DE69828405T2 - Inhibitoren von zellulolytischen, xylanolytischen und beta-glukanolytischen enzymen - Google Patents

Inhibitoren von zellulolytischen, xylanolytischen und beta-glukanolytischen enzymen Download PDF

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft einen Inhibitor xylanolytischer Enzyme (gelegentlich auch als Pentosanasen bezeichnet), insbesondere einen Inhibitor von Pentosan-abbauenden Enzymen, wie etwa Endoxylanase (wie etwa EC: 3.2.1.8), β-Xylosidase (wie etwa EC: 3.2.1.37) und α-L-Arabinofuranosidase (wie etwa EC: 3.2.1.55), sowie Inhibitoren anderer Xylan-, Arabinoxylan- und β-Glucan-abbauender Enzyme, die in Mikroorganismen, Pflanzen, Pflanzenmaterialien oder Fraktionen derselben (wie etwa in Getreiden, Getreidekörnern oder Getreidemehlen oder Fraktionen hiervon) vorkommen.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Gewinnung eines solchen Inhibitors, sowie die Verwendung dieses Inhibitors auf verschiedenen Gebieten der Nahrungsmittel-, Futtermittel- und/oder Getränke-Technologien, beispielsweise der Mälzerei und dem Brauereiwesen, bei der Herstellung von Tierfuttern, etwa um deren Konversion zu steigern, bei der Herstellung von gebackenen und/oder extrudierten Getreideprodukten, wie etwa normalem Teig, Vorteig, Chorleywood-Brot, Frühstücksgetreiden, verschiedenen Typen von Gebäck, Teigwaren und Nudeln, der Herstellung von von Stärke abgeleiteten Sirupen, Sorbitol, Xylose und/oder Xylit, der Industrie der Weizen-Gluten-Stärke-Trennung, der Maisverarbeitung, der Verbesserung der Krankheitsresistenz von Pflanzen, bei pharmazeutischen oder nutrazeutischen Anwendungen, wie etwa der Aufrechterhaltung der Struktur von diätetischem Fasermaterial, sowie auf dem Gebiet der Papier- und Faserstoff/Zellstoff-Technologien.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Neben Gerstenmalz werden auch nicht gemälzte Getreide, wie etwa Weizen, üblicherweise bei der Bierherstellung verwendet (Pierce, J. S., Proceedings of the European Brewery Convention Congress Madrid, 1987, 445). Nicht gemälzter Weizen (40–50%) wird z. B. für die Herstellung belgischer (Weizen-)Weißbiere verwendet.
  • Obwohl die Endosperm-Zellwände von Gerste und Weizen 20 bzw. 70 Gewichts-% an Arabinoxylan enthalten (Ballance, G. M. & Manners, D. J., Carbohydrate Research, 1978, 61,107; Fincher, G. B. & Stone, B. A. in: Advances in Cereal Science and Technology, Band VIII, Y. Pomeranz (Herausgeber), Am. Assoc. Cereal Chem., St. Paul (MN), 1986, 207), ist ihr Gesamtgehalt an Arabinoxylan vergleichbar, d. h. 2,8 bis 7,1 Gewichts-% für Gerste und 3,6 bis 7,1 Gewichts-% für Weizen (Henry, J., Journal of the Science of Food and Agriculture, 1985, 36, 1243; Hashimoto, S., Shogren, M. D. & Pomeranz Y., Cereal Chemistry, 1987, 64, 30).
  • Die Getreidekörner enthalten außerdem vergleichbare Mengen an Wasser-extrahierbarem Arabinoxylan, d. h. 0,24 bis 0,80 Gewichts-% für Gerste und 0,25 bis 1,18% für Weizen (Henry, J., Journal of the Science of Food and Agriculture, 1985, 36, 1243; Hashimoto, S., Shogren, M. D. & Pomeranz, Y., Cereal Chemistry, 1987, 64, 30; Aman, P. & Hesselman, K., Swedish Journal of Agricultural Research, 1984, 14, 135; Girhammer, U. & Nair, B. M., Food Hydrocolloids, 1992, 6, 285). Darüber hinaus enthalten die Endosperm-Zellwände von Gerste und Weizen 70 bzw. 20% an β-Glucan (Ballance, G. M. & Manners, D. J., Carbohydrate Research 1978, 61, 107; Fincher, G. B. & Stone, B. A. in: Advances in Cereal Sciences and Technology, Band VIII, Y. Pomeranz (Herausgeber), Am. Assoc. Cereal Chem., St. Paul (MN), 1986, 207).
  • Gerstenkörner enthalten 1,7 bis 4,1 Gewichts-% an Wasser-extrahierbarem β-Glucan und 3,6 bis 6,4 Gewichts-% an Gesamt-β-Glucan (Anderson, M. A., Cook, J. A. & Stone, B. A., Journal of the Institute of Brewing, 1978, 84, 233–239; Henry, J., Journal of the Science of Food and Agriculture, 1985, 36, 1243). Weizenkörner enthalten 0,1 bis 0,8 Gewichts-% an Wasser-extrahierbarem β-Glucan und 0,6 bis 1,4 Gewichts-% an Gesamt-β-Glucan (Anderson, M. A., Cook, J. A. & Stone, B. A., Journal of the Institute of Brewing, 1978, 84, 233–239; Henry, J., Journal of the Science of Food and Agriculture, 1985, 36, 1243). Da in Weizen nur geringe Mengen an Arabinoxylan (Cleemput, G., Bleukx, W., van Oort, M., Hessing, M. & Delcour, J. A., Journal of Cereal Science, 1995, 22, 139) und β-Glucan abbauenden Enzym-Aktivitäten gemessen werden können, muss das Gerstenmalz hauptsächlich verantwortlich für die Hydrolyse von Weizen- und Malz-Arabinoxylan und -β-Glucan während des Brauens sein.
  • Eine effiziente Hydrolyse von Arabinoxylanen und β-Glucan ist wichtig, da diese Verbindungen an Produktionsproblemen, wie etwa einer Viskosität der Bierwürze (Ducroo, P. & Frelon, P. G., Proceedings of the European Brewery Convention Congress, Zurich, 1989, 445; Vietor, R. J. & Voragen, A. G. J., Journal of the Institute of Brewing, 1993, 99, 243), der Filtrierbarkeit und Bildung von Trübungen (Coote, N. & Kirsop, B. H. 1976, Journal of the Institute of Brewing, 1976, 82, 34; Izawa, M., Kano, Y. & Kanimura, M. 1991, Proceedings Aviemore Conference on Malting, Brewing and Distilling, 1990, 427) beteiligt sein können.
