JP2003504412A - ＩｇＥをダウンレギュレーションするための小ペプチドおよび方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ＩｇＥレベルをダウンレギュレーションするための方法が記載される。この方法は、ＩｇＥをダウンレギュレーションするのに効果的な量の、式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択される）を有するペプチドを患者に投与することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （発明の分野） 本発明は、ＩｇＥのダウンレギュレーション活性を有する小ペプチド（特に、
Ｎ−ホルミル−メチオニルペプチド）に関し、そしてＩｇＥ媒介応答から生じる
適応症を処置するための方法に関する。より詳細には、本発明のペプチドは、コ
ルチコステロイドが使用されている適用のいずれかにおいてコルチコステロイド
の代用として使用することができる。

【０００２】 （発明の背景） 免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）は、ヒトに存在する５種類の抗体クラスの１つで
あり、そして免疫グロブリンＥはアレルギー反応を引き起こす免疫グロブリンで
あることが３０年以上も前から知られている。ＩｇＥは、抗原が侵入したときに
Ｂ細胞により産生され、そして分泌される。しかし、ＩｇＥは、ヒト血清におい
て抗体全体の小さい割合（ＩｇＧの１０ｍｇ／ｍｌと比較して５０〜３００ｎｇ
／ｍｌ）を構成するにすぎず、従って、抗原を直接中和するのに十分な量で存在
していない。その代わり、その作用は細胞の標的受容体によって増幅され、そし
て抗原に対する広範囲の細胞応答を誘発し、それにより、炎症、かゆみ、咳、流
涙、気管支収縮、粘液分泌、嘔吐および下痢をもたらす。これらのすべての症状
は、一般に、アレルギー性疾患に関連している。

【０００３】 即時的な過敏性反応は、マスト細胞および好塩基球に見出される高親和性Ｉｇ
Ｅ受容体（Ｆｃ_εＲＩ）によって開始される。Ｆｃ_εＲＩに結合したＩｇＥに対
してアレルゲンが結合することにより、受容体分子の架橋が細胞膜上で引き起こ
される。これにより、細胞の脱顆粒が開始され、そしてアレルギー応答の即時期
に関連する様々なヒスタミンおよび他の媒介因子のその後の放出が開始される。
マスト細胞脱顆粒のこれらの産生物は炎症性細胞の活性化を引き起こし、さらに
、ＣＤ２３としても知られている低親和性のＩｇＥ受容体（Ｆｃ_εＲＩＩ）を誘
導する。Ｆｃ_εＲＩＩは、活性化されたＢ細胞；様々な炎症性細胞（マクロファ
ージ、好酸球、血小板、ナチュラルキラー細胞）、Ｔ細胞、濾胞樹状細胞（ＦＤ
Ｃ）、骨髄および胸腺のランゲルハンス細胞および上皮細胞に見出され得る（Ｄ
ｅｌｅｓｐｅｓｓｅ他、Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎ．４９：１４９〜１９０、１９９１
；Ｄｅｌｅｓｐｅｓｓｅ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１２５：７８〜９７、１
９９２）。Ｂ細胞の表面において、Ｆｃ_εＲＩＩは、Ｔ細胞に対するＩｇＥ依存
的な抗原提示における役割を果たし、そしてＢ細胞を架橋することにおける役割
もまた果たしている。ＦＤＣ上において、Ｆｃ_εＲＩＩは大量に発現し、従って
、リンパ節および脾臓における二次濾胞の胚中心へのＢ細胞の動員に関与してい
る。Ｆｃ_εＲＩＩが炎症性細胞に発現した場合、Ｆｃ_εＲＩＩは、単球による免
疫複合体の食作用などのＩｇＥに依存した細胞傷害的活性を生じさせると考えら
れている。可溶性のＦｃ_εＲＩＩ（ｓＦｃ_εＲＩＩ）もまた、形質細胞、Ｔ細胞
および好塩基球の前駆体の成長および分化を開始させることによって、ホルモン
および細胞により媒介される免疫応答を開始させることができる。

【０００４】 Ｂ細胞のＩｇＥ分泌形質細胞への分化は、リンパ節および脾臓における二次濾
胞の胚中心において主として生じていると考えられる、様々なサイトカインおよ
び表面分子の複雑なシグナル伝達カスケードを伴う。表面分子は、ＩｇＥの産生
を開始させるために必要な、Ｂ細胞とＴ細胞およびマスト細胞との物理的な相互
作用を生じさせるために必須である。これらの表面分子は、ＣＤ４０リガンド（
ＣＤ４０Ｌ）およびＦｃ_εＲＩＩである。２型Ｔヘルパー細胞（Ｔｈ_２）が抗原
提示細胞（ＡＰＣ）にさらされたときに活性化された場合、２型Ｔヘルパー細胞
はＣＤ４０Ｌを一時的に発現する。ＣＤ４０ＬはＢ細胞上のＣＤ４０と相互作用
し、この結果、Ｂ細胞が活性化される。活性化されたＴｈ_２細胞は、ＩＬ−４お
よびＩＬ−１３などの様々なサイトカインを分泌し、これらのサイトカインが活
性化されたＢ細胞に作用して、ＩｇＥ産生に切り替える。さらに、ＩＬ−４がＢ
細胞および炎症性細胞におけるＦｃ_εＲＩＩ発現をアップレギュレーションし、
これにより接触刺激および可溶性増殖因子のさらなる供給源がもたらされる。

【０００５】 マスト細胞および好塩基球もまたＩＬ−４を分泌し、ＣＤ４０Ｌを発現し、従
って、ＩＬ−４の存在下でＢ細胞と物理的に相互作用したときにＢ細胞によるＩ
ｇＥ合成を、Ｔｈ_２細胞と同様な様式で誘導し得る。ＩｇＥ産生に関与する様々
なタイプの細胞の組織分布を考慮すれば、ＩｇＥ合成は、皮膚、肺および腸にお
いても生じ得ることが考えられる。

【０００６】 ＩｇＥ合成のアップレギュレーションおよびアポトーシスからの胚中心Ｂ細胞
の救援が、Ｂ細胞の膜に結合したＩｇＥおよび補体受容体２（ＣＲ２）（これは
またＣＤ２１とも呼ばれている）をｓＦＣ_εＲＩＩにより架橋することによって
媒介される。ＣＲ２は、Ｂ細胞、ＦＤＣならびにいくつかのＴ細胞および好塩基
球に見出される高度にグリコシル化された膜タンパク質である。ｓＦＣ_εＲＩＩ
は、Ｂ細胞上のＣＲ２を始動させて、ＩｇＥ合成を高めることによってＩｇＥ合
成の正のフィードバック制御に関与することができ、同時に、ＩｇＥで感作され
たＢ細胞の生存をも促進することができる。

【０００７】 ＩｇＥ産生の活性化は２つの異なる状況をもたらし得る。アレルゲンにされさ
れたことによる急性の炎症が、ヒスタミン類、エイコサノイド類、血小板活性化
因子、酸素フリーラジカル、神経ペプチドおよびサイトカイン類を含む前炎症性
媒介因子を放出するマスト細胞、気道マクロファージおよび気管支上皮細胞の迅
速な活性化を伴う初期反応とともに開始される。これらの媒介因子は、気道平滑
筋の収縮、粘液の分泌および血管拡張を誘導し得る。気道の炎症は、微小血管か
らの漏出を増大させ、気道への血漿滲出をもたらす。気道壁の厚壁化および気道
内腔の狭小化が生じる。

【０００８】 後期反応において、末梢血液細胞が気道内に動員され、慢性型の炎症が確立さ
れる。そのような細胞には、好酸球、リンパ球および単球が含まれ、動員は、Ｉ
Ｌ−５および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣ−ＳＦ）などのサ
イトカインに依存している。ＲＡＮＴＥＳおよびエオタキシンなどのケモカイン
もまた好酸球の動員を増強すると考えられる。炎症部位において、これらの細胞
が活性化され、そしてそれらの生存が、ＧＭＣ−ＳＦなどの因子により媒介され
る低下したアポトーシスによって増大する。

【０００９】 喘息に対する処置は、従来は疾患の重症度および持続性に基づいている。急性
の断続的な症状の場合、処置は、一般に、気管支拡張剤を伴う。気管支拡張剤に
は、β−アドレナリン作動性アゴニスト、メチルキサンチン類および抗コリン作
動薬が含まれる。これらの薬剤は、喘息患者の気道閉塞を改善し得るが、気道の
炎症または気管支の反応亢進性を低下させることにおいては効果的でないようで
ある。より近年には、ロイコトリエン阻害剤が、軽度〜中程度の喘息を処置する
ために利用できるようになっている。様々なロイコトリエンが５−リポキシゲナ
ーゼ代謝経路によってアラキドン酸から生成し、そしてこれらは強力な気管支収
縮性を有することが以前から知られている。アナフィラキシーのこれらのいわゆ
る遅速反応性物質（「ＳＲＳ−Ａ」）もまた、様々な白血球の血管への遊走、接
着および凝集を誘導し、肺における毛細管透過性、間質性水腫の形成、白血球の
走化性、粘液産生、粘膜線毛の機能不全、および気管支痙攣を増大させる。特に
、ロイコトリエンＤ_４（ＬＴＤ_４）が、気道でのこの活性に主に関わっているよ
うであり、気道の平滑筋細胞における特定の受容体を介して作用している。シス
テイニルロイコトリエン類を含む様々なロイコトリエンが、ＩｇＥによって媒介
されるマスト細胞の脱顆粒のときに放出される。

【００１０】 ロイコトリエン阻害剤は２つのクラスから構成される：１つは、ロイコトリエ
ンの合成に必要な５−リポキシゲナーゼ（５−ＬＯ）の活性を阻害することによ
ってロイコトリエン類の合成を阻止する阻害剤であり、もう１つは、平滑筋細胞
におけるＬＴＤ_４受容体を競合的に阻止する阻害剤である。ジロイチン（ｚｉｌ
ｅｕｔｉｎ）は、利用可能になった最初の５−ＬＯ阻害剤である。ザフィルルカ
スト（ｚａｆｉｒｌｕｋａｓｔ）は、承認されようとしている最初のＬＴＤ_４受
容体アンタゴニスであり、同時にモネルカスト（ｍｏｎｅｌｕｋａｓｔ）および
プランルカスト（ｐｒａｎｌｕｋａｓｔ）などの他の阻害剤が現在臨床試験中で
ある。これらのロイコトリエン阻害剤は、これまでのところ軽度の持続性喘息を
処置するために使用されているが、より重症な形態の喘息には有効性が未だ証明
されていない。

【００１１】 抗炎症剤が、現在、より重症で持続性の形態の喘息を処置するために用いられ
ている。抗炎症剤として分類される薬剤には、テオフィリン、様々なコルチコス
テロイド、クロモリンナトリウムおよびネドクロミルナトリウムが含まれる。特
に、コルチコステロイドは、気管支の亢進性反応性および重症な悪化状態を低下
させることにおいてより効果的であると考えられる。コルチコステロイドは、好
酸球の動員を抑制することによって、サイトカインおよびケモカインの産生を阻
害することによって、そして好酸球のアポトーシスを誘導することによって作用
する。コルチコステロイドはまた、気道の水腫および気管支漏を妨げるように作
用し、従って、吸入コルチコステロイドは、慢性の喘息患者に対する最も一般的
な処置である。吸入コルチコステロイドには、ベクロメタゾン、フルニソリド、
トリアムシノロン、フルチカゾンおよびブデソニドが含まれる。慢性的な喘息の
場合、β_２−アゴニストが気管支の閉塞を一時的に改善し得る場合を除き、β_２ −アゴニストは効果的でない。従って、最適な処置は、吸入コルチコステロイド
および長期間作用するβ_２−アゴニストの両方を組み合わせることであり得る。
しかし、コルチコステロイドの潜在的な副作用には、口腔咽頭カンジダ症、発声
障害、副腎抑制、小児における生育遅延、皮膚の薄化、骨粗鬆症、緑内障および
白内障が含まれる。さらに、これらのコルチコステロイドの「有効対毒性」用量
の関係は、現時点では不明である。

