ES2656440T3

ES2656440T3 - Variantes de xilanasa

Info

Publication number: ES2656440T3
Application number: ES10178666.3T
Authority: ES
Inventors: Ole Sibbesen; Jens Frisbaek Soerensen
Original assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS
Priority date: 2000-03-08
Filing date: 2001-03-08
Publication date: 2018-02-27
Anticipated expiration: 2021-03-08
Also published as: AU785107B2; US20030180895A1; PT1263941E; WO2001066711A1; DE60143606D1; EP2295558B1; AU4098401A; ATE491024T1; NZ520659A; US7611881B2; EP1263941B1; CA2399700C; US20090155413A1; DK1263941T3; AU785107C; DK2295558T3; JP4795604B2; EP2295558A1; US20050271769A1; US7527957B2

Abstract

Un método para alterar la sensibilidad de un polipéptido de xilanasa de la Familia 11 a un inhibidor, cuyo método comprende: (a) modificar uno o más restos de aminoácidos de dicho polipéptido; en donde dichas modificaciones están en una cualquiera de las posiciones 11, 12, 13, 15, 17, 29, 31, 32, 34, 113, 114, 119, 120, 121, 122, 123, 124 o 175 de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ. ID. NO. 1, o en la posición(es) equivalente(s) en otras xilanasas homólogas, en donde al menos una de dichas modificaciones de aminoácido está al menos en la posición 11 de la secuencia de aminoácidos de B. subtilis mostrada como SEQ. ID. NO. 1 o en posición(es) equivalente(s) en otras xilanasas homólogas; (b) medir la sensibilidad de dicho polipéptido de xilanasa a un inhibidor de xilanasa; y (c) medir el efecto de dicho polipéptido de xilanasa en la viscosidad de la suspensión de harina; en donde dicho polipéptido o fragmento del mismo tiene una sensibilidad reducida a un inhibidor de xilanasa en comparación con la enzima xilanasa parental; en donde además dicho polipéptido o fragmento del mismo disminuye la viscosidad de la suspensión de harina más que la enzima xilanasa parental.

Description

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De particular interés para las aplicaciones de horneado son las enzimas clasificadas en la Familia 11. Todas éstas son xilanasas y se conocen como “xilanasas de la Familia 11”. Algunas publicaciones se refieren a éstas sinónimamente como xilanasas de la Familia G, pero el término “xilanasas de la Familia 11” se utilizará aquí para referirse a ambas xilanasas de la Familia G y Familia 11.

En la Tabla A se lista una serie de xilanasas conocidas de la Familia 11. La mayoría de ellas tienen una masa molecular de aproximadamente 21.000 Da. Tres de las xilanasas de la Familia 11 (Clostridium stercorarium XynA, Streptomyces lividans XynB, y Thermomonospora fusca XynA) tienen una masa molecular más alta de 31.000 a

50.000 Da. Sin embargo, estas xilanasas tienen una secuencia central catalítica de aproximadamente 21.000 Da similar a la de las otras xilanasas de la Familia 11. Las secuencias de aminoácidos de las xilanasas de la Familia 11 (o, para las enzimas más grandes, el núcleo catalítico) muestran un alto grado de similitud, habitualmente con más del 40% de aminoácidos idénticos en una alineación de aminoácidos adecuada. Las xilanasas de la Familia 11, que son de origen bacteriano, de levadura, o fúngico, comparten la misma estructura molecular general.

La Figura 2 muestra los datos de alineación de la secuencia de aminoácidos con respecto a 51 xilanasas de la Familia 11.

Tabla A – xilanasas de la Familia 11

Aspergillus niger Xyn A: Aspergillus kawachii Xyn C

Aspergillus tubigensis Xyn A: Bacillus circulans Xyn A

Bacillus pumilus Xyn A: Bacillus subtilis Xyn A

Cellulomonas fimi Xyn D: Chainia spp. Xyn

Clostridium acetobutylicum Xyn B: Clostridium stercorarium Xyn A

Fibrobacter succinogenes Xyn C: Neocallimastix patriciarum Xyn A

Nocardiopsis dassonvillei Xyn II: Ruminococcus flavefaciens Xyn A

Schizophyllum commune Xyn: Streptomyces lividans Xyn B

Streptomyces lividans Xyn C: Streptomyces sp. No. 36a Xyn

Streptomyces thermoviolaceus Xyn II: Thermomonospora fusca Xyn A

Trichoderma harzianum Xyn: Trichoderma reesei Xyn I

Trichoderma reesei Xyn II: Trichoderma viride Xyn

Variantes de xilanasas de la invención

Una variante del polipéptido de xilanasa de la invención se obtiene por modificación de un polipéptido de xilanasa sustituyendo, eliminando o añadiendo uno o más restos de aminoácidos dentro de la secuencia de aminoácidos del polipéptido de xilanasa. Preferiblemente la modificación comprende una o mas sustituciones de aminoácidos. La modificación de las secuencias de polipéptidos se puede llevar a cabo utilizando técnicas estándar tales como la mutagénesis dirigida al sitio. La modificación puede ocurrir también mediante técnicas químicas – tales como la modificación química de uno o más restos de aminoácidos.

La secuencia de inicio puede ser una secuencia de tipo nativo o una secuencia que no se produce de modo natural, por ejemplo un derivado que se ha sometido ya a ingeniería de proteínas. La secuencia de xilanasa a modificar puede ser de cualquier origen, por ejemplo un origen bacteriano, fúngico o vegetal. Preferiblemente la secuencia de xilanasa a modificar es la de una xilanasa de la Familia 11, más preferiblemente una xilanasa de la Familia 11 seleccionada de Trichoderma reesei xylanase I, Trichoderma reesei xylanase II, Trichoderma harzianum xylanase, Trichoderma viride xylanase, Bacillus circulans xylanase A, Bacillus subtilis xylanase A, Aspergillus niger xylanase A, Aspergillus kawachii xylanase C, Aspergillus tubigensis xylanase A, Streptomyces lividans xylanase B, y Streptomyces lividans xylanase C.

En una realización particularmente preferida, la secuencia de xilanasa a modificar es la secuencia de xilanasa de B. subtilis mostrada como SEQ. ID. NO. 1 o un homólogo de la misma. Preferiblemente dicho homólogo tiene al menos 40, 50, 60 o 80% de homología en al menos 50 o 100 restos de aminoácidos según se determina utilizando el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Universidad de Wisconsin, U.S.A.; Devereux y colaboradores, 1984, Nucleic Acids Research 12: 387).

Modificaciones específicas de acuerdo con la presente invención incluyen una o más sustituciones de aminoácidos en las posiciones 11, 12, 13, 15, 17, 29, 31, 32, 34, 113, 114, 119, 120, 121, 122, 123, 124 y 175 basándose en la numeración de aminoácidos de la xilanasa de B. subilis mostrada como SEQ. ID. NO.1, o los restos equivalentes en otros polipéptidos de xilanasa homólogos.