  • Auf anderen Gebieten ist eine effiziente Hydrolyse von Xylanen und/oder Arabinoxylanen ebenfalls hochgradig erstrebenswert. Beispiele hierfür beinhalten Verfahren zur Herstellung von Roggen- und Weizen-Brot und Papier- und Zellstoff-Technologien. Es folgt hieraus, dass den (potentiellen) Anwendungen von Xylan- und/oder Arabinoxylan-Hydrolyseenzymen aufgrund ihrer oben beschriebenen Anwendungen zahlreiche Forschungsanstrengungen gewidmet wurden.
  • Ziser, Lothar et al: „Synthesis and testing of substrates and mechanism-based inactivators for xylanases", Carbohydr. Res. (1995), 274 und Paul, Jaishree et al: "Influence of sugars on endoglucanase and beta-xylanase activities of a Bacillus strain", Biotechnol. Lett. (1990), 12(1) zeigen, dass Xylanasen durch organische Moleküle, wie etwa 2,4-Dinitrophenyl-2-deoxy-2-fluor-β-xylobiosid oder Xylose, beides Zuckermoleküle oder modifizierte Zuckermoleküle, inaktiviert oder inhibiert werden können. Offensichtlich sind Xylanasen bekannt. Keskar, Sulaba S. et al: „Characterisation and sequencing of an active-site cysteine-containing peptide from the xylanase of a thermotolerant Streptomyces", Biochem. J. (1992), 281(3) beschreiben eine Sequenz eines aktiven Zentrums einer Xylanase. Gomes, D. J. et al.: „Factors influencing the induction of endoxylanase by Thermoascus aurantiacus", J. Biotech. (1994), 33(1) beschreibt anorganische Salze, die die Synthese von Xylanase inhibieren.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft einen Inhibitor für xylanolytische Enzyme, bevorzugt einen Inhibitor von Endoxylanase, von β-Glucanase, von β-Xylosidase, von α-L-Arabinofuranosidase und von anderen Xylan, Arabinoxylan und β-Glucan abbauenden Enzymen, bevorzugt erhalten aus Mikroorganismen, Pflanzen, Pflanzenmaterialien oder Fraktionen hiervon (wie etwa Getreiden, Getreidekörnern, Getreidekeimen oder Fraktionen hiervon, Getreidemehlen oder Fraktionen hiervon).
  • „Ein Inhibitor eines Enzyms" bezeichnet ein Molekül, das dazu in der Lage ist, die Aktivität des Enzyms teilweise oder vollständig zu inhibieren. Bei der irreversiblen Inhibition wird der Inhibitor kovalent an das Enzym gebunden oder wird so fest gebunden, dass seine Dissoziation von dem Enzym sehr langsam ist. In diesem Fall imitiert der Inhibitor für gewöhnlich das normale Substrat des besagten Enzyms in einer Vernetzungs-Reaktion. Im Gegensatz dazu kann die reversible Inhibition durch ein schnelles Gleichgewicht zwischen dem Enzym und dem Inhibitor gekennzeichnet sein. Ein kompetitiver Inhibitor hält das Substrat davon ab, an das aktive Zentrum zu binden und kann die Reaktionsrate durch Verminderung des Anteils von Enzymmolekülen, die an das Substrat gebunden sind, herabsetzen. Bei der nicht-kompetitiven Inhibition kann der Inhibitor die Wechselzahl vermindern. Die kompetitive kann von der nicht-kompetitiven Inhibition unterschieden werden, indem bestimmt wird, ob die Inhibition durch Erhöhung der Substrat-Konzentration überwunden werden kann. Inhibitoren, die aus einer bestimmten biologischen Spezies isoliert werden, und die von proteinischer oder glykoproteinischer Natur sind, können gegen Enzyme derselben Spezies (d. h. endogene Enzyme) und/oder gegen Enzyme andersartiger Spezies (d. h. exogene Enzyme) aktiv sein.
  • Vorteilhafter Weise kann der Inhibitor der Erfindung durch Mikroorganismen produziert werden oder kann vorhanden sein in verschiedenen Extraktionsmedien von Pflanzenmaterial, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Getreiden oder Fraktionen hiervon, Getreidekörnern oder Fraktionen hiervon, Getreidemehlen oder Fraktionen hiervon von Weizen, Hartweizen, Roggen, Triticale, Gerste, Hirse, Hafer, Mais und/oder Reis, aus denen er durch Verfahren gewonnen werden kann, die dem Fachmann wohlbekannt sind. Der Inhibitor gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Xylanase-Inhibitor, der typischer Weise eine wasserlösliche, alkalische, proteinöse Spezies darstellt, die einen pΙ-Wert (d. h. -log des isoelektrischen Punktes) von mehr als etwa 7,0 aufweist. Das Molekulargewicht des Xylanase-Inhibitors beträgt gemäß der Bestimmung durch SDS-PAGE typischer Weise 40–43 kDa. Nach der Reduktion mit β-Mercaptoethanol werden drei SDS-PAGE Proteinbanden mit SDS-PAGE-Molekulargewichten von ca. 40–43 kDa, ca. 30 kDa und ca. 10 kDa gefunden. Die N-terminale Sequenz des 40–43 kDa Proteins oder -Glykoproteins ist bis zum jetzigen Zeitpunkt noch nicht beschrieben worden und ist typischer Weise wie folgt: SEQ ΙD No. 1: Lys-Gly-Leu-Pro-Val-Leu-Ala-Pro-Val-Thr-Lys-Xaa-Thr-Ala, wobei Xaa bevorzugt Asp ist. Die 30 kDa-Bande besitzt die oben beschriebene, typische N-terminale Aminosäuresequenz SEQ ID No. 1, während die N-terminale Aminosäuresequenz der 10 kDa-Bande typischer Weise wie folgt ist: SEQ ID No. 2: Xaa-Ala-Pro-Val-Ala-Lys-Met-Val-Leu-Pro-Val-Ala-Met-Lys-Glu-Xaa-Val, wobei das erste Xaa vorzugsweise Ser, Phe oder Gly ist, und wobei das zweite Xaa nicht identifiziert ist. Diese Sequenz ist zuvor noch nicht beschrieben worden.
  • Daher betrifft die vorliegende Erfindung auch einen Inhibitor mit einem SDS-PAGE-Molekulargewicht von typischer Weise 40–43 kDa, der ein Protein oder Glykoprotein darstellt, das einen Marker aufweist, dessen Aminosäuresequenz mehr als 70% Homologie, bevorzugt mehr als 85% Homologie zu SEQ ID No. 1 aufweist, noch bevorzugter mit SEQ ID No. 1 identisch ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner auch einen Inhibitor mit einem SDS-PAGE-Molekulargewicht von typischer Weise 30 kDa, der ein Protein oder Glykoprotein darstellt, das einen Marker aufweist, dessen Aminosäuresequenz mehr als 70% Homologie, bevorzugt mehr als 85% Homologie zu SEQ ID No. 1 aufweist, noch bevorzugter mit SEQ ID No. 1 identisch ist.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner auch einen Inhibitor mit einem SDS-PAGE-Molekulargewicht von typischer Weise 10 kDa, der ein Protein oder Glykoprotein darstellt, das einen Marker aufweist, dessen Aminosäuresequenz mehr als 70% Homologie, bevorzugt mehr als 85% Homologie zu SEQ ID No. 2 aufweist, noch bevorzugter mit SEQ ID No. 2 identisch ist.
