ES2354533T3 - Variantes de xilanasa que presentan una sensibilidad alterada a los inhibidores de xilanasa. - Google Patents

Abstract

Polipéptido variante o fragmento del mismo con actividad de xilanasa, que comprende una mutación seleccionada de entre D11Y, D11F, D11K, D11F/R122D y D11F/G34D con referencia a la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1, o en posición o posiciones equivalente(s) en otras xilanasas de la familia 11, de tal modo que el polipéptido variante o un fragmento del mismo presenta una sensibilidad reducida a un inhibidor de xilanasa en comparación con un polipéptido con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC. ID. nº 1.

Description

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a enzimas mutantes de xilanasa que presentan una sensibilidad alterada a los inhibidores de xilanasa. La presente invención se refiere además a la utilización de estas enzimas mutantes en el tratamiento de materiales vegetales. 5

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Durante muchos años, las endo-β-1,4-xilanasas (EC 3.2.1.8) (denominadas en la presente memoria xilanasas) se han utilizado para la modificación de carbohidratos complejos procedentes del material de la pared de células vegetales. Es bien conocido en la técnica que la funcionalidad de diferentes xilanasas (procedentes de diferentes microorganismos o plantas) se diferencia enormemente. 10

Se han realizado estudios exhaustivos que caracterizan la funcionalidad de la xilanasa en sustratos bien caracterizados y puros (Kormelink et al., 1992). Estos estudios demuestran que diferentes xilanasas tienen diferentes requisitos específicos con respecto a la sustitución de los ejes centrales de xilosa del arabinoxilano (AX). Algunos xilanos requieren tres restos de xilosa insustuidos para hidrolizar el eje central de la xilosa; otros necesitan solamente uno o dos. Se cree que las razones de estas diferencias de especificidad 15 son debidas a la estructura tridimensional en los dominios catalíticos, que a su vez depende la estructura primaria de la xilanasa, es decir la secuencia de aminoácidos. Sin embargo, la traducción de estas diferencias en las secuencias de aminoácidos en diferencias en la funcionalidad de las xilanasas, no se ha documentado hasta ahora cuando la xilanasa actúa en un medio complejo, tal como un material vegetal.

Los sustratos de xilanasa encontrados en el trigo (harina de trigo), se han dividido tradicionalmente 20 en dos fracciones: la AX (WU-AX) inextraíble en agua y la AX (WE-AX) extraíble en agua. La relación WU-AX:WE-AX es aproximadamente 70:30 en la harina de trigo. Han existido numerosas explicaciones en cuanto a porqué existen dos fracciones diferentes de AX. La bibliografía más antigua (D’Appolonia y MacArthur (1976) y Montgomery y Smith (1955)) describe grandes diferencias en el grado de sustitución entre WU-AX y WE-AX. El mayor grado de sustitución se encontró en WE-AX. Esto se utilizó para explicar porqué alguna de 25 las AX era extraíble. El alto grado de sustitución hizo al polímero soluble, en comparación con un grado de sustitución menor, que produciría el enlace de hidrógeno entre polímeros y por consiguiente precipitación.

La diferencia entre la funcionalidad de diferentes xilanasas se ha creído que es debida a diferencias en la especificidad de la xilanasa y de este modo a su preferencia por los sustratos WU-AX o WE-AX.

En algunas aplicaciones (por ejemplo, en panadería) es deseable producir polímeros solubles de alto 30 peso molecular (HMW) a partir de la fracción WU-AX. Dichos polímeros se han correlacionado con un aumento de volumen en la elaboración de pan (Rouau, 1993; Rouau et al., 1994 y Courtin et al., 1999).

En otras aplicaciones es deseable modificar la WU-AX de HMW, disminuyendo el peso molecular, reduciendo su efecto hidrocoloide y por consiguiente el enlace con el agua en el producto (galletas saladas, separación de harina, etc.). 35

Estas aplicaciones diferentes requieren diferentes funcionalidades de las xilanasas utilizadas para realizar el trabajo. Como se mencionó anteriormente, la diferencia en funcionalidad se ha explicado mediante las diferentes especificidades de sustrato de las xilanasas.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

En comparación con los estudios iniciales, ahora se ha demostrado que otros factores son más 40 importantes para determinar la funcionalidad de la xilanasa que la especificidad del sustrato de las xilanasas determinada en sustratos puros bien caracterizados. Los datos presentados en la presente memoria demuestran que los inhibidores de xilanasa endógena fijan la funcionalidad de las xilanasas actualmente utilizadas, por ejemplo, sistemas de harina de trigo, Esto significa que una xilanasa que normalmente modifica el WU-AX, proporcionando un aumento de viscosidad líquida de la masa en un sistema de harina de trigo, 45 tiene una funcionalidad diferente si el inhibidor endógeno de la xilanasa está ausente en la harina de trigo. Por lo tanto, los descubrimientos indican que el diseño y la aplicación de las xilanasas no inhibidas, por ejemplo, utilizando mutagénesis dirigida podría ser una manera de imitar la ausencia de inhibidores de xilanasa en varios materiales vegetales, proporcionando nuevas xilanasas con funcionalidad completamente nueva. Dichas xilanasas serían muy eficaces en aplicaciones en las que se requiere una reducción de viscosidad. La 50 xilanasa no inhibida actuaría rápidamente en la AX, e influiría principalmente en su actividad específica, en lugar de mediante inhibidores endógenos. A partir de estos estudios, se considera que los efectos inhibidores son probablemente con mucho mas importantes que la actividad específica. De hecho, los resultados demuestran por primera vez que existen 10 a 50 veces diferencias en los niveles de inhibición entre las xilanasas de la familia 11. 55

Además, se ha seguido adelante para diseñar y probar una serie de xilanasas modificadas por mutagénesis dirigida para demostrar que pueden producirse xilanasas que tengan sensibilidad reducida a los inhibidores de xilanasa presentes en los materiales vegetales. En particular, se han identificado numerosos restos en xilanasas de la familia 11 que influyen en el grado de inhibición de la xilanasa.

Por lo tanto, será posible producir variantes de xilanasas con sensibilidad reducida a los inhibidores 5 de xilanasa y por consiguiente con funcionalidad alterada. Esto, por ejemplo, permitirá una reducción en la cantidad de xilanasa requerida en numerosas aplicaciones tal como piensos para animales, producción de almidón, panadería, separación de harina (molienda en húmedo) y producción de papel y pulpa.

Por consiguiente, la presente invención proporciona un polipéptido de xilanasa variante o un fragmento del mismo que tiene actividad de xilanasa, que comprende una mutación seleccionada de entre 10 D11Y, D11F, D11K, D11F/R122D y D11F/G34D con referencia a la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1, o en posición o posiciones equivalentes en otras xilanasas de la familia 11 de modo que el polipéptido variante o un fragmento del mismo tiene sensibilidad reducida a un inhibidor de xilanasa en comparación con un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC. ID. nº 1. 15

Una “enzima original”, es la enzima xilanasa de la que procede o puede proceder la enzima de xilanasa variante. Con respecto a la expresión “que puede proceder”, la variante no necesita necesariamente proceder de la enzima original. En su lugar, la variante podría prepararse, por ejemplo, por utilización de técnicas de ADN recombinante que utilizan secuencia(s) nucleotídica(s) que codifica(n) dicha secuencia de xilanasa variante, es decir aquí la(s) secuencia(s) nucleotídica(s) es o son similares(es) a la(s) secuencia(s) 20 nucleotídica(s) mutada(s) pero no se preparan por mutación de la(s) secuencia(s) nucleotídica(s) original(es). La variante puede prepararse incluso modificando químicamente una enzima original.

La enzima original puede ser la enzima natural. El término “natural” es un término de la materia comprendido por los expertos e incluye un fenotipo que es característico de la mayoría de los miembros de una especie natural y que contrasta con el fenotipo de un mutante. De este modo, en el presente contexto, la 25 enzima natural puede ser una forma de la enzima hallada en la naturaleza en la mayoría de los miembros de las especies relevantes. Generalmente, la enzima natural relevante en relación con los polipéptidos de la variante de la invención es la más íntimamente relacionada que corresponde con la enzima natural desde el punto de vista de la homología de secuencia. Por ejemplo, para las xilanasas mutantes específicas descritas en los ejemplos, la correspondiente enzima natural es la xilanasa A natural de B. subtilis, más 30 específicamente la xilanasa A natural de B. subtilis, publicada por Paice et al., 1986 y presentada como SEC. ID. nº 1. Sin embargo, cuando se ha utilizado una secuencia natural específica como base para producir u polipéptido variante de la invención, será la correspondiente secuencia natural independientemente de la existencia de otra secuencia natural que está más íntimamente relacionada desde el punto de vista de homología de la secuencia de aminoácidos. 35

Para algunas formas de realización, preferentemente el polipéptido variante procede una xilanasa de la familia 11.

Uno de los sorprendentes descubrimientos de los inventores es que en sus estudios hasta ahora una mutación en la secuencia activa de la xilanasa no tiene ningún efecto mensurable sobre la inhibición contra el inhibidor de xilanasa. Esto está en comparación directa con la mutación o mutaciones que están construidas 40 fuera de la secuencia activa, mutaciones que se exponen con más detalle a continuación.

En un aspecto preferido, la modificación de aminoácidos es de uno o más restos de aminoácidos superficiales.

En un aspecto más preferido, la modificación de aminoácidos es de uno o más restos accesibles al disolvente. En este caso, el disolvente es el agua. 45

En un aspecto más preferido la modificación de aminoácidos es de uno o más restos superficiales fuera de la secuencia activa.

En un aspecto muy preferido la modificación de aminoácidos es de uno o más restos superficiales fuera de la secuencia activa y que es o son por lo menos accesibles al 8% del disolvente. En este caso, el disolvente es el agua. 50

En un aspecto muy preferido la modificación de aminoácidos es de uno o más restos de la superficie fuera de la secuencia activa y que es o son por lo menos accesibles al 10% del disolvente. En este caso, el disolvente es el agua.

La accesibilidad al disolvente puede determinarse utilizando Swiss-PdbViewer (versión 3.5b1), que 55

puede encontrarse por internet en http:///www.expasy.ch/spdbv/mainpage.htlm. Glaxo Wellcome Experimental Research presenta el Swiss-PdbViewer.

Un experto en la materia puede determinar los aminoácidos superficiales de las enzimas xilanasa.

A título de ejemplo, la secuencia de aminoácidos de B. subtilis para la xilanasa A se presenta como SEC. ID. nº 1. Con respecto a esta secuencia, los restos de aminoácidos en superficie son: 5

Ala1-Trp6, Asn8, Thr10-Gly23, Asn25, Ser27, Asn29, Ser31-Asn32, Gly34, Thr43-Thr44, Ser46,-Thr50, Asn52, Asn54, Gly56-Asn61, Asn63, Arg73-Leu76, Thr87-Arg89, Thr91-Lys95, Thr97, Lys99, Asp101-Gly102, Thr104, Thr109-Thr111, Tyr113-Asn114, Asp119-Thr124, Thr126, Gln133-Asn141, Thr143, Thr145, Thr147-Asn148, Asn151, Lys154-Gly157, Asn159-Leu160, Ser162-Trp164, Gln175, Ser177, Ser179, Asn181, Thr183, Trp185. 10

Tal como se indica, un experto en la materia puede determinar los aminoácidos superficiales u otras enzimas xilanasa (tal como la xilanasa A, de Thermomyces lanuginosus, cuya secuencia nucleotídica de codificación se presenta como SEC. ID. nº 9).

En la presente memoria, se describe un polipéptido de xilanasa variante, o un fragmento del mismo con actividad de xilanasa, cuyo polipéptido de xilanasa variante o un fragmento comprende una o más 15 modificaciones de aminoácidos en cualquiera de los restos de aminoácidos:

Ala1-Trp6, Asn8, Thr10-Gly23, Asn25, Ser27, Asn29, Ser31-Asn32, Gly34, Thr43-Thr44, Ser46,-Thr50, Asn52, Asn54, Gly56-Asn61, Asn63, Arg73-Leu76, Thr87-Arg89, Thr91-Lys95, Thr97, Lys99, Asp101-Gly102, Thr104, Thr109-Thr111, Tyr113-Asn114, Asp119-Thr124, Thr126, Gln133-Asn141, Thr143, Thr145, Thr147-Asn148, Asn151, Lys154-Gly157, Asn159-Leu160, Ser162-Trp164, Gln175, 20 Ser177, Ser179, Asn181, Thr183, Trp185.

de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1 o su(s) posición o posiciones equivalente(s) en otros polipéptidos homólogos de xilanasa.

En la presente memoria, se describe un polipéptido de xilanasa variante, o un fragmento del mismo con actividad de xilanasa, que comprende una o más modificaciones de aminoácidos en cualquiera de los 25 restos de aminoácidos números:

11, 12, 13, 15, 17, 29, 31, 32, 34, 113, 114, 119, 120, 121, 122, 123, 124 y 175

de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1 o sus posiciones equivalentes en otros polipéptidos homólogos de xilanasa.

En la presente memoria, se describe un polipéptido de xilanasa variante, o un fragmento del mismo 30 con actividad de xilanasa, que comprende una o más modificaciones de aminoácidos en cualquiera de los restos de aminoácidos números 11, 12 y 13 de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1 o sus posiciones equivalentes en otros polipéptidos homólogos de xilanasa.

