PL205013B1

PL205013B1 - Sposób wytwarzania ekstraktów z liści karczocha oraz te ekstrakty

Info

Publication number: PL205013B1
Application number: PL368184A
Authority: PL
Inventors: Jürgen Eich; Thomas Haffner; Thomas Goerke; Werner Schneider
Original assignee: Divapharma Chur Ag
Priority date: 2001-08-08
Filing date: 2002-08-07
Publication date: 2010-03-31
Also published as: EP1416950A1; HUP0600153A2; DE10164893B4; IL160083A0; HRP20040225A2; HUP0600153A3; IL160083A; PL368184A1; NO20040979L; US20040234674A1; DE10138929A1; YU12404A; CA2455761A1; HRPK20040225B3; MXPA04001115A; WO2003013562A1; JP2004537578A

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są sposób wytwarzania ekstraktów z liści karczocha (Cynarae folium) i te ekstrakty.

Dotychczasowy stan techniki

Preparaty wytworzone z liści karczocha zwyczajnego (Cynara scolymus L.) znajdują szeroko rozpowszechnione zastosowanie w leczeniu czynnościowych dolegliwości dyspeptycznych. Stosuje się soki wyciśnięte ze świeżych liści, jak również bezpośrednio otrzymane wodne i wodno-alkoholowe ekstrakty (ekstrakty pierwotne) z liści świeżych i suszonych.

Za pomocą eksperymentów przeprowadzonych in vitro i in vivo można było w jednoznaczny sposób wykazać ich aktywność choleretyczną (żołciopędną), podstawową zasadę działania w leczeniu czynnościowej niestrawności, i aktywność ta uchodzi za pewną z naukowego punktu widzenia [N. Brand, Monographie Cynara. W: R. Hansel, K. Keller, H. Rimpler, G. Schneider (wyd.): Hager's Handbuch der Pharmazeutischen Praxis. Wydanie V, tom 4: Drogen A-D. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1117 - 1122 (1992); N. Brand, Zeitschr. Phytother., 20, 292 - 302 (1999)]. Ekstrakty te zostały oficjalnie uznane za nadające się do leczenia dolegliwości dyspeptycznych (Aufbereitungsmonographie far Cynarae folium, Artischo-kenblatter, BAnz 122, 6.7.1988 w skorygowanej wersji BAnz 164, 1.9.1990).

W odniesieniu do wspomnianych działań omawia się następujące klasy składników liści karczocha i otrzymanych z nich ekstraktów, jako specyficznych substancji wiodących i potencjalnych substancji czynnych: 1. kwasy monokofeoilochinowe i dikofeoilochinowe (CCS) oraz 2. flawonoidy. Wynika z tego, że swój udział w farmakologicznym i klinicznym spektrum działania ekstraktów z karczocha i frakcji tych ekstraktów mogą mieć jeszcze dalsze związki, dotychczas nie zidentyfikowane. Z zastosowaniem analitycznej gradientowej metody RP-HPLC można rozdzielić i skwantyfikować poszczególne mono-CCS i di-CCS, jak również flawonoidy uzyskane z liści karczocha i otrzymanych z nich ekstraktów [Brand i Weschta, Zeitschr. Phytother., 12, 15 - 21 (1991)]. Na chromatogramie typu „fingerprint, otrzymanym dla wodnych ekstraktów z liści karczocha, można zidentyfikować cztery izomery mono-CCS i aż do pięciu izomerów di-CCS. W przypadku tej metody analitycznej, wpierw eluują się bardziej hydrofilowe mono-CCS, a po nich cynaryna (1,5-di-CCS) i 2 - 3 glikozydyflawonowe. Po tym następują pozostałe bardziej lipofilowe di-CCS, jak również, ewentualnie, w mniejszych ilościach, dalsze glikozydy flawonowe i aglikony flawonowe (fig. 1). Kwantyfikacja klas składników odbywa się zazwyczaj przez sumowanie, przy czym zawartość CCS oblicza się jako kwas chlorogenowy (= mono-CCS), a zawartość flawonoidów jako luteolino-7-glukozyd (= cynarozyd). Oprócz podstawowej zasady działania, a mianowicie „wzmożonego wydzielania żółci, istnieją, jeśli chodzi o ekstrakty z liści karczocha, wskazówki odnoszące się do ich działaniu skierowanego przeciw zastojowi żółci, przeciwutleniającego i stymulującego komórki oraz ochronnego dla komórek, jak również korzystnego wpływu na przemianę lipidową. Wskazówki te uzyskano w rezultacie przeprowadzenia badań in vitro i na zwierzętach, oraz farmakologicznych i klinicznych badań na ludziach [N. Brand, Zeitschr. Phytother., 20, 292 - 302 (1999); N. Brand, Monographie Cynara. W: R. Hansel, K. Keller, H. Rimpler, G. Schneider (wyd.): Hager's Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, wyd. V, tom 4: Drogen A-D. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1117 - 1122 (1992); dokument patentowy EP-A-0 958 828].

Następnie, istnieją dane dotyczące skuteczności ekstraktów z liści karczocha pod względem obniżania poziomu glukozy, kreatyniny i bilirubiny w surowicy, a dalej immunostymulacji i leczenia leukopenii, granulocytopenii, limfocytopenii i uszkodzeń szpiku kostnego, w leczeniu cukrzycy i uszkodzeń popromiennych względnie wynikających ze stosowania leków cytostatycznych w onkoterapii (dokumenty patentowe DE-A-196 27 376; WO 98/01143; DE-A-198 50 543).