  • Vorteilhafter Weise sind diese Marker die endständigen Aminosäuresequenzen des Proteins oder Glykoproteins.
  • Gemäß der Erfindung, bezeichnet ein „Marker eines Proteins oder Glykoproteins" eine spezifische Aminosäuresequenz (oder deren korrespondierende Nukleinsäuresequenz), die dazu befähigt ist, eine Proteinfamilie von einer anderen Proteinfamilie zu unterscheiden.
  • Der inhibitorische Effekt gegenüber Xylan und/oder Arabinoxylan hydrolysierenden Enzymen kann z. B. durch das Endoxylanase-Verfahren mit AZCL-Arabinoxylan (siehe unten) demonstriert werden. Entsprechend kann der inhibitorische Effekt gegenüber β-Glucan hydrolysierenden Enzymen z. B. durch das β-Glucanase Verfahren mit AZCL β-Glucan (siehe unten) demonstriert werden.
  • Die Erfindung betrifft außerdem ein Verfahren zur Gewinnung des Inhibitors aus einem Mikroorganismus, wie etwa einem genetisch modifizierten Mikroorganismus, der diese Inhibitoren exprimiert, aus einer Pflanze oder aus Pflanzenmaterial (wie etwa Getreiden, Getreidekörnern, Getreidemehlen oder Fraktionen hiervon), indem die Pflanze, das Pflanzenmaterial und/oder der Mikroorganismus einem oder mehreren Extraktions- und/oder Fraktionierungsschritten unterworfen wird.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur genetischen Transformation eines Mikroorganismus, einer Pflanze oder eines Pflanzenmaterials, um die Expression des Inhibitors gemäß der Erfindung zu erhalten, wobei der Mikroorganismus, die Pflanze oder das Pflanzenmaterial durch die Einführung eines den Inhibitor codierenden genetischen Materials in den Mikroorganismus, die Pflanze oder das Pflanzenmaterial genetisch modifiziert wird und die Translation und Expression des Inhibitors durch dem Fachmann wohlbekannte gentechnische Verfahren erreicht werden.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren, die darauf abzielen, den Gehalt des Inhibitors in einem Mikroorganismus, einer Pflanze oder einem Pflanzenmaterial zu verändern, vorzugsweise zu reduzieren oder zu steigern, indem die Expression des Inhibitors durch die dem Fachmann wohlbekannten Verfahren und/oder durch die Verwendung von Molekülen, die dazu befähigt sind, die Inhibitor-Aktivität zu blockieren oder den Inhibitor zu aktivieren, reduziert oder gesteigert wird.
  • Die Erfindung betrifft weiterhin den erhaltenen Inhibitor, den Mikroorganismus, die erhaltene Pflanze, das erhaltene Pflanzenmaterial und/oder Fraktionen hiervon, sowie deren Verwendung in verschiedenen Gebieten der Nahrungsmittel-, Futtermittel- und/oder Getränketechnologien, wie etwa die Verbesserung des Mälzens und Brauens, die Verbesserung der Effizienz von Tierfuttern, die Verwendung bei gebackenen und/oder extrudierten Getreideprodukten (wie etwa normalem Teig, Vorteig, Chorleywood-Brot, Frühstücksgetreiden, verschiedenen Typen von Gebäck, Teigwaren und Nudeln), die Verbesserung der Herstellung von von Stärke abgeleiteten Sirupen, Sorbitol, Xylose und/oder Xylit, die Verbesserung der Weizen-Gluten-Stärke-Trennung und -Produktion, der Maisverarbeitung, die Verbesserung der Krankheitsresistenz von Pflanzen, die Verbesserung pharmazeutischer oder nutrazeutischer Anwendungen (etwa der Aufrechterhaltung der Struktur von diätetischem Fasermaterial), sowie die Verbesserung von Papier- und Faserstoff/Zellstoff-Technologien.
  • Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail in der folgenden Beschreibung einer bevorzugten Ausführungsform beschrieben, ohne dadurch den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einzuschränken.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Im Verlauf ihrer Arbeiten über die Struktur von Arabinoxylanen in belgischen Weißbieren und in den Zwischenprodukten des Herstellungsprozesses haben die Erfinder unerwartet Anzeichen für die Inhibition des xylanolytischen Gerstenmalz-Systems durch Wasser-extrahierbare Stoffe aus Weizen gefunden. Hierüber gab es zuvor keine Berichte, obwohl es etabliertes Wissen war, dass endogene und exogene Inhibitoren von α-Amylase (Deponte, R., Parlamenti, T., Petrucci, V., Silano, V. & Tomasi, M., Cereal Chemistry, 1976, 53, 805; Buonocore, V., Petrucci, T. & Silano, V., Phytochemistry, 1977, 16, 811; Mundy, J., Hejgaard, J. & Svendsen, Ι., Federation of Societies, 1984, 167, 210; Silano, V. α-Amylase inhibitors. In: Enzymes and their Role in Cereal Technology, J. E. Kruger, D. Lineback und C. E. Stauffer, (Herausgeber) Am. Assoc. Cereal Chem., St. Paul (MN), 1987, 141) und Protease (Birk, Y., Methods Enzymology, 1976, 45, 723; Lawszkowski, M. & Kato, I., Annual Review of Biochemistry, 1980, 49, 593) in Getreidekörnern vorkommen.
  • Tatsächlich fanden sich Anhaltspunkte für das Vorkommen von Xylanase-Inhibitoren in Weizen, wenn man die Solubilisierung von Arabinoxylanen während des Brauens mit Gerstenmalz und ungemälztem Weizen mit den Zielsetzungen verfolgte, (1) die enzymatischen Aktivitäten der Ausgangsmaterialien mit den Arabinoxylan-Gehalten der entsprechenden Bierwürzen in Beziehung zu setzen, und (2) untersuchte, auf welche Weise Weizen in die Solubilisierung von Arabinoxylanen während des Brauens eingreift. Dies wurde tatsächlich beobachtet, wenn man die Solubilisierung von Arabinoxylanen und die Freisetzung von freier Xylose (Xyl) in Bierwürze, die mit 60% Malz und 40% Weizen hergestellt worden war, mit den Werten für eine 100% Malz-basierte Bierwürze verglich.
