus tubigensis, ksylanazy B Streptomyces Iividans i ksylanazy C Streptomyces Iividans.

W szczególnie zalecanej postaci realizacji, modyfikowaną sekwencją ksylanazy jest sekwencja ksylanazy B.substilis ukazana jako SEQ ID nr 1 lub jej homolog. Korzystnie wymieniony homolog ma co najmniej 40, 50, 60 lub 80% homologii przez co najmniej 50 lub 100 reszt aminokwasowych, jak określono przy użyciu pakietu GCG Wisconsin Bestfit (University of Wisconsin, USA; Devereux i inni, 1984, Nucleic Acids Research 12:387).

Specyficzne modyfikacje, które są zalecane zgodnie z niniejszym opisem obejmują jedną lub dwie substytucje w pozycjach 11, 12, 13, 15, 17, 29, 31, 34, 113, 114, 119, 120, 121, 122, 123, 124 i 175 na podstawie numerowania aminokwasów ksylanazy B.subtilis ukazanych jako SEQ ID nr 1 lub równoważnych reszt w innych homologicznych polipeptydach ksylanazy.

PL 212 113 B1

Szczególnie zalecane substytucje opisane tutaj obejmują jeden lub więcej D11Y, D11N, D11F, D11K, D11S, D11W, G12F, I15K, N17K, N17Y, N17D, N29K, N29Y, N29D, S31K, S31Y, S31D,

N32K, G34D, G34F, G34T, Y114A, Y113D, Y113K, N114A, N114D, N114F, N114K, Dl19§K, D119Y, D119N, G120K, G120D, G120F, G120Y, G120N, D121N, D121K, D121F, D121A, R122D, R122F, R122A, T123K, T123Y, T123D, T124K, T124Y, T124D, Q175E, Q175S i Q175L (w odniesieniu do sekwencji ksylanazy B.subtilis) lub ich równoważników w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych. Dodatkowe odniesienia do specyficznych reszt ksylanazy B.subtilis ukazanych jako SEQ ID nr 1 będą także obejmować ich równoważniki w innych homologicznych polipeptydach ksylanazowych.

Można przeprowadzić połączenia mutacji, np. mutacje przy dwóch lub więcej z wyżej wymienionych resztach. Przykłady takich połączeń są przedstawione w sekcji przykładów w niniejszym.

W dodatkowej postaci realizacji, warianty polipeptydów według wynalazku mogą być oczyszczonymi i wyizolowanymi zmutowanymi ksylanazami naturalnie występującymi. Alternatywnie, zmutowane ksylanazy można wytworzyć przez poddanie organizmów mutagenom, a następnie skriningowi pod względem szczegółów obejmujących mutacje w genach ksylanazowych. Naturalnie występujące mutanty i mutanty wytworzone przez losową mutagenezę można identyfikować/przesiewać stosując różne techniki, takie jak skrining PCR przy użyciu odpowiednich primerów kwasu nukleinowego, w celu powielenia regionów genów ksylanazy i sekwencjonowania otrzymanych fragmentów.

Tak więc warianty polipeptydów według wynalazku obejmują naturalnie występujące zmutowane ksylanazy (oczyszczone i wyizolowane z organizmów, w których one występują lub otrzymane rekombinacyjnie), zmutowane ksylanazy otrzymane przez losową mutagenezę oraz zmutowane ksylanazy otrzymane przez miejscowo skierowaną mutagenezę.

Warianty polipeptydów według wynalazku można także poddawać dodatkowym modyfikacjom, które niekoniecznie wpływają na wrażliwość wobec inhibitorów, włączając każdą substytucję, odmianę, modyfikację, zastąpienie, delecję lub addycję jednego (lub więcej) aminokwasów z sekwencji lub do sekwencji, zapewniając, że otrzymana sekwencja aminokwasowa zachowa aktywność ksylanazy, przy czym korzystnie posiada co najmniej zasadniczo taką samą aktywność ksylanazową jak sekwencja nie modyfikowana.

Można wykonywać substytucje konserwatywne, np. zgodnie z poniższą tabelą. Aminokwasy w tym samym bloku w drugiej kolumnie i korzystnie w tym samym wierszu i w trzeciej kolumnie, można podstawiać między sobą:

Alifatyczne	Nie polarne	G A P
I L V
Polarne - bez ładunku	C S T M
N Q
Polarne - naładowane	D E
K R
Aromatyczne		H F W Y

Polipeptydy według wynalazku obejmują także fragmenty sekwencji pełnej długości wymienionych powyżej, mających aktywność ksylanazy.

Polipeptydy według wynalazku mogą dodatkowo obejmować heterologiczne sekwencje aminokwasowe, zwykle przy końcu N lub końcu C, korzystnie końcu N. Sekwencje heterologiczne mogą obejmować sekwencje, które wpływają na nacelowywanie wewnątrz- lub zewnątrzkomórkowe (tak jak sekwencje liderowe).

Polipeptydy według wynalazku wykonuje się zwykle za pomocą rekombinacji, np. jak opisano poniżej. Jednak można je także wykonać za pomocą syntezy, przy użyciu technik dobrze znanych fachowcom, takim jak synteza w fazie stałej. Polipeptydy według wynalazku można także wytworzyć jako białka fuzyjne, np. aby pomóc w ekstrakcji i oczyszczaniu. Może być także wygodne wprowadzenie miejsca rozszczepienia między partnerem w białku fuzyjnym, a sekwencją interesującego białka, pozwalając na usunięcie sekwencji białka fuzyjnego, tak jak miejsce rozszczepienia trombinowego. Korzystnie, białko fuzyjne nie będzie przeszkadzać działaniu sekwencji interesującego białka.

PL 212 113 B1

Oczekuje się, że stosowanie komórek gospodarza zapewni takie modyfikacje potranslacyjne jakie mogą być potrzebne do nadania optymalnej aktywności biologicznej produktom rekombinacyjnej ekspresji według wynalazku.

Polipeptydy według wynalazku mogą występować w postaci zasadniczo wyizolowanej. Zrozumiałe będzie, że białko można wymieszać z nośnikami lub rozcieńczalnikami, które nie zakłócą zamierzonego celu białka i będzie ono wciąż postrzegane jako zasadniczo wyizolowane. Polipeptyd według wynalazku może także występować w postaci zasadniczo oczyszczonej, w którym to przypadku będzie ono generalnie obejmować białko w preparacie, w którym ponad 90%, np. 95%, 98% lub 99% białka w preparacie jest polipeptydem według wynalazku.

Warianty polipeptydów według wynalazku mają zmienioną wrażliwość wobec inhibitorów w porównaniu z pierwotną sekwencją ksylanazy, które mogą być odpowiadającą ksylanazą dzikiego typu. Korzystnie, warianty polipeptydów mają zmniejszoną wrażliwość wobec inhibitorów ksylanazowych. Określenie „zmieniona wrażliwość wobec inhibitorów ksylanazowych oznacza, że stopień, do którego inhibitowana jest aktywność endo-e-1,4-ksylanazowa wariantu polipeptydu według wynalazku, przez inhibitor ksylanazy, jest inna niż ta pierwotnego enzymu ksylanazowego, który może być białkiem dzikiego typu. Może to być spowodowane np. zmianą struktury trójwymiarowej wariantu polipeptydu tak, że inhibitor nie wiąże już z takim samym powinowactwem jak czyni to wobec pierwotnego enzymu ksylanazowego, który może być enzymem dzikiego typu.

Wrażliwość wariantów polipeptydów według wynalazku wobec inhibitorów ksylanazowych można testować przy użyciu np. testu opisanego w przykładzie 4 i poniżej. Odpowiednim inhibitorem do stosowania w teście jest inhibitor oczyszczony z mąki pszennej w przykładzie 1. Inne inhibitory są opisane poniżej.

Test ksylanazy (aktywność endo-β-1,4-ksylanazy)

Próbki ksylanazy rozcieńcza się w kwasie cytrynowym (0,1 M) - bufor wodorofosforanu disodowego (0,2 M), pH 5,0, aby otrzymać w przybliżeniu OD = 0,7 w końcowym teście. Trzy rozcieńczenia próbki i standardu wewnętrznego o określonej aktywności, utrzymuje się w stałej temperaturze 40°C przez 5 minut. O czasie = 5 minut, do roztworu enzymu dodaje się 1 tabletkę Xylanase (usieciowany, barwiony substrat ksylanowy). O czasie = 15 minut (lub w pewnych przypadkach dłużej, w zależności od aktywności ksylanazowej występującej w próbce), reakcję kończy się dodając 10 ml 2% TRIS. Mieszaninę reakcyjną wiruje się i mierzy OD supernatantu przy 590 nm. Biorąc pod uwagę rozcieńczenia i ilość ksylanazy, można obliczyć aktywność próbki (TXU, Total-Xylanase-Units), w stosunku do standardu.

Inhibitory ksylanazy

Jak stosuje się w niniejszym, określenie „inhibitor ksylanazy odnosi się do związku, zwykle białka, którego rolą jest kontrola depolimeryzacji złożonych węglowodanów, takich jak arabinoksylan, znajdujących się w ścianie komórkowej roślin. Te inhibitory ksylanazowe są zdolne do redukcji aktywności naturalnie występujących enzymów ksylanazowych, jak również tych pochodzenia grzybowego, czy bakteryjnego. Chociaż obecność inhibitorów ksylanazy opisywano w nasionach zbóż (patrz np. McLauchlan i inni 1999a; Rouau i Suget 1998) ich wpływ na skuteczność enzymów ksylanazowych nie został szeroko zbadany.

McLauchlan i inni 1999a ujawnia izolowanie i charakteryzację białka z pszenicy, które wiąże i inhibituje dwie ksylanazy rodziny 11. Podobnie, WO 98/49278 pokazuje wpływ ekstraktu mąki pszennej na aktywność grupy ksylanaz drobnoustrojowych, z których wszystkie klasyfikuje się jako ksylanazy rodziny 11. Debyser i inni (1999) także ujawnia, że endoksylanazy od Aspergillus niger i Bacillus subtilis, które obie są członkami ksylanaz rodziny 11, były inhibitowane przez pszenny inhibitor ksylanazy zwany TAXI. McLauchlan i inni (1999b) poucza, że ekstrakty z rynkowych mąk, takich jak pszenna, jęczmienna, ryżowa i kukurydziana, są zdolne do inhibitowania ksylanaz zarówno rodziny 10 jak i 11.

Inhibitorem ksylanazy może być każdy odpowiedni inhibitor ksylanazy. Przykładowo, inhibitorem ksylanazy może być inhibitor opisany w WO-A-98/49278 i/lub inhibitor ksylanazy opisany przez Rouau, X i Surget A (1998), McLauchlan R i innych (1999) i/lub inhibitor ksylanazy opisany w brytyjskim zgłoszeniu patentowym numer 9828599.2 (złożonym 23 grudnia 1998), brytyjskim zgłoszeniu patentowym numer 9907805.7 (złożonym 6 kwietnia 1999) oraz brytyjskim zgłoszeniu patentowym numer 9908645.6 (złożonym 15 kwietnia 1999).

PL 212 113 B1

Test inhibitora ksylanazy

Miesza się 100 μl frakcji kandydata na inhibitor, 250 μl roztworu ksylanazy (zawierającego 12 TXU ksylanazy drobnoustrojowej/ml) oraz 650 μl buforu (0,1 M kwas cytrynowy - 0,2 M bufor wodorofosforan disodowy, pH 5,0).

Mieszaninę utrzymuje się w stałej temperaturze 40°C przez 5 minut. O czasie - 5 minut, dodaje się jedną tabletkę Xylanase. O czasie = 15 minut, reakcję przerywa się przez dodanie 10 ml 2% TRIS. Mieszaninę reakcyjną wiruje się (3500 g, 10 minut, temperatura pokojowa) i supernatant mierzy przy 590 nm. Inhibicję oblicza się jako aktywność resztkową w porównaniu z wartością pustą. Wartość pustą otrzymuje się w ten sam sposób z wyjątkiem tego, że 100 μl inhibitora zastępuje się 100 μl buforu (0,1 M kwas cytrynowy - 0,2 M bufor wodorofosforan disodowy, pH 5,0).

Specyficzny inhibitor ksylanazy

Jak zaznaczono, inhibitorem ksylanazy, który można stosować zgodnie z niniejszym wynalazkiem, jest inhibitor opisany w brytyjskim zgłoszeniu patentowym numer 9828599.2 (złożonym 23 grudnia 1998), brytyjskim zgłoszeniu patentowym numer 9907805.7 (złożonym 6 kwietnia 1999) oraz brytyjskim zgłoszeniu patentowym numer 9908645.6 (złożonym 15 kwietnia 1999).

Ten endogeniczny inhibitor endo-e-1,4-ksylanazy można otrzymać z mąki pszennej. Inhibitor jest dipeptydem, mającym MW wynoszącą około 40 kDa (jak zmierzono przez SDS-PAGE lub spektrometrię masową) oraz pl wynoszący około 8 do około 9,5.

Analiza sekwencji do dzisiaj ujawniała, że inhibitor posiada co najmniej jedną lub więcej sekwencji przedstawionych jako SEQ ID nr 2, SEQ ID nr 3, SEQ ID nr 4, SEQ ID nr 5, SEQ ID nr 6, SEQ ID nr 7 i/lub SEQ ID nr 8.

Te inhibitory opisane w poprzednim stanie techniki można także stosować w testach określających wrażliwość wariantu polipeptydu według wynalazku wobec inhibitorów ksylanazowych. Można je także stosować jak opisano poniżej do modulowania funkcjonalności ksylanazy.

Polinukleotydy

Polinukleotydy według wynalazku zawierają sekwencje kwasu nukleinowego kodujące sekwencje wariantu polipeptydu według wynalazku. Zrozumiałe będzie przez fachowca, że liczne inne polinuklotydy mogą kodować ten sam polipeptyd, w wyniku degeneracji kodu genetycznego. Poza tym, zrozumiałe będzie, że fachowcy mogą, stosując rutynowe techniki, wykonywać substytucje nukleotydowe, które nie wpływają na sekwencję polipeptydu kodowanego przez polinukleotydy według wynalazku, aby odzwierciedlić stosowanie kodonu każdego poszczególnego organizmu gospodarza, w którym ma nastąpić ekspresja polipeptydów według wynalazku.

Polinukleotydy według wynalazku mogą obejmować DNA lub RNA. Mogą one mieć pojedynczą nić lub podwójną nić. Mogą to być także polinukleotydy, które obejmują syntetyczne lub modyfikowane nukleotydy. W stanie techniki znane są liczne różne rodzaje modyfikacji w stosunku do oligonukleotydów. Obejmują one szkielety metylofosfonianowe i fosforotionianowe, dodatek akrydyny lub łańcuchów polilizyny na końcach 3' i/lub 5' cząsteczki. Dla celów niniejszego wynalazku, zrozumiałe będzie, że opisane w niniejszym polinukleotydy można modyfikować każdą metodą dostępną w technice. Takie modyfikacje można przeprowadzać w celu wzmocnienia aktywności in vivo lub długości życia polinukleotydów według wynalazku.

Wektory nukleotydowe i komórki gospodarza

Polinukleotydy według wynalazku można wprowadzać do rekombinowanych wektorów, które można powielać.

Wektor można stosować do replikacji kwasu nukleinowego w zgodnej komórce gospodarza. Tak więc w dodatkowej postaci realizacji, opis podaje sposób wykonania polinukleotydów według wynalazku, przez wprowadzenie polinukleotydu według wynalazku do wektora, który można powielać, wprowadzenie wektora do zgodnej komórki gospodarza i hodowlę komórki gospodarza w warunkach, które powodują replikacje wektora. Wektor można odzyskiwać z komórki gospodarza. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują bakterie, takie jak E.coli, drożdże i grzyby.

Korzystnie, opisany polinukleotyd w wektorze jest połączony operacyjnie z sekwencją regulatorową, która jest zdolna do zapewnienia ekspresji sekwencji kodującej przez komórkę gospodarza, czyli wektor jest wektorem ekspresji. Określenie „operacyjnie połączony odnosi się do zestawienia, w którym opisane składniki występują w związku pozwalającym im na funkcjonowanie w zamierzony sposób. Sekwencja regulatorowa „operacyjnie połączona z sekwencją kodującą, połączona jest w taki sposób, że ekspresję sekwencji kodującej uzyskuje się w warunkach zgodnych z sekwencjami

PL 212 113 B1 kontrolnymi. Określenie „sekwencje regulatorowe obejmuje promotory i wzmacniacze oraz inne sygnały regulacji ekspresji.

Wzmocnienie ekspresji polinukleotydu kodującego polipeptyd według wynalazku, można także uzyskać przez selekcję heterologicznych regionów regulatorowych, np. promotora, regionów liderowych i terminatorowych wydzielania, które służą do zwiększania ekspresji oraz, jeśli trzeba, poziomu sekwencji interesującego białka z wybranego gospodarza ekspresji i/lub w celu zapewnienia możliwej do indukcji kontroli ekspresji polipeptydu według wynalazku.

Oprócz promotora natywnego w stosunku do genu kodującego polipeptyd według wynalazku, można stosować inne promotory do kierowania ekspresji polipeptydu według wynalazku. Promotor można wybrać pod względem jego skuteczności w kierowaniu ekspresją polipeptydu według wynalazku, w żądanym gospodarzu ekspresji.

Można także wybrać konstytutywny promotor, kierujący ekspresją żądanego polipeptydu według wynalazku. Przykładami silnych konstytutywnych i/lub możliwych do indukcji promotorów, które są zalecane do stosowania w grzybowych gospodarzach ekspresji są promotory, które można otrzymać z genów grzybowych dla ksylanazy (xlnA), fitazy, ATP-syntetazy, podjednostki 9 (oliC), izomerazy triozofosforanu (tpi) dehydrogenazy alkoholowej (AdhA), a-amylazy(amy), anyloglukozydazy (AG - z genu glaA), acetamidazy (amdS) oraz dehydrogenazy gliceroaldehydo-3-fosforanowej (gpd).

Przykłady silnych promotorów drożdżowych to te otrzymywane z genów dla dehydrogenazy alkoholowej, laktazy, kinazy 3-fosfoglicerynianowej i izomerazy triozofosforanowej.

Przykłady silnych promotorów bakteryjnych to promotory α-amylazy i SP02 jak również promotory z genów proteaz zewnątrzkomórkowych.

Można także stosować promotory hybrydowe do poprawiania możliwej do indukcji regulacji konstrukcji ekspresji.

Często pożądane jest dla polipeptydu według wynalazku, aby był wydzielany z gospodarza ekspresji do pożywki hodowlanej, skąd polipeptyd według wynalazku może być łatwo odzyskiwany. Sekwencję liderową wydzielania polipeptydu według wynalazku można stosować w celu wywierania wpływu na wydzielanie w następstwie ekspresji polipeptydu według wynalazku. Jednak zwiększenie ekspresji polipeptydu według wynalazku czasami powoduje wytwarzanie białka na poziomie, poza którym gospodarz ekspresji nie jest zdolny do obrabiania i wydzielania, tworząc wąskie gardło tak, że białkowy produkt akumuluje się wewnątrz komórki. W związku z tym, w opisie wskazano także heterologiczne sekwencje liderowe zapewniające najskuteczniejsze wydzielanie polipeptydu według wynalazku z wybranego gospodarza ekspresji.

Lider wydzielania może być wybrany na podstawie żądanego gospodarza ekspresji. Można wybrać heterologicznego lidera wydzielania, który jest homologiczny wobec innych regionów regulatorowych konstrukcji ekspresji. Przykładowo, lider silnie wydzielanego białka amyloglukozydazy (AG) może być stosowany w połączeniu z samym promotorem amyloglukozydazy (AG), jak również w połączeniu z innymi promotorami. W kontekście opisu niniejszego wynalazku można także stosować hybrydowe sekwencje sygnałowe.

Przykładami zalecanych heterologicznych sekwencji liderowych wydzielania są te pochodzące od genu grzybowej amyloglukozydazy (AG) (glaA - wersja zarówno 18 jak i 24-aminokwasowa, np. od Aspergillus), gen czynnika α (drożdże, np. Saccharomyces oraz Kluyveromyces) albo gen α-amylazy (Bacillus).

Takie wektory można transformować do odpowiedniej komórki gospodarza, jak opisano powyżej, w celu ekspresji opisywanego polipeptydu. Tak więc, w dodatkowym aspekcie, opis niniejszy podaje sposób wytwarzania wspomnianych polipeptydów, który obejmuje hodowlę komórki gospodarza transformowanej lub transfekowanej wektorem ekspresji jaki opisano powyżej, w warunkach zapewniających ekspresję przez wektor z sekwencją kodującą, kodujący polipeptydy, oraz odzyskanie polipeptydów otrzymanych w następstwie ekspresji. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują np. komórki grzybowe, takie jak komórki Aspergillus i drożdżowe, takie jak komórki drożdżowe z rodzaju Kluyveromyces lub Saccharomyces. Inne odpowiednie komórki gospodarza są omówione poniżej.

Wektorami mogą być np. wektory plazmidowe, wirusowe lub fagowe posiadające początek replikacji, ewentualnie promotor dla ekspresji wymienionego poIinukleotydu i ewentualnie regulator promotora. Wektory mogą zawierać jeden lub więcej możliwych do selekcji genów markerowych. Najodpowiedniejszymi systemami selekcji dla przemysłowych drobnoustrojów są te utworzone przez grupę markerów selekcji, które nie wymagają mutacji w organizmie gospodarza. Przykładami grzybowych markerów selekcji są geny dla acetamidazy (amdS), syntetazy ATP, podjednostki 9 (oliC), orotydyno12

PL 212 113 B1

5'-fosfatodekarboksylazy (prvA), oporności fleomycynowej i benomylowej (benA). Przykłady nie grzybowych markerów selekcji są gen oporności G418 (może on być także stosowany w drożdżach lecz nie w grzybach), gen oporności ampicylinowej (E.coli), gen oporności neomycynowej (Bacillus) oraz gen uidA E.coli, kodujący β-glukuronidazę (GUS). Wektory można stosować in vitro, np. do wytwarzania RNA albo stosować do transfekcji komórki gospodarza.

Dodatkowo opis podaje komórki gospodarza transformowane lub transfekowane polinukleotydem opisanym w wynalazku. Korzystnie, wymieniony polinukleotyd jest zawarty w wektorze w celu replikacji i ekspresji wymienionych polinukleotydów. Komórki będą tak wybrane, aby być zgodnymi w wymienionych wektorem i np. mogą to być komórki prokariotyczne (np. bakteryjne), grzybowe, drożdżowe lub roślinne.

Bakterie z rodzaju Bacillus są bardzo odpowiednie jako gospodarze heterologiczni, z powodu ich zdolności do wydzielania białek do pożywki hodowlanej. Inne bakterie odpowiednie jako gospodarze to te z rodzajów Streptomyces i Pseudomonas.

W zależności od charakteru polinukleotydu kodującego polipeptyd i/lub konieczności dodatkowej obróbki białka, które uległo ekspresji, zalecany może być gospodarz eukariotyczny, taki jak drożdże lub grzyby. Ogólnie, komórki drożdżowe są bardziej polecane niż komórki grzybowe, ponieważ są one łatwiejsze do manipulacji. Jednak niektóre białka są albo słabo wydzielane z komórki drożdżowej albo w pewnych przypadkach nie są prawidłowo obrabiane (np. hiperglikozylacja u drożdży). W tych przypadkach, powinien być wybrany grzybowy organizm gospodarza.

Można także wybrać gospodarza heterologicznego, w którym wytwarzany polipeptyd jest w postaci, która jest zasadniczo pozbawiona innych ksylanaz. Można to osiągnąć wybierając gospodarza, który nie wytwarza normalnie takich enzymów.

Przykłady zalecanych gospodarzy ekspresji opisane w niniejszym opisie, to grzyby, takie jak gatunki Aspergillus oraz gatunki Trichoderma; bakterie takie jak gatunki Bacillus, gatunki Streptomyces i gatunki Pseudomonas; oraz drożdże, takie jak gatunki Kluyveromyces i gatunki Saccharomyces.

Szczególnie zalecanych gospodarzy ekspresji można wybrać spośród Aspergillus niger, Aspergillus niger odmiana tubigensis, Aspergillus niger odmiana awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kuyveromyces lactis i Saccharomyces cerevisiae.

Wytwarzanie polipeptydu według wynalazku można uzyskać przez hodowlę drobnoustrojowych gospodarzy ekspresji, których transformowano jednym lub więcej polinukleotydów według niniejszego wynalazku, w konwencjonalnej odżywczej pożywce fermentacyjnej.

Pożywka farmentacyjna może obejmować znaną pożywkę hodowlaną zawierającą źródło węgla (np. glukozę, maltozę, melasę itd.), źródło azotu (np. siarczan amonu, azotan amonu, chlorek amonowy itd.), źródło azotu organicznego (np. ekstrakt drożdżowy, ekstrakt słodowy, pepton itd.) oraz źródła nieorganicznych substancji odżywczych (np. fosforan, magnez, potas, cynk, żelazo itd.). Ewentualnie można dodać środek indukujący.

Wybór odpowiedniej pożywki może być na podstawie wyboru gospodarzy ekspresji i/lub wymagań regulatorowych konstrukcji ekspresji. Takie pożywki są dobrze znane fachowcom. Pożywka może, jeśli trzeba, zawierać dodatkowe składniki faworyzujące transformowanych gospodarzy ekspresji ponad inne potencjalnie zanieczyszczające drobnoustroje.

Po fermentacji, komórki można usunąć z bulionu fermentacyjnego za pomocą wirowania lub filtracji. Po usunięciu komórek, można potem odzyskiwać wariant polipeptydu według wynalazku i, jeśli trzeba, oczyszczać i izolować konwencjonalnymi metodami.

Organizmy

Określenie „organizm w stosunku do niniejszego wynalazku, obejmuje każdy organizm, który mógłby zawierać sekwencję nukleotydową kodującą wariant białka ksylanazowego według niniejszego wynalazku i/lub produkty otrzymywane od nich, w którym transkrypcyjna sekwencja regulatorowa może pozwolić na ekspresję sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku, jeśli jest obecna w organizmie. Odpowiednie organizmy mogą obejmować prokariotę, grzyba, drożdże lub roślinę. Pod względem aspektu ksylanazy niniejszego wynalazku, zalecanym organizmem może być bakteria, korzystnie z rodzaju Bacillus, korzystnie Bacillus subtilis.

Określenie „organizm transgeniczny w stosunku do niniejszego wynalazku, obejmuje każdy organizm, który zawiera sekwencję nukleotydową kodującą białko według niniejszego wynalazku i/lub produkty od niego otrzymane, w którym transkrypcyjna sekwencja regulatorowa może pozwolić na

PL 212 113 B1 ekspresję sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku, wewnątrz organizmu. Korzystnie, sekwencja nukleotydowa jest włączona do genomu organizmu.

Określenie „organizm transgeniczny nie pokrywa natywnych nukleotydowych sekwencji kodujących w ich naturalnym środowisku, kiedy znajdują się one pod kontrolą swego natywnego promotora, który także znajduje się w swym naturalnym środowisku.

Zatem, organizm transgeniczny obejmuje organizm zawierający jakąkolwiek sekwencję lub połączenie nukleotydowej sekwencji kodującej, sekwencję aminokwasową według niniejszego wynalazku, konstrukt według niniejszego wynalazku (łącznie z ich kombinacjami), opisane w opisie wektory, plazmidy, komórki, tkanki albo ich produkty. Transformowana komórka lub organizm może wytworzyć dopuszczalne ilości żądanego związku, który byłby łatwo odzyskiwany z komórki lub organizmu.