Wyniki badań nad wodnymi pierwotnymi ekstraktami z liści karczocha, przeprowadzonych in vitro z udziałem szczurzych hepatocytów i ludzkich komórek HepG2 (hepatocytów), wykazują umiarkowane, zależne od stężenia, hamowanie biosyntezy cholesterolu, powodowane przez pośrednie hamowanie aktywności reduktazy HMG-CoA, kluczowego enzymu endogennej biosyntezy cholesterolu. Dla wodnych pierwotnych ekstraktów z liści karczocha klinicznie udowodniono umiarkowaną skuteczność obniżania poziomu cholesterolu i LDL oraz korzystny wpływ na wzajemne stosunki ilościowe HDL/LDL [V. Fintelmann, Z. Allg. Med., 72, 48 - 57 (1996); K. Kraft i in., Phytomedicine, 4, 369 - 378 (1997); W. Englisch i in., Arzneim.-Forsch./Drug Res., 50, 260 - 265 (2000); H. Siedek i in., Wiener Klinische Wochenschrift, 75, 460 - 453 (1963); G. Schonholzer, Schweizerische Medizinische Wochenzeitschrift, 69, 1288 - 1290 (1939)]. Jako składniki liści karczocha o hamującym wpływie na aktywność reduktazy

PL 205 013 B1

HMG-CoA można, przy pomocy przeprowadzanych in vitro eksperymentów na hepatocytach, zidentyfikować w pierwotnych ekstraktach glikozydy luteolinowe jak również wolną luteolinę i kwas 1,5-dikofeoilochinowy (cynarynę). Jednakże działanie tych związków w przypadku zastosowania ich do leczenia ludzi, nie jest wyjaśnione [R. Gebhardt, J. Pharmacol. Exp. Therap., 286, 1122 - 1128 (1998), R. Gehard, Phytotherap. Res., 15, 1-5 (2001); R. Gebhardt, Medwelt, 46, 348 - 350 (1995); dokument patentowy EP 0 807 435 A2; G. Mars i in., Med. Welt, 25, 1572 - 1574 (1974); H. Pristautz, Wiener Med. Wochenzeitschr., 49, 705 - 709 (1975)].

Dla wyżej wymienionych oraz dalszych, poszczególnych związków wyizolowanych z ekstraktów z liś ci karczocha potwierdzono dział ania farmakologiczne, pozwalają ce sugerować ich zastosowanie lecznicze w powyżej i poniżej wymienionych wskazaniach [N. Brand, Zeitschr. Phytoter., 20, 292 - 302 (1999); N. Brand, Monographie Cynara. W: R. Hansel, K. Keller, H. Rimpler, G. Schneider (wyd.): Hager's Handbuch der Pharmazeutischen Praxis, wyd. V, tom 4: Drogen A-D. Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York, 1117-1122 (1992); dokument patentowy EP-A-0 958 828]. Jeśli chodzi o leczenie ludzi, do dnia dzisiejszego nie jest wykorzystywana żadna z tych wyizolowanych substancji.

Reasumując, można z całą pewnością stwierdzić, że jeśli chodzi o pierwotne ekstrakty z liści karczocha, opisano bardzo dużo rozmaitych dziedzin ich użytkowania, takich jak, na przykład, zastosowanie w leczeniu chorób żołądka i jelit (np. niestrawności) czy zakłóconej przemiany tłuszczowej, a także do zwiększenia ochrony komórek u chorych na cukrzycę i nowotwory praz do immunostymulacji. Jednakże na tle tak licznych dziedzin ich użytkowania pokazuje się także jedna niepożądana właściwość pierwotnych ekstraktów z liści karczocha, a mianowicie to, że ukierunkowane leczenie określonej choroby nie może się obejść bez działań ubocznych w innych obszarach organizmu.

Znajdujące się na rynku preparaty z liści karczocha zawierają wyłącznie pierwotne ekstrakty z liści karczocha o opisanym powyżej kompleksowym farmakologicznym i klinicznym profilu działania, ale nie zawierają żadnych „ekstraktów specjalnych o działaniu „ograniczonym do nakierowanych terapii, wolnych od działań ubocznych [N. Brand, Zeitschr. Phytother., 20, 292-302 (1999)]. Do dotychczasowego stanu techniki należą wytłoczone soki, pierwotne wyciągi wodne, metanolowe i etanolowe, z których handlowo wykorzystywane są w zasadzie tylko wyciągi wodne, przede wszystkim w postaci wyciągów suchych jako stałe formy leków (tabela 1). Oprócz nich stosuje się także wyciągi etanolowe w postaci preparatów płynnych (krople, soki). W upowszechnieniu tych leków odgrywają one rolę jedynie podrzędną.

Wytwarzanie pierwotnych ekstraktów odbywa się w zasadzie sposobem wyczerpującej ekstrakcji świeżych lub wysuszonych liści, w temperaturze podwyższonej. W przypadku ekstrakcji przy użyciu wody, na jedną część ekstraktu potrzeba, z reguły, od 3 do 8 części leku, względnie od 20 do 40 części świeżych liści (zawartość wody w świeżych liściach mieści się w zakresie od 80 do 90%). Wydajność ekstraktu zależy od jakości liści, warunków przyjętych podczas ekstrakcji i rodzaju środka użytego do ekstrakcji.

Za stan techniki można uważać zawartość CCS wynoszącą mniej niż 6% w odniesieniu do pierwotnych ekstraktów wodnych. Z tego, 55-69% przypada na mono-CCS, względnie 31-45% na di-CCS. Zawartość flawonoidów w wodnych ekstraktach pierwotnych mieści się w zakresie 0,1-1% w zależności od jakości leku (tabela 1).

T a b e l a 1

Całkowita zawartość CCS i flawonoidów, jak również udziały mono-CCS i di-CCS w całkowitej zawartości CCS w wodnych, suchych ekstraktach z liści karczocha z preparatów handlowych [BRAND DAZ, 137, 60 - 76 (1997)] oraz własne wyniki otrzymane zgodnie ze sposobem standartowym.

Klasa związku	Zawartość (%)	Udział w całkowitej zawartości CCS (%)
Całkowita zawartość CCS	0,37 - 4,71**	-
	1,0 - 5,9*	-
Flawonoidy (na przykład skolimozyd, cynarozyd, luteolinoglukoronid, luteolina)	0,13 - 0,51**	-
	0,1 - 2,5*	-
Mono-CCS (na przykład kwas chlorogenowy, kwas neokofeoilochinowy i izomery kwasu chlorogenowego)	0,55 - 4,5*	55 - 69*
Di-CCS (na przykład cynaryna, 1,3-di-CCS, i inne izomery di-CCS)	0,25 - 2,7*	31 - 45*

* wyniki własne otrzymane zgodnie ze sposobem standartowym;

preparaty handlowe (według Brand DAZ, 137, 60 - 76 (1997).