Ejemplos específicos preferidos de las modificaciones realizadas se presentan en el apartado de Ejemplos en la presente memoria. 35

Preferentemente, el polipéptido de xilanasa variante, o un fragmento del mismo con actividad de xilanasa, que comprende una o más modificaciones de aminoácidos en cualquiera de los restos de aminoácidos números 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 61, 62, 63, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 173, 174, 175, 176, 177, 178 de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1 o sus posiciones equivalentes en otros 40 polipéptidos homólogos de xilanasa.

Por conveniencia, algunas veces se hace referencia a los restos de aminoácidos números: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 61, 62, 63, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 122, 123, 124, 125, 173, 174, 175, 176, 177, 178 como BANDA 1.

La figura 1 presenta la estructura tridimensional de la xilanasa de B. subtilis que tiene la secuencia de 45 aminoácidos mostrada como SEC. ID. nº 1. La BANDA 1 está representada en la figura 1 como la capa superior de la molécula y se extiende aproximadamente 13 Ångstroms desde la parte superior de la molécula cuando la molécula está orientada como se muestra en la figura 1. La BANDA 1 finaliza con el resto Phe 125 en el lado izquierdo según se observa en la figura 1 y con el resto Asn 61 en el lado derecho según se ve la figura 1. 50

Además, o como alternativa, preferentemente el polipéptido de xilanasa variante, o un fragmento del mismo con actividad de xilanasa comprende una o más modificaciones de aminoácidos en cualquiera de los demás restos de aminoácidos.

Preferentemente, dichas otras modificaciones pueden ocurrir en uno cualquiera o más de los restos de aminoácidos números: 3, 4, 5, 6, 7, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 108, 109, 110, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 172, 179, 180, 181, 182, 183 de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis 5 mostrada como SEC. ID. nº 1 o sus posiciones equivalentes en otros polipéptidos homólogos de xilanasa.

Por conveniencia, algunas veces se hace referencia a los restos de aminoácidos números: 3, 4, 5, 6, 7, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 108, 109, 110, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 158, 159, 160, 161, 162, 163, 164, 165, 166, 167, 168, 169, 170, 171, 10 172, 179, 180, 181, 182, 183 de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como BANDA 2.

Preferentemente dichas otras modificaciones pueden ocurrir en cualquiera o más de los restos de aminoácidos números: 3, 4, 5, 6, 19, 20, 21, 22, 23, 25, 27, 43, 44, 56, 57, 58, 59, 60, 73, 74, 75, 76, 87, 89, 91, 92, 93, 94, 109, 110, 126, 159, 160, 162, 163, 164, 179, 181, 183 de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1 o sus posiciones equivalentes en otros polipéptidos homólogos de 15 xilanasa.

Se describe un polipéptido de xilanasa variante, o un fragmento del mismo con actividad de xilanasa, que comprende una o más modificaciones de aminoácidos en la BANDA 1 y opcionalmente/o BANDA 2 de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis o sus posiciones (bandas) equivalentes en otros polipéptidos homólogos de xilanasa. Por consiguiente, la modificación está en por lo menos la BANDA 1; pero podría estar 20 en nada más la BANDA 2 sola.

El polipéptido de xilanasa variante puede comprender otras modificaciones en otros restos de aminoácidos, tal como la modificación en cualquiera de los restos de aminoácidos: 1, 2, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 95, 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103, 104, 105, 106, 107, 132, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 142, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 149, 150, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 184, 185 de la 25 secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1, o sus posiciones equivalentes en otros polipéptidos homólogos de xilanasa.

El polipéptido de xilanasa variante puede comprender otras modificaciones en otros restos de aminoácidos superficiales, tal como la modificación en cualquiera de los restos de aminoácidos superficiales: 1, 2, 46, 47, 48, 49, 50, 52, 54, 95, 97, 99, 101, 102, 104, 133, 134, 135, 136, 137, 138, 139, 140, 141, 143, 30 145, 147, 148, 151, 154, 155, 156, 157, 185 de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1, o sus posiciones equivalentes en otros polipéptidos homólogos de xilanasa.

Preferentemente, el inhibidor es un inhibidor hallado en la naturaleza en tejidos vegetales. Preferentemente la sensibilidad de la enzima xilanasa variante para el inhibidor es reducida en comparación con la de la enzima xilanasa original. 35

La presente invención proporciona además una molécula de ácido nucleico (una secuencia nucleotídica) que codifica un polipéptido de la invención. Se proporciona además un vector que comprende un ácido nucleico de la invención, opcionalmente unido operativamente a una secuencia reguladora capaz de dirigir la expresión de dicho ácido nucleico a una célula hospedadora adecuada. Se proporciona también una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o un vector de la invención. 40

Se describe también un procedimiento de preparación de un polipéptido de la invención que comprende la transformación de una célula hospedadora con un ácido nucleico que codifica dicho polipéptido, cultivar la célula transformada y expresar dicho polipéptido.

Los resultados demuestran que estos polipéptidos variantes han mejorado las propiedades que les hacen adecuados para una variedad de aplicaciones, tales como en panadería, piensos para animales, 45 producción de almidón, separación de harina (molienda en húmedo) y en la producción de papel y pulpa.

Por consiguiente, la presente invención proporciona además, la utilización de un polipéptido variante de la invención en un procedimiento de modificación de materiales vegetales.

Además se proporciona la utilización de un polipéptido variante de la invención en la elaboración del 50 pan. La invención proporciona además la utilización de un polipéptido variante de la invención en el tratamiento de cereales, producción de almidón y piensos para animales y la utilización de un polipéptido variante de la invención en el tratamiento de la madera, por ejemplo, en la mejora del blanqueo de la pulpa de madera.

Se describe también un procedimiento de alteración de la sensibilidad de un polipéptido de xilanasa 55

para un inhibidor, procedimiento que comprende modificar uno o más restos de aminoácidos de dicha enzima seleccionada de entre los aminoácidos números, 11, 12, 13, 15, 17, 29, 31, 32, 34, 113, 114, 119, 120, 121, 122, 123, 124 y 175 referidos a la numeración de aminoácidos de la xilanasa de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1, o los restos equivalentes en otros polipéptidos homólogos de xilanasa. Preferentemente se reduce la sensibilidad. 5

Significativamente, los resultados de los inventores demuestran también por primera que los inhibidores de xilanasa desempeñan una función importante en la determinación de la funcionalidad de las enzimas de la xilanasa en un sistema complejo tal como un material vegetal. El término “funcionalidad” significa las propiedades bioquímicas de la xilanasa en un sistema dado. Estas propiedades incluyen la especificidad del sustrato, los parámetros cinéticos Km y Vmax (cuando proceda) y la naturaleza de los 10 productos de reacción obtenidos mediante la acción de la xilanasa en este sistema. La funcionalidad puede describirse también por consiguiente desde el punto de vista del efecto sobre las propiedades físicas y/o químicas de los materiales vegetales sobre los que actúa la xilanasa, por ejemplo, la medida en que se altera la viscosidad del material.

De la misma manera que las xilanasas variantes pueden utilizarse en varias solicitudes de 15 tratamiento, los inhibidores de xilanasa pueden utilizarse en varias aplicaciones del tratamiento, tales como en panadería, tratamiento de la pulpa de la madera y tratamiento de cereales.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Aunque en general algunas técnicas moleculares mencionadas en la presente memoria son bien conocidas en la técnica, puede hacerse referencia en particular a Sambrook et al., Molecular Cloning, A 20 Laboratory Manual (1989) y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4ª Ed., John Wiley & Sons, Inc.

A. Polipéptidos variantes de xilanasa

Se han descrito enzimas de xilanasa en aproximadamente 100 organismos diferentes, incluyendo plantas, hongos y bacterias. Las enzimas de la xilanasa se clasifican en varias de las más de 40 familias de 25 enzimas glucosil hidrolasa. Las enzimas glucosil hidrolasa, que incluyen las xilanasas, mananasas, amilasas, β-glucanasas, celulasas y otras carbohidrasas, se clasifican basándose en propiedades tales como la secuencia de aminoácidos, la estructura tridimensional y la geometría de la zona catalítica (Gilkes, et al., 1991, Microbiol. Reviews 55:303-315).

De particular interés para las aplicaciones en la preparación del pan son las enzimas clasificadas en 30 la familia 11. Todas estas son xilanasas y se conocen como las “xilanasas de la familia 11”. Algunas publicaciones se refieren a éstas con el mismo nombre que las xilanasas de la familia G, pero en la presente memoria se utilizará la terminología “xilanasas de la familia 11” para referirse tanto a las xilanasas de la familia G como a las de la familia 11.

La Tabla A detalla numerosas xilanasas de la familia 11 conocidas. La mayoría de ellas tienen una 35 masa molecular de aproximadamente 21.000 Da. Tres de las xilanasas de la familia 11 (XynA de Clostridium stercorarium, XynB de Streptomyces lividans y XynA de Thermomonospora fusca) tienen una masa molecular mayor de 31.000 a 50.000 Da. Sin embargo, estas xilanasas tiene una secuencia del núcleo catalítico de aproximadamente 21.000 Da similar a las otras xilanasas de la familia 11. Las secuencias de aminoácidos de las xilanasas de la familia 11 (o, para las enzimas mayores, el núcleo catalítico) presentan un alto grado de 40 similitud, normalmente con más de 40% de aminoácidos idénticos en una alineación apropiada de aminoácidos. Las xilanasas de la familia 11, que son de origen bacteriano, de levaduras o fúngico, comparten la misma estructura molecular general.

La figura 2 muestra los datos de la alineación de la secuencia de aminoácidos con respecto de las 51 xilanasas de la familia 11. 45

TABLA A- Xilanasas de la familia 11

Aspergillus niger Xyn A

Aspergillus kawachii Xyn C

Aspergillus tubigensis Xyn A

Bacillus circulans Xyn A

Bacillus pumilus Xyn A

Bacillus subtilis Xyn A

Cellulomonas fimi Xyn D

Chainia s pp. Xyn

Clostridium acetobutylicum Xyn B

Clostridium stercorarium Xyn A

Fibrobacter succinogenes Xyn C

Neocallimastix patriciarum Xyn A

Nocardiopsis dassonvillei Xyn II

Ruminococcus flavefaciens Xyn A

Schizophyllum commune Xyn

Streptomyces lividans Xyn B

Streptomyces lividans Xyn C

Streptomyces sp. nº 36a Xyn

Streptomyces thermoviolaceus Xyn II

Thermomonospora fusca Xyn A

Trichoderma harzianum Xyn

Trichoderma reesei Xyn I

Trichoderma reesei Xyn II

Trichoderma viride Xyn

Variantes de xilanasas de la invención

Un polipéptido de xilanasa variante de la invención se obtiene por lo general modificando un 5 polipéptido de xilanasa sustituyendo, eliminando o añadiendo uno o más restos de aminoácidos en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de xilanasa. Preferentemente, la modificación comprende una o más sustituciones de aminoácidos. La modificación de las secuencias polipeptídicas puede realizarse utilizando técnicas habituales tales como la mutagénesis dirigida. La modificación puede producirse también por técnicas químicas, tal como la modificación química de uno o más restos de aminoácidos. 10

La secuencia de partida puede ser una secuencia natural o una secuencia artificial, por ejemplo un derivado que ha sido sometido ya a la ingeniería de proteínas. La secuencia de xilanasa que ha de modificarse puede ser de cualquier procedencia, por ejemplo, de procedencia bacteriana, fúngica o vegetal. Preferentemente la secuencia de xilanasa que debe modificarse es la de la xilanasa de la familia 11, más preferentemente una xilanasa de la familia 11 seleccionada de entre la xilanasa I de Trichoderma reesei, la 15 xilanasa II de Trichoderma reesei, la xilanasa de Trichoderma harzianum, la xilanasa de Trichoderma viride, la xilanasa A de Bacillus circulans, la xilanasa A de Bacillus subtilis, la xilanasa A de Aspergillus niger, la xilanasa C de Aspergillus kawachii, la xilanasa A de Aspergillus tubigensis, la xilanasa B de Streptomyces lividans y xilanasa C de Streptomyces lividans.

En una forma de realización particularmente preferida, la secuencia de xilanasa que debe modificarse 20 es la secuencia de xilanasa de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1, o un homólogo de la misma. Preferentemente, dicho homólogo tiene por lo menos 40, 50, 60 u 80% de homología sobre por lo menos 50 ó 100 restos de aminoácidos tal como se determina utilizando el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, US; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387).

Las modificaciones específicas preferidas incluyen una o más sustituciones de aminoácido en las 25 posiciones 11, 12, 13, 15, 17, 29, 31, 32, 34, 113, 114, 119, 120, 121, 122, 123, 124 y 175 referidas a la numeración de aminoácidos de la xilanasa B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1, o de los restos equivalentes en otros polipéptidos homólogos de xilanasa.