Transformacja komórki gospodarza lub organizmów gospodarza

Jak zaznaczono wcześniej, organizm gospodarza może być organizmem prokariotycznym lub eukariotycznym. Przykłady odpowiednich gospodarzy prokariotycznych obejmują E.coli i Bacillus subtilis. Opisy transformacji gospodarzy prokariotycznych są dobrze udokumentowane w technice, np. patrz Sambrook i inni (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-gie wydanie, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) oraz Ausubel i inni, Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4-te wydanie, John Wiley & Sons, Inc.

Jeśli wykorzystuje się gospodarza prokariotycznego, wtedy sekwencja nukleotydowa może wymagać odpowiedniej modyfikacji przed transformacją - takiej jak usunięcie intronów.

Jak wspomniano powyżej, zalecanym organizmem gospodarza jest rodzaj Bacillus, tak jak Bacillus subtilis .

W innej postaci realizacji, organizmem transgenicznym mogą być drożdże. Pod tym względem, drożdże były także szeroko wykorzystywane jako podłoże dla ekspresji genu heterologicznego. Gatunki Saccharomyces cerevisiae mają długą historię stosowania w przemyśle, łącznie ze stosowaniem do ekspresji genu heterologicznego. Ekspresja genów heterologicznych w Saccharomyces cerevisiae została opisana przez Goodey i innych (1987, Yeast Biotechnology,DR Berry i inni, wydawcy, strony 401-429, Allen i Unwin, Londyn) oraz przez King i innych (1989, Molecular and Cell Biology of Yeast, E F Walton and G T Yarronton, wydawcy, strony 107-133, Blackie, Glasgow).

Z kilku powodów Saccharomyces cerevisiae jest dobrze dopasowany do ekspresji genu heterologicznego. Po pierwsze, nie jest on patogeniczny dla ludzi i jest niezdolny do wytwarzania pewnych endotoksyn. Po drugie, ma on długą historię bezpiecznego stosowania w ciągu wieków wykorzystania rynkowego, w różnych celach. Doprowadziło to do szerokiej publicznej akceptacji. Po trzecie, szerokie wykorzystanie rynkowe i badania poświęcone organizmowi, spowodowało powstanie bagatej wiedzy o genetyce i fizjologii, jak również cechach fermentacji na wielką skalę Saccharomyces cerevisiae.

Przegląd zasad ekspresji genu heterologicznego w Saccharomyces cerevisiae i wydzielanie produktów genowych, jest podane u E Hinchcliffe E Kenny (1993, „Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes, Yeasts, tom 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, wydawcy, 2-gie wydanie, Academic Press Ltd.).

Dostępnych jest kilka wektorów drożdżowych, łącznie z wektorami integracyjnymi, które wymagają rekombinacji z genomem gospodarza w celu ich utrzymania oraz autonomicznej replikacji wektorów plazmidowych.

Aby wytworzyć transgeniczne Saccharomyces, wytwarza się konstrukcje ekspresji przez wprowadzenie sekwencji nukleotydowej według niniejszego wynalazku do konstrukcji zaplanowanej do ekspresji w drożdżach. Opracowano kilka rodzajów konstrukcji stosowanych do ekspresji heterologicznej. Konstrukcje zawierają promotor aktywny w drożdżach połączonych przez fuzję z sekwencją nukleotydową według niniejszego wynalazku, zwykle stosuje się promotor pochodzenia drożdzowego, taki jak promotor GAL1. Zazwyczaj wykorzystuje się sekwencję sygnałową pochodzenia drożdżowego, taką jak sekwencja kodująca peptyd sygnałowy SUC2. Terminator aktywny w drożdżach kończy układ ekspresji.

Opracowano kilka protokołów transformacji dla transformacji drożdży. Przykładowo, transgeniczny Saccharomyces według niniejszego wynalazku można wytworzyć postępując zgodnie z opisem Hinnen i innych (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs J D (1978, Nature Londyn, 275, 104; oraz Ito, H i innych (1983, J Bacteriology 153, 163-168).

Komórki transformowanych drożdży selekcjonuje się stosując różne markery selekcji. Wśród markerów stosowanych do transformacji są liczne markery auksotroficzne, takie jak LEU2, HIS4 i TRP1 oraz

PL 212 113 B1 markery dominującej oporności antybiotykowej, takie jak markery antybiotyków amino glikozydowych, np. G418.

Innym organizmem gospodarza jest roślina. Podstawową zasadą w konstruowaniu genetycznie modyfikowanych roślin jest insercja informacji genetycznej do genomu rośliny, tak aby otrzymać stabilne utrzymanie wprowadzonego materiału genetycznego.

Roślinę transgeniczną według wynalazku można wytworzyć z każdej rośliny, takiej jak rośliny nasienne (okrytozalążkowe), oraz iglaste. Okrytozalążkowe obejmują dwuliścienne i jednoliścienne. Przykłady roślin dwuliściennych obejmują tytoń (Nicotiana plumbaginifolia oraz nicotiana tabacum), rzodkiewnik (Arabidopsis thaliana), Brassica napus, Brassica nigra, Datura innoxia, Vicia narbonensis, Vicia Faba, groszek (Pisum sativum), kalafior, goździk i soczewica (Lens culinaris). Przykłady roślin jednoliściennych obejmują zboża, takie jak pszenica, jęczmień, owies i kukurydza.

Techniki wytwarzania roślin transgenicznych są dobrze znane w technice. Zwykle, albo całe rośliny, komórki albo protoplasty można transformować odpowiednią konstrukcją kwasu nukleinowego kodującą cząsteczkę palca cynkowego lub docelowego DNA (patrz powyżej dla przykładów konstrukcji kwasu nukleinowego). Istnieje wiele metod wprowadzania transformujących konstrukcji DNA do komórek, lecz nie wszystkie są odpowiednie do dostarczania DNA do komórek roślinnych. Odpowiednie metody obejmują infekcję Agrobacterium (patrz między innymi Turpen i inni, 1993, J. Virol. Methods, 42:227-239) lub bezpośrednie dostarczanie DNA, tak jak np. przez transformację za pośrednictwem PEG, przez elektroporację lub akcelerację cząstek opłaszczonych DNA. Metody akceleracji są generalnie zalecane i obejmują np. bombardowanie mikropociskami. Typowy protokół wytwarzania roślin transgenicznych (w szczególności jednoliściennych), wzięty z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych nr 5 874 265, jest opisany poniżej.

Przykładem metody dostarczania transformujących segmentów DNA do komórek roślin, jest bombardowanie mikropociskami. W tej metodzie, cząstki pochodzenia nie biologicznego, można powlekać kwasami nukleinowymi i dostarczać do komórek przez siłę napędzającą. Przykładowe cząstki obejmują te złożone z wolframu, złota, platyny i innych.

Szczególną korzyścią bombardowania mikropociskami, oprócz tego, że jest do skuteczny sposób powtarzalnego, stabilnego transformowania zarówno dwuliściennych jak i jednoliściennych, jest to, że nie potrzebna jest ani izolacja protoplastów ani wrażliwość na infekcję Agrobacterium. Ilustracyjną postacią realizacji metody dostarczania DNA do komórek roślinnych przez akcelerację jest Biolistic Particie Delivery System, który można stosować do napędzenia cząsteczek powleczonych DNA przez ekran, taki jak stal nierdzewna lub ekran Nytex, na powierzchnię filtra powleczonego komórkami roślinnymi hodowanymi w zawiesinie. Ekran rozprasza cząstki wolframowe z DNA tak, że nie są one dostarczane do biorczych komórek w wielkich agregatach. Uważa się, że bez ekranu oddzielającego urządzenie wyrzucające od komórek do bombardowania, pociski mogą się zlepiać i być zbyt duże, aby uzyskać wysoką częstość transformacji. Może to być spowodowane uszkodzeniem zadanym komórkom biorczym przez pociski, które są zbyt duże.

Do bombardowania, komórki w zawiesinie są korzystnie skoncentrowane na filtrach. Filtry zawierające komórki do bombardowania, są ustawione w odpowiedniej odległości poniżej płyty zatrzymującej makropociski. Jeśli trzeba, między działkiem i komórkami do bombardowania ustawia się także jeden lub więcej ekranów. Stosując techniki przedłożone w niniejszym, można otrzymać do 1000 lub więcej ugrupowań komórkowych wykazujących krótkotrwałą ekspresję genu markerowego („ognisk) na bombardowanym filtrze. Liczba komórek w ognisku, która wykazuje ekspresję produktu genu egzogenicznego 48 godzin po bombardowaniu, często wynosi od 1 do 10, a średnio 2 do 3.

Po przeprowadzeniu dostarczenia egzogenicznego DNA do komórek biorczych którąkolwiek z metod omówionych powyżej, zalecanym etapem jest identyfikacja transformowanych komórek do dalszej hodowli i regeneracji rośliny. Etap ten może obejmować testowanie hodowli bezpośrednio pod względem śladu możliwego do skriningu lub przez ekspozycję zbombardowanych hodowli wobec czynnika lub czynników selekcji.

Przykładem śladu markera możliwego do selekcji jest czerwony pigment wytwarzany pod kontrolą lokusa R u kukurydzy. Pigment ten można wykrywać przez hodowlę komórek na stałym podłożu, zawierającym pożywki umożliwiające podtrzymanie wzrostu na tym etapie, inkubację komórek w tem-2 -1 peraturze np. 18°C i ponad 180 μΕm^- s^- , oraz selekcji komórek z kolonii (widoczne agregaty komórkowe), które są pigmentowane. Te komórki można hodować dalej, albo w zawiesinie albo na pożywkach stałych.

PL 212 113 B1

Przykładową postacią realizacji metod identyfikacji transformowanych komórek jest ekspozycja zbombardowanych hodowli wobec czynnika selekcji, takiego jak inhibitor metaboliczny, antybiotyk, herbicyd lub inne. Komórki, które zostały transformowane i mają stabilnie zintegrowany gen markerowy nadający oporność wobec czynnika selekcji, będą rosły i dzieliły się w hodowli. Komórki wrażliwe będą niezdolne do dalszej hodowli.

Stosowanie systemu selekcji bar-bialaphos, zbombardowane komórki na filtrach zawiesza się ponownie z nieselektywnej pożywce płynnej, hoduje (np. przez jeden do dwóch tygodni) i przenosi na filtry, nad którymi znajduje się stała pożywka zawierająca 1-3 mg/l bialaphos. Mimo, że zaleca się zakres 1-3 mg/l, sugeruje się, że zakres 0,1-50 mg/l znajdzie wykorzystanie w praktyce wynalazku. Rodzaj filtru do wykorzystania przy bombardowaniu nie uważa się za szczególnie decydujący i może obejmować każde stałe, porowate, obojętne podłoże.

Komórki, które przeżyją ekspozycję wobec czynnika selekcji, można hodować w pożywkach, które podtrzymują regenerację roślin. Tkanki utrzymuje się na pożywkach podstawowych z hormonami, przez około 2-4 tygodnie, następnie przenosi do pożywek bez hormonów. Po 2-4 tygodniach, rozwój kiełków zasygnalizuje czas przeniesienia do następnej pożywki.

Regeneracja zwykle wymaga progresji pożywek, których skład został zmodyfikowany w celu zapewnienia odpowiednich składników odżywczych i sygnałów hormonalnych podczas kolejnych etapów rozwojowych od transformowanej tkanki kalusowej do bardziej dojrzałej rośliny. Rozwijające się roślinki przenosi się do gleby i hartuje, np. w komorze o kontrolowanym środowisku przy około 85%

-2 -1 wilgotności względnej, 600 ppm CO2, oraz 250 μΕ m^-2s^-1 światła. Rośliny dojrzewają korzystnie albo w komorze wzrostowej albo w szklarni. Regeneracja trwa zwykle około 3-12 tygodni. Podczas regeneracji, komórki hoduje się na stałych pożywkach w naczyniach do hodowli tkankowej. Ilustracyjną postacią realizacji takiego naczynia jest płytka Petriego. Regenerujące się rośliny hoduje się korzystnie w temperaturze około 19°C do 28°C. Po osiągnięciu przez regenerujące rośliny stadium kiełka i rozwoju korzenia, można je przenieść do szklarni w celu dalszej hodowli i testowania.

Genomowy DNA można izolować z linii komórek kallusa i roślin w celu określenia obecności genu egzogenicznego przez stosowanie technik dobrze znanych fachowcom, takich jak PCR i/lub Southern blotting.

Istnieje kilka technik wprowadzania informacji genetycznej, przy czym dwie główne zasady stanowią bezpośrednie wprowadzanie informacji genetycznej i wprowadzanie informacji genetycznej z użyciem układu wektorowego. Przegląd ogólnych technik można znaleźć w artykułach Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) oraz Christou (Agro-Food-Industry HiTech marzec/kwiecień 1994 17-24).

Tak więc, niniejszy opis odnosi się także do układu wektorowego, który niesie konstrukcję kodującą wariant polipeptydu ksylanazowego według niniejszego wynalazku oraz który umożliwia wprowadzenie konstrukcji do genomu rośliny.

Układ wektorowy może obejmować jeden wektor, lecz może on obejmować co najmniej dwa wektory. W przypadku dwóch wektorów, układ wektorowy przytacza się zwykle jako binarny układ wektorowy. Binarne układy wektorowe są opisane bardziej szczegółowo u Gynheung An i innych (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19.

Jeden z szeroko wykorzystywanych układów do transformowania komórek roślinnych z danym promotorem lub sekwencją nukleotydową albo konstrukcją opiera się o stosowanie plazmidu Ti z Agrobacterium tumefaciens lub plazmidu Ri z Agrobacterium rhizogenes (An i inni (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 i Butcher D.N. i inni (1980) Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, wydawcy: D.S. Ingrams and J.P Helgeson, 203-208).

Skonstruowano kilka różnych plazmidów Ti i Ri, które są odpowiednie do konstrukcji konstrukcji dla roślin lub komórek roślinnych opisanych powyżej.

B. Zastosowania

W ogólnym znaczeniu, wariant ksylanazy według wynalazku można stosować do zmiany np. zmniejszenia, lepkości otrzymanej z obecności hemicelulozy lub arabinoksylanu w roztworze lub układzie zawierającym materiał ściany komórkowej rośliny. Zwykle wymieniony materiał ściany komórkowej rośliny zawiera jeden lub więcej inhibitorów ksylanazy.

Konkretnie, wariant ksylanazy według wynalazku można stosować przy obróbce materiałów roślinnych do stosowania jako pokarmy, takie jak pasza dla zwierząt, przy produkcji skrobi, przy pieczeniu i przy obróbce miazgi drzewnej w celu wytworzenia papieru.

PL 212 113 B1

Wytwarzanie pokarmów

Wariant ksylanazy według wynalazku można stosować do obróbki materiałów roślinnych, takich jak zboża, które stosuje się przy pokarmach obejmujących pasze dla zwierząt. Jak stosuje się w niniejszym, określenie „zboża oznacza jakikolwiek rodzaj ziarna stosowany do paszy i/lub jakąkolwiek trawę produkującą to ziarno, tak jak, lecz bez ograniczanie się do jakiegokolwiek, pszenica, jęczmień, kukurydza, sorgo, żyto, owiec, pszenżyto i ryż lub ich kombinacje. W jednej zalecanej postaci realizacji, zbożem jest pszenica.

Ksylan w dodatku paszowym i/lub pokarmowym, jest modyfikowany przez zetknięcie ksylanu z wariantem ksylanazy według niniejszego wynalazku.

Jak stosuje się w niniejszym, określenie „zetknięcie obejmuje, lecz bez ograniczania, zraszanie, powlekanie, impregnowanie lub kładzenie warstwy na dodatku do paszy i/lub pokarmu, wariantu enzymu ksylanazowego według niniejszego wynalazku.

W jednej postaci realizacji, dodatek do paszy i/lub pokarmu, można wytworzyć przez mieszanie wariantu enzymu ksylanazowego bezpośrednio z dodatkiem do pokarmu i/lub paszy. Przykładowo, wariant enzymu ksylanazowego można zetknąć (np. przez zroszenie) z dodatkiem do pokarmu i/lub paszy na osnowie zboża, takiej jak mielona pszenica, kukurydza lub mączka sojowa.

Możliwe jest także wprowadzenie wariantu enzymu ksylanazowego do drugiego (i innego) pokarmu i/lub paszy lub wody do picia, którą następnie dodaje się do dodatku do pokarmu i/lub paszy według niniejszego wynalazku. W związku z tym, nie jest zasadnicze, aby wariant enzymu ksylanazowego podanego przez niniejszy wynalazek był wprowadzony do samego pokarmu i/lub paszy na osnowie zboża, chociaż takie wprowadzenie tworzy szczególnie zalecany aspekt niniejszego wynalazku.

W jednej postaci jak opisano w wynalazku, dodatek do pokarmu i/lub paszy można łączyć z innymi składnikami pokarmu i/lub paszy, tworząc pokarm i/lub paszę na osnowie zboża. Takie składniki innego pokarmu i/lub paszy mogą obejmować jeden lub więcej (korzystnie termostabi Ine) dodatki enzymatyczne, dodatki witaminowe do pokarmu i/lub paszy, dodatki mineralne do pokarmu i/lub paszy oraz dodatki aminokwasowe do pokarmu i/lub paszy. Otrzymany (łączony) dodatek do pokarmu i/lub paszy obejmujący możliwie kilka różnych rodzajów związków, można potem mieszać w odpowiedniej ilości z innymi składnikami pokarmu i/lub paszy, takimi jak dodatki zbożowe i białkowe, tworząc pokarm dla człowieka i/lub paszę dla zwierząt.

W jednej zalecanej postaci, dodatek do pokarmu i/lub paszy, można wytworzyć przez wymieszanie różnych enzymów mających odpowiednią aktywność, tworząc mieszankę enzymatyczną. Przykładowo, dodatek do pokarmu i/lub paszy na osnowie zboża utworzony z np. mielonej pszenicy lub kukurydzy, można zetknąć (np. przez rozpryskanie) równoczesne lub kolejne z enzymem ksylanazowym mającym odpowiednią aktywność. Enzymy te mogą obejmować, lecz bez ograniczenia, jedną lub więcej amylazę, glukoamylazę, mannazę, galaktozydazę, fitazę, lipazę, glukanazę, arabinofuranozydazę, pektynazę, proteazę, glukooksydazę, oksydazę heksozową oraz ksylanazę. Enzymy mające żądaną aktywność można np. mieszać z polipeptydem o aktywności ksylanazy według niniejszego wynalazku, albo przed zetknięciem tych enzymów z dodatkiem do pokarmu i/lub paszy na osnowie zboża, albo alternatywnie, takie enzymy można zetknąć równocześnie lub kolejno z takim dodatkiem na osnowie zboża. Dodatek do pokarmu i/lub paszy miesza się potem ponownie z pokarmem i/lub paszą na osnowie zboża, otrzymując ostateczny pokarm i/lub paszę. Możliwe jest także opracowanie dodatku do pokarmu i/lub paszy w postaci roztworu o aktywności poszczególnego enzymu, a następnie mieszanie tego roztworu z materiałem pokarmu i/lub paszy, przed obróbkę dodatku do pokarmu i/lub paszy do postaci grudek lub jako granulatu.

Produkty piekarskie

Niniejszy wynalazek podaje zastosowanie wariantu polipeptydu ksylanazowego według wynalazku w procesie wytwarzania artykułów żywnościowych. Typowe produkty piekarnicze (pieczone) według niniejszego wynalazku, obejmują chleb, taki jak bochenki, bułki, słodkie bułki, podstawy do pizzy itd., precle, tortille, placki, ciastka, herbatniki, suchary itd. Wytwarzanie artykułów żywnościowych, takich jak produkty piekarnicze, jest dobrze znane w technice. Wytwarzanie ciasta np. jest opisane w przykładzie 2. Zastosowanie wariantów ksylanazy według wynalazku do zmieniania lepkości zawiesiny mącznej, jest opisane w przykładzie 5.

Wytwarzanie skrobi

Wariant ksylanazy według wynalazku można także stosować przy wytwarzaniu skrobi z materiałów roślinnych pochodzących od zbóż i bulw, takich jak ziemniaki.

PL 212 113 B1

Obrabianie miazgi drzewnej

Wariant ksylanazy według wynalazku można także stosować przy obrabianiu miazgi drzewnej, np. przy wytwarzaniu papieru.

Jak omówiono powyżej, wykazaliśmy, że główną determinantą funkcjonalności ksylanazy jest obecność endogenicznych inhibitorów w materiale roślinnym. W konsekwencji, chociaż jedną z metod zmiany funkcjonalności ksylanazy jest modyfikacja ksylanazy w celu zmiany jej wrażliwości wobec endogenicznych inhibitorów, inną metodą byłoby zmienianie ilości i/lub rodzaju inhibitora obecnego w materiale roślinnym. Tak więc niniejszy wynalazek opisuje także zastosowanie inhibitora ksylanazowego do zmieniania funkcjonalności ksylanazy i w konsekwencji zastosowanie inhibitora ksylanazowego w sposobach obrabiania materiału roślinnego, opisanych powyżej.

Wynalazek został zilustrowany w następujących przykładach wykonania.

P r z y k ł a d 1. Oczyszczanie i charakterystyka endogennego inhibitora ksylanazowego pszenicy.

kg mąki pszennej (Danish Reform, partia 99056) ekstrahowano wodą, stosując stosunek mąka:woda wynoszący 1:2, w ciągu 10 minut mieszania. Rozpuszczalny endogeniczny inhibitor ksylanazy oddzielono z zawiesiny mąka-woda, przez wirowanie. Ekstrakcję i wirowanie przeprowadzono w temperaturze 4°C. Inhibitor oczyszczono z ekstraktu wodnego przez następujące techniki chromatograficzne i techniki zatężania: HPLC-SEC, HPLC-CIEC, odparowywanie na wyparce obrotowej, HPLC-HIC, HPLC-SEC i odparowywanie na wyparce obrotowej. Inhibitor ksylanazowy mógł być monitorowany i oceniany ilościowo w czasie oczyszczania, przy użyciu następującej metody oceny ilościowej.

Metoda oceny ilościowej inhibitora

XIU (jednostka inhibitora ksylanazowego) jest określona jako ilość inhibitora, jaka zmniejsza 1 TXU do 0,5 TXU w warunkach opisanych poniżej.

Ksylanazą stosowaną w tym teście jest ksylanaza dzikiego typu Bacillus subtilis.

250 μΐ roztworu ksylanazy, zawierającego 12 TXU/ml, około 100 μΐ roztworu inhibitora ksylanazy i kwasu cytrynowego (0,1 M) - bufor wodorofosforanu disodowego (0,2 M), pH 5, do przereagowania objętości reakcyjnej wynoszącej 1000 μl inkubuje się wstępnie przez 5 minut w temperaturze 40°C. O czasie t = 5 minut, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 1 tabletkę Xylazyme (Megazyme, Irlandia). O czasie t = 15 minut, reakcję kończy się przez dodanie 10 ml 2% TRIS/NaOH, pH 12. Roztwór filtruje się i mierzy absorbancję supernatantu przy 590 nm. Wybierając kilka różnych stężeń inhibitora w powyższym teście, możliwe jest utworzenie wykresu OD w stosunku do stężenia inhibitora. Stosując nachylenie (a) i punkt przecięcia (b) z tego wykresu oraz stężenie ksylanazy, możliwe jest obliczenie ilości XIU w danym roztworze inhibitora (równanie 1).

Równanie 1 ilość XIU w roztworze = ((b/2)-a)/TXU

Z oczyszczania endogenicznego inhibitora ksylanazowego, odzyskano inhibitor z następującą wydajnością (tabela 1).

T a b e l a 1

Odzysk endogenicznego inhibitora ksylanazowego pszenicy po oczyszczaniu

Próbka	Ilość	XIU	XIU, całość	Odzysk %
Mąka	2000 g	590/g	1,180000	100
Oczyszczony inhibitor	90 ml	4658/ml	419,220	35,5

Próbka inhibitora była czysta i pozbawiona pszennych endogenicznych aktywności ksylanowitycznych

P r z y k ł a d 2. Frakcjonowanie i rekonstrukcja mąki pszennej pozbawionej inhibitora ksylanazowego oraz funkcjonalność ksylanaz w tej mące jako funkcja dodanego inhibitora ksylanazy.

Frakcjonowanie i rekonstytucja mąki

Stosowaną mąką była: mąka Danish Reform, partia 99056. Frakcjonowanie, inaktywacja inhibitora i rekonstytucja były następujące:

Wykonano zwykłe ciasto przez wymieszanie 1600 gramów mąki, dodanie optymalnej ilości wody, zgodnie z absorpcją piekarską przy 500 BU i czas mieszania zgodnie z wynikami Farinografu. Uzyskano 2512 gramów ciasta. Gluten wymyto ręcznie z ciasta, stosując stosunek wody do ciasta wynoszący około 5:1. Stosowana woda była wstępnie schłodzona do 4°C, aby zapobiec dodatkowej aktywności enzymu w cieście. Uzyskana woda po myciu zawierała rozpuszczalne białka (łącznie z inhibitorem ksylanazowym), lipidy, polisacharydy nie będące skrobią oraz skrobię, skrobię i inne nierozpuszczalne składniki oddzielono od wody z mycia, przez wirowanie (5000 g, 10 minut, tempera18

PL 212 113 B1 tura 10°C). Aby inaktywować endogeniczny inhibitor ksylanazowy w wodzie po myciu, supernatant z wirowania gotowano przez trzy minuty przy użyciu gorącej wyparki.

Wszystkie trzy frakcje (gluten, skrobię i substancje rozpuszczalne) zamrożono w kolbach i umieszczono w urządzeniu do liofilizacji. Po wysuszeniu, frakcje zważono, rozdrobniono z użyciem moździerza i tłuczka, młynka do kawy i przesiano przez sito o oczku wielkości 250 μm. Wszystkie frakcje zważono ponownie i mąkę rekonstytuowano, na podstawie stosunków otrzymanych po frakcjonowaniu.

Enzymy

W badaniu użyte zostały ksylanazy wymienione w tabeli 2. Ksylanazy oczyszcza się, co oznacza, że nie ma żadnej innej aktywności ksylolitycznej w próbce.

T a b e l a 2

Ksylanazy stosowane w badaniu, oraz aktywność, TXU

ID	Pochodzenie	TXU
B. sub	B.subtilis	5100
A. nig	A.niger	8800

Test ksylanazy (aktywność endo-e-1,4-ksylanazy)

Próbki ksylanazy rozcieńcza się w kwasie cytrynowym (0,1 M) - bufor wodorofosforanu disodowego (0,2 M), pH 5, otrzymując w przybliżeniu OD = 0,7 w teście końcowym. Trzy rozcieńczenia próbki oraz standard wewnętrzny o określonej aktywności, utrzymuje się w stałej temperaturze 40°C przez 5 minut. O czasie = 5 minut, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 1 tabletkę Xylazyme (usieciowany, barwiony substrat ksylanowy). O czasie t = 15 minut (lub w pewnych przypadkach dłużej w zależności od aktywności ksylanazy obecnej w próbce) reakcję kończy się przez dodanie 10 ml 2% TRIS. Mieszaninę reakcyjną wiruje się i mierzy absorbancję supernatantu przy 590 nm. Biorąc pod uwagę rozcieńczenia i ilość ksylanazy, można obliczyć aktywność w próbce(TXU, jednostki całkowitej ksylanazy), w stosunku do standardu.

Próby pieczenia

Wykonano próby pieczenia, odpowiednio z (1,44 x początkowym poziomem inhibitora w mące Danish Reform, partia nr 99056) oraz bez dodatku oczyszczonego endogenicznego inhibitora ksylanazowego do rekonstytuowanej mąki. Próby pieczenia przeprowadzono przy użyciu ksylanaz wymienionych w tabeli 2 i składników wymienionych w tabeli 3.