PL 205 013 B1

Reasumując, można stwierdzić, że ekstrakcja przy użyciu wody lub wodnych alkoholi powoduje ilościowe wzbogacenie ekstraktu w CCS i flawonoidy. Względne wzajemne stosunki ilościowe poszczególnych związków pozostają jednak, praktycznie, niezmienione. Z tego można wyciągnąć wniosek, że znany dotychczas kompleksowy farmakologiczny/kliniczny profil działania tak w odniesieniu do leków wyjściowych, jak i do wytworzonych z nich ekstraktów wodnych lub wodno/alkoholowych powinien być, pod względem jakościowym, identyczny. Funkcję stężenia analizowanych związków powinna stanowić jedynie moc ich działania.

Wynalazek niniejszy oparty jest na zadaniu oddzielenia od siebie różniących się, w części rozbieżnych, profilów aktywności wodnych, względnie alkoholowo/wodnych ekstraktów pierwotnych, w celu zagwarantowania ukierunkowanego zastosowania leczniczego pozbawionego niepożądanych działań ubocznych (na przykład działania obniżającego poziom lipidów, ale bez działania antydyspeptycznego, i na odwrót). W tym celu, ekstrakty pierwotne zostają rozdzielone sposobem według wynalazku na dwie frakcje ekstraktu, A i B, które mają odmienne spektrum działania. Frakcja A ekstraktu wywiera działanie obniżające poziom lipidów i ochronne względem komórek (przeciwutleniające) oraz, w porównaniu z ekstraktem pierwotnym, brak dział ania antydyspeptycznego. Frakcja B ekstraktu jest wyraźnie skuteczniejszym niż ekstrakt pierwotny lekiem antydyspeptycznym, ale nie przejawia prawie żadnych właściwości obniżających poziom lipidów/cholesterolu.

Dalszym zadaniem jest oddanie tych frakcji ekstrakcyjnych do dyspozycji.

Streszczenie wynalazku

Sposób wytwarzania ekstraktów z liści karczocha (Cynarae folium), polega według wynalazku na tym, że obejmuje następujące etapy:

- wytwarzanie pierwotnego ekstraktu ze ś wież ych lub wysuszonych liś ci karczocha, otrzymanego drogą ekstrakcji wodą lub rozpuszczalnikiem organicznym z szeregu alkoholi, ketonów, estrów i eterów, korzystnie metanolem i etanolem, lub mieszaninami tych związków z wodą;

- zatężanie objętości ekstraktu pierwotnego lub zadawanie ekstraktu pierwotnego wodą, aż ekstrakt pierwotny będzie zawierał powyżej 50% wody;

- przemywanie obrobionego tak ekstraktu pierwotnego niepolarnym, nie mieszającym się z wodą rozpuszczalnikiem, korzystnie rozpuszczalnikiem z szeregu alkanów, alkenów, eterów, estrów lub chlorowanych węglowodorów;

- oddzielenie i odrzucenie warstwy organicznej; ekstrahowanie w ukł adzie ciecz-ciecz obrobionego tak, pierwotnego ekstraktu niewodnym rozpuszczalnikiem organicznym z szeregu alkoholi, ketonów, estrów, eterów, związków aromatycznych lub mieszaniny tych związków; i

- rozdzielenie tak otrzymanych faz na dwie róż ne frakcje i otrzymanie na tej drodze po pierwsze fazy organicznej a po drugie fazy wodnej.

Korzystnie w sposobie według wynalazku organicznym rozpuszczalnikiem do ekstrahowania ekstraktu pierwotnego jest mieszanina 2-butanolu i octanu etylu.

Ekstrakt z liści karczocha (Cynarae folium), otrzymany sposobem według wynalazku, wyróżnia się tym, że ekstrakt ten otrzymuje się drogą suszenia fazy organicznej.

Wyżej wspomniany ekstrakt korzystnie wykazuje całkowitą zawartość CCS, obejmującą monoCCS i di-CCS, równą co najmniej 6%, korzystnie 10-50%, w odniesieniu do całkowitej ilości ekstraktu, i zawartość flawonoidu równą co najmniej 3%, korzystnie 4%, zwłaszcza 7-30%, w odniesieniu do całkowitej ilości ekstraktu.

Szczególnie korzystnie ekstrakt ten wykazuje zawartość mono-CCS poniżej 30%, korzystnie 3-30%, zwłaszcza 10-30%, w odniesieniu do całkowitej zawartości CCS.

Omówiony ekstrakt wykazuje stosunek zawartości mono-CCS do zawartości flawonoidu mniejszy od 1.

Ekstrakt z liści karczocha (Cynarae folium), otrzymany sposobem według wynalazku, może wyróżniać się jeszcze tym, że ekstrakt ten otrzymuje się drogą suszenia fazy wodnej.

Ostatnio wspomniany ekstrakt korzystnie wykazuje całkowitą zawartość CCS, obejmującą mono-CCS i di-CCS, równą co najmniej 1%, korzystnie 2-15%, w odniesieniu do całkowitej ilości ekstraktu, i zawartość flawonoidu równą co najwyżej 2%, korzystnie 0,02-1,5%, w odniesieniu do całkowitej ilości ekstraktu, oraz udział mono-CCS co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 75%, w odniesieniu do całkowitej zawartości CCS.

Tenże ekstrakt szczególnie korzystnie wykazuje stosunek zawartości mono-CCS do zawartości flawonoidu w zakresie 4-35, korzystnie w zakresie 5-35.

PL 205 013 B1

Powyższe ekstrakty można stosować do wytwarzania leków, środków spożywczych, żywności dietetycznej i kosmetyków.

Wyżej wspomniane ekstrakty wykazują przy tym zgodnie z wynalazkiem działanie przeciwutleniające i ochronne względem komórek i narządów i można ich stosować do leczenia i zapobiegania hipercholesterolemii i hiperlipoproteinemii oraz do leczenia i zapobiegania schorzeniom serca/krążenia, stwardnieniu tętnic i schorzeniom demencyjnym.

Ekstrakty zgodne z drugim aspektem niniejszego wynalazku wykazują działanie antyserotonergiczne, spazmolityczne, skierowane przeciw zastojowi żółci, żółciopędne, przeciwwymiotne i prokinetyczne, i można je stosować do wzmagania wydzielania pęcherzykowego i trawienia tłuszczów, do leczenia niestrawności i do leczenia IBS (zespołu nadwrażliwości jelita -+ Irretable Bowel Syndrom).