  • Unter bestimmten Versuchsbedingungen verbesserte die Zugabe einer Xylanase mikrobiellen Ursprungs zu der Bierwürze eindeutig die Arabinoxylan-Solubilisierung während der Herstellung der Bierwürze.
  • Beispiele
  • Materialien
  • β-D-Allose, β-Mercaptoethanol, p-Nitrophenyl-β-D-xylopyranosid und Trizma Base (Reagenzgrad, Tris[hydroxymethyl]amino-methan) wurden von Sigma, St-Louis, MO, USA, bezogen. Azurin-quervernetztes (AZCL) Weizen-Arabinoxylan (Xylazym Arabinoxylan Tabletten), AZCL und Xylanase M4 aus Aspergillus niger stammten von Megazym, Bray, Irland. Mikrobielle Xylanasen von den Mikroorganismen Bacillus subtilis, Trichoderma viride und Aspergillus niger wurden von NV Puratos, Groot-Bijgaarden, Belgien, bezogen. Puffer A war: 0,025 M Natriumacetat, pH 4,7; Puffer B war: 0,025 M Natriummaleat, pH 6,0; Puffer C war: 0,025 M Natriumphosphat pH 6,0; Puffer D war: 0,250 mM Natriumacetat pH 5,0; Puffer E war: 0,025 M Natriumacetat pH 5,0.
  • Die Gerstenmalz-Proben wurden von der Cargill Malt Division, Herent (Belgien) geliefert. Die Erfinder verwendeten eine zweizeilige Wintergersten-Varietät (Clarine) mit einer niedrigen Endoxylanase-Aktivität und niedrigem Wasser-extrahierbarem Xyl-Gehalt und zwei Malze von einer sechszeiligen Wintergersten-Varietät (Plaisant) mit einem hohen Wasser-extrahierbaren Xyl-Gehalt. Die Plaisant-Malzproben 1 und 2 besaßen eine hohe, bzw. niedrige Endoxylanase-Aktivität. Die Weizenproben stammten von Amylum, Aalst (Belgien) und SAPSA SES SA, Jodoigne (Belgien). Die Erfinder verwendeten Skirlou und Soissons mit hohen bzw. niedrigen Wasser-extrahierbaren Xyl-Gehalten. Weizenkeime wurden von Ceres, Vilvoorde (Belgien) geliefert. Das Roggenmehl stammte von einem Gemisch niederländischer Roggenvarietäten, geliefert von Maneba, Rotterdam (Niederlande). Die Gerste der Varietät Clarine wurde von Cargill, Malt Division, Herent (Belgien) geliefert. Clarine Gerste, Plaisant 1 und Plaisant 2 Gerstenmalze, Skirlou und Soissons Weizenvollmehle wurden entweder mit der Tecator Probenmühle (Höganäs, Schweden) oder, für die Brau-Versuche, mit einer EBC-geprüften Labormühle (Analytica-EBC, vierte Auflage, Brauerei- und Getränke-Rundschau, Zürich, 1987) gemahlen. Soissons Weizenmehl wurde mit einer Bühler MLU-202 Labormühle (Bühler, Uzwil, Schweiz, Extraktionsausbeute 70%) hergestellt.
  • Extrakte
  • BMWM1, WWM und WG
  • Proben (3,00 g) von gemahlenem Gerstenmalz und Weizen oder Weizenkeimen (1,00 g) wurden in Puffer A (10,0 ml) suspendiert. Nach 15 min heftigem Schütteln bei Raumtemperatur wurden die Suspensionen zentrifugiert (3.000 g, 15 min, 20°C). Die resultierenden Extrakte werden als BMWM1 (Gerstenmalz-Vollmehlextrakt 1), WWM (Weizenvollmehlextrakt) und WG (Weizenkeimextrakt) bezeichnet.
  • WF, RF und BWM
  • Proben des geeigneten Mehls oder Vollmehls (2,50 g) wurden in Puffer B (10,0 ml) suspendiert. Nach 15 min heftigem Schütteln bei Raumtemperatur wurden die Suspensionen zentrifugiert (10.000 g, 15 min, 20°C) und die Überstände filtriert (0,45 μ). Die resultierenden Vollmehlextrakte werden als WF (Weizenmehlextrakt), RF (Roggenmehlextrakt) und BWM (Gerstenvollmehlextrakt) bezeichnet.
  • BMWM2
  • Proben (5,00 g) von gemahlenem Gerstenmalz wurden in Puffer B (10,0 ml) suspendiert. Nach 15 min heftigem Schütteln bei Raumtemperatur wurden die Suspensionen zentrifugiert (10.000 g, 15 min, 20°C) und die Überstände filtriert (0,45 μ). Die resultierenden Vollmehlextrakte werden als BMWM2 (Gerstenmalz-Vollmehlextrakt 2) bezeichnet.
  • Verfahren
  • Bestimmung des Xyl-Gehaltes
  • Die Prozeduren der Extraktion und Hydrolyse entsprachen der Beschreibung durch Cleemput et al. (Cleemput, G., Roels, S. P., van Oort, M., Grobet P. J. & Delcour, J. A., Cereal Chemistry, 1993, 70, 324), mit einem Erhitzen (130°C) der Proben aus Vollmehl (Weizen und Gerstenmalz) für 5 Stunden, um Enzymaktivität vor der Extraktion zu eliminieren. Bierwürzen wurden in derselben Weise analysiert wie die wässrigen Extrakte der Vollmehle. Freie Xyl wurde bestimmt, indem man den Hydrolyseschritt vor der Alditolacetat-Präparation wegließ. Alditolacetat-Proben (1 μl) (Englyst, H. N. & Cummings J. H., Analyst, 1984, 109, 937) wurden bei 225°C auf einer Supelco SP-2380 Säule (30 m, 0,32 mm ID, 0,2 μm Filmdicke) aufgetrennt und mittels eines Flammenionisationsdetektors in einem Chrompack 9011 Chromatograph (Middelburg, Niederlande) detektiert. Die Injektionstemperatur und die Detektionstemperatur betrugen 275°C. β-D-Allose wurde als interner Standard verwendet. Die gemessene Arabinose (Ara) stammte sowohl aus Arabinoxylan als auch aus Arabinogalactan, was es unmöglich machte, die Arabinoxylan-Mengen als 0,88 × (Ara + Xyl) (Cleemput, G., van Oort, M., Hessing, M., Bergmans, M. E. F., Gruppen, H., Grobet, P. J., Delcour, J. A., Journal of Cereal Science, 1995, 22, 73–84) zu berechnen. Darüber hinaus stammte ein wesentlicher Teil der Galactose (Gal) – ebenso wie bei den wässrigen Extrakten von Weizenvollmehl – nicht aus Arabinogalactan, so dass die Korrigierung der Ara-Werte für Arabinogalactan auf Basis der Annahme, dass das Gal/Ara-Verhältnis in Arabinogalactan 1,5 beträgt, wie es für Weizenmehle bekannt ist (Izydorczyk, M., Biliaderis, C. G. & Bushuk, W., Cereal Chemistry, 1991, 68, 139–144), ebenso unmöglich war. Folglich wurden die Xyl-Werte daher als ein relatives Maß für die Arabinoxylan-Gehalte verwendet. In ähnlicher Weise ist der Anstieg der Xyl-Spiegel beim Brauen anzeigend für die Arabinoxylan-Solubilisierung während des Brauens.