T a b e l a 3

Skład ciasta wykonanego w ciągu prób pieczenia

Ciasto nr	ID	TXU	Dodany inhibitor, XIU/50 g
1	Kontrola	0	0
23	B. sub	7500	0
4	A. nig	7500	0
5	B. sub	7500	850
6	A. nig	7500	850
	Kontrola	0	850

Analiza ciasta

Ciasto analizowano ze względu na:

Kleistość

Kleistość ciasta mieszono z użyciem systemu ΤΧ-ΧΤ2 (Stable Micro Systems) przy użyciu SMS Dough Stickiness Cell zgodnie z metoda opisaną przez Chen i Hoseney (Lebensmittel Wiss u.-Technol., 28, 467-473, 1995).

PL 212 113 B1

Analiza lepkości płynnego ciasta

Lepkość ekstrahowanego płynnego ciasta mierzono przy użyciu lepkościomierza Brookfield, po ekstrakcji

Analiza pentozanowa płynnego ciasta

Rozpuszczony pentozan mierzono w płynnym cieście, przy użyciu metody Rouoa i Surget (Carbohydrate polymers, 24, 123-132, 1994).

Wyniki

Frakcjonowanie i rekonstytucja mąki

Frakcjonowanie i rekonstytucja ciasta dała 168,15 gramów liofilizowanego glutenu, 111,13 gramów liofilizowanej rozpuszczalnej frakcji oraz 1143,56 gramów liofilizowanej skrobi.

Ocena ilościowa inhibitora w mące

Stosując metodę oceny ilościowej inhibitora, można było wykryć poziom inhibitora w mące 99056 oraz mące rekonstytuowanej. Wyniki tych analiz są wymienione w tabeli 4.

T a b e l a 4

Wyniki oceny ilościowej inhibitora w rodzimej mące (99056) i mące rekonstytuowanej

Mąka	Stężenie inhibitora, XIU/g mąki
99056	590
Mąka rekonstytuowana	42

Porównując poziom inhibitora w dwóch porcjach mąki, ukazany jest 93% (100-(42XIU/590XIU) x 100%) spadek poziomu inhibitora w mące rekonstytuowanej.

Próby pieczenia

Wyniki z próby pieczenia są wymienione w tabelach 5 i 6.

T a b e l a 5

Dane prób pieczenia z mąką rekonstytuowaną, ksylanaza oraz +/- dodatek inhibitora ksylanazy. Std.dev.% oznacza odchylenie standardowe w ciągu dwóch dni pieczenia

ID	TXU	Inhibitor, XIU/50 g	Średnia objętość gatunku ml/gram	Std.dev%
Kontrola	0	42	3,04	4,06
B. sub	7500	42	3,23	12,51
A. nig.	7500	42	3,44	5,24
B. sub	7500	850	3,22	4,26
A. nig.	7500	850	3, 38	0,70
Kontrola	0	850	2, 94	0,05

Odchylenie standardowe ukazane w tabeli 5 odzwierciedla właściwości wyrabiania dla testowanego ciasta. Ciasto wykonane bez inhibitora ksylanazowego (42 XIU) było bardzo trudne do wyrobienia. Odchylenie standardowe dla tych ciast znajdują się w obszarze wynoszącym 3 do 12,5%. W porównaniu z ciastem z dodatkiem inhibitora, jest ono całkiem wysokie. Jeśli te odchylenia standardowe porównuje się z właściwymi zmianami objętości chleba, widać, że cyfry mają w przybliżeniu taką samą wartość. Oznacza to, że nie możemy wywnioskować nic o braku wpływu inhibitora na objętość chleba. Jeśli spojrzymy na ciasto wykonane z dodatkiem endogenicznego inhibitora ksylanazy (850 XIU) w tabeli 5, widzimy, że mogliśmy wytwarzać chleb z mąki rekonstytuowanej w sposób powtarzalny przez okres dwóch dni. Odchylenie standardowe znajdowało się w obszarze 0,05 do 4,2%, jaki jest dopuszczalny. Z tabeli 6 widać, że wszystkie ksylanazy zwiększały objętość pieczonego chleba.

PL 212 113 B1

T a b e l a 6

Zwiększanie objętości chleba pieczonego z mąki rekonstytuowanej jako funkcja ksylanazy i dodatku inhibitora ksylanazy

ID	TXU	Inhibitor XIU/50 g	Średnia objętość gatunku ml/gram	Wzrost objętości jako funkcja ksylanazy,%
Kontrola	0	42	3,04	0,0
B. sub	7500	42	3,23	6,2
A. nig.	7500	42	3,44	13,3
B. sub	7500	850	3,22	9,7
A. nig.	7500	850	3,38	15,0
Kontrola	0	850	2,94	0,0

Z tabeli 5 i tabeli 6 można wywnioskować, że brak inhibitora ksylanazowego w mące czyniło wyrabianie ciasta bardzo trudnym. Zatem, to, co może się wydawać pozytywną odpowiedzią objętości na dodatek inhibitora w tabeli 6, prawdopodobnie można wytłumaczyć przez wysokie odchylenie standardowe w cieście bez inhibitora, z powodu właściwości trudnego wyrabiania. Ponadto, można wywnioskować, że wszystkie testowane ksylanazy istotnie zwiększyły objętość chleba w porównaniu z kontrolną próbą ślepą.

Kleistość

To samo ciasto, które wykorzystano w próbach pieczenia, wykorzystano do pomiarów kleistości. Wyniki są wymienione w tabeli 7.

T a b e l a 7

Dane przedstawiające kleistość jako funkcja czasu, ksylanazy, dodatku inhibitora ksylanazowego do mąki rekonstytuowanej

ID	TXU	Inhibitor XIU/50 g	Sr.kleistość po 10 min, g x s	Śr. kleistość po 60 min,g x s
Kontrola	0	42	4,71	4,79
B. sub	7500	42	12,20	13,39
A. nig.	7500	42	9,22	12,58
B. sub	7500	850	2,51	3,66
A.nig.	7500	850	5,24	6,45
Kontrola	0	850	4,10	4,15

Wyniki w tabeli 7 wyraźnie wskazują wpływ inhibitora, jaki obserwowano w tym doświadczeniu. Ciasto o niskim poziomie inhibitora ksylanazowego w połączeniu z ksylanazą, było bardzo trudne do wyrobienia i uformowania. Jednakże gdy dodano inhibitor, ciasto stało się suche i bardzo łatwe do wyrobienia. Jak widać w tabeli 7, dodanie ksylanazy 990202 w połączeniu z inhibitorem zmniejszyło kleistość. Ciasto stało się bardziej suche.

Tabela 7 ukazuje także, że istnieje jedynie mały wpływ czasu na kleistość. Wydaje się, że ksylanazy działają bardzo szybko. W ciągu pierwszych 10 minut większość arabinoksylanu ulega modyfikacji po dodaniu pierwszej ksylanazy (B. sub). Druga testowana ksylanaza (A. nig) wydaje się działać wolniej. Funkcję czasu łatwo można zaobserwować stosując tę ksylanazę. Jest to także ksylanaza, która wykazuje mniejszy wpływ jako funkcję poziomu inhibitora przy analizowaniu kleistości.

Lepkość ciasta

Lepkość ciasta oraz wyniki analizy pentozanu otrzymano od tego samego ekstraktu ciasta wytworzonego z rekonstytuowanej mąki z dodatkiem ksylanazy i inhibitora ksylanazy. Ciasto to analizowano po dwóch okresach impregnacji, 30 i 120 minut.

Wyniki analizy lepkości przestawiono w tabeli 8.

PL 212 113 B1

T a b e l a 8

Dane reprezentujące lepkość płynu ciasta jako funkcja czasu, dodatek ksylanazy i inhibitora ksylanazy do mąki rekonstytuowanej

ID	TXU	Inhibitor XIU/50 g	Śr. lepkość ciasta, cP, 30 min impregnacji	Śr. lepkość ciasta, cP, 120 min impregnacji
Kontrola	0	42	5,21	5,56
B. sub	7500	42	5,07	4,55
A. nig.	7500	42	5,78	4,14
B. sub	7500	850	9,03	11,09
A. nig.	7500	850	8,44	8,55
Kontrola	0	850	5,96	6,95

Jak widać z tabeli 8, inhibitor ma istotny wpływ na funkcjonalność ksylanaz. Bez dodatku inhibitora, arabinoksylan jest depolimeryzowany do arabinoksylanu o niskim ciężarze cząsteczkowym (LMW) o niskiej lepkości. Dodatek inhibitora zapobiega tej bardzo szerokiej depolimeryzacji arabinoksylanu.

Analiza pentozanowa płynu ciasta

Wyniki z analizy pentozanowej (arabinoksylanowej) płynu ciasta są przedstawione w tabeli 9.

T a b e l a 9

Dane reprezentujące rozpuszczanie pentozanu jako funkcję czasu, dodatek ksylanazy i inhibitora ksylanazowego do mąki rekonstytuowanej.

ID	TXU	Inhibitor XIU/50 g	Śr. % pentozanu 30 minut impregnacji	Śr. % pentozanu 100 minut impregnacji
Kontrola	0	42	0,387	0,458
B. sub	7500	42	0,766	0,819
A. nig.	7500	42	0,719	0,798
B. sub	7500	850	0,410	0,544
A. nig.	7500	850	0,560	0,673
Kontrola	0	850	0,400	0,528

Jak widać z wyników w tabeli 9, dodatek endogenicznego inhibitora zmniejszało rozpuszczalność arabinoksylanu. Oceniając po 30 mintach impregnacji, ilość arabinoksylanu rozpuszczonego przy braku inhibitora jest prawie dwukrotnie większa niż ilość w obecności inhibitora. Obliczona na podstawie pokrewnych próbek kontrolnych, rozpuszczalność arabinoksylanu przy użyciu ksylanazy Bacillus, 30 minut impregnacji oraz +/- inhibitor.

P r z y k ł a d 3. Miejscowo skierowana mutageneza ksylanaz.

Specyficzne mutanty ksylanazy Bacillus subtilis można otrzymać przez miejscowo skierowana mutagenezę enzymu dzikiego typu, przez stosowanie licznych dostępnych na rynku zestawów do mutagenezy. Przykład, jak otrzymać mutanta D11F stosując zestaw Quick Exchange, dostępny od Stratagene Cloning Systems, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, USA, jest podany poniżej:

Sekwencję DNA kodującą ksylanazę A Bacillus subtilis opublikowano przez Paice i innych, 1986.

Sekwencja regionu kodujące jest następująca, przy czym sekwencja kodująca dojrzałe części białka, jest ukazana dużymi literami:

PL 212 113 B1 catatgtttaagtttaaaaagaatttcttagttggattatcggcagctttaatgagtatt agcttgttttcggcaaccgcctctgcaGCTAGCACAGACTACTGGCAAAATTGGACTGAT

GGGGGCGGTATAGTAAACGCTCTCAATGGGTCTGGCGGGAATTACAGTGTTAATTGGTCT

AATACCGGAAATTTTGTTGTTGGTAAAGGTTGGACTACAGGTTCGCCATTTAGGACGATA

AACTATAATGCCGGAGTTTGGGCGCCGAATGGCAATGGATATTTAACTTTATATGGTTGG

ACGAGATCACCTCTCATAGAATATTATGTAGTGGATTCATGGGGTACTTATAGACCTACT

GGAACGTATAAAGGTACTGTAAAAAGTGATGGGGGTACATATGACATATATACAACTACA

CGTTATAACGCACCTTCCATTGATGGCGATCGCACTACTTTTACGCAGTACTGGAGTGTT

CGCCAGTCGAAGAGACCAACCGGAAGCAACGCTACAATCACTTTCAGCAATCATGTGAAC

GCATGGAAGAGCCATGGAATGAATCTGGGCAGTAATTGGGCTTACCAAGTCATGGCGACA

GAAGGATATCAAAGTAGTGGAAGTTCTAACGTAACAGTGTGGTAA

Część genu kodująca dojrzałą część enzymu dzikiego typu można poddawać wewnątrzkomórkowej ekspresji w E.coli, metodami znanymi przez fachowców z dziedziny biologii molekularnej. Przykładowo:

1. Utworzenie kopii części opisanej dużymi literami wyżej opisanego genu przez stosowanie reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) z dodaniem miejsca dla enzymu restrykcyjnego Ndel (CATATG) przed GCTATCACAi dodaniem miejsca restrykcji HindIII (AAGCTT) po GTGTGGTAA.

2. Wprowadzenie otrzymanej modyfikowanej kopii genu, stosując wyżej wymienione enzymy, do wektora ekspresji pET24a(+), który można otrzymać od Novagen Inc.601 Science Drive, Madison, WI 53711 USA.

3. Transformowanie do odpowiedniego szczepu E.coli i ekspresja przez fermentację, jak opisano, przez wektor pET24a(+).

Nasz zmutowany enzym D11F można otrzymać stosując zestaw do mutagenezy ,,Quick Exchange zgodnie z producentem, i stosując wyżej opisaną konstrukcję ksylanaza dzikiego typu Bacillus subtilis-pET24a(+) oraz następujące primery mutagenezy PCR:

Primer sensowny:

CTACTGGCAAAATTGGACTTTTGGAGGAGGTATAGTAAACGCTG

Primer antysensowny:

CAGCGTTTACTATACCTCCTCCAAAAGTCCAATTTTGCCAGTAG

Zmutowany enzym ulega ekspresji i jest oczyszczany przy użyciu takich samych protokołów jak dla enzymu dzikiego typu.

P r z y k ł a d 4 - Badania inhibicji mutantów ksylanazy.

Mutanty ksylanazy w E.coli (patrz przykład 3) uzyskano w wyniku fermentacji i oczyszczono (co oznacza brak innej aktywności ksylolitycznej w oczyszczonym preparacie) przy użyciu etapu odsalania i etapu chromatografii wymiany kationu.

Te czyste preparaty mutanta ksylanazy rozcieńczono do 12 TXU/ml stosując 0,1 M kwas cytrynowy - 0,2 M bufor wodorofosforan dwusodowy, pH 5,0, i stosowano w następującym teście.

Wykonano stabilny preparat inhibitora zgodnie z protokołem opisanym w przykładzie 1. Ten stabilny preparat stosowano jako wyjściowy do wszystkich badań ksylanaza-inhibitor ksylanazowy. Stosując metodę oceny ilościowej inhibitora opisaną w przykładzie 1, uzyskano zawartość preparatu inhbitora wynoszącą 126 XIU/ml.

Test

Do 250 μ! rozcieńczonych preparatów zmutowanej ksylanazy dodaje się odpowiednio 0, 10, 25, 50 lub 100 μl preparatu inhibitora. Do tych mieszanin inhibitor-ksylanaza dodano 0,1 M kwas cytrynowy - 0,2 M bufor wodorofosforan disodowy, pH 5,0 uzyskując końcową objętość wynoszącą 1000 pl. Te mieszaniny reakcyjne inkubowano wstępnie przez 5 minut w temperaturze 40°C. Następnie do wszystkich mieszanin inhibitor-ksylanaza dodano 1 tabletkę Xylazyme (Megazyme, Irlandia). Po 10 minutach inkubacji w temperaturze 40°C, reakcje zakończono dodając 10 ml 2% Tris/NaOH, pH 12,0. Mieszaniny wirowano i niebieską barwę uwolnioną z substratu mierzono przy 590 nm.

PL 212 113 B1

Wyniki są przedstawione w tabeli 10.

T a b e l a 10

Względna inhibicja mutantów ksylanazy i pierwotnej ksylanazy (tutaj enzym dzikiego typu) jako funkcja inhibitora ksylanazowego

ID mutanta	0	1,26	3,15 6,3	12,6
			Względna inhibicja, %
Typ dziki	100	77	48	29	23
D11Y	100	120	114	126	124
D11N	100	93	72	53	32
D11F	100	114	119	116	115
D11K	100	109	112	113	116
D11S	100	98	81	60	38
D11W	100	101	88	70	50
G34D	100	94	83	70	53
G34F	100	76	53	34	29
G34T	100	99	99	93	86
Y113A	100	96	80	62	43
Y113D	100	96	81	63	45
Y113K	100	103	85	63	47
N114A	100	80	49	28	22
N114D	100	84	57	39	29
N114F	100	84	54	39	34
N114K	100	87	56	33	24
D121N	100	80	36	16	14
D121K	100	104	95	85	75
D121F	100	101	89	72	60
D121A	100	81	50	27	21
R122D	100	85	59	41	28
R122F	100	93	74	58	58
R122A	100	78	46	33	26
Q175E	100	87	59	40	31
Q175S	100	88	59	30	19
Q17 5L	100	78	42	25	23
G12F	100	110	106	100	92
G13F	100	104	95	87	84
I15K	100	84	47	28	23
N32K	100	82	42	19	14

PL 212 113 B1 cd. tabeli 10

G120K	100	85	52	29	22
G120D	100	84	47	24	18
G120F	100	71	35	18	15
G120Y	100	81	40	18	16
G120N	100	84	49	29	23
D119K	100	94	67	40	26
D119Y	100	87	50	28	22
D119N	100	91	74	44	22
T123K	100	80	46	30	25
T123Y	100	80	47	28	27
T123D	100	83	36	20	17
T124K	100	110	92	73	57
T124Y	100	101	76	49	33
T124D	100	87	52	32	25
N17K	100	88	48	31	26
N17Y	100	79	42	23	19
N17D	100	90	81	50	22
N29K	100	83	50	30	23
N29Y	100	85	49	30	24
N29D	100	74	44	26	20
S31K	100	77	42	23	23
S31Y	100	83	50	27	22
S31D	100	79	52	30	24
D11F/R122 D	100	709	111	110	109
D11F/G34D	100	704	106	103	104

Z wyników w tabeli 10 widać, że mutanty ksylanazy D11Y, D11F, D11K, D11F/R122D i D11F/G34D nie są inhibitowane przez endogeniczny inhibitor ksylanazy pszennej. Te mutanty ksylanazy, jak się oczekuje, działają bardziej agresywnie/specyficznie na rozpuszczalny arabinoksylan w porównaniu z innymi mutantami ksylanazy lub innymi ksylanazami. Będą one zatem lepsze w zastosowaniach, w których pożądana jest mniejsza lepkość (jako funkcja arabinoksylanu HMW).

P r z y k ł a d 5. Badania funkcjonalności mutantów ksylanazy.

Mutanty ksylanazy o ekspresji w E.coli (patrz przykład 3) uzyskano w wyniku fermentacji i oczyszczono (co oznacza brak innej aktywności ksylanolitycznej obecnej w oczyszczonym preparacie).

Te czyste preparaty mutantów rozcieńczono do 400 TXU/ml przy użyciu wody i wykorzystano w następującym teście.

Test

Sporządzono 200 ml 30% (wagowo) zawiesiny mąki przy użyciu wody (utrzymywanej w temperaturze 25°C), przez mieszanie przez 5 minut. 60,0 ml tej zawiesiny wylewa się do miseczki Ford i mierzy się czas potrzebny do odprowadzenia 50,0 ml. Ten pomiar jest pomiarem pustym. 60,0 ml zawiesiny wlewa się z powrotem i do zawiesiny dodaje się przy mieszaniu 1000 μl rozcieńczonego preparatu mutanta ksylanazy. Po 2, 5, 10 i 20 minutach do miseczki Ford wlewa się 60,0 ml i zapisuje czas odprowadzania dla 50,0 ml. Każdy pomiar wykonywano potrójnie.

Wyniki są przedstawione w tabeli 11.

PL 212 113 B1

T a b e l a 11

Względna lepkość zawiesiny mąki jako funkcja mutanta ksylanazy i ksylanazy macierzystej (tutaj ksylanazy dzikiego typu)

			Czas inkubacji, minuty
ID mutanta	0	2	5	10	20
		Względna zmiana lepkości, %
Typ dziki	100	112	120	131	141
D11Y	100	97	93	83	75
D11N	100	112	125	130	136
D11F	100	93	87	78	69
D11K	100	105	95	88	78
D11S	100	102	110	113	117
D11W	100	106	115	121	122
G34D	100	110	120	128	124
G34F	100	111	126	128	146
G34T	100	100	108	111	106
Y113A	100	118	129	130	124
Y113D	100	116	127	124	114
Y113K	100	118	123	121	115
N114A	100	117	128	127	131
N114D	100	125	144	162	170
N114F	100	113	119	131	150
N114K	100	119	129	141	147
D121N	100	104	103	106	104
D121K	100	122	132	141	162
D121F	100	107	117	128	147
D121A	100	101	102	103	107
R122D	100	120	119	124	115
R122F	100	127	144	150	160
R122A	100	123	138	144	153
Q175E	100	116	134	142	149
Q175S	100	110	113	121	129
Q175L	100	111	111	119	126
G12F	100	127	132	122	101
G13F	100	106	119	124	113
I15K	100	109	108	113	118
Ν32Κ	100	97	98	101	101
G120K	100	103	111	115	121

PL 212 113 B1 cd tabeli 11

G120D	100	112	122	120	126
G120F	100	103	111	117	130
G120Y	100	106	106	108	126
G120N	100	119	123	130	141
D119K	100	118	119	127	125
D119Y	100	102	102	111	110
D119N	100	126	137	145	146
Τ123Κ	100	106	109	121	120
Τ123Υ	100	101	106	108	116
T123D	100	113	123	125	126
Τ124Κ	100	117	131	128	127
Τ124Υ	100	112	123	132	135
T124D	100	103	110	111	118
Ν17Κ	100	114	119	119	132
Ν17Υ	100	102	102	108	108
N17D	100	120	131	135	143
Ν29Κ	100	98	100	100	104
Ν29Υ	100	115	117	132	143
N29D	100	104	104	113	111
S31K	100	119	115	124	134
S31Y	100	110	118	122	137
S31D	100	99	103	109	110
D11F/R12 2D	100	91	89	82	77
D11F/G34 D	100	96	93	84	80

P r z y k ł a d 6. Miejscowo skierowana mutacja w miejscu aktywnym ksylanazy A Bacillus subtilis nie wpływa na interakcję ksylanaza:inhibitor ksylanazy.

Resztę w aktywnym miejscu dzikiego typu enzymu ksylanazy A Bacillus subtilis, zmieniono przez miejscowo skierowaną mutagenezę (patrz przykład 3). W zmutowanej reszcie (Y166F) potencjalne wiązanie wodorowe jest utracone. Zmutowaną ksylanazę, która ulegała ekspresji w E.coli, poddano fermentacji i oczyszczono. Następnie, mutanta badano pod względem interakcji z inhibitorem ksylanazowym (patrz przykład 4).

Jak można zauważyć poniżej (tabela 12), wymiana aminokwasu w miejscu aktywnym, niespodziewanie nie miała żadnego wpływu na interakcje z inhibitorem ksylanazowym, w porównaniu z dzikiego typu enzymem ksylanazowym Bacillus subtilis .

T a b e l a 12

Względna inhibicja dzikiego typu ksylanazy Bacillus subtilis oraz zmutowanej ksylanazy Y166F.

			XIU/ml
ID ksylanazy	0	1,26	3,15	6,3	12,6
			Względna inhlibicja %
Typ dziki	100	75	40	24	20
Y166F	100	75	39	22	20

PL 212 113 B1

Skutkiem tego w podsumowaniu, wyżej opisane doświadczenie ukazuje miejscowo skierowaną mutację w miejscu aktywnym ksylanazy A Bacillus subtilis, która to mutacja nie ma wpływu na interakcje ksylanazy z inhibitorem ksylanazowym.

P r z y k ł a d 7. Mutacja skierowana miejscowo w ksylanazach rodziny 11 innych niż ksylanaza A Bacillus subtilis, wpływająca na interakcje ksylanaza-inhibitor ksylanazowy.

Resztę D19 enzymu ksylanazy A Thermomyces lanuginosus zmutowano do F19 przez mutagenezę skierowaną miejscowo. D19 odpowiada reszcie Dll w ksylanazie Bacillus subtilis (SEQ ID nr 1). Gen ksylanazy A Thermomyces lanuginosus jest opisany jako SEQ ID nr 9.

Primery do konstruowania PCR mutanta D19F mogą być następujące:

Primer sensowny:

GGTTATTACTATTCCTGGTGGAGTTTTGGAGGAGCGCAGGCCACG

Primer antysensowny:

CGTGGCCTGCGCTCCTCCAAAACTCCACCAGGAATAGTAATAACC

Otrzymaną zmutowaną ksylanazę (D19F) poddawano ekspresji w E.coli, fermentowano i oczyszczono. Następnie, zmutowaną i dzikiego typu ksylanazę A Thermomyces lanuginosus badano pod względem interakcji z inhibitorem ksylanazowym (patrz przykład 4) . Jak widać z wyników w tablicy 13, mutant D19F ksylanazy A Thermomyces lanuginosus jest znacznie mniej inhibitowana przez inhibitor ksylanazy w porównaniu z ksylanazą A Thermomyces lanuginosus dzikiego typu.

T a b e l a 13

Względna inhibicja dzikiego typu ksylanazy A Thermomyces lanuginosus (TLX) oraz zmutowanej ksylanazy Thermomyces lanuginosus, D19F (D19F)

			XIU/ml
ID ksylanazy	0	1,26	3,15	6,3	12,6
			Względna inhibicja %
TLX	100	45	24	17	14
D19F	100	73	38	24	20

Skutkiem tego w podsumowaniu, wyżej opisane doświadczenie ukazuje mutację skierowaną miejscowo, w ksylanazie A Thermomyces lanuginosus. Wyniki ukazują, że mutacja wprowadzająca substytucję aminokwasową na powierzchni cząsteczki ksylanazy (analogiczna do D11F u B.subtilis) zmienia interakcje ksylanaza:inhibitor ksylanazy. Tak więc, nasz wynalazek (czyli, że reszty powierzchniowe kontrolują poziom inhibicji ksylanazy) podtrzymują prawidziwość twierdzenia dla ksylanaz, które są homologiczne w stosunku do ksylanazy B.subtilis.

Podsumowanie

W podsumowaniu, niniejszy wynalazek podaje sposoby zmieniania wrażliwości enzymu ksylanazowego wobec inhibitora ksylanazowego.

Odniesienia

Courtin, C., Roelants, A. oraz Delcour, J., (1999). Fractionation-reconstitution experiments provide insight into the role of endoxylanases in bread-making. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47, 1870-1877.

D^'Appolonia, B.L. i MacArthur, L.A. (1976), Comparison of bran and endosperm pentosans in immature and mature wheat. Cereal Chem. 53, 711-718.

Debyser, W. i Delcour, J.A. (1998). Inhibitors of cellolytic, xylanolytic and β-glucanolytic enzymes. W098/4 927 8.

Hazlewood, G.P. i Gelbert, H.J. (1993). Recombinant xylanases. Zgłoszenie PCT WO 93/25693.

Ingelbrecht, J.A., Verwimp, T. i Delcour, J.A. (1999). Endoxylanases in durum wheat semolina processing: solubilisation of arabinoxylans, action of endogenous inhibitors and effects on rheological properties. J. Agri. Food Chem.

Jacobsen, T.S., Heldt-Hansen, H.P., Kofod, L.V., Bagger, C. i Mϋllertz, A. (1995). Processing plant materiał with xylanase. Zgłoszenie PCT WO 95/23514.

Kormelink, F.J.M. (1992). Characterisation and mode of action of xylanase and some accesory enzymes.

Ph.D.Thesis, Agricultural University Wageningen, Holandia (strona 175, angielskie i duńskie podsumowania).

PL 212 113 B1

McLauchlan, R., Garcia-Conesa, M.T., Williamson, G., Roza, M., Ravestein, P. i MacGregor, A.W., (1999a). A novel class of protein from wheat which inhibits xylanases. Biochem. J., 338, 441-446.

McLauchlan, R., Flatman, R i inni (1999) Poster Presentation from meeting at University of Newcastle (1999) 11-17 kwiecień. Xylanase inhibitors, a novel class of proteins from cereals.