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Los polipéptidos de la invención pueden estar en una forma sustancialmente aislada. Se entenderá que la proteína se puede mezclar con vehículos o diluyentes que no interferirán con el propósito pretendido de la proteína y aún se considerarán sustancialmente aislados. Un polipéptido de la invención puede estar también en una forma sustancialmente purificada, en cuyo caso comprenderá generalmente la proteína en una preparación en la que más del 90%, por ejemplo 95%, 98% o 99% de la proteína en la preparación es un polipéptido de la invención.

Las variantes de polipéptidos de la invención tienen una sensibilidad altereda a los inhibidores de xilanasa en comparación con la secuencia de xilanasa parental que puede ser la correspondiente xilanasa de tipo nativo. Preferiblemente, las variantes de polipéptidos tienen una sensibilidad reducida a inhibidores de xilanasa. El término “sensibilidad alterada a inhibidores de xilanasa” significa que el grado en el que la actividad de endo-β-1,4-xilanasa de una variante de polipéptido de la invención es inhibida por el inhibidor de xilanasa es diferente al de la enzima xilanasa parental – que puede ser la correspondiente xilanasa de tipo nativo. Preferiblemente, el grado en el que la variante del polipéptido es inhibído por el inhibidor es menor que el de la enzima xilanasa parental – que puede ser la proteína de tipo nativo. Esto puede deberse, por ejemplo, a un cambio en la estructura tridimensional de la variante del polipéptido de modo que el inhibidor ya no se une con la misma afinidad que lo hace la enzima xilanasa parental – que puede ser una enzima de tipo nativo.

La sensibilidad de las variantes de polipéptidos de la invención a inhibidores de xilanasa puede analizarse utilizando, por ejemplo, el ensayo descrito en el Ejemplo 4 y a continuación. Un inhibidor adecuado para su uso en el ensayo es el inhibidor purificado a partir de la harina de trigo en el Ejemplo 1. Otros inhibidores se describen a continuación.

Ensayo de xilanasas (actividad de Endo-β-1,4-xilanasa)

Las muestras de xilanasa se diluyen en tampón de ácido cítrico (0,1 M) – hidrógeno fosfato de di-sodio (0,2 M), pH 5,0, para obtener aproximadamente OD = 0,7 en el ensayo final. Se termostatizan tres diluiciones de la muestra y un estándar interno con una actividad definida durante 5 minutos a 40ºC. En el tiempo = 5 minutos, se añade 1 tableta de Xylazime (sustrato de xilano teñido y reticulado) a la solución de la enzima. En el tiempo = 15 minutos (o en algunos casos más, dependiendo de la actividad de xilanasa presente en la muestra) termina la reacción, añadiendo 10 ml de TRIS al 2%. La mezcla de reacción se centrifuga y se mide el OD del sobrenadante a 590 nm. Teniendo en cuenta las diluciones y la cantidad de xilanasa, la actividad (TXU, Total-Xylanase-Units) de la muestra puede calcularse con relación al estándar.

Inhibidores de xilanasa

Como se usa aquí, el término “inhibidor de xilanasa” se refiere a un compuesto, típicamente una proteína, cuyo papel es controlar la despolimerización de carbohidratos complejos, tales como arabinoxilano, que se encuentran en las paredes de las células vegetales. Estos inhibidores de xilanasa son capaces de reducir la actividad de las enzimas xilanasas de origen natural así como aquellas de origen fúngico o bacteriano. Aunque se ha informado de la presencia de inhibidores de xilanasa en semillas de cereales (véase por ejemplo McLauchlan y colaboradores 1999a; Rouau y Suget 1998) su impacto sobre la eficacia de las enzimas xilanasa no se ha examinado exhaustivamente.

McLauchlan y colaboradores (1999a) describen el aislamiento y la caracterización de una proteína de trigo que se une e inhibe dos xilanasas de la Familia 11. Asímismo, el documento de Patente WO 98/49278 demuestra el efecto de un extracto de harina de trigo en la actividad de un grupo de xilanasas microbianas, todas las cuales se clasifican como xilanasas de la Familia 11. Debyser y colaboradores (1999) describen también que las endoxilanasas de Aspergillus niger y Bacillus subtilis, que son ambas miembros de las xilanasas de la Familia 11 se inhibieron por un inhibidor de xilanasa de trigo llamado TAXI. McLauchlan y colaboradores (1999b) muestran que los extractos de harinas comerciales tales como trigo, cebada, centeno y maíz son capaces de inhibir las xilanasas de las Familias 10 y 11.

El inhibidor de xilanasa puede ser cualquier inhibidor de xilanasa adecuado. A modo de ejemplo, el inhibidor de xilanasa puede ser el inhibidor descrito en el documento de Patente WO-A-98/49278 y/o el inhibidor de xilanasa descrito por Rouau, X. y Surget, A. (1998), McLauchlan, R. y colaboradores (1999) y/o el inhibidor de xilanasa descrito en la solicitud de Patente UK número 9828599.2 (presentada el 23 de Diciembre de 1998), la solicitud de Patente UK número 9907805.7 (presentada el 6 de Abril de 1999) y la solicitud de Patente UK número 9908645.6 (presentada el 15 de Abril de 1999).

Ensayo del inhibidor de xilanasa

Se mezclan 100 µl de una fracción de un inhibidor candidato, 250 µl de solución de xilanasa (que contiene 12 TXU de xilanasa microbiana/ml) y 650 µl de tampón (tampón ácido cítrico 0,1M – hidrogeno fosfato di sódico 0,2M, pH 5,0). La mezcla se termostatiza durante 5 minutos a 40,0ºC. En el tiempo = 5 minutos se añade una tableta de Xylazyme. En el tiempo = 15 minutos se termina la reacción por adición de 10 ml de TRIS al 2%. La mezcla de reacción se centrifuga (3.500g, 10 minutos, temperatura ambiente) y el sobrenadante se mide a 590 nm. La inhibición se calcula como actividad residual en comparación con el blanco. El blanco se prepara de la misma manera, excepto que los 100 µl del inhibidor se sustituyen con 100 µl de tampón (tampón ácido cítrico 0,1M – hidrogeno fosfato di sódico 0,2M, pH 5,0).

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Inhibidor de xilanasa específico

Como se indicó, un inhibidor de xilanasa que se puede utilizar de acuerdo con la presente invención es el inhibidor de xilanasa descrito en la solicitud de Patente UK número 9828599.2 (presentada el 23 de Diciembre de 1998), la solicitud de Patente UK número 9907805.7 (presentada el 6 de Abril de 1999) y la solicitud de Patente UK número 9908645.6 (presentada el 15 de Abril de 1999).