Oba omawiane ekstrakty wyróżniają się tym, że wykazują odpowiednie działania bez niepożądanych działań ubocznych.

Krótki opis rysunku

Fig. 1 przedstawia typowy chromatogram RP-HPLC wodnego, pierwotnego suchego ekstraktu z liści karczocha.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek opiera się na nieoczekiwanym stwierdzeniu, że wodne lub wodno/alkoholowe ekstrakty pierwotne można rozdzielić sposobem według wynalazku, za pomocą frakcjonowania metodą ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz przy użyciu niewodnych środków ekstrahujących, takich jak rozpuszczalniki organiczne, takie jak alkohole, ketony, estry, etery i związki aromatyczne, na przykład alifatyczne alkohole lub estry kwasów karboksylowych, albo ich mieszaniny, na dwie odmienne frakcje. Frakcje te różnią się wyraźnie między sobą, na przykład, pod względem bezwzględnej i względnej zawartości mono-CCS, di-CCS i flawonoidów, a także na zasadzie ich farmakologicznego profilu działania. Składniki ekstraktu, które można uzyskać przez odparowanie obciążonego nimi po ekstrakcji środka ekstrahującego, określane są w dalszej części niniejszego opisu skrótowo jako „frakcja A ekstraktu. Składniki pozostałe w fazie zawierającej wodę określane są łącznie jako „frakcja B ekstraktu).

Frakcja A ekstraktu według wynalazku odznacza się zwiększoną zawartością związków lipofilowych, względnie zmniejszoną zawartością związków hydrofilowych, obecnych w ekstrakcie pierwotnym. To zwiększenie, względnie zmniejszenie zaznacza się wyraźnie zmniejszonym udziałem mono-CCS, jak również silnie obniżonymi wartościami ilorazu mono-CCS/flawonoid (patrz: fig. 1, jak również porównaj tabelę 3 z tabelą 7). Można stwierdzić całkowitą zawartość CCS wynosząca co najmniej 6%, zazwyczaj od 10 do 30% w przypadku użycia wodnych ekstraktów pierwotnych, oraz co najmniej 6%, korzystnie co najmniej 10%, szczególnie korzystnie od 15 do 50% w przypadku użycia alkoholowo/wodnych ekstraktów pierwotnych. Udział mono-CCS w całkowitej zawartości CCS w tej frakcji jest zwiększony w porównaniu z ekstraktem pierwotnym do poniżej 30%, na przykład mieści się on w zakresie od 3 do 30%, korzystnie w zakresie od 10 do 30%, niezależnie od rodzaju pierwotnie użytego środka ekstrakcyjnego. Zawartość flawonoidów we frakcji A ekstraktu wynosi co najmniej 3% w przypadku wodnych i alkoholowo/wodnych ekstraktów pierwotnych i korzystnie mieści się, na przykład, w zakresie od 7 do 20% w przypadku wodnych i alkoholowo/wodnych ekstraktów pierwotnych. Iloraz mono-CCS/flawonoid dla frakcji A jest, zgodnie z wynalazkiem, obniżony w porównaniu z wodnymi lub alkoholowo/wodnymi ekstraktami pierwotnymi, do wartości mniejszej niż 1.

Frakcja B ekstraktu według wynalazku odznacza się zmniejszoną zawartością związków lipofilowych, względnie zwiększoną zawartością związków hydrofilowych. To zwiększenie, względnie zmniejszenie zaznacza się wyraźnie podwyższonym udziałem mono-CCS, jak również silnie podwyższonymi wartościami ilorazu mono-CCS/flawonoid (patrz: fig. 1, jak również porównaj tabelę 3 z tabelą 7).

W przypadku stosowania wodnych ekstraktów pierwotnych stwierdza się całkowitą zawartość CCS wynoszącą co najmniej 1%, zazwyczaj od 2 do 10%, a w przypadku użycia alkoholowo/wodnych ekstraktów pierwotnych zawartość ta zazwyczaj mieści się w zakresie od 3 do 15%. Udział mono-CCS w całkowitym udziale CCS niezależnie od rodzaju pierwotnie użytego środka ekstrakcyjnego jest zwiększony do co najmniej 70%, na przykład do co najmniej 75%, a najczęściej do ponad 75% i aż do 85%. W przypadku wodnych i alkoholowo/wodnych ekstraktów pierwotnych zawartość flawonoidu we frakcji B ekstraktu wynosi najwyżej 2%, korzystnie mieści się w zakresie od 0,02 do 1,5%. Iloraz mono-CCS/flawonoid dla frakcji B jest, w porównaniu z ekstraktem pierwotnym, podwyższony, niezależnie od rodzaju pierwotnie użytego środka ekstrakcyjnego, do wartości mieszczącej się w zakresie od 4 do 35, na przykład w zakresie od 5 do 35.

PL 205 013 B1

W poniższej tabeli 7 przedstawiono przykładowo wyniki otrzymane dla czterech operacji frakcjonowania sposobem według wynalazku ekstraktów pierwotnych z wysokowartościowych leków (przykłady 8-11).

Środkiem ekstrakcyjnym zastosowanym w sposobie według wynalazku jest niewodny środek ekstrakcyjny, taki jak rozpuszczalnik organiczny. Przykładowo przytoczyć tu można alkohole, ketony, estry, etery, związki aromatyczne itd. Szczególnie odpowiednie są w tym przypadku alkohole alifatyczne i estry kwasów karboksylowych. Rozpuszczalników tych można używać osobno lub w mieszaninie jednych z drugimi. Zgodnie ze szczególnie korzystnym sposobem wykonania wynalazku, jako środek ekstrakcyjny stosuje się mieszaninę złożoną z 2-butanolu i octanu etylu.

W korzystnej postaci wykonania tego sposobu rozdrobniony lek ekstrahuje się wodą. Objętość pierwotnego ekstraktu można następnie pod próżnią zmniejszyć do około połowy i pozostałość ekstrahuje się mieszaniną 2-butanolu i octanu etylowego. Frakcję rozpuszczalną w fazie organicznej oddziela się i zatęża do sucha (frakcja A). Ekstrakt zawiera wyżej podane ilości pochodnych CCS i flawonoidów, jak również dalsze, nie zidentyfikowane substancje.