Montgomery, R. i Smith, F. (1995). The Carbohydrates of the Gramineae. VIII. The constitution of a water soluble hemicellulose of the endosperm of wheat (Triticum vulgare). J. Am. Chem. Soc. 77, 3325-3328.

Paice, M.G., Bourbonnais, R., Desrochers, M., Jurasek, L. i Yaguchi, M. (1986): A Xylanase Gene from Bacillus subtilis: Nucleotide Sequence and Comparison with

B.pumilis Gene. Arch. Microbiol. 144, 201-206)

Rouau, X. (1993). Investigations into the effets of an enzyme preparation for baking on wheat flour dough pentosans. J.Cereal Science. 18, 145-157.

Rouau, X., E1-Hayek, M-L i Moreau, D. (1994) Effect of an enzyme preparation containing pentosanes on the bread quality of flour in relation to changes in pentosan properties. J.Cereal Science. 19,259-272.

Slade, L., Levine, H., Craig, S., Arciszewski, H i Saunders, S. (1993). Enzyme treated Iow moisture content comestible products. US 5200215 przez Nabisco.

Soerensen, J.F., i Sibbensen, 0 (1999). Bacterial xylanase. UK A 9828599.2

PL 212 113 B1

Lista sekwencji

Sekwencja aminokwasowa dojrzalej ksylanazy Bacillus subtilis (SEQ ID nr 1)

10 11 20 21. 30 31 40 41 50 51 60

ASTDYWQNWT DGGGIVNAVN GSGGNYS7NW SNTGNFWGK GWTTGSPFRT INYNAGWAP ?0 31 80 81 90 91 100 101 110 111 120

NGNGYLTLYC WTRSPLIEYY WDSWGTYRP TGTYKGTYKS DGGTYDIYTT TRYNAPSIDG

121 130 131 140 141 150 151 160 161 170 171 180

DRTTFTQYWS VRQSKR?TGS NAIITFSNHV NAWKSHGMNL GSNWAYQVMA TEGYQSSGSS

181

NVTVW

Sekwencje aminokwasowe pochodzące od inhibitora ksylanazy mąki pszennej Łańcuch A inhibitora

N-terminalny:

GAPVARAVEAVAPFGVCYDTKTLGNNLGGYAVPNV (35aa) SEQ ID nr 2

C-termianlny:

KRLGFSRLPHFTGCGGL (17aa) SEQ ID nr 3

Łańcuch B inhibitora

N-terminalny:

LPVPAPVTKDPATSLYTIPFH (21 aa) SEQ ID nr 4

Łańcuch B trawiony Lys-C:

LLASLPRGSTGVAGLANSGLALPAQVASAQK (31aa) SEQ ID nr 5 GGSPAHYISARFIEVGDTRVPSVE <24aa) SEQ IN nr 6 VNVGVLAACAPSK (13aa) SEQ ID nr 7

VANRFLLCŁPTGGPGVAIFGGGPVPWPQFTQSMPYTLWVK SEQ ID nr 8 Gen ksylanazy A Thermomyces lanuginosus (SEQ ID nr 9)

10 11 20 21 30 31 40 41 50 51 60

ATGCAGACAA CCCCCAACTC GGAGGGCTGG CACGATGGTT ATTACTATTC CTGGTGGAGT

70 71 80 81 90 91 100 101 100 111 120

GACGGTGGAG CGCAGGCCAC GTACACCAAC CTGGAAGGCG GCACCTACGA GATCAGCTGG

PL 212 113 B1

121 130 131 140 141 150

GGAGATGGCG GTAACCTCGT CGGTGGAAAG

181 190 191 200 201 210 ATCCACTTTG AGGGTGTTTA CCAGCCAAAC

241 250 251 260 261 270 ACCCGCAACC CGCTGGTCGA GTATTACATC

301 310 311 320 321 330 TCCGGTGCTA CCGATCTAGG AACTGTCGAG

361 670 371 380 381 390 ACCACTCGCG TCAACGCACC TAGCATCGAC

481 490 491 500 501 510 GCTCGCGCTG GTTTGAATGT CAACGGTGAC

541 550 551 560 561 570 TACTTCAGCA GCGGCTATGC TCGCATCACC

151 160 161 170 171 180

GGCTGGAACC CCGGCCTGAA CGCAAGAGCC

211 220 221 230 231 240

GGCAACAGCT ACCTTGCGGT CTACGGTTGG

271 280 281 290 291 300

GTCGAGAACT TTGGCACCTA TGATCCTTCC

331 340 341 350 351 360 TGCGACGGTA GCATCTATCG ACTCGGCAAG

391 400 401 410 411 420 GGCACCCAAA CCTTCGACCA ATACTGGTCG

511 520 521 530 531 540 CACTACTACC AGATCGTTGC AACGGAGGGC

571 580 581 588

GTTGCTGACG TGGGCTAA

PL 212 113 B1

Lista sekwencji <110> Danisco AZS

Sibbesen, Ole Sorensen, Jens <120> Enzym <130> p8526wo <140> PCT/IBO1/00426 <141> 2001-03-08 ' <150> GB 0005585.5 <151> 2000-03-00 <150> GB 0015751.1 <151> 2000-06-27 <1SQ> 66 . .

<170> PatentIrv wersja 3.0 <210> 1. ' ' <211> 185 ; . : .

<212> PRT .

‘Bacillus-subtilis < 4 0 0 > 1

Ala

Ser

Thr

Tyr

Trp

Gin

Aśn

Trp

Thr

Asp

Gly

Gly

Gly

Ile

Val

1

5

10

15

Asn

Ala

Val

Asń

Gly

Ser

Gly

Gly

Asn

Tyr

Ser

Val

Asn

Trp

Ser

Asn

20

25

30

Thr

Gly

Asń

Phe

Val

Val

Gly

Lys

Gly

Trp

Thr

Thr

Gly

Ser

Pro

Phe

35

40

45

Arg

Thr

Ile

Asn

Tyr

Asn

Ala

Gly

Val

Trp

Ala

Pro

Asn

Gly

Asn

Gly

50

55

60

Tyr

Leu

Thr

Leu

Tyr

Gly

Trp

Thr

Arg

Ser

Pro

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tvr

65

70

75

30

PL 212 113 B1

Val

Val

Asp Ser

Trp 85

Gly

Thr

Tyr Arg Pro Thr Gly Thr Tyr Lys

Gly

. 90

95

Thr

Val

Lys

Ser

Asp

Gly

Gly

Thr

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Thr

Thr

Thr

Arg

100

105

110

Tyr

Asn

Ala

Pro

Ser

Ile

Asp

Gly

Asp

Arg

Thr

Thr

Phe

Thr

Gin

Tyr

115

120

125

Trp

Ser

Val

Arg

Gin

Ser

Lys

Arg

Pro

Thr

Gly

Ser

Asn

Ala

Thr,

Ile

130

135

140

Thr

Phe

Ser

Asn

His

Val

Asn

Ala

Trp

Lys

Ser

His

Gly

Met

Asn

Leu

145

150

155

160

Gly

Ser

Asn

Trp

A 1

Tyr

G.lń

Val

Met

I.

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

165

170

175

Ser Gly Ser Ser flsn Val Thr Val Trp 180 185 <210> 2 <211> 35. · ..

<212> PRT <213> pszenica <4 Ó0> 2 . .......

Gly

1 Ćł

Pro

val

Ala

Arg

Aia

Val

Glu

Ala

Val

Ala

Pro

Phe

Gly

val

1

5

1Q

15

cys

Tyr

Asp

Thr

Lys

Thr

Leu'

Gly

Asn

Asn

Leu

Gly

Gly

Tyr

Ala

Val

25- 30

Pró Asn Val

<210>	35 3
<211>	17
<212>	PRT
<213>	Pszenica
<400>	3 :

Lys Arg Leu Gly Phe Ser Arg Leu Pro His Phe Thr Gly Cys Gly Gly

1
Leu
<210>	4
<211 >	21
<212>	PRT

PL 212 113 B1 <213> Pszenica <400> 4 .

Leu Pro Val Pro Ala Pro Val Thr Lys Asp Pro Ala Thr Ser Leu Tyr 1 5 10 15 '

Thr Ile Pro Phe His

-20
<210>	5
<211>	31
<212>	PRT
<213>	Pszenica
<400>	5

Leu 1 .

Leu

7\l3

Ser

Leu 5

Pro

Arg

Gly

Ser

Thr 10

Gly

Val

Ala

Gly

Leu Ala 15

Asn

Ser

Gly

Leu 20

Ala

Leu

Pro

Ala

Gin 25

Val

Ala

Ser

Ala

Gin 30

Lys

<210> S .

<211> 24 <212> PR?

<213> Pszenica <400> 6

Gly .Gly .Ser Pro Ala His Tyr Ile Ser Ala Arg Phe Ile Glu Val Gly i 5 10 15

Asp Thr Arg Val Pro Ser Val Glu 20 <210> 7 <211> 13 <212> PRT <213> Pszenica

PL 212 113 B1

Ala	Ile	Phe	Gly 20	Gly Gly Pro Val	Pro Trp 25	Pro Gin Phe Thr Gin Ser 30
Met	Pro	Tyr	Thr	Leu	Val	Val	Val	Lys
		35					40

<210> 9 <21ł> 588 <212> DNA <thermomyces lanuginosus <400> 9

atgcagacaa	cccccaactc	ggagggctgg	cacgatggtt	attactattc	ctggtggagt	60
gacggtggag	cgcaggccac	gtacaccaac	ctggaaggcg	gcacctacga	gatcagctgg	120
ggagatggcg	gtaacctcgt	cggtggaaag	ggctggaacc	ccggcctgaa	cgcaagagcc	180
atccactttg	agggtgttta	ccagccaaac	ggcaacagct	accttgcggt	ctacggttgg	240
acccgcaacc	cgctggtcga	gtattacatc	gtcgagaact	ttggcaccta	tgatccttcc'	300
tccggtgcta	ccgatctagg	aactgtcgag	tgcgacggta	gcatctatcg	actcggcaag	360
accactcgcg	tcaacgcacc	tagcatcgac	ggcacccaaa	ccttcgacca	atactggtcg	420
gtccgccagg	acaagcgcac	cagcggtacc	gtccagacgg	gctgccactt.	cgacgcctgg	480
gctcgcgctg	gtttgaatgt	caacggtgac	cactactacc	agatcgttgc	aacggagggc	540
tacttcagca	gcggctatgc	tcgcatcacc	gttgctgacg	tgggctaa		588

<210> 10 <211> 645 ' <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400 10

catatgttta	agtttaaaaa	gaatttctta	gttggattat	cggcagcttt	aatgagtatt	60
agcttgtttt	cggcaaccgc	ctctgcagct	agcacagact	actggcaaaa	ttggactgat	120
gggggcggta	tagtaaacgc	tgtcaątggg	tctggcggga	attacagtgt	taattggtct	180
aataccggaa	attttgttgt	tggtaaaggt	tggactacag	gttcgccatt	taggaogata	240
aactataatg	ccggagtttg	ggcgccgaat	ggcaatggat	atttaacttt	atatggttgg	300
acgagatcac	ctctcataga	atattat-gta	gtggattcat	ggggtactta	tagacctact	3 60
ggaacgtata	aaggtactgt	aaaaagtgat	gggggtacat	atgaoatata	tacaactaca	420
cgttataacg	caccttccat	tgatggcgat	cgcactactt	ttacgcagta	ctggagtgtt	480
cgccagtcga	agagaccaac	cggaagcaac	gctacaatca	ctttcagcaa	tcatgtgaac	540

PL 212 113 B1

gcatggaaga gccatggaat gaaggatatc aaagtagtgg	gaatctgggc aagttctaac	agtaattggg gtaacagtgt	cttaccaagt ggtaa	catggcgaca	600 645
<210>	11
<211>	657					-
<212>	DNA
<213>	Sztuczny
<220>
<223>	Opis sztucznej	sekwencj i:	sekwencja	ksylanazy A	0. subtilis	z

dodanym miejscem restrykcyjnym <400> 11

catatgttta	agtttaaaaa	gaatttctta	gttggattat	cggcagcttt	aatgagtatt	60
agcttgtttt	cggcaaccgc	ctctgcacat	atggctagca	cagactactg	gcaaaattgg'	120
actgatgggg	gcggtatagt	aaacgctgtc	aatgggtctg	gcgggaatta	cagtgttaat	180
tggtctaata	ccggaaattt	tgttgttggt	aaaggttgga	ctacaggttc	gccatttagg	240
acgataaact	ataatgccgg	agtttgggcg	ccgaatggca	atggatattt	aactttatat	300
ggttggacga	gatcacctct	catagaatat	tatgtagtgg	attcatgggg	tacttataga	360
cctactggaa	cgtataaagg	t c λ. t a .a a	agtgatgggg	gtacatatga	catatataca	420
actacacgtt	ataacgcacc	ttccattgat	ggcgatcgca	ctacttttac	gcagtactgg	480
agtgttcgcc	agtcgaagag	accaaccgga	agcaacgcta	caatcacttt	cagcaatcat	540
gtgaacgcat	ggaagagcca	tggaatgaat	ctgggcagta	attgggctta	ccaagtcatg	600
gcgacagaag	gatatcaaag	tagtggaagt	tctaacgtaa	cagtgtggta	aaagctt	657

<210> 12 < 2 11 > 4 4 <212> DNA <213> Sztuczny <220>

<223> Opis sztucznej sekwencji: primer sensowny ' <400> 12 ctactggcaa aattggactt ttggaggagg tatagtaaac gctg 44 <210> 13 <211> 44

PL 212 113 B1

<212>	DNA
<213>	Sztuczny

<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji: primer antysensowny
<400>	13

cagcgtttac tatacctcct ccaaaagtcc aattttgcca gtag 44

<210	14
<211>	45
<212>	DNA
<213>	Sztuczny '

<220
<223>	Opis sztucznej sekwencji: Primer sensowny
<400	14 ' '

ggttattact attcctggtg gagttttgga ggagcgcagg ccacg ' 45

<210	15
<211>	45
<212>	DNA
<213>	Sztuczny

<220>
<223>	Opis sztucznej sekwencji: primer antysensowny
<400	15

egtggcctgc gctcctccaa aactccacca ggaatagtaa taacc 45

<210>	16
<211>	213
<212>	PRT
<213>	Baciilus subtilis
<400	16

PL 212 113 B1

Met 1

Phe

Lys

Phe

Lys 5

Lys

Asn

Phe

Leu

Val 10

Gly

Leu

Ser

Ala

Ala 15

Leu

Met

Ser

Ile

Ser

Leu

Phe

Ser

Ala

Thr

Ala

Ser

Ala

Ala

Ser

Thr

Asp

20

25

30

Tyr

Trp

Gin

Asn

Trp

Thr

Asp

Gly

Gly

Gly

Ile

Vai

Asn

Ala

Val

Asn

35

40

45

Gly

Ser

Gly

Gly

Asn

Tyr

Ser

Val

Asn

Trp

Ser

Asn

Thr

Gly

Asn

Phe

50

55

60

Val

Val

Gly

Lys

Gly

Trp

Thr

Thr

Gly

Ser

Pro

Phe

Arg

Thr

I le

Asn

65

70

75

80

Tyr

Asn

Ala

Gly

Val

Trp

Ala

Pro

Asn

Gly

Asn

Gly

Tyr

Leu

Thr

Leu

85

90

95

Tyr

Gly

Trp

Thr

Arg

Ser

Pro

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tyr

Val

Val

Asp

Ser

100

105

110

Trp

Gly

Thr

Tyr

Arg

Pro

Thr

Gly

Thr

Tyr

Lys

Gly

Thr

Val

Lys

Ser

115

120

125

Asp

Gly

Gly

Thr

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Thr

Thr

Thr

Arg

Tyr

Asn

Ala

Pro

130

135

140

Ser

Ile

Asp

Gly

Asp

Arg

Thr

Thr

Phe

Thr

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

145

150

155

160

Gin

Ser

Lys

Arg

Pro

Thr

Gly

Ser

Asn

Ala

Thr

Ile

Thr

Phe

Ser

Asn

165

170

175

His

Val

Asn

Ala

Trp

Lys

Ser

His

Gly

Met

Asn

Leu

Gly

Ser

Asn

Trp

180

185

190

Ala

Tyr

Gin

Val

Met

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Ser

Ser

195

200

205

Asn

Val

Thr

Val

Trp

210

<210> :

L 7

<2ii> ;

213

<212> i

?RT

<213> i

Sacillus

circulans

<400>

17 Lys

Phe

Lys 5

Lys

Asn

Phe

Leu

Val 10

Gly Leu Sfer Ala

Ala 15

Ls u

Met 1

Phe

Met

Ser

Ile

Ser 20

Leu

Phe

Ser

Ala

Thr 25

Ala

Ser Ala Ala Ser 30

Thr

Asp-

Tyr

Trp

Gin 35

Asn

Trp

Thr

Asp

Gly 40

Gly

G1 y

Ile Vał Asn Ala 45

Val

Asn

Gly

Ser 50

Gly

Gly

Asn

Tyr

Ser 55

Val

Asn

Trp

Ser Asn Thr Gly 60

Asn

Phe

Val 65

Val

Gly

Lys

Gly

Trp 70

Thr

Thr

Gly

Ser

Pro Phe Arg Thr 7 5

Ile

Asn 30

PL 212 113 B1

Tyr

Asn

Ala

Gly

Val 85

Trp

1 a

Pro

Asn

Gly 90

Asn

Gly

Tyr

Leu

Thr 95

Leu

Tyr

Gly

Trp

Thr 100

Arg

Ser

Pro

Leu

Ile 105

Glu

Tyr

Tyr

Val

Val 110

Asp

Ser

Trp

Gly

Thr 115

Tyr

Arg

Pro

Thr

Gly 120

Thr

Tyr

Lys

Gly

Thr 125

Val

Lys

Ser

Asp

Gly 130

Gly

Thr

Tyr

Asp

Ile 135

Tyr

Thr

Thr

Thr

Arg 140

Tyr

Asn

Ala

Pro

Ser 145

Ile

Asp

Gly

Asp

Arg 150

Thr

Thr

Phe

Thr

Gin 155

Tyr

Trp

Ser

Vai

Arg 160

Gin

Ser

Lys

Arg

Pro 165

Thr

Gly

Ser

Asn

Ala 170

Thr

Ile

Thr

Phe

Thr 175

Asn

His

Val

Asn

Ala 180

Trp

Lys

S e r

His

Gly 185

Met

Asn

Leu

Gly

Ser 190

Asn

Trp

Ala

Tyr

Gin 195

Val

Met

Ala

Thr

Glu 200

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser 205

Gly

Ser

Ser

Asn

Val 210

Thr

Val

Trp

<210> '

18

<211

> :

211

<212> :

PRT

<213> ]

Bacillus

stearothermophilus

<400> :

18

Met I '

Lys

Leu

Lys

Lys 5

Lys

Met

Leu

Thr

Leu 10

Leu

Leu

Thr

Ala

Ser 1 <

Met

Ser

Phe

Gly

Leu 20

Phe

Gly

Ala

Thr

Ser 25

Ser

Ala

Ala

Thr

Asp 30

Tyr

Trp

Gin

Tyr

Trp 35

Thr

Asp

Gly

Gly

Gry 40

Met

Val

Asn

Ala

Val 45

Asn

Giy

Pro

Gly

Gly 50

Asn

Tyr

Ser

Val

Thr 55

Trp

Gin

Asn

Thr

Gly 60

Asn

Phe

Val

Val

Gly 65

Lys

Gly

Trp

Thr

Val 70

Gly

Ser

Pro

Asn

Arg 7 5

Va.l

Ile

Asn

Tyr

Asn 80

Ala

Gly

Ile

Trp

Glu 85

Pro

Ser

Gly

Asn

Gly 90

Tyr

Leu

Thr

Leu

Tyr 95

Gly

Trp

Thr

Arg

Asn 100

Ala

Leu

Ile

G.lu

Tyr 105

Tyr

Vai

Val

Asp

Ser 110

Trp

Gly

Thr

Tyr

Arg

Ala

Thr

Gly

Asn

Tyr 120

Glu

Ser

Gly

Thr

Val 125

Asn

Ser

Asp

Gly

Gly 130

Thr

Tyr

Asp

Ile

Tyr 135

Thr

Thr

Met

Arg

Tyr 14 0

Asn

Ala

Pro

Ser

PL 212 113 B1

Ile Asp Gly 145

Thr

Gin

Thr 150

Phe

Gin

Gin

Phe

Trp 155

Ser

Val

Arg

Gin

Ser 160

Lys Arg Pro

Thr

Gly

Ser

Asn

Val

Ser

Ile

Thr

Phe

Ser

Asn

His

Val

165

170

175

Asn Ala Trp

Arg

Ser

Lys

Gly

Met

Asn

Leu

Gly

Ser

Ser

Trp

Ala

Tyr

180

185

190

Gin Val Leu

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Arg

Ser

Asn

Val

195

200

205

Thr Val Trp

210

<210> 19

<211> 211

<212> PRT

<213> A. caviae

<400> 19

Met Phe Lys

Phe

Gly

Lys

Lys

Leu

Met

Thr

Val

Val

Leu

Ala

Ala

Ser

1

5

10

15

Met Ser Phe

Gly

Val

Phe

Ala

Ala

Thr

Ser

Ser

Ala

Ala

Thr

Asp

Tyr

20

25

30’

Trp Gin Asn

Trp

Thr

Asp

Gly

Gly

Gly

Thr

Val

Asn

Ala

Vai

Asn

Gly

35

40'

45

Ser Gly Gly

Asn

Tyr

Ser

Val

Ser

Trp

Gin

Asn

Thr

Gly

Asn

Phe

Val

50

55

60

Val Gly Lys

Gly

Trp

Thr

Tyr

Gly

Thr

Pro

Asn

Arg

Val

Val

Asn

Tyr

65

70

7 5

80

Asn Ala Gly

Val

.Phe

Ala

Pro

Ser

Gly

Asn

Gly

Tyr

Leu

Thr

Phe

Tyr

85

90

95

Gly Trp Thr

Arg

Asn

Ala

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tyr

Val

Val

Asp

Ser

Trp

100

105

110

Gly Thr Tyr

Arg

Pro

Thr

Gly

Thr

Tyr

Lys

Gly

Thr

Val

Asn

Ser

Asp

115

120

125

Gly Gly Thr

Tyr

Asp

I le

Tyr

Thr

Thr

Met

Arg

Tyr

Asn

Ala

Pro

Ser

130

135

140

Ile Asp Gly

Thr

Gin

Thr

Phe

Pro

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Gin

Ser

145

150

155

160

Lys Arg Pro

Thr

Gly

Val

Asn

Ser

Thr

Ile

Thr

Phe

Ser

Asn

His

Val

165

no

17 5

Asn Ala Trp

Pro

Ser

Lys

Gly

Met

Tyr

Leu

Gly

Asn

Ser

Trp

Ser

Tyr

180

185

190

Gin Val Met

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Asn

Ala

Asn

Val

195

200

205

Thr Val Trp

210

PL 212 113 B1

<210>	20
<211>	221
<212>	PRT
<213>	C. carbonum

<400> 20 .

Met

Val

Ser

Phe

Thr

Ser

Ile

Ile

Thr

Ala

Ala

Val

Ala

Ala

Thr

Gry

1

5

10

15

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Ala

Thr

Asp

Val

Ser

Leu

Val

Ara

Arg

Gin

Asn

20

25

30

Thr

Pro

Asn

Gl y

Glu

Gly

Thr

His

Asn

Gly

Cys

Phe

Trp

Ser

Trp

Trp

35

40

4S

Ser

Asp

Gly

Gly

Ala

Arg

Ala

Thr

Tyr

Thr

Asn

Gly

Ala

'Gly

Gly

Ser

50

55

60

Tyr

Ser

Val

Ser

Trp

Gly

Ser

Giy

Gly

Asn

Leu

Val

Gl-y

Gly

Lys

Gly

55

70

75

50

Trp

Asn

Pro

Gly

Thr

Ala

Arg

Thr

Ile

Thr

Tyr

Ser

Gly

Thr

Tyr

Asn

85

90

95

Tyr

Asn

Gly

Asn

Ser

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gly

Trp

Thr

Arg

Asn

Pro

100

105

110

Leu

Val

Glu

Tyr

Tyr

Val

Val

Glu

Asn

Phe

Gly

Thr

Tyr

Asp

Pro

115

120

125

Ser

Gin

Ser

Gin

Asn

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

Ser

Asp

Gly

Ser

Ser

Tyr

130

135

140

Lys

Ile

Ala

Gin

Ser

Thr

Arg

Thr

Asn

Gin

Pro

Ser

Ile

Asp

Gly

Thr

145

150

155

160

Arg

Thr

Phe

Gin

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Gin

Asn

Lys

Arg

Ser

Ser

165

170

175

Gly

Ser

Val

Asn

Met

Lys

Thr

His

Phe

Asp

Ala

Trp

Ala

Ser

Lys

Gly

180

135

190

Met

Asn

Leu

Gly

Gin

His

Tyr

Tyr

Gin

Ile

Val

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

195

200

205

Phe

Ser

Thr

Gly

Asn

Ala

Gin

Ile

Thr

Val

Asn

Cys

Pro

210

215

220

<210>	21
<21i>	227
<212>	PRT
<2 13>	H.
<400>	21

PL 212 113 B1

Met 1

Val

Ser

Phe

Thr 5

Ser

Ile

Ile

Thr Ala Ala 10

Val

Ala

Ala

Thr C. X _

Gly

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Al a

Thr

Asp

Ile

Ala

Ala

Arg

Ala

Pro

Ser

Asp

20

25

30

Leu

Val

Ala

Arg

Gin

Ser

Thr

Pro

Asn

Gly

Glu

Gly

Thr

His

Asn

Gly

35

40

45

Cys

Phe

Tyr

Ser

Trp

Trp

Ser

Asp

Gly

Gly

Al a

Arg

Al a

Thr

Tyr

Thr

50

55

60

As η

Gly

Ala

Gly

Gly

Ser

Tyr

Ser

Val

Ser

Trp

Gly

Thr

Gly

Gly

Asn

65

70

75

80

Leu

Val

Gly

Gly

Lys

Gly

Trp

Asn

Pro

Gly

Thr

Ala

Arg

Thr

Ile

Thr

85

90

95

Tyr

Ser

Gly

Gin

Tyr

Asn

Pro

Asn

Gly

Asn

Ser

Tyr

Leu

il

I le

Tyr

100

105

110

Gly

Trp

Thr

Arg

Asn

Pro

Leu

Val

Glu

Tyr

Tyr

Val

Val

Glu

Asn

Phe

115

120

125

Gly

Thr

Tyr

Asp

Pro

Ser

Ser

Gin

Ala

Gin

Asn

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

130

135

140

Ser

Asp

Gly

Ser

Ser

Tyr

Lys

Ile

Ala

Gin

Ser

Thr

Arg

Thr

Asn

Gin

.145.

150

155

160

Pro

Ser

Ile

Asp

Gly

Thr

Arg

Thr

Phe

Gin

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

165

170

175

Gin

Asn

Lys

Arg

Ser

Ser

Gly

Ser

Val

Asn

Met

Lys

Thr

-His

Phe

Asp

180

185

190

Ala

Trp

Ala

Ser

Lys

Gly

Met

Asn

Leu

Gly

Ser

His

Tyr

Tyr

Gin

ΐ Ls

195

200

205

Val

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Phe

Ser

Ser

Gly

Ser

Ala

Ser

Ile

Thr

Yal

210

215

220

Asn

Cys

Pro

225 <210> 22 <211> 227..

