KR100629546B1

KR100629546B1 - 소형 펩타이드 및 천식 및 염증을 치료하기 위한 방법

Info

Publication number: KR100629546B1
Application number: KR1020007005194A
Authority: KR
Inventors: 하욱존씨
Original assignee: 히스타테크, 엘엘씨
Priority date: 1997-11-13
Filing date: 1998-07-07
Publication date: 2006-09-27
Also published as: US20130274208A1; ATE432078T1; US20080214478A1; DE69840851D1; US7994137B2; EP1037651A1; CA2309639A1; US8097589B2; CN1282253A; US20130252907A1; US20140127245A1; EP1037651B1; US20080214475A1; CA2309639C; ES2326500T3; BR9815288A; US20080214477A1; US20080214472A1; US20120058958A1; US6391856B1

Abstract

약리학적 담체 및 식 f-Met-Leu-X(여기에서 X는 Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe 및 Phe-Tyr로 구성되는 그룹으로부터 선택된다)를 갖는 펩타이드의 혼합물로서 약제학적 조성물이 기술된다. 또한 예를들어, 염증이 천식, 류마티스성 관절염 및 아나필락시로 구성되는 그룹으로부터 선택된 질병의 결과인 경우환자에 있어서 비만 세포의 탈과립화를 억제하고 염증을 치료하기 위한 방법이 기술된다. 또한, 환자에 있어서 시토킨의 방출을 억제하는 방법, 환자에 있어서 히스타민의 방출을 억제하는 방법, 환자에 있어서, 히스타민의 방출을 억제하는 방법. 환자에 있어서 류코트리엔 방출을 억제하는 방법, 환자의 염증 부위에 림프구, 호산수 및 호중구의 접착, 이동 및 응집을 감소시키기 위한 방법, 환자의 염증 부위에서 IgE 항체의 생산을 감소시키는 방법, 및 환자의 염증 부위에서 혈관의 투과성이 증가되는 것을 억제하는 방법이 기술된다. 이 방법들은 상기의 약제학적 조성물을 사용한다.

Description

소형 펩타이드 및 천식 및 염증을 치료하기 위한 방법{Small peptides and methods for treatment of asthma and inflammation}

본 발명은 비만 세포 탈과립화 억제 활성을 갖는 소형 펩타이드 및 염증을 치료하는 방법에 관한 것으로, 특히 염증치료에 유용한 N-포르밀-메티오닐 펩타이드에 관한 것이다. 보다 특히, 본 발명은 예를들어 천식, 류마티스성 관절염 및 아나필락시를 포함한 비만세포 탈과립화(degranulation)를 포함하는 질병 또는 증상을 치료하는 방법에 관한 것이다.

천식은 복합 질환이다. 유전성 및 환경적 인자들(알레르기, 바이러스성 감염, 자극)이 천식의 개시 및 그의 염증성 악화에 관여한다. 천식환자(성인 및 어린이)의 반이상이 알레르기를 갖고; 정말로, 집 먼지 진드기 배설물에 대한 알레르기가 천식의 발달 및 악화의 주요 인자이다. 유년기동안 호흡기 합포체(syncytial) 바이러스의 감염은 또한 천식의 발달과 매우 관련되어 있고, 호흡기 바이러스 감염은 종종 급성 에피소드를 야기한다.

30년전 베타₂ 수용체에 대해 선택적인 기관지 확장 베타₂-작용제--아드레날린성 작용제의 도입은 천식 치료를 대변혁시켰다. 이들 작용제는 알파- 및 베타- 아 드레날린성 수용체를 자극하는, 이소프로테레놀과 같은 비선택적인 아드레날린성 수용체 작용제보다 효능적이고 보다 오래 작용(4-6시간)하는 것으로 입증되었다. 베타₂-작용제는 급속히 증상을 완화하고 또한 운동 및 냉냉한 공기의 흡입과 같은 자극에 의해 야기되는 급성 기관지확장으로부터 보호한다. 사용 빈도는 천식 억제의 지시자 기능을 할 수 있다. 최근에, 더 오래(extra long)-작용하는 베타₂-작용제 살메테롤(12시간 까지 동안)이 미합중국에 출현했다. 살메테롤은 염증 신호를 마스킹 할수 있을 정도로 효능적이다; 따라서, 이는 항염증제와 함께 사용되어야 한다.

테오필린은 좁은 치료 한계(혈중 농도 추적이 독성을 피하기 위하여 권장된다) 및 약물 상호작용 경향(간의 시토크롬 P-450 약물-대사 효소에 대한 경쟁은 동일한 시스템에 의해 대사되는 수개의 중요한 약물의 혈장 농도를 변형시킨다)을 갖는 비교적 약한 기관지 확장제이다.