Este inhibidor de endo-β-1,4-xilanasa endógeno se puede obtener a partir de harina de trigo. El inhibidor es un di péptido, que tiene un peso molecular de aproximadamente 40 kDa (medido mediante SDS-PAGE o espectrometría de masas) y un pl de aproximadamente 8 a aproximadamente 9,5.

El análisis de la secuencia hasta la fecha ha revelado que el inhibidor tiene al menos una o más de las secuencias presentadas como SEQ. ID. NO. 2, SEQ. ID. NO. 3, SEQ. ID. NO. 4, SEQ. ID. NO. 5, SEQ. ID. NO. 6, SEQ. ID. NO. 7 y/o SEQ. ID. NO. 8.

Estos inhibidores descritos en la técnica anterior también se pueden utilizar en ensayos para determinar la sensibilidad de una variante de polipéptido de la invención a los inhibidores de xilanasa. También se pueden utilizar como se describe a continuación para modular la funcionalidad de la xilanasa.

Polinucleótidos

Los polinucleótidos descritos aquí comprenden secuencias de ácidos nucleicos que codifican las secuencias de variantes de polipéptidos de la invención. Se entenderá por una persona experta que numerosos polinucleótidos diferentes pueden codificar el mismo polipéptido como resultado de la degeneración del código genético. Además, debe entenderse que las personas expertas pueden, utilizando técnicas rutinarias, hacer sustituciones de nucleótidos que no afectan a la secuencia polipeptídica codificada por los polinucleótidos descritos aquí para reflejar el uso de codones de cualquier organismo huésped particular en el que los polipéptidos de la invención deben expresarse.

Los polinucleótidos descritos aquí pueden comprender ADN y ARN. Pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Pueden ser también polinucleótidos que incluyen dentro de ellos nucleótidos sintéticos o modificados. Se conocen varios tipos diferentes de modificación de oligonucleótidos en la técnica. Estos incluyen esqueletos de metilfosfonato y fosforotioato, además de cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3’ y 5’ de la molécula. Para los propósitos de la presente invención, debe entenderse que los polinucleótidos descritos aquí pueden modificarse por cualquier método disponible en la técnica. Tales modificaciones pueden llevarse a cabo para mejorar la actividad in vivo o la duración de la vida de los polinucleótidos descritos aquí.

Vectores y células huésped de nucleótidos

Los polinucleótidos descritos aquí pueden incorporarse en un vector recombinante replicable. El vector puede utilizarse para replicar el ácido nucleico en una célula huésped compatible. Así también se describe aquí un método para preparar polinucleótidos descritos aquí introduciendo un polinucleótido como se describe aquí en un vector replicable, introduciendo el vector en una célula huésped compatible, y cultivando la célula huésped bajo condiciones que provocan la replicación del vector. El vector puede recuperarse de la célula huésped. Células huésped adecuadas incluyen bacterias tales como E. coli, levadura y hongos.

Preferiblemente, un polinucleótido descrito aquí en un vector está operativamente unido a una secuencia reguladora que es capaz de proporcionar la expresión de la secuencia codificante por la célula huésped, es decir, el vector es un vector de expresión. El término “operativamente unido” se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos están en una relación que les permite funcionar de la manera prevista. Una secuencia reguladora “operativamente unida” a una secuencia codificante se une de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra en condiciones compatibles con las secuencias de control. El término “secuencias reguladoras” incluye promotores y potenciadores y otras señales reguladoras de la expresión.

El aumento de la expresión del polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención se puede lograr también mediante la selección de regiones reguladoras heterólogas, por ejemplo, promotor, líder de secreción y regiones terminadoras, que sirven para aumentar la expresión y, si se desea, los niveles de secreción de la proteína de interés del huésped de expresión elegido y/o para proporcionar el control inducible de la expresión del polipéptido de la invención.

Además del promotor nativo del gen que codifica el polipéptido de la invención, se pueden utilizar otros promotores para la expresión directa del polipéptido de la invención. El promotor se puede seleccionar por su eficacia para dirigir de la expresión del polipéptido de la invención en el huésped de expresión deseado.

Se puede seleccionar un promotor constitutivo para dirigir la expresión del polipéptido deseado de la invención. Ejemplos de promotores constitutivos y/o inducibles fuertes que se prefieren para su uso en huéspedes de expresión fúngica son los que se obtienen a partir de genes fúngicos de los promotores de xilanasas (xlnA), fitasa, ATP

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sintetasa, subunidad 9 (oliC), triosa fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa (AdhA), α-amilasa (amy), amiloglucosidasa (AG – del gen glaA), acetamidasa (amdS) y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (gpd).

Ejemplos de promotores de levadura fuertes son los que se obtienen a partir de los genes de alcohol deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfoglicerato kinasa y trisefosfato isomerasa.

Ejemplos de promotores bacterianos fuertes son los promotores de α-amilasa y SP02 así como los promotores de los genes de proteasa extracelular.

También se pueden utilizar promotores híbridos para mejorar la regulación inducible del constructo de expresión.

A menudo, es deseable que el polipéptido de la invención se secrete del huésped de expresión en el medio de cultivo de donde el polipéptido de la invención se recupera más fácilmente. La secuencia líder de secreción nativa del polipéptido de la invención se puede utilizar para efectuar la secreción del polipéptido expresado de la invención. Sin embargo, un aumento en la expresión del polipéptido de la invención resulta algunas veces en la producción de la proteína en niveles más allá de los que el huésped de expresión es capaz de procesar y secretar, creando un cuello de botella tal que el producto de proteína se acumula dentro de la célula. Por consiguiente, también se describe aquí secuencias líderes heterólogas para porporcionar la secreción más eficiente del polipéptido de la invención del huésped de expresión elegido.

El líder de secreción se puede seleccionar en base al huésped de expresión deseado. Se puede elegir un líder de secreción heterólogo que sea homólogo a las otras regiones reguladoras del constructo de expresión. Por ejemplo, el líder de la proteína amiloglucosidasa (AG) altamente secretada se puede utilizar en combinación con el pormotor de la amiloglucosidasa (AG) en sí, así como en combinación con otros promotores. Las secuencias de señal híbridas se pueden utilizar también con el contexto de la presente invención.

Ejemplos de secuencias líderes de secreción heterólogas preferidas son aquellas que se originan a partir del gen de amiloglucosidasa (AG) fúngica (glaA – ambas versiones de 18 y 24 aminoácidos por ejemplo de Aspergillus), el gen del factor α (levaduras, por ejemplo, Saccharomyces y Kluyveromyces) o el gen de α-amilasa (Bacillus).

Tales vectores pueden transformarse en una célula huésped adecuada como se describió anteriormente para proporcionar la expresión de un polipéptido de la invención. Por tanto, se describe también aquí un proceso para preparar polipéptidos de acuerdo con la invención que comprende cultivar una célula huésped transformada o transfectada con un vector de expresión como se describió anteriormente bajo condiciones para proporcionar la expresión por el vector de una secuencia codificante que codifique los polipéptidos, y recuperar los polipéptidos expresados. Células huésped adecuadas incluyen, por ejemplo, células fúngicas, tales como Aspergillus y células de levadura, tales como células de levadura del género Kluyveromyces o Saccharomyces. Otras células huésped adecuadas se discuten a continuación.