Las sustituciones particularmente preferidas incluyen una o más de las siguientes D11şY, D11şN, D11şF, D11şK, D11şS, D11şW, G12şF, G13şF, I15şK, N17şK, N17şY, N17şD, N29şK, N29şY, N29şD, 30 S31şK, S31şY, S31şD, N32şK, G34şD, G34şF, G34şT, Y113şA, Y113şD, Y113şK, N114şA, N114şD, N114şF, N114şK, D119şK, D119şY, D119şN, G120şK, G120şD, G120şF, G120şY, G120şN, D121şN, D121şK, D121şF, D121şA, R122şD, R122şF, R122şA, T123şK, T123şY, T123şD, T124şK, T124şY, T124şD, Q175şE, Q175şS y Q175şL (con referencia a la secuencia de aminoácidos de la xilanasa de B. subtilis) o sus equivalentes en otros polipéptidos homólogos de xilanasa. Más referencias para restos específicos de la 35 xilanasa de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1 incluirán además sus equivalentes en otros polipéptidos homólogos de xilanasa.

Una combinación de mutaciones puede realizarse, por ejemplo de mutaciones en dos o más de los restos mencionados anteriormente. Ejemplos de dichas combinaciones se presentan en el apartado Ejemplos en la presente memoria.

En una forma de realización adicional, las variantes de polipéptidos de la invención pueden ser xilanasas mutantes naturales purificadas y aisladas. Alternativamente, pueden generarse xilanasas mutantes 5 sometiendo los organismos a mutagénesis y a continuación identificando individuos que comprenden mutaciones en sus genes de xilanasa. Los mutantes naturales y los mutantes generados por mutagénesis al azar pueden identificarse o cribarse utilizando varias técnicas tales como el cribado por PCR utilizando cebadores de ácido nucleico adecuados para ampliar las zonas de los genes de xilanasa y secuenciar los fragmentos resultantes. 10

Por tanto, las variantes de polipéptidos de la invención incluyen xilanasas mutantes naturales (purificadas y aisladas de los organismos en los que se producen o se obtienen de manera recombinante), las xilanasas mutantes obtenidas por mutagénesis al azar y las xilanasas mutantes obtenidas por mutagénesis dirigida.

Las variantes de polipéptidos de la invención pueden someterse también a modificaciones 15 adicionales que no afectan necesariamente a la sensibilidad a los inhibidores, incluyendo cualquier sustitución, variante, modificación, reemplazamiento, eliminación o adición de uno (o más) aminoácidos procedentes de o para la secuencia que proporciona la secuencia de aminoácidos resultante que conserva actividad de xilanasa, preferentemente que tiene por lo menos sustancialmente la misma actividad de xilanasa que la secuencia inalterada. 20

Pueden llevarse a cabo sustituciones conservadoras, por ejemplo, según la Tabla siguiente. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferentemente en la misma línea en la tercera columna pueden sustituirse entre sí:

ALIFÁTICO

Apolar G A P

I L V

Polar-inalterada

C S T M

N Q

Polar-con carga

D E

K R

AROMÁTICO

H F W Y

25

Los polipéptidos de la invención incluyen además fragmentos de las secuencias completas mencionadas anteriormente con actividad de xilanasa.

Los polipéptidos de la invención pueden comprender además secuencias heterólogas de aminoácidos, por lo general en el terminal N o en el terminal C, preferentemente en el terminal N. La secuencia heteróloga puede incluir secuencias que afectan la dirección a la proteína intra o extracelular (tales 30 como las secuencias principales).

Los polipéptidos de la invención se preparan por lo general por medios recombinantes, por ejemplo tal como se describe a continuación. Sin embargo pueden prepararse también por medios sintéticos utilizando técnicas bien conocidas por los expertos, tales como la síntesis en fase sólida. Los polipéptidos de la invención pueden producirse también como proteínas de fusión, por ejemplo para ayudar en la extracción y 35 purificación. Pueden ser convenientes también para incluir una secuencia de escisión proteolítica entre el acompañante de la proteína de fusión y la secuencia de proteínas de interés para permitir la eliminación de las secuencias de la proteína de fusión, tal como una secuencia de escisión de trombina. Preferentemente, la proteína de fusión no impedirá la función de la secuencia de la proteína de interés.

La utilización de células hospedadoras apropiadas cabe esperar que proporcione dichas 40 modificaciones después de la traducción a medida que pueden ser necesarias para proporcionar actividad biológica óptima en productos de expresión recombinante de la invención.

Los polipéptidos de la invención pueden estar en una forma sustancialmente aislada. Debe sobreentenderse que la proteína puede mezclarse con vehículos o diluyentes que no interfieran con el fin deseado de la proteína y considerarse todavía como sustancialmente aislados. Un polipéptido de la invención 45

puede estar también en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso generalmente comprenderá la proteína en preparación en la que más del 90%, por ejemplo, 95%, 98% o 99% de la proteína en la preparación es un polipéptido de la invención.

Las variantes de polipéptidos de la invención tienen sensibilidad alterada a los inhibidores de xilanasa en comparación con la secuencia de xilanasa original, que puede ser una xilanasa natural correspondiente. 5 Preferentemente, las variantes de polipéptidos tienen la sensibilidad reducida a los inhibidores de xilanasa. La expresión “sensibilidad alterada a los inhibidores de xilanasa” significa que la medida en la que la actividad de la endo-β-1,4-xilanasa de un polipéptido variante de la invención está inhibida por el inhibidor de xilanasa es diferente a la de la enzima xilanasa original, que puede ser la xilanasa natural correspondiente. Preferentemente, la medida en que el polipéptido variante es inhibido por el inhibidor es menor que la de la 10 enzima xilanasa original, que puede ser la proteína natural. Esto puede ser debido, por ejemplo, a un cambio en la estructura tridimensional del polipéptido variante tal que el inhibidor no se une ya con la misma afinidad que lo hace la enzima xilanasa original, que puede ser la enzima natural.

La sensibilidad de las variantes de polipéptidos de la invención a los inhibidores de xilanasa puede ensayarse utilizando, por ejemplo, el ensayo descrito en el Ejemplo 4 y siguientes. Un inhibidor adecuado para 15 su utilización en el ensayo es el inhibidor purificado procedente de harina de trigo en el Ejemplo 1. Otros inhibidores se describen a continuación.

Ensayo de xilanasa (actividad de endo-β-1,4-xilanasa)

Se diluyen muestras de xilanasa tampón fosfato básico disódico (0,2 M) en ácido cítrico (0,1 M), pH 5,0, para obtener aproximadamente una D.O. = 0,7 en el ensayo final. Tres diluciones de la muestra y un 20 patrón interno con una actividad definida se termostatizan durante 5 minutos a 40ºC. En el tiempo = 5 minutos, se añade a la solución enzimática 1 comprimido de Xilazima (sustrato de xilano reticulado y teñido). En el tiempo = 15 minutos (o en algunos casos más dependiendo de la actividad de xilanasa presente en la muestra) se termina la reacción, añadiendo 10 ml de TRIS al 2%. La mezcla de reacción se centrifuga y la D.O. del sobrenadante se mide a 590 nm. Teniendo en cuenta las diluciones y la cantidad de xilanasa, puede 25 calcularse la actividad (TXU, Unidades Totales de Xilansa) de la muestra en relación con el patrón.

Inhibidores de xilanasa

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “inhibidor de xilanasa” se refiere a un compuesto, por lo general una proteína, cuya función es controlar la despolimerización de carbohidratos complejos, tal como arabinoxilano, encontrado en las paredes celulares de plantas. Estos inhibidores de 30 xilanasa pueden reducir la actividad de las enzimas xilanasa naturales así como las de origen fúngico o bacteriano. Aunque la presencia de inhibidores de xilanasa se ha publicado en las semillas de cereales (véase por ejemplo McLauchlan et al., 1999a; Rouau y Suget 1998) su impacto sobre la eficacia de las enzimas xilanasa no se ha examinado extensamente.

McLauchlan et al., (1999a) dan a conocer el aislamiento y caracterización de una proteína de trigo 35 que se une e inhibe a dos xilanasas de la familia 11. Asimismo, el documento WO 98/49278 demuestra el efecto de un extracto de harina de trigo sobre la actividad de un grupo de xilanasas microbianas, todas las cuales están clasificadas como xilanasas de la familia 11. Debyser et al., (1999) dan a conocer además que las endoxilanasas de Aspergillus niger y de Bacillus subtilis, que son ambas miembros de las xilanasas de la familia 11 fueron inhibidas por el inhibidor de la xilanasa de trigo denominado TAXI. McLauchlan et al., (1999b) 40 dan a conocer que los extractos de harinas comerciales tales como de trigo, cebada, centeno y maíz son capaces de inhibir las xilanasas tanto de la familia 10 como de la 11.

El inhibidor de xilanasa puede ser cualquier inhibidor de xilanasa apropiado. A título de ejemplo, el inhibidor de xilanasa puede ser el inhibidor descrito el documento WO-A-98/49278 y/o el inhibidor de xilanasa descrito por Rouau, X. y Surget, A. (1998), McLauchlan, R. et al., (1999) y/o el inhibidor de xilanasa descrito 45 en la solicitud de patente GB nº 9828599.2 (presentada en 23 de diciembre de 1998), la solicitud de patente GB nº 9907805.7 (presentada el 6 de abril de 1999) y la solicitud de patente GB nº 9908645.6 (presentada el 15 de abril de 1999).

Ensayo con inhibidor de xilanasa

Se mezclan 100 μl de una fracción de inhibidor experimental, 250 μl de solución de xilanasa (que 50 contiene 12 TXU de xilanasa microbiana/ml) y 650 μl de tampón (ácido cítrico 0,1 M - tampón de fosfato básico disódico 0,2 M, pH 5,0). La mezcla se termostatiza durante 5 minutos a 40ºC. En el tiempo = 5 minutos se añade un comprimido de Xilazima. En el tiempo = 15 minutos se termina la reacción añadiendo 10 ml de TRIS al 2%. Se centrifuga la mezcla de reacción (3.500 g, 10 minutos, temperatura ambiente) y se mide el sobrenadante a 590 nm. La inhibición se calcula como actividad residual comparada con el blanco. Se 55 prepara el blanco de la misma manera, excepto que se sustituyen 100 μl de inhibidor por 100 μl de tampón (ácido cítrico 0,1 M - tampón de fosfato básico disódico 0,2 M, pH 5,0).

Inhibidor específico de xilanasa

Tal como se indica, un inhibidor de xilanasa que puede utilizarse según la presente invención es el inhibidor de xilanasa descrito en la solicitud de patente de GB nº 9828599.2 (presentada en 23 de diciembre de 1998), solicitud de patente GB nº 9907805.7 (presentada el 6 de abril de 1999) y la solicitud de patente de 5 GB nº 9908645.6 (presentada el 15 de abril de 1999).

El inhibidor endógeno de endo-β-1,4-xilanasa puede obtenerse a partir de la harina de trigo. El inhibidor es un dipéptido, que tiene un P.M. de aproximadamente 40 kDa (medido por SDS-PAGE o por espectrometría de masas) o un pI de aproximadamente 8 a aproximadamente 9,5. 10

El análisis de la secuencia hasta la fecha ha puesto de manifiesto que el inhibidor tiene por lo menos una o más de las secuencias presentadas como SEC. ID. nº 2, SEC. ID. nº 3, SEC. ID. nº 4, SEC. ID. nº 5, SEC. ID. nº 6, SEC. ID. nº 7 y/o SEC. ID. nº 8.

15

Estos inhibidores descritos en la técnica anterior pueden utilizarse también en análisis para determinar la sensibilidad de un polipéptido variante de la invención a inhibidores de xilanasa. Pueden utilizarse también como se describe a continuación para modular la funcionalidad de una xilanasa.

Polinucleótidos 20

Los polinucleótidos de la invención comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de variantes de polipéptidos de la invención. Un experto en la materia entenderá que numerosos polinucleótidos diferentes pueden codificar el mismo polipéptido como resultado de la degeneración del código genético. Además, debe entenderse que los expertos en la materia, utilizando técnicas de rutina, pueden 25 llevar a cabo sustituciones de nucleótidos que no afectan a la secuencia de polipéptidos codificada por los polinucleótidos de la invención para reflejar la utilización del codón de cualquier organismo hospedador específico en la que han de expresarse los polipéptidos de la invención.

Los polinucleótidos de la invención pueden comprender ADN o ARN. Pueden ser monocatenarios o 30 bicatenarios. Además, pueden ser polinucleótidos que incluyen en ellos nucleótidos sintéticos o modificados. Numerosos tipos de modificación diferentes a los oligonucleótidos son conocidos en la técnica. Éstos incluyen ejes centrales de fosfonato de metilo y fosforotioato, la adición de cadenas de acridina o polilisina en los extremos de 3’ y/o 5’ de la molécula. En la presente invención, debe entenderse que los polinucleótidos descritos en la presente memoria pueden ser modificados por cualquier procedimiento disponible en la 35 materia. Dichas modificaciones pueden realizarse con objeto de aumentar la actividad in vivo o la vida de los polinucleótidos de la invención.

Vectores nucleotídicos y células hospedadoras

40

Los polinucleótidos de la invención pueden incorporarse en un vector recombinante replicable.

El vector puede utilizarse para replicar el ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. Por tanto, en una forma de realización adicional, la invención proporciona un procedimiento de preparación de polinucleótidos de la invención introduciendo un polinucleótido de la invención en un vector replicable, 45 introduciendo el vector en una célula hospedadora compatible y cultivando la célula hospedadora en condiciones que den lugar a la replicación del vector. El vector puede recuperarse en la célula hospedadora. Células hospedadoras adecuadas incluyen bacterias tales como E. coli, levaduras y hongos.

