PL203758B1 - Zastosowanie peptydu o aktywności przeciwko zwłóknieniu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy zastosowania peptydu o aktywności przeciwko zwłóknieniu do wytwarzania leku do leczenia zwłóknienia płuc, i tym samym zahamowania, zapobiegnięcia lub nawet zlikwidowania stanu zwłóknienia. Dokładniej, takie leczenie ssaków wykazujących zmiany zwłóknieniowe w światłach przewodów tętnic lub dróg oddechowych powoduje przebudowę światła przewodów, w wyniku której następuje redukcja obszaru zwłóknienia.

Zakłócenie funkcji śródbłonka będące skutkiem urazu prowadzi do odpowiedzi kompensującej, która zmienia normalne właściwości homeostatyczne śródbłonka. Zatem, różnorodne formy urazów zwiększają adhezyjność śródbłonka względem leukocytów lub płytek krwi, jak również jego przepuszczalność. Uraz indukuje również właściwości prokoagulacyjne nabłonka, zamiast właściwości antykoagulacyjnych i wpływa na tworzenie cząsteczek naczyniowo-aktywnych, cytokin i czynników wzrostu.

Gdy odpowiedź zapalna nie powoduje skutecznego zneutralizowania lub usunięcia czynników ją wywołujących, stan ten może przybrać formę przewlekłą. W takim przypadku, odpowiedź zapalna wpływa na pobudzenie procesu migracji i proliferacji komórek mięśni gładkich, włączonych w obszar stanu zapalnego i tworzących pośrednie zmiany chorobowe. W przypadku gdy odpowiedź pozostaje niewytłumiona, może ona prowadzić do zwężenia ścian tętnicy, dróg oskrzelowych lub innych świateł przewodów w stanie zapalnym.

Zwykle, w przypadku miażdżycy tętnic, światło przewodu jest kompensowane przez rozszerzenie przekroju, aż do momentu, w którym światło przewodu pozostaje niezmienione. Odnośnie komórek zapalnych, granulocyty są rzadko obecne w dowolnej fazie miażdżycy tętnic. Zamiast tego na każdym etapie tej choroby odpowiedź przebiega za pośrednictwem makrofagów pochodzących od monocytów i specyficznych podtypów limfocytów T.

Przewlekły stan zapalny powoduje zwiększenie liczby makrofagów i limfocytów, które migrują z krwi i dzielą się w miejscu zapalenia. Aktywacja tych komórek prowadzi do uwalniania enzymów hydrolitycznych, cytokin, chemokin, i czynników wzrostu, które mogą indukować dalsze uszkodzenia, a nawet prowadzić do ogniskowej martwicy. Zatem cykle akumulacji komórek jednoją drzastych, migracji i proliferacji komórek mięśni gładkich i tworzenie tkanki włóknistej prowadzi do dalszego powiększania i przebudowy tkanek w zmianie, co prowadzi do pokrycia jej włóknistym czopem śluzowym, który nakrywa rdzeń lipidowy i tkankę martwiczą, tak zwanej zmiany zaawansowanej/powikłanej. W pewnym momencie tętnica nie może już kompensować poprzez rozszerzanie. Wtedy zmiana dociera do światła tętnicy i zmienia przepływ krwi.

Oddziaływania międzykomórkowe w procesie powstawania miażdżycy tętnic zasadniczo nie różnią się od procesów występujących w chorobach zapalno-zwłóknieniowych, takich jak marskość wątroby, reumatoidalne zapalenie stawów, stwardnienie kłębków nerkowych, zwłóknienie płuc i przewlekłe zapalenie trzustki. Odpowiedź każdej tkanki lub narządu zależy od cech jej komórek i budowy, jej zaopatrzenia w krew i limfę oraz rodzaju czynników powodujących uraz. Stąd też, odpowiedź komórkowa w tętnicach (miażdżyca tętnic), wątrobie (marskość wątroby), stawach (reumatoidalne zapalenie stawów), nerkach (stwardnienie kłębków nerkowych), płucach (zwłóknienie płuc), i trzustce (zapalenie trzustki) są podobne lecz charakterystyczne dla każdego narządu.

Astma charakteryzuje się kompleksową odpowiedzią zapalną w postaci eozynofilii, obrzęku, nadmiernego wydzielania śluzu, uszkodzenia nabłonka oskrzeli i nadczynności dróg oddechowych. Prowokacja wziewnym alergenem wywołuje w przypadku astmy alergicznej natychmiastową reakcję nadczynności dróg oddechowych, wczesną odpowiedź dróg oddechowych (an. early airway response, EAR), która często poprzedza o kilka godzin późniejszą reakcję dróg oddechowych, odpowiedź dróg oddechowych późnej fazy (ang. late phase airway response, LAR).

Poznanie mechanizmów przewlekłego zapalenia w astmie nastąpiło poprzez badanie LAR na modelach zwierzęcych. Liczne modelowe układy zwierzęce okazały się być zdolne do wykazywania typowych cech LAR w różnych gatunkach obejmujących myszy, szczury, świnki morskie i naczelne z wyłączeniem człowieka.

Myszy Balb/C okazały się być zdolne do przechodzenia alergicznych chorób płuc przypominających ludzkie alergiczne choroby płuc obejmujących eozynofilię dróg oddechowych/śródmiąższa, wydzielanie śluzu, obrzęk i skurcz dróg oddechowych w odpowiedzi na immunizację owoalbuminą (OVA) po kilkukrotnej prowokacji. Struktura i funkcja zmian tkanki płucnej w przewlekłej astmie została wykazana poprzez dokonywanie biopsji płuc i w oparciu o materiały z sekcji. Zmiany strukturalne cechuje przewlekłe zapalenie, zaleganie kolagenu włóknikowego w śródmiąższu i zwężenia

PL 203 758 B1 dróg oddechowych. Wiodącą zmianą funkcjonalną związaną z przewlekłą astmą jest zmniejszona wydolność płuc. Pokazano, że immunizacja myszy Balb/C za pomocą OVA prowadzona przez trzy miesiące lub dłużej powoduje podobną patologię do występującej u ludzi przewlekłej astmy ze zwłóknieniem, zwężeniem dróg oddechowych i przewlekłym zapalnym naciekiem.

W miaż dż ycy tę tnic, marskoś ci wątroby, stwardnieniu kłębków nerkowych i przewlekłym zapaleniu trzustki granulocyty występują rzadko. Występują one tylko w reumatoidalnym zapaleniu stawów i zwłóknieniu płuc. W przypadku reumatoidalnego zapalenia płuc, pomimo, że wczesna odpowiedź rozpoczynana jest przez granulocyty, występują one głównie w jamie stawu. Makrofagi i limfocyty przeważają w błonie maziowej, prowadząc do erozji chrząstki i kości, które są zastępowane przez tkankę włóknistą (łuszczkę, ang. pannus). W zwłóknieniu płuc granulocyty początkowo występują w przestrzeni pęcherzyków płuc; jednakże parenchyma płucna, gdzie najczęściej dochodzi do zwłóknienia, ulega naciekowi przez makrofagi i limfocyty. Zatem wśród tych chorób zapalnych istnieją podobieństwa. Zidentyfikowano przynajmniej trzy różne typy makrofagów, każdy regulowany przez różne T-komórkowe cytokiny (interferon-7, interleukina-2, interleukina-4, i interleukina-10).