【００１２】 ＩｇＥシグナル伝達経路の下流の事象を標的化することに加えて、いくつかの
新しい治療方法が、ＩｇＥおよびその合成に直接介入するために開発されつつあ
る。アレルギー反応を導く複雑なネットワークにおいてＩｇＥが果たす中心的な
位置により、ＩｇＥを除くか、または受容体に対するＩｇＥの結合を阻止するこ
とを標的とする治療は、実際にはアレルギー応答を完全に妨げることが示唆され
る。依然としてその初期段階にあるが、ある程度の成功が、ＩｇＥに対するモノ
クローナル抗体を使用することによって示されている。Ｆａｈｙ他（Ａｍ．Ｊ．
Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ ｍｅｄ．１５５：１８２８〜１８３４、１
９９７）は、ＩｇＥに対して開発されたヒト化ネズミモノクローナル抗体は遊離
のＩｇＥを低下させ、そしてアレルゲン刺激に対する初期応答および後期応答の
両方を阻止することに成功したことを報告している。Ｆｃ_εＲＩに対する結合に
必要なＩｇＥの一部の領域を標的とする抗ＩｇＥ抗体は、ＩｇＥがその受容体に
結合することを阻止するだけでなく、好塩基球およびマスト細胞においてＦｃ_ε ＲＩに結合したＩｇＥが架橋されることにより誘導されるマスト細胞の脱顆粒お
よびアナフィラキシーをも妨げる。２つのそのような抗ＩｇＥ抗体が現在試験中
である（ＭａｃＧｌａｓｈａｎ他、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１４３８〜１
４４５、１９９７；Ｃｏｒｎｅ他、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：８７９
〜８８７、１９９７）。今までのところ、それらは血清中のＩｇＥ濃度を低下さ
せ、そしてまた好塩基球におけるＦｃ_εＲＩのレベルを低下させているようであ
る。このことは、ＩｇＥに依存する応答を、循環しているＩｇＥのレベルを調節
することによって変化させることができることを示唆している。

【００１３】 今までの処置は、典型的には、ＩｇＥの活性化から生じる下流の事象に集中し
ている。従って、ＩｇＥによって媒介される応答を処置するために、ＩｇＥレベ
ルを調節する処置を開発することが望ましい。Ｎ−ホルミル−メチオニル−ロイ
シル−フェニルアラニンおよびペプスタチンなどの走化性ペプチドがマスト細胞
の脱顆粒を阻害することが報告されている（Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ、第５巻
第１号、１３頁〜１６頁、１９８１）。本発明のペプチドは、ＩｇＥレベルをダ
ウンレギュレーションし、従って、様々なＩｇＥ媒介応答を調節するために使用
することができる。

【００１４】 （発明の開示） 本発明は、ＩｇＥダウンレギュレーション活性を有するＮ−ホルミル−メチオ
ニル−ロイシル（「ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ」）ペプチドを好適な薬理学的キャリア
中に含有する薬学的組成物を使用して、ＩｇＥ媒介応答から生じる様々な適応症
を処置するための方法を提供する。特に有用なペプチドは、式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅ
ｕ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−
Ｔｙｒからなる群から選択される）を有するペプチドである。本発明のペプチド
は、コルチコステロイドが使用されている適用のいずれかにおいてコルチコステ
ロイドの代用として使用することができる。

【００１５】 本発明により、哺乳動物におけるＩｇＥ媒介応答を処置するための方法は、Ｉ
ｇＥをダウンレギュレーションするのに効果的な量の、式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−
Ｘ（式中、Ｘは、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙ
ｒからなる群から選択される）を有するペプチドを哺乳動物に投与することを含
む。

【００１６】 本発明はまた、ＩｇＥに対する膜結合型受容体または可溶性受容体をダウンレ
ギュレーションするための方法を提供する。この方法は、ＩｇＥ受容体をダウン
レギュレーションするのに効果的な量の、式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中、Ｘ
は、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群
から選択される）を有するペプチドを患者に投与することを含む。

【００１７】 本発明はさらに、形質細胞によるＩｇＥ分泌を阻害するための方法を提供する
。この方法は、ＩｇＥ分泌を阻害するのに効果的な量の、式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ
−Ｘ（式中、Ｘは、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔ
ｙｒからなる群から選択される）を有するペプチドを患者に投与することを含む
。

【００１８】 別の実施形態により、本発明は、ＣＤ４０Ｌの発現をダウンレギュレーション
するための方法を提供する。この方法は、ＣＤ４０Ｌをダウンレギュレーション
するのに効果的な量の、式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｔｙｒ、Ｔｙ
ｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択される）
を有するペプチドを患者に投与することを含む。

【００１９】 本発明のいくつかの好ましい実施形態において、患者は、本発明のペプチドを
もう１つの有効成分と組み合わせて投与することによって利益を受けることがで
きる。本発明によるそのような組合せに対する特に有用な他の有効成分は、例え
ば、抗ロイコトリエン剤、β_２−アゴニストおよびコルチコステロイドなどであ
る。

【００２０】 （図面の簡単な説明） 図１は、急性喘息マウスにおけるＯＶＡ特異的な血清ＩｇＥレベルに対するＨ
Ｋ−Ｘの様々な投薬量の効果を例示する対数用量応答曲線である。

【００２１】 図２は、５０μｇのＨＫ−Ｘが投与された急性喘息マウスに由来する肺切片を
示す。限定された細胞浸潤が（Ａ）および（Ｂ）に存在し、限定された粘液蓄積
が（Ｃ）に存在した。

【００２２】 図３は、１０μｇのＨＫ−Ｘが投与された急性喘息マウスに由来する肺切片を
示す。非常に少数の細胞が気道に結合し（Ａ）および（Ｂ）、粘液は気道上皮細
胞層（Ｃ）の表面に限定されていた。

【００２３】 図４は、１μｇのＨＫ−Ｘが投与された急性喘息マウスに由来する肺切片を示
す。治療効果は、細胞浸潤の増大（Ａ）、および気道への粘液分泌の増大（Ｂ）
および（Ｃ）により損なわれた。

【００２４】 図５は、生理食塩水（Ａ）またはビヒクル（０．０５％ＤＭＳＯ）（Ｂ）のい
ずれかで抗原刺激されたＯＶＡ免疫化マウスに由来する肺切片を示す。粘液分泌
は気道で検出されなかった（Ｃ）。

【００２５】 図６は、慢性喘息マウスモデルを確立する際に使用された免疫化および処置法
の概略図である。

【００２６】 図７は、慢性喘息マウスの肺における肉芽腫の数を例示するヒストグラムであ
る。

【００２７】 図８は、６ヶ月にわたってＯＶＡで毎週免疫化され、そしてＨＫ−Ｘまたは生
理食塩水のいずれかで処置されたマウスに由来する慢性的な喘息マウスの肺切片
の組織学を示す。（Ａ）はコントロールマウスの肺組織学を示し、（Ｂ）は、Ｈ
Ｋ−Ｘで処置されたマウスの組織学を示し、（Ｃ）は、ＯＶＡで抗原刺激された
未処置マウスの組織学を示す。

【００２８】 図９は、コラーゲンフィブリルの慢性的な喘息のマウス肺組織蓄積の光学顕微
鏡写真を示す。（Ａ）は、生理食塩水が投与されたコントロールマウスの肺切片
を示し、（Ｂ）は、ＨＫ−Ｘで処置されたマウスの肺切片を示し、（Ｃ）は、Ｏ
ＶＡで抗原刺激された未処置マウスの肺切片を示す。

【００２９】 図１０は、ＯＶＡで慢性的に免疫化され、かつ生理食塩水で処置されたマウス
の肺切片を示す。

【００３０】 図１１は、ＯＶＡで慢性的に免疫化され、かつビヒクル（０．５％ＤＭＳＯ）
で処置されたマウスの肺切片を示す。

【００３１】 図１２は、慢性喘息における組織形態測定を例示するヒストグラムである。

【００３２】 図１３は、様々な処置の後における慢性喘息マウスの気道における粘液含有細
胞の頻度を例示するヒストグラムである。

【００３３】 図１４は、慢性喘息マウスの肺における好酸球および好塩基球の浸潤に対する
様々な処置の効果を例示するヒストグラムである。

【００３４】 図１５は、急性喘息マウスモデルにおけるＨＫ−Ｘおよびデキサメタゾンによ
る免疫化および処置プロトコルの概略図である。

【００３５】 図１６は、ＯＶＡ特異的なＩｇＥレベルに対するデキサメタゾンおよびＨＫ−
Ｘの鼻内投与の効果を比較するヒストグラムである。

【００３６】 図１７は、急性喘息マウスモデルにおけるＨＫ−Ｘおよび対照ペプチドよる免
疫化および処置プロトコルの概略図である。

【００３７】 （発明の詳細な説明） 本発明により、式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐ
ｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択される）を有す
るいくつかの小ペプチドが、ＩｇＥのレベルをダウンレギュレーションすること
に関して驚くべき活性を有していることが見出された。その結果、そのようなペ
プチドは、ＩｇＥ媒介応答から生じる様々な適応症を処置するために有用である
。本発明のペプチドは、コルチコステロイドが使用されている適用のいずれかに
おいてコルチコステロイドの代用として使用することができる。

【００３８】 好ましいペプチドは、本発明により、血中ＩｇＥレベルを低下させ、そして例
えば、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、ＴＮＦなどのリンパ球のＩｇＥ
活性化を阻止する。

【００３９】 好ましい実施形態において、本発明のペプチドによる処置の後では、持続した
マスト細胞の脱顆粒、およびロイコトリエン類、ヒスタミン類および他のサイト
カイン類のその放出もまた低下するか、または完全に停止させられる。本発明の
好ましい実施形態により、ペプチドはまた、好酸球、好塩基球および好中球の炎
症組織への浸潤を低下させることができる。リンパ球、好酸球および好中球は、
本発明の好ましいペプチドに応答して走化性を示さない。その結果、リンパ球、
好酸球および好中球の炎症部位への走化的な接着、遊走および凝集が、炎症部位
における血管透過性が低下するように著しく低下する。さらに、本発明の好まし
い化合物は、心臓、肝臓および肺などの生命に必要な器官に対する毒性を示さな
い。

【００４０】 本発明のペプチドは、従来の小ペプチド化学技術によって調製することができ
る。ペプチドが投与のために使用される場合、ペプチドは、薬学的に受容可能な
キャリアまたは希釈剤を用いて無菌条件のもとで調製される。