Preferentemente, un polinucleótido de la invención en un vector está operativamente unido a una 50 secuencia reguladora que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia de codificación por la célula hospedadora, es decir el vector es un vector de expresión. La expresión “operativamente unido” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar en su manera deseada. Una secuencia reguladora “operativamente unida” a una secuencia de codificación está unida de tal manera que la expresión de la secuencia de codificación se consigue en condiciones compatibles 55 con las secuencias de referencia. La expresión “secuencia reguladora” incluye activadores y potenciadores y otras señales de regulación de la expresión.

La expresión aumentada del polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención puede conseguirse también mediante la selección de zonas reguladoras heterólogas, por ejemplo, zonas 60 activadoras, principales de secreción y terminadoras, que sirven para aumentar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés en el hospedador con la expresión seleccionada y/o

proporcionar el control inducible de la expresión del polipéptido de la invención.

Aparte del activador natural para el gen que codifica el polipéptido de la invención, pueden utilizarse otros activadores para dirigir la expresión del polipéptido de la invención. El activador puede seleccionarse por su eficacia para dirigir la expresión del polipéptido de la invención en el hospedador con la expresión deseada. 5

En otra forma de realización, puede seleccionarse un activador constitutivo para dirigir la expresión del polipéptido deseado de la invención. Ejemplos deseados de activadores constitutivos y/o inducibles potentes que se prefieren para su utilización en hospedadores con la expresión fúngica son aquellos que se pueden obtener a partir de genes de hongos para activadores de xilanasa (xlnA), fitasa, ATP-sintetasa, la 10 subunidad 9 (oliC), triosa fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa (AdhA), α-amilasa (amy), amiloglucosidasa (AG del gen glaA), acetamidasa (amdS) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gpd).

Ejemplos de activadores de levadura potentes son los que se pueden obtener a partir de los genes para alcohol deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfoglicerato cinasa y triosafosfato isomerasa. 15

Ejemplos de activadores bacterianos potentes son los activadores para α-amilasa y SP02 así como los activadores de los genes de proteasa extracelular.

Pueden utilizarse también activadores híbridos para mejorar la regulación inducible del montaje de 20 expresión.

Con frecuencia, es deseable que el polipéptido de la invención sea segregado por el hospedador de expresión en el medio de cultivo de donde el polipéptido de la invención puede recuperarse más fácilmente. Según la presente invención, el polipéptido de la secuencia natural principal de secreción de la invención 25 puede utilizarse para efectuar la secreción del polipéptido expresado de la invención. Sin embargo, un aumento en la expresión del polipéptido de la invención a veces da como resultado la producción de la proteína en niveles más allá de los cuales el hospedador de expresión es capaz de procesar y segregar, creando un cuello de botella de modo que el producto proteico se acumula en la célula. Por consiguiente, la presente invención proporciona también secuencias principales heterólogas que proporcionan la secreción 30 más eficaz del polipéptido de la invención a partir del hospedador de expresión seleccionado.

Según la presente invención, la secreción principal puede seleccionarse basándose en el hospedador de expresión deseado. Puede seleccionarse una secreción principal heteróloga que es homóloga a otras zonas reguladoras del montaje de expresión. Por ejemplo, puede utilizarse la proteína principal de la 35 amiloglucosidasa (AG) muy segregada combinada con el propio activador de la amiloglucosidasa (AG), así como combinada con otros activadores. En el contexto de la presente invención, pueden utilizarse también secuencias señal híbridas.

Ejemplos de secuencias principales de secreción heterólogas preferidas son las que se originan a 40 partir del gen para la amiloglucosidasa (AG) fúngica (glaA - ambas versiones de 18 y 24 aminoácidos, por ejemplo, de Aspergillus) el gen para el factor α (levaduras por ejemplo, Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen para α-amilasa (Bacillus).

Dichos vectores pueden transformarse en una célula hospedadora apropiada tal como se describió 45 anteriormente para proporcionar la expresión de un polipéptido de la invención. De este modo, en un aspecto más la invención proporciona un procedimiento para preparar polipéptidos según la invención que comprende cultivar una célula hospedadora transformada o transfectada con un vector de expresión como se describió anteriormente en condiciones que proporcionen la expresión por el vector de una secuencia de codificación que codifica los polipéptidos, y recuperando los polipéptidos expresados. Las células hospedadoras 50 adecuadas incluyen, por ejemplo, células fúngicas, tales como Aspergillus y células de levadura, tales como las células de levadura del género Kluyveromyces o Saccharomyces. Otras células hospedadoras adecuadas se exponen a continuación.

Los vectores pueden ser, por ejemplo, vectores de plásmido, virus o fago con un origen de 55 replicación, opcionalmente un activador para la expresión de dicho polinucleótido y opcionalmente un regulador del activador. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables. Los sistemas de selección más apropiados para los microorganismos industriales son los formados por el grupo de marcadores de selección que no necesitan una mutación en el organismo hospedador. Ejemplos de marcadores de selección fúngicos son los genes para la acetamidasa (amdS), ATP-sintetasa, subunidad 9 60 (oliC), orotidina-5’-fosfato-descarboxilasa (pvrA), con resistencia la fleomicina y benomilo (benA). Ejemplos de marcadores de selección no fúngicos son el gen con resistencia a G418 bacteriano (éste puede utilizarse

también en levadura pero no en hongos), gen con resistencia a la ampicilina (E. coli), el gen con resistencia a la neomicina (Bacillus) y el gen uidA de E. coli, que codifica la β-glucuronidasa (GUS). Los vectores pueden utilizarse in vitro, por ejemplo para la producción de ARN o utilizarse para transfectar o transformar una célula hospedadora.

5

Se describen también células hospedadoras transformadas o transfectadas con un polinucleótido de la invención. Preferentemente, dicho polinucleótido se transporta en un vector para la replicación de la expresión de dichos polinucleótidos. Las células se seleccionan para que sean compatibles con dicho vector, y por ejemplo, pueden ser procarióticas (por ejemplo, de bacterias), de hongos, levaduras o células vegetales.

10

Las bacterias procedentes del género Bacillus son muy adecuadas como hospedadores heterólogos debido a su capacidad para segregar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como hospedadores son las de los géneros Streptomyces y Pseudomonas.

Dependiendo de la naturaleza del polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención, y/o del 15 deseo de continuar el tratamiento de la proteína expresada, pueden preferirse hospedadores eucarióticos tales como levaduras u hongos. En general, se prefieren las células de levadura sobre las células de hongos porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, la célula de levadura segregan escasamente algunas proteínas, o en algunos casos no son procesadas de manera apropiada (por ejemplo, la hiperglucosilación en levaduras). En estos casos, debería seleccionarse un organismo hospedador fúngico. 20

Puede seleccionarse también un hospedador heterólogo en el que el polipéptido de la invención se produce en una forma que está sustancialmente exento de otras xilanasas. Esto puede conseguirse seleccionando un hospedador que no produzca normalmente dichas enzimas.

25

Ejemplos de hospedadores de expresión preferidos dentro del alcance de la presente invención son los hongos tales como la especie Aspergillus y la especie Trichoderma; bacterias tales como la especie Bacillus, la especie Streptomyces y la especie Pseudomonas y levaduras tales como la especie Kluyveromyces y la especie Saccharomyces.

30

Particularmente los hospedadores de expresión preferidos pueden seleccionarse de entre Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis y Saccharomyces cerevisiae.

35

Según la presente invención, la producción del polipéptido de la invención puede efectuarse mediante el cultivo de hospedadores de expresión microbianos, que han sido transformados con uno o más polinucleótidos de la presente invención, en un medio de fermentación de nutrientes convencional.

El medio de fermentación puede comprende un medio de cultivo conocido que contiene una fuente 40 de carbono (por ejemplo, glucosa, maltosa, molasas, etc.), una fuente de nitrógeno orgánico (por ejemplo, extracto de levadura, extracto de malta, peptona, etc.), y fuentes de nutrientes orgánicos (por ejemplo, fosfato, magnesio, potasio, zinc, hierro, etc.). Opcionalmente, puede añadirse un inductor.

La selección del medio apropiado puede basarse en la selección de hospedadores de expresión y/o 45 basarse en los requisitos reguladores del montaje de expresión. Dichos medios son bien conocidos por los expertos en la materia. El medio puede contener, si se desea, unos componentes adicionales que favorecen los hospedadores con expresión transformada sobre otros microorganismos potencialmente contaminantes.

Tras la fermentación, las células pueden extraerse del caldo de fermentación por centrifugación o 50 filtración. Tras la separación de las células, el polipéptido variante de la invención puede recuperarse a continuación, y, si se desea, purificarse y aislarse por medios convencionales.

Organismos

55

El término “organismo” en relación con la presente invención incluye cualquier organismo que pueda comprender la secuencia nucleotídica que codifica la proteína de la xilanasa variante según la presente invención y/o los productos obtenidos a partir de la misma, en el que una secuencia reguladora de la transcripción puede permitir la expresión de la secuencia nucleotídica de la presente invención cuando está presente en el organismo. Los organismos adecuados pueden incluir procariotas, hongos, levadura o 60 vegetales. Para la xilanasa característica de la presente invención, un organismo preferible puede ser una bacteria, preferentemente del género Bacillus, más preferentemente Bacillus subtilis.

La expresión “organismo transgénico” en relación con la presente invención incluye cualquier organismo que comprenda la secuencia nucleotídica que codifica la proteína según la presente invención y/o los productos obtenidos a partir de la misma y/o en la que la secuencia reguladora de la transcripción puede permitir la expresión de la secuencia nucleotídica según la presente invención en el organismo. 5 Preferentemente, la secuencia nucleotídica está incorporada en el genoma del organismo.

La expresión “organismo transgénico” no abarca las secuencias de codificación nucleotídicas naturales en su medio natural cuando están bajo el control de su activador natural que está también en su medio natural. 10

Por consiguiente, el organismo transgénico incluye un organismo que comprende alguna de las secuencias nucleotídicas, o las combinaciones de las mismas, que codifica(n) la secuencia de aminoácidos según la presente invención, los montajes según la presente invención (incluyendo las combinaciones de los mismos), los vectores según la presente invención, los plásmidos según la presente invención, las células 15 según la presente invención, los tejidos según la presente invención o los productos de los mismos. La célula o el organismo transformado podrían preparar cantidades aceptables del compuesto deseado que serían fácilmente recuperables de la célula o el organismo.

Transformación de las células/organismos hospedadores

Como se indicó al principio, el organismo hospedador puede ser un organismo procariótico o eucariótico. Ejemplos de hospedadores procarióticos incluyen E. coli y Bacillus subtilis. Lo dado a conocer sobre la transformación de hospedadores procarióticos está muy documentado en la técnica, por ejemplo 5 véase Sambrook et al., (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) y Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999), 4ª ed., John Wiley & Sons, Inc.

Si se utiliza un hospedador procariótico, entonces puede ser necesario que la secuencia nucleotídica 10 se modifique adecuadamente antes de la transformación, tal como mediante la eliminación de intrones.

Como se mencionó anteriormente, un organismo hospedador preferido es del género Bacillus, tal como Bacillus subtilis.

15

El organismo transgénico puede ser una levadura. A este respecto, se han utilizado también ampliamente levaduras como vehículo para la expresión génica heteróloga. La especie Saccharomyces cerevisiae tiene unos largos antecedentes de utilización industrial, incluyendo su utilización para la expresión génica heteróloga. La expresión de los genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae ha sido estudiada por Goodey et al., (1987, Yeast Biotechnology, D. R. Berry et al., ediciones, páginas. 401-429; Allen y Unwin, 20 Londres) y por King et al., (1989, Mollecular and Cell Biology of Yeasts, E. F. Walton y G. T. Yarronton, ediciones, páginas 107-133, Blackie, Glasgow).

Por varias razones, la Saccharomyces cerevisiae es muy adecuada para la expresión génica heteróloga. En primer lugar, es inocua para las personas y es incapaz de producir determinadas endotoxinas. 25 En segundo lugar, tiene extensos antecedentes de utilización segura desde hace siglos de explotación comercial con varias finalidades. Esto ha conllevando su aceptación por un amplio sector del público. En tercer lugar, la utilización comercial extensa y la investigación dedicada al organismo ha dado como resultado un caudal de conocimientos acerca de la genética y fisiología así como de las características de la fermentación a gran escala de Saccharomyces cerevisiae. 30

Un estudio de los principios de la expresión génica heteróloga en Saccharomyces cerevisiae y de la secreción de los productos génicos es proporcionada por E Hinchcliffe E. Kenny (1993, “Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes”, Yeasts, Vol. 5, Anthony H. Rose y J. Stuart Harrison, eds., 2ª edición; Academic Press Ltd.). 35

Varios tipos de vectores de levadura están disponibles, incluyendo los vectores integradores, que requieren recombinación con el genoma del hospedador para su mantenimiento, y vectores plásmido que se replican de manera autónoma.

40

Con el objetivo de preparar el Saccharomyces transgénico, se preparan montajes de expresión insertando la secuencia nucleotídica de la presente invención en un montaje diseñado para la expresión en levadura. Se han desarrollado varios tipo de montajes utilizados para la expresión heteróloga. Los montajes contienen un activador activo en levadura fusionado a la secuencia nucleotídica de la presente invención, normalmente se utiliza un activador de origen levadura, tal como el activador GAL 1. Normalmente, se utiliza 45 una secuencia señal de origen levadura, tal como la secuencia que codifica el péptido señal SUC2. Un terminador activo en la levadura finaliza el sistema de expresión.