Również suszy się pozostałą frakcję, zawierająca wodę (frakcja B).

W innym korzystnym wykonaniu tego sposobu rozdrobniony lek najpierw ekstrahuje się alkoholowo/wodnym środkiem ekstrakcyjnym (ekstrakt pierwotny). Alkohole pierwszorzędowe lub drugorzędowe mają łańcuchy o długości rzędu C1-C4. Przeszkadzające składniki roślinne (na przykład chlorofile, woski), zawarte w alkoholowo-wodnych ekstraktach pierwotnych usuwa się z zatężonej fazy wodnej za pomocą odpowiednich, nie mieszających się z wodą, niepolarnych rozpuszczalników organicznych, takich jak, na przykład, heksan, eter naftowy lub dichlorometan. Fazę wodą (ekstrakt pierwotny) ekstrahuje się w temperaturze pokojowej za pomocą mieszaniny 2-butanolu i octanu etylu. Frakcję rozpuszczalną w mieszaninie rozpuszczalników oddziela się i zatęża do sucha (frakcja A). Ekstrakt zawiera wyżej podane ilości pochodnych CCS i flawonoidów oraz dalsze, nie zidentyfikowane substancje. Również suszy się pozostałą frakcję, zawierająca wodę (frakcja B).

Frakcje A i B ekstraktu różnią się wyraźnie zawartością i składem CCS i flawonoidów zarówno od odpowiednich wyjściowych ekstraktów pierwotnych, jak i ogólnie od ekstraktów pierwotnych z dotychczasowego stanu techniki.

Wynikowe frakcje ekstraktów A i B nieoczekiwanie wykazują bardzo odmienne farmakologiczne profile działania. Frakcja A ekstraktu jest silnym inhibitorem biosyntezy cholesterolu i wykazuje bardzo wysoką przeciwutleniającą zdolność tłumienia tworzenia wolnych rodników. Stwierdzono, że działania farmakologiczne wyraźnie przewyższają działanie ekstraktów pierwotnych. Natomiast frakcja A w przeciwień stwie do ekstraktu pierwotnego lub frakcji B ekstraktu, nie wykazuje ż adnej skuteczności lub wykazuje tylko bardzo nikłą skuteczność w testowym modelu niestrawności (patrz: tabele 4-6).

Frakcja B ekstraktu, w przeciwieństwie do ekstraktu pierwotnego wykazuje natomiast wysoką aktywność w modelu niestrawności i wcale nie przejawia zdolności do znaczącego zahamowania biosyntezy cholesterolu. Słabsze są też przeciwutleniające właściwości frakcji B (patrz: poniższe tabele 4-6).

Opisane ekstrakty A i B można przetwarzać w zwykle spotykane, stałe, półstałe i płynne farmaceutyczne i inne postacie stosowania leków i je aplikować, jak np. w proszki, roztwory, zawiesiny, tabletki, tabletki powlekane, drażetki, kapsułki, tabletki musujące, granulaty musujące, tabletki do żucia, tabletki do ssania, czopki, kremy, maści i żele. Przy tym, do wytworzenia każdorazowej postaci aplikacyjnej wykorzystać można zwykłe środki pomocnicze, takie jak np. celulozy, dwutlenki krzemu, laktoza, polimery syntetyczne, sole, barwniki, środki aromatyzujące, tłuszcze, oleje, środki powierzchniowo czynne, woda i alkohole.

P r z y k ł a d y

Niżej objaśnia się wynalazek bliżej, za pomocą przykładów.

Zawartości i udziały każdorazowo określanych składników zmierzono tak, jak to opisali Brand i Weschta w Zeitschr. Phytother., 12, 15-21 (1991).

P r z y k ł a d 1a

Z zastosowaniem 2-stopniowej maceracji, dokonanej w temperaturze mieszczącej się w zakresie od 80 do 90°C (5h/3h), przy użyciu łącznie 4,5 litra wody, wytrawiono 300 g leku z liści karczocha (lek handlowy A). Oba eluaty połączono ze sobą i zatężono do objętości 2,5 litra. Zawartości CCS i flawonoidów oznaczano sposobem, który opisali Brand i Weschta w Zeitschr. Phytother., 12, 15-21 (1991). Otrzymane wyniki przedstawiono w tabelach 2 i 3.

PL 205 013 B1

P r z y k ł a d y 2a i 3a

Leki handlowe B i C poddano obróbce analogicznie do przykładu 1a i odpowiednio oznaczono zawartości poszczególnych składników. Otrzymane wyniki zamieszczono w tabelach 2 i 3.

P r z y k ł a d 1b

Z zastosowaniem 5-godzinnej perkolacji, dokonanej w temperaturze mieszczącej się w zakresie od 55 do 60°C, przy użyciu 5 litrów mieszaniny metanolu i wody 80:20 (obj/obj) wody, dokonano ekstrakcji 300 g leku z liści karczocha (lek handlowy A). Eluaty połączono ze sobą i zbiorczy eluat zatężono do mniej więcej 1/3 jego objętości, po czym rozcieńczono wodą w stosunku 1:1 (obj/obj), a następnie przemyto 3 razy po 500 ml dichlorometanu. Fazę organiczną odrzucono. Zawartości CCS i flawonoidów w fazie wodnej oznaczano sposobem, który opisali Brand i Weschta w Zeitschr. Phytother., 12, 15-21 (1991). Otrzymane wyniki przedstawiono w tabelach 2 i 3.

P r z y k ł a d y 2b i 3b

Leki handlowe B i C poddano obróbce analogicznie do przykładu 1b i odpowiednio oznaczono zawartości poszczególnych składników. Otrzymane wyniki zamieszczono w poniższych tabelach 2 i 3.

P r z y k ł a d 4

Z zastosowaniem 2-stopniowej maceracji, dokonanej w temperaturze mieszczącej się w zakresie od 80 do 90°C (5h/3h), przy użyciu łącznie 4,5 litra wody, wytrawiono 300 g leku z liści karczocha. Oba eluaty, zawierające łącznie około 124 g substancji suchej połączono ze sobą i zatężono do objętości 2,5 litra. Zawartości CCS i flawonoidów oznaczano sposobem, który opisali Brand i Weschta w Zeitschr. Phytother., 12, 15 - 21 (1991). Otrzymane wyniki przedstawiono w tabelach 2 i 3.