【００４１】 薬学的組成物は、好都合には、単位投薬形態で提供されてもよく、そして処置
され得るＩｇＥ媒介応答から生じるそれぞれのタイプの適応症に対して調製され
得る。組成物は、薬学の分野でよく知られている方法のいずれかによって調製さ
れ得る。方法は、典型的には、本発明の有効成分を、１つまたは２つ以上の補助
成分を構成するキャリアと一緒にする工程を含む。

【００４２】 例えば、薬学的組成物の用量は、対象者、処置すべき適応症のタイプに依存し
て、そして使用される特定の投与経路に依存して変化する。活性なペプチドの投
薬量は、急性のＩｇＥ媒介応答を処置する場合には、１日あたり０．１μｇ／ｋ
ｇ〜１００，０００μｇ／ｋｇであり、より好ましくは１μｇ／ｋｇ〜１０，０
００μｇ／ｋｇであり得る。最も好ましい投薬量は、約１μｇ／ｋｇ体重〜１０
０μｇ／ｋｇ体重の範囲であり、より好ましくは約１μｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋ
ｇの範囲であり、最も好ましくは１０μｇ／ｋｇ〜２０μｇ／ｋｇの範囲である
。活性なペプチドの投薬量は、慢性のＩｇＥ媒介応答を処置する場合には、１日
あたり０．１μｇ／ｋｇ〜１００，０００μｇ／ｋｇであり、より好ましくは１
μｇ／ｋｇ〜１０，０００μｇ／ｋｇであり得る。最も好ましい投薬量は、約１
μｇ／ｋｇ体重〜１０００μｇ／ｋｇ体重の範囲であり、より好ましくは約１μ
ｇ／ｋｇ〜１００μｇ／ｋｇの範囲であり、最も好ましくは５０μｇ／ｋｇ〜７
０μｇ／ｋｇの範囲である。投薬は、状態の重篤度に依存して、典型的には、１
日に１回から、４時間〜６時間毎に行われる。急性状態の場合には、ペプチドを
４時間〜６時間毎に投与することが好ましい。維持する場合には、１日に１回ま
たは２回だけ投与することが好ましいと考えられる。好ましくは、約０．１８ｍ
ｇ〜約１６ｍｇのペプチドが、投与経路および状態の重篤度に依存して、１日あ
たり投与される。特定の組成物の多回用量を送達するために所望される時間間隔
は、日常的にすぎない実験を用いて当業者によって決定され得る。

【００４３】 投与経路には、経口的、非経口的、直腸的、膣内、局所的、鼻的、眼的、直接
的な注射などが含まれる。好ましい実施形態において、本発明のペプチドは、Ｉ
ｇＥをダウンレギュレーションするのに効果的な量で患者に投与される。例示的
な薬学的組成は、ＩｇＥをダウンレギュレーションする効果をもたらす本発明に
よるペプチドのＩｇＥ調節有効量である。これは、典型的には薬学的に受容可能
なキャリアに含まれる。

【００４４】 本明細書中で使用され、そしてより詳しくは下記に記載されている用語「薬学
的に受容可能なキャリア」には、ヒトまたは他の動物への投与に好適な、１つま
たは２つ以上の適合し得る固体または液体の賦形希釈剤またはカプセル化物質が
含まれる。従って、本発明において、用語「キャリア」は、適用を容易にするた
めに本発明の分子が一緒にされる有機成分または無機成分（天然物または合成物
）を意味する。用語「ＩｇＥ調節有効量（ＩｇＥ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ−ｅｆ
ｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ」は、ＩｇＥをダウンレギュレーションする効果
を処置されている特定の状態に対して生じさせる本発明の薬学的組成物のそのよ
うな量である。様々な濃度を、処置される患者の年齢、状態の重篤度、処置の継
続期間および投与様式における変動に備えるために、同じ成分が配合されている
組成物を調製する際に使用することができる。

【００４５】 キャリアはまた相容性でなければならない。本明細書中で使用されている用語
「相容性」は、所望する薬学的効力を実質的に損なわないような様式で、薬学的
組成物の構成成分が、本発明の小ペプチドと、そして相互に混合し得ることを意
味する。

【００４６】 本発明の小ペプチドは、典型的には、それ自体（そのまま）で投与される。し
かし、本発明の小ペプチドは、薬学的に受容可能な塩の形態で投与することがで
きる。そのような薬学的に受容可能な塩には、下記の酸から調製される塩が含ま
れるが、そのような塩に限定されない：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸
、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、クエン酸
、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナフタレン−２−スルホン酸
およびベンゼンスルホン酸。また、薬学的に受容可能な塩は、カルボン酸基のナ
トリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などのアルカリ金属塩またはアルカ
リ土類金属塩として調製することができる。従って、本発明は、本発明のペプチ
ドを、１つまたは２つ以上のその薬学的に受容可能なキャリアおよび必要に応じ
て任意の他の治療成分とともに含む薬学組成物を医学的使用のために提供する。

【００４７】 組成物には、経口投与、直腸投与、膣内投与、局所投与、鼻投与、眼投与また
は非経口投与に好適なものが含まれる。これらの経路はすべて、本発明の材料を
使用する投与経路として使用することができる。本発明のペプチドを含有する薬
学的組成物はまた、１つまたは２つ以上の薬学的に受容可能なキャリアを含有す
ることができる。このようなキャリアには、安定化剤（長期間の貯蔵を促進する
）、乳化剤、結合剤、増粘剤、塩、保存剤、溶媒、分散媒体、コーティング剤、
抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などの賦形剤が含まれ得る。薬
学的に活性な物質に対するそのような媒体および薬剤の使用は、当業者に十分に
知られている。何らかの従来的な媒体または薬剤が本発明のペプチドとの相容性
を有しない場合を除いて、薬学的調製物におけるその使用は本明細書中において
考えられる。補助的な有効成分もまた、本発明の組成物に配合することができる
。

【００４８】 経口投与に好適な組成物は、典型的には、吸入エアロゾル、噴霧剤、シロップ
または錠剤として調製される。局所投与に好適な組成物は、典型的には、クリー
ム、軟膏または溶液として調製される。急性のＩｇＥ媒介応答を処置する場合、
そのような組成物におけるペプチド有効成分の濃度は、典型的には１０００μｇ
／ｍｌ未満であり、より好ましくは５００μｇ／ｍｌ未満であり、最も好ましく
は約２００μｇ／ｍｌ〜４００μｇ／ｍｌである。慢性のＩｇＥ媒介応答を処置
する場合、そのような組成物におけるペプチド有効成分の濃度は、典型的には３
ｍｇ／ｍｌ未満であり、より好ましくは２ｍｇ／ｍｌ未満であり、最も好ましく
は約１ｍｇ／ｍｌ〜１．５ｍｇ／ｍｌである。

【００４９】 吸入投与に好適な本発明の組成物は、例えば、エアロゾル剤または吸入溶液剤
として調製され得る。急性のＩｇＥ媒介応答を処置するための典型的なエアロゾ
ル組成物の一例は、用量あたり、トリクロロ−モノフルオロメタンおよびジクロ
ロジフルオロメタン＋オレイン酸の混合物に懸濁された約０．１μｇ〜１００μ
ｇの微結晶性ペプチドから構成される。組成物における微結晶性ペプチドのより
好ましい量は１μｇ〜５０μｇであり、最も好ましくは、エアロゾル組成物の用
量あたり１０μｇ〜２０μｇである。慢性のＩｇＥ媒介応答を処置するための典
型的なエアロゾル組成物の一例は、用量あたり、トリクロロ−モノフルオロメタ
ンおよびジクロロジフルオロメタン＋オレイン酸の混合物に懸濁された約０．１
μｇ〜１０００μｇの微結晶性ペプチドから構成される。組成物における微結晶
性ペプチドのより好ましい量は１μｇ〜１００μｇであり、最も好ましくは、エ
アロゾル組成物の用量あたり５０μｇ〜７０μｇである。典型的な溶液剤の一例
は、無菌の生理食塩水（必要に応じて、溶解させるための約５％ｖ／ｖのジメチ
ルスルホキシド（「ＤＭＳＯ」））に溶解または懸濁させたペプチドの所望する
量、ベンザルコニウム塩化物および硫酸（ｐＨ調節用）からなる。

【００５０】 経口投与に好適な本発明の組成物はまた、カプセル剤、サッシェ剤、錠剤また
はトローチ剤などの分離したユニット物として提供され得る。これらはそれぞれ
が、処置されるＩｇＥ媒介応答のタイプに依存して、所定量の本発明のペプチド
を含有する。あるいは、経口投与に好適な本発明の組成物はリポソームに含有さ
れ得るか、または、シロップ、エリキシル剤もしくはエマルション剤などの水性
液体もしくは非水性液体での懸濁物として含有され得る。錠剤配合基剤の例には
、不活性な成分として、トウモロコシデンプン、ラクトースおよびステアリン酸
マグネシウムが含まれる。シロップ配合基剤の例には、クエン酸、着色色素、風
味剤、ヒドロキシルプロピルセルロース、サッカリン、安息香酸ナトリウム、ク
エン酸ナトリウムおよび精製水が含まれる。

【００５１】 非経口投与に好適な組成物は、好都合には、受容者の血液と等張であることが
好ましい本発明の分子の滅菌された水性調製物を含む。この水性調製物は、その
ような好適な分散剤または湿潤化剤および懸濁剤を使用して知られている方法に
従って配合され得る。滅菌された注射可能な調製物はまた、例えば、１，３−ブ
タンジオールにおける溶液のような、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤また
は溶剤における滅菌された注射可能な溶液または懸濁剤であり得る。用いること
ができる受容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル溶液および等張
の塩化ナトリウム溶液が含まれる。水溶液において、約１０％ｖ／ｖまでのＤＭ
ＳＯまたはＴｒａｐｐｓｏｌを、いくつかのペプチドの溶解性を維持するために
使用することができる。また、滅菌された不揮発性油を、好都合には、溶媒また
は懸濁媒体として用いることができる。この目的のために、合成モノグリセリド
または合成ジグリセリドを含む多数の不揮発性油を使用することができる。さら
に、脂肪酸（オレイン酸または中性脂肪酸など）を注射剤の調製において使用す
ることができる。さらに、プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ブロックコポリマ
ーを、数週間または数ヶ月の期間にわたって３７℃での固体形態からの時間放出
に基づく複合注入のために４℃で脂質と配合することができる。

【００５２】 局所投与に好適な組成物は、ＴｒａｐｐｓｏｌまたはＤＭＳＯにおけるペプチ
ドの溶液として、あるいはクリーム、軟膏またはローションで提供され得る。典
型的には、約０．１％〜約２．５％の有効成分が基剤またはキャリアに配合され
る。クリーム配合基剤の例には、精製水、ワセリン、ベンジルアルコール、ステ
アリルアルコール、プロピレングリコール、ミリスチン酸イソプロピル、ポリオ
キシル４０ステアラート、カルボマー９３４、ラウリル硫酸ナトリウム、アセタ
ート二ナトリウム、水酸化ナトリウム、および必要に応じてＤＭＳＯが含まれる
。軟膏配合基剤の例には、白色ワセリンおよび必要に応じてミネラルオイル、ソ
ルビタンセスキオレアートならびにＤＭＳＯが含まれる。ローション配合基剤の
例には、カルボマー９４０、プロピレングリコール、ポリソルベート４０、プロ
ピレングリコールステアラート、コレステロールおよび関連するステロール、ミ
リスチン酸イソプロピル、パルミチン酸ソルビタン、アセチルアルコール、トリ
エタノールアミン、アスコルビン酸、シメチコーンならびに精製水が含まれる。