  • Messung der Endoxylanase (EC 3.2.1.8) Aktivität und der Inhibition derselben
  • Die Extrakte (1,0 ml) BMWM1 und WWM (siehe oben) wurden für 5 min bei 50°C inkubiert, bevor eine AZCL-Xylan Tablette (Megazyme) hinzu gegeben wurde. Die Inkubation wurde dann für 60 min bei 50°C fortgesetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 1% (Gewicht/Volumen) Trizma-Base (10,0 ml) und heftiges Rühren (Vortexen) beendet. Nach 5 min bei Raumtemperatur wurden die Röhrchen heftig geschüttelt und der Inhalt jeweils durch einen Whatman N°1 Filter filtriert. Die Extinktion wurde bei 590 nm gegenüber einer Kontrolle gemessen, die hergestellt wurde, indem der Extrakt ohne die Substrat-Tablette für 60 min bei 50°C inkubiert wurde. Die Substrat-Tablette wurde nach der Zugabe von 1% (Gewicht/Volumen) Trizma-Base zu dem Extrakt zugegeben. Die Aktivität wurde als Differenz in der Extinktion bei 590 nm zwischen der Probe und der Kontrolle gemessen und pro Gramm Trockenmalz ausgedrückt (ΔA590/g).
  • Die Endoxylanase-Aktivität von 0,6 ml BMWM1 (siehe oben) und 0,4 ml Puffer A wurde mit der Aktivität von 0,6 ml BMWM1 verglichen, zu dem 0,4 ml WWM zugegeben worden war. In einigen Fällen wurde das WWM vor der Zugabe für 30 min gekocht und zentrifugiert (3.000 g, 15 min, 20°C).
  • Bei der Bewertung der Inhibition der mikrobiellen Enzyme durch Extrakte aus verschiedenen Getreiden wurde der folgende Arbeitsablauf verwendet: Extrakte (WF, WG, RF und BWM) oder die gekochten (30 min, 100°C) und zentrifugierten (10.000 g, 15 min, 20°C) Extrakte (250 μl) wurden für 30 min bei Raumtemperatur mit 250 μl der geeignet verdünnten, mikrobiellen Xylanase-Lösung präinkubiert, die Xylazyme-Tablette wurde zugegeben und das Gemisch für 60 min bei 50°C inkubiert. Der Rest der Prozedur war wie oben beschrieben, wobei 5,0 ml 2% (Gewicht/Volumen) Trizma-Base anstelle von 10 ml der 1 (Gewicht/Volumen)-Lösung zur Terminierung der Reaktion zugegeben wurden.
  • Messung der β-Glucanase (EC: 3.2.3.73)-Aktivität und der Inhibition derselben (hier durch Referenz beschrieben)
  • Extrakte (WF, RF und BWM) oder gekochte (30 min, 100°C) und zentrifugierte (10.000 g, 15 min, 20°C) Extrakte (450 μl) wurden für 30 min bei Raumtemperatur mit 50 μl an BMWM2 präinkubiert, die β-Glucazyme-Tablette zugegeben und das Gemisch für 60 min bei 40°C inkubiert. Der Rest der Prozedur war wie oben beschrieben, wobei 5,0 ml 2% (Gewicht/Volumen) Trizma-Base anstelle von 10,0 ml der 1% (Gewicht/Volumen)-Lösung zur Terminierung der Reaktion zugegeben wurden.
  • Brauen
  • Proben von Bierwürze wurden in doppeltem Ansatz gemäß dem EBC-Verfahren (Analytica-EBC, vierte Auflage, Brauerei- und Getränke-Rundschau, Zürich, 1987) hergestellt. Für die 100% Gerstenmalz-basierten Bierwürzen wurden 50,0 g Gerstenmalz verwendet, für die Bierwürzen mit 40% Weizen wurden 30,0 g Gerstenmalz und 20,0 g Weizen verwendet. Die Bierwürzen wurden für 15 min bei 2.000 × g (Raumtemperatur) zentrifugiert. Die verwendeten Körner wurden gewaschen (150 ml) und die Waschlösung jeweils zu den Bierwürzen hinzu gegeben.
  • Die Bacillus subtilis Endoxylanase wurde zu dem Wasser (46°C) hinzu gegeben, bevor das Mischen mit 60% Clarine Malz und 40% Soissons oder Skirlou Weizen erfolgte. Die Menge an zu den Bierwürzen hinzu gegebener Endoxylanase (0,867 ΔA590/g) entsprach derjenigen, die benötigt wurde, um die Endoxylanase-Aktivität von Clarine-Malz (0,750 ΔA590/g) auf das Niveau von Plaisant 1-Malz (1,617 ΔA590/g) anzuheben.
  • Alle oben beschriebenen Analysen wurden wenigstens in doppelten Ansätzen durchgeführt und die Mittelwerte angegeben. Der Versuchsfehler (E. E.) wurde aus der Differenz (in %) zwischen den Einzelwerten und den Mittelwerten berechnet.
  • SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese und isoelektrische Fokussierung
  • Das Molekulargewicht des gereinigten Inhibitors wurde mittels SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese (SDS-PAGE) auf 20% Polyacrylamid-Gelen unter reduzierenden (β-Mercaptoethanol, 1%) oder nicht-reduzierenden Bedingungen mit der PhastSystem-Einheit (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gemäß dem Verfahren von Laemmli, U. K. (Nature, 1970, 227, 680–685) bestimmt. Die Gele wurden gemäß den Anweisungen des Herstellers (Pharmacia, Development Technique file N° 210) durch Silberfärbung angefärbt. Als niedrige Molekulargewichtsmarker dienten α-Lactalbumin (14.400 Da); Trypsin-Inhibitor (20.100 Da); Carboanhydrase (30.000 Da); Ovalbumin (43.000 Da); Albumin (67.000 Da) und Phosphorylase B (94.000 Da). Der isoelektrische Punkt des Inhibitors wurde mit der PhastSystem-Einheit unter Verwendung von Polyacrylamid-Gelen, die Ampholyte (pH 3–9) enthalten, und mittels geeigneter Standards (Pharmacia Kalibrierungs-Kits; pI 3,5–9,3) bestimmt. Die Proteine wurden durch Silberfärbung angefärbt (s. o.).