<212> PRT <213> A. pisi <400> 22

Met 1

Yal

Ser

Phe

Thr 5

Ser

Ile

Phe

Thr

Ala 10

Ala

Val

Ala

Ala

Thr i 5

Gly

Ala

Leu

Ala

Val 20

Pro

Yal

Thr

Asp

Leu 25

Ala

Thr

Arg

Ser

Leu 30

Gly

Ala

Leu

Thr

Ala 35

Arg

Ala

Gly

Thr

Pro 40

Ser

Ser

Gin

Gly

Thr 45

His

Asn

Gly

Cvs

. Phe

Tyr

Ser

Trp

Trp

Thr

Asp

Gly

Gly

Ala

Gin

Ala

Thr

Tyr

Thr

55 60

PL 212 113 B1

Asn 65

Gly

Ala

Gly

Gly

Ser 70

Tyr

Ser

Val

Asn

Trp 75

Lys

Thr

Gly

Gly

Asn 80

Leu

Val

Gly

Gly

Lys

Gly

Trp

Asn

Pro

Gly

Ala

Ala

Arg

Thr

Ile

Thr

85

90

95

Tyr

Ser

Gly

Thr

Tyr

Ser

Pro

Ser

Gly

Asn

Ser

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

100

105

110

Gly

Trp

Thr

Arg

Asn

Pro

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tyr

Val

Val

Glu

Asn

Phe

115

120

125

Gly

Thr

Tyr

Asp

Pro

Ser

Ser

Gin

Ala

Thr

Val

Lys

Gly

Ser

Val

Thr

130

135

140

Ala

Asp

Gly

Ser

Ser

Tyr

Lys

Ile

Ala

Gin

Thr

Gin

Arg

Thr

Asn

Gin

145

150

155

160

Pro

Ser

Ile

Asp

Gly

Thr

Gin

Thr

Phe

Gin

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

165

170

175

Gin

Asn

Lys

Arg

Ser

Ser

Gly

Ser

Val

Asn

Met

Lys

Thr

His

Phe

Asp

180

185

190

Ala

Trp

Ala

Ala

Lys

Gly

Met

Lys

Leu

Gly

Thr

His

Asn

Tyr

Gin

Ile

195

200

205

Val

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Phe

Ser

Ser

Gly

Ser

^tl cl

Gin

Ile

Thr

Val

210

215

220

Asn

Cys

Ala

225

<210>

23

<2r

L> .

201

<212>

PRT

<213>

S. commune

<400> :

23

Ala

Ala

Ser

Gly

Thr

Pro

Ser

Ser

Thr

Gly

Thr

Asp

Gly

Gly

Tyr

Tyr

1

5

10

15

Tyr

Ser

Trp

Trp

Thr

Asp

Gly

Ala

Gly

Asp

Ala

Thr

Tyr

Gin

Asn

Asn

20

25

30

Gly

Gly

Gly

Ser

Tyr

Thr

Leu

Thr

Trp

Ser

Gly

Asn

Asn

Gly

Asn

Leu

3 5

40

45

Val

Gly

Gly

Lys

Gly

Trp

Asn

Pro

Gly

Ala

Ala

Ser

Arg

Ser

Ile

Ser

50

55

60

Tyr

Ser

Gly

Thr

Tyr

Gin

Pro

Asn

Gly

Asn

Ser

Tyr

Leu

Ser

Val

Tyr

65

70

75

50

Gly

Trp

Thr

Arg

Ser

Ser

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Val

Glu

Ser

Tyr

85

90

95

Gly

Ser

Tyr

Asp

Pro

Ser

Ser

Ala

Ala

Ser

His

Lys

Gly

Ser

Val

Thr

100

105

110

PL 212 113 B1

Cys

Asn Gly 115

Ala

Thr

Tyr

Asp

Ile 120

Leu

Ser

Thr

Trp

Arg 125

Tyr

Asn

Ala

Pro

Ser

Ile

Asp

Gly

Thr

Gin

Thr

Phe

Glu

Gin

Phe

Trp

Ser

Vai

Arg

130

135

140

Asn

Pro

Lys

Lys

Ala

Pro

Gly

Gly

Ser

Ile

Ser

Gly

Thr

Val

Asp

Val

145

150

155

160

Gin

Cys

His

Phe

Asp

Ala

Trp

Lys

Gly

Leu

Gly

Met

Asn

Leu

Gly

Ser

165

170

175

Glu

His

Asn

Tyr

Gin

Ile

Val

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

180

185

190

Thr

Ala

Thr

Ile

Thr

Val

Thr

Ala

Ser

195

200

<210>

24

<211>

225

<212>

PRT

<213> 1

T. lanuginosus

<400>

24

Met

Val

Gly

Phe

Thr

Pro

Val

Ala

Leu

Ala

Ala

Leu

Ala

Ala

Thr

Gly

1

5

10

15

Ala

Leu

Ala

Phe

Pro

Ala

Gly

Asn

Ala

Thr

Glu

Leu

Glu

Lys

Arg

Gin

20

25

30

Thr

Thr

Pro

Asn

Ser

Glu

Gly

Trp

His

Asp

Gly

Tyr

Tyr

Tyr

Ser

Trp

35

40

45

Trp

Ser

.Asp

Gly

Gly

Ala

Gin

Ala

Thr

Tyr

Thr

Asn

Leu

Glu

Gly

Gly

50

55

60

Thr

Tyr

Glu

Ile

Ser

Trp

Gly

Asp

Gly

Gly

Asn

Leu

Val

Gly

Gly

Lys

65

“70

75

80

Gly

Trp

Asn

Pro

Gly

Leu

Asn

Ala

Arg

Ala

Ile

His

Phe

Glu

Gly

Val

85

90

95

Tyr

Gin

Pro

Asn

Gly

Asn

Ser

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gly

Trp

Thr

Arg

100

105

110

Asn

Pro

Leu

Val

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Val

Glu

Asn

Phe

Gly

Thr

Tyr

Asp

115

120

12 5

Pro

Ser

Ser

Gly

Ala

Thr

Asp

Leu

Gly

Thr

Val

Glu

Cys

Asp

Gly

Ser

130

135

140

Ile

Tyr

Arg

Leu

Gly

Lys

Thr

Thr

Arg

Val

Asn

Ala

Pro

Ser

Ile

Asp

145

150

155

160

Gly

Thr

Gin

Thr

Phe

Asp

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Gin

Asp

Lys

Arg

165

170

17 5

Thr

Ser

Gly

Thr

Val

Gin

Thr

Glv

Cys

His

Phe

Asp

Ala

Trp

Ala

Arg

180

185

190

Ala

Gly

Leu

Asn

Val

Asn

Gly

Asp

His

Tyr

Tyr

Gin

Ile

Val

Ala

Thr

195

200

205

PL 212 113 B1

Glu Gly Tyr Phe Ser Ser Gly Tyr Ala Arg Ile Thr Val, Ala Asp Val 210 215 220

Gly

225 <210> 25 <211> 231 <212> PRT <213> C. carbonum

<400> 25

Met

Val

Ser

Phe

Lys

Ser

Leu

Leu

Łeu

Ala

Ala

Val

Ala

Thr

Thr

Ser

1

5

10

15

Val

Leu

Ala

Ala

Pro

Phe

Asp

Phe

Leu

Arg

Glu

Arg

Asp

Asp

Val

Asn

20

25

30

Ala

Thr

Ala

Leu

Leu

Glu

Lys

Arg

Gin

Ser

Thr

Pro

Ser

Ala

Glu

Gly

35

40

45

Tyr

His

Asn

Gly

Tyr

Phe

Tyr

Ser

Trp

Trp

Thr

Asp

Gly

Gly

Gly

Ser

50

55

60

Ala

Gin

Tyr

Thr

Met

Gly

Glu

Gly

Śer

Arg

Tyr

Ser

Val

Thr

Trp

Arg

65

70

75

8 0

Asn

Thr

Gly

Asn

Phe

Val

Gly

Gly

Łys

Gly

Trp

Asn

Pro

Gly

Ser

Gly

85

90

95

Arg

Val

Ile

Asn

Tyr

Gly

Gly

Ala

Phe

Asn

Pro

Gin

Gly

Asn

Gly

Tyr

100

105

110

Leu

Ala

Val

Tyr

Gly

Trp

Thr

Arg

Aśn

Pro

Leu

Val

Glu

Tyr

Tyr

Val

115

120

125

Ile

Glu

Ser

Tyr

Gly

Thr

Tyr

Asn

Pro

Ser

Ser

Gly

Ala

Gin

Ile

Lys

130

135

140

Gly

Ser

Phe

Gin

Thr

Asp

Gly

Gly

Thr

Tyr

Asn

Val

Ais

Val

Ser

Thr

145

150

155

160

Arg

Tyr

Asn

Gin

Pro

Ser

Ile

Asp

Gly

Thr

Arg

Thr

Phe

Gin

Gin

Tyr

165

170

175

Trp

Ser

Vai

Arg

Thr

Gin

Lys

Arg

Val

Gly

Gly

Ser

Val

Asn

Met

Gin

180

185

190

Asn

His

Phe

Asn

Ala

Trp

Ser

Arg

Tyr

Gly

Leu

Asn

Leu

Gly

Gin

His

195

200

205

Tyr

Tyr

Gin

Ile

Val

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Ser

Ser

210

215

220

Asp

Ile

Tyr

Val

Gin

Thr

Gin

225

230

<210> 26 <211> 231

PL 212 113 B1 <212> PRT <213> C. sativus <400> 25

Met 1

Val

Ser

Phe

Lys 5

Ser

L(3U

Leu

Le u

^\1 a 10

A1. a

Val

Al a

Thr

Thr 15

Ser

Vai

Leu

Ala

Ala

Pro

Phe

Asp

Phe

Leu

Arg

Glu

Arg

Asp

Asp

Gly

Asn

20

25

30

Ala

Thr

Ala

Leu

Leu

Glu

Lys

Arg

Gin

Ser

Thr

Pro

Ser

Ser

Glu

Gly

35

40

45

Tyr

His

Asn

Gly

Tyr

Phe

Tyr

Ser

Trp

Trp

Thr

Asp

Gly

Gly

Gly

Ser

50

55

60

Ala

Gin

Tyr

Thr

Met

Gly

Glu

Gly

Ser

Arg

Tyr

Ser

Val

Thr

Trp

Arg

65

70

75

80

Asn

Thr

Gly

Asn

Phe

Val

Gly

Gly

Lys

Gly

Trp

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

85

90

95

Arg

Val

Ile

Asn

Tyr

Gly

Gly

Al a

Phe

Asn

Pro

Gin

GI v

Asn

Gly

Tyr

100

105

110

Leu

Ala

Val

Tyr

Gly

Trp

Thr

Arg

Asn

Pro

Leu

Va 1

Glu

Tyr

Tyr

Val

115

120

125

Ile

Glu

Ser

Tyr

Gly

Thr

Tyr

Asn

Pro

Ser

Ser

Gly

Ala

.Gin

Val

Lys

130

135

140

Gly

Ser

Phe

Gin

Thr

Asp

Gly

Gly

Thr

Tyr

Asn

Val

Ala

Va 1

Ser

Thr

145

150

155

160

Arg

Tyr

Asn.

Gin

Pro

Ser

Ile

Asp

G1 y

Thr

Arg

Thr

Phe

Gin

Gin

Tyr

165

170

175

Trp

Ser

Val

Arg

Gin

Gin

Lys

Arg

Val

Gly

Gly

Ser

Val

Asn

Met

Gin

180

185

190

Asn

His

Phe

Asn

Ala

Trp

Ser

Arg

Tyr

Gly

Leu

Asn

Leu

Gly

Gin

His

195

200

205

Tyr

Tyr

Gin

Ile

Val

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Ser

Ser

210

215

220

Asp

Ile

Tyr

Val

Gin

Thr

Gin

225

230

<210>

27

<211>

227

<212>

PRT

<213>

H. insolens

<400>

27

Met

Val

Ser

Leu

Lys

Ser

Val

Leu

Ala

Al a

Ala

Thr

Ala

Val

ger

Ser

1

5

10

ł 3

PL 212 113 B1

Ala

Ile

Ala

Ala 20

Pro

Phe Asp

Phe Val 25

Pro

Arg

Asp

Asn

Ser 30

Thr

Ala

Leu

Gin

Ala

Arg

Gin

Val

Thr

Pro

Asn

Al a

Glu

Gly

Trp

His

Asn

Gly

35

40

45

Tyr

Phe

Tyr

Ser

Trp

Trp

Ser

Asp

Gly

Gly

Gly

Gin

Val

Gin

Tyr

Thr

50

55

60

Asn

Leu

Glu.

Gly

Ser

Arg

Tyr

Gin

Val

Arg

Trp

Arg

Asn

Thr

Gly

Asn

65

70

75

80

Phe

Val

Gly

Gly

Lys

Gly

Trp

Asn

Pro

Gly

Thr

Gly

Arg

Thr

Ile

Asn

85

90

95

Tyr

Gly

Gly

Tyr

Phe

Asn

Pro

Gin

Gly

Asn

Gly

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

100

105

110

Gly

Trp

Thr

Arg

Asn

Pro

Leu

Val

Glu

Tyr

Tyr

Val

Ile

Glu

Ser

Tyr

115

120

125

Gly

Thr

Tyr

Asn

Pro

Gly

Ser

Gin

Ala

Gin

Tyr

Lys

Gly

Thr

Phe

Tyr

130

135

140

Thr

Asp

Gly

Asp

Gin

Tyr

Asp

Ile

Phe

Val

Ser

Thr

Arg

Tyr

Asn

Gin

145

150

155

160

Pro

Ser

Ile

Asp

Gly

Thr

Arg

Thr

Phe

Gin

Gin

Tyr

Trp

Ser

Ile

Arg

165

170

175

Lys

Asn

Lys

Arg

Val

Gly

Gly

Ser

Val

Asn

Met

Gin

Asn

His

Phe

Asn

180

185

190

Ala

Trp

Gin

Gin

His

Gly

Met

Pro

Leu

Gly

Gin

His

Tyr

Tyr

Gin

Val

195

200

205

Val

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Glu

Ser

Asp

Ile

Tyr

Val

210

215

220

Gin

Thr

His

225

<210> .28

<211> 233

<212> PRT

<213> M. grisea

<400>

28

Met 1

Val

Ser

Phe

Thr 5

Ser

Ile

Val

Thr

Ala 10

Val

Val

Ala

Leu

Ala 15

Gly

Ser

Ais

Leu

Ala 20

Ile

Pro

Ala

Pro

Asp 25

Gly

Asn

Met

Thr

Gly 30

Phe

Pro

Phe

Glu

Gin 35

Leu

Met

Arg

Arg

Gin 40

Ser

Thr

Pro

Ser

Ser 4 5

Thr

Gly

Arg

His

Asn 50

Gly

Tyr

Tyr

Tyr

Ser 55

Trp

Trp

Thr

Asp

Glv 60

Ala

Ser

Pro

Val

PL 212 113 B1

Gin 65

Tyr

Gin

Asn

Gly Asn Gly Gly Ser Tyr Ser

Vai

Gin

Trp

Gin

Ser 80

70

75

Gly

Gly

Asn

Phe

Val

Gly

Gly

Lys

Gly

Trp

Met

Pro

Gly

Gly

Ser

Lys

85

90

95

Ser

Ile

Thr

Tyr

Ser

Gly

Thr

Phe

Asn

Pro

Val

Asn

Asn

Gly

Asn

Ala

100

105

110

Tyr

Leu

Cys

Ile

Tyr

Gly

Trp

Thr

Gin

Asn

Pro

Leu

Val

Glu

Tyr

Tyr

115

120

125

Ile

Leu

Glu

Asn

Tyr

Giy

Glu

Tyr

Asn

Pro

Gly

Asn

Ser

Ala

Gin

Ser

130

135

140

Arg

Gly

Thr

Leu

Gin

Ala

A .1 ct

Gly

Gly

Thr

Tyr

Thr

Leu

His

Glu

Ser

145

150

155

160

Thr

Arg

Val

Asn

Gin

Pro

Ser

Ile

Glu

Gly

Thr

Arg

Thr

Phe

Gin

Gin

165

170

175

Tyr

Trp

Ala

Ile

Arg

Gin

Gin

Lys

Arg

Asn

Ser

«y

Thr

Val

Asn

Thr

180

185

190

Gly

Glu

Phe

Phe

Gin

Ala

Trp

Glu

Arg

Ala

Gly

Met

Arg

Met

Gly

Asn

195

200

205

His

Asn

Tyr

Met

Ile

Val

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Arg

Ser

Ala

Gly

Ąsn

210

215

220

Ser

Asn

Ile

Asn

Val

Gin

Thr

Pro

Aj. a

225

230

<210>

29

<2ii> :

219

< 212 >

PRT

<213> (

2. gracile

<400> :

29

Met

Val

Ser

Phe

Lys

Ala

Leu

Leu

Leu

Gly

Ais

Ala

1 y

Ala

Leu

Ala

1

5

10

15

Phe

Pro

Phe

Asn

Val

Thr

Gin

Met

Asn

Glu

Leu

Val

Ala

Arg

Ala

Gly

20

25

30

Thr

Pro

Ser

Gly

Thr

Gly

Thr

Asn

Asn

Gly

Tyr

Phe

Tyr

Ser

Phe

T isp

35

40

45

Thr

Asp

dy

Gly

Gly

Thr

Val

Asn

Tyr

Gin

Asn

Glv

Ala

Gly

Gly

Ser

50

55

60'

Tyr

Ser

Val

Gin

Trp

Gin

Asn

Cys

Gly

Asn

Phe

Vai

Gly

Gly

Lys

Giy

65

70

75

80

Trp

Asn

Pro

Gly

Ala

Ala

Arg

Thr

Ile

Asn

Phe

Ser

Gly

Thr

Phe

Ser

85

90

95

Pro

Gin

Gly

Asn

Gly

Tyr

Leu

Ala

I le

Tyr

Gly

Trp

Thr

Gin

Asn

Pro

100

105

110

Leu

Vai

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Val

Glu

Ser

Phe

Gly

Thr

Tyr

Asp

Pro

Ser

115

120

125

PL 212 113 B1

Ser Gin 130

Ala

Ser

Lys

Phe

Gly 135

Thr

Ile

Gin

Gin

Asp 140

Giy

Ser

Thr

Tyr

Thr Ile 145

Ala

Lys

Thr

Thr 150

Arg

Val

Asn

Gin

Pro 155

Ser

Ile

Glu

Gly

Thr 160

Ser Thr

Phe

Asp

Gin 165

Phe

Trp

Ser

Val

Arg 170

Gin

Asn

His

Arg

Ser 175

Ser

Gly Ser

Val

Asn 180

Val

Ala

Ala

His

Phe 185

Asn

Ala

Trp

Ala

Gin 190

Ala

Gry

Leu Lys

Leu 195

Gly

Ser

His

Asn

Tyr 200

Gin

Ile

Val

Ala

Thr 205

Glu

Gly

Tyr

Gin Ser 210

Ser

Gly

Ser

Ser

Ser 215

Ile

Thr

Val

Ser

<210>

30

<211>

223

<212>

PRT

<213>

T. reesei

<400> 30

Met 1

Val

Ser

Phe

Thr 5

Ser

Leu

Leu

Ala

Gly 10

Val

Ala

Ala

Ile

Ser 15

Gly

Val

Leu

Ala

Ala 20

Pro

Ala

Ala

Glu

Val 25

Glu

Pro

Val

Ala

Val 30

Glu

Lys

Arg

Gin

Thr 35

Ile

Gin

Pro

Gly

Thr 40

Gly

Tyr

Asn

Asn

Giy 45*

Tyr

Phe

His

Ser

Tyr 50

Trp

Asn

Asp

Gly

His 55

Gly

Gly

Val

Thr

Tyr 60

Thr

Asn

Gly

Pro

Gly 65

Gly

Gin

Phe

Ser

Val 70

Asn

Trp

Ser

Asn

Ser 7 5

Gly

Asn

Phe

Val

Gly 30*

Gly

Lys

Gly

Trp

Gin 85

Pro

Gly

Thr

Lys

Asn 90

Lys

Val

Ile

Asn

Phe 95

Ser

Gly

Ser

Tyr

Asn 100

Pro

Asn

Gly

Asn

Ser 105

Tyr

Leu

Ser

Vai

Tyr 110

Gly

Trp

Ser

Arg

Asn 115

Pro

Leu

Ile

Glu

Tyr 120

Tyr

Ile

Val

Gly

Asn 125

Phe

Gly

Thr

Tyr

Asn 130.

Pro

Ser

Thr

Gly

Ala 135

Thr

Lys

Leu

Gly

Glu 140

Val

Thr

Ser

Asp

Gl y 145

Ser

Val

Tyr

Asp

Ile 150

Tyr

Arg

Thr

Gin

Arg 155

Val

Asn

Gin

Pro

Ser 160

Ile

Ile

Gly

Thr

Ala 165

Thr

Phe

Tyr

Gin

Tyr 170

Trp

Ser

Val

Arg

Arg IGS

Asn

His

Arg

Ser

Ser 180

dy

Ser

Val

Asn

Thr 185

Ala

Asn

His

Phe

Asn 190

Ala

Trp

PL 212 113 B1

Ala Gin

Gin Gly

Leu

Thr

1,

Gly

Thr

Met

Asp

Tyr

Gin

Ile

Val Ala

195

200

205

Val Glu

Gly Tyr

Phe

Ser

Ser

Gly

Ser

Ala

Ser

Ile

Thr

Val

Ser

210

215

220

<210>

31

<211>

223

<212>

PRT

<213>

T. reesei

<40

0>

31

Met

Val

Ser

Phe

Thr

Ser

Leu

Leu

Ala

Gly

Val

Ala

Ala

Ile

Ser

Gly

1

5

10

15

Val

Leu

Ala

Ala

Pro

Ala

Ala

Glu

Val

Glu

Ser

Val

Aid

Val

Glu

Lys

20

25

30

Arg

Gin

Thr

Ile

Gin

Pro

Gly

Thr

Gly

Tyr

Asn

Asn

Gly

Tyr

Phe

Tyr

35

40

4 5.

Ser

Tyr

Trp

Asn

Asp

Gly

His

Gly

Gly

Val

Thr

Tyr

Thr

Asn

Gly

Pro

50

55

60

Gly

Gly

Gin

Phe

Ser

Val

Asn

Trp

t Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

Phe

Val

Gly

65

70

75

30

Gly

Lys

Gly

Trp

Gin

Pro

Gly

Thr

Lys

Asn

Lys

Val

Ile

Asn

Phe

Ser

85

90

95

Gly

Ser

Tyr

Asn

Pro

Asn

Gly

Asn

Ser

Tyr

Leu

Ser

Val

Tyr

Gly

Trp

100

105

110

Ser

Arg

Asn

Pro

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Val

Glu

Asn

Phe

Gly

Thr

115

120

125

Tyr

Asn

Pro

Ser

Thr

Gly

Ala

Thr

Lys

Leu

Gly

Glu

Val

Thr

Ser

Asp

130

135

140

Gly

Ser

Val

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Arg

Thr

Gin

Arg

Val

Asn

Gin

Pro

Ser

145

150

155

160

Ile

Ile

Gly

Thr

Ala

Thr

Phe

Tyr

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Arg

Asn

165

170

175

His

Arg

Ser

Ser

Gly

Ser

Val

Asn

Thr

Ala

Asn

His

Phe

Asn

Ala

Trp

180

135

190

Ala

Gin

Gin

Gly

Leu

Thr

Leu

Gly

Thr

Met

Asp

Tyr

Gin

Ile

Val

Ala

195

200

205

Val

Glu

Gly

Tyr

Phe

Ser

Ser

Giy

Ser

Ala

Ser

Ile

Thr

Val

Ser

210 215 . 220

<2I0>	32
<21i>	222
<212>	PRT
<213>	T .