Para la transformación de la levadura se han desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, un Saccharomyces transgénico según la presente invención puede prepararse siguiendo las 50 enseñanzas de Hinnen, et al., (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J. D. (1978, Nature, Londres, 275, 104); y Ito, H et al., (1983, J. Bacteriology 153, 163-168).

Las células de levadura transformadas se seleccionan utilizando varios marcadores selectivos. Entre los marcadores utilizados para la transformación están numerosos marcadores auxótrofos, tales como LEU2, 55 HIS4 y TRP1, y marcadores con resistencia a antibióticos dominantes tales como marcadores de antibiótico aminoglucósido, por ejemplo, G418.

Otro organismo hospedador es una planta. El principio básico en la construcción de plantas modificadas genéticamente consiste en insertar información genética en el genoma de la planta a fin de 60 obtener un mantenimiento estable del material genético insertado.

Una planta transgénica puede producirse a partir de cualquier planta, tal como las plantas que tienen semillas (angiospermas) y las coníferas. Las angiospermas incluyen las dicotiledóneas y monocotiledóneas. Ejemplos de plantas dicotiledóneas incluyen el tabaco (Nicotiana plumbaginifolia y Nicotiana tabacum), arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Brassica napus, Brassica nigra, Datura innoxia, Vicia narbonensis, Vicia faba, guisante (Pisum sativum), coliflor, clavel y lentejas (Lens culinaris). Ejemplos de plantas 5 monocotiledóneas incluyen los cereales tales como trigo, cebada, avena y maíz.

Las técnicas para producir plantas transgénicas son bien conocidas en la materia. Por lo general, las plantas completas, las células o los protoplastos pueden transformarse con un montaje de ácido nucleico adecuado que codifica una molécula de huella de cinc o ADN diana (véase anteriormente para los ejemplos 10 de montaje de ácido nucleico). Existen muchos procedimientos para introducir montajes de ADN transformante en las células, pero no todos son adecuados para suministrar ADN a las células vegetales. Los procedimientos adecuados incluyen la infección de Agrobacterium (véase entre otros, Turpen et al., 1993, J. Virol. Methods, 42: 227-239) o el suministro directo de ADN tal como, por ejemplo, por transformación mediada por PEG, por electroporación o por aceleración de partículas recubiertas de ADN. Se prefieren 15 generalmente los procedimientos de aceleración e incluyen, por ejemplo, el bombardeo con microproyectiles. Se describe a continuación un protocolo típico para producir plantas transgénicas (en particular, monocotiledóneas), tomado de la patente US nº 5.874.265.

Un ejemplo de procedimiento para suministrar segmentos de ADN transformante a las células 20 vegetales es el bombardeo con microproyectiles. En este procedimiento, las partículas no biológicas pueden recubrirse con ácidos nucleicos y suministrarse a las células mediante una fuerza propulsora. A título de ejemplo, las partículas incluyen las compuestas de tungsteno, oro, platino y similares.

Una ventaja específica del bombardeo con microproyectiles, además de ser un medio eficaz de 25 transformar de manera reproducible y estable, tanto las dicotiledóneas como las monocotiledóneas es que no se necesita ni el aislamiento de los protoplastos ni la sensibilidad a la infección por Agrobacterium. Una forma de realización ilustrativa de un procedimiento para suministrar ADN a las células vegetales por aceleración es un Sistema Biolístico de Suministro de Partículas, que puede utilizarse para propulsar las partículas recubiertas con ADN a través de un tamiz, tal como un tamiz de acero inoxidable o de Nytex, en la superficie 30 del filtro recubierta con células vegetales cultivadas en suspensión. El tamiz dispersa las partículas de ADN con tungsteno de modo que no se suministran a las células receptoras en grandes agregados. Se cree que sin un tamiz que intervenga entre el aparato del proyectil y las células que van a bombardearse, los proyectiles se acumulan y pueden ser demasiado grandes para alcanzar una alta frecuencia de transformación. Esto puede ser debido al daño infringido a las células del proyector por los proyectiles que 35 son demasiado grandes.

Para el bombardeo, las células en suspensión se concentran preferentemente en los filtros. Los filtros que contienen las células que se van a bombardear se colocan a la distancia apropiada bajo la placa de parada de los macroproyectiles. Si se desea, uno o más tamices se colocan también entre la pistola y las 40 células que van a bombardearse. Mediante la utilización de técnicas publicadas en la presente memoria se pueden obtener hasta 1000 o más grupos de células que expresan temporalmente un gen marcador (“focos”) en el filtro bombardeado. El número de células en un foco que expresa el producto génico exógeno 48 horas después del bombardeo con frecuencia está comprendido entre 1 y 10 y por término medio entre 2 y 3.

45

Después de efectuar el suministro de ADN exógeno a las células receptoras por alguno de los procedimientos expuestos anteriormente, una etapa preferida consiste en identificar las células transformadas para el cultivo adicional y la regeneración de la planta. Esta etapa puede incluir ensayar cultivos directamente para un atributo tamizable o exponiendo los cultivos bombardeados a un agente o agentes selectivos.

50

Un ejemplo de un atributo tamizable del marcador es el pigmento rojo producido bajo el control del locus R en el maíz. Este pigmento puede detectarse cultivando células en un soporte sólido que contienen medio nutriente capaz de soportar el crecimiento en esta etapa, incubando las células por ejemplo, a 18ºC y a más de 180 μE m-2 s-1 y seleccionando las células procedentes de las colonias (agregados visibles de células) que están pigmentadas. Estas células pueden cultivarse más, ya sea en suspensión o en medio sólido. 55

Una forma de realización ilustrativa de los procedimientos para identificar células transformadas implica exponer los cultivos bombardeados a un agente selectivo, tal como a un inhibidor metabólico, un antibiótico, un herbicida o similar. Las células que se han transformado y se han integrado de manera estable un gen marcador que proporciona resistencia al agente selectivo utilizado, crecerán y se dividirán en el cultivo. 60 Las células sensibles no son adecuadas para el cultivo adicional.

Para utilizar el sistema selectivo bar-bialaphos, las células bombardeadas en los filtros se ponen en suspensión en medio liquido no selectivo, se cultivan, (por ejemplo, durante una a dos semanas) y se transfieren a filtros recubriendo el medio sólido que contiene de 1 a 3 mg/l de bialaphos. Aunque, por lo general, se prefieren intervalos de 1 a 3 mg/l, se sugiere que los intervalos de 0,1 a 50 mg/l hallarán utilidad en la puesta en práctica de la invención. El tipo de filtros para utilizar en el bombardeo no se cree que sea 5 particularmente crucial, y puede comprender cualquier soporte sólido, poroso e inerte.

Las células que sobreviven a la exposición al agente selectivo pueden cultivarse en medio que soporte la regeneración de las plantas. El tejido se mantiene en un medio básico con hormonas durante aproximadamente 2 a 4 semanas, transfiriéndolo a continuación al medio sin hormonas. Después de un 10 periodo de 2 a 4 semanas el desarrollo de brotes señalará el tiempo para transferir a otro medio.

La regeneración requiere por lo general una evolución del medio cuya composición se ha modificado para proporcionar los nutrientes apropiados y las señales hormonales durante las etapas de desarrollo sucesivas desde el callo transformado hasta la planta más madura. Las plántulas en desarrollo se trasplantan 15 en el suelo y se endurecen, por ejemplo, en una cámara ambientalmente controlada a aproximadamente 85% de humedad relativa, 600 ppm de CO2 y 250 μE m-2 s-1 de luz. Las plantas son maduradas preferentemente ya sea en una cámara de cultivo o en un invernadero. La regeneración por lo general tardará aproximadamente 3 a 12 semanas. Durante la regeneración las células se cultivan en un medio sólido en recipientes con cultivo tisular. Una forma de realización ilustrativa de dicho recipiente es una placa Petri. Las plantas en regeneración 20 se cultivan preferentemente a aproximadamente entre 19ºC y 28ºC. Una vez las plantas en regeneración han alcanzado la etapa de brote y el desarrollo de la raíz, pueden transferirse a un invernadero para más cultivo y experimentación.

El ADN genómico puede aislarse de las estirpes de células de callo y de las plantas para determinar 25 la presencia del gen exógeno mediante la utilización de técnicas bien conocidas por los expertos en la materia tales como PCR y/o inmunotransferencia Southern.

Existen varias técnicas para insertar la información genética, siendo las dos principales la introducción directa de la información genética y la introducción de la información genética mediante la 30 utilización de un sistema de vector. Un estudio de las técnicas generales puede encontrarse en los artículos de Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. [1991] 42: 205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech, abril/marzo de 1994; 17-27).

Por lo tanto, en un aspecto, la presente invención se refiere a un sistema vectorial que lleva un 35 montaje que codifica un polipéptido de xilanasa variante según la presente invención y que puede introducir el montaje en el genoma de una planta.

El sistema vectorial puede comprender un vector, pero puede comprender por lo menos dos vectores. En el caso de los dos vectores, el sistema vectorial se denomina normalmente sistema vectorial binario. Los 40 sistemas vectoriales binarios están descritos con más detalle en Gynheung An et al., (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19.

Un sistema empleado extensamente para la transformación de células vegetales con un activador dado, una secuencia nucleotídica o un montaje se basa en la utilización de un plásmido Ti de Agrobacterium 45 tumefaciens o un plásmido Ri de Agrobacterium rhizogenes (Ann et al., (1986), Plant Physiol., 81, 301-305 y Butcher D. N. et al., (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D. S. Ingrams y J. P. Helgeson, 203-208).

Se han construido varios plásmidos diferentes Ti y Ri que son adecuados para la construcción de los 50 montajes de la planta o la célula vegetal descritos anteriormente.

B. Utilizaciones

En un sentido general, puede utilizarse una xilanasa variante de la invención para alterar, reducir, la 55 viscosidad procedente de la presencia de hemicelulosa o arabinoxilano en una solución o sistema que comprende el material de la pared celular de la planta. Por lo general, dichos materiales de la pared celular de la planta comprenderán uno o más inhibidores de xilanasa.

Específicamente, una xilanasa variante de la invención puede utilizarse en el tratamiento de 60 materiales vegetales para su utilización como artículos alimenticios, tal como pienso para animales, en la producción de almidón, en la elaboración del pan y en el tratamiento de la pulpa de la madera para fabricar

papel.

Preparación de artículos alimenticios

Una xilanasa variante de la invención puede utilizarse para procesar materiales vegetales tales como 5 cereales que se utilizan en artículos alimenticios incluyendo pienso para animales. Tal como se utiliza en la presente memoria, el término “cereal” significa cualquier tipo de grano utilizado para alimentos y/o cualquier hierba que produce este grano tal como, pero sin limitarse a alguna de entre trigo, trigo molido, cebada, maíz, sorgo, centeno, avena, trítical y arroz o combinaciones de los mismos. En una forma de realización preferida, el cereal es un cereal de trigo. 10

El xilano en el alimento y/o complemento alimenticio se modifica poniendo en contacto el xilano con la xilanasa variante de la presente invención.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “poniendo en contacto” incluye pero no se 15 limita a atomización, revestimiento, impregnación o aplicación en capas del alimento y/o complemento para piensos con la enzima xilanasa variante de la presente invención.

El suplemento alimenticio y/o para piensos puede prepararse mezclando la enzima xilanasa variante directamente con un suplemento alimenticio y/o de piensos. A título de ejemplo, la enzima xilanasa variante, 20 puede ponerse en contacto, atomizando un complemento alimenticio y/o complemento para piensos a base de cereal tal como trigo molido, harina de maíz o de soja.

También es posible incorporar la enzima xilanasa variante en un segundo (y diferentes) alimento y/o pienso o agua potable que se añade a continuación al suplemento alimenticio y/o para piensos. Por 25 consiguiente, no es esencial que la enzima xilanasa variante proporcionada por la presente invención se incorpore en el propio alimento a base de cereal y/o complemento para piensos, aunque dicha incorporación forma un aspecto particularmente preferido.

El complemento alimenticio y/o para piensos puede combinarse con otros componentes alimenticios 30 y/o de piensos para producir una alimento y/o pienso a base de cereal. Dichos componentes alimenticios y/o para piensos pueden incluir un u otros más complementos enzimáticos (preferentemente termoestables), complementos alimenticios y/o para piensos con vitaminas, complementos alimentos y/o para piensos minerales y complementos alimenticios y/o para piensos con aminoácidos. El complemento alimenticio y/o para piensos resultante (combinado) que comprende posiblemente varios tipos diferentes de compuestos 35 pueden mezclarse a continuación en una cantidad apropiada con los demás componentes alimenticios y/o para piensos, tales como los complementos de cereal y proteínas para formar un alimento humano y/o un pienso para animales.