Przewlekłe odpowiedzi zapalne są często związane ze specyficznymi typami czynników indukujących uszkodzenia lub ziarniniaki. Gdy czynnik lub czynniki wywołujące uszkodzenie nie zostaną usunięte lub zneutralizowane przez odpowiedź zapalną i zapalenie postępuje, odpowiedź zamienia się z ochronnej w szkodliwą . Takie stał e lub nawrotowe uszkodzenia mog ą prowadzić do stymulowania każdej tkanki do naprawy lub zabudowywania uszkodzeń przez czynniki związane z odpowiedzią fibroproliferacyjną, która, gdy występuje w namiarze, ogranicza wydolność funkcjonalną tkanki lub narządu i staje się częścią procesu chorobowego.

Widoczną cechą tkanki w stanie przewlekłego zapalenia jest zwłóknienie. Cechuje się ono stałą i postę pują c ą akumulacją zewną trzkomórkowej macierzy kolagenowej w wyniku zwię kszonej proliferacji fibroblastów (główny typ komórek mezenchymalnych odpowiedzialnych za syntezę kolagenu śródmiąższowego). Cechą tkanki płucnej pochodzącej od pacjentów cierpiących na zwłóknienie płuc jest zwiększona liczba komórek tucznych, z których duża ilość jest w stadium częściowej degranulacji znajdujących się w pobliżu proliferujących fibroblastów.

Kolageny typu I, II, III, V i XI, reprezentujące większość kolagenu śródmiąższowego, są złożone z jednego do trzech ł a ń cuchów α , każ dy o masie czą steczkowej 95-100kD, połączonych w postaci pojedynczej struktury potrójnej helisy. Kolagen typu I posiada asymetryczną konfigurację heterotrimerową złożoną z łańcuchów α1 i α2 w proporcji stechiometrycznej 2:1, odpowiadając składowi łańcucha (a₁[I]₂, a₂[I]), natomiast kolagen typu III, homotrimer z trzech łańcuchów α1 posiada oznaczenie [a₁(I)]₃. Łańcuchy α1 i α2 kolagenu typu I migrują w nieco inny sposób w warunkach redukujących. Kolagen stymulowany przez traktowanie tryptazą został zidentyfikowany jako typ I w oparciu o skład łańcucha α, oraz przez immunobloting za pomocą przeciwciał specyficznych wobec kolagenu typu I.

Kolageny tworzą integralną część macierzy zewnątrzkomórkowej, a ilość kolagenu deponowanego w płucach jest ściśle regulowana w celu zapewnienia całkowitej równowagi pomiędzy biosyntezą a degradacją. Niewłaściwa kontrola tej równowagi może prowadzić do nasilenia odkładania kolagenu prowadząc do zwłóknienia. Stwierdzono obecnie, że każda zmiana czy to ilości kolagenu co stwierdzono w ostrym zespole niewydolności oddechowej, skrytopochodnym włókniejącym zapaleniu pęcherzyków płucnych, sarkoidozie, lub typu kolagenu, może prowadzić do zaburzeń komórkowych w płucach.

Zdrowe płuco ludzkie składa się z 65% kolagenu typu I i 30% kolagenu typu III. Specyficzny wzrost ilości kolagenu typu I, z towarzyszącym mu spadkiem typu III, został stwierdzony w idiopatycznym przewlekłym zwłóknieniu płuc i w zwłóknieniu towarzyszącym miażdżycy tętnic oraz marskości wątroby. Ogólnie, tkanki podatne posiadają niski stosunek kolagenu typu I do typu III. Mniej podatne tkanki, takie jak stwierdzane w przypadku zwłóknienia płuc, posiadają wyższą wartość tego stosunku.

Komórki mięśni gładkich w podłożu tętnic oraz w zmianach są otoczone różnymi typami tkanki łącznej. W podłożu tętnic macierz składa się głównie z typu I i typu III włóknistego kolagenu, natomiast w zmianach miażdżycowych składa się ona głównie z proteoglienu, z domieszką luźno rozmieszczonych włókien kolagenowych.

Obecnie poszukuje się nowych metod leczenia zwłóknień będących wynikiem zapaleń wywoływanych przez różne stany chorobowe, urazy lub zabiegi chirurgiczne.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie peptydu o wzorze f-Met-Leu-X, w którym X wybrany jest z grupy składającej się z Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe i Phe-Tyr, lub jego soli, w dawce skutecznej przeciwko zwłóknieniu, do wytwarzania leku do leczenia zwłóknienia płuc u ssaka.

PL 203 758 B1

Stwierdzono, że zwłóknienie u ssaków może być leczone poprzez podawanie tym ssakom kompozycji farmaceutycznych zawierających w odpowiednim nośniku farmaceutycznym mały peptyd posiadający aktywność przeciwzwłóknieniową. Może to zahamować włóknienie. W zalecanej realizacji wynalazku, i zwłóknienie jest redukowane lub eliminowane, zapewniając, że światło przewodu ma niewielkie ograniczenie drogi przepływu i przepływu płynów.

Zatem zastosowanie według wynalazku może być użyteczne do leczenia zwłóknienia u ssaków za pomocą kompozycji farmaceutycznych zawierających w odpowiednim nośniku farmaceutycznym przeciwzwłóknieniowo skuteczną ilość peptydu N-formylo-metionylo-leucylu („f-Met-Leu”) posiadającego aktywność przeciwzwłóknieniową. Szczególnie przydatne są peptydy o wzorze f-Met-Leu-X, w którym X jest wybrany z grupy skł adają cej się z Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe i Phe-Tyr.

Zastosowanie według wynalazku może być przydatne w leczeniu ssaków cierpiących na wiele schorzeń zwłóknieniowych, obejmujących, przykładowo, miażdżycę tętnic, marskość wątroby, stwardnienie kłębków nerkowych, przewlekłe zapalenie trzustki i chorobę wieńcową (taką jak wywoływane przez bakterię Chlamydia pneumoniae). Rozległe zwłóknienie będące wynikiem urazu lub zabiegów chirurgicznych może być także leczone z wykorzystaniem zastosowania według wynalazku, przykładowo, pooperacyjne zwłóknienie okołonerwowe w oponie twardej lub korzeni nerwowych po operacji kręgosłupa, uwolnienie ścięgna ze zrostów po uszkodzeniu lub naprawie ścięgien z adhezją, uwolnienie ze zrostów uszkodzonych lub leczonych nerwów obwodowych z adhezją, pooperacyjne adhezje po operacjach ginekologicznych lub brzusznych, operacje naprawcze nasieniowodów lub jajowodów służące cofnięciu sterylizacji kobiecej lub męskiej oraz operacje naprawcze innych struktur przewodowych, takich jak cewka moczowa, jelito lub przełyk.

W leczeniu błon dróg oddechowych zalecanym sposobem podawania jest inhalacja. W leczeniu zmian powierzchniowych zalecane jest podawanie powierzchniowe z uż yciem odpowiedniego nośnika farmaceutycznego. W podawaniu układowym mogą być stosowane wstrzyknięcia śródskórne lub tabletki.