PL 212 113 B1 <400> 32

Met 1'

Val

Ser

Phe

Thr 5

Ser

Leu

Leu

Ala

Ala 10

Ser

Pro

Pro

Ser

Arg 15

Ala

Ser

Cys

Arg

Pro

Ala

Ala

Glu

Val

Glu

Ser

Val

Ala

Yal

Glu

Lys

Arg

20

25

30

Gin

Thr

Ile

Gin

Pro

Gly

Thr

Gly

Tyr

Asn

Asn

Gly

Tyr

Phe

Tyr

Ser

35

40

45

Tyr

Trp

Asn

Asp

Gly

His

Gly

Gly

Va x

Thr

Tyr

Thr

Asn

Gly

Pro

Gly

50

55

60

Gly

Gin

Phe

Ser

Vał

Asn

Trp

Ser

Asn

Ser

Gly

Asn

Phe

Val

Gly

Gly

65

70

75

80

Łys

Gly

Trp

Gin

Pro

Gly

Thr

Lys

Asn

Lys

Val

Ile

Asn

Phe

Ser

Gly

85

90

95

Ser

Tyr

Asn

Pro

Asn

Gly

Asn

Ser

Tyr

Leu

Ser

Val

Tyr

Gly

Trp

Ser

100

105

110

Arg

Asn

Pro

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Val

Glu

Asn

Phe

Gly

Thr

Tyr

115

120

12 5

Asn

Pro

Ser

Thr

Gly

Ala

Thr

Lys

Leu

Glv

Glu

Val

Thr

Ser

Asp

Gly

130

135

140

Ser

Yal

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Arg

Thr

Gin

Arg

Val

Asn

Gin

Pro

Ser

Ile

145

150

155

160

Ile

Gly

Thr

Ala

Thr

Phe

Tyr

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Arg

.Asn

His

165

170

i 7 c

Arg

Ser

Ser

Gly

Ser

Val

Asn

Thr

Ala

Asn

His

Phe

Asn

Ala

Trp

Ala

180

18S

190

Gin

Gin

Gly

Leu

Thr

Leu

Gly

Thr

Met

Asp

Tyr

Gin

Ile

Val

Al 5

Yal

195

200

205

Glu

Gly

Tyr

Phe

Ser

Ser

Gly

Ser

Ala

Ser

Ile

Thr

Yal

Ser

21Ó

215

220

<210>

33

<21

i>;

190

<212>

PRT

<213>

T. harzianum

<400>

33

Gin

Thr

Ile

Gly

Pro

Gly

Thr

Gly

Tyr

Ser

Asn

Gly

Tyr

Tyr

Tyr

Ser

I

5

10

15

Tyr

Trp

Asn

Asp

Gly

His

Ala

Gly

Yal

Thr

Tyr

Thr

Asn

Gly

Gly

Gly

20

25

30

Gly

Ser

Phe

Thr

Yal

Asn

Trp

Ser

Asn

Ser

Giy

Asn

Phe

Yal

Al a

Gly

40 4

PL 212 113 B1

Lys

Gly 50

Trp

Gin

Pro Gly

Thr 55

Lys

Asn

Lys

Val

Ile 60

Asn

Phe

Ser

Gly

Ser

Tyr

Asn

Pro

Asn

Gly

Asn

Ser

Tyr

Leu

Ser

Ile

Tyr

Gly

Trp

Ser

65

70

75

80

Arg

Asn

Pro

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Val

Glu

Asn

Phe

Gly

Thr

Tyr

35

90

95

Asn

Pro

Ser

Thr

Gly

Ala

Thr

Lys

Leu

Gly

Glu

Val

Thr

Ser

Asp

Giy

100

105

l 10

Ser

Val

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Arg

Thr

1 n

Arg

Val

Asn

Gin

Pro

Ser

Ile

115

120

125

Ile

Gly

Thr

Ala

Thr

Phe

Tyr

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Arg

Asn

His

130

135

140

Arg

Ser

Ser

Gly

Ser

Val

Asn

Thr

Al a

Asn

His

Phe

Asn

Ala

Trp

Ala

145

150

155

160

Ser

His

Gly

Leu

Thr

Leu

Gly

Thr

Met

Asp

Tyr

Gin

Ile

Val

Ala

Val

165

170

175

Glu

Gly

Tyr

Phe

Ser

Ser

Gly

Ser

Ala

Ser

Ile

Thr

vai

Ser

180

185

190

<210>

34

<211>

223

<212>

PRT

<213>

T. viride

<400> :

34

Met

Val

Ser

Phe

Thr

Thr

Leu

Leu

Ala

Gly

Phe

Val

Ala

Vał

Thr

Giy

1

c

10

15

Val

Leu

Ser

Ala

Pro

Thr

Glu

Thr

Val

Glu

Val

Val

Asp

Val

Glu

Lys

20

25

30

Arg

Gin

Thr

Ile

Gly

Pro

Gly

Thr

Gly

Phe

Asn

Asn

Gly

Tyr

Tyr

Tyr

35

40

45

Ser

Tyr

Trp

Asn

Asp

Gly

His

Ser

Gly

Vai

Thr

Tyr

Thr

Asn

Gly

Ala

50

55

60

Gly

Gly

Ser

Phe

Ser

Val

Asn

Trp

Ala

Asn

Ser

Gly

Asn

Phe

Val

Gly

65

70

75

80

Gly

Lys

Gly

Trp

Asn

Pro

Gly

Ser

Ser

Ser

Arg

Val

Ile

Asn

Phe

Ser

85

90

95

Gly

Ser

Tyr

Asn

Pro

Asn

Gly

Ąsn

Ser

Tyr

Leu

Ser

Val

Tyr

Giy

Trp

100

105

110

Ser

Lys

Asn

Pro

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Val

Glu

Asn

Phe

G1 y

Thr'

115

120

125

Tyr

Asn

Pro

Ser

Thr

Gly

Thr

Thr

Lys

Leu

Gly

Glu

Val

Thr

Ser

Asp

130

135

14 0

PL 212 113 B1

Gly Ser 145

Val

Tyr

Asp

Ile 150

Tyr

Arg

Thr

Gin

Arg 155

Val

Asn

Gin

Pro

Ser 160

Ile Ile

Gly

Thr

Al a

Thr

Phe

Tyr

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Arg

Asn

165

170

175

His Ala

Pro

Al a

Ala

Arg

Ser

Arg

Leu

Arg

Thr

Thr

Ser

Asn

Ala

Trp

.180

185

190

Arg Asn

Leu

dy

Leu

Thr

Leu

Giy

Thr

Leu

Asp

Tyr

Gin

Ile

Ile

Ala

195

200

205

Val Glu

Gly

Tyr

Phe

Ser

Ser

Gly

Asn

Ala

Asn

Ile

Asn

Val

Ser

210

215

220

<210>

35

<211>

241

<212>

PRT

<213>

C. gracile

<4oo> :

35

Met

Val

Asn

Phe

Ser

Ser

Leu

Phe

Łeu

Ala

Ala

Ser

Ala

Ala

Val

Vai

1

5

10

15

Ala

Val

Ala

Ala

Pro

Gly

Glu

Leu

Pro

Gly

Met

His

Lys

Arg

Gin

Thr

20

25

30

Leu

Thr

Ser

Ser

Gin

Thr

Gly

Thr

Asn

Asn

Gly

Tyr

Tyr

.Tyr

Ser

Phe

35

40

45

Trp

Thr

Asp

Gly

Gin

Gly

Asn

Val

Gin

Tyr

Thr

Asn

Glu

Ala

Gly

Gly

50

55

60

Gin

Tyr

Ser

Val

Thr

Trp

Ser

Gly

Asn

Gly

Asn

Trp

Val

Gly

Gly

Lys

65

70

75

80

Gly

Trp

Asn

Pro

Gly

Ser

Ala

Arg

Thr

Ile

Asn

Tyr

Thr

Ala

Asn

Tyr

85

90

95

Asn

Pro

Asn

Gly

Asn

Ser

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gly

Trp

Thr

Arg

Asn

100

105

110

Pro

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tyr

Val

Val

Glu

Asn

Phe

Gly

Thr

Tyr

Asn

Pro

115

120

125

Ser

Thr

Gly

Ala

Thr

Arg

Leu

Gly

Ser

Val

Thr

Thr

ASp

Giy

Ser

Cys

130

135

140

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Arg

Thr

Gin

Arg

Val

Asn

Gin

Pro

Ser

I ie

i j i Łi

Gly

145

150

155

160

Thr

Ser

Thr

Phe

Tyr

Gin

Phe

Trp

Ser

Val

Arg

Gin

Asn

Lys

Arg

Ser

165

170

' *7

Gly

Gly

Ser

Val

Asn

Met

Ala

Ala

His

Phe

Asn

Ala

Trp

Ala

Ala

Ala

180

'185

190

Gly

Leu

Gin

Leu

Gly

Thr

His

Asp

Tyr

Gin

Ile

V a I

Ara

Thr

1 sj

Gly

195

200

205

Tyr

Tyr

Ser

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

Val

Asn

Val

Gly

Ala

Ser

Ser

Asp

PL 212 113 B1

210 215 220

Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser Thr Gly Gly Gly Ser Thr Asn Val Ser 225 230 235 240

Phe <210> 36 <211> 225 <212>- PRT <213> A. niger <400 36

Met 1

Leu

Thr

Lys

Asn 5

Leu

Leu

Leu

Cys

Phe 10

Ala

Ala

Ala

Lys

Ala 15

Ala

Leu

Ala

Val

Pro

His

Asp

Ser

Val

Ala

Gin

Arg

Ser

Asp

Ala

Leu

His

20

25

30

Met

Leu

Ser

Glu

Arg

Ser

Thr

Pro

Ser

Ser

Thr

Gly

Glu

Asn

Asn

Gly

35

40

45

Phe

Tyr

Tyr

Ser

Phe

Trp

Thr

Asp

Gly

Gly

Gly

Asp

Vał

Thr

Tyr

Thr

50-

55

60

Ash

Gly

Asp

Ala

Giy

Ala

Tyr

Thr

Val

Glu

Trp

Ser

Asn

Val

Gly

Asn

65

70

75

80

Phe

Val

Gly

Gly

Lys

Gly

Trp

Asn

Pro

Gly

Ser

Ala

Gin

Asp

Ile

85

90

95

Tyr

Ser

Gly

Thr

Phe

Thr

Pro

Ser

Gly

Asn

Gly

Tyr

Leu

Ser

Val

Tyr

100

105

110

Gly

Trp

Thr

Thr

Asp

Pro

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Val

Glu

Ser

Tyr

115

120

125

Gly

Asp

Tyr

Asn

Pro

Gly

Ser

Gly

Gly

Thr

Tyr

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

130

135

140

Ser

Asp

Gly

Ser

Val

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Thr

Ala

Thr

Arg

Thr

Asn

Ala

145

150

155

160

a

Ser

Ile

Gin

Gly

Thr

Ala

Thr

Phe

Thr

Gin

Tyr

Trp

Ser

val

Arg

165

170

175

Gin

Asn

Lys

Arg

Val

Gly

Gly

Thr

Val

Thr

Thr

Ser

Asn

His

Phe

Asn

180

185

190

Ala

Trp

Ala

Lys

Leu

Gly

Met

Asn

Leu

Gly

Thr

His

Asn

Tyr

Gin

Ile

195

200

205

Val

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Ser

Ser

Ser

Ile

Thr

Val

210

215

220

Gin

225 <210> 37

PL 212 113 B1

<2łl>	221
<212>	PRT
<213>	Penicillium sp 40
<400>	37

Met 1

Lys

Ser

Phe

Ile 5

Ala

Tyr Leu

Leu Ala 10

Ser

Vai

Ala

Val

Thr 15

Gly

Val

Met

Ala

Val

Pro

Gly

Glu

Tyr

His

Lys

Arg

His

Asp

Lys

Arg

Gin

20

25

30

Thr

Ile

Thr

Ser

Ser

Gin

Thr

Gly

Thr

Asn

Asn

Gly

Tyr

Tyr

Tyr

Ser

35

40

45

Phe

Trp

Thr

Asn

Gly

Gly

Gly

Thr

Val

Gin

Tyr

Thr

Asn

Gly

Al a

Ala

50

55

60

Gly

Glu

Tyr

Ser

Val

Thr

Trp

Glu

Asn

Cys

Gly

Asp

Phe

Thr

Ser

Gly

65

70

75

80

Lys

Gly

Trp

Ser

Thr

Gly

Ser

Ala

Arg

Asp

Ile

Thr

Phe

Glu

Gly

Thr

85

90

95_

Phe

Asn

Pro

Ser

Gly

Asn

Ala

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gly

Trp

Thr

Thr

100

105

110

Ser

Pro

Leu

Val

Glu

ψ V2?

gyr

Ile

Leu

Glu

Asp

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Asn

115

120

125

Pro

Gly

Asn

Ser

Met

Thr

Tyr

Lys

Gly

Thr

Val

Thr

Ser

Asp

Gly

Ser

130

135

140

Val

Tyr

Asp

Il.e

Tyr

Glu

His

Gin

Gin

Val

Asn

Gin

Pro

S θ 17

1 i β

Ser

145

150

155

160

Gly

Thr

Aia

Thr

Phe

Asn

Gin

Tyr

Trp

Ser

Ile

Arg

Gin

Asn

Thr

Arg

165 170 . 175

Ser

Ser

Gly

Thr

Val

Thr

Thr

Ala

Asn

His

Phe

Asn

Al a

Trp

Ala

Lys

180

' 185

190

Leu

Gly

Met

Asn

Leu

Gly

Ser

Phe

Asn

Tyr

Gin

Ile

Val

Ser

Thr

Glu

195

200

205

Gly

Tyr

Glu

Ser

Ser

Gly

Ser

Ser

Thr

Ile

Thr

Val

Ser

210

215

220

<210>	38
<211>	24 0 .
<212>	PRT
<213>	Streptomyces
<400>	38

Met Gin Gin Asp Gly Lys Arg Gin Asp Gin Asn Gin Gin Asn Pro Ala 1 5 10 15

PL 212 113 B1

Pro Phe Ser Gly Leu

Ser Arg Arg Gly Phe Leu Gly Gly Ala Gly

Thr

20

25

30

Val

Ala

Leu

Ala

Thr

Ala

Ser

Gly

Leu

Leu

Leu

Pro

Ser

Thr

Ala

His

35

40

45

Ala

Ala

Thr

Thr

Ile

Thr

Thr

Asn

Gin

Thr

Gly

Tyr

Asp

Gly

Met

Tyr

50

55

60

Tyr

Ser

Phe

Trp

Thr

Asp

Gly

siy

Gly

Ser

Val

Ser

Met

Thr

Leu

Asn

65

70

7 7

80

Gly

Gly

Gly

Ser

Tyr

Ser

Thr

Gin

Trp

Thr

Asn

Cys

Gly

Asn

Phe

Vai

85

90

95

Ala

Gly

Lys

Gly

Trp

Gly

Asn

Gly

Gly

Arg

Arg

Thr

Val

Arg

Tyr

Ser

100

105

110

Gly

Tyr

Phe

Asn

Pro

Ser

Gly

Asn

Gly

Tyr

Gly

Cys

Leu

Tyr

Gly

Trp

115

120

125

Thr

Ser

Asn

Pro

Leu

Val

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Val

Asp

Asn

Trp

Gly

Ser

130

135

140

Tyr

Arg

Pro

Thr

Gly

Glu

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val

Tyr

Ser

Asp

Gly

Gly

145

150

155

160

Thr

Tyr

Asp

Ile

Lys

Thr

Thr

Arg

Tyr

Asn

Ala

Pro

Ser

Val

Glu

165

170

ps

Giy

Thr

Arg

Thr

Phe

Asp

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Gin

Ser

Lys

Val

ISO

185

'190

Ile

Gly

Ser

Gly

Thr

Ile

Thr

Thr

Gly

Asn

His

Phe

Asp

-Ala

Trp

Al a

195

200

205

Arg

Ala

Gly

Met

Asn

Łeu

Gl y

Gin

Phe

Gin

Tyr

Tyr

Met

Ile

Met

Ala

210

215

220

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Ser

Ser

Asn

Σ1Θ

Thr

Val

Ser

Giy

225

230

235

240

<210> 39 <211> 228 <212> PRT

<213>

Streptomyces

SP

<400>

39

Met

Thr

Lys

Asp

Asn

Thr

Pro

Ile

Arg

Pro

Val

Ser

Arg

Arg

Gly

' Phe

1

5

10

15

Ile

Gly

Arg

Ala

Gly

Ala

Leu

Ala

Leu

Ala

Thr

Ser

Gly

Leu

Met

Leu

20

25

30

Pro

Gly

Thr

Ala

Arg

Ala

Asp

Thr

Val

Ile

Thr

Thr

Asn

Gin

Thr

G i y

35

40

45

Thr

Asn

Asn

Gly

Tyr

Tyr

Tyr

Ser

Phe

Trp

Thr

Asp

Gly

G1 v

Gly

Ser

50

55

60

Val

Ser

Met

Asn

Leu

Ala

Ser

Gly

Gly

Ser

Tyr

Gly

Thr

Ser

Trp

Thr

65

70

75

30

PL 212 113 B1

Asn

Cys

Gly

Asn

Phe

Val

Ala

Gly

Lys

Gly

Trp

Ala

Asn

Gly

Ala

Arg

85

90

95

Arg

Thr

Val

Asn

Tyr

Ser

Gly

Ser

Phe

Asn

Pro

Ser

Gly

Asn

Ala

Tyr

100

105

110

Leu

Thr

Leu

Tyr

Gly

Trp

Thr

Ala

Asn

Pro

Leu

Val

Glu

Tyr

Tyr

Ile

115

120

125

Val

Asp

Asn

Trp

Gly

Thr

Tyr

Arg

Pro

Thr

Gly

Thr

Tyr

Lys

Gly

Thr

130

135

140

Val

Thr

Ser

Asp

Gly

Gly

Thr

Tyr

Asp

Val

Tyr

Gin

Thr

Thr

Arg

Val

145

150

155

160

Asn

Ala

Pro

Ser

Val

Glu

Gly

Thr

Łys

Thr

Phe

Asn

Gin

Tyr

Trp

Ser

165

no

175

Val-

Arg

Gin

Ser

Lys

Arg

Thr

G1 y

Gly

Ser

Ile

Thr

Ala

Gly

Asn

His

180

185

190

Phe

Asp

Ala

Trp

Ala

Arg

Tyr

Gly

Met

Pro

Leu

Gly

Ser

Phe

Asn

Tyr

195

200

205

Tyr

Met

Ile

Met

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Ser

Ser

Ser

210

215

220

Ile

Ser

Val

Ser

225

<21C

)> 4

0

<211

.> 2

39

<212

:> p

!RT

<212

!> S

thermocyaneoviolaceus

<400>

40

Met

Asn

Thr

Leu

Val

His

Pro

Gin

Gly

Arg

Ala

Gly

Gly

Leu

Arg

Leu

1

5

10

15

Leu

Val

Arg

Ala

Ala

Trp

Ala

Leu

Ala

Leu

Ala

Ala

Leu

Ala

Ala

Met

20

25

30

Mąt

Phe

Gly

Gly

Thr

Ala

Arg

Ala

Asp

Thr

Ile

Thr

Ser

Asn

Gin

Thr

35

40

45

Gly

Thr

His

Asn

Gly

Tyr

Phe

Tyr

Ser

Phe

Trp

Thr

Asp

Ala

Pro

Gly

, 50

55

60

Thr

Val

Thr

Met

Asn

Thr

Gly

Ala

Gly

Gly

Asn

Tyr

Ser

Thr

Gin

Trp

65

70

75

80

Ser

Asn

Thr

Gly

Asn

Phe

Val

Ala

Gly

Lys

Gly

Trp

Ai a

Thr

Gly

Gly

S5

90

95

Arg

Arg

Thr

Val

Thr

Tyr

Ser

Gly

Thr

Phe

Asn

Pro

Ser

Gly

Asn

Ala

100

105

110

Tyr

Leu

Ala

Leu

Tyr

ciy

Trp

Ser

Gin

Asn

Pro

Leu

Val

Glu

Tyr

Tyr

115 . 120 125

PL 212 113 B1

Ile Val

Asp

Asn

Trp

Gly

Thr

Tyr

Arg

Pro

Thr

Giy

Thr

Tyr

Lys

Gly

130

135

140

Thr Val

Tyr

Ser

Asp

Gly

Gly

Thr

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Met

Thr

Thr

Arg

145

150

155

160

Tyr Asn

Ala

Pro

Ser

Ile

Glu

Gly

Thr

Lys

Thr

Phe

Asn

Gin

Tyr

Trp

165

170

175

Ser Val

Arg

Gin

Asn

Lys

Arg

Thr

Gly

Gly

Thr

Ile

Thr

Thr

Gly

Asn

180

185

190

His Phe

Asp

Ala

Trp

Ala

Ala

His

Gly

Met

Pro

Leu

Gly

Thr

Phe

Asn

195

200

205

Tyr Met

Ile

Leu

Al a

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Ser

Ser

Asn

210

215

220

Ile Thr

Val

Gly

Asp

Ser

Gly

Gly

Asp

Asn

Gly

Gly

Gly

Gly

Gly

225

230

235

<210>

41

<211>

242

<212>

PRT

<213> .

S. viridosporus

<400>

41 '

Met .Asn

Ala

Phe

Ala

His

Pro

Arg

Gly

Arg

Arg

His

Gly

Arg

Ser

Ala

1

5

10

15

Pro Męt

Ser

Pro

Arg

Ser

Thr

Trp

Ala

Val

Leu

Leu

Ala

Ala

Leu

Ala

20

25

30

Vai Met

Leu

Leu

Pro

Gly

Thr

Ala

Thr

Ala

Ala

Pro

Val

Ile

Thr

Thr

35

40

45

Asn· Gin

Thr

Gly

Thr

Asn

Asn

Gly

Trp

Trp

Tyr

Ser

Phe

Trp

Thr

Asp

' 50

55

60

Ala Gin

Gly

Thr

Val

Ser

Met

Asp

Leu

Gly

Ser

Gly

Gly

Thr

Tyr

Ser

65.

70

75

80

Thr Gin

Trp

Arg

Asn

Thr

Gly

Asn

Phe

Vał

Ala

Gly

Lys

Gly

Trp

Ser

85

90

95

Thr Gly

Gly

Arg

Lys

Thr

Val

Asn

Tyr

Ser

Gly

Thr

Phe

Asn

Pro

Ser

100

105

110

Gly Asn

Ala

Tyr

Leu

Thr

Leu

Tyr

Gly

Trp

Thr

Thr

Gly

Pro

Leu

Ile

115

120

125

Glu Tyr

Tyr

Ile

Val

Asp

Asn

Trp

Gly

Thr

Tyr

Arg

Pro

Thr

Gly

Lys

130

135

140

Tyr Lys

Gly

Thr

Val

Thr

Ser

Asp

Gly

Gly

Thr

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Lys

145

150

155

160·

Thr Thr

Arg

Tyr

Asn

Ala

Pro

Ser

Ile

Glu

Gly

Thr

Lys

Thr

Phe

Asp

165

170

175

Gin Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Gin

Ser

Lys

Arg

Thr

Gly

Gly

Thr

Ile

Thr

180

185

190

PL 212 113 B1

Ser Gly

Asn

His

Phe

Asp

Ala

Trp

Ala

Arg

Asn

Gly

Met

Asn

Leu

Gly

195

200

205

Asn His

Asn

Tyr

Met

Ile

Met

ił

Thr

Glu

Giy

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

210

215

220

Ser Ser

Thr

Tle

Thr

Val

Ser

Glu

Ser

Gly

Ser

Gly

Giy

Gly

Gly

Gly

225

230

235

240

Giy Gly

< 210 >

42

<2U>

240

<212>

PRT

<213>

T. fusca

<4 Oi

3>

42

Met

Asn

His

Ala

Pro

Ala

Ser

Leu

Lys

Ser

Arg

Arg

Apg

Phe

Arg

Pro

1

5

10

- c

Arg

Leu

Leu

Ile

Gly

Lys

Ais

Phe

Ala

Ala

Ala

Leu

Val

Ala

V a .t

V 51

20

25

30

Thr

Met

Ile

Pro

Ser

Thr

Ala

Ala

His

Ala

Ala

Val

Thr

Ser

Asn

Glu

35

40

4 5

Thr

Gly

Tyr

His

Asp

Gly

Tyr

Phe

Tyr

Ser

Phe

Trp

Thr

Asp

Ala

Pro

50

55

60

Giy

Thr

Val

Ser

Met

Glu

Leu

Gly

Pro

Gly

Gly

Asn

Tyr

Ser

Thr

Ser

65

70

75

80

Trp

Arg

Asn

Thr

Gly

Asn

Phe

Val

Ala

Gly

Lys

Gly

Trp

Ala

Thr

Gly

85

90

95

Gly

Arg

Arg

Thr

Val

Thr

Tyr

Ser

Ala

Ser

Phe

Asn

Pro

Ser

Gly

Asn

100

105

110

Ala

Tyr

Leu

Thr

Leu

Tyr

Gly

Trp

Thr

Arg

Asn

Pro

Leu

Vai

Glu

Tyr

115

120

125

Tyr

Ile

Val

Glu

Ser

Trp

Gly

Thr

Tyr

Arg

Pro

Thr

Gly

Thr

Tyr

Met

130

135

140

Gly

Thr

Val

Thr

Thr

Asp

Gly

Gly

Thr

Tyr

Asp

i l.

Tyr

Lys

Thr

Thr

145

150

155

160

Arg

Tyr

Asn.

Ala

Pro

Ser

I le

Glu

Gly

Thr

Arg

Thr

Phe

Asp

Gin

Tyr

165

170

175

Trp

Ser

Val

Arg

Gin

Ser

Lys

Arg

Thr

Ser

Gly

Thr

Ile

Thr

Ala

Gly

180

185

190

Asn

His

Phe

Asp

Ala

Trp

Ala

Arg

His

Gly

Met

His

Leu

Gly

Thr

His

195

200

205

Asp

Tyr

Met

Ile

Met

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Giy

Ser

Ser

'210

215

220

PL 212 113 B1

Asn Val Thr Leu Gly Thr Ser Gly Gly Gly Asn Pro Gly Gly Gly Asn 225 . 230 235 240 <210> 43 <211> 241 <212> PRT <213> C. pachnodae <400> 43

Met 1

Thr

Arg

Thr

I le 5

Ser

Arg

Ala

Ala

His 10

Arg

Pro

Pro

Ala

Gly L5

Gly

Arg

Tle

Ala

Arg

Ala

Leu

Ala

Ala

Ala

Gly

Ala

Thr

Val

Ala

Met

Val

20

25

30

Ile

Ala

Gly

Val

Ala

Ala

Ala

Gin

Pro

Ala

Ala

Ala

Val

Asp

Ser

Asn

35

40

45

Ser

Thr

Gly

Ser

Ser

Gly

Gly

Tyr

Phe

Tyr

Ser

Phe

Trp

Thr

Asp

Ala

50

55

60

Pro

Gly

Thr

Val

Ser

Met

Asn

Leu

Gly

Ser

Gly

Gly

Asn

Tyr

Ser

Thr

65

30

75

80

Ser

Trp

Ser

Asn

Thr

Gly

Asn

Phe

Val

Ais

Gly

Lys

Gly

Trp

Ser

Thr

85

90

95 .

Gly

Ser

Ala

Arg

Thr

Ile

Ser

Tyr

Ser

Gly

Thr

Phe

Asn

Pro

Se r

G r y

100

105

110

As ii

Ala

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gly

Trp

Ser

His

Asp

Pro

Leu

Val

Glu

115

120

125

Tyr

Tyr

Ile

Val

Asp

Ser

Trp

Gly

Thr

Tyr

Arg

Pro

Thr

Gly

Thr

Phe

130

135

140

Met

Gly

Thr

Val

Asn

Ser

Asp

Gly

Gly

Thr

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Lys

Thr

145

150

155

160

Thr

Arg

Thr

Asn

Ala

Pro

Ser

Ile

Glu

Gly

Thr

Ala

Thr

Phe

Thr

Gin

165

170

175

Tyr

Trp

Ser

Vai

Arg

Gin

Ser

Lys

Arg

Val

Gly

Gly

Thr

Tle

Thr

Thr

180

185

190

Ala

Asn

His

Phe

Asn

Ala

Trp

Ala

Ser

His

Gly

Met

Asn

Leu

Gly

Arg

195

200

205

His

Asp

Tyr

Gin

Ile

Leu

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Ser

210

215

220

Ser

Asn

Ile

Thr

Ile

Gly

Ser

Thr

Ser

Gly

Gly

Gly

Gly

Ser

Gly

Gly

225

230

235

240

Gly <210> 44

221

PL 212 113 B1 <212> PRT <213> A. oryzae <400> 44

Met 1

Val

Ser

Phe

Ser 5

Ser

Leu

Leu

Leu

Ala 10

Val

Ser

Ala

Val

Ser 15

Gly

Ala

Leu

Ala

Ala

Pro

Gly

Asp

Ser

Thr

Leu

Val

Glu

Leu

Ala

Lys

Arg

20

25

30

Ala

Ile

Thr

Ser

Ser

Glu

Thr

Gly

Thr

Asn

Asn

Gly

Tyr

Tyr

Tyr

Ser

35

40

45

Phe

Trp

Thr

Asn

Gly

Gly

Gly

Asp

Val

Glu

Tyr

Thr

Asn

Gly

Asn

Gly

50

55

60

Gly

Gin

Tyr

Ser

Val

Lys

Trp

Thr

Asn

Cys

Asp

Asn

Phe

Val

Ala

Gly

65

70

75

80

Lys

Gly

Trp

Asn

Pro

Gly

Ser

Ala

Lys

Thr

Val

Thr

Tyr

Ser

Gly

Glu

85

90

95

Trp

Glu·'

Ser

Asn

Ser

Asn

Ser

Tyr

Val

Ser

Leu

Tyr

Gly

Trp

Thr

Gin

100

105

110

Asn

Pro

Leu

Val

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Val

Asp

Lys

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Asp

115

120

125

Pro

Ser

Thr

Gly

Ala

Thr

Glu

Leu

Gly

Thr

Val

Glu

Ser

Asp

Gly

Gly

130

135

140

Thr

Tyr

Lys

Ile

Tyr

Lys

Thr

Thr

Arg

Glu

Asn

Ala

Pro

Ser

Ile

Glu

14 5

150

155

160

Gly

Thr

Ser

Thr

Phe

Asn

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Gin

Ser

Gly

Arg

165

170

17 5

Val

Gly

Gly

Thr

Ile

Thr

Ala

Gin

Asn

His

Phe

Asp

Ala

Trp

Ala

Asn

180

185

190

Val

Gly

Leu

Gin

Leu

Gly

Thr

His

Asn

Tyr

Met

Ile

Leu

Al a

Thr

Glu

195

200

205

Gly

'Tyr

Lys

Ser

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

Ile

Thr

Val

Glu

210

215

220

<210 45.