Los vectores pueden ser por ejemplo, plasmidos, virus o fagos provistos de un origen de replicación, opcionalmente un promotor para la expresión de dicho polinucleótido y opcionalmente un regulador del promotor. Los vectores pueden contener uno o más genes marcadores seleccionables. Los sistemas de selección más adecuados para microorganismos indusriales son los formados por el grupo de marcadores de selección que no requieren una mutación en el organismo huésped. Ejemplos de marcadores de selección fúngicos son los genes para acetamidasa (amdS), ATP sintetasa, subunidad 9 (oliC), orotidina-5’-fosfatodescarboxilasa (pvrA), fleomicina y resistencia al benomil (benA). Ejemplos de marcadores de selección no fúngicos son el gen de resistencia bacteriano G418 (este puede utilizarse también en levaduras, pero no en hongos), el gen de resistencia a amplicilina (E. coli), el gen de resistencia a neomicina (Bacillus) y el gen uidA de E. coli, que codifica la β-glucuronidasa (GUS). Los vectores se pueden utilizar in vitro, por ejemplo para la producción de RNA o utilizado para transfectar o transformar una célula huésped.

También se describe aquí células huésped transformadas o transfectadas con un polinucleótido descrito aquí. Preferiblemente dicho polinucleótido se lleva en un vector para la replicación y expresión de dicho polinucleótido. Las células se escogerán para ser compatibles con dicho vector y pueden ser por ejemplo procarióticas (por ejemplo bacterianas), fúngicas, levadura o células vegetales.

Las bacterias del género Bacillus son muy adecuadas como huéspedes heterólogos debido a su capacidad para secretar porteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias adecuadas como huéspedes son las del género Streptomyces y Pseudomonas.

Dependiendo de la naturaleza del polinucleótido que codifica el polipéptido de la invención, y/o la conveniencia de un procesamiento adicional de la proteína expresada, pueden preferirse los huéspedes eucarióticos tales como levaduras u hongos. En general, las células de levadura se prefieren sobre las células fúngicas porque son más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas son pobremente secretadas de la célula de levadura, o en algunos casos no se procesan adecuadamente (por ejemplo, hiperglicosilación en levaduras). En estos casos, se seleccionaría un organismo huésped fúngico.

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Si se utiliza un huésped procariótico entonces puede ser necesario modificar adecuadamente la secuencia de nucleótidos antes de la transformación – tal como por la eliminación de intrones.

Como se mencionó anteriormente, un organismo de huésped preferido es del género Bacillus, tal como Bacillus subtilis.

El organismo transgénico puede ser una levadura. A este respecto, las levaduras se han utilizado también ampliamente como un vehículo para la expresión de genes heterólogos. Las especies Saccharomyces cenevisiae tienen una larga historia de uso industrial, incluyendo su uso para la expresión de genes heterólogos. La expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae ha sido reportada por Goodey y colaboradores (1987, Yeast Biotechnology, D R Berry y colaboradores, eds, pp 401-429, Allen and Unwin, London) y por King y colaboradores (1989, Molecular and Cell Biology of Yeast, E F Walton and G T Tarronton, eds, pp 107-133, Blackie, Glasgow).

Por varias razones Saccharomyces cerevisiae es muy adecuado para la expresión de genes heterólogos. En primer lugar, no es patogénico para humanos y es incapaz de producir ciertas endotoxinas. En segundo lugar, tiene una larga historia de uso seguro después de siglos de explotación comercial para varios propósitos. Esto ha llevado a una amplia aceptación pública. En tercer lugar, la extensa utilización comercial y la investigación dedicada al organismo ha dado como resultado una riqueza de conocimientos sobre la genética y la fisiología así como las características de fermentación a gran escala de Saccharomyces cerevisiae.

Una revisión de los principios de la expresión de genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae y la secreción de los productos génicos es dada por E Hinchcliffe E Kenny (1993, “Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes”, Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose and J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.).

Están disponibles varios tipos de vectores de levadura, incluyendo vectores integradores, que requieren la recombinación con el genoma del huésped para su mantenimiento, y vectores plasmídicos de replicación autónoma.

Para preparar el Saccharomyces transgénico, los constructos de expresión se preparan insertando la secuencia de nucleótidos descrita aquí en un constructo diseñado para la expresión en levaduras. Se han desarrollado varios tipos de constructos utilizados para la expresión heteróloga. Los constructos contienen un promotor activo en la levadura unido a la secuencia de nucleótidos descrita aquí, por lo general se utiliza un promotor de origen levadura, tal como el promotor GAL 1. Por lo general se utiliza una secuencia de señal de origen levadura, tal como la secuencia que codifica el péptido de señal SUC2. Un terminador activo en la levadura finaliza el sistema de expresión.

Para la transformación de levaduras se han desarrollado varios procedimientos de transformación. Por ejemplo, un Saccharomyces transgénico como se describe aquí se puede preparar siguiendo las enseñanzas de Hinnen y colaboradores (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104); y Ito, H y colaboradores (1983, J Bacteriology 153, 163-168).

Las células de levadura transformadas se seleccionan utilizando varios marcadores selectivos. Entre los marcadores utilizados para la transformación están un número de marcadores auxotróficos tales como LEU2, HIS4 y TRP1; y marcadores de resistencia a antibióticos dominantes tales como marcadores de antibiótico aminoglicósido, por ejemplo G418.

Otro organismo huésped es una planta. El principio básico en la construcción de plantas modificadas genéticamente es insertar información genética en el genoma de la planta para así obtener un mantenimiento estable del material genético.

Una planta transgénica como se describe aquí se puede producir a partir de cualquier planta tal como las plantas con semillas (angiospermas), y coníferas. Las angiospermas incluyen dicotiledóneas y monocotiledóneas. Ejemplos de plantas dicotiledóneas incluyen tabaco (Nicotiana plumbaginifolia y Nicotiana tabacum), arabidopsis (Arabidopsis thaliana), Brassica napus, Brassica nigra, Datura innoxia, Vicia narbonensis, Vicia Faba, guisante (Pisum sativum), coliflor, clavel y lenteja (Lens culinaris). Ejemplos de plantas monocotiledóneas incluyen cereales tales como trigo, cebada, avena y maíz.