P r z y k ł a d 5

Z zastosowaniem 2-stopniowej maceracji, dokonanej w temperaturze mieszczą cej się w zakresie od 80 do 90°C (5h/3h), przy użyciu łącznie 4,5 litra wody, wytrawiono 300 g leku z liści karczocha innej szarży (szarża 2)). Oba eluaty, zawierające łącznie około 121 g substancji suchej połączono ze sobą i zatężono do obję toś ci 2,5 litra. Zawartości CCS i flawonoidów oznaczano sposobem, który opisali Brand i Weschta w Zeitschr. Phytother., 12, 15-21 (1991). Otrzymane wyniki przedstawiono w tabelach 2 i 3.

P r z y k ł a d 6

Z zastosowaniem 5-godzinnej perkolacji, dokonanej w temperaturze mieszczą cej się w zakresie od 55 do 60°C, przy użyciu 5 litrów mieszaniny metanolu i wody 80:20 (obj/obj) wody, dokonano ekstrakcji 300 g leku z liści karczocha. Eluaty połączono ze sobą. Łącznie zawierają one 108 g substancji suchej. Zbiorczy eluat zatężono do mniej więcej 1/3 jego objętości, po czym rozcieńczono wodą w stosunku 1:1 (obj/obj), a następnie przemyto 3 razy po 500 ml dichlorometanu. Fazę organiczną odrzucono. Faza wodna zawiera 86 g substancji suchej. Zawartości CCS i flawonoidów w fazie wodnej oznaczano sposobem, który opisali Brand i Weschta w Zeitschr. Phytother., 12, 15-21 (1991). Otrzymane wyniki przedstawiono w tabelach 2 i 3.

P r z y k ł a d 7

Z zastosowaniem 5-godzinnej perkolacji, dokonanej w temperaturze mieszczą cej się w zakresie od 55 do 60°C (5h/3h), przy użyciu 5 litrów mieszaniny metanolu i wody 80:20 (obj/obj) wody, dokonano ekstrakcji 300 g leku z liści karczocha (szarża 2). Eluaty połączono ze sobą. Łącznie zawierają one 85 g substancji suchej. Zbiorczy eluat zatężono do mniej więcej 1/3 jego objętości, po czym rozcieńczono wodą w stosunku 1:1 (obj/obj), a następnie przemyto 3 razy po 500 ml dichlorometanu. Fazę organiczną odrzucono. Faza wodna zawiera 71 g substancji suchej. Zawartości CCS i flawonoidów w fazie wodnej oznaczano sposobem, który opisali Brand i Weschta w Zeitschr. Phytother., 12, 15-21 (1991). Otrzymane wyniki przedstawiono w tabelach 2 i 3.

T a b e l a 2

Wpływ jakości leku i wyboru środka ekstrahującego na zawartość CCS i flawonoidów w rozmaitych szarżach leków i otrzymanych z nich szarżach ekstraktów (przykłady handlowych leków A, B i C, oraz wysokowartościowych leków wyjściowych)

Przykład	Lek	Ekstrakt wodny	Ekstrakt metanolowo/wodny
CCS (%)	Flawonoidy (%)	CCS (%)	Flawonoidy (%)	CCS (%)	Flawonoidy (%)
1	2	3	4	5	6	7
Lek handlowy A	0,69	0,21	1,54	0,46	2,48	0,71
Lek handlowy B	1,85	0,49	4,57	1,11	6,30	1,577

PL 205 013 B1 cd. tabeli 2

1	2	3	4	5	6	7
Lek handlowy C	4,55	0,80	10,94	2,13	15,07	2,82
Przykład 4 i 6	6,21	1,18	10,06	1,98	18,83	2,79
Przykład 5 i 7	4,94	0, 91	10,53	1,81	19,14	2,89

Zawartość CCS i flawonoidów w pierwotnych ekstraktach z liści karczocha zależy od ich zawartości w wyjściowym leku oraz od wyboru rodzaju środka ekstrakcyjnego. Wysokowartościowe leki oparte na liściach karczocha mogą zawierać, zależnie od odmiany, pochodzenia i czasu zbioru oraz od warunków uprawy, suszenia i magazynowania, od 1 do 7% CCS i od 0,2 do 1,2% flawonoidów, przy czym udział mono-CCS w całkowitej zawartości CCS wynosi od 40 do 60%. W tabelach 2 i 3 przedstawiono wyniki prac badawczych nad ekstraktami pierwotnymi otrzymanymi z jakościowo odmiennych leków przy użyciu różnych środków ekstrakcyjnych. Zawartość CCS w ekstraktach wodnych wynosi najwyżej 11%, a w ekstraktach metanolowo-wodnych najwyżej 20%. Zawartość flawonoidów w ekstraktach wodnych może sięgać 2,5%, a w ekstraktach alkoholowo/wodnych 3%.

T a b e l a 3

Udział mono-CCS w całkowitej zawartości CCS i iloraz mono-CCS/flawonoid w rozmaitych szarżach leków i przynależnych do nich szarżach ekstraktów (przykłady handlowych leków A, B i C oraz wysokowartościowych leków wyjściowych)

Przykład	Lek	Ekstrakt wodny	Ekstrakt metanoIowo/wodny
Udział monoCCS w CCS (%)	Stosunek mono-CCS/flawonoidy	Udział mono-CCS w CCS (%)	Stosunek mono-CCS/- -flawonoidy	Udział mono-CCS w CCS (%)	Stosunek mono-CCS/- -flawonoidy
Lek handlowy A	57	1,87	65	2,41	59	2,06
Lek handlowy B	49	1,85	49	2,02	51	2,05
Lek handlowy C	46	2,62	53	2,72	49	2,29
Przykład 4 i 6	45	2,37	54	2,48	44	2,41
Przykład 5 i 7	50	2,72	60	3,14	49	2,65

Udział mono-CCS w przeliczeniu na całkowitą ilość CCS może wahać się w zakresie od 49 do 65% w przypadku ekstraktów wodnych i od 44 do 59% w przypadku ekstraktów metanolowo/wodnych. Iloraz mono-CCS/flawonoid w ekstrakcie mieści się w zakresie od 2,0 do 3,2 w przypadku ekstrakcji dokonywanej przy użyciu wody i w zakresie od 2,0 do 2,7 w przypadku ekstrakcji dokonywanej przy użyciu mieszaniny metanol/woda. Oba te parametry odzwierciedlają prawie dokładnie stosunki ilościowe w leku wyjściowym (tabela 3). Tak więc, można stwierdzić, że jakościowy skład ekstraktów zarówno wodnych, jak i wodno/alkoholowych, w porównaniu między sobą i z lekiem wyjściowym, jest niemal identyczny.