W pewnej zalecanej realizacji pacjent może być leczony poprzez podawanie peptydu tu opisanego w połączeniu z innym czynnikiem aktywnym. Szczególnie zalecane inne czynniki aktywne w takich kombinacjach to w szczególności, przykładowo, antyleukotrieny, agoniś ci beta2, kortykosterydy i tym podobne.

Na Fig. 1 przedstawiono schematycznie proces immunizacji wywołujący przewlekłą astmę oraz późniejsze leczenie, zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku.

Na Fig. 2A i 2B przedstawiono fotografie ilustrujące porównanie cech patologicznych tkanki płucnej myszy z przewlekłą astmą po leczeniu (A) zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, i bez leczenia (B).

Na Fig. 3A i 3B przedstawiono fotografie ilustrujące porównanie tkanki płucnej myszy wykazującej związane ze zwłóknieniem nagromadzenie kolagenu po leczeniu (A) zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, bez leczenia (C) i kontrolę (B).

Na Fig. 4A i 4B przedstawiono fotografie ilustrujące porównanie tkanki płucnej myszy wykazującej związane ze zwłóknieniem nagromadzenie kolagenu po leczeniu (B) zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, bez leczenia (C) i kontrolę (A).

Na Fig. 5 przedstawiono wykres ilustrujący wpływ leczenia, zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, na zaczopowanie śluzowe w drogach oddechowych i akumulację komórek zapalnych u myszy z indukowaną przewlekłą astmą.

Na Fig. 6 przedstawiono wykres ilustrujący wpływ leczenia przeprowadzonego zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, na ilość płucnych komórek śluzowych w drogach oddechowych myszy z indukowaną przewlekłą astmą.

Na Fig. 7 przedstawiono wykres obrazujący wpływ leczenia przeprowadzonego zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, na ilość granulocytów kwasochłonnych i granulocytów obojętnochłonnych w drogach oddechowych myszy z indukowaną przewlekłą astmą.

Na Fig. 8 przedstawiono wykres obrazujący wpływ leczenia przeprowadzonego zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, na ilość ziarniniaka w płucach myszy z indukowaną przewlekłą astmą.

Na Fig. 9A - 9C przedstawiono fotografie wykazujące brak toksyczności wobec wątroby indukowanej przez leczenie zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku u myszy z indukowaną przewlekłą astmą, po leczeniu zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku (A), bez leczenia (C) i kontrolę (B).

PL 203 758 B1

Na Fig. 10 przedstawiono schematycznie immunizację indukującą przewlekłą astmę i przebieg dalszego leczenia, zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, przed dodatkowymi prowokacjami donosowymi.

Na Fig. 11A - 11C przedstawiono fotografie obrazujące porównanie tkanki płucnej myszy z przewlekłą astmą, następnie poddanych prowokacji donosowej, po leczeniu (A) zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, bez leczenia (C) i kontrolę (B).

Na Fig. 12A - 12C przedstawiono fotografie obrazujące porównanie kolagenu w tkance płucnej myszy z przewlekłą astmą, następnie poddanych prowokacji donosowej, po leczeniu (A) zgodnie z zastosowaniem wedł ug niniejszego wynalazku, bez leczenia (C) i kontrolę (B).

Na Fig. 13A - 13C przedstawiono fotografie obrazujące porównanie występowania komórek śluzowych w tkance płucnej myszy z przewlekłą astmą, następnie poddanych prowokacji donosowej, po leczeniu (A) zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, bez leczenia (C) i kontrolę (B).

Na Fig. 14 przedstawiono wykres obrazujący wpływ leczenia zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, na ilość granulocytów kwasochłonnych i granulocytów obojętnochłonnych obecnych w drogach oddechowych myszy z indukowaną przewlekłą astmą i poddanych wielokrotnej prowokacji alergenem.

Na Fig. 15 przedstawiono wykres obrazujący wpływ leczenia, zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, na poziom akumulacji czopów śluzowych dróg oddechowych i komórek zapalnych u myszy z indukowaną przewlekłą astmą i poddanych wielokrotnej prowokacji alergenem.

Na Fig. 16 przedstawiono wykres obrazujący wpływ leczenia, zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, na ilość powstających czopów śluzowych w drogach oddechowych myszy z indukowaną przewlekłą astmą i poddanych wielokrotnej prowokacji alergenem.

Na Fig. 17 przedstawiono, wykres obrazujący wpływ leczenia, zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, na ilość płucnych komórek śluzowych obecnych w drogach oddechowych myszy z indukowaną przewlekłą astmą i poddanych wielokrotnej prowokacji alergenem.

Na Fig. 18 przedstawiono wykres obrazujący wpływ leczenia, zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, na obecność ziarniniaka w płucach myszy z indukowaną przewlekłą astmą i poddanych wielokrotnej prowokacji alergenem.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem wykazano, że pewne małe peptydy o wzorze f-Met-Leu-X, w którym X wybrany jest z grupy sk ł adają cej się z Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe i Phe-Tyr, charakteryzują się zaskakującą aktywnością hamującą zwłóknienie a, w zalecanych realizacjach, powodują ograniczenie zmian zwłóknieniowych i przebudowę światła przewodu. Zgodnie z wynalazkiem termin „przebudowa” odnosi się do przebudowy światła przewodu, np. dróg oddechowych lub tętnicy, itp., w celu odtworzenia pierwotnego stanu sprzed zmian patologicznych. W szczególnie zalecanych realizacjach przywracany jest początkowy, występujący przed pojawieniem się schorzenia, stan przewodu.

W konsekwencji takie peptydy mogą być użyteczne w leczeniu ssaków wykazujących zmiany zwłóknieniowe, spowodowane, na przykład, zwłóknieniem płuc, miażdżycą tętnic, marskością wątroby, stwardnieniem kłębków nerwowych, przewlekłym zapaleniem trzustki oraz chorobą wieńcową. Rozległe zwłóknienie wywołane urazem lub zabiegiem chirurgicznym może być również leczone zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, włączając, na przykład, pooperacyjne zwłóknienie okołonerwowe opony twardej lub korzeni nerwowych, występujące po operacji kręgosłupa, uwolnienie ścięgna ze zrostów po uszkodzeniu ścięgna lub naprawie ścięgna z adhezją po operacji, uwolnienie ze zrostów uszkodzonych nerwów lub leczonych nerwów obwodowych z adhezją, pooperacyjne adhezje związane z operacjami ginekologicznymi lub brzusznymi, zabiegi naprawcze nasieniowodów lub jajowodów, służące cofnięciu sterylizacji mężczyzn lub kobiet oraz zabiegi naprawcze innych struktur przewodowych, takich jak cewka moczowa, jelito lub przełyk.

Peptydy do zastosowania według wynalazku mogą być wytwarzane za pomocą konwencjonalnych technik chemicznych, pozwalających na uzyskanie krótkich peptydów. Stosowane do podawania peptydy wytwarzane są w sterylnych warunkach, wraz z farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem.