  • N-terminale Aminosäuresequenzierung von Proteinen
  • Die Sequenzen der N-terminalen Aminosäuren wurden mittel eines Applied Biosystems Modell 477 A Gasphasen-Sequenzierers, der durch einen Anschluss mit einem 120 A PTH Analysator (Perkin Elmer, Belgien) verbunden war, bestimmt.
  • Nachweis für das Vorkommen von Endoxylanase-Inhibitoren in Weizen
  • Die Xyl-Gehalte in Gerstenmalz und Weizen und die Arabinoxylan hydrolysierenden Aktivitäten sind in Tabelle I aufgelistet. Die Xyl-Gehalte in den 100% Malz-basierten Bierwürzen (Tabelle II) variierten von 0,41 bis 0,62% (alle analytischen Daten angegeben als Prozent der Trockenmasse). Die Xyl-Gehalte in den Bierwürzen mit 40% Weizen variierten von 0,35 bis 0,61% (Tabelle III).
  • In den Bierwürzen mit 40% Weizen verwendeten die Erfinder 60% Gerstenmalz. Der Vergleich des Anstiegs von Xyl während des Brauens unter Verwendung von 60%igem Malz mit 60% des Xyl-Anstiegs unter Verwendung von 100%igem Gerstenmalz zeigte eine Verminderung von 12 bis 58% (Tabellen II und III). Dies legte nah, dass die Endoxylanasen aus Gerstenmalz in Gegenwart von Weizen inhibiert wurden oder dass die Weizen-Arabinoxylane ein weniger geeignetes Substrat für Malz-Endoxylanasen sind. Das Mälzen bricht die Gerstenzellwände auf und macht diese zugänglicher für Enzyme (Selvig, A. & Aarnes, H., Journal of the Institute of Brewing, 1986, 92, 185).
  • Freie Xyl-Gehalte in Bierwürze
  • Die Gehalte an freier Xyl in 100% Malz-basierten Bierwürzen variierten von 0,046 bis 0,076% und in den Bierwürzen mit 40% Weizenanteil von 0,025 bis 0,040% (Tabelle IV). Der Unterschied zwischen den Gehalten der freigesetzten, freien Xyl betrug 0,032 bis 0,044% für die 100% Malz-basierten Bierwürzen und 0,015 bis 0,020% für die Bierwürzen mit 40% Weizen. Die Verminderung der Freisetzung freier Xyl im Vergleich mit 60% der Freisetzung freier Xyl bei der 100% Gerstenmalz-basierten Bierwürze variierte von 1 bis 32% (Tabellen II und IV). Die Verwendung der Bacillus subtilis Endoxylanase resultierte nicht in einem Anstieg freier Xyl. Die freien Ara-Gehalte stiegen ebenfalls nicht an. Die Endoxylanase besaß demnach keine Nebenaktivitäten als β-D-Xylosidase und α-L-Arabinofuranosidase.
  • Die Verminderung des durch Endoxylanase induzierten Anstiegs der Xyl- oder Arabinoxylan-Solubilisierung als Ergebnis der Verwendung von Weizen in Verbindung mit Gerstenmalz war offensichtlicher als die Verminderung der Freisetzung von freier Xyl. Aus diesem Grund konzentrierte man sich auf die Inhibition der Gerstenmalz-Endoxylanasen durch eine Weizenkomponente.
  • Inhibition des xylanolytischen Systems von Malz durch Weizenextrakte
  • In 1 ist die Verminderung der Endoxylanase-Aktivität von BMWM1 dargestellt, die auftritt, wenn WWM anstelle von Puffer A zugegeben wird. Die Verminderung der Endoxylanase-Aktivität variierte von 26 bis 58%. Die Verminderung der Endoxylanase-Aktivität von Gerstenmalz-Vollmehlextrakten (BMWM1) wurde erhalten, indem anstelle von Puffer Weizenvollmehl-Extrakte (WWM) zugegeben wurden. 1 zeigt die Ergebnisse, die mit ungekochten (☐) und gekochten (
    Figure 00130001
    ) Extrakten erhalten wurden. (a) Clarine Malz + Soissons Weizen, (b) Clarine Malz + Skirlou Weizen, (c) Plaisant 1 Malz + Soissons Weizen, (d) Plaisant 1 Malz + Skirlou Weizen, (e) Plaisant 2 Malz + Soissons Weizen, (f) Plaisant 2 Malz + Skirlou Weizen.
  • Im Falle des Kultivars Skirlou wurde eine stärkere Verminderung beobachtet als bei dem Kultivar Soissons. Dies stand in Übereinstimmung mit der Verminderung des Xyl-Anstiegs beim Brauen, die bei dem Kultivar Skirlou höher war als bei dem Kultivar Soissons (siehe Tabelle III). Der höhere Wasser-extrahierbare Xyl-Gehalt des Kultivars Skirlou gegenüber dem Kultivar Soissons implizierte, dass die geringere Suszeptibilität des Weizensubstrats während des Brauens die verminderte Solubilisierung verursachen könnte. Wenn WWM gekocht wurde, verschwand nahezu die gesamte Inhibition. Der Inhibitor schien hitzeempfindlich zu sein, und die Erfinder schlussfolgerten daraus, dass dieser daher von proteinischer Natur sein könnte. Es wurde jedoch als unwahrscheinlich angesehen, dass man es mit einer Protease zu tun hatte, da die Proteaseaktivität des Malzes vielfach höher war als die Proteaseaktivität von Weizen. Der Hauptteil der verminderten Aktivität wurde offenbar nicht durch die Weizen-Arabinoxylane verursacht, da die thermische Behandlung nicht die Arabinoxylan-Konzentration des Weizenextraktes veränderte. Ob der Weizen-Inhibitor aktiv gegen die endogenen Gerstenmalz-Endoxylanasen oder gegen exogene Endoxylanasen war, war unklar.
  • Brauen mit Bacillus subtilis Xylanase: Eine Lösung für die geringe Solubilisierung von Arabinoxylan in Gerstenmalz – Brauen mit Weizenvollmehl
  • Die Endoxylanase aus Bacillus subtilis, eines der mikrobiellen Enzyme, das unter den Versuchsbedingungen der 2 relativ geringfügig inhibiert wurde, steigerte die in Bierwürze vorliegenden Xyl-Gehalte. Im Vergleich mit den entsprechenden, ohne Zugabe von Endoxylanase hergestellten Bierwürzen, wurde bei Verwendung des Kultivars Soissons als Weizen-Zusatz 94% mehr Xyl-Solubilisierung erhalten, bei Verwendung des Kultivars Skirlou als Weizen-Zusatz 179% mehr Xyl-Solubilisierung. Offenbar solubilisiert die Bacillus subtilis Endoxylanase mehr Arabinoxylan aus der Weizenvarietät Skirlou als aus der Weizenvarietät Soissons (Tabelle IV).