【００５３】 本明細書中に記載されている本発明をより詳しく理解するために、下記の実施
例が示される。これらの実施例は例示目的のためだけであり、本発明を限定する
ものとして決して解釈され得ないことを理解しなければならない。

【００５４】 アレルゲンに特異的な急性肺疾患に対するマウスモデル ヒト疾患の重要な形態学的特徴および生理学的特徴を模倣する喘息のインビボ
マウスモデルが確立されている（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ他、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．
１８４：１４８３〜１４９４、１９９６）。特異的な治療試薬が入手できるため
に、肺の炎症を誘導する前に、その誘導中に、そしてその誘導後に一貫した様式
でマウスモデルのさらなる実験的操作が可能である。

【００５５】 オバルブミン（ＯＶＡ）をモデルアレルゲンとして投与するプロトコルが、正
常なＢａｌｂ／Ｃマウスにおいてアレルゲンに特異的な急性肺疾患を誘導するた
めに開発されている。このプロトコルには、ミョウバンアジュバントにおける１
００μｇのオバルブミン（ＯＶＡ）による１日目および１４日目のマウスの腹腔
内（ｉ．ｐ．）免疫化、ならびに規定生理食塩水における５０μｇ〜１００μｇ
のＯＶＡの１４日目、２５日目、２６日目および２７日目の単回鼻内（ｉ．ｎ．
）投薬が含まれる。コントロールマウスには、ｉ．ｐ．注射によるミョウバンだ
け、そしてｉ．ｎ．投与による規定生理食塩水だけが与えられる。２８日目に、
ＯＶＡ免疫化マウスは、アレルゲンによって誘導されたヒト喘息に著しく類似す
る疾患を示す。この動物モデルを、アレルギー性の急性肺疾患における薬物効力
を評価するために使用した。

【００５６】 アレルゲンに特異的な後期慢性肺疾患のマウスモデル 正常なＢａｌｂ／Ｃマウスにおけるアレルゲンに特異的な後期慢性肺疾患を誘
導するためにオバルブミン（ＯＶＡ）をモデルアレルゲンとして投与するプロト
コルは、ミョウバンアジュバントにおける１００μｇのオバルブミン（ＯＶＡ）
による１日目および１４日目のマウスの腹腔内（ｉ．ｐ．）免疫化、ならびに規
定生理食塩水における５０μｇ〜１００μｇのＯＶＡの１４日目、２５日目、２
６日目および２７日目の単回鼻内（ｉ．ｎ．）投薬、そしてその後、６ヶ月間に
わたる毎週の鼻内投薬を含む。コントロールマウスには、ｉ．ｐ．注射によるミ
ョウバンだけ、そしてｉ．ｎ．投与による規定生理食塩水だけが与えられる。２
８日目に、ＯＶＡ免疫化マウスは、アレルゲンによって誘導されたヒト喘息に著
しく類似する疾患を示す。この動物モデルもまた、慢性のアレルギー性肺疾患に
おける薬物効力を評価するために有用である。

【００５７】 材料および方法 特別な試薬：結晶性ＯＶＡをＰｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．（Ｒｏｃｋｆｏ
ｒｄ、ＩＬ）から入手し、硫酸アルミニウムカリウム（ミョウバン）をＳｉｇｍ
ａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から入手した。ＯＶＡ（５０
０ｕｇ／ｍｌ）を蒸留水における１０％（重量／容量）ミョウバンの等容量と混
合した。混合物を１０ＮのＮａＯＨでｐＨ６．５に調節し、室温で６０分間イン
キュベーションした。この材料を７５０ｇで５分間遠心分離し、ペレットを蒸留
水で最初の容量に再懸濁して、１時間以内に使用した。

【００５８】 免疫化プロトコル：免疫化プロトコルは、ミョウバンにおける１００μｇのＯ
ＶＡを１日目に腹腔内投与し、その後、生理食塩水における１００μｇのＯＶＡ
を１４日目に鼻内投与することと組み合わせたミョウバンにおける１００μｇの
ＯＶＡを腹腔内投与することからなった。２５日目、２６日目および２７日目に
、マウスは、鼻内ＯＶＡ（生理食塩水において１００μｇ）で抗原刺激された。
急性喘息の研究の場合には、動物を２８日目に安楽死させ、肺を取り出した。慢
性喘息の研究の場合には、マウスは、その後、６ヶ月間にわたって毎週免疫化さ
れた。

【００５９】 分析 血清ＩｇＥに対するＥＬＩＳＡプロトコル：Ｉｍｍｕｌｏｎ２マイクロタイタ
ープレート（Ｄｙｎｅｘ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を、５０ｍＭ炭酸塩−重
炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．４）のＯＶＡ溶液を用いて４℃で一晩コーティングし、
そして０．１％カゼインを用いて室温（ＲＴ）で２時間ブロッキングした。すべ
ての試験血清を、０．１％カゼインを含有するＴｒｉｓ−ＮａＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．０）で１：１００に希釈し、その後、ＯＶＡコーティングプレートを用いて
インキュベーションした。ＯＶＡに対するＩｇＥ抗体を含有することが知られて
いる陽性の血清サンプル、および非免疫化マウスに由来する正常な血清サンプル
が、コントロールとしてそれぞれのアッセイに含まれた。血清サンプルをプレー
トにおいて室温で２時間インキュベーションし、そしてＰＢＳで６回洗浄した。
適切に希釈された二次抗体（ヒツジ、抗マウスＩｇＥビオチン（Ｂｉｎｄｉｎｇ
Ｓｉｔｅ、カタログ番号ＰＢ２８４、ロット番号０２６９１７）をＲＴで２時
間加え、そしてプレートをＰＢＳで６回洗浄した。ＯＰＤ溶液、尿素溶液および
ペルオキシド溶液をＲＴで３０分間加えた。反応を２．５Ｍ硫酸で停止させた。
ＯＤを４９０／６３０ｎｍで読み取った。すべてのサンプルを二連で処理した。
陽性コントロールのサンプル内変動およびサンプル間変動は平均値の１０％未満
であった。

【００６０】 肺の組織学：肺および気管を取り出し、１０％中性緩衝化ホルマリンで固定し
た。組織をパラフィンに包埋し、７μｍの切片に切断した。脱パラフィンおよび
水和を行った後、切片を好酸球染色液で染色して、メチレンブルーで対比染色し
た。アルシアンブルー、トルイジンブルーおよび過ヨウ素酸シッフの染色により
、気道内の粘液が同定された。組織を光学顕微鏡で検査した。

【００６１】 気管支肺胞洗浄検査（ＢＡＬ）：左肺を主気管支のところで結紮した。右肺を
０．４ｍｌの規定生理食塩水で３回洗浄し、洗浄液をまとめた。総細胞数を、血
球計算器を使用して測定した。残りの細胞を遠心分離によってペレット化し、細
胞を１０％ＢＳＡ溶液に入れて再懸濁した。細胞を顕微鏡のスライドガラスに載
せ、好酸球染色液で染色した（メチレンブルー対比染色を伴うエオシン）。

【００６２】 肺の組織形態測定分析：アレルギー性肺疾患の下記のパラメーターを本明細書
に報告される実験で測定した： １．気道栓スコアを以前に報告されたように評価した（Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ他
、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１４８３〜１４９４、１９９６）。粘液分泌の
重症度を反映して、＋から＋＋＋＋までの評価システムを使用した。

【００６３】 ２．総粘液細胞を、中気道〜大気道（６００μｍ〜１，０００μｍの直径）に
おける１００個の上皮細胞あたり、粘液を含有する上皮細胞の数を無作為に計数
することによって推定した。１０視野を種々の肺葉において計数した。

【００６４】 ３．血管周辺区画または気道隣接領域のいずれかに存在する浸潤細胞（好中球
、好酸球、単球およびリンパ球）の細胞密度を、ｏから＋＋＋＋までの範囲の評
価システムを使用することによって概算した。＋のスコアは、３細胞で、５細胞
未満の炎症性細胞層を示す；＋＋は、５細胞〜１０細胞の炎症密度を示す；＋＋
＋は、１０細胞〜２０細胞の炎症密度を示す；＋＋＋＋は、２０細胞〜４０細胞
の炎症密度を示す。

【００６５】 ４．多数の様々な細胞タイプを、高倍率（１０Ｘ、４０Ｘ）でその数を計数す
ることによって定量した。

【００６６】 ５．水腫の程度を、血管を取り囲む流体の蓄積度合いを推定する評価システム
を使用することによって計算した。

【００６７】 組織形態測定データの統計学的分析：ＳｉｇｍａＳｔａｔ（バージョン２．０
）を使用して、統計学的分析を行った。差を、独立した平均値に対する適切な事
後検定（ｐｏｓｔｈｏｃ ｔｅｓｔ）を使用するＡＮＯＶＡによって有意性（ｐ
＜０．０５）について分析した。ＳｉｇｍａＰｌｏｔ（バージョン４．０）また
はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、データのグラフ表示を行った。

【００６８】 実施例１：急性喘息マウスのＨＫ−Ｘに対する治療的用量応答 理想的には、治療的効力が薬物投薬量と相関することを明らかにする実験は、
３つの異なる領域の挙動を示す：１）低用量では治療効果がない；２）それより
も高い投薬量では、治療的効力は用量依存的である；３）用量の第３範囲（最大
量）は、中間範囲内の最も大きな用量で認められる治療的効力よりも大きな治療
的効力を示さない。

【００６９】 用量応答曲線は、ヒトにおける使用に対する安全な投薬量に関する重要な情報
源である。ときには、最適な治療的投薬量を超える薬物用量が投与された場合に
、毒性応答が認められ得る。これは、薬物が鼻内などのその場に投与された場合
には特に当てはまる。

【００７０】 ＯＶＡによる反復的な免疫化によって誘導される２５日目、２６日目および２
７日目の気管支喘息の急性エフェクター期のときにおけるｆ−ｍｅｔ−Ｌｅｕ−
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ（ＨＫ−Ｘ）の様々なの用量の治療的有効性を明らかにするため
に、０．１μｇ、１．０μｇ、１０μｇおよび５０μｇの鼻内ＨＫ−Ｘの用量が
選ばれた。ＨＫ−Ｘは、ＯＶＡ抗原刺激の３０分前に投与された。コントロール
群は、ＯＶＡで免疫化され、かつＯＶＡで抗原刺激されたマウス、ならびに生理
食塩水におけるミョウバンで免疫化され、かつ生理食塩水だけで抗原刺激された
動物からなった。すべての動物は最後のＯＶＡ抗原刺激の翌日（２８日目）に屠
殺された。血清ＩｇＥレベルが測定され、そして血清および肺組織がさらなる分
析のために採取された。

【００７１】 急性喘息モデルにおいて血清ＩｇＥレベルを効果的にダウンレギュレーション
する最適な用量を最初に確立するために、０．１μｇ、１．０μｇ、１０μｇお
よび５０μｇの各用量のＨＫ−Ｘ（４０μＬの生理食塩水において）を、２５日
目、２６日目および２７日目の抗原刺激の１５分前〜３０分前に肺に注入した。
血清ＩｇＥレベルの用量応答曲線が図１に示されている。