Dawki kompozycji farmaceutycznych będą zależeć od podmiotu i stosowanej drogi podawania leku. Dawki mogą mieścić się w zakresie od 0,1 do 100000 μg/kg na dzień, zwłaszcza 1 do 10000 μg/kg. Najbardziej zalecane dawki mieszczą się w zakresie od około 1 do 100 μg/kg masy ciała, zwłaszcza, od około 1 do 10 μg/kg i w szczególności, 1,0 do 2,0 μg/kg. Dawki podawane są zazwyczaj od raz dziennie do co 4 - 6 godzin, zależnie od stanu zaawansowania schorzenia. W ostrych stanach

PL 203 758 B1 chorobowych zalecane jest podawanie peptydu co 4 - 6 godzin. W celu zachowawczym lub terapeutycznym zalecane może być podawanie jedynie raz lub dwa razy dziennie. Dogodnie dzienne podawanie stanowi od około 0,18 do około 16 mg peptydu, zależnie od drogi podawania i stanu zaawansowania schorzenia. Pożądane przerwy w przyjmowaniu wielokrotnych dawek poszczególnej kompozycji mogą zostać ustalone przez specjalistę w dziedzinie na podstawie rutynowych doświadczeń.

Drogi podawania leku obejmują podawanie doustne, pozajelitowe, doodbytnicze, dopochwowe, miejscowe, donosowe, dooczne, bezpośrednie wstrzyknięcie, itp. W zalecanej realizacji peptydy do zastosowania według niniejszego wynalazku podawane są pacjentowi w ilości przeciwzapalnie skutecznej lub w dawce hamującej degranulację komórek tucznych. Przykładową kompozycję farmaceutyczną stanowi terapeutycznie skuteczna ilość peptydu, zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, wywierająca wpływ przeciwzapalny lub hamująca degranulację komórek tucznych, zawarta zazwyczaj w farmaceutycznie akceptowalnym nośniku.

Stosowany tu termin „farmaceutycznie akceptowalny nośnik”, opisany bardziej szczegółowo poniżej, dotyczy jednego lub więcej zgodnych, stałych lub ciekłych wypełniających rozcieńczalników lub substancji do enkapsuacji, odpowiednich do podawania ludziom lub innym zwierzętom. W niniejszym wynalazku terminem „nośnik” określany jest zatem składnik organiczny lub nieorganiczny, naturalny lub syntetyczny, z którym, w celu ułatwienia podawania, łączone są cząsteczki jakich dotyczy wynalazek. Termin „terapeutycznie skuteczna ilość” dotyczy ilości niniejszych kompozycji farmaceutycznych, zapewniających pożądany skutek lub wywierających pożądany wpływ na poszczególny stan zdrowia podlegający leczeniu.

Do wytwarzania kompozycji możliwe jest zastosowanie różnych stężeń tego samego składnika w celu dostosowania dawki odpowiedniej dla wieku leczonego pacjenta, stanu zaawansowania choroby, czasu trwania leczenia i sposobu podawania leku.

Nośnik musi być zgodny z pozostałymi składnikami. Termin „zgodny” oznacza, że składniki kompozycji farmaceutycznych wykazują zgodność po wymieszaniu z małymi peptydami do zastosowania według wynalazku, nie wpływając w istotny sposób na skuteczność farmaceutyczną leku.

Małe peptydy do zastosowania według wynalazku, podawane są zazwyczaj per se (bez domieszek). Jednakże, mogą być one podawane w postaci farmaceutycznie akceptowalnej soli. Takie farmaceutycznie akceptowalne sole obejmują, ale bez ograniczenia, sole następujących kwasów: chlorowodorowego, bromowodorowego, siarkowego, azotowego, fosforowego, maleinowego, octowego, salicylowego, p-tolueno-sulfonowego, winowego, cytrynowego, metanosulfonowego, mrówkowego, malonowego, bursztynowego, naftaleno-2-sulfonowego i benzenosulfonowego. Farmaceutycznie akceptowalne sole mogą być również wytwarzane w postaci soli metali zasadowych lub metali ziem alkalicznych, takich jak sole sodowe, potasowe lub wapniowe grupy kwasu karboksylowego. Zatem zgodnie z niniejszym wynalazkiem możliwe jest wytwarzanie kompozycji farmaceutycznych do zastosowania medycznego, zawierających opisane tu peptydy wraz z jednym lub więcej farmaceutycznie akceptowalnym nośnikiem, i, ewentualnie inne składniki terapeutyczne.

Kompozycje obejmują kompozycje odpowiednie do podawania drogą doustną, pozajelitową, doodbytniczą, dopochwową, miejscowo, donosowo, do oczu, przez bezpośrednie wstrzyknięcie, z których wszystkie mogą być stosowane jako drogi podawania materiałów opisanych w niniejszym wynalazku. Kompozycje farmaceutyczne zawierające peptydy do zastosowania według wynalazku mogą również zawierać jeden lub więcej farmaceutycznie akceptowalnych nośników, które mogą obejmować zarobki, takie jak środki stabilizujące (pozwalające na długoterminowe przechowywanie), środki emulgujące, środki wiążące, środki zagęszczające, sole, środki konserwujące, rozpuszczalniki, środki do dyspersji, powłoki, środki przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, środki izotoniczne i opóźniające absorbcję, itp. Zastosowanie takich podłóż i środków do wytwarzania farmaceutycznie aktywnych substancji jest dobrze znane w dziedzinie. Zgodnie z wynalazkiem do wytwarzania preparatów farmaceutycznych mogą być wykorzystane jakiegokolwiek podłoża lub środki za wyjątkiem podłóż lub środków niezgodnych z peptydami do zastosowania według wynalazku. Do kompozycji tu opisanych można także włączać dodatkowe czynniki aktywne.

W leczeniu astmy zalecane są kompozycje przeznaczone do podawania drogą doustną . Zazwyczaj, kompozycje takie przygotowywane są w postaci aerozoli inhalacyjnych, do nebulizacji, syropu lub tabletki. W leczeniu zapalenia stawów zalecane są kompozycje do podawania miejscowego, jednak również odpowiednie jest w tym wypadku podawanie leku drogą doustną. Zazwyczaj, takie kompozycje do podawania miejscowego wytwarzane są w postaci kremu, maści lub roztworu. StężePL 203 758 B1 nie aktywnego składnika peptydowego w tych kompozycjach jest zazwyczaj niższe niż 50 μg/ml, zwłaszcza niższe niż 30 μg/ml, w szczególności wynosi od około 5 do 10 μg/ml.

Kompozycje mogą mieć dogodnie postać dawkowania jednostkowego i mogą być wytwarzane dowolnym sposobem znanym w farmacji. Sposoby te zazwyczaj obejmują etap łączenia składników aktywnych tu opisanych z nośnikiem zawierającym jeden lub więcej składników pomocniczych.

Kompozycje tu opisane odpowiednie do podawania drogą inhalacji mogą mieć postać, na przykład, aerozoli lub roztworów inhalacyjnych. Przykładowa, typowa, kompozycja aerozolowa zawiera pożądaną ilość mikrokrystalicznej formy peptydu, zawieszoną w mieszaninie trichloromonofluorometanu i dichlorodifluorometanu wraz z kwasem oleinowym. Przykładowy typowy roztwór zawiera pożądaną ilość peptydu, rozpuszczonego lub zawieszonego w sterylnym fizjologicznym roztworze soli (dowolnie około 5% obj. dimetylosulfotlenku („DMSO”) zwiększającego rozpuszczalność), chlorek benzalkoniowy oraz kwas siarkowy (w celu ustalenia pH).