<211> 2

‘16-

<212> PRT

<213> C

:. purpurea

<400> 45

Met Phe Leu

Thr

Ser

Val

Val

Ser

Leu

Val

Val

Giy

Ala

Ile

Ser

Cys

1

5

10 '

15

Val Ser Ala

Ala

Pro

.1 ci

Ala

Ais

Ser

Glu

Leu

Met

Gin

Met

Thr

Pro

25 30

PL 212 113 B1

Arg

Asn

Ser 35

Cys

Tyr

Gly Gly Gly Leu Tyr 40

Ser

Ser

Tyr 45

Trp

Ala

Asp

Tyr

Gly

Asn

Thr

Arg

Tyr

Ser

Cys

Gly

Al a

Gly

Gly

His

Tyr

Asp

Leu

50

55

60

Ser

Trp

Gly

Asn

Gly

Gly

Asn

Val

Val

Ala

Gly

Arg

Gly

Trp

Lys

Pro

65

70

75

80

Ala

Ser

Pro

Arg

Ala

Val

Thr

Tyr

Ser

Gly

Ser

Trp

Gin

Cys

Asn

Gly

85

90

95

Asn

Cys

Tyr

Leu

Ser

Val

Tyr

Gly

Trp

Thr

I le

Asn

Pro

Leu

Vai

Glu

100

105

110

Tyr

Tyr

Ile

Val

Glu

Asn

Tyr

Gly

Asn

Tyr

Asn

Pro

Ser

Ala

Gly

Ais

115

120

125

Gin

Arg

Arg

Gly

Gin

Val

Thr

Ala

Asp

Gly

Ser

Ile

Tyr

Asp

Ile

Tyr

130

135

140

Ile

Ser

Thr

Gin

His

Asn

Gin

Pro

Ser

Ile

Leu

Gly

Thr

Asn

Thr

Phe

145

150

155

160

His

Gin

Tyr

W

Ser

Ile

Arg

Arg

Asn

Lys

Arg

Val

Gly

Gly

Thr

Val

165

170

175

Ser

Thr

Gly

Val

His

Phe

Asn

Ala

Trp

Arg

Ser

Leu

Gly

Met

Pro

Leu

180

185

190

Gly

Thr

Tyr

Asp

Tyr

Met

Ile

Val

Ala

Thr

Glu

Gly

Phe

Arg

Ser

Ser

195

200

205

Gly

Ser

Ala

Ser

Ile

Thr

Val

Ser

210

215

<210>	46
<211>	236 .
<212>	PRT
<213>	C. mixtus
<400>	46

Met 1

Lys

Phe

Pro

Leu 5

Ile

Gly

Lys

Ser

Thr 10

Leu

Ala

Ala

Leu

Phe 15

Cys

Ser

Al a

Leu

Leu

Gly

Val

Asn

Aśn

Thr

Gin

Ala

Gin

Thr

Leu

Thr

Asn

20

25

30

Asn

Ala

Thr

Gly

Thr

His

Asn

Gly

Phe

Tyr

Tyr

Thr

Phe

Trp

Lys

Asp

35

40

45

Ser

Gly

Asp

Ala

Ser

Met

Gly

Leu

Gin

Ala

Gly

Gly

Arg

Tyr

Thr

Ser

50

55

60

Gin

Trp

Ser

Asn

Gly

Thr

Asn

Asn

Trp

Val

Gly

Gly

Lys

Gly

Trp

Asn

65

70

75

80

Pro

Gly

Gly

Pro

Lys

Val

Val

Thr

Tyr

Ser

Gly

Ser

Tyr

Asn

Val

Asp

85

90

95

PL 212 113 B1

Asn

Ser

Gin

Asn 100

Ser

Tyr

Leu Ala

Leu 105

Tyr

Gly

Trp

Thr

Arg 110

Ser

Pro

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tyr

Val

Ile Glu

Ser

Tyr

Gly

Ser

Tyr

Asn

Pro

Ala

115

120

125

Ser

Cys

Ser

Gly

Gly

Thr

Asp Tyr

Gly

Ser

Phe

Gin

Ser

As?

Gly

Ala

130

135

140

Thr

Tyr

Asn

Val

Arg

Arg

Cys Gin

Arg

Val

Gin

Gin

Pro

Ser

Ile

Asp

145

150

155

160

Gly

Thr

Gin

Thr

Phe

Tyr

Gin Tyr

Phe

Ser

Val

Arg

Ser

Pro

Lys

Lys

165

170

175

Gly

Phe

Gly

Gin

Ile

Ser

Gly Thr

I le

Thr

Thr

Ala

Asn

His

Phe

Asn

180

185

190

Phe

Trp

Ala

Ser

Lys

Gly

Leu Asn

Leu

Gly

Asn

His

Asp

Tyr

Met

Val

195

200

205

Leu

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin Ser

Arg

Gly

Ser

Ser

Asp

Ile

Thr

Val

210

215

220

Ser

Glu

Gly

Thr

Gly

Gly

Thr Thr

Ser

Ser

Ser

Val

225

230

235

<210>

47

<211>

237

<211

PRT

< 213>

P. fluorescens cellulosa

<4 00>

47

Met

Lys

Leu

Pro

Thr

Leu

Gly Lys

Cys

Val

Val

Arg

Thr

Leu

Met

Gly

1

5

10

15

Ala

Val

Ala

1, C Li

Gly

Ala

Ile Ser

Val

Asn

Ala

Gin

Thr

Leu

Ser

Ser

20

25

30

Asn

Ser

Thr

Gly

Thr

Ąsn

Asn Gly

Phe

Tyr

Tyr

Thr

Phe

TtP

Asp

35

40

45

Ser

Gly

Asp

Al a

Ser

Met

Thr Leu

Leu

Ser

Gly

Gly

Arg

Tyr

Gin

Ser

50

55

60

Ser

Trp

Gly

Asn

Ser

Thr

Asn Asn

Trp

Val

Gly

Gly

Lys

Gly

Trp

Asn

65

70

75

80

Pro

Gly

Asn

As n

Ser

Arg

Val Ile

Ser

Tyr

Ser

Gly

Ser

Tyr

Gly

Va 1

85

90

95

Asp

Ser

Ser

Gin

Asn

Ser

Tyr Leu

Ala

Leu

Tyr

Gly

Trp

Thr

Arg

Ser

100

105

110

Pro

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tyr

Val Ile

Glu

Ser

Tyr

Gxv

Ser

Tyr

Aśn

Pro

115

120

125

Ala

Ser

Cys

Ser

Gly

Gly

Thr Asp

Tyr

Gly

Ser

Phe

Gin

Ser

Asp

Gly

130

135

140

Ala

Thr

Tyr

Asn

Val

Arg

Arg Cys

Gin

Arg

Val

Asn

Gin

Pro

Ser

1 L €

145

150

155

160

PL 212 113 B1

Asp

Gly

Thr

Gin

Thr 165

Phe

Tyr

Gin

Tyr

Phe 170

Ser

Val

Arg

Asn

Pro 17 5

Lys

Lys

Gly

Phe

Gly

Asn

Ile

Ser

Gly

Thr

Ile

Thr

Phe

Ala

Asn

His

Val

180

185

190

Asn

Phe

Trp

Ala

Ser

Lys

Gly

Leu

Asn

Leu

Gly

Asn

His

Asn

Tyr

Gin

195

200

205

Val

Leu

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Arg

Gly

Ser

Ser

Asp

ile

Thr

210

215

220

Val

Ser

Glu

Gly

Thr

Ser

Gly

Gly

Gly

Thr

Ser

Ser

Val

225

230

235

<210>

49

<211>

217

<212>

PRT

<213>

P. cochleariae .

<400>. -

ie

Met

Gin

Phe

Leu

Ile

Pro

Val

Val

Ile

Leu

Cys

Val

Ser

Leu

Val

Asp

1'

5 '

10

15

Ser

Gin

Lys

Val

Leu

Tyr

Asn

Asn

Glu

Ile

Gly

Phe

Asn

Asn

Gly

Phe

20

25

3Ό

Tyr

Tyr

Ala

Phe

Trp

Lys

Asp

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

Phe

Thr

Leu

Glu

35

40

45

Ser

Gly

Gly

Arg

Tyr·

Ala

Gly

Asn

Trp

Thr

Thr

Ser

Thr

Asn

Asr,

Trp

50

55

60

Val

Gly

Gly

Lys

Gly

Trp

Asn

Pro

Gly

Asn

Ser

Trp

Arg

Thr

Val

Asn

65

70

75

80

Tyr

Ser

Gly

Tyr

Tyr

dy

Ile

Asn

Glu

Tyr

Ala

Asn

Ser

Tyr

Leu

Ser

85

90

95

Leu

Gly

Trp

Thr

Thr

Asn

Pro

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tyr

Val

Val

Glu

100

105

no

Ser

Tyr

Gly

Ser

Tyr

Ser

Pro

Leu

Asn

Cys

Pro

Gly

dy

Thr

Asp

Glu

115

120

125

Gly

Ser

Phe

Thr

Ser

Gly

Gly

Ala

Thr

Tyr

Gin

Val

Arg

Lys

Cys

Arg

130

135

140

Arg

Thr

Asn

Ala

Pro

Ser

Tle

Ile

Gly

Thr

Gin

Ser

Phe

Asp

Gin

Tvr

145

150

155

160

Phe

Ser

Val

Arg

Thr

Pro

Lys

Lys

Gly

Phe

Gly

Gin

Val

Ser

Gly

Ser

165

170

175

Vał

Asn

Phe

Ala

Asp

His

Val

Gin

Tyr

Trp

Ala

Ser

Lys

Gly

Leu

Pro

180

185

190

Leu

Gly

Thr

His

Ala

His

Gin

Ile

Phe

Ala

Thr

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

195

200

205

PL 212 113 B1

Ser Gly Phe Ala Asp Ile Thr Val Ser 210 215

<210>	49
<211>	182
<212>	PRT
<213>	A.
<400>	49

Ala 1

Gly Ile Asn Tyr 5

Val

Gin

Asn

Tyr Asn Gly Asn Leu Gly Asp

Phe

10

15

Thr

Tyr

Asp

Glu

Ser

Ala

Gly

Thr

Phe

Ser

Met

Tyr

Trp

Glu

Asp

Gly

20

2 5

30

Val

Ser

Ser

Asp

Phe

Val

Val

Gly

Leu

Gly

Trp

Thr

Thr

Gly

Ser

Ser

35

40

45

Asn

Ala

' Ile

Thr

Tyr

Ser

Ala

Glu

Tyr

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

Ser

Ser

50

55

60

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gly

Trp

Val

Asn

Tyr

Pro

Gin

Ala

Glu

Tyr

Tyr

65

70

75

80

Ile

Val

Glu

Asp

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Asn

Pro

Cys

Ser

Ser

Ala

Thr

Ser

35

90

95

Leu

Gly

Thr

Val

Tyr

Ser

Asp

dy

Ser

Thr

Tyr

Gin

Val.

.Cys

Thr

Asp

100

105

no

Thr

Arg

Thr

Asn

Glu-

Pro

Ser

Ile

Thr

Gly

Thr

Ser

Thr

Phe

Thr

Gin

115

120

125

Tyr

Phe

Ser

Val

Arg

Glu

Ser

Thr

Arg

Thr

Ser

Gly

Thr

Val

Thr

Val

130

135

140

Ala

Asn

His

Phe

Asn

Phe

Trp

Ala

Gin

His

Gly

Phe

Gly

Asn

Ser

Asp

145

150

155

160

Phe

Asn

Gin

Val

Met

Ala

Val

Glu

Ala

Trp

Ser

Gly

Ala

Gly

Ser

165

170

175

Ala

Ser

Val

Thr

Ile

Ser

180

<210> !

50

<211> ,

211

<212> :

PRT

<213> i

A. niger

<400> !

50

Met

Lys

Val

Thr

Ala

Ala

Phe

Ala

Giy

Leu

Leu

val

Thr

Ala

Phe

Ala

1

5

10

15

Ala

Pro

Val

Pro

Glu

Pro

Val

Leu

Val

Ser

Arg

Ser

Ala

Gly

Ile

Asn

20

25

30

PL 212 113 B1

Tyr Val	Gin 35	Asn	Tyr Asn	Gly	Asn 40	Leu Gly Asp	Phe	Thr 45	Tyr	Asp	Glu
Ser Ala	Gly	Thr	Phe Ser	Met	Tyr	Trp Glu Asp	Gly	Val	Ser	Ser	Asp
50				55			60
Phe Val	Val	Gly	Leu Gly	Trp	Thr	Thr Gly Ser	Ser	Lys	Ala	Ile	Thr
65			70			75					80
Tyr Ser	Ala	Glu	Tyr Ser	Ala	Ser	Gly Ser Ser	Ser	Tyr	Leu	Ala	Vai
			85			90				95
Tyr Gly	Trp	Val	Asn Tyr	Pro	G1 n	Ala Glu Tyr	Tyr	i	Val	Glu	Asp
		100				105			110
Tyr Gly	Asp	Tyr	Asn Pro	Cys	Ser	Ser Ala Thr	Ser	Leu	Gly	Thr	Val
	115				120			125
Tyr Ser	Asp	Gly	Ser Thr	Tyr	Gin	Val Cys Thr	Asp	Thr	Arg	Thr	Asn
130				135			140
Glu Pro	Ser	Ile	Thr Gly	Thr	Ser	Thr Phe Thr	Gin	Tyr	Phe	Ser	Val
145 '			150			155					160
Arg Glu	Ser	Thr	Arg Thr	Ser	Gly	Thr Val Thr	Val	Ara	Asn	His	Phe
			165			170				175
Asn Phe	Trp	Ala	Gin His	Gly	Phe	Gly Asn Ser	Asp	Phe	Asn	Tyr	Gin
		180				185			190
Val Met	Ala	Val	Glu Ala	Trp	Ser	Gly Ala Gly	Ser	Ala	Ser	Val	Thr
	195				200			205
Ile Ser	Ser
210
<210>	51
<211>	210
<212>	PRT
<213> .	A .tubigensis ,:

<400>

51

Met

Lys

Val

Thr

Ala

Ala

Phe

Ala

Gly

Leu

Leu

Val

Thr

Ala

Phe

Ala

1

5

10

1 5

Ala

Pro

Ala

Pro

Glu

Pro

Asp

Leu

Val

Ser

Arg

Ser

Ala

Gly

Ile

Asn

20

25

30

Tyr

Val

Gin

Asn

Tyr

Asn

Gly

Asn

Leu

Gly

Asp

Phe

Thr

Tyr

Asp

Glu

35

40

45

Ser

Ala

Gly

Thr

Phe

Ser

Met

Tyr

Trp

Glu

Asp

Gly

Val

Ser

Ser

Asp

50

55

60

Phe

Val

val

Gly

Leu

Gly

Trp

Thr

Thr

Gly

Ser

Ser

Thr

Ile

Thr

Tyr

65

70

75

80

Ser

Ala

Glu

Tyr

Ser

Ala

Ser

Gly

Ser

Ala

Ser

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

85

90

95

PL 212 113 B1

Gly

Trp Val

Asn Tyr 100

Pro

Gin Ala

Glu 105

Tyr

Tyr

Ile Val

Glu 110

Asp

Tyr

Gly

Asp

Tyr

Asn

Pro

Cys

Ser

Ser

Ala

Thr

Ser

Leu

Gly

Thr

Val

Tyr

115

120

125

Ser

Asp

Gly

Ser

Thr

Tyr

Gin

val

Cys

Thr

Asp

Thr

Arg

Thr

Asn

Glu

130

135

140

Pro

Ser

Ile

Thr

Gly

Thr

Ser

Thr

Phe

Thr

Gin

Tyr

Phe

Ser

Val

Arg

145

150

155

160

Glu

Ser

Thr

Arg

Thr

Ser

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ala

Asn

His

Phe

Asn

165

170

175

Phe

Trp

Ala

His

His

Gly

Phe

Gly

Asn

Ser

Asp

Phe

Asn

Tyr

Gin

Val

180

185

190

Val

Ala

Val

Glu

Ala

Trp

Ser

Gly

Ala

Gly

Ser

Al a

Ser

Val

Thr

Ile

195

200

205

Ser

Ser

210

<210>

52

<2il>

206

<21;

>>

PRT

<213>

P, purpurogenum

<400>

52

Met

Lys

Val

Thr

Ala

Ala

Phe

Ala

Gly

Leu

Leu

Ala

Arg

His

Ser

Pro

7

5

10

15

Pro

Leu

Ser

Thr

Glu

Leu

Val

Thr

Arg

Ser

Ile

Asn

Tyr

Val

Gin

Asn

20

25

30

Tyr

Asn

Gly

Asn

Leu

Gly

Ala

Phe

Ser

Tyr

Asn

Glu

Gly

Ala

Gly

Thr

35

40

45

Phe

Ser

Met

Tyr

Trp

Gin

Gin

Giy

val

Ser

Asn

Asp

Phe

Val

Val

Gly

50

55

60

Leu

Gly

Arg

Ser

Thr

Giy

Ser

Ser

Asn

Pro

Ile

Thr

Tyr

Ser

Ala

Ser

65

70

75

80

Tyr

Ser

Ala

Ser

Gly

Gly

Ser

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

Giy

Trp

Val

Asn

35

90

95

Ser

Pro

Gin

Ala

Glu

Tyr

Tyr

Val

Val

Glu

Ala

Tyr

Gly

Asn

Tyr

Asn

100

105

110

Pro

Cys

Ser

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

Asn

Leu

Giy

Thr

Val

Ser

Ser

Asp

115

120

125

Gly

Gly

Thr

Tyr

Gin

Val

Cys

Thr

Asp

Thr

Arg

Val

Asn

Gin

Pro

Ser

130

135

140

Ile

Thr

Gly

Thr

Ser

Thr

Phe

Thr

Gin

Phe

Phe

Ser

Val

Arg

Gin

Gly

14 5

150

155

160

Ser

Arg

Thr

Ser

Gly

Thr

Val

Thr

Ile

Ala

Asn

His

Phe

Asn

Phe

Trp

165 170 175

PL 212 113 B1

Ala Asn

Asp

Gly Phe Gly 180

Asn

Ser

Asn 185

Phe

Asn

Tyr

Gin

Val 190

val

Ala

Val Glu

Ala 195

Trp Ser Gly

Thr

Gly 200

Thr

Ala

Ser

Val

Thr 205

Val

Ser

Ala

<210>

53

<211>

233

<212>

PRT

<213>

P. purpurogenum

<40C

!> !

53

Met

Lys

Val

Thr

Ala

Ala

Phe

Ala

Gly

Leu

Leu

Ala

Arg

His

Ser

Pro

1

£

10

15

Pro

Leu

Ser

Thr

Glu

Leu

Val

Thr

Arg

Ser

Ile

Asn

Tyr

Val

Gin

Asn

20

25

30

Tyr

Asn

Gly

Asn

Leu

Gly

Ala

Phe

Ser

Tyr

Asn

Glu

Giy

Ala

Gly

Thr

35

40

45

Phe

Ser

Met

Tyr

Trp

Gin

Gin

Gly

Val

Ser

Asn

Asp

Phe

Val

Val

Gly

50

55

60

Leu

Gly

Arg

Ser

Thr

Gly

Ser

Ser

Asn

Pro

Ile

Thr

Tyr

Ser

Ala

Ser

65

70

75

80

Tyr

Ser

Ala

Ser

Gly

Gly

Ser

Tyr

Leu

Ala

Val

Tyr

Gly

Trp

Val

Asn

85

90

95

Ser

Pro

Gin

Ala

Glu

Tyr

Tyr

Val

Val

Glu

Ala

Tyr

Giy

Asn

Tyr

Asn

100

105

110

Pro

Cys

Ser

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

Asn

Leu

Gly

Thr

Val

Ser

Ser

Asp

115

i 2 0

125

Gly

Gly

Thr

Tyr

Gin

Val

Cys

Thr

Asp

Thr

Arg

Val

Asn

Gin

Pro

Ser

130

135

140

Ile

Thr

Gly

Thr

Ser

Thr

Phe

Thr

Gin

Phe

Phe

Ser

Vai

Arg

Gin

Giv

145

150

155

160

Ser

Arg

Thr

Ser

Gly

Thr

Val

Thr

Ile

Ala

Asn

His

Phe

Asn

Phe

Trp

165

170

17 5

Ala

Asn

Asp

Gly

Phe

Gly

Asn

Ser

Asn

Phe

Asn

Tyr

Gin

Val

Val

Ala

130

185

190

Val

Glu

Ala

Trp

Ser

Gly

Thr

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Thr

Val

Ser

Ala

195

200

205

Asn

Phe

Asn

Tyr

Gin

Val

Leu

Ala

Val

Glu

Gly

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

210

215

220

Asn

Ala

Asn

Met

Lys

Leu

Ile

Ser

Gly

225

230

'-.z. 10 i* .

54

<211> .

229

PL 212 113 B1 <212> PRT <213> Τ. reesei <400> 54

Met 1

Val

Ala

Phe

Ser 5

Ser

Leu

Ile

Cys

Ala 10

Leu

Thr

Ser

Ile

Ala 15

Ser

Thr

Leu

Ala

Met

Pro

Thr

Gly

Leu

Glu

Pro

Glu

Ser

Ser

Yal

Asn

Val

20

25

30

Thr

Glu

Arg

Gly

Met

Tyr

Asp

Phe

Val

Leu

Gly

Ala

His

Asn

Asp

His

35

40

45

Arg

Arg

Arg

Ala

Ser

Ile

Asn

Tyr

Asp

Gin

Asn

Gin

Thr

Gly

Gly

50

55

60

Gin

Val

Ser

Tyr

Ser

Pro

Ser

Asn

Thr

Gly

Phe

Ser

Val

Asn

Trp

Asn

65

70

75

80

Thr

Gin

Asp

Asp

Phe

Val

Yal

Gly

Val

Gly

Trp

Thr

Thr

Gly

Ser

Ser

85

90

95

Ala

Pro

Ile

Asn

Phe

Gly

Gly

Ser

Phe

Ser

Val

Asn

Ser

Gly

Thr

Gly

100

105

110

Leu

Leu

Ser

Val

Tyr

Gly

Trp

Ser

Thr

Asn

Pro

Leu

Val

Glu

Tyr

Tyr

115

120

125

Ile

Met

Glu

Asp

Asn

His

Asn

Tyr

Pro

Ala

Gin

Gly

Thr

-Yal

Lys

Gly

130

135

14Ó

Thr

Val

Thr

Ser

Asp

Gly

Al a

Thr

Tyr

Thr

Ile

Trp

Glu

Asn

Thr

Arg

145

150

155

160

Yal

Asn

Glu

Pro

Ser

Ile

Gin

Gly

Thr

Ala

Thr

Phe

Asn

Gin

Tyr

Ile

165

170

175

Ser

Val

Arg

Asn

Ser

Pro

Arg

Thr

Ser

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Gin

Asn

180

185

190

His

Phe

Asn

Ala

Trp

Ala

Ser

Leu

Gly

Leu

His

Leu

Gly

Gin

Met

Asn

195

200

205

Tyr

Gin

Yal

Yal

Ala

Yal

Glu

Gly

Trp

Gly

Gly

Ser

Gly

Ser

Ala

Ser

210

215

220

Gin Ser Val Ser Asn 225 .

<210> 55 <211> 227 <212> PRT <213> B. pumilus <400> 55

Met Asn Leu Lys Arg Leu Arg Leu Leu Phe Val Met Cys Ile Gly Phe ¹ 5 10 15

PL 212 113 B1

Val

Leu

Thr

Leu 20

Thr

Ala

Val

Pro

Ala 25

His

Ala

Glu

Thr

Ile 30

Tyr

Asp

Asn

Arg

Ile

Gly

Thr

His

Ser

Gly

Tyr

Asp

Phe

Glu

Leu

Trp

Lys

Asp

35

40

45

Tyr

Gly

Asn

Thr

Ser

Met

Thr

Leu

Asn

Asn

Gly

Gly

Ala

Phe

Ser

Ala

50

55

60

Ser

Trp

Asn

Asn

Ile

Gly

Asn

Ala

Leu

Phe

Arg

Lys

Gly

Lys

Lys

Phe

65

70

75

80

Asp

Ser

Thr

Lys

Thr

His

His

Gin

Leu

Gly

Asn

Ile

Ser

11 e

Asn

Tyr

85

90

95

Asn

Ala

Ala

Phe

Asn

Pro

Gly

Gly

Asn

Ser

Tyr

Leu

Cys

Val

Tyr

Gly

100

105

110

Trp

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ala

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Val

Glu

Ser

Trp

Gly

115

. 120

125

Thr

Tyr

Arg

Pro

Thr

Gly

Thr

Tyr

Lys

Gly

Ser

Phe

Tyr

Ala

Asp

Gly

130

135

140

Gly

Thr

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Glu

Thr

Leu

Arg

Val

Asn

Gin

Pro

Ser

r le

145

150

155

160

Ile

Gly

Asp

^31

Thr

Phe

Lys

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Gin

Thr

Lys

165

170

175

Arg

Thr

Ser

Gly

Thr

Ala

Ser

Val

Ser

Glu

His

Phe

Lys

Lys

Trp

Glu

180

185

190

Ser

Leu

Gly

Met

Pro

Met

Gly

Lys

Met

Tyr

Glu

Thr

Ala

Leu

Thr

Val

195

200

205

Glu

Gly

Tyr

Arg

Ser

Asn

Gly

Ser

Al a

Asn

Val

Met

Thr

Asn

Gin

Leu

210

215

220

Met

Ile

Arg

225

<2io> :

36 '

<211> 228

<212> PRT

<213> B. pumilus

<400>

56

Met

Asn

Leu

Arg

Lys

Leu

Arg

Leu

Leu

Phe

Val

Met

Cys

Ile

Gly

Leu

1

Cl

10

15

Thr

Leu

Ile

Leu

Thr

Ala

Val

Pro

Ala

His

Al 3

Arg

Thr

Ile

Thr

Asn

20

25

30

Asn

Glu

Met

Gly

Asn

His

Ser

Gly

Tyr

Asp

Tyr

Glu

Leu

Trp

Lys

Asp

35

40

45

Tyr

Gly

Asn

Thr

Ser

Met

Thr

Leu

Asn

Asn

Gly

dy

Ala

Phe

Ser

Ala

55 60

PL 212 113 B1

Gly 65

Trp Asn Asn

Ile

Gly Asn Ala 70

Leu

Phe

Arg 75

Lys

Gly

iys

Lys

Phe 90

Asp

Ser

Thr

Arg

Thr

His

His

Gin

Leu

Gly

Asn

I le

Ser

Ile

Asn

Tyr

85

90

95

Asn'