【００７２】 急性のアレルギー性抗原刺激に対する肺組織の応答に対するＨＫ−Ｘの様々な
用量の効果が図２Ａ〜図４Ｃに示されている。急性喘息マウスに鼻内投与された
５０マイクログラムのＨＫ−Ｘは、急性喘息の作用に対するある程度の保護をも
たらした（図２Ａ〜図２Ｃ）。炎症性細胞の限定された血管周辺および気管支周
辺の蓄積があった（図２Ａおよび図２Ｂ）。図２Ｃは、粘液の蓄積が存在したが
、限定されていたことを明らかにしている。

【００７３】 １０マイクログラムのＨＫ−Ｘは最も効果的な用量であると考えられる（図３
Ａ〜図３Ｃ）。図３Ａおよび図３Ｂは、血管および気道を取り囲む最小の炎症性
浸潤を示している。気道における粘液分泌の程度が図３Ｃに例示されている。粘
液は気道上皮細胞の表面に限定されている。

【００７４】 ＨＫ−Ｘの用量を１／１０の１μｇに低下させたとき、治療的効果は損なわれ
た。血管周辺および気道の炎症量は増大した（図４Ａ）。気道上皮細胞による粘
液分泌はそれに対応して増大していた（図４Ｂおよび図４Ｃ）。

【００７５】 対比およびコントロールのために、図５Ａ〜図５Ｃは、生理食塩水またはＨＫ
−Ｘビヒクル（０．０５％ＤＭＳＯ）の投与に対する免疫化マウスの良性応答を
例示している。図５Ａおよび図５Ｂに示されているように、肺の血管周辺域また
は気道周辺域における炎症性浸潤はほとんど検出できなかった。これに対応して
、気道内腔内または気道上皮細胞表面には粘液が蓄積していなかった（図５Ｃ）
。

【００７６】 急性喘息の重症度の重要な組織学的測定値の中で、粘液栓、好酸球の数、およ
び粘液を分泌する気道細胞の割合は、０．１μｇ〜１０μｇのＨＫ−Ｘによる処
置の後で用量に依存した改善を示し、粘液栓スコアを７０％低下させた（ｐ＜０
．０５）。興味深いことに、５０μｇのＨＫ−Ｘは、粘液栓の著しく小さい低下
（ｐ＜０．０５）をもたらした。応答性のこの同じパターンが、好酸球の数、お
よび粘液を分泌する気道細胞の割合について認められた。１０μｇ用量のＨＫ−
Ｘは、間質性好酸球の数における５７％の低下を示した。これは、０．１μｇ用
量の効果よりも著しく大きかった（ｐ＜０．０５）。５０μｇの用量による好酸
球の低下は、１０μｇのＨＫ−Ｘにより得られる低下の１／２よりも小さかった
（ｐ＜０．０５）。

【００７７】 粘液を分泌する気道細胞の割合もまた、０．１μｇから１０μｇまでの用量依
存的な様式で阻害された（３７％の低下、ｐ＜０．０５）。５０μｇの用量は少
量の低下（１１％）をもたらした。これは、０．１μｇ用量のＨＫ−Ｘよりも著
しく小さいものではなかった。血管を取り囲む流体の蓄積に対するＨＫ−Ｘの効
果は、１０μｇおよび５０μｇの用量であまり大きくない低下を示した。しかし
、これらの用量はいずれも、０．１μｇ用量のＨＫ−Ｘとは異なっていなかった
。炎症性細胞スコアまたは炎症性細胞の蓄積における最大の低下を示すＨＫ−Ｘ
の用量は１０μｇであった。

【００７８】 これらのデータは、下記のパラメーターが用量応答効果を示したことを明らか
にしている：血清ＩｇＥレベルおよび組織病理学的特徴（細胞浸潤、粘液栓形成
、および間質組織における総好酸球）。鼻内投与された１０マイクログラムのＨ
Ｋ−Ｘは、低用量および高用量（５０μｇ）と比較して、最も効果的な投薬量で
あった。コントロールと比較した場合、１０μｇのＨＫ−Ｘで処置された動物は
、血清ＩｇＥレベルにおける６０％の低下、肺の細胞浸潤における５０％の低下
、粘液栓形成における７０％の低下、および好酸球数における６７％の低下を示
した。

【００７９】 実施例２：ＨＫ−Ｘ介入およびＨＫ−Ｘ非介入による慢性喘息 動物モデルはまた、慢性のアレルギー性肺疾患における薬物効力を評価するた
めにも有用である。この研究において、６ヶ月の免疫化期間により、ＯＶＡを用
いた毎週の鼻内抗原投与で維持される持続性の炎症が誘導された。マウスは、肺
に生じる変化を評価するために、２０日の期間にわたって生理食塩水で８回処置
された。慢性喘息マウスのＨＫ−Ｘ処置を図６に示されているように行った。５
０μｇのＨＫ−Ｘ（２．５％未満のＤＭＳＯを含有する５０μＬの生理食塩水に
おいて）を、１６日の期間にわたって送達された合計で８回の投薬についてｉ．
ｎ．投与した。動物を、最後の生理食塩水またはＨＫ−Ｘが投与された４日後に
屠殺した。実験結果を、ＨＫ−Ｘ処置マウスとＨＫ−Ｘ未処置マウスとの間で比
較した。

【００８０】 ＯＶＡの存在下または非存在下で抗原刺激されたマウスマウスの血液における
ＯＶＡに対する抗体のＩｇＥレベルを表１に示す。すべての動物が最初の６ヶ月
間はＯＶＡで免疫化され、しかし、「生理食塩水」と示される群は生理食塩水が
鼻内投与され、最後の２０日の期間はＯＶＡで抗原刺激されなかったことに留意
することは重要である。従って、これらのＩｇＥレベルは免疫化期間から引き継
がれ、そしてすべての比較が補正されるバックグラウンド値として使用された。
例えば、生理食塩水またはＤＭＳＯのいずれかおよびＯＶＡによる抗原刺激で処
置された動物は、ＨＫ−ＸおよびＯＶＡによる抗原刺激で処置された動物におけ
るＩｇＥレベルの１４％の増大と比較して、ＩｇＥレベルの３６％の増大を有し
ていた。ＨＫ−ＸによるＩｇＥレベルの抑制量は〜６０％であると計算された。

【００８１】

【表１】

【００８２】 ネズミモデルにおける慢性喘息の重要な特徴の１つは、肺における肉芽腫的構
造の出現である。効果的なＩｇＥダウンレギュレーション用量の５０μｇのＨＫ
−Ｘは、コラーゲン沈着を自発的に低下させることができる動物と比較して、処
置された動物の肺におけるこれらの構造体の数およびサイズを著しく低下させた
（ｐ＜０．０５）［生理食塩水またはＤＭＳＯ］（図７）。

【００８３】 さらに、ＯＶＡによるマウスの免疫化、および２０日の期間にわたって合計で
８回の５０μｇの投薬量でのＨＫ−Ｘによるその後の処置を行っているときに、
有害な反応または病気の適応症は何ら認められなかった。マウスは、実験期間を
通して活動的であった。ＯＶＡのみで免疫化された動物群に由来する肺組織の検
査により、ヒトにおいて認められる慢性喘息の特徴と一致する肺の重大な病理学
的変化が明らかにされた。気道基底膜の外側領域（間質領域）および血管に関連
した炎症性細胞の著しい浸潤があった（図８Ｃ）。動物が２０日の期間にわたっ
て処理あたり５０μｇのＨＫ−Ｘの８回の投薬で処置された場合、炎症性細胞の
数は、気道および血管の回りで明らかに低下した（図８Ｂ）。生理食塩水による
偽免疫化マウスまたはコントロール免疫化マウスによる生理食塩水吸入は、正常
な外見を有する開存的な気道および血管をもたらした（図８Ａ）。ＯＶＡ免疫化
マウスは、血管および気道の回りにコラーゲンの増大した蓄積（青色）を含んで
いた（図９Ｃ）。しかし、ＨＫ−Ｘで処置された肺は、低下したレベルのコラー
ゲン沈着を示していた（図９Ｂ）。（生理食塩水においてＨＫ−Ｘが投与された
）コントロールマウスでは、肺組織は炎症性細胞および線維症的なコラーゲン沈
着を有していなかった（図９Ａ）。対照的に、ＯＶＡで感作され、そして生理食
塩水（図１０Ａ〜図１０Ｃ）または０．５％ＤＭＳＯ溶液（図１１Ａ〜図１１Ｃ
）のいずれかでのみ処置されたマウスでは、粘液を可視化するためにアルシアン
ブルー（ｐＨ２．３）が使用されたときに、気道は粘液を含み、粘液分泌細胞を
有していた。血管周辺および気道の炎症性細胞浸潤の量は類似していた。これら
の６月齢の慢性喘息マウスの気道の６０％以上が粘液で詰まっていた（それぞれ
、図１０Ａ〜図１０Ｂおよび図１１Ａ〜図１１Ｂ）。

【００８４】 慢性喘息における肺組織の変化もまた、持続性炎症、線維症的なコラーゲン沈
着、および構造的な変化を伴う気道の狭小化の程度を定量するために形態測定的
な方法で評価された。図１２〜図１４には、ＯＶＡで６ヶ月間にわたって免疫化
され、かつ様々な薬剤で処置された動物の応答が図の左側に示され、一方、偽免
疫化され、かつ生理食塩水で処置された動物が右側に示されている。２０日の期
間にわたって生理食塩水のみが与えられた動物に対するＨＫ−Ｘ処置動物におけ
る粘液栓形成の程度には著しい違いがあった（ｐ＜０．０５）（図１２）。ＨＫ
−Ｘの代わりにビヒクル（０．５％ＤＭＳＯ）で処置された動物もまた、ＨＫ−
Ｘと比較して、粘液栓スコアの改善を全く示さなかった。これらの結果は、生理
食塩水で処置された場合と同じであった。気道内および気道周辺における炎症性
細胞の蓄積に対する応答パターンは、様々な実験的処置に対する粘液栓データと
一致していた（図１２）。それぞれが４０μＬのビヒクルにおいて５０μｇのＨ
Ｋ−Ｘの８回の用量が１６日の期間にわたって鼻内投与された場合、気道におけ
る粘液蓄積および粘液細胞出現は著しく低下した（図１３）。再度ではあるが、
生理食塩水による処置は単独では何ら治療的効果を示さなかったが、ＨＫ−Ｘは
、気道内における粘液含有細胞の数を著しく低下させた（ｐ＜０．０５）。この
観測結果は、ＯＶＡにより誘導される慢性喘息が確立された後では自発的な修復
がないということをさらに立証している。気道に関連して浸潤した炎症性細胞の
数の分析において、データは、単位面積あたりの好酸球および好中球もまた低下
していることを示した（図１４）。鼻内に生理食塩水を吸入させた動物は、ＤＭ
ＳＯで処置された動物が維持したように高レベルの好酸球を維持した（ｐ＞０．
０５）；しかし、ＨＫ−Ｘによる処置は、２つのコントロール群と比較して、好
酸球の数を著しく低下させた（ｐ＜０．０５）。