Kompozycje tu opisane odpowiednie do podawania drogą doustną mogą być wytwarzane w postaci odrębnych jednostek, takich jak kapsułki, opłatki, tabletki lub pastylki do ssania, z których każda zawiera ustaloną uprzednio ilość peptydu do zastosowania według wynalazku. Kompozycje też mogą być zawarte w liposomach lub zawieszone w roztworach wodnych, lub innych, takich jak syropy, eliksiry lub emulsje. Przykładowa masa tabletkowa zawiera jako czynniki nieaktywne skrobię kukurydzianą, laktozę i stearynian magnezu. Przykładowa podstawa syropu zawiera kwas cytrynowy, barwnik, środek zapachowy, hydroksypropylometylocelulozę, sacharynę, benzoesan sodu, cytrynian sodu i oczyszczoną wodę.

Kompozycje odpowiednie do podawania drogą pozajelitową dogodnie zawierają sterylny preparat wodny cząsteczki do zastosowania według wynalazku, dogodnie izotoniczny z krwią biorcy. Taka postać wodnego preparatu może być wytwarzana za pomocą znanych metod, w których wykorzystywane są odpowiednie środki dyspergujące lub zwilżające oraz zawieszające. Sterylne preparaty do wstrzyknięć mogą być również sterylnym roztworem lub zawiesiną w nietoksycznym, dopuszczalnym do podawania pozajelitowego rozcieńczalniku lub rozpuszczalniku, na przykład w roztworze 1,3-butanodiolu. Spośród akceptowalnych podłoży i rozpuszczalników można wykorzystać wodę, roztwór Ringera i izotoniczny roztwór chlorku sodu. W roztworach wodnych, w celu utrzymania rozpuszczalności pewnych peptydów, można wykorzystać DMSO lub Trappsol w stężeniu do 10% obj. Podobnie, sterylne zestalone oleje można wykorzystać jako rozpuszczalnik lub podłoże zawiesin. W tym celu można dogodnie wykorzystać sterylne zestalone oleje, włączając syntetyczne mono- lub diglicerydy. Ponadto, do wytwarzania preparatów do wstrzyknięć można wykorzystać kwasy tłuszczowe (takie jak oleinowy lub obojętne kwasy tłuszczowe). Ponadto kopolimery blokowe Pluronic mogą być preparowane z lipidami w 4°C w celu wytwarzania preparatu w postaci stałej do uwalnia w 37°C przez okres kilku tygodni lub miesięcy.

Kompozycje odpowiednie do podawania miejscowego mogą mieć postać roztworu peptydu w Trappsol lub DMSO, lub kremu, maści czy lotionu. Zazwyczaj do podstawy lub nośnika wprowadza się około 0,1 do około 2,5% składnika aktywnego. Przykładowa podstawa kremu zawiera oczyszczoną wodę, wazelinę, alkohol benzylowy, alkohol stearylowy, glikol propylenowy, mirystynian izopropylu, stearynian polioksylu 40, karbomer 934, siarczan laurylowo-sodowy, octan disodowy, wodorotlenek sodu i ewentualnie DMSO. Przykładowa podstawa maści zawiera wazelinę białą i ewentualnie olej mineralny, seskwiskwoleinian sorbitanu i DMSO. Przykładowa podstawa lotionu zawiera Karbomer 940, glikol propylenowy, polisorbat 40, stearynian glikolu propylenowego, cholesterol i pochodne sterole, mirystynian izopropylu, palmitynian sorbitanu, alkohol acetylowy, trietanolaminę, kwas askorbinowy, simetikon i oczyszczoną wodę.

Model mysi astmy oskrzelowej indukowanej OVA

W celu określenia skutków działania f-Met-Leu-Phe-Phe (HK-X) na przewlekłą astmę, zastosowano model mysi przewlekłej astmy. W tym modelu mysim astmy przewlekłej ma miejsce intensywny naciek komórek zapalnych w zewnętrznej granicy blaszki podstawnej dróg oddechowych. Stan przewlekłej astmy u myszy wywołano poprzez immunizację w okresie 5 miesięcy, podczas których myszy poddawano wstępnej immunizacji w pierwszym miesiącu, a następnie poddawano cotygodniowej prowokacji donosowej OVA. W przypadku immunizowanych myszy obserwowano podwyższony poziom akumulacji kolagenu wokół naczyń krwionośnych i dróg oddechowych, wykazujący zwłóknienie. Immunizowane myszy poddawano działaniu HK-X osiem razy w okresie 16 dni leczenia (tj. co drugi dzień).

PL 203 758 B1

P r z y k ł a d 1

Materiały i metody

Odczynniki: krystaliczną OVA otrzymaną z Pierce Chem. Co. (Rockford, IL), ałun (siarczan potasowo-glinowy, ang. alum) z Sigma Chem. Co. (St. Louis, MO) oraz wolną od pirogenu wodę destylowaną z Baxter, Healthcare Corporation (Deerfield, IL). OVA (500 μg/ml) mieszano z równymi objętościami 10% (wag./obj.) ałunu w wodzie destylowanej. Po upływie 60-minutowej inkubacji mieszaniny (doprowadzonej do pH 6,5 stosując 10 N NaOH) w temperaturze pokojowej, mieszaninę wirowano przy 750 g przez 5 min; uzyskany osad zawieszano ponownie w objętości początkowej w wodzie destylowanej i stosowano w ciągu godziny.

Samice myszy BALB/c (w wieku 6-8 tyg. w momencie zakupu; D and K, Seattle WA) hodowano w konwencjonalnych warunkach do badań.

Immunizacja alergenem/ protokoły prowokacji do indukcji przewlekłej astmy:

W pierwszym dniu myszom wstrzykiwano dootrzewnowo („i.p.”) 0,2 ml (100 μg) OVA w ałunie a w dniu 14, również dootrzewnowo, (100 μg OVA w ałunie), wraz z donosowym podaniem OVA (100 μg w fizjologicznym roztworze soli). W 25, 26 i 27 dniu myszy poddawano prowokacji OVA, drogą donosową (100 μg w fizjologicznym roztworze soli). Następnie, co tydzień przez kolejnych pięć miesięcy myszy poddawano donosowej prowokacji OVA (100 μg w fizjologicznym roztworze soli). Patrz, Fig. 1.

Leczenie przewlekłej astmy

Jak przedstawiono na Fig. 1, 50 μg HK-X podawano donosowo („IN”), w 8 dawkach podawanych w okresie 16 dni. Myszy uśmiercano 1 dzień po podaniu ostatniej dawki HK-X.

Przygotowanie HK-X do podawania μg HK-X (w 50 μl fizjologicznego roztworu soli zawierającego mniej niż 2,5% DMSO). Zastosowano ilość DMSO wystarczającą do rozpuszczenia związku, jednakże nie przekroczono poziomu 2,5% objętościowych DMSO. Roztwór ten dostarczano do płuc poprzez nos, stosując znieczulenie biorcy.

W przypadku kontrolnej zaróbki znieczulone zwierzęta otrzymywały drogą donosową taką samą ilość fizjologicznego roztworu soli.