Las técnicas para producir plantas transgéncias son bien conocidas en la técnica. Típicamente, cualquiera de las plantas completas, células o protoplastos se pueden transformar con un constructo de ácido nucleico adecuado que codifica una molécula de dedo de zinc o el ADN objetivo (véase anteriormente para ejemplos de constructos de ácidos nucleicos). Hay muchos métodos para introducir la transformación de los constructos de ADN en las células, pero no todos son adecuados para administrar ADN a las células vegetales. Métodos adecuados incluyen la infección por Agrobacterium (véase, entre otros, Turpen y colaboradores, 1993, J. Virol. Methods, 42: 227-239) o el suministro directo del ADN tal como, por ejemplo, por transformación mediada por PEG, por electroporación o por aceleración de las partículas de ADN recubiertas. Los métodos de aceleración son generalmente preferidos e incluyen, por ejemplo, bombardeo de microproyectiles. Un procedimiento típico para producir plantas transgénicas (en particular monocotiledónea), tomado del documento de Patente U. S. No. 5.874.265, se describe a continuación.

Un ejemplo de un método para suministrar segmentos de ADN transformante a células vegetales es el bombardeo de microproyectiles. En este método, las partículas no biológicas pueden recubrirse con ácidos nucleicos y se

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Existen varias técnicas para insertar la información genética, siendo los dos principales principios la introducción directa de la información genética y la introducción de la información genética mediante el uso de un sistema de vectores. Una revisión de las técnicas generales se puede encontrar en los artículos por Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech Marzo/Abril 1994 17-27).

Por tanto, también se describe aquí un sistema de vectores que lleva un constructo que codifica una variante del polipéptido de xilanasa de acuerdo con la presente invención y que es capaz de introducir el constructo en el genoma de la planta.

El sistema de vectores puede comprender un vector, pero puede comprender al menos dos vectores. En el caso de dos vectores, el sistema de vectores se refiere normalmente como un sistema de vectores binario. Los sistemas de vectores binarios se describen con más detalle en Gynheung An y colaboradores (1980), Binary Vectors, Plant Molecular Biology Manual A3, 1-19.

Un sistema empleado ampliamente para la transformación de células vegetales con un promotor dado o una secuencia de nucleótidos o un constructo se basa en la utilización de un plásmido Ti de Agrobacterium tumefacines

o un plásmido Ri de Arobacterium rhizogenes (An y colaboradores. (1986), Plant Physiol. 81, 301-305 y Butcher D.N. y colaboradores (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams y J.P. Helgeson, 203208).

Se han construido varios plásmidos Ti y Ri diferentes que son adecuados para la construcción de los constructos de plantas o células vegetales descritos anteriormente.

B. Usos

En un sentido general, una variante de xilanasa de la invención se puede utilizar para alterar, por ejemplo reducir, la viscosidad derivada de la presencia de hemicelulosa o arabinoxilano en una solución o sistema que comprende material de pared celular vegetal. Típicamente dichos materiales de pared celular vegetal comprenderán uno o más inhibidores de xilanasa.

Específicamente, una variante de xilanasa de la invención se puede utilizar en el procesamiento de materiales vegetales para su uso como productos alimenticios, tales como alimentación animal, en la producción de almidón, en el horneado y en el procesamiento de la pasta de madera para fabricar papel.

Preparación de productos alimenticios

Una variante de xilanasa de la invención se puede utilizar para procesar materiales vegetales tales como cereales que se utilizan en los productos alimenticios incluyendo alimentación animal. Como se usa aquí, el término “cereal” significa cualquier tipo de grano utilizado para la alimentación y/o cualquier tipo de hierba que produzca este grano tal como pero no limitado a uno cualquiera de trigo, trigo molido, cebada, maíz, sorgo, centeno, avena, triticale y arroz o combinaciones de los mismos. En una realización preferida, el cereal es un cereal de trigo.

El xilano en la alimentación y/o suplemento alimenticio se modifica al poner en contacto el xilano con la variante de xilanasa de la presente invención.

Como se usa aquí, el término “poner en contacto” incluye pero no se limita a pulverizar, recubrir, impregnar o estratificar el alimento y/o suplemento alimenticio con la variante de la enzima xilanasa de la presente invención.

Los alimentos y/o suplementos alimenticios descritos aquí se pueden preparar mezclando la variante de la enzima xilanasa directamente con el alimento y/o suplemento alimenticio. A modo de ejemplo, la variante de la enzima xilanasa puede ponerse en contacto (por ejemplo, por pulverización) en un alimento y/o suplemento alimenticio a base de cereales tales como trigo molido, maíz o harina de soja.

Es posible incorporar también la enzima de la variante de xilanasa en un segundo (y diferente) alimento y/o suplemento alimenticio o agua potable que se añade después al alimento y/o suplemento alimenticio descrito aquí. Por consiguiente, no es esencial que la enzima de la variante de xilanasa proporcionada por la presente invención se incorpore en el alimento y/o suplemento alimenticio basado en cereales por sí mismo, aunque tal incorporación forma un aspecto particularmente preferido.

El alimento y/o suplemento alimenticio se puede combinar con otros componentes del alimento y/o suplemento alimenticio para producir un alimento y/o suplemento alimenticio basado en cereales. Tales otros componentes de alimentos y/o suplementos alimenticios pueden incluir uno u otros más (preferiblemente termoestables) suplementos de enzimas, alimentos y/o suplementos alimenticios con vitaminas, alimentos y/o suplementos alimenticios con minerales y alimentos y/o suplementos alimenticios con aminoácidos. El alimento y/o suplemento alimenticio resultante (combinado) que comprende posiblemente varios tipos diferentes de compuestos puede después mezclarse en una cantidad apropiada con los otros componentes del alimento y/o suplemento alimenticio tales como suplementos de cereales y proteínas para formar un alimento humano y/o alimento animal.

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El alimento y/o suplemento alimenticio descrito aquí se puede preparar mezclando diferentes enzimas que tienen las actividades apropiadas para producir una mezcla de enzimas. A modo de ejemplo, un alimento y/o suplemento alimenticio basado en cereales formado a partir, por ejemplo, de trigo molido o maíz se pueden poner en contacto (por ejemplo, por pulverización) o simultáneamente o secuencialmente con la enzima xilanasa y otras enzimas que tienen actividades apropiadas. Estas enzimas pueden incluir pero no se limitan a una cualquiera o más de una amilasa, una glucoamilasa, una mananasa, una galactosidasa, una fitasa, una lipasa, una glucanasa, una arabinofuranosidasa, una pectinasa, una proteasa, una gluocosa oxidasa, una hexosa oxidasa y una xilanasa. Las enzimas que tienen las actividades deseadas pueden, por ejemplo, mezclarse con la xilanasa de la presente invención o antes de poner en contacto estas enzimas con el alimento y/o suplemento alimenticio basado en cereales o alternativamente tales enzimas se pueden poner en contacto simultáneamente o secuencialemente con dicho suplemento a base de cereales. El alimento y/o suplemento alimenticio se mezcla a su vez con un alimento y/o suplemento alimenticio basado en cereales para preparar el alimento y/o suplemento alimenticio final. También es posible formular el alimento y/o suplemento alimenticio como una solución de las actividades de la enzima individual y mezclar después esta solución con un alimeto y/o material alimenticio anterior para procesar el alimento y/o suplemento alimenticio en granos o como un puré.