  • Reinigung von Xylanase-Inhibitor aus Weizenmehl
  • Soissons Weizenmehl (2,0 kg) wurde in 10,0 l 0,1% (Gewicht/Volumen) Ascorbinsäure suspendiert. Die Suspension wurde über Nacht bei 7°C durchmischt und zentrifugiert (7°C, 10.000 g, 30 min). Zu dem Überstand wurden 2,0 g/l CaCl2 hinzu gegeben und der pH durch Zugabe von 2,0 M NaOH auf 9,0 angehoben. Man ließ den Extrakt über Nacht bei 7°C stehen und zentrifugierte diesen dann (7°C, 10.000 g, 30 min). Der pH des Extrakts wurde mit 2,0 M HCl auf 5,0 eingestellt und dann über einen Kationenaustauscher (SP Sepharose Fast Flow, 50 × 50 mm, Pharmacia) gepumpt. Die Säule wurde mit Puffer C (200 ml) äquilibriert und eine Proteinfraktion mit 200 ml 0,5 M NaCl eluiert. Dieses Eluat wurde 5mal verdünnt, der pH wie oben auf 5,0 eingestellt und die Kationen ausgetauscht (SP Sepharose Fast Flow, 26 × 100 mm, Pharmacia). Die Säule wurde mit Puffer C (200 ml) äquilibriert und nach einem linearen Salzgradienten von 0 bis 0,5 M NaCl (800 ml) wurden Fraktionen von 10 ml nach dem Entsalzen (PD 10 Säule, Pharmacia) auf die Inhibition von Endoxylanase getestet, wobei hierfür das zitierte Xylazym-Verfahren verwendet wurde, das Eluat anstelle von Getreideextrakt sowie geeignet verdünnte Xylanase M4 aus Aspergillus niger verwendet. Die Fraktionen mit inhibitorischer Aktivität wurden gesammelt, gegen deionisiertes Wasser dialysiert (7°C, über Nacht) und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material wurde in Puffer D (6,0 ml) gelöst und auf einer Sephacryl S100-Säule (26 × 670 mm, Pharmacia) aufgetrennt, wobei die Elution mit dem gleichen Puffer erfolgte. Fraktionen von 2,5 ml wurden gesammelt und auf ihre inhibitorische Aktivität getestet. Die aktiven Fraktionen wurden gesammelt, wie oben dialysiert und gefriergetrocknet. Das gefriergetrocknete Material wurde in Puffer E (6 ml) gelöst und ein Kationenaustausch (Mono S HR 5/5, Pharmacia) mit dem gleichen Puffer durchgeführt. In einem Salzgradienten (0 bis 0,5 M NaCl) eluierte Fraktionen wurden gesammelt und wie oben auf ihre Xylanase-Inhibition getestet. Auf diese Weise erhielten wir eine Fraktion (1 ml) des Inhibitors, der als einzelne Proteinbande in der SDS-PAGE lief. Dieser Inhibitor besaß ein scheinbares Molekulargewicht von ca. 40–43 kDa. Nach der Reduktion mit β-Mercaptoethanol wurden zwei zusätzliche SDS-PAGE Banden mit typischen Molekulargewichten von 30 und 10 kDa detektiert.
  • N-terminale Aminosäuresequenzierung des Endoxylanase-Inhibitors
  • Die durch β-Mercaptoethanol reduzierten Inhibitorprotein- und/oder Glykoprotein-Fraktionen wurden der SDS-PAGE unterzogen, geblottet und die N-terminalen Aminosäuren sequenziert.
  • Die N-terminale Aminosäuresequenz der Bande von ca. 40–43 kDa (SEQ ID No. 01) war: Lys-Gly-Leu-Pro-Val-Leu-Ala-Pro-Val-Thr-Lys-Xaa-Thr-Ala, wobei Xaa vorzugsweise Asp ist. Über diese Sequenz ist zuvor noch nicht berichtet worden. Die oben genannte, ca. 30 kDa große Bande weist ebenfalls die oben beschriebene, typische N-terminale Aminosäuresequenz SEQ ID No. 1 auf, während die N-terminale Aminosäuresequenz der ca. 10 kDa großen Bande typischer Weise wie folgt ist: SEQ ID No. 2: Xaa-Ala-Pro-Val-Ala-Lys-Met-Val-Leu-Pro-Val-Ala- Met-Lys-Glu-Xaa-Val, wobei das erste Xaa vorzugsweise Ser, Phe oder Gly ist, und wobei das zweite Xaa nicht identifiziert ist. Diese Sequenz ist zuvor noch nicht beschrieben worden.
  • Inhibition verschiedener mikrobieller Endoxylanasen durch Endoxylanase-Inhibitoren aus Weizen und anderen Getreiden
  • In 2 ist die Inhibition der verschiedenen mikrobiellen Xylanasen in Gegenwart von WF, RF und BWM dargestellt. Es ist die Verminderung der Xylanase-Aktivität (%) angegeben, die auftritt, wenn ein Getreideextrakt anstelle des gleichen, für 30 min gekochten Extraktes zugegeben wurde. Unter den Versuchsbedingungen wurde die höchste Verminderung für das Gemisch dreier Xylanasen aus Trichoderma reesei (82 bis 94%) gefunden, die niedrigste für die Xylanasen aus Bacillus subtilis (24 bis 39%).
  • Die Verminderung der mikrobiellen Endoxylanase-Aktivität wurde durch die Zugabe von Getreideextrakten (WF, RF und BWM) anstelle der gekochten Getreideextrakte erhalten. Figur 2 repräsentiert die Ergebnisse, die mit Weizenmehl (
    Figure 00150001
    ), Roggenmehl (☐) und Gerstenvollmehl (
    Figure 00150002
    ) erhalten wurden. Mikrobielle Xylanasen: (a) Gemisch dreier Xylanasen aus Trichoderma reesei, (b) Xylanase M4 aus Aspergillus niger, (c) Xylanase aus Bacillus subtilis, (d) Gemisch dreier Xylanasen aus Bacillus subtilis, (e) Xylanase aus Aspergillus niger, (f) Gemisch von fünf Xylanasen aus Aspergillus niger, (g) Gemisch von fünf Xylanasen aus Aspergillus niger. Unter den Versuchsbedingungen verminderte WG die Aktivität der Xylanase M4 aus Aspergillus niger um ca. 80%.
  • Inhibition von Gerstenmalz-β-Glucanase durch Inhibitoren aus Weizen und anderen Getreiden (hier beschrieben durch Referenz)
  • In 3 ist die Inhibition von Malz-β-Glucanase in Gegenwart von WF, RF und BWM dargestellt. Die Verminderung der β-Glucanase-Aktivität (%) bei Zugabe eines Getreideextraktes anstelle des gleichen, für 30 min gekochten Extraktes, ist dargestellt. Die Verminderung variierte zwischen 7 bis 12%.