Histologia

Wszystkie zwierzęta uśmiercano drogą uśpienia po podaniu ostatniej dawki HK-X lub ostatniej prowokacji OVA. Wycinano płuca i utrwalano w 10% formalinie. Do badań immunocytochemicznych przeznaczano jeden płat płuc, który umieszczano w środku utrwalającym Carnoy'a. Po 24-godzinnym utrwalaniu płuca odwadniano i umieszczano w bloczkach parafinowych. Wszystkie bloczki parafinowe oznaczano numerami laboratorium i przeznaczano do analizy ślepej.

Bloczki parafinowe cięto na skrawki i wybierano 2 poziomy dla każdego płuca, oddzielone odległością 1 mm, a następnie sporządzano dla każdego poziomu 8 szkiełek. Szkiełka barwiono hematoksyliną i eozyną w celu wizualizacji ogólnej struktury komórkowej i tkankowej. Do identyfikacji komórek zawierających śluz i śluzu wydzielanego do dróg oddechowych stosowano błękit Alcian, do określenia złogów kolagenowych w zwłóknieniu wykorzystano trichrom Masona, natomiast eozynę zastosowano w celu wykazania obecności granulocytów kwasochłonnych w tkance płucnej.

Analiza morfometryczna

Analizowano następujące parametry alergicznego, przewlekłego schorzenia płuc.

1. Ocena zaczopowania dróg oddechowych - poprzez zastosowanie systemu oceny punktowej od + do ++++, można mierzyć z wykorzystaniem wcześniejszego doniesienia (Henderson et al., J.Exp.Medicine, tom 1-84, str. 1483-94, paźdz. 1996) stopień wydzielania śluzu do podłoża i szerokich fragmentów dróg oddechowych.

2. Frakcje komórek nabłonka zawierających ziarna śluzu - oceniano poprzez losowe zliczanie liczby komórek nabłonka zawierających śluz na 100 komórek nabłonka w podłożu dróg oddechowych (średnicy 600 μm do 1,000 μm). Komórki zliczano w 10 polach dla dwóch różnych płatów płuc i przedstawiano średni wynik.

3. Gęstość komórek naciekających - nagromadzone komórki zapalne (granulocyty kwasochłonne, granulocyty obojętnochłonne, monocyty i limfocyty) obecne w drogach oddechowych oraz w przedziale okołonaczyniowym oceniano stosując punktową skalę oceny od + do ++++. Ocena + wskazywała na gęstość warstwy komórek zapalnych, składającą się z 3 ale mniej niż 5 komórek; ocena ++ wskazywała na gęstość 5-10 komórek zapalnych; ocena +++ wskazywała na gęstość 10-20 komórek zapalnych; a ocena + + + + wskazywała na gęstość 20-40 komórek zapalnych.

PL 203 758 B1

4. Liczba różnego typu komórek - liczbę granulocytów kwasochłonnych i granulocytów obojętnochłonnych określano ilościowo poprzez zliczanie ich w polu mikroskopowym przy dużym powiększeniu (40x) w obszarze 2,200 μ² pochodzącym z dróg oddechowych.

5. Ocena ziarniniaków - struktury ziarniniako-podobne zliczano w polu mikroskopowym o małym powiększeniu (5x). Skupiska komórek związanych z drogami oddechowymi lub naczyniami krwionośnymi traktowano jako ziarniniaki.

Analiza statystyczna danych histomorfologicznych

Do statystycznej analizy porównawczej grupy eksperymentalnej i kontrolnej zastosowano program SigmaStat, wersję 2.0. Różnice analizowano pod kątem istotności różnicy (p < 0,05) za pomocą programu ANOVA. Program SigmaPlot, wersję 4.0 lub GraphPad Prism wykorzystano do przygotowania graficznej prezentacji danych.

Wyniki

Podczas immunizacji myszy za pomocą OVA i następnie podczas etapu leczenia HK-X nie zaobserwowano żadnych działań ubocznych lub objawów choroby. Myszy pozostały aktywne podczas całego okresu trwania eksperymentu.

Jednakże, po uśmierceniu zwierząt i dokonaniu badań histologicznych tkanek płuc zaobserwowano, że zwierzęta immunizowane jedynie za pomocą OVA charakteryzowały się poważnymi zmianami patologicznymi płuc zbieżnymi ze zmianami w przewlekłej astmie u ludzi. Zatem, ten model mysi jest modelem astmy przewlekłej, w którym występuje ogromny naciek komórek zapalnych związanych z zewnętrzną warstwą blaszki podstawnej dróg oddechowych (patrz, Fig. 2A).

W przypadku gdy zwierzę tom podawano 8 dawek HK-X w okresie 16 dni, liczba komórek zapalnych wokół dróg oddechowych i naczyń krwionośnych została wyraźnie zredukowana (patrz, Fig. 2A).

Jak przedstawiono na Fig. 3, myszy immunizowane za pomocą OVA charakteryzowały się podwyższonym poziomem nagromadzonego kolagenu (kolor niebieski) wokół naczyń i dróg oddechowych (patrz, Fig. 3C). Jednakże, w płucach leczonych za pomocą HK-X wykazano zredukowany poziom złogów kolagenowych (patrz, Fig. 3A). U myszy kontrolnych (HK-X podawany w fizjologicznym roztworze soli) tkanka płucna pozbawiona była komórek zapalnych i związanych ze zwłóknieniem złogów kolagenu (patrz, Fig. 3B).

Podobne wyniki uzyskano stosując barwienie błękitem Aliacianu o pH 2,3, uwidaczniające komórki zawierające śluz. U myszy immunizowanych OVA odnotowano bardzo duży udział komórek nabłonka zawierających ziarna śluzu (patrz, Fig. 4C). Natomiast, leczenie za pomocą HK-X wywołało silną redukcję liczby komórek zawierających śluz w drogach oddechowych (patrz, Fig. 4B). W istocie, częstotliwość ich występowania nie różniła się od kontroli lub nieimmunizowanych zwierząt, otrzymujących jedynie fizjologiczny roztwór soli zawierający HK-X (patrz, Fig. 4A).

W pięćdziesięciu do sześćdziesięciu procentach dróg oddechowych u tych 6-miesięcznych myszy z przewlekłą astmą występowały czopy śluzowe (Fig. 5). Po podaniu donosowym 8 dawek HK-X w okresie 16 dni odnotowano znaczną redukcję poziomu nagromadzenia ś luzu i komórek ś luzowych w drogach oddechowych (Fig. 6). Podobnie, została zredukowana liczba przypadających na jednostkę powierzchni naciekających komórek zapalnych - w tym granulocytów kwasochłonnych i granulocytów obojętnochłonnych (Fig. 7). Obserwacje histopatologiczne myszy immunizowanych OVA i leczonych za pomocą HK-X były podobne do wyników uzyskanych dla zwierząt otrzymujących jedynie fizjologiczny roztwór soli lub jedynie fizjologiczny roztwór soli zawierający HK-X.

Jedną z istotnych cech związanych z przewlekłą astmą w modelu mysim jest pojawianie się struktur ziarniniakowych w płucach. Zastosowanie HK-X powodowało redukcję liczby i wielkości tych struktur w płucach leczonych zwierząt (Fig. 8).