Productos de panadería

La presente invención proporciona el uso de una variante del polipéptido de xilanasa de la invención en un proceso para preparar productos alimenticios. Productos de panadería típicos (horneados) de acuerdo con la presente invención incluyen pan – tales como panes, rollos, bollos, bases de pizza, etc.-galletas saladas, tortillas, pasteles, galletas, bizcohos, galletitas de agua, etc. La preparación de los productos alimenticios tales como los productos de panadería es bien conocida en la técnica. La producción de masa, por ejemplo, se describe en el Ejemplo 2. El uso de las variantes de xilanasas de la invención para alterar la viscosidad de una suspensión de harina se describe en el Ejemplo 5.

Producción de almidón

Una variante de xilanasa de la invención se puede utilizar también en la producción de almidón a partir de materiales vegetales derivados de cereales y tubérculos tales como patatas.

Procesamiento de la pasta de madera

Una variante de xilanasa de la invención puede utilizarse también en el procesamiento de la pasta de madera, por ejemplo en la preparación del papel.

Como se describió anteriormente, hemos mostrado que un importante determinante de la funcionalidad de la xilanasa es la presencia de inhibidores endógenos en el material vegetal. Por consiguiente, aunque un método para alterar la funcionalidad de la xilanasa es modificar una xilanasa para cambiar su sensibilidad a inhibidores endógenos, otro método sería variar la cantidad y/o tipo del inhibidor presente en el material vegetal. Por tanto, también se describe aquí el uso de un inhibidor de xilanasa para alterar la funcionalidad de una xilanasa y por consiguiente el uso de un inhibidor de xilanasa en los métodos de procesamiento de materiales vegetales descritos anteriormente.

La presente invención se describirá ahora adicionalmente con referencia a los siguientes ejemplos que están destinados a ser sólo ilustrativos y no limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1 – Purificación y caracterización del inhibidor de xilanasa endógeno de trigo.

2 Kg de harina de trigo (Danish Reform, lote 99056) se extrajeron con agua, utilizando una proporción harina:agua de 1:2, durante 10 minutos de agitación. El inhibidor de xilanasa endógeno soluble se separó de la suspensión de harina-agua por centrifugación. La extracción y la centrifugación se llevó a cabo a 4ºC. El inhibidor se purificó a partir del extracto acuoso mediante las siguientes técnicas cromatográficas y técnicas de concentración: HPLC-SEC, HPLC-CIEC, evaporación rotatoria, HPLC-HIC, HPLC-SEC y evaporación rotatoria. El inhibidor de xilanasa podría monitorizarse y cuantificarse durante la purificación, utilizando el siguiente método de cuantificación.

Método de cuantificación del inhibidor

1 XIU (Unidad de inhibidor de xilanasa) se define como la cantidad de inhibidor que disminuye 1 TXU a 0,5 TXU bajo las condiciones descritas a continuación.

La xilanasa utilizada en este ensayo es la xilanasa de tipo nativo de Bacillus subtilis.

250 µl de solución de xilanasa que contiene 12 TXU/ml, aproximadamente 100 µl de solución de inhibidor de xilanasa y tampón de ácido cítrico (0,1 M) -hidrogeno fosfato di sódico (0,2 M), pH 5, para hacer reaccionar un volumen de reacción de 1.000 µl se preincuba durante 5 minutos a 40ºC. A un t = 5 minutos, 1 tableta de Xilazyme (Megazime, Ireland) se añade a la mezcla de reacción. A un t = 15 minutos se termina la reacción mediante la

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adición de 10 ml de TRIS/NaOH al 2%, pH 12. Se filtra la solución y se mide la absorbancia del sobrenadante a 590 nm. Al elegir varias concentraciones diferentes del inhibidor en el ensayo anterior, es posible crear un gráfico de OD frente a la concentración del inhibidor. Utilizando la pendiente (a) y la intersección (b) de este gráfico y la concentración de la xilanasa es posible calcular la cantidad de XIU en una solución de inhibidor dada (ecuación 1).

Ecuación 1 cantidad de XIU en solución = ((b/2)/-a)/TXU

A partir de la purificación del inhibidor de xilanasa endógeno, se recuperó el siguiente rendimiento del inhibidor (Tabla 1).

Tabla 1. Recuperación del inhibidor de xilanasa endógeno de trigo después de la purificación.

Muestra: Cantidad XIU XIU, total Recuperación, %

Harina: 2.000 g 590/g 1.180.000 100

Inhibidor purificado: 9 ml 4.658/ml 419.220 35,5

La muestra de inhibidor estaba pura y libre de las actividades xilanolíticas endógenas de trigo.

Ejemplo 2 – Fraccionamiento y reconstrucción de harina de trigo libre del inhibidor de xilanasa y de funcionalidades de xilanasas en esta harina como una función del inhibidor de xilanasa añadido.

Fraccionamiento y reconstitución de la harina

La harina utilizada fue: harina Danish Reform, lote No. 99056. El fraccionamiento, inactivación del inhibidor y reconstitución fueron como sigue:

Una masa simple se preparó al mezclar 1.600 g de harina, con una adición óptima de agua, de acuerdo con la absorción de un panadero a 500 BU y el tiempo de mezcla de acuerdo con los resultados del farinógrafo. Esto dio como resultado 2.512 gramos de masa. El gluten se lavó manualmente de la masa, utilizando una proporción agua/masa de aproximadamente 5:1. El agua utilizada se pre-enfrió a 4ºC para prevenir la actividad enzimátia adicional en la masa. El agua de lavado resultante contenía las proteínas solubles (incluyendo los inhibidores de xilanasa), lípidos, polisacáridos sin almidón y almidón. El almidón y otros componentes no solubles se separaron de las aguas de lavado por centrifugación (5.000 g, 10 minutos, 10ºC). Para inactivar el inhibidor de xilanasa endógeno en el agua de lavado, el sobrenadante de la centrifugación se ebullió durante tres minutos utilizando un evaporador de calor.

Todas las tres fracciones (gluten, almidón y solubles) se congelaron en frascos y se colocaron en un liofilizador. Después del secado, las fracciones se pesaron, se molieron utilizando un mortero y una maza, un molinillo de café y se tamizaron a través de un tamiz de 250 µm. Todas las fracciones se pesaron otra vez y se reconstituyó la harina, basándose en las proporciones obtenidas después del fraccionamiento.

Enzimas

Las xilanasas enumeradas en la Tabla 2 se han utilizado en el estudio. Las xilanasas se purifican, lo que significa que no hay otra actividad xilonolítica presente en la muestra.