P r z y k ł a d 8

Bezpośrednio po ekstrakcji pierwotnej, wykonanej zgodnie ze sposobem podanym w powyższym przykładzie 4, przeprowadza się pięciokrotną ekstrakcję w układzie ciecz-ciecz, każdorazowo przy użyciu 600 ml mieszaniny octan etylu/2-butanol 60:40 (obj/obj), każdorazowo w czasie od 3 do 5 minut, w temperaturze pokojowej. Następnie, fazy organiczne łączy się ze sobą, zatęża pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C do sucha, a potem jeszcze dosusza w ciągu 2 godzin, pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze 60°C, w wyniku czego otrzymuje się 18,65 g ekstraktu suchego (frakcja A ekstraktu).

Pozostałą po ekstrakcji organicznej dolną fazę wodną zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C, a potem jeszcze dosusza w cią gu 2 godzin pod zmniejszonym ciś nieniem, w temperaturze 60°C, w wyniku czego otrzymuje się 93,45 g ekstraktu suchego (frakcja B ekstraktu).

P r z y k ł a d 9

Bezpośrednio po ekstrakcji pierwotnej, wykonanej zgodnie ze sposobem podanym w powyższym przykładzie 5, przeprowadza się pięciokrotną ekstrakcję w układzie ciecz-ciecz, każdorazowo przy użyciu 600 ml mieszaniny octan etylu/2-butanol 60:40 (obj/obj), każdorazowo w czasie od 3 do 5 minut, w temperaturze pokojowej. Nastę pnie, fazy organiczne łączy się ze sobą , zatęża pod zmniejszonym

PL 205 013 B1 ciśnieniem w temperaturze 40° C do sucha, a potem jeszcze dosusza w ciągu 2 godzin, pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze 60°C, w wyniku czego otrzymuje się 11 g ekstraktu suchego (frakcja A ekstraktu).

Pozostałą po ekstrakcji organicznej dolną fazę wodną zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C, a potem jeszcze dosusza w ciągu 2 godzin pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze 60°C, w wyniku czego otrzymuje się 96 g ekstraktu suchego (frakcja B ekstraktu).

P r z y k ł a d 10

Fazę wodną z przykładu 6 zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem do mniej więcej 1/3 jej objętości, po czym poddaje się ją pięciokrotnej ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz, każdorazowo przy użyciu 500 ml mieszaniny octan etylu/2-butanol 60:40 (obj/obj), każdorazowo w czasie od 3 do 5 minut, w temperaturze pokojowej. Następnie, fazy organiczne łączy się ze sobą, i usuwa rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze 40°C, po czym pozostałość jeszcze dosusza się w ciągu 2 godzin, pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze 60°C, w wyniku czego otrzymuje się 16 g ekstraktu suchego (frakcja A ekstraktu).

Pozostałą po ekstrakcji organicznej dolną fazę wodną zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C, a potem jeszcze dosusza w ciągu 2 godzin pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze 60°C, w wyniku czego otrzymuje się 61 g ekstraktu suchego (frakcja B ekstraktu).

P r z y k ł a d 11

Fazę wodną z przykładu 7 zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem do mniej więcej 1/3 jej objętości, po czym poddaje się ją pięciokrotnej ekstrakcji w układzie ciecz-ciecz, każdorazowo przy użyciu 500 ml mieszaniny octan etylu/2-butanol 60:40 (obj/obj), każdorazowo w czasie od 3 do 5 minut, w temperaturze pokojowej. Następnie, fazy organiczne łączy się ze sobą, i usuwa rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze 40°C, po czym pozostałość jeszcze dosusza się w ciągu 2 godzin, pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze 60°C, w wyniku czego otrzymuje się 11 g ekstraktu suchego (frakcja A ekstraktu).

Pozostałą po ekstrakcji organicznej dolną fazę wodną zatęża się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C, a potem jeszcze dosusza w ciągu 2 godzin pod zmniejszonym ciśnieniem, w temperaturze 60°C, w wyniku czego otrzymuje się 57 g ekstraktu suchego (frakcja B ekstraktu).

Badania farmakologiczne

Hamowanie biosyntezy cholesterolu

Oznaczanie hamowania biosyntezy cholesterolu przeprowadzono zgodnie ze sposobem podanym przez K. Martensa i in. [Toxic, in vitro, 7, 439 - 441 (1993)].

T a b e l a 4

Hamowanie biosyntezy cholesterolu w hepatocytach szczura przy stosowanym stężeniu 0,1 mg/ml i 1,0 mg/ml

Przykład	Substancja	Działanie hamujące przy stężeniu 0,1 mg/ml	Działanie hamujące przy stężeniu 1,0 mg/ml
4 i 8	Ekstrakt pierwotny	13%	90%
Frakcja A	86%	99%
Frakcja B	0%	0%
5 i 9	Ekstrakt pierwotny	5%	25%
Frakcja A	15%	91%
Frakcja B	0%	21%
6 i 10	Ekstrakt pierwotny	0%	90%
Frakcja A	32%	99%
Frakcja B	6%	16%
7 i 11	Ekstrakt pierwotny	12%	19%
Frakcja A	46%	97%
Frakcja B	13%	18%

PL 205 013 B1

Zdolność przeciwutleniania

Oznaczanie zdolności przeciwutleniania przeprowadzono zgodnie ze sposobem podanym przez

N. Gugelera w: „Peroxidationsreaktionen bei der Artherogenese: Modulatoren der LDL-Oxidation und der

Radikalbildung von Makrophagen (Dissertation 1997, Fakultat Biologie der Universitat Tiibingen, RFN).