【００８５】 これらの研究は、ＨＫ−Ｘが投与されない限り、アレルゲンにより誘導される
慢性喘息のこのモデルにおける気道炎症または粘液細胞分泌が自発的にほとんど
低下しなかったことを示している。このモデルにおいて、マウスはＯＶＡに感作
され、そして５ヶ月間にわたって毎週、鼻内経路によりＯＶＡにさらされ、２０
日の期間にわたって８回、鼻内的にＨＫ−Ｘで処置された。このアレルゲン免疫
化および抗原刺激法は、好酸球および他のタイプの炎症性細胞の慢性的な気道浸
潤、粘液の気道内蓄積、ならびに粘液分泌細胞の過形成をもたらした。効果的な
ＩｇＥダウンレギュレーション用量の５０μｇのＨＫ−Ｘを投与することにより
、気道の過剰分泌、粘液細胞の過形成、ならびに好酸球および好中球の動員が低
下した。これらの結果は、効果的な量のＨＫ−Ｘを投与して、ＩｇＥレベルをダ
ウンレギュレーションすることによって、ＨＫ−Ｘは、喘息のこのアレルゲン誘
導モデルにおいて生じる、気道の粘液過剰分泌およびコラーゲンの沈着などのＩ
ｇＥ媒介応答をもダウンレギュレーションし得ることを示している。

【００８６】 実施例３：急性のネズミ喘息におけるＨＫ−Ｘおよびデキサメタゾンの効果 グルココルチコイドは、Ｔ細胞、マスト細胞、単球、樹状細胞および好酸球を
含む様々な細胞タイプによって産生される炎症性媒介因子の強力な阻害剤である
。グルココルチコイドは、吸入または全身的に使用された場合にヒト喘息の処置
において効果的である。グルココルチコイドは、炎症性細胞の浸潤を抑制し、そ
して粘液分泌および肺水腫を低下させることが明らかにされている。これらの応
答は、気管支上皮細胞に対するグルココルチコイドの直接的な効果に関連してい
る。同等に重要なことに、ステロイドは気管支の過剰応答性を低下させる。それ
らの明らかにされた効力のために、グルココルチコステロイドは、喘息の処置に
おける主要な治療装備の１つであり、そしてその価値を時間とともに制限する十
分に示されている累積的な毒性を別にすれば、無条件で使用することができる。
グルココルチコイドは喘息に対する効力の現在の標準として有益であるので、喘
息を処置する新しい化合物をグルココルチコイドと比較して評価することは望ま
しい。

【００８７】 この実験では、このマウスモデルにおける粘液放出、好酸球数、水腫、および
アレルゲンに特異的なＩｇＥレベルを調節するＨＫ−Ｘの有効性が、広く使用さ
れているグルココルチコイドのデキサメタゾンと比較された。１０μｇおよび５
０μｇのＨＫ−Ｘおよびデキサメタゾンの比較される投薬量がこの研究では使用
された。鼻内投与が、両方の薬物についてすべての用量で使用された。５０マイ
クログラムのＨＫ−Ｘは、慢性喘息モデルから得られた以前の結果に基づく高用
量として選ばれた。免疫化および処置プロトコルの概略を図１５に示す。

【００８８】 実験パラメーターは、１０μｇの鼻内ＨＫ−Ｘが、血清ＩｇＥレベルを低下さ
せることにおいて、１０μｇまたは５０μｇのいずれかのデキサメタゾンよりも
効果的であることを示した（図１６）。１０マイクログラムのＨＫ−Ｘは、血清
ＩｇＥレベルを２８％低下させた。ＨＫ−Ｘはまた、間質組織における細胞浸潤
および好酸球総数の２つの組織病理学的特徴を改善することにおいてデキサメタ
ゾンよりも効果的であった。１０μｇおよび５０μｇの両用量のＨＫ−Ｘは、Ｏ
ＶＡコントロールと比較して、炎症性浸潤を５４％と著しく低下させ（ｐ＜０．
０５）、そして１０μｇ（１３％）および５０μｇ（１３％）のデキサメタゾン
よりも著しく効果的であった（ｐ＜０．０５）。１０μｇおよび５０μｇの両用
量のＨＫ−Ｘは、１０μｇのデキサメタゾンよりも効果的であった（ｐ＜０．０
５）。１０μｇのＨＫ−Ｘは好酸球細胞数を５７％低下させたが、同じ用量のデ
キサメタゾンは好酸球細胞数を１３％低下させた。

【００８９】 鼻内投与された５０マイクログラムの高用量のＨＫ−Ｘは、下記の組織病理学
的特徴を低下させることにおいてデキサメタゾンのいずれかの用量と同じくらい
効果的であった：気管支肺胞洗浄検査（ＢＡＬ）における好酸球の数、粘液栓形
成、気道粘液分泌細胞の割合、間質組織における好酸球の数、および水腫。これ
らの結果により、ネズミの喘息モデルにおけるＨＫ−Ｘおよびグルココルチコイ
ド（デキサメタゾン）の相対的な効力が明らかにされる。

【００９０】 実施例４：ネズミの急性喘息におけるＨＫ−Ｘおよび関連する対照ペプチドの
効果 この実験では、下記の尺度に関連して、ＨＫ−Ｘの有効性が、関連する多数の
ペプチドファミリーｆ−Ｍｅｔ−Ｍｅｔ（対照ペプチドと呼ばれる）と比較され
た：急性喘息マウスモデルにおける粘液放出、細胞浸潤、好酸球数、水腫、およ
びアレルゲンに特異的なＩｇＥレベル。比較される投薬量の５０μｇのＨＫ−Ｘ
および対照ペプチドがこの研究では使用された。鼻内投与が両方の化合物につい
て使用された。免疫化および処置法は図１７に概略される。

【００９１】 対照ペプチドは、化学化合物の同じファミリーに属し、そして分子サイズが非
常に関連しているが、ＨＫ−Ｘの治療的特性をどれも示さなかった。最も重要な
ことは、５０μｇのＨＫ−Ｘは、アレルゲンＯＶＡに対する血清における血清Ｉ
ｇＥレベルの７％の低下を生じさせた（ｐ＞０．０５）。５０μｇの対照ペプチ
ドは血清ＩｇＥレベルに影響を及ぼさなかった（ｐ＞０．０５）。さらに、ビヒ
クルで送達され、コントロール動物に投与された対照ペプチドは、下記のパラメ
ーターにおける明瞭な前炎症的な増大を促進した：粘液栓形成、粘液を分泌する
気道細胞の数、および間質組織の炎症性細胞の程度。以前の実験において、ＨＫ
−Ｘは、測定された組織学的パラメーターにおける前炎症的変化を何ら示さなか
った。従って、ＨＫ−Ｘの特徴的な組成物は、ＩｇＥレベルおよびＩｇＥ媒介応
答をダウンレギュレーションする際にその効力を生じさせると考えられる。

【００９２】 実施例５：高治療レベルのＨＫ−Ｘの長期間投薬に対する肺組織応答 治療的な用量範囲の高用量限界でＨＫ−Ｘに長期間鼻内曝露されることの潜在
的な毒性作用があるかどうかを明らかにするために、マウスを３ヶ月間にわたっ
て２０μｇの用量の鼻内ＨＫ−Ｘに毎週さらした。最後の２週間は、ＨＫ−Ｘの
鼻内投薬を５０μｇに増大させた。肺組織を、組織学的分析のために最後のＨＫ
−Ｘ投与の２４時間後に集めた。

【００９３】 ３ヶ月間にわたる２０μｇのＨＫ−Ｘの毎週の鼻内投与、その後の５０μｇの
２週間の投与は、肺組織の病理学的変化を生じさせなかった。粘液栓形成および
炎症性浸潤に関して、生理食塩水投与とＨＫ−Ｘ投与との間には差（ｐ＞０．０
５）がなかった。気道細胞による粘液分泌は、ＨＫ−Ｘを投与した後に上昇した
が、これは生物学的に有意であるとは判断されなかった。類似した現象が、間質
組織における好酸球の数に関して認められた。ＨＫ−Ｘで処置された動物は２，
２００μ^２あたり約２倍の好酸球を有していたが、生理食塩水で処置された動物
は単位面積あたり１個未満（ｐ＜０．０５）であることが明らかにされた。肝臓
、脾臓および腎臓が病理学的変化について調べられた。コントロール群および処
置群に由来する動物の肝臓における炎症性細胞の偶発的な病巣を除いて、病理学
的な変化は認められなかった。これらのデータは、治療的用量を超えたＨＫ−Ｘ
のマウスにおける寛容性を明らかにしている。

【００９４】 実施例６：ＨＫ−Ｘの免疫原性および抗原性 この研究の目的は、ＨＫ−Ｘが、いくつかの異なる経路によってマウスに投与
されたときに、抗体産生によって評価されるような免疫応答を生じさせるかどう
かを明らかにすることである。従って、免疫原性および抗原性がともに、この研
究においてＨＫ−Ｘに関連して評価された。

【００９５】 ＨＫ−Ｘは小さなテトラペプチドである。ほとんどの場合、そのような小ペプ
チドは免疫原性が低い。しかし、生体内では、小分子は、より大きいなタンパク
質に結合または吸着して（ハプテンになり）得るか、あるいは血液細胞（キャリ
ア）に結合または吸着し得る。ペニシリン、キニジンおよびα−メチルドーパの
アレルギー性応答はハプテンによるそのような応答の例である。ハプテンに対す
る抗体は、赤血球（キャリア）の破壊のために貧血および免疫複合体疾患を生じ
させ得る。

【００９６】 実験的に使用されているジニトロフェノール（ＤＮＰ）またはトリニトロフェ
ノール（ＴＮＰ）などの多数のハプテンがキャリア分子に共有結合させられる。
キャリア分子の抗原性が大きいほど、ハプテンに対する免疫応答が誘発される可
能性が大きくなる。キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）は、広く使用
されているキャリアであり、ＤＮＰまたはＴＮＰのようなハプテンに対する強力
な抗体応答を一般に助ける。

【００９７】 アジュバントの使用は、潜在的な免疫原が免疫応答を誘発する可能性を大きく
増大させる。完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）または細菌のペプチドグリ
カンが、免疫原性が悪いハプテンに対する免疫応答を刺激するために広く使用さ
れている。

【００９８】 従って、（抗ＨＫ−Ｘ反応性を伴わない）通常の薬物曝露経路に由来する抗体
の利用性を最初に明らかにした後、ＨＫ−ＸをＫＬＨに結合して、細菌アジュバ
ントにおいて投与したときに、ＨＫ−Ｘの潜在的な免疫原性を調べた。これらの
極端な条件により、ＨＫ−Ｘが免疫原性であり得るかどうかが明らかにされた。

【００９９】 材料および方法 ＨＫ−Ｘの免疫原性結合体：ＨＫ−Ｘを、カルボキシ末端に付加された１２個
〜２０個の炭素スペーサーを介してＫＬＨに結合させた。結合は、ＫＬＨにおけ
るリシン残基を介して完成した。Ｕｎｉｔｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｅ
ａｔｔｌｅ、ＷＡ）により結合体が調製された。

【０１００】 免疫原の調製：ＰＢＳに０．１ｍｇ／ｍｌで懸濁させたＨＫ−Ｘ−ＫＬＨ結合
体を、１．０ｍｇ／ｍｌのウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅ
ｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）において
１：１の比で乳化した。

【０１０１】 アジュバント免疫化プロトコル：Ｂａｌｂ／Ｃ雌性マウスを０．１ｍｌのエマ
ルションで皮内に免疫化し、４週間後に追加免疫し、６週間目に採血した。

【０１０２】 可溶性免疫化プロトコル：Ｂａｌｂ／Ｃ雌性マウスに、０．１ｍｌ〜０．２ｍ
ｌの容量で、アジュバントを使用することなく１００μｇの結合体を腹腔内注射
した。マウスは２１日後に採血された。