Tabla 2. Xilanasas utilizadas en el estudio y actividad, TXU.

ID: Origen TXU

B. sub: B. subtilis 5.100

A. nig: A. niger 8.800

Ensayo de xilanasa (actividad de endo-β-1,4-xilanasa)

Las muestras de xilanasa se diluyen en tampón de ácido cítrico (0,1M) – hidrogeno fosfato di sódico (0,2M), pH 5.0, para obtener aproximadamente un OD = 7 en el ensayo final. Tres diluciones de la muestra y un estándar interno con una actividad definida se termostatizan durante 5 minutos a 40ºC. A un t = 5 minutos, se añade 1 tableta de Xylazyme (sustrato de xilano teñido y reticulado) a la solución de la enzima. A un t = 15 minutos (o en algunos casos mayor, dependiendo de la actividad de xilanasa presente en la muestra) se termina la reacción, por adición de 10 ml de TRIS al 2%. La mezcla de reacción se centrifuga y se mide el OD del sobrenadante a 590 nm. Teniendo en cuenta las diluciones y la cantidad de xilanasa, la actividad (TXU, Unidades de Xilanasa Totales) de la muestra puede calcularse con relación al estándar.

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ID: TXU Inh., XIU/50 g Promedio adherencia después de 10 min, g x s Promedio adherencia después de 60 min, g x s

A. sub: 7.500 850 5,24 6,45

Control: 0 850 4,10 4,15

Los resultados en la Tabla 7 indican claramente la influencia del inhibidor que se observó en el experimento. La masa con un bajo nivel de inhibidor de xilanasa en combinación con xilanasa, fue muy difícil de manipular y moldear. Sin embargo, cuando se añadió el inhibidor, la masa se volvió seca y muy fácil de manejar. Como puede verse en la Tabla 7, la adición de xilanasa 990202 en combinación con el inhibidor disminuyó la adherencia. La masa se volvió

5 más seca.

La Tabla 7 muestra también que solo hay un pequeño efecto de tiempo en la adherencia. Parece que las xilanasas actúan muy rápidamente. Dentro de los 10 primeros minutos la mayoría del arabinoxilano se modifica cuando se añade la primera xilanasa (B. sub). La segunda xilanasa probada (A. nig), parece que actúa menos rápidamente. Una función del tiempo se puede observar fácilmente utilizando esta xilanasa. Ésta es también la xilanasa que

10 muestra el menor efecto como una función del nivel de inhibidor cuando se analiza sobre la adherencia.

Viscosidad de la mezcla

Los resultados del análisis de la viscosidad de la masa y del pentosano se obtuvieron de la misma extracción a partir de la masa preparada a partir de la harina reconstituida añadida xilanasa e inhibidor de xilanasa. Esta masa se analizó después de dos tiempos de prueba, 30 y 120 minutos.

15 Los resultados del análisis de viscosidad se presentan en la Tabla 8.

Tabla 8. Datos que representan la viscosidad del líquido de la masa como una función del tiempo, adición de xilanasa e inhibidor de xilanasa a la harina reconstituida.

ID: TXU Inh., XIU/50 g Promedio de la viscosidad de la masa, cP, 30 minutos de pueba Promedio de la viscosidad de la masa, cP, 60 minutos de pueba

Control: 0 42 5,21 5,56

B. sub: 7.500 42 5,07 4,55

A. nig: 7.500 42 5,78 4,14

B. sub: 7.500 850 9,03 11,09

A. sub: 7.500 850 8,44 8,55

Control: 0 850 5,96 6,95

Como puede verse en la Tabla 8 el inhibidor tiene un efecto significante en la funcionaliad de las xilanasas. Sin la adición del inhibidor, el arabinoxilano se despolimeriza a arabinoxilano de Bajo Peso Molecular (LMW) con baja 20 viscosidad. La adición del inhibidor evita esta despolimerización muy extensa del arabinoxilano.

Análisis de pentosano del líquido de la masa

Los resultados del análisis de pentosano (arabinoxilano) del líquido de la masa se presentan en la Tabla 9.

Tabla 9. Datos que representan la solubilización del pentosano como una función del tiempo, adición de xilanasa e inhibidor de xilanasa a la harina reconstituida.

ID: TXU Inh., XIU/50 g Promedio de Pentosano, %, 30 minutos de pueba Promedio de Pentosano, %, 30 minutos de pueba

Control: 0 42 0,387 0,458

B. sub: 7.500 42 0,766 0,819

A. nig: 7.500 42 0,719 0,798

B. sub: 7.500 850 0,410 0,544

A. sub: 7.500 850 0,560 0,673

Control: 0 850 0,400 0,528

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Ejemplo 4 – Estudios de inhibición de los mutantes de xilanasa

Los mutantes de xilanasa expresados en E. coli (véase Ejemplo 3) se fermentaron y purificaron (lo que significa que no estaba presente ninguna otra actividad xilanolítica en la preparación purificada) utizando una etapa de desalinización y una etapa de cromatografía de intercambio catiónico.

5 Estas preparaciones de mutante de xilanasa pura se diluyeron a 12 TXU/ml utilizando ácido cítrico 0,1 M – hidrogeno fosfato di sódico 0,2 M, pH 5,0 y se utilizaron en el siguiente ensayo.

Se preparó una preparación de inhibidor estable de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 1. Esta preparación de inhibidor estable se utiliza como reserva para todos los estudios del inhibidor de xilanasa-xilanasa. Utilizando el método de cuantificación del inhibidor descrito en el Ejemplo 1, la preparación de inhibidor se analizó 10 que contenía 126 XIU/ml.

Ensayo

A 250 µl de las preparaciones de mutante de xilanasa diluidas, se añaden 0, 10, 25, 50 o 100 µl de preparación de inhibidor, respectivamente. A estas mezclas xilanasa-inhibidor se añadieron ácido cítrico 0,1 M – hidrogeno fosfato di sódico 0,2 M, pH 5,0 obteniéndose el volumen final de 1.000 µl. Estas mezclas de reacción se preincubaron durante 15 5 minutos a 40ºC. En lo sucesivo, se añadió 1 tableta de xylazyme (Megazyme, Ireland) a todas las mezclas xilanasa-inhibidor. Después de 10 minutos de incubación a 40ºC, se terminaron las reacciónes, por adición de 10 ml de Tris/NaOH al 2%, pH 12,0. Las mezclas se centrifugaron y el color azul liberado del sustrato se midió a 590 nm.

Los resultados se presentan en la Tabla 10.

Tabla 10. Inhibición relativa de mutantes de xilanasa y xilanasa parental (aquí enzima de tipo nativo) como una 20 función de xilanasa.