Ala

Ser

Phe

Asn

Pro

Gly

Gly

Asn

Ser

Tyr

Leu

Cys

Val

Tyr

Gly

100

105

110

Trp

Thr

Gin

Ser

Pro

Leu

Ala

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Val

Asp

Ser

Trp

Gly

115

120

125

Thr

Tyr

Arg

Pro

Thr

Gly

Ala

Tyr

Lys

Gly

Ser

Phe

Tyr

Ala

Asp

Gly

130

135

140

Gly

Thr

Tyr

Asp

Ile

Tyr

Glu

Thr

Thr

Arg

Val

Asn

Gin

Pro

Ser

Ile

145

150

155

160

Ile

Gly

Ile

Ala

Thr

Phe

Lys

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Gin

Thr

Lys

165

170

17 5

Arg

Thr

Ser

Gly

Thr

Val

Ser

Val

Ser

Ala

His

Phe

Arg

Lys

Trp

Glu

180

185

190

Ser

Leu

Gly

Met

Pro

Met

Gly

Lys

Met

Tyr

Glu

Thr

Ala

Phe

Thr

Val

195

200

20,5

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

Gly

Ser

Ala

Asn

Val

Met

Thr

Asn

Gin

Leu

210

215

220

Phe

Ile

Gly

Asn

225 <210> 57 <211> 261 <212> PRT <213> C. acetobutylicum

<400> 57

Met

Leu

Arg

Arg

Lys

Val

Ile

Phe

Thr

Val

Leu

Ala

Thr

Leu

Val

Met

1

5

10

15

Thr

Ser

Leu

Thr

Ile

Val

Asp

Asn

Thr

Ala

Phe

Ala

Ala

Thr

Asn

Leu

20

25

30

Asn

Thr

Thr

Glu

Ser

Thr

Phe

Ser

Lys

Glu

Val

Leu

Ser

Thr

Gin

Lys

35

40

45

Thr

Tyr

Ser

Ala

Phe

Asn

Thr

Gin

Ala

Ala

Pro

Lys

Thr

Ile

Thr

Ser

50

55

60

Asn

Glu

Ile

Gly

Val

Asn

Gly

Gly

Tyr

Asp

Tyr

Glu

Leu

Trp

Lys

Asp

65

70

75

80

Tyr

Gly

Asn

Thr

Ser

Met

Thr

Leu

Lys

Asn

Gly

Gly

Ala

Phe

Ser

C vs

85

90

95

Gin

Trp

Ser

Asn

I le

Gly

Asn

1 ci

Leu

Phe

Arg

Lys

Gly

Lys

Lys

Phe

100

105

110

Asn

Asp

Thr

Gin

Thr

Tyr

Lys

Gin

Leu

Gly

Asn

Ile

Ser

Val

Asn

Tyr

115 120 125

PL 212 113 B1

Asp

Cys 130

Asn

Tyr

Gin

Pro

Tyr 135

Gly

Asn

Ser

Tyr

Le u 140

Cys

Val

Tyr

Gly

Trp 145

Thr

Ser

Ser

Pro

Leu 150

Val

Glu

Tyr

Tyr

I le 155

Va 1

Asp

Ser

Trp

Gly 160

Ser

Trp

Arg

Pro

Pro 165

Gly

Gly

Thr

Ser

Lys 170

Gly

Thr

Ile

Thr

Val 175

Asp

Gly

Gly

Ile

Tyr 130

Asp

Ile

Tyr

Glu

Thr 185

Thr

Arg

Ile

Asn

Gin 190

Pro

Ser

Ile

Gin

Gly 195

Asn

Thr

Thr

Phe

Lys 200

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val 205

Arg

Arg

Thr

Lys

Arg 210

Thr

Ser

Gly

Thr

Ile 215

Ser

Val

Ser

Lys

His 220

Phe

Ala

Ala

Trp

Glu 225

Ser

Lys

Gly

Met

Pro 230

Leu

Gly

Lys

Met

His 235

Glu

Thr

Ala

Phe

Asn 240

Ile

Glu

Gly

Tyr

Gin 245

Ser

Ser

Gly

Lys

Ala 250

Asp

Val

Asn

Ser

Met 255

Ser

Ile

Asn

Ile

Gly 2S0

Lys

<210> :

58

<2ii> ;

234

<212> :

PRT

<213> i

3. ' thermocellum

<400>

58

Met

Lys

Gin

Lys

Leu

Leu

Val

Thr

Phe

Leu

Ile

Leu

Ile

Thr

Phe

Thr

1

5

10

15

Val

Ser

Leu

Thr

Leu

Phe

Pro

Val

Asn

Val

Arg

Ala

Asp

Val

Val

Ile

20

25

30

Thr

Ser

Asn

Gin

Thr

Gly

Thr

Gly

Gly

Gly

Tyr

Asn

Phe

Glu

Tyr

Trp

35

40

45

Lys

Asp

Thr

Gly

Asn

Gly

Thr

Met

Val

Leu

Lys

Asp

Gly

Gly

Ala

Phe

50

55

60

Ser

.Cys

Glu

Trp

Ser

Asn

Ile

Asn

Asn

Ile

Leu

Phe

Arg

Lys

Gly

Phe

65

70

75

80

Lys

Tyr

Asp

Glu

Thr

Lys

Thr

His

Asp

Gin

Leu

Gly

Tyr

Ile

Thr

Val

85

90

95

Thr

Tyr

Ser

Cys

Asn

Tyr

Gin

Pro

Asn

Gly

Asn

Ser

Tyr

Leu

Gly

Val

100

105

110

Tyr

Gly

Trp

Thr

Ser

Asn

Pro

Leu

Val

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Ile

Glu

Ser

115

120

125

Trp

Gly

Thr

Trp

Arg

Pro

Pro

Gly

Ala

Thr

Pró

Lys

Gly

Thr

Ile

Thr

130

135

140

PL 212 113 B1

Val 145

Asp Gly

Gly Thr

Tyr 150

Glu

Ile

Tyr

Glu

Thr 155

Thr

Arg

Val

Asn

Gin 160

Pro

Ser

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Phe

Gin

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

165

170

175

Thr

Ser

Lys

Arg

Thr

Ser

Gly

Thr

Ile

Ser

Val

Thr

Glu

His

Phe

Lys

180

185

190

Ala

Trp

Glu

Arg

Leu

Gly

Met

Lys

Met

Gly

Lys

Met

Tyr

Glu

Val

Ala

195

200

205

Leu

Val

Val

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ser

dy

Lys

Ala

Asp

Val

Thr

Ser

210

215

220

Met

Thr

Ile

Thr

Val

Gly

Asn

Ala

Pro

Ser

225

230

<210

59

<211>

230

<212>

PRT

<213>

Bacillus

sp 41M-:

L

<400>

59

Met

Lys

Gin

Val

Lys

Ile

Met

Phe

Leu

Met

Thr

Met

Phe

Leu

Gly

Ile

1

5

10

15

Gly

Leu

Leu

Phe

Phe

Ser

Glu

Asn

Al zi

Glu

Ala

Ala

Ile

Thr

Ser

Asn

20

25

.30

Glu

Ile

Gly

Thr

His

Asp

Gly

Tyr

Asp

Tyr

Gru

Phe

Trp

Lys

Asp

Ser

35

40

4 5

Gly

Gly

Ser

Gly

Ser

Met

Thr

Leu

Asn

Ser

Gly

Gly

Thr

Phe

Ser

Ala

50

55

60

Gin

Trp

Ser

Asn

Val

Asn

Asn

Ile

Leu

Phe

Arg

Lys

Gly

Lys

Lys

Phe

65

70

75

80

Asp

Glu

Thr

Gin

Thr

His

Gin

Gin

Ile

Gly

Asn

Met

Ser

Ile

Asn

Tyr

85

90

95

Gly

Ala

Thr

Tyr

Asn

Pro

Asn

Gly

Asn

Ser

Tyr

Leu

Thr

Val

Tyr

Gly

100

105

110

Trp

Thr

Val

Asp

Pro

Leu

Val

Glu

Phe

Tyr

Ile

Val

Asp

Ser

Trp

Gly

115

120

125

Thr

Trp

Arg

Pro

Pro

Gly

dy

Thr

Pro

Lys

Gly

Thr

Ile

Asn

Val

Asp

130

135

140

Gly

Gly

Thr

Tyr

Gin

I le

Tyr

Glu

Thr

Thr

Arg

Tyr

Asn

Gin

Pro

Ser

145

150

155

160

Ile

Lys

Gly

Thr

Ala

Thr

Phe

Gin

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Thr

Ser

165

170

175

Lys

Arg

Thr

Ser

Gly

Thr

Ile

Ser

Val

Ser

Glu

His

Phe

Arg

Ala

Trp

180

185

190

Glu

Ser

Leu

Gly

Met

Asn

Met

Gly

Asn

Met

Tyr

Glu

Val

Ala

Leu

Thr

195

200

205

PL 212 113 B1

Val Glu Gly Tyr Gin Ser	Ser Gly 215	Ser Ala Asn Val Tyr Ser Asn Thr 220
	210
Leu	Thr Ile Gly Gly Gin
225	230

<210> 60 <211> 217 <212> PRT <213> Ρ. mułtivesiuulatum <400> 60

Glu Lys 1

Val

Ile Cys 5

Leu

Leu

11© Als

Leu Phe Gly Leu Ile 10 '

Glu 15

Ala

Gin

Thr

Phe

Tyr

Asn

As n

Ala

Gin

Gly

Gin

Ile

Asp

Gly

Leu

Asp

Tyr

20

25

30

Glu

Leu

Trp

Lys

Asp

Thr

Gly

Thr

Thr

Ser

Met

Thr

Leu

Leu

Gly

Giy

35

40

4 5

Giy

Lys

Phe

Ser

Cys

Ser

Trr

Ser

Asn

Ile

Asn

Asn

Cys

Leu

Phe

Arg

50

55*

60

Ile

Gly

Lys

Lys

Trp

Asn

Cys

Gin

Tyr

Glu

Trp

Trp

Glu

Leu

Gly

Thr

65

70

75

80

Val

Leu

Val

Asn

Tyr

Asp

Val

Asp

Tyr

Asn

Pro

Asn

Gly

Asn

Ser

Tyr

85

90

95

Leu

Cys

Ile

Tyr

Gly

Trp

Thr

Arg

Asn

Pro

Leu

Val

Glu

Tyr

Tyr

Ile

100

105

110

Val

Glu

Ser

Trp

Gly

Ser

Trp

Arg

Pro

Pro

Gly

Gly

Ser

Pro

Met

Asn

115

120

125

Thr

Met

Tyr

Val

Asp

Asp

Gly

Gin

Tyr

Asp

Val

Tyr

Val

Thr

Asp

Arg

130

135

140

Ile

Asn

Gin

Pro

Ser

Ile

Asp

Gly

Asn

Thr

Asn

Phe

Lys

Gin

Tyr

Trp

145

150

155

160

Ser

Val

Arg

Thr

Gm

Lys

Lys

Thr

Arg

Gly

Thr

Val

His

Val

Asn

His

165

170

175

His

Phe

Tyr

Asn

Trp

Gin

Glu

Met

Gly

Leu

Lys

Vai

Giy

Lys

Val

Tyr

180

185

190

Glu

Ala

Ser

Leu

Asn

Ile

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Ala

Gly

Ser

Ala

Thr

195

200

205

Val

Asn

Lys

Asn

Glu

Val

Val

Gin

Thr

210

215

<210>	61
<211>	175
<212>	PRT

PL 212 113 B1 <213> Ρ multivesiculatura <400> 61

Met 1

Thr Leu

Leu

Gly 5

Gly

dy

Lys

Phe

Ser Cys Asn Trp Ser Asn

Ile

10

15

Gly

Asn

Ala

Leu

Phe

Arg

I le

Gly

Lys

Lys

Trp

Α®Ρ

cys

Thr

Lys

Thr

20

25

30

Trp

Gin

Gin

Leu

Gly

Thr

Ile

Ser

Val

Ala

Tyr

Asn

Val

Asp

Tyr

Arg

35

40

45

Pro

Asn

Gly

Asn

Ser

Tyr

Met

Cys

Val

Tyr

Gly

Trp

Thr

Arg

Ser

Pro

50

55

60

Leu

Ile

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Val

Asp

Ser

Trp

Gly

Ser

Trp

Arg

Pro

Pro

65

70

75

80

Gly

Ser

Asn

Ser

Met

Gly

Thr

Ile

Asn

Val

Asp

Giy

Gly

Thr

Tyr

Asp

85

90

95

Ile

Tyr

Val

Thr

Asp

Arg

Ile

Asn

Gin

Pro

Ser

Ile

Asp

Gly

Thr

Thr

100

105

110

Thr

Phe

Lys

Gin

Phe

Trp

Ser

Val

Arg

Thr

Gin

Lys

Lys

Thr

Ser

Gly

115

120

125

Val

Ile

Ser

Val

Ser

Lys

His

Phe

Glu

Ala

Trp

Thr

Ser

Lys

Gly

Leu

130

135

140

Aśn

Leu

Gly

Leu

Met

Tyr

Glu

Ala

Ser

Leu

Thr

Ile

Glu

Gly

Tyr

Gin

145

150

155

160

Ser

Ser

Gly

Ser

Ala

Thr

Val

Asn

Gin

Asn

Asp

Val

Thr

Gly

Gly

165

170

17 5

<210>

62

<2U> :

265

<212>

PRT

<213> 1

R. albus

<4 00>

62

Met

Arg

Asn

Asn

Phe

Lyś

Met

Arg

Val

Met

Ala

Gly

Val

Ala

Ala

Val

1

5

10

15

Ile

cys

Leu

Ala

Gly

Val

Leu

Gly

Ser

Cys

Gly

Asn

Ser

Ser

Asp

Lys

20 '

25

30

Asp

Ser

Ser

Ser

Lys

Lys

Ser

Ala

Asp

Ser

Ala

Lys

Al a

Asp

Ser

Asn

35

40

45

Lys

Asp

Ser

Lys

Asn

Gly

Gin

Val

Phe

Thr

Lys

Asn

Ala

Arg

Gly

Thr

50

55

60

Ser

Asp

Gly

Tyr

Asp

Tyr

Gł u

Leu

Trp

Lys

Asp

Lys

Gly

Asp

Thr

1 U

65

70

7 5

50

Met

Thr

Ile

Asn

Glu

Gly

Giy

Thr

Phe

Ser

Cys

Lys

Trp

Ser

Asn

I le

85

90

95

PL 212 113 B1

Asn

Asn Ala

Leu 100

Phe Arg Arg

Gly

Lys 105

Lys

Phe Asp

Cys

Thr 110

Lys

Thr

Tyr

Lys

Glu

Leu

Gly

Asn

Ile

Ser

Val

Lys

Tyr

Gly

Val

Asp

Tyr

Gin

115

120

125

Pro

Asp

Gly

Asn

Ser

Tyr

Met

Cys

Val

Tyr

Gly

Trp

Thr

Ile

Asp

Pro

130

135

140

Leu

Val

Glu

Phe

Tyr

Ile

Val

Glu

Ser

Trp

Gly

Ser

Trp

Arg

Pro

Pro

145

150

155

160

Gly

Ala

Ala

Glu

Ser

Leu

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Asp

Gly

Gly

Thr

Tyr

165

no

175

Asp

Ile

Tyr

Lys

Thr

Thr

Arg

Tyr

Glu

Gin

Pro

Ser

Ile

Asp

Gly

Thr

180

185

190

Lys

Thr

Phe

Asp

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Gin

Asp

Lys

Pro

Thr

Gry

195

200

205

Asp

Gly

Thr

Lys

Ile

Glu

Gly

Thr

Ile

Ser

Ile

Ser

Lys

His

Phe

Asp

210

215

220

Ais

Trp

Glu

Gin

Val

Gly

Leu

Thr

Leu

Giy

Asn

Met

Tyr

Glu

Val

Ala

225

230

235

240

Ljfiti

Asn

Ile

Glu

Gly

Tyr

Gin

Ser

Asn

Gly

Gin

Ala

Thr

Ile

Tyr

Glu

245

250

255

Asn

Glu

Lsu

Thr

Val

Asp

Giy

Asn

Tyr

260

265

<210>

63

<211

226

<212

:>

PRT

<213> i

Caldieellulosiruptor

sp

<400

)>

63

Met

Cys

Val

Val

Leu

Ala

Asn

Pro

Phe

Tyr

Ala

Gin

Ala

Ala

Met

Thr

1

5

10

15

Phe

Thr

Ser

Asn

Ala

Thr

Gly

Thr

Tyr

Asp

Gly

Tyr

Tyr

Tyr

Glu

Leu

20

25

30

Trp

Lys

Asp

Thr

Gly

Asn

Thr

Thr

Met

Thr

Val

Asp

Thr

Glv

Gly

Arg

35

40

45

Phe

Ser

Cys

Gin

Trp

Ser

Asn

Ile

Asn

Asn

Ala

Leu

Phe

Arg

Thr

Gly

50

55

60

Lys

Lys

Phe

Ser

Thr

Ala

Trp

Asn

Gin

Leu

Gly

Thr

Val

Lys

Ile

Thr

65

70

75

80

Tyr

Ser

Ala

Thr

Tyr

Asn

Pro

Asn

Gly

Asn

Ser

Tyr

Leu

Cys

Ile

T yr

85

90

95

Gly

Trp

. Ser

Arg

Asn

Pro

Leu

Val

Glu

Phe

Tyr

Ile

Val

Glu

Ser

Trp

100

105

110

PL 212 113 B1

Gly Ser

Trp 115

Arg

Pro

Pro Gly

Ala 120

Thr

Ser

Leu

Gly

Thr 125

Val

Thr

Ile

Asp Gly

Ala

Thr

Tyr

Asp Ile

Tyr

Lys

Thr

Thr

Arg

Val

Asn

Gin

Pro

130

135

140

Ser Ile

Glu

Gly

Thr

Arg Thr

Phe

Asp

Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Thr

145

150

155

160

Ser Lys

Arg

Thr

Ser

Gly Thr

Val

Thr

Val

Thr

Asp

His

Phe

Lys

Ala

165

170

1T5

Trp Ala

Ala

Lys

Gly

Leu Asn

Leu

Gly

Thr

Ile

Asp

Gin

Ile

Thr

Leu

180

185

190

Cys Val

Glu

Gly

Tyr

Gin Ser

Ser

Gly

Ser

Ala

Asn

Ile

Thr

Gin

Asn

195

200

205

Thr Phe

Thr

Ile

Gly

Gly Ser

Ser

Ser

Gly

Ser

Ser

Asn

Gly

Ser

Asn

210

215

220

Asn Gly

225

<210>

64

<211>

232

<212>

PRT

<213>' '

D. thermophilum'

<400>

64

Met Phe

Leu

Lys

Lys

Leu Ser

Lys

Leu

Leu

Leu

Val

Val

Leu

Leu

Val

1 '

5

10

15

Ala Val

Tyr

Thr

Gin

Val Asn

Ala

Gin

Thr

Ser

Ile

Thr

Leu

Thr

Ser

20

25

30

Asn Ala

Ser

Gly

Thr

Phe Asp

Gly

Tyr

Tyr

Tyr

Glu

Leu

Trp

Lys

Asp

35

40

45

Thr Gly

Asn

Thr

Thr

Met Thr

Val

Tyr

Thr

Gin

Gly

Arg

Phe

Ser

Cys

50

55

60

Gin Trp

Ser

Asn

Ile

Asn Asn

Ala

Leu

Phe

Arg

Thr

Gly

Lys

Lys

Tyr

65

70

75

80

Asn Gin

Asn

Trp

Gin

Ser Leu

Gly

Thr

Ile

Arg

Ile

Thr

Tyr

Ser

Ala

35

90

95

Thr Tyr

Asn

Pro

Asn

Gly Asn

Ser

Tyr

Leu

Cys

Ile

Tyr

Giy

Trp

Ser

100

105

110

Thr Asn

Pro

Leu

Val

Glu Phe

Tyr

Ile

Val

Glu

Ser

Trp

Gly

Asn

Trp

115

120

125

Arg Pro

Pro

Gly

Ala

Thr Ser

Leu

Gly

Gin

Va 1

Thr

Ile

Asp

Gly

Gly

130

135

140

Thr Tyr

Asp

Ile

Tyr

Arg Thr

Thr

Arg

Val

Asn

Gin

Pro

Ser

Ile

Val

145

150

155

160

Gly Thr

Ala

Thr

Phe

Asp Gin

Tyr

Trp

Ser

Val

Arg

Thr

Ser

Lys

Arg

165

170

]_ 7 ς

PL 212 113 B1

Thr

Ser

Gly

Thr 180

Val

Thr

Val

Thr

Asp 185

His

Phe

Arg

Ala

Trp 190

Ala

Asn

Arg

Gly

Leu 195

Asn

Leu

Gly

Thr

Ile 200

Asp

Gin

Ile

Thr

Leu 205

Cys

Yal

Glu

Gly

Tyr 210

Gin

Ser

Ser

Gly

Ser 215

Ala

Asn

Ile

Thr

Gin 220

Asn

Thr

Fhe

Ser

Gin 225

Gly

Ser

Ser

Ser

Gly 230

Ser

Ser

<210>

55

<211

>

255

<212>

PRT

<213>

R. flatefaciens

<40(

0>

S5

Met

Lys

Leu

Ser

Lys

Ile

Łys

Lys

val

Leu

Ser

Gly

Thr

Yal

Ser

Ala

i

5

10

15

Leu

Met

Ile

Ala

Ser

Ala

Ala

Pro

Val

Val

Ala

Ser

Ala

Ala

.Asp

Gin

20

25

30

Gin

Thr

Arg

Gly

Asn

Yal

Gly

Gly

Tyr

Asp

Tyr

Glu

Met

Trp

Asn

Gin

35

40

45

Asn

Gly

Gin

Gly

Gin

A1 a

Ser

Met

Asn

Pro

Gly

Ala

Gly

Ser

Phe

Thr

50

55

60

Cys

Ser

Trp

Ser

Asn

Ile

Glu

Asn

Phe

Leu

Ala

Arg

Met

Gly

Lys

Asn

65

70

75

80

Tyr

Asp

Ser

Gin

Łys

Lys

Asn

Tyr

Lys

Ala

Phe

Gly

Asn

I le

Val

Leu

85

90

95

Thr

Tyr

Asp

Yal

Glu

Tyr

Thr

Pro

Arg

Gly

Asn

Ser

Tyr

Met

Cys

Val

100

105

110

Tyr

Gly

Trp

Thr

Arg

Asn

Pro

Leu

Met

Glu

Tyr

Tyr

Ile

Yal

Glu

Gly

115

120

125

Trp

Gly

Asp

Trp

Arg

Pro

Pro

Gly

Asn

Asp

Gly

Glu

Val

Lys

Gly

Thr

130

135

140

Val

Ser

Ala

Asn

Gly

Asn

Thr

Tyr

Asp

Ile

Arg

Lys

Thr

Met

Arg

Tyr

.145

150

155

160

Asn

Gin

Pro

Ser

Leu

Asp

Gly

Thr

Ala

Thr

Phe

Pro

Gin

Tyr

Trp

Ser

165

170

175

Val

Arg

Gin

Thr

Ser

Gly

Ser

Ala

Asn

Asn

Gin

Thr

Asn

Tvr

Met

Lys

180

185

190

Gly

Thr

Ile

Asp

Val

Thr

Lys

His

Phe

Asp

Ala

Trp

Ser

Ala

Ala

Gly

195

200

205

Leu

Asp

Met

Ser

Gly

Thr

Leu

Tyr

Glu

Yal

Ser

Leu

Asn

Ile

Glu

.l y

210

215

220

PL 212 113 B1

Tyr Arg Ser Asn 225

Gly

Ser 230

Ala

Asn

Val

Lys

Ser Val 235

Ser Val

Thr Gin 240

Gly Gly Ser

Ser

Asp

Asn

Gly

Gly

Gin

Gin

Gin

Asn

Asn

Asp

Trp

245

250

255

<210>	66
<21I>	280
<212>	PRT
<213>	P. .
<400>	66

Met Thr Val Tyr Lys Arg Lys Ser Arg Val Leu Ile Ala Val Val Thr 15 10 15

Leu

Leu

His

Val 20

Leu

Ser

His

Ala

Pro 25

Thr

Lys

Met

Leu

Thr 30

Thr

Asp

Val

Leu

Leu 35

Thr

Arg

Cys

Met

His 40

lSU

Cys

His

Phe

Arg 45

Thr

Ser

Asp

Ser

Val 50

Tyr

Thr

Asn

Glu

Thr 55

Ser

Glu

Glu

Arg

Ser 60

Met

Ser

Asp

Arg

Leu 65

Asn

Ile

Thr

Arg

Val 70

Met

Ser

Tyr

Asp

Arg 7 A

Trp

Thr

Asp

Leu

Vai 80

Gly

Glu

Leu

Glu

Val

Arg

Glu

Leu

Lys

His

Val

Met

Ser

His

Arg

Thr

90 95

Tyr Ser.Leu Cys Asp Leu Ser Cys Ser Thr Val Leu Asp Ser Asn Ser 100 105 110

Met

Phe

Ser

Leu

Gly

Lys

Gly

Trp

Gin

Ala

Ile

Ser

Ser

Arg

Gin

Gly

115

120

125

Val

Gly

Ala

Thr

Val

Tyr

Gly

Trp

Thr

Arg

Ser

Pro

Leu

Leu

Ile

Glu

130

135

140

Tyr

Tyr

Val

Val

Asp

Ser

Trp

Gly

Ser

Tyr

His

Pro

Ser

Asn

Thr

I it!

145

150

155

160

Thr

Gly

Thr

Phe

Val

Thr

Val

Lys

Cys

Asp

Gly

Gly

Thr

Tyr

Asp

Ile

165 170 175

Tyr

Thr

Ala

Val 180

Arg

Val

Asn

Ala

Pro 185

Ser

Ile

Glu

Gly

Thr 190

Thr

Phe

Thr

Gin

Tyr 195

Trp

Ser

Val

Arg

Gin 200

Ser

Ala

Thr

Ile

Gin 205

Leu

Ala

Vai

Ile

Lys 210

Pro

Leu

Thr

Leu

Gin 215

Asn

Ala

Thr

Ile

Thr 220

Phe

Thr

Phe

Ser

Asn

His

Phe

Asp

Ala

Trp

Lys

Thr

Met

Thr

Leu

Glu

Ala

Thr

His

Ser

225 230 23.5 240

Thr

Glu

Gly

Tyr

Phe 245

Ser

Ser

Gly

Ile

Thr 250

Tyr

Glu

Gin

Pro

His Gin 255

Pro

His

Arg

Asn

Thr

Trp

Ala

Thr

Ser

Leu

Thr

Ser

Gin

Thr

Lys His

260 265 270

Thr Ala Arg Ser Leu Pro Ile Asn

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Wariant polipeptydu lub jego fragment posiadający aktywność ksylanazy zawierający mutację wybraną spośród: D11Y, D11F, D11K, D11F/R122D i D11F/G34D w odniesieniu do sekwencji aminokwasowej B.subtilis ukazanej jako SEQ ID nr 1, lub równoważnej (ych) pozycji(ach) w innych ksylanazach rodziny 11 tak, że wariant polipeptydu lub jego fragmentu ma zredukowaną wrażliwość na inhibitor ksylanazy w porównaniu z polipeptydem o sekwencji aminokwasowej ukazanej jako SEQ ID Nr 1.
2. 2. Wariant polipeptydu według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera mutację D11F.
3. 3. Wariant polipeptydu według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawiera mutację D11F/R122D.
4. 4. Wariant polipeptydu według jednego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że wspomnianym inhibitorem jest inhibitor naturalnie znajdujący się w tkankach roślinnych.
5. 5. Kompozycja, znamienna tym, że zawiera wariant polipeptydu zdefiniowanego w jednym z zastrz. 1 do 4.
6. 6. Sposób rozkładu lub modyfikowania roślinnej ściany komórkowej, znamienny tym, że kontaktuje się wspomnianą roślinną ścianę komórkową z polipeptydem zdefiniowanym w jednym z zastrz. 1 do 4 lub z kompozycją zdefiniowaną w zastrz. 5.
7. 7. Sposób obróbki materiału roślinnego, znamienny tym, że kontaktuje się ten materiał roślinny z polipeptydem zdefiniowanym w jednym z zastrz. 1 do 4 lub z kompozycją zdefiniowaną w zastrz. 5.
8. 8. Sekwencja nukleotydowa, znamienna tym, że koduje wariant polipeptydu jak zdefiniowano w jednym z zastrz. 1 do 4.
9. 9. Konstrukt, znamienny tym, że zawiera sekwencję nukleotydową zdefiniowaną w zastrz. 8.
10. 10. Zastosowanie wariantu polipeptydu zdefiniowanego w jednym z zastrz. 1 do 4 w sposobie modyfikowania materiału roślinnego.
11. 11. Zastosowanie wariantu polipeptydu zdefiniowanego w jednym z zastrz. 1 do 4 w jednym lub więcej spośród: pieczenia, pasz dla zwierząt, wytwarzania skrobi, oddzielania mąki (mielenie na mokro) oraz wytwarzania papieru i miazgi drzewnej.
12. 12. Zastosowanie wariantu polipeptydu zdefiniowanego w jednym z zastrz. 1 do 4 w jednym lub więcej spośród: obróbki zbóż, w obróbce drewna i we wzmacnianiu procesu bielenia miazgi drzewnej.