Porównanie wyników histopatologicznych wątroby dla myszy z przewlekłą astmą i leczonych HK-X oraz zwierząt otrzymujących fizjologiczny roztwór soli nie wykazało jasnych różnic (Fig. 9). Zatem zgodnie z tym co tu określono nie występuje toksyczność wobec wątroby na skutek częstego donosowego podawania dawek HK-X.

Badania zaplanowano w celu określenia czy podawanie HK-X ogranicza stan zapalny dróg oddechowych i nadczynność komórek śluzowych w modelu mysim indukowanej alergenem przewlekłej astmy. W modelu tym myszy uwrażliwiano na OVA i poddawano donosowej ekspozycji na OVA drogą donosową co tydzień przez 5 miesięcy OVA, a następnie leczono za pomocą HK-X podawanego donosowo 8 razy w okresie 16 dni. Taka immunizacja alergenem i schemat prowokacji prowadziły do stanu przewlekłego nacieku dróg oddechowych komórkami granulocytów kwasochłonnych i innymi

PL 203 758 B1 typami komórek zapalnych, gromadzenia śluzu w drogach oddechowych i zwiększenia liczby komórek wydzielających śluz.

Pod wpływem podawania HK-X ulegały redukcji nadmierne procesy wydzielnicze dróg oddechowych, zwiększenie liczby komórek śluzowych i wykorzystanie granulocytów kwasochłonnych i granulocytów obojętnochłonnych. Wyniki te wskazują, że HK-X pełni istotną rolę zarówno w ograniczeniu nadmiernego wydzielania śluzu przez drogi oddechowe, jak i przebiegu późnej fazy stanu zapalnego, występujących w modelu astmy przewlekłej indukowanej alergenem. W wyniku zastosowania HK-X obserwowano złagodzenie stanu zapalnego płuc, redukcję wydzielania śluzu oraz ograniczenie różnicowania komórek śluzowych.

Interesujący jest fakt, że HK-X pozostawał skuteczny w okresie 16 dni leczenia, co wskazuje na to, że w modelu tym nie wystąpiła szybko rozwijająca się tolerancja leku. Ponadto, donosowe podawanie myszom 1 mg HK-X na kg masy ciała przez okres dłuższy okres nie powodowało jakichkolwiek wykrywalnych skutków toksycznych względem wątroby.

P r z y k ł a d 2

W modelu mysim przewlekłej astmy zmiany patologiczne ściśle naśladują chorobę u ludzi. Zamieszczony powyżej Przykład 1 wskazuje, że przeprowadzone zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku leczenie redukuje zmiany patologiczne wywołane przewlekłą astmą, w tym zwłóknienie. Obserwowano znaczące ograniczenie zwłóknienia, liczby komórek zapalnych zgromadzonych wokół dróg oddechowych oraz komórek śluzowych i wydzielania śluzu w obrębie dróg oddechowych.

Przykład ten przedstawia wyniki testów, w których wykorzystano myszy z przewlekłą indukowaną astmą oraz poddane leczeniu zgodnie z zastosowaniem według niniejszego wynalazku, po kolejnym wzbudzeniu u nich odpowiedzi przez donosowe („IN”) podanie OVA. Zastosowano te same Materiały jak w Przykładzie 1.

Metody

Myszy Balb/C wielokrotnie immunizowano za pomocą OVA w okresie 6 miesięcy jak w Przykładzie 1. Następnie myszy leczono 50 μg HK-X na dawkę, podawaną donosowo, 8 razy w okresie 16 dni, jak w przykładzie 1. Następnie 15-20 minut przed donosową prowokacją OVA myszom podawano drogą donosową 50 μg dawkę HK-X. Schemat ten powtarzano przez trzy kolejne dni. 1 dzień po ostatnim leczeniu myszy uśmiercano. Patrz, Fig. 10.

HK-X przygotowano w sposób opisany w Przykładzie 1.

Podawanie HK-X

Grupa zwierząt HK-X/OVA, otrzymała dawkę 0,4 mg/kg masy ciała (50 μg na 20 gm masy ciała na dzień), podczas gdy grupa otrzymująca fizjologiczny roztwór soli otrzymała taką samą dawkę HK-X bez dodatku OVA. Wcześniejsze badania farmakokinetyczne wykazały, że okres półtrwania w osoczuT 1/2 (okres półtrwania) HK-X u myszy był krótszy niż 30 min. Zatem, w celu utrzymania jego poziomu w osoczu w momencie dostarczenia alergenu, myszy te otrzymywały donosowo dodatkowe dawki HK-X tu ż przed prowokacj ą OVA.

Histologia płuc

Pobierano tchawicę i lewe płuco i utrwalano w 10% formalinie w 20°C przez 15 godz. (górny i dolny płat). Po zatopieniu w parafinie, tkanki cięto na 5 μm skrawki. Granulocyty kwasochłonne w tkankach płucnych wybarwiano stosując zmodyfikowany roztwór Discombe'a. Liczbę granulocytów kwasochłonnych przypadających na jednostkę powierzchni dróg oddechowych (2,000 μm²) określano na podstawie analizy morfometrycznej, zgodnie z tym, jak uprzednio opisano (Henderson et al., J.Exp.Medicine, tom 1-84, str. 1483-94, paźdz. 1996, Su et al., American Review Repetitive Diseases, tom 147, str. 448-56, 1993). Występujący w drogach oddechowych śluz i komórki śluzowe identyfikowano na podstawie wyników barwienia błękitem metylenowym, mucykarminem, błękitem toluidynowym i błękitem Alcian.

Stopień okluzji dróg oddechowych oceniano na podstawie półilościowej oceny, obejmującej punktację w skali 0 do 5+. Dla każdej myszy, zgodnie z protokołem doświadczenia, stosując ocenę na ślepo, oceniano 10 losowo wybranych skrawków dróg oddechowych, pobranych z lewego płuca do analizy morfologicznej okluzji śluzem. Każdy z badanych skrawków dróg oddechowych oceniany był w skali punktowej pod kątem okluzji średnicy dróg oddechowych przez śluz, na podstawie następujących kryteriów: 0, brak śluzu; 1+, -10% okluzja; 2+, -30% okluzja; 3+, -50% okluzja; 4+, -80% okluzja oraz 5+, -90-100% okluzja.

PL 203 758 B1

Wyniki

Mikrografia świetlna tkanek płucnych pochodzących z poddanych prowokacji alergenem myszy

W przypadku zwierząt poddawanych immunizacji za pomocą OVA przez okres ponad 6 miesięcy, a następnie wielokrotnie poddawanych prowokacji OVA obserwowano poważne zmiany strukturalne płuc, zbieżne z przewlekłą astmą u ludzi. Odnotowano nadzwyczaj wysoki poziom nacieku komórek zapalnych, związany z zewnętrzną częścią graniczną blaszki podstawnej dróg oddechowych (patrz, Fig. 11C). Liczba komórek zapalnych wokół dróg oddechowych i naczyń krwionośnych uległa silnej redukcji na skutek podawania zwierzętom w okresie 16 dni 8 dawek HK-X oraz podania HK-X 30 min. przed prowokacją alergenem (patrz, Fig. 11A) i wynik ten był podobny do obserwowanego dla myszy, którym podawano fizjologiczny roztwór soli (patrz, Fig. 11B).