【０１０３】 通常の薬物曝露経路：血清を、治療的な喘息研究において鼻内経路によりＨＫ
−Ｘが投与された動物から採取した。

【０１０４】 抗体の測定：ＥＬＩＳＡにより、結合型ＨＫ−Ｘおよび非結合型ＨＫ−Ｘに対
する抗体を分析した。Ｉｍｍｕｌｏｎ２マイクロタイタープレート（Ｄｙｎｅｘ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号３４５５）を、ＰＢＳにおける１０
μｇ／ｍｌの下記のＨＫ−ＸまたはＨＫ−Ｘ結合体を用いて４℃で一晩コーティ
ングした： ・ＨＫ−Ｘ、ペプチド単独 ・ＨＫ−Ｘ−ＫＬＨ、ＫＬＨに結合させたペプチド ・ＨＫ−ＸＬＩＳＡ、ＢＳＡに結合させたペプチド ・ＨＫ−Ｘスペーサー、１２個の炭素の直鎖スペーサーを有するペプチド。 翌日、ウエルをＰＢＳで洗浄し、その後、０．１ＭＴｒｉｓ−０．１５ＭＮａＣ
ｌ緩衝液（ｐＨ８．０）および０．１％カゼイン（ＩＣＮカタログ番号９０２８
９６、ロット９９３３３）からなる同じ希釈緩衝液を用いて室温で３０分間ブロ
ッキングした。マウスの血清サンプルを同じ希釈緩衝液で１：１００または１：
２００のいずれかに希釈し、ウエルに加えて、室温で２時間インキュベーション
した。その後、ウエルをＰＢＳで洗浄し、ヤギ抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ
を結合させた二次抗体（Ｃａｐｐｅｌカタログ番号５５５５４、ロット番号３９
７１４）を用いて室温で２時間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄した後、
ウエルをＯＰＤ発色源（ＳＩＧＭＡカタログ番号Ｐ−９１８７、ロット１８Ｈ８
２１１１）と室温で３０分間反応させた。反応を５０μｌの２．５Ｍ硫酸で停止
させた。その後、ＯＤを、ＢＩＯ−ＴＥＫ ＥＬ８００読み取り装置を使用して
４９０／６３０で測定した。

【０１０５】 結果 通常の薬物曝露経路に由来するＨＫ−Ｘの測定：下記のマウス群に由来する血
清を抗ＨＫ−Ｘ反応性について調べた：ＯＶＡ誘導喘息およびＨＫ−Ｘ処置、Ｏ
ＶＡ誘導喘息およびＤＭＳＯ（ビヒクル）処置コントロール、生理食塩水免疫化
およびＤＭＳＯ（ビヒクル）処置。マウスを５０μｇのＨＫ−Ｘまたはビヒクル
で１６日間にわたって１日おきに鼻内処置した。

【０１０６】 ＩｇＧ反応性は、１２−Ｃスペーサーに結合させたＨＫ−Ｘ（ＨＫ−Ｘ＋スペ
ーサー）、ＫＬＨに結合させたＨＫ−Ｘ（ＫＬＨ−ＨＫ−Ｘ）またはＢＳＡに結
合させたＨＫ−Ｘ（ＢＳＡ−ＨＫ−Ｘ）のいずれに対しても認められなかった。
ＯＶＡに対するＩｇＧ反応性が、すべてのＯＶＡ免疫化マウスおよび１匹の生理
食塩水免疫化コントロールマウスで認められ、ＥＬＩＳＡのコントロールとして
役に立った。ＫＬＨ−ＨＫ−ＸおよびＢＳＡ−ＨＫ−Ｘに対するＩｇＧ反応性が
、アジュバントにおけるＫＬＨ−ＨＫ−Ｘで免疫化された動物から得られた血清
で認められ、これらの抗原がＥＬＩＳＡプレートにコーティングされていること
に対するコントロールとして役に立った。

【０１０７】 キャリアに結合させた可溶性免疫化ＨＫ−Ｘ：マウスを可溶性のＫＬＨ−ＨＫ
−Ｘで免疫化し、２１日後に採血した。ＥＬＩＳＡの結果は、４／５の血清サン
プルがＫＬＨおよびＫＬＨ−ＨＫ−Ｘに反応したが、ＢＳＡ−ＨＫ−ＸまたはＨ
Ｋ−Ｘ＋スペーサーに対する反応性は認められなかったことを示している。この
ことは、抗体が、ＨＫ−Ｘに結合させた可溶性キャリアによる免疫化の後に、Ｋ
ＬＨに結合させたＨＫ−Ｘに対して生じなかったことを示している。

【０１０８】 キャリアに結合させたアジュバント免疫化ＨＫ−Ｘ：ＨＫ−Ｘに対する抗体を
生じさせるために、マウスを、完全フロイントアジュバントにおいてＫＬＨまた
はＫＬＨ−ＨＫ−Ｘで免疫化し、一回追加免疫して、６週間後に採血した。ＥＬ
ＩＳＡの結果は、抗体がＫＬＨに対して生じたことを示している。抗体は、ＨＫ
−Ｘに対して生じていた。このことは下記により裏付けられた：１）ＫＬＨ−Ｈ
Ｋ−Ｘに由来するＫＬＨ−ＨＫ−Ｘに対する抗体反応性は、ＫＬＨのみの免疫血
清に由来する場合よりも２倍大きかった；そして２）ＫＬＨ−ＨＫ−Ｘ免疫化の
ＨＫ−Ｘ免疫化マウスに由来する血清はＢＳＡ−ＨＫ−Ｘに反応したが、ＢＳＡ
単独には反応しなかった。しかし、抗体反応性は、１２Ｃスペーサーに結合させ
たＨＫ−Ｘに対しては認められなかった。

【０１０９】 これらの研究の結果から、ＨＫ−Ｘペプチドの免疫原性および抗原性に関する
いくつかの結論を得ることができる。第１に、マウスは、１６日間にわたるペプ
チドの治療的な鼻内投与の後、ＨＫ−Ｘに対する抗体を生じさせなかった。第２
に、マウスは、免疫原性キャリアのＫＬＨに結合させた可溶性ペプチドで免疫化
されたときには抗体を生じさせなかった。第３に、マウスは、ＫＬＨに結合し、
かつ完全アジュバントにおいて免疫化されたときに、極端な条件のもとでＨＫ−
Ｘに対する抗体を生じさせることができる。しかし、この場合でさえ、１２Ｃス
ペーサーに結合させたＨＫ−Ｘに対しては抗体反応性が検出できないため、抗体
反応性は、ＨＫ−ＸおよびＫＬＨの結合によって生じたネオエピトープに対して
生じたと考えられる。この結論は、試験抗原ＨＫ−Ｘ−ＫＬＨとインキュベーシ
ョンする前に遊離のＨＫ−Ｘを抗血清に少なくとも３０分間加えることによって
、ＨＫ−Ｘ−ＫＬＨに対する抗体反応性が低下しなかったという観測結果から支
持される。

【０１１０】 従って、ＨＫ−Ｘに対する臨床的に関連する抗体応答または他の免疫応答が臨
床的環境で誘発される可能性はないと考えられる。そのような考えを裏付ける５
つの観測結果が存在する。これらの観測結果を下記に示す： １．ＨＫ−Ｘはサイズが４アミノ酸にすぎず（６００ダルトン未満であり）、こ
れにより、免疫原性になるとは考えられない； ２．ＨＫ−Ｘ内のアミノ酸はすべて疎水性であり、その性質は免疫原性との関連
がない； ３．免疫原性になるためには、ＨＫ−Ｘは、より大きな免疫原性キャリアとイン
ビボで共有結合的または静電的に結合しなければならない； ４．ＨＫ−Ｘに対して産生された抗体は、キャリアおよびＨＫ−Ｘの組合せによ
って形成されたエピトープ（ネオ抗原）に対すると考えられる； ５．ネオ抗原に対する抗体は、遊離のＨＫ−Ｘに対して仮に反応するとしても弱
く反応するにすぎない（親和性が低い）。

【０１１１】 実施例７：ＨＫ−Ｘの霊長類における毒物学 この研究は、ＢＩＯＳＵＰＰＯＲＴ（Ｒｅｄｍｏｎｄ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ
）にある動物研究施設）においてＧＬＰ基準に従って行われた。Ｃｈａｒｌｅｓ
Ｒｉｖｅｒから入手した６頭の成体の雌雄マカクサルを調べた。コントロール
群と見なされるグループＡは、５日間にわたって毎日、ビヒクル（３％ＤＭＳＯ
を含む緩衝化生理食塩水）がＩＶ投与された２頭の動物からなった。ＣＢＣおよ
び化学的性質のための血液サンプリングが０日目〜４日目および７日目に行われ
た。グループＢは、５日間にわたって毎日、２０μｇ／ｋｇのＨＫ−Ｘがビヒク
ル（３％ＤＭＳＯを含む緩衝化生理食塩水）でＩＶ投与された３頭の動物からな
った。ＣＢＣおよび化学的性質のための血液サンプリングが０日目〜４日目およ
び７日目に行われた。グループＣは、同一の方法で毎日、１５０μｇ／ｋｇがＩ
Ｖ投与された別の３頭の動物からなった。グループＤは、グループＢおよびグル
ープＣに由来する６頭のすべての動物からなり、グループＣの動物がその処置を
完了した５日後に同じ方法を使用して１０００μｇ／ｋｇが毎日ＩＶ投与された
。すべての動物は、体重および全身的な健康状態および行動を記録するために、
研究期間中、毎日観察された。グループＤの処置が終了したときに、すべての動
物を安楽死させ、解剖して、下記の器官に由来する代表的な組織サンプルを組織
学的分析のために採取した：肝臓、腎臓、脾臓、肺、心臓、リンパ節および脳。
組織病理学的な評価が、ＢＩＯＳＵＰＰＯＲＴに関係する委員会認定動物病理学
者によって、そしてそれとは別にＨｉｓｔａｔｅｋに関係する組織病理学者によ
って行われた。

【０１１２】 ＨＫ−Ｘのこれらの投薬量は、マウスの喘息モデルにおける１０μｇ／ｋｇお
よび５０μｇ／ｋｇのＨＫ−Ｘの効果的な治療的投薬量に基づいて選ばれた。

【０１１３】 白血球、ヘマトクリット／ヘモグロビンまたは血小板数の著しい異常は、すべ
ての日数またはすべての用量レベルで認められなかった。同様に、化学的測定値
の著しい異常は、３つの投与レベルのいずれにおいても認められなかった。組織
学的異常は、脾臓の代表的な組織サンプルにおいて、そして２０μｇ／ｋｇまた
は１５０μｇ／ｋｇのＨＫ−Ｘのいずれかに、そしてその後、１０００μｇ／ｋ
ｇに毎日さらされた動物から得られたリンパ節において、あるいはビヒクルコン
トロール群において認められなかった。最小の多病巣的なリンパ球浸潤が、処置
された動物およびコントロール動物の両方に由来する肝臓、腎臓、心臓および肺
の組織サンプルで認められ、従って、これは処置に関連しないと判断された。糸
球体の軽度の病変（これは老化したマカクには一般的である）が、処置に従って
分離せず、従って、これもまた処置に関連しないと見なされた。他の小さな組織
学的変化は有意とは見なされなかった。