El complemento alimenticio y/o para piensos puede prepararse mezclando diferentes enzimas con 40 las actividades apropiadas para producir una mezcla enzimática. A título de ejemplo, un alimento y/o complemento para piensos a base de cereales, formado a partir de por ejemplo, trigo o maíz molido puede ponerse en contacto (por ejemplo, atomizando) bien simultánea o sucesivamente con la enzima xilanasa y otras enzimas que tienen actividades apropiadas. Estas enzimas pueden incluir pero no se limitan a una cualquiera o más de entre una amilasa, una glucoamilasa, una mananasa, una galactosidasa, una fitasa, una 45 lipasa, una glucanasa, una arabinofuranosidasa, una pectinasa, una proteasa, una glucosaoxidasa, una hexosaoxidasa y una xilanasa. Las enzimas que tienen las actividades deseadas pueden mezclarse por ejemplo con la xilanasa de la presente invención ya sea antes de poner en contacto estas enzimas con un complemento alimenticio y/o para piensos a base de cereal o alternativamente dichas enzimas pueden ponerse en contacto simultánea o sucesivamente en dicho complemento a base de cereal. El complemento 50 alimenticio y/o para piensos se mezcla a su vez a continuación con un alimento y/o pienso a base de cereal para preparar el alimento y/o el pienso final. Además es posible regular el complemento alimenticio y/o para piensos como una solución de las actividades enzimáticas individuales y a continuación mezclar esta solución con el material alimenticio y/o para piensos antes de procesar el complemento alimenticio y/o para piensos en gránulos o como una papilla. 55

Productos de panadería

Se describe la utilización de un polipéptido de xilanasa variante de la presente invención en un procedimiento para preparar un artículo alimenticio. Los productos típicos de panadería (horneados) según la 60 presente invención incluyen pan (tales como barras de pan, bollos, panecillos, bases para pizza, etc.) galletas saladas, tortitas, pasteles, golosinas, galletas, galletitas de aperitivo, etc. La preparación de artículos

alimenticios tales como los productos de panadería es bien conocida en la materia. La producción de la masa, por ejemplo, se describe en el ejemplo 2. La utilización de variantes de xilanasas variantes de la invención para alterar la viscosidad de una suspensión de harinas se describe en el ejemplo 5.

Producción de almidón 5

Una xilanasa variante de la invención puede utilizarse también en la producción de almidón para materiales vegetales procedentes de cereales y tubérculos, tales como las patatas.

Tratamiento de la pulpa de madera 10

Una xilanasa variante de la invención puede utilizarse también en el tratamiento de la pulpa de madera, por ejemplo en la preparación de papel.

Como se expuso anteriormente, se ha demostrado que un determinante principal de la funcionalidad 15 de la xilanasa es la presencia de inhibidores endógenos en el material vegetal. Por consiguiente, aunque un procedimiento para alterar la funcionalidad de la xilanasa consiste en modificar una xilanasa para cambiar su sensibilidad a inhibidores endógenos, otro procedimiento consistiría en variar la cantidad y/o el tipo de inhibidor presente en el material vegetal. Se describe también la utilización de un inhibidor de la xilanasa para alterar la funcionalidad de la xilanasa y por consiguiente la utilización de un inhibidor de xilanasa en los 20 procedimientos de tratamiento de materiales vegetales descritos anteriormente.

La presente invención se describirá a continuación con mayor detalle en los siguientes ejemplos que se proporcionan únicamente a título ilustrativo y no limitativo.

25

EJEMPLOS

EJEMPLO 1 - Purificación y caracterización del inhibidor de xilanasa endógeno de trigo

Se extrajeron con agua 2 kg de harina de trigo (Danish Reform, lote 99056), utilizando una relación 30 harina:agua de 1:2, durante 10 minutos de agitación. Se separó el inhibidor soluble de xilanasa endógena de la suspensión de harina en agua por centrifugación. La extracción y la centrifugación se realizaron a 4ºC. El inhibidor se purificó del extracto de agua mediante las técnicas cromatográficas y las técnicas de concentración siguientes: HPLC-SEC, HPLC-CIEC, evaporación rotativa, HPLC-HIC, HPLC-SEC y evaporación rotativa. El inhibidor de xilanasa pudo controlarse y cuantificarse durante la purificación, utilizando 35 el siguiente procedimiento de análisis cuantitativo.

Procedimiento de análisis cuantitativo del inhibidor

1 UIX (Unidad Inhibidora de Xilanasa) se define como la cantidad de inhibidor que disminuye 1 TXU 40 hasta 0,5 TXU en las condiciones descritas a continuación.

La xilanasa utilizada en este ensayo es la xilanasa natural de Bacillus subtilis.

Se incuban previamente 250 μl de solución de xilanasa que contienen 12 TXU/ml, aproximadamente 45 100 μl de solución inhibidora de xilanasa y ácido cítrico (0,1 M), tampón bifosfato disódico (0,2 M), pH 5, para reaccionar un volumen de reacción de 1.000 μl durante 5 minutos a 40ºC. A los t = 5 minutos se añade 1 comprimido de Xilazima (Megazyme, Irlanda) a la mezcla de reacción. A los t = 15 minutos se termina la reacción., mediante la adición de 10 ml de TRIS al 2%/NaOH, pH 12. Se filtra la solución y se mide la absorbancia del sobrenadante a 590 nm. Eligiendo varias concentraciones diferentes de inhibidor en el 50 análisis anterior, es posible crear un gráfico del D.O. frente a la concentración de inhibidor. Utilizando la pendiente (a) y la intersección (b) en este gráfico y la concentración de la xilanasa, es posible calcular la cantidad de UIX en una solución de inhibidor dada (ecuación 1).

Ecuación 1 cantidad de UIX en solución = ((b/2)/-a)/TXU 55

A partir de la purificación del inhibidor endógeno de xilanasa se recuperó el rendimiento en inhibidor siguiente (tabla 1).

Tabla 1. Recuperación tras la purificación del inhibidor endógeno de xilanasa de trigo

Muestra

Cantidad UIX UIX, total Recuperación, %

Harina

2.000 g 590/g 1,180,000 100

Inhibidor purificado

90 ml 4.658/ml 419,220 35,5

La muestra de inhibidor fue pura y sin actividades xilanolíticas endógenas de trigo.

5

EJEMPLO 2 - Fraccionamiento y reconstitución de la harina de trigo exenta de inhibidor de xilanasa y funcionalidad de xilanasas en esta harina en función del inhibidor de xilanasa añadido

Fraccionamiento y reconstitución de la harina

10

La harina utilizada era: harina Reform de Danish, lote nº 99056. El fraccionamiento, la inactivación y reconstitución del inhibidor fueron de la manera siguiente:

Se preparó una masa simple mezclando 1.600 gramos de harina con adición óptima de agua, según una absorción de panadero a 500 BU y tiempo de mezcla según los resultados del harinógrafo. Esto produjo 15 2.512 gramos de masa. Se lavó manualmente el gluten de la masa, utilizando una relación agua:masa de aproximadamente 5:1. El agua utilizada se enfrió previamente a 4ºC para evitar más actividad enzimática en la masa. El agua de lavado resultante contenía las proteínas solubles (incluyendo el inhibidor de xilanasa), lípidos, polisacáridos no de almidón y almidón. El almidón y los otros componentes insolubles se separaron del agua de lavado por centrifugación (5.000 g, 10 minutos, 10ºC). Para inactivar el inhibidor de xilanasa 20 endógeno en el agua de lavado, el sobrenadante de la centrifugación se hirvió durante tres minutos utilizando un evaporador térmico.

Las tres fracciones (gluten, almidón y solubles) se congelaron en matraces y se colocaron en un secador por congelación. Después del secado se pesaron las fracciones, se molieron utilizando un mortero y 25 mano de mortero, molinillo de café y se tamizaron a través de un tamiz de 250 μm. Todas las fracciones se pesaron otra vez y la harina se reconstituyó, basándose en las relaciones obtenidas después del fraccionamiento.

Enzimas 30

En este estudio se han utilizado las xilanasas listadas en la tabla 2. Las xilanasas se purifican, lo que significa que ninguna otra actividad xilonolítica está presente en la muestra.

Tabla 2. Xilanasas utilizadas en el estudio y actividad, TXU. 35

ID

Origin TXU

B. sub

B. subtilis. 5.100

A. nig

A. niger 8.800

Análisis de xilanasa (actividad de endo-β-1,4-xilanasa)

Se diluyen muestras de xilanasa en ácido cítrico (0,1 M), tampón de bifosfato disódico (0,2 M), pH 5,0, para obtener aproximadamente una D.O. = 0,7 en el análisis final. Tres diluciones de la muestra y un 40 patrón interno con una actividad definida se termostatizan durante 5 minutos a 40ºC. En el tiempo = 5 minutos, se añade 1 comprimido de Xilazima (sustrato de xilano reticulado y teñido) a la solución enzimática. En el tiempo = 15 minutos (o en algunos casos mayor, dependiendo de la actividad de xilanasa presente en la muestra) se termina la reacción añadiendo 10 ml de TRIS al 2%. Se centrifuga la mezcla de reacción y se mide la D.O. del sobrenadante a 590 nm. Teniendo en cuenta las diluciones y la cantidad de xilanasa, puede 45 calcularse la actividad (TXU, Unidades de Xilanasa Totales) de la muestra con relación al patrón.

Pruebas de cocción

Se hicieron pruebas de cocción con (1,44 x concentración de inhibidor inicial en la harina Reform de Danish, lote nº 99056) y sin adición de inhibidor de xilanasa endógeno purificado a la harina reconstituida, respectivamente. Las pruebas de cocción se hicieron utilizando las xilanasas listadas en la tabla 2 y las composiciones listadas en la tabla 3. 5

Tabla 3. Composición de la masa realizada en las pruebas de cocción.

Masa nº

ID TXU Inh. añadido, UIX/50 g

1

Control 0 0

2

B. sub 7.500 0

3

A. nig 7.500 0

4

B. sub 7.500 850

5

A. nig 7.500 850

6

Control 0 850

Análisis de la masa

Se analizó la masa con respecto a: 10

Pegajosidad

Se midió la pegajosidad de la masa en un sistema TX-XT2 (Stable Micro Systems) utilizando una celda de pegajosidad de la masa SMS según el procedimiento descrito por Chen y Hoseney (Lebensmittel Wiss u.- Technol., 28, 467-473, 1995).

15

Análisis de viscosidad del líquido de la masa

Se midió la viscosidad del líquido de la masa extraído utilizando un viscosímetro Brookfield después de la extracción.

5

Análisis de pentosano del líquido de la masa

Se midió el pentosano disuelto en el líquido de la masa utilizando el método de Rouau y Surget (Carbohydrate polymers, 24, 123-132, 1994).

10

RESULTADOS

Fraccionamiento y reconstitución de la harina

El fraccionamiento y la reconstitución de la masa produjo 168,15 gramos de gluten seco congelado, 15 111,13 de fracción soluble seca congelada y 1.143,56 gramos de almidón seco congelado.

Análisis cuantitativo del inhibidor en la harina

Utilizando el método del análisis cuantitativo de inhibidor, pudo detectarse la concentración de 20 inhibidor en la harina 99056 y en la harina reconstituida. Los resultados de estos análisis se listan en la tabla 4.

Tabla 4. Resultados del análisis cuantitativo del inhibidor en harina natural (99056) y harina reconstituida.

25

Harina

Concentración de inhibidor, UIX/g de harina

99056

590

Harina reconstituida

42

Comparando la concentración de inhibidor en las dos fracciones de harina se muestra un 93% (100 - (42UIX/590UIX) x 100%)) de disminución de la concentración de inhibidor en la harina reconstituida.

Pruebas de cocción 30

Los resultados de la prueba de cocción se detallan en las tablas 5 y 6.

Tabla 5. Datos de las pruebas de cocción con adición de harina reconstituida, xilanasa ± inhibidor de xilanasa. Desv. Estándar., % representa la desviación estándar durante dos días de cocción. 35

ID

TXU Inh., UIX/50 g Vol. espec. medio, ml/gramo Desv. estándar, %

Control

0 42 3,04 4,06

B. sub

7.500 42 3,23 12,51

A. nig.

7.500 42 3,44 5,24

B. sub

7.500 850 3,22 4,26

A. nig.

7.500 850 3,38 0,70

Control

0 850 2,94 0,05

La desviación estándar mostrada en la tabla 5 refleja las propiedades de la manipulación de la masa ensayada. Las masas preparadas sin inhibidor de xilanasa endógeno (42 UIX), fueron muy difíciles de manipular. La desviación estándar para estas masas están en el intervalo del 3 al 12,5%. En comparación con 40 la masa con el inhibidor añadido, esta es completamente alta. Si estas desviaciones estándar se comparan con los cambios reales en el volumen del pan, puede apreciarse que las figuras son aproximadamente del mismo valor. Esto significa que no se puede llegar a ninguna conclusión acerca de la ausencia de la influencia del inhibidor sobre el volumen del pan. Si se observa la masa preparada con adición de inhibidor de xilanasa

endógeno (850 UIX) en la tabla 5, se puede ver que fue posible producir pan a partir de la harina reconstituida de manera reproducible durante un periodo de dos días. La desviación estándar estaba dentro del intervalo comprendido entre 0,05 y 4,2%, lo que es aceptable. En la tabla 6 se puede apreciar, que todas las xilanasas aumentaron el volumen del pan cocido.

5

Tabla 6. Aumento de volumen en el pan cocido de harina reconstituida en función de la adición de xilanasa e inhibidor de xilanasa.