Myszy immunizowane OVA charakteryzowały się podwyższonym poziomem akumulacji kolagenu (kolor niebieski) wokół naczyń i dróg oddechowych (patrz, Fig. 12C). Jednakże, wykazano, że w płucach leczonych HK-X uległ redukcji poziom złogów kolagenu (patrz, Fig. 12A). W przypadku myszy kontrolnych, którym podawano HK-X w fizjologicznym roztworze soli, tkanka płucna pozbawiona była komórek zapalnych oraz związanych ze zwłóknieniem złogów kolagenu (patrz, Fig. 12B).

Podobny obraz obserwowano gdy zastosowano Alcian o pH 2,3 do uwidocznienia komórek zawierających śluz. Odnotowano wysoki udział komórek nabłonka zawierających ziarna śluzu u immunizowanych OVA myszy, (patrz, Fig. 13C). Natomiast, leczenie za pomocą HK-X powodowało silną redukcję liczby komórek zawierających śluz, obecnych w drogach oddechowych (patrz, Fig. 13A). W istocie, częstotliwość występowania komórek tych komórek nie różniła się od częstotliwości odnotowanej dla myszy kontrolnych lub myszy nie poddanych immunizacji, otrzymujących fizjologiczny roztwór soli zawierający HK-X (patrz, Fig. 13B).

Wpływ działania HK-X na rekrutację granulocytów kwasochłonnych i granulocytów obojętnochłonnych do płuc

Na Figurze 14 przedstawiono wpływ leczenia za pomocą HK-X na rekrutację granulocytów kwasochłonnych i granulocytów obojętnochłonnych do płuc. Wstępne leczenie za pomocą HK-X powodowało 70% redukcję ilości naciekających granulocytów kwasochłonnych i 30% redukcję liczby naciekających granulocytów obojętnochłonnych w tkance płucnej myszy immunizowanych za pomocą OVA. Średnia ilość granulocytów kwasochłonnych, odnotowana dla płuc poddanych działaniu fizjologicznego roztworu soli, wynosiła 0,3 ± 0,1 komórek na 2,200 μm². Leczenie za pomocą HK-X w fizjologicznym roztworze soli spowodowało, natomiast, niewielki wzrost ilości granulocytów kwasochłonnych w tkankach płuc 0,75 ± 0,18 komórek na 2,200 μm². Natomiast leczenie za pomocą HK-X znacznie zredukowało całkowity naciek komórek zapalnych, występujący w drogach oddechowych i naczyniach krwionośnych (Fig. 15).

Zredukowane procesu gromadzenia śluzu w płucach w wyniku leczenia za pomocą HK-X

Za pomocą oceny punktowej określano ilość czopów śluzowych dróg oddechowych oraz liczbę komórek śluzowych dróg oddechowych po donosowej prowokacji alergenem przez 3 kolejne dni.

Ilość czopów śluzowych dróg oddechowych oceniana była w skali 0 - 5, zgodnie z opisem zawartym w Metodyce. Liczbę komórek śluzowych określono pół-ilościowo, zgodnie z opisem zawartym w Przykładzie 1. W grupie, której podawano fizjologiczny roztwór soli średnia ilość punktów odpowiadająca akumulacji śluzu w drogach oddechowych wynosiła 0,1 ± 0,05 (patrz, Fig. 16). W przypadku grupy, poddawanej prowokacji OVA, ilość tych punktów wzrosła 23,3-krotnie, do punktacji 2,33 ± 0,17 (grupa otrzymująca fizjologiczny roztwór soli vs. Grupa otrzymująca OVA, p < 0,001; określono na podstawie testu Mann Whitney Rank Sum Test). W wyniku podawania HK-X, 15-30 min przed prowokacją OVA, ilość punktów określających obecność czopów śluzowych dróg oddechowych lub stopień okluzji dróg oddechowych została zredukowana o 78%, (p < 0,001; w teście Mann Whitney Rank Sum Test). Podobnie, uległa redukcji liczba komórek śluzowych dróg oddechowych (patrz, Fig. 17). Szczególnie, w przypadku płuc poddanych prowokacji OVA, lecz nie leczonych HK-X, 34,66 ± 6,45% komórek nabłonka uległo procesowi różnicowania, prowadzącego do wydzielania śluzu, podczas gdy w przypadku płuc leczonych za pomocą HK-X jedynie 11,24 ± 4,73% komórek zawierało śluz (p < 0,001; w teście Mann Whitney Rank Sum Test).

Poziom tworzenia ziarniniako-podobnych struktur w płucu w stanie przewlekłej astmy

Tworzenie ziarniniaka określano w płucach prowokowanych wielokrotnie za pomocą OVA i HK-X lub jedynie OVA u zwierząt immunizowanych za pomocą OVA przez 6 miesięcy. Jak przedstawiono na Figurze 18, leczenie HK-X zredukowało trzykrotnie tworzenie ziarniniaka w płucach (p < 0,001; w teście Mann Whitney Rank Sum Test).

PL 203 758 B1

Badania zaplanowano w celu określenia czy podawanie HK-X powoduje zredukowanie stanu zapalnego dróg oddechowych i nadczynności komórek śluzowych w modelu mysim indukowanej alergenem przewlekłej astmy. W modelu tym myszy uwrażliwiano na OVA, a następnie, co tydzień poddawano donosowej prowokacji OVA przez 3 kolejne dni. Taka immunizacja alergenem i schemat prowokacji prowadziły do przewlekłego nacieku dróg oddechowych przez granulocyty kwasochłonne i inne typy komórek zapalnych, gromadzenia ś luzu w drogach oddechowych i zwię kszenia liczby komórek wydzielających śluz.

Następnie, w modelu tym, w wyniku podawania HK-X nastąpiła redukcja nadmiernego wydzielania przez drogi oddechowe, zwiększonej liczby komórek śluzowych oraz rekrutacji granulocytów kwasochłonnych i granulocytów obojętnochłonnych. Wyniki te wskazują, że HK-X odgrywa istotną rolę zarówno w ograniczeniu nadmiernego wydzielania śluzu w drogach oddechowych, jak i w redukcji późnego etapu stanu zapalnego, występującego w indukowanym obecnością alergenu modelu przewlekłej astmy. Wywołane przez HK-X złagodzenie stanu zapalnego płuc i ograniczenie wydzielania śluzu i różnicowania się komórek śluzowych wskazuje na to, że HK-X będzie skuteczny w leczeniu przewlekłej astmy u ludzi.

Wynalazek został szczegółowo opisany w odniesieniu do jego korzystnych realizacji. Jednakże, biorąc pod uwagę niniejszy opis i rysunki, specjalista może dokonać modyfikacji oraz udoskonaleń, pozostających w zgodzie z myślą przewodnią i zakresem wynalazku.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Zastosowanie peptydu o wzorze f-Met-Leu-X, w którym X wybrany jest z grupy składającej się z Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe i Phe-Tyr, lub jego soli, w dawce skutecznej przeciwko zwł óknieniu, do wytwarzania leku do leczenia zwłóknienia płuc u ssaka.