  • Die Verminderung der β-Glucanase-Aktivität von Gerstenmalzextrakten (BMWM2) wurde durch Zugabe von Getreideextrakten (WF, RF, BWM) anstelle der gekochten Getreideextrakte erhalten. 3 zeigt die Ergebnisse, die mit Weizenmehl (a), Roggenmehl (b) und Gerstenvollmehl (c) erhalten wurden.
  • Tabelle Ι Wasser-extrahierbare und freie Xylose-Gehalte (% der Trockenmasse) und Arabinoxylan abbauende Enzymaktivitäten von 3 Gerstenmalzen und 2 Weizen*
    Figure 00160001
  • Tabelle II Xylose und freie Xylose-Gehalte (% der Trockenmasse) in Bierwürze und Ausmaße des Anstiegs an Xylose und freier Xylose (% der Trockenmasse) beim Brauen mit 100% Gerstenmalz*
    Figure 00160002
  • Tabelle III Xylose-Gehalte (% der Trockenmasse) in Körnern und entsprechenden Bierwürzen, die aus 60% Gerstenmalz und 40% Weizen hergestellt wurden. Zunahme der Xylose-Gehalte (% der Trockenmasse) beim Brauen und Effekt der Zugabe von Bacillus subtilis Endoxylanase. Differenz (%) zu 60% des Anstiegs der Xylose-Gehalte bei einer 100% Malz-basierten Bierwürze*
    Figure 00170001
  • Tabelle IV Freisetzung freier Xylose beim Brauen mit 60% Gerstenmalz und 40% Weizen. Effekt der Zugabe von Bacillus subtilis Endoxylanase. Differenz (%) zu 60% der Freisetzung von Xylose bei einer 100% Malz-basierten Bierwürze*
    Figure 00180001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00190001
  • Figure 00200001

Claims (15)

  1. Proteinischer oder glycoproteinischer Inhibitor für xylanolytische Enzyme, wobei der Inhibitor aus Pflanzenmaterial oder Fraktionen davon erhältlich ist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Getreiden, Getreidekörnern oder Getreidemehlen von Weizen, Hartweizen, Roggen, Triticale, Gerste, Hirse, Hafer, Mais oder Reis, und wobei der Inhibitor eine wasserlösliche Spezies ist.
  2. Inhibitor nach Anspruch 1, welcher einen Marker aufweist, dessen Aminosäuresequenz mehr als 70% Homologie mit SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 hat.
  3. Inhibitor nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker die N-terminale Aminosäuresequenz des Proteins oder Glycoproteins ist.
  4. Inhibitor nach Anspruch 2 oder 3, welcher einen Marker aufweist, dessen Aminosäuresequenz mehr als 85% Homologie mit SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 hat.
  5. Inhibitor nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker die N-terminale Aminosäuresequenz des Proteins oder Glycoproteins ist.
  6. Inhibitor nach Anspruch 1, welcher einen Marker aufweist, dessen Aminosäuresequenz zu SEQ ID NO: 1 und/oder SEQ ID NO: 2 identisch ist.
  7. Inhibitor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der Marker die N-terminale Aminosäuresequenz des Proteins oder Glycoproteins ist.
  8. Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Glycoprotein aus der Gruppe ausgewählt ist, welche Proteine oder Glycoproteine mit einem Molekulargewicht typischerweise zwischen 40 kDa und 43 kDa, Proteine oder Glycoproteine mit einem Molekulargewicht von typischerweise 30 kDa und Proteine oder Glycoproteine mit einem Molekulargewicht von typischerweise 10 kDa umfaßt.
  9. Inhibitor nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Protein oder Glycoprotein typischerweise ein Molekulargewicht zwischen 40 kDa und 43 kDa und einen pI-Wert von mehr als etwa 7 hat.
  10. Verfahren zum Erhalten des Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 9 aus möglicherweise genetisch modifizierten Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenmaterialien, wobei die Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenmaterialien einer oder mehreren Extraktions- und/oder Fraktionierungsstufen unterzogen werden.
  11. Verfahren zum Erhalten des Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenmaterialien durch das Einbringen von einem genetischen Material, welches den Inhibitor codiert, in die Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenmaterialien genetisch modifiziert werden.
  12. Verfahren zum Transformieren von Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenmaterialien, wobei die Aktivität des Inhibitors nach einem der Ansprüche 1 bis 11 vermindert wird, vorzugsweise durch die Verminderung von dessen Expression oder durch Blockieren der Inhibitorfunktion.
  13. Verfahren zum Transformieren von Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenmaterialien, wobei die Aktivität des Inhibitors nach Anspruch 6 erhöht wird, vorzugsweise durch eine Erhöhung von dessen Expression oder durch Aktivierung der Inhibitorfunktion.
  14. Mikroorganismen, Pflanzen oder Pflanzenmaterialien, erhalten nach dem Verfahren gemäß Anspruch 12 oder 13.
  15. Verwendung des Inhibitors nach einem der vorangegangenen Ansprüche 1 bis 9 oder erhalten nach dem Verfahren von Anspruch 10 oder Anspruch 11, die Mikroorganismen, die Pflanzen und/oder die Pflanzenmaterialien nach Anspruch 14 zur Verbesserung des Mälzens von Getreiden, wie Gerste, Hirse und Weizen, und/oder der Produktion von Bier, zur Verbesserung der Produktion und/oder Qualität von gebackenen oder extrudierten Getreideprodukten, ausgewählt unter der Gruppe, bestehend aus normalem Teig, Vorteig, Chorleywood-Brot, Frühstücksgetreiden, Gebäck, Teigwaren und Nudeln, zur Verbesserung der Tierfuttereffizienz, zur Verbesserung der Produktion von von Stärke abgeleiteten Sirupen, Sorbitol, Xylose und/oder Xylit, für die Weizen-Gluten-Stärke-Trennung und -Produktion, für die Verbesserung der Maisverarbeitung, für die Verbesserung der Beständigkeit gegen Pflanzenkrankheit, zur Verbesserung von nutrazeutischen und/oder pharmazeutischen Anwendungen zur Aufrechterhaltung der Struktur von Ballaststoffmaterial oder zur Verbesserung von Papier- und Faserstoff/Zellstoff-Technologien.
DE69828405T 1997-04-30 1998-05-04 Inhibitoren von zellulolytischen, xylanolytischen und beta-glukanolytischen enzymen Expired - Lifetime DE69828405T2 (de)

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Application Number Priority Date Filing Date Title
EP97870060 1997-04-30
EP97870060 1997-04-30
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