ID

TXU Inh., UIX/50 g Vol. espec. medio, ml/gramo Aumento de volumen en función de la xilanasa, %

Control

0 42 3,04 0,0

B. sub

7.500 42 3,23 6,2

A. nig.

7.500 42 3,44 13,3

B. sub

7.500 850 3,22 9,7

A. nig.

7.500 850 3,38 15,0

Control

0 850 2,94 0,0

A partir de la tabla 5 y de la tabla 6 puede deducirse que la ausencia del inhibidor de xilanasa en la 10 harina, dificulta mucho la manipulación de la masa. Por consiguiente, lo que puede apreciarse como una respuesta positiva en el volumen por adición del inhibidor en la tabla 6, puede explicarse probablemente por la desviación estándar elevada en la masa que carece de inhibidor, debido a las propiedades de difícil manipulación. Además, puede sacarse la conclusión que todas las xilanasas probadas aumentaron el volumen del pan significativamente con el blanco de referencia. 15

Pegajosidad

La misma masa que se utilizó para las pruebas de panificación, se utilizó para las mediciones de pegajosidad. Los resultados se detallan en la tabla 7. 20

Tabla 7. Datos que representan la pegajosidad en función del tiempo, la adición de xilanasa e inhibidor de xilanasa a la harina reconstituida

ID

TXU Inh., UIX/50 g Pegajosidad media tras 10 min., g x s Pegajosidad media tras 60 min., g x s

Control

0 42 4,71 4,79

B. sub.

7.500 42 12,20 13,39

A. nig.

7.500 42 9,22 12,58

25

Tabla 7. (Continuación)

ID

TXU Inh., UIX/50 g Pegajosidad media tras 10 min., g x s Pegajosidad media tras 60 min., g x s

B. sub.

7.500 850 2,51 3,66

A. nig.

7.500 850 5,24 6,45

Control

0 850 4,10 4,15

Los resultados en la tabla 7 indican claramente la influencia del inhibidor que se observó en el experimento. La masa con una baja concentración de inhibidor de xilanasa en combinación con xilanasa, fue 30 muy difícil de manipular y de moldear. Sin embargo, cuando se añadió el inhibidor, la masa se volvió seca y muy fácil de manipular. Como puede apreciarse en la tabla 7, la adición de 990202 xilanasa en combinación

con el inhibidor disminuyó la pegajosidad. La masa se volvió más seca.

La tabla 7 demuestra además que existe solamente un pequeño efecto del tiempo sobre la pegajosidad. Parece que las xilanasas actúan muy rápidamente. Dentro de los 10 primeros minutos la mayoría del arabinoxilano se modifica cuando se añade la primera xilanasa (B. sub.). La segunda xilanasa 5 probada (A. nig.), parece actuar menos rápidamente. Puede observarse fácilmente una función del tiempo utilizando esta xilanasa. Esta es también la xilanasa que presenta el menor efecto en función del nivel de inhibidor cuando se analiza la pegajosidad.

Viscosidad de la masa 10

La viscosidad de la masa y los resultados del análisis de pentosano se obtuvieron de la misma extracción de la masa preparada a partir de la xilanasa añadida a la harina reconstituida y del inhibidor de xilanasa. Esta masa fue analizada después de dos periodos de prueba de 30 y 120 minutos.

15

Los resultados de los análisis de viscosidad se presentan en la tabla 8.

Tabla 8. Datos que representan la viscosidad del líquido de la masa en función del tiempo, adición de xilanasa y del inhibidor de xilanasa a la harina reconstituida

20

ID

TXU Inh., UIX/50 g Viscosidad media de la masa, cP, 30 min de prueba Viscosidad media de la masa, cP, 120 min de prueba

Control

0 42 5,21 5,56

B. sub.

7.500 42 5,07 4,55

A. nig.

7.500 42 5,78 4,14

B. sub.

7.500 850 9,03 11,09

A. nig.

7.500 850 8,44 8,55

Control

0 850 5,96 6,95

Como puede observarse en la tabla 8 el inhibidor tiene un efecto significativo sobre la funcionalidad de las xilanasas. Sin adición de inhibidor, el arabinoxilano se está despolimerizando a arabinoxilano de bajo peso molecular (LMW) con baja viscosidad. La adición del inhibidor impide esta muy extensa despolimerización del arabinoxilano. 25

Análisis de pentosano del líquido de la masa

Los resultados del análisis del pentosano (arabinoxilano) del líquido de la masa se presentan en la tabla 9. 30

Tabla 9. Datos que representan la disolución de pentosano en función del tiempo, adición de xilanasa y del inhibidor de xilanasa a la harina reconstituida

ID

TXU Inh., UIX/50 g Pentosano medio, %, 30 min de prueba Pentosano medio, %, 120 min de prueba

Control

0 42 0,387 0,458

B. sub.

7.500 42 0,766 0,819

A. nig.

7.500 42 0,719 0,798

B. sub.

7.500 850 0,410 0,544

A. nig.

7.500 850 0,560 0,673

Control

0 850 0,400 0,528

Como puede apreciarse de los resultados en la tabla 9, la adición de inhibidor de xilanasa endógeno disminuyó la disolución del arabinoxilano. Cuando se evalúa después de 30 minutos de tiempo de prueba, la cantidad de arabinoxilano disuelto en ausencia del inhibidor es casi el doble de la cantidad en presencia del inhibidor. Calculado sobre la base de las muestras de referencia relacionadas, la disolución es mucho mayor en ausencia del inhibidor, tal como se ilustra en el siguiente ejemplo: 5

(0,766 - 0,387) / (0,410 - 0,400) = 37,9 veces mayor disolución

Se calculó el ejemplo anterior basándose en la disolución del arabinoxilano utilizando la xilanasa de Bacillus, 30 minutos de prueba y ± inhibidor. 10

EJEMPLO 3 - Mutagénesis dirigida en xilanasas

Los mutantes específicos de la xilanasa de Bacillus subtilis pueden obtenerse por mutagénesis dirigida al sitio de la enzima natural, mediante la utilización de cualquier número de kits de mutagénesis 15 disponibles en el mercado. Un ejemplo de cómo obtener el mutante D11F utilizando el kit Quick Exchange disponible en Stratagene Cloning Systems, 11011 North Torrey Pines Road, La Jolla, CA 92037, US. se proporciona a continuación:

La secuencia de ADN que codifica la xilanasa A de Bacillus subtilis ha sido publicada por Paice et al., 20 1986.

La secuencia de la región de codificación es la siguiente, con la secuencia que codifica la parte madura de la proteína mostrada en mayúsculas:

25

La parte del gen que codifica la parte madura de la enzima natural puede ser expresada intracelularmente en E. coli, por procedimientos bien conocidos por los expertos en materia de biología 30 molecular. Por ejemplo:

1. Generando una copia de la parte en mayúsculas del gen descrito anteriormente mediante la utilización de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con una secuencia de la enzima de restricción Nde1 añadida (CATATG) antes de la GCTAGCACA y una secuencia de restricción HindIII 35 añadida (AAGCTT) después de la GTGTGGTAA.

2. Insertando la copia del gen resultante modificada mediante la utilización de las enzimas mencionadas anteriormente en el vector de expresión pET24a(+), que puede adquirirse en Novagen, Inc., 601 Science Drive, Madison, WI 53711, US. 40

3. Transformando una cepa de E. coli adecuada y la expresión por fermentación tal como describe el vendedor de pET24a(+).

La enzima mutante D11F de los inventores puede obtenerse utilizando el kit de mutagénesis “Quick 45 Exchange” según el fabricante, y utilizando el montaje xilanasa-pET24a(+) natural de Bacillus subtilis y los cebadores de mutagénesis de PCR siguientes:

Cebador transcrito:

CTACTGGCAAAATTGGACTTTTGGAGGAGGTATAGTAAACGCTG

Cebador complementario: 5

CAGCGTTTACTATACCTCCTCCAAAAGTCCAATTTTGCCAGTAG

La enzima mutante se expresa y purifica utilizando los mismos protocolos que para la enzima natural.

EJEMPLO 4 - Estudios de inhibición de mutantes de xilanasa 10

Se fermentaron y se purificaron mutantes de xilanasa expresados en E. coli (véase el ejemplo 3) (lo cual significa que ninguna otra actividad xilanolítica estaba presente en la preparación purificada) utilizando una etapa de desalado y una etapa de cromatografía de intercambio catiónico.

15

Estas preparaciones puras del mutante de xilanasa se diluyeron hasta 12 TXU/ml utilizando ácido cítrico 0,1 M-bifosfatodisódico 0,2 M, pH 5,0 y utilizado en el ensayo siguiente.

Se realizó una preparación estable de inhibidor según el protocolo descrito en el ejemplo 1. Esta preparación estable de inhibidor se utiliza como solución madre para todos los estudios de xilanasa-inhibidor 20 de xilanasa. Utilizando el método de análisis cuantitativo del inhibidor descrito en el ejemplo 1, se analizó la preparación del inhibidor la cual contiene 126 UIX/ml.

Ensayo

25

A 250 μl de preparaciones diluidas de xilanasa mutante, se añaden 0, 10, 25, 50 ó 100 μl de preparación de inhibidor, respectivamente. A estas mezclas de inhibidor-xilanasa se añadieron ácido cítrico 0,1 M-bifosfato disódico 0,2 M, pH 5,0 llevando hasta el volumen final de 1.000 μl. Estas mezclas de reacción se incubaron previamente durante 5 minutos a 40ºC. A continuación se añadió 1 comprimido de Xilazima (Megazyme, Irlanda) a todas las mezclas de inhibidor-xilanasa. Tras 10 minutos de incubación a 40ºC, se 30 terminaron las reacciones, añadiendo 10 ml de Tris al 2%/NaOH, pH 12,0. Se centrifugaron las muestras y se midió a 590 nm el color azul liberado.

Los resultados se presentan en la tabla 10.

35

Tabla 10. Inhibición relativa de mutantes de xilanasa y xilanasa original (aquí enzima natural) en función del inhibidor de xilanasa.

ID del mutante

0 1,26 3,15 16,3 12,6

Inhibición relativa, %

Natural

100 77 48 29 23

D11Y

100 120 114 126 124

D11N

100 93 72 53 32

D11F

100 114 119 116 115

D11K

100 109 112 113 116

D11S

100 98 81 60 38

D11W

100 101 88 70 50

G34D

100 94 83 70 53

G34F

100 76 53 34 29

G34T

100 99 99 93 86

Y113A

100 96 80 62 43

Y113D

100 96 81 63 45

Y113K

100 103 85 63 47

N114A

100 80 49 28 22

N114D

100 84 57 39 29

N114F

100 84 54 39 34

N114K

100 87 56 33 24

D121N

100 80 36 16 14

D121K

100 104 95 85 75

Tabla 10. (Continuación)

ID del mutante

0 1,26 3,15 16,3 12,6

Inhibición relativa, %

Natural

100 77 48 29 23

D121F

100 101 89 72 60

D121A

100 81 50 27 21

R122D

100 85 59 41 28

R122F

100 93 74 58 58

R122A

100 78 46 33 26

Q175E

100 87 59 40 31

Q175S

100 88 59 30 19

Q175L

100 78 42 25 23

G12F

100 110 106 100 92

G13F

100 104 95 87 84

I15K

100 84 47 28 23

N32K

100 82 42 19 144

G120K

100 85 52 29 22

G120D

100 84 47 24 18

G120F

100 71 35 18 15

G120Y

100 81 40 18 16

G120N

100 84 49 29 23

D119K

100 94 67 40 26

D119Y

100 87 50 28 22

D119N

100 91 74 44 22

T123K

100 80 46 30 25

T123Y

100 80 47 28 27

T123D

100 83 36 20 17

T124K

100 110 92 73 57

T124Y

100 101 76 49 33

T124D

100 87 52 32 25

N17K

100 88 48 31 26

N17Y

100 79 42 23 19

N17D

100 90 81 50 22

N29K

100 83 50 30 23

N29Y

100 85 49 30 24

N29D

100 74 44 26 20

S31K

100 77 42 23 23

S31Y

100 83 50 27 22

S31D

100 79 52 30 24

D11F/R122D

100 109 111 110 109

D11F/G34D

100 104 106 103 104

A partir de los resultados en la tabla 10, se puede apreciar que los mutantes de xilanasa de D11Y, D11F, D11K, D11F/R122D y D11F/G34D están desinhibidos por el inhibidor de xilanasa endógeno del trigo. Estos mutantes de xilanasa cabe esperar que actúen de manera más agresiva/específicamente sobre el arabinoxilano soluble, en comparación con los demás mutantes de xilanasa u otras xilanasas. Por 5 consiguiente, debería ser superior en aplicaciones cuando se requiere una disminución de viscosidad (en función del HMW de arabinoxilano).

EJEMPLO 5 - Estudios de funcionalidad de los mutantes de xilanasa

10

Los mutantes de xilanasa expresados en E. coli (véase el ejemplo 3) se fermentaron y purificaron (lo que significa que ninguna otra actividad xilanolítica estaba presente en la preparación purificada).