T a b e l a 5

Hamowanie peroksydazy z chrzanu i oksydazy ksantynowej przy stosowanym stężeniu 0,3 μg/wsad

Przykład	Substancja	Hamowanie peroksydazy z chrzanu	Hamowanie oksydazy ksantynowej
4 i 8	Ekstrakt pierwotny	37%	26%
Frakcja A	57%	64%
Frakcja B	35%	26%
5 i 9	Ekstrakt pierwotny	53%	33%
Frakcja A	75%	69%
Frakcja B	43%	29%
6 i 10	Ekstrakt pierwotny	50%	49%
Frakcja A	85%	75%
Frakcja B	36%	39%
7 i 11	Ekstrakt pierwotny	52%	47%
Frakcja A	86%	76%
Frakcja B	41%	35%

Działanie antydyspeptyczne

Oznaczanie działania antydyspeptycznego przeprowadzono zgodnie ze sposobem podanym przez H. Bonischa i in. [Brit. J. Pharmacol., 108, 436-442 (1993)].

T a b e l a 6

Pobranie kationu ¹⁴C-guanidyniowego przez komórki neuroblastyczne po podaniu rozmaitych substancji użytych w teście

Przykład	Substancja	Pobranie kationu ¹⁴C-guanidyniowego Kontrola (= 100%)
4 i 8	Ekstrakt pierwotny	27
Frakcja A	110
Frakcja B	21
5 i 9	Ekstrakt pierwotny	37
Frakcja A	123
Frakcja B	38
6 i 10	Ekstrakt pierwotny	74
Frakcja A	130
Frakcja B	38
7 i 11	Ekstrakt pierwotny	28
Frakcja A	101
Frakcja B	25

PL 205 013 B1

T a b e l a 7

Zawartość mono-CCS, di-CCS i całkowita zawartość CCS oraz flawonoidów w ekstrakcie pierwotnym i odnośnych frakcjach ekstraktów z przykładów 4-11.

Przykład	Substancja	Całkowita zawartość CCS (%)	Mono-CCS (%)	Di-CCS (%)	Flawonoidy (%)	Udział mono-CCS w całkowitej zawartości CCS (%)	Stosunek ilościowy monoCCS/flawonoidy
4 i 3	Ekstrakt pierwotny	9,74	5,39	4,35	2,20	55,3	2,45
Frakcja A	25,99	4,41	21,58	13,29	16,9	0,33
Frakcja B	6,32	4,83	1,49	0,76	76,4	6,36
5 i 9	Ekstrakt pierwotny	10,44	6,31	4,13	2,00	60,4	3,16
Frakcja A	25,77	6,26	19,51	17,50	24,3	0,36
Frakcja B	7,67	6,07	1,60	0,24	79,1	25,29
6 i 10	Ekstrakt pierwotny	18,84	8,32	10,52	2,79	44,2	2,40
Frakcja A	47,62	6,38	41,24	10,90	13,4	0,59
Frakcja B	10,38	8,12	2,26	1,41	78,2	5,76
7 i 11	Ekstrakt pierwotny	19,14	9,37	9,77	2,89	48,9	2,65
Frakcja A	42,48	6,33	36,15	17,52	14,9	0,36
Frakcja B	11,26	9,00	2,26	0,34	79,9	26,47

Zastrzeżenia patentowe

Claims

1. Sposób wytwarzania ekstraktów z liści karczocha (Cynarae folium), znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:

- wytwarzanie pierwotnego ekstraktu ze świeżych lub wysuszonych liści karczocha, otrzymanego drogą ekstrakcji wodą lub rozpuszczalnikiem organicznym z szeregu alkoholi, ketonów, estrów i eterów, korzystnie metanolem i etanolem, lub mieszaninami tych związków z wodą;

- oddzielenie i odrzucenie warstwy organicznej;

- ekstrahowanie w układzie ciecz-ciecz obrobionego tak, pierwotnego ekstraktu niewodnym rozpuszczalnikiem organicznym z szeregu alkoholi, ketonów, estrów, eterów, związków aromatycznych lub mieszaniny tych związków; i

- rozdzielenie tak otrzymanych faz na dwie różne frakcje i otrzymanie na tej drodze po pierwsze fazy organicznej a po drugie fazy wodnej.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że organicznym rozpuszczalnikiem do ekstrahowania ekstraktu pierwotnego jest mieszanina 2-butanolu i octanu etylu.

3. Ekstrakt z liści karczocha (Cynarae folium), otrzymany sposobem według zastrz. 1 albo 2, przy czym ekstrakt ten otrzymuje się drogą suszenia fazy organicznej.

4. Ekstrakt według zastrz. 3, znamienny tym, że wykazuje całkowitą zawartość CCS, obejmującą mono-CCS i di-CCS, równą co najmniej 6%, korzystnie 10-50%, w odniesieniu do całkowitej ilości ekstraktu, i zawartość flawonoidu równą co najmniej 3%, korzystnie 4%, zwłaszcza 7-30%, w odniesieniu do całkowitej ilości ekstraktu.

PL 205 013 B1

5. Ekstrakt według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że wykazuje zawartość mono-CCS poniżej 30%, korzystnie 3-30%, szczególnie korzystnie 10-30%, w odniesieniu do całkowitej zawartości CCS.

6. Ekstrakt według jednego z zastrz. 3-5, znamienny tym, że wykazuje stosunek zawartości mono-CCS do zawartości flawonoidu mniejszy od 1.

7. Ekstrakt z liści karczocha (Cynarae folium), otrzymany sposobem według zastrz. 1 albo 2, przy czym ekstrakt ten otrzymuje się drogą suszenia fazy wodnej.

8. Ekstrakt według zastrz. 7, znamienny tym, że wykazuje całkowitą zawartość CCS, obejmującą mono-CCS i di-CCS, równą co najmniej 1%, korzystnie 2-15%, w odniesieniu do całkowitej ilości ekstraktu, i zawartość flawonoidu równą co najwyżej 2%, korzystnie 0,02-1,5%, w odniesieniu do całkowitej ilości ekstraktu, oraz udział mono-CCS co najmniej 70%, korzystnie co najmniej 75%, w odniesieniu do całkowitej zawartości CCS.

9. Ekstrakt według zastrz. 7 albo 10, znamienny tym, że wykazuje stosunek zawartości mono-CCS do zawartości flawonoidu w zakresie 4-35, korzystnie w zakresie 5-35.