【０１１４】 治療的と見なされる投薬量よりも著しく大きな投薬量レベルのＨＫ−Ｘにさら
された６頭のマカクサルから得られる血液数または化学的性質には、認識される
ほどの毒性は認められなかった。肝臓、腎臓、脾臓、リンパ節、心臓および肺で
認められた小さな組織病理学的変化は、処置に従って分離せず、背景の病理学ま
たは安楽死に関連する人為的な変化の発現と見なされた。

【０１１５】 霊長類のこの試験は、ＨＫ−Ｘの治療的な量は、見かけの毒性または副作用を
伴うことなくヒトの処置において有用であり得ることを示唆している。

【０１１６】 本発明が、その好ましい実施形態を参照して詳しく記載されている。しかし、
本明細書および図面を検討したとき、当業者は、請求項によって規定される本発
明の精神および範囲に含まれる様々な改変および改善を行い得ることが理解され
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】 急性喘息マウスにおけるＯＶＡ特異的な血清ＩｇＥレベルに対するＨＫ−Ｘの
様々な投薬量の効果を例示する対数用量応答曲線である。

【図２Ａ】 ５０μｇのＨＫ−Ｘが投与された急性喘息マウスに由来する肺切片を示す。限
定された細胞浸潤が（Ａ）および（Ｂ）に存在し、限定された粘液蓄積が（Ｃ）
に存在した。

【図２Ｂ】 ５０μｇのＨＫ−Ｘが投与された急性喘息マウスに由来する肺切片を示す。限
定された細胞浸潤が（Ａ）および（Ｂ）に存在し、限定された粘液蓄積が（Ｃ）
に存在した。

【図２Ｃ】 ５０μｇのＨＫ−Ｘが投与された急性喘息マウスに由来する肺切片を示す。限
定された細胞浸潤が（Ａ）および（Ｂ）に存在し、限定された粘液蓄積が（Ｃ）
に存在した。

【図３Ａ】 １０μｇのＨＫ−Ｘが投与された急性喘息マウスに由来する肺切片を示す。非
常に少数の細胞が気道に結合し（Ａ）および（Ｂ）、粘液は気道上皮細胞層（Ｃ
）の表面に限定されていた。

【図３Ｂ】 １０μｇのＨＫ−Ｘが投与された急性喘息マウスに由来する肺切片を示す。非
常に少数の細胞が気道に結合し（Ａ）および（Ｂ）、粘液は気道上皮細胞層（Ｃ
）の表面に限定されていた。

【図３Ｃ】 １０μｇのＨＫ−Ｘが投与された急性喘息マウスに由来する肺切片を示す。非
常に少数の細胞が気道に結合し（Ａ）および（Ｂ）、粘液は気道上皮細胞層（Ｃ
）の表面に限定されていた。

【図４Ａ】 １μｇのＨＫ−Ｘが投与された急性喘息マウスに由来する肺切片を示す。治療
効果は、細胞浸潤の増大（Ａ）、および気道への粘液分泌の増大（Ｂ）および（
Ｃ）により損なわれた。

【図４Ｂ】 １μｇのＨＫ−Ｘが投与された急性喘息マウスに由来する肺切片を示す。治療
効果は、細胞浸潤の増大（Ａ）、および気道への粘液分泌の増大（Ｂ）および（
Ｃ）により損なわれた。

【図４Ｃ】 １μｇのＨＫ−Ｘが投与された急性喘息マウスに由来する肺切片を示す。治療
効果は、細胞浸潤の増大（Ａ）、および気道への粘液分泌の増大（Ｂ）および（
Ｃ）により損なわれた。

【図５Ａ】 生理食塩水（Ａ）またはビヒクル（０．０５％ＤＭＳＯ）（Ｂ）のいずれかで
抗原刺激されたＯＶＡ免疫化マウスに由来する肺切片を示す。粘液分泌は気道で
検出されなかった（Ｃ）。

【図５Ｂ】 生理食塩水（Ａ）またはビヒクル（０．０５％ＤＭＳＯ）（Ｂ）のいずれかで
抗原刺激されたＯＶＡ免疫化マウスに由来する肺切片を示す。粘液分泌は気道で
検出されなかった（Ｃ）。

【図５Ｃ】 生理食塩水（Ａ）またはビヒクル（０．０５％ＤＭＳＯ）（Ｂ）のいずれかで
抗原刺激されたＯＶＡ免疫化マウスに由来する肺切片を示す。粘液分泌は気道で
検出されなかった（Ｃ）。

【図６】 慢性喘息マウスモデルを確立する際に使用された免疫化および処置法の概略図
である。

【図７】 慢性喘息マウスの肺における肉芽腫の数を例示するヒストグラムである。

【図８Ａ】 ６ヶ月にわたってＯＶＡで毎週免疫化され、そしてＨＫ−Ｘまたは生理食塩水
のいずれかで処置されたマウスに由来する慢性的な喘息の肺切片の組織学を示す
。（Ａ）はコントロールマウスの肺組織学を示し、（Ｂ）は、ＨＫ−Ｘで処置さ
れたマウスの組織学を示し、（Ｃ）は、ＯＶＡで抗原刺激された未処置マウスの
組織学を示す。

【図８Ｂ】 ６ヶ月にわたってＯＶＡで毎週免疫化され、そしてＨＫ−Ｘまたは生理食塩水
のいずれかで処置されたマウスに由来する慢性的な喘息の肺切片の組織学を示す
。（Ａ）はコントロールマウスの肺組織学を示し、（Ｂ）は、ＨＫ−Ｘで処置さ
れたマウスの組織学を示し、（Ｃ）は、ＯＶＡで抗原刺激された未処置マウスの
組織学を示す。

【図８Ｃ】 ６ヶ月にわたってＯＶＡで毎週免疫化され、そしてＨＫ−Ｘまたは生理食塩水
のいずれかで処置されたマウスに由来する慢性的な喘息の肺切片の組織学を示す
。（Ａ）はコントロールマウスの肺組織学を示し、（Ｂ）は、ＨＫ−Ｘで処置さ
れたマウスの組織学を示し、（Ｃ）は、ＯＶＡで抗原刺激された未処置マウスの
組織学を示す。

【図９Ａ】 コラーゲンフィブリルの慢性的な喘息のマウス肺組織蓄積の光学顕微鏡写真を
示す。（Ａ）は、生理食塩水が投与されたコントロールマウスの肺切片を示し、
（Ｂ）は、ＨＫ−Ｘで処置されたマウスの肺切片を示し、（Ｃ）は、ＯＶＡで抗
原刺激された未処置マウスの肺切片を示す。

【図９Ｂ】 コラーゲンフィブリルの慢性的な喘息のマウス肺組織蓄積の光学顕微鏡写真を
示す。（Ａ）は、生理食塩水が投与されたコントロールマウスの肺切片を示し、
（Ｂ）は、ＨＫ−Ｘで処置されたマウスの肺切片を示し、（Ｃ）は、ＯＶＡで抗
原刺激された未処置マウスの肺切片を示す。

【図９Ｃ】 コラーゲンフィブリルの慢性的な喘息のマウス肺組織蓄積の光学顕微鏡写真を
示す。（Ａ）は、生理食塩水が投与されたコントロールマウスの肺切片を示し、
（Ｂ）は、ＨＫ−Ｘで処置されたマウスの肺切片を示し、（Ｃ）は、ＯＶＡで抗
原刺激された未処置マウスの肺切片を示す。

【図１０Ａ】 ＯＶＡで慢性的に免疫化され、かつ生理食塩水で処置されたマウスの肺切片を
示す。

【図１０Ｂ】 ＯＶＡで慢性的に免疫化され、かつ生理食塩水で処置されたマウスの肺切片を
示す。

【図１０Ｃ】 ＯＶＡで慢性的に免疫化され、かつ生理食塩水で処置されたマウスの肺切片を
示す。

【図１１Ａ】 ＯＶＡで慢性的に免疫化され、かつビヒクル（０．５％ＤＭＳＯ）で処置され
たマウスの肺切片を示す。

【図１１Ｂ】 ＯＶＡで慢性的に免疫化され、かつビヒクル（０．５％ＤＭＳＯ）で処置され
たマウスの肺切片を示す。

【図１１Ｃ】 ＯＶＡで慢性的に免疫化され、かつビヒクル（０．５％ＤＭＳＯ）で処置され
たマウスの肺切片を示す。

【図１２】 慢性喘息における組織形態測定を例示するヒストグラムである。

【図１３】 様々な処置の後における慢性喘息マウスの気道における粘液含有細胞の頻度を
例示するヒストグラムである。

【図１４】 慢性喘息マウスの肺における好酸球および好塩基球の浸潤に対する様々な処置
の効果を例示するヒストグラムである。

【図１５】 急性喘息マウスモデルにおけるＨＫ−Ｘおよびデキサメタゾンによる免疫化お
よび処置プロトコルの概略図である。

【図１６】 ＯＶＡ特異的なＩｇＥレベルに対するデキサメタゾンおよびＨＫ−Ｘの鼻内投
与の効果を比較するヒストグラムである。

【図１７】 急性喘息マウスモデルにおけるＨＫ−Ｘおよび対照ペプチドよる免疫化および
処置プロトコルの概略図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/08 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ 43/00 １０５ １１１ １１１ Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ， ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，Ｋ Ｒ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ， ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，Ｓ Ｉ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C084 AA02 AA19 BA01 BA08 BA15 BA16 BA23 BA31 CA59 DA39 DA58 MA02 NA14 ZA591 ZA612 ZB071 ZB072 ZB111 ZB131 ZB212 ZC012 ZC412 ZC751 ZC752

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物におけるＩｇＥ媒介応答から生じる適応症を処置す
   るための方法であって、ＩｇＥをダウンレギュレーションするのに効果的な量の
   、式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−
   ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択される）を有するペプチドを前
   記哺乳動物に投与することを含む方法。
2. 【請求項２】 抗ロイコトリエン剤、β_２−アゴニストおよびコルチコステ
   ロイドからなる群から選択される別の有効成分が前記ペプチドと一緒に投与され
   る、請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 ＩｇＥに対する受容体をダウンレギュレーションするための
   方法であって、ＩｇＥ受容体をダウンレギュレーションするのに効果的な量の、
   式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐ
   ｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択される）を有するペプチドを投与
   することを含む方法。
4. 【請求項４】 前記ＩｇＥ受容体は、Ｆｃ_εＲＩ、Ｆｃ_εＲＩＩおよび可溶
   性Ｆｃ_εＲＩＩからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
5. 【請求項５】 ＣＤ４０リガンドをダウンレギュレーションし、それにより
   ＩｇＥ産生におけるそのさらなる関与を妨げるための方法であって、ＣＤ４０リ
   ガンドをダウンレギュレーションするのに効果的な量の、式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ
   −Ｘ（式中、Ｘは、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔ
   ｙｒからなる群から選択される）を有するペプチドを投与することを含む方法。
6. 【請求項６】 形質細胞によるＩｇＥ分泌を阻害するための方法であって、
   前記形質細胞を、ＩｇＥ分泌を阻害するのに効果的な量の、式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅ
   ｕ−Ｘ（式中、Ｘは、Ｔｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−
   Ｔｙｒからなる群から選択される）を有するペプチドと接触させることを含む方
   法。