Estas preparaciones de mutante de xilanasa puras, se diluyeron hasta 400 TXU/ml utilizando agua y se utilizaron en el ensayo siguiente. 15

Ensayo

Se prepararon 200 ml al 30% (p/p) de harina en suspensión utilizando agua (termostatizada a 25ºC), agitando durante 5 minutos. 60,0 ml de esta harina en suspensión se vierten en una copa Ford y se midió el 20 tiempo de vertido de 50,0 ml. Esta medición es la del blanco. Los 60,0 ml de harina en suspensión se vuelven a verter y se añaden 1.000 μl de la preparación del mutante de xilanasa diluida a la harina en suspensión en agitación. Después de 2, 5, 10 y 20 minutos, se vierten 60,0 ml en la copa Ford, y se registra el tiempo de vertido de 50,0 ml. Cada medición se realizó por triplicado.

25

Los resultados se presentan en la tabla 11.

Tabla 11. Viscosidad relativa de la harina en suspensión en función del mutante de xilanasa y de la xilanasa original (en este caso, xilanasa natural)

30

Tiempo de incubación, minutos

ID del mutante

0 2 5 10 20

Cambio de viscosidad relativa, %

Natural

100 112 120 131 141

D11Y

100 97 93 83 75

D11N

100 112 125 130 136

D11F

100 93 87 78 69

D11K

100 105 95 88 78

D11S

100 102 110 113 117

D11W

100 106 115 121 122

G34D

100 110 120 128 124

G34F

100 111 126 128 146

G34T

100 100 108 111 106

Y113A

100 118 129 130 124

Y113D

100 116 127 124 114

Y113K

100 118 123 121 115

N114A

100 117 128 127 131

N114D

100 125 144 162 170

Tabla 11. (Continuación)

Tiempo de incubación, minutos

ID del mutante

0 2 5 10 20

Cambio de viscosidad relativa, %

Natural

100 112 120 131 141

N114F

100 113 119 131 150

N114K

100 119 129 141 147

D121N

100 104 103 106 104

D121K

100 122 132 141 162

D121F

100 107 117 128 147

D121A

100 101 102 103 107

R122D

100 120 119 124 115

R122F

100 127 144 150 160

R122A

100 123 138 144 153

Q175E

100 116 134 142 149

Q175S

100 110 113 121 129

Q175L

100 111 111 119 126

G12F

100 127 132 122 101

G13F

100 106 119 124 113

I15K

100 109 108 113 118

N32K

100 97 98 101 101

G120K

100 103 111 115 121

G120D

100 112 122 120 126

G120F

100 103 111 117 130

G120Y

100 106 106 108 126

G120N

100 119 123 130 141

D119K

100 118 119 127 125

D119Y

100 102 102 111 110

D119N

100 126 137 145 146

T123K

100 106 109 121 120

T123Y

100 101 106 108 116

T123D

100 113 123 125 126

T124K

100 117 131 128 127

T124Y

100 112 123 132 135

T124D

100 103 110 111 118

N17K

100 114 119 119 132

N17Y

100 102 102 108 108

N17D

100 120 131 135 143

N29K

100 98 100 100 104

N29Y

100 115 117 132 143

N29D

100 104 104 113 111

S31K

100 119 115 124 134

S31Y

100 110 118 122 137

S31D

100 99 103 109 110

D11F/R122D

100 91 89 82 77

D11F/G34D

100 96 93 84 80

EJEMPLO 6. La mutación dirigida en la zona activa de la xilanasa A de Bacillus subtilis, no influye en la interacción xilanasa:inhibidor de xilanasa

Una mutación dirigida alteró un resto de la enzima xilanasa A natural de Bacillus subtilis (véase el 5 ejemplo 3). En el resto mutado (Y166F), se pierde un potencial enlace de hidrógeno. La xilanasa mutante, se expresó en E. coli, se fermentó y purificó. Después, se investigó en el mutante su interacción con el inhibidor de xilanasa (véase el ejemplo 4).

Como puede observarse a continuación (tabla 12), el intercambio de un aminoácido en la zona activa 10 sorprendentemente no tuvo ningún efecto en las interacciones con el inhibidor de xilanasa en comparación con la enzima xilanasa natural de Bacillus subtilis.

Tabla 12. Inhibición relativa de xilanasa natural de Bacillus subtilis y el mutante Y166F de xilanasa

15

UIX/ml

ID de xilanasa

0 1,26 3,15 6,3 12,6

Inhibición relativa, %

Natural

100 75 40 24 20

Y166F

100 74 39 22 20

Por consiguiente, en resumen, el experimento descrito anteriormente presenta una mutación dirigida en la zona activa de la xilanasa de Bacillus subtilis, cuta mutación no influye en las interacciones de xilanasa con el inhibidor de xilanasa.

20

EJEMPLO 7. Mutación dirigida en otras xilanasas de la familia 11 aparte de la xilanasa A de Bacillus subtilis, que influyen en las interacciones de xilanasa-inhibidor de xilanasa.

El resto D19 de la enzima xilanasa A de Thermomyces lanuginosus se mutó en F19 por mutagénesis dirigida. D19 corresponde al resto D11 en la xilanasa de Bacillus subtilis (SEC. ID. nº 1). El gen para xilanasa 5 A de Thermomyces lanuginosus se describe como SEC. ID. nº 9.

Los cebadores para la construcción por PCR del mutante D19F pueden ser los siguientes:

Cebador transcrito: 10

GGTTATTACTATTCCTGGTGGAGTTTTGGAGGAGCGCAGGCCACG

Cebador complementario:

CGTGGCCTGCGCTCCTCCAAAACTCCACCAGGAATAGTAATAACC

15

La xilanasa mutante (D19F) obtenida, se expresó en E. coli, se fermentó y purificó. Después, se investigó la interacción del mutante y la xilanasa A natural de Thermomyces lanuginosus con el inhibidor de xilanasa (véase el ejemplo 4). Como puede apreciarse en los resultados en la tabla 13, el mutante D19F de la xilanasa A de Thermomyces lanuginosus es significativamente menos inhibido por el inhibidor de xilanasa en comparación con la xilanasa A natural de Thermomyces lanuginosus. 20

Tabla 13. Inhibición relativa de la xilanasa A natural de Thermomyces lanuginosus (TLX) y la xilanasa mutante Thermomyces lanuginosus D19F (D19F)

UIX/ml

ID de xilanasa

0 1,26 3,15 6,3 12,6

Inhibición relativa, %

TLX

100 45 24 17 14

D19F

100 73 38 24 20

25

Por consiguiente, en resumen, el experimento descrito anteriormente presenta una mutación dirigida en la xilanasa A de Thermomyces lanuginosus. Los resultados demuestran que una mutación que introduce una sustitución de un aminoácido en la superficie de la molécula de xilanasa (análoga a la de D11F en B. subtilis) cambia las interacciones xilanasa:inhibidor de xilanasa. Por lo tanto, la invención (es decir, estos restos superficiales controlan el nivel de inhibición de la xilanasa) continúa siendo cierta para las xilanasas 30 que son homólogas a la xilanasa de B. subtilis.

SUMARIO

En resumen, la presente invención proporciona un medio para alterar la sensibilidad de una enzima 35 xilanasa a un inhibidor de xilanasa.

Varias modificaciones y variaciones de los procedimientos y del sistema descritos de la presente invención serán evidentes para los expertos en la materia. Aunque la presente invención se ha descrito en relación con formas de realización preferidas específicas, debe entenderse que la invención tal como se 40 reivindica no debería limitarse excesivamente a dichas formas de realización específicas.

REFERENCIAS

Courtin, C., Roelants, A. y Delcour, J. (1999). Fractionation-reconstitution experiments provide insight into the role of endoxylanases in bread-making. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 47. 1870-1877. 45

D’Appolonia, B.L. y MacArthur, L.A. (1976). Comparison of bran and endosperm pentosans in immature and mature wheat. Cereal Chem. 53. 711 - 718.

Debyser, W. y Delcour, J. A. (1998). Inhibitors of cellolytic, xylanolytic and β-glucanolytic enzymes. WO 50

98/49278.

Hazlewood, G. P. y Gelbert, H. J. (1993). Recombinant xylanases. PCT application. WO 93/25693.

Ingelbrecht, J. A., Verwimp, T. y Delcour, J. A. (1999). Endoxylanases in durum wheat semolina processing: 5 solubilisation of arabinoxylans, action of endogenous inhibitors and effects on rheological properties. J. Agri. Food Chem.

Jacobsen, T. S., Heldt-Hansen, H. P., Kofod, L. V., Bagger, C. y Müllertz, A. (1995). Processing plant material with xylanase. PCT application WO 95/23514. 10

Kormelink, F. J. M. (1992). Characterisation and mode of action of xylanases and some accessory enzymes. Ph.D. Thesis, Agricultural University Wageningen, Holland (175 pp., English and Dutch summaries).

McLauchlan, R., Garcia-Conesa, M. T., Williamson, G., Roza, M., Ravestein, P. y MacGregor, A. W.. (1999a). 15 A novel class of protein from wheat which inhibits xylanases. Biochem.J. 338. 441-446.

McLauchlan, R, Flatman, R et al (1999) Poster Presentation from meeting at University of Newcastle (1999) April 11th-April 17th. Xylanase inhibitors, a novel class of proteins from cereals.

20

Montgomery, R y Smith, F. (1955). The Carbohydrates of the Gramineae. VIII. The constitution of a water soluble hemicellulose of the endosperm of wheat (Triticum vulgare). J. Am. Chem. Soc. 77. 3325 - 3328.

Paice, M.G., Bourbonnais, R., Desrochers, M., Jurasek, L. y Yaguchi, M. (1986): A Xylanase Gene from Bacillus subtilis: Nucleotide Sequence and Comparison with B. pumilus Gene. Arch. Microbiol. 144, 201-206.) 25

Rouau, X. (1993). Investigations into the effects of an enzyme preparation fro baking on wheat flour dough pentosans. J. Cereal Science. 18. 145-157.

Rouau, X., El-Hayek, M-L. y Moreau, D. (1994). Effect of an enzyme preparation containing pentosanases on 30 the bread-making quality of flour in relation to changes in pentosan properties. J. Cereal Science. 19. 259-272.

Slade, L., Levine, H., Craig, S., Arciszewski, H. y Saunders, S. (1993). Enzyme treated low moisture content comestible products. US 5200215 by Nabisco.

35

Soerensen, J.F. and Sibbesen, O. (1999). Bacterial xylanase. UK A 9828599.2.

LISTADO DE SECUENCIAS

Secuencia de aminoácidos de la xilanasa madura de B. subtilis (SEC. ID. nº 1)

5

Secuencias de aminoácidos procedentes del inhibidor de xilanasa de harina de trigo

Cadena de inhibidor

10

Terminal N:

GAPVARAVEAVAPFGVCYDTKTLGNNLGGYAVPNV (35aa) SEC ID nº 2

Terminal C:

KRLGFSRLPHFTGCGGL (17aa) SEC ID nº 3 15

Cadena B de inhibidor

Terminal N:

LPVPAPVTKDPATSLYTIPFH (21aa) SEC ID nº 4 20

Cadena B digerida con Lys-C:

LLASLPRGSTGVAGLANSGLALPAQVASAQK (31aa) SEC ID nº 5

GGSPAHYISARFIEVGDTRVPSVE (24aa) SEC ID nº 6

VNVGVLAACAPSK (13aa) SEC ID nº 7 25

VANRFLLCLPTGGPGVAIFGGGPVPWPQFTQSMPYTLVVVK SEC ID nº 8

Gen de xilanasa A de Thermomyces lanuginosus (SEC. ID. nº 9)

30

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES
2. 1. Polipéptido variante o fragmento del mismo con actividad de xilanasa, que comprende una mutación seleccionada de entre D11Y, D11F, D11K, D11F/R122D y D11F/G34D con referencia a la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEC. ID. nº 1, o en posición o posiciones equivalente(s) en otras 5 xilanasas de la familia 11, de tal modo que el polipéptido variante o un fragmento del mismo presenta una sensibilidad reducida a un inhibidor de xilanasa en comparación con un polipéptido con la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC. ID. nº 1.
3. 2. Polipéptido variante o fragmento del mismo según la reivindicación 1, que comprende la 10 mutación D11F.
4. 3. Polipéptido variante o fragmento del mismo según la reivindicación 1 ó 2, que comprende la mutación D11F/R122D.

   15
5. 4. Polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho inhibidor es un inhibidor que se encuentra en la naturaleza en los tejidos vegetales.
6. 5. Composición que comprende un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4. 20
7. 6. Procedimiento degradación o modificación de una pared de célula vegetal, cuyo procedimiento comprende poner en contacto dicha célula vegetal con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una composición según la reivindicación 5.

   25
8. 7. Procedimiento de tratamiento de un material vegetal, cuyo procedimiento comprende poner en contacto dicho material vegetal con un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o una composición según la reivindicación 5.
9. 8. Secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido variante según cualquiera de las 30 reivindicaciones 1 a 4.
10. 9. Montaje que comprende la secuencia nucleotídica de la reivindicación 8.
11. 10. Utilización de un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en un 35 procedimiento de modificación de materiales vegetales.
12. 11. Utilización de un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en uno o más de entre: panadería, piensos para animales, producción de almidón, separación de harina (molienda en húmedo) y producción de papel y pulpa. 40
13. 12. Utilización de un polipéptido variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en uno o más de entre: tratamiento de cereales, producción de almidón, piensos para animales, en el tratamiento de la madera, en la mejora del procedimiento de blanqueo de la pulpa de la madera.