Mutante ID: 0 1,26 3,15 6,3 12,6

Inhibición relativa, %

Tipo nativo: 100 77 48 29 23

D11Y: 100 120 114 126 124

D11N: 100 93 72 53 32

D11F: 100 114 119 116 115

D11K: 100 109 112 113 116

D11S: 100 98 81 60 38

D11W: 100 101 88 70 50

G34D: 100 94 83 70 53

G34F: 100 76 53 34 29

G34T: 100 99 99 93 86

Y113A: 100 96 80 62 43

Y113D: 100 96 81 63 45

Y113K: 100 103 85 63 47

N114A: 100 80 49 28 22

N114D: 100 84 57 39 29

N114F: 100 84 54 39 34

N114K: 100 87 56 33 24

D121N: 100 80 36 16 14

D121K: 100 104 95 85 75

D121F: 100 101 89 72 60

D121A: 100 81 50 27 21

Mutante ID: 0 1,26 3,15 6,3 12,6

Inhibición relativa, %

R122D: 100 85 59 41 28

R122F: 100 93 74 58 58

R122A: 100 78 46 33 26

Q175E: 100 87 59 40 31

Q175S: 100 88 59 30 19

Q175L: 100 78 42 25 23

G12F: 100 110 106 100 92

G13F: 100 104 95 87 84

I15K: 100 84 47 28 23

N32K: 100 82 42 19 14

G120K: 100 85 52 29 22

G120D: 100 84 47 24 18

G120F: 100 71 35 18 15

G120Y: 100 81 40 18 16

G120N: 100 84 49 29 23

D119K: 100 94 67 40 26

D119Y: 100 87 50 28 22

D119N: 100 91 74 44 22

T123K: 100 80 46 30 25

T123Y: 100 80 47 28 27

T123D: 100 83 36 20 17

T124K: 100 110 92 73 57

T124Y: 100 101 76 49 33

T124D: 100 87 52 32 25

N17K: 100 88 48 31 26

N17Y: 100 79 42 23 19

N17D: 100 90 81 50 22

N29K: 100 83 50 30 23

N29Y: 100 85 49 30 24

N29D: 100 74 44 26 20

S31K: 100 77 42 23 23

S31Y: 100 83 50 27 22

S31D: 100 79 52 30 24

D11F/R122D: 100 109 111 110 109

D11F/G34D: 100 104 106 103 104

A partir de los resultados en la tabla 10, se puede observar que los mutantes de xilanasa D11Y, D11F, D11K, D11F/R122D y D11F/G34D no están inhibidos por el inhibidor de xilanasa endóngeno de trigo. Se esperaría que estos mutantes de xilanasa actuaran más agresivamente/específicamente sobre el arabinoxilano soluble, en comparación con los otros mutantes de xilanasa u otras xilanasas. Por lo tanto, serían superiores en aplicaciones donde se desea una disminución en la viscosidad (como una función de arabinoxilano HMW).

Ejemplo 5 – Estudios de funcionalidad de mutantes de xilanasa

Los mutantes de xilanasa expresados en E. coli (véase Ejemplo 3) se fermentaron y purificaron (lo que significa que no establan presentes otras actividades xilanolíticas en la preparación purificada).

Estas preparaciones de mutantes de xilanasas puras se diluyeron a 400 TXU/ml utilizando agua y se utilizaron en el 5 siguiente ensayo.

Ensayo

200 ml de suspensión de harina al 30% (peso/peso) se prepararon utilizando agua (termostatizada a 25ºC), por agitación durante 5 minutos. Se vierten 60,0 ml de esta suspensión de harina en una copa Ford, y se mide el tiempo para el drenaje de 50,0 ml. Esta medición es la medición en blanco. Los 60,0 ml de suspensión de harina y 1000 l 10 de preparación de mutante de xilanasa diluido se añaden a la suspensión de harina bajo agitación. Después de 2, 5, 10 y 20 minutos, se vierten 60,0 ml en la copa Ford, y se registra el tiempo para drenaje de 50,0 ml. Esta medición se hizo por triplicado.

Los resultados se presentan en la Tabla 11.

Tabla 11. Viscosidad relativa de la suspensión de harina como una función del mutante de xilanasa y xilanasa 15 parental (aquí xilanasa de tipo nativo)

Tiempo de incubación, minutos

Mutante ID: 0 2 5 10 20

Cambio de viscosidad relativa, %

Tipo nativo: 100 112 120 131 141

D11Y: 100 97 93 83 75

D11N: 100 112 125 130 136

D11F: 100 93 87 78 69

D11K: 100 105 95 88 78

D11S: 100 102 110 113 117

D11W: 100 106 115 121 122

G34D: 100 110 120 128 124

G34F: 100 111 126 128 146

G34T: 100 100 108 111 106

Y113A: 100 118 129 130 124

Y113D: 100 116 127 124 114

Y113K: 100 118 123 121 115

N114A: 100 117 128 127 131

N114D: 100 125 144 162 170

N114F: 100 113 119 131 150

N114K: 100 119 129 141 147

D121N: 100 104 103 106 104

D121K: 100 122 132 141 162

D121F: 100 107 117 128 147

D121A: 100 101 102 103 107

R122D: 100 120 119 124 115

R122F: 100 127 144 150 160

Tiempo de incubación, minutos

Mutante ID: 0 2 5 10 20

Cambio de viscosidad relativa, %

R122A: 100 123 138 144 153

Q175E: 100 116 134 142 149

Q175S: 100 110 113 121 129

Q175L: 100 111 111 119 126

G12F: 100 127 132 122 101

G13F: 100 106 119 124 113

I15K: 100 109 108 113 118

N32K: 100 97 98 101 101

G120K: 100 103 111 115 121

G120D: 100 112 122 120 126

G120F: 100 103 111 117 130

G120Y: 100 106 106 108 126

G120N: 100 119 123 130 141

D119K: 100 118 119 127 125

D119Y: 100 102 102 111 110

D119N: 100 126 137 145 146

T123K: 100 106 109 121 120

T123Y: 100 101 106 108 116

T123D: 100 113 123 125 126

T124K: 100 117 131 128 127

T124Y: 100 112 123 132 135

T124D: 100 103 110 111 118

N17K: 100 114 119 119 132

N17Y: 100 102 102 108 108

N17D: 100 120 131 135 143

N29K: 100 98 100 100 104

N29Y: 100 115 117 132 143

N29D: 100 104 104 113 111

S31K: 100 119 115 124 134

S31Y: 100 110 118 122 137

S31D: 100 99 103 109 110

D11F/R122D: 100 91 89 82 77

D11F/G34D: 100 96 93 84 80

Ejemplo 6. La mutación dirigida al sitio en el sitio activo de la xilanasa A de Bacillus subtilis, no influye en la interacción xilanasa:inhibidor de xilanasa.

Un resto en el sitio activo de la enzima de xilanasa A de tipo nativo de Bacillus subtilis se alteró mediante una mutación dirigida al sitio (véase Ejemplo 3). En el resto mutado (Y166F) se pierde un enlace de hidrógeno potencial.

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Claims

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