약한 천식은 돌파(breakthrough) 증상 또는 알레르겐- 또는 운동-유도된 천식을 완하하기위하여 항-염증성-코르티코스테로이드 또는 비만세포 억제제(크로몰린 소듐 또는 네도크로밀)를 매일 흡입하고, 필요한대로( 1일 3-4회) 베타₂-작용제를 흡입하여 치료한다. 크로몰린 소듐 및 네도크로밀은 기관지 경련 및 염증을 차단하나, 보통 알레르겐 또는 운동과 관련된 천식에만 및 전형적으로 어린 천식 환자에만 효과적이다. 흡입된 코르티코스테로이드는 염증, 기도 과다활동 항진(airways hyperreactivity), 및 폐쇄(obstruction)를 개선시키고, 급성 악화(exacerbations)의 수를 감소시킨다. 그러나, 효과가 명백하는데에는 한달이 걸리고, 뚜렷한 개선이 나타나기에는 1년이 걸린다. 가장 잦은 부작용은 쉰목소리 및 경구 칸디다증이다. 보다 고투여량의 사용 경우에서만이지만 보다 심각한 부작용인 부분적 부신 억제, 성장 억제, 및 감소된 뼈 형성이 보고되었다. 베클로메타손, 트리암시놀론, 및 플루니솔리드가 아마도 유산한 mg-대-mg 효능을 나타내고; 새로이 승인된 부데소니드 및 플루티카손이 보다 효능적이고, 전신적 부작용이 적다고 보고되었다.

약한 질병을 앓는 환자조차도 점막 및 상피에의 활성화된 T-세포, 비만세포, 및 호산구(eosinophils)의 침투를 포함하는 기도 염증을 나타낸다. T-세포 및 비만세포는 호산구 성장 및 성숙 및 IgE 항체의 생성을 촉진하는 시토킨을 방출하고, 다시 미소혈관계 투과성을 증가시키며, 상피를 붕괴시키고, 신경 반사작용 및 점액-분비 선을 자극한다. 결과적으로, 숨을 헐떡임, 기침 및 호흡곤란에 의해 징후가 나타나는 기도 과다활동 항진, 기관지 수축, 및 과분비가 일어난다.

전통적으로, 천식은 경구용 및 흡입되는 기관지확장제로 치료되어 왔다. 이들 제제는 천식의 증상에는 도움이 되지만, 근원적인 염증에 대해서는 도움이 안된다. 지난 10년동안 천식의 원인론에서 염증의 중요성이 인식되어 코르티코스테로이드의 사용이 증가되었으나, 많은 환자들은 계속 억제되지 않는 천식을 앓고 있다.

과학자들은 류코트리엔(이에는 A, B, C, D, 및 E 서브타입이 있다)이 천식에서 중대한 역할을 한다고 결정지었었다. 류코트리엔은 기도 평활근 경련을 일으 키고, 혈관 투과성을 증가시키며, 부종을 일으키고, 점액 생성을 증가시키며, 뮤코실리어리(mucociliary) 수송을 감소시키며, 백혈구 화학주성을 일으킨다.

관련된 프로스타글란딘 화합물과 같이, 류코트리엔은 세포막에서 아라키돈산으로부터 합성된다. 비만 세포, 호산구, 대식세포, 단핵세포, 및 호염기구에서 아라키돈산은 포스포리파제 A2를 활성화시켜 막 인지질로부터 형성된다. 형성후, 아라키돈산은 두개의 주요 경로를 통해 대사된다: 사이클로옥시게나제 경로(다양한 프로스타글란딘 및 트롬복산을 생성함) 및 5-리폭시게나제 경로(류코트리엔을 생성). 아라키돈산 대사의 도식은 도4에 예시되어 있다. 프로스타글란딘, 트롬복산, 및 류코트리엔은 집합적으로 에이코사노이드라고 알려져 있다.

항-류코트리엔은 염증 캐스케이드(cascade)에서 초기 단계들을 방해하는 잠재력을 갖는 항-천식제의 이종 부류의 한 구성원이다. 류코트리엔은 프로스타글란딘과 관계가 있는 염증 물질이고; 둘 모두 세포막에서 아라키돈산으로부터 생성된다. 비만세포, 호산구, 대식세포, 단핵세포, 및 호염기구에서 아라키돈산이 형성된후, 이는 두개의 주요 경로를 통해 대사된다:(1) 사이클로옥시게나제 경로(프로스타글라딘과 트롬복산을 생성한다) 및 (2) 세포질에서 류코트리엔을 생성하는 5-리폭시게나제 경로. 류코트리엔은 아나필락시의 느린 반응 물질("SRS-A")로서 의학계에서 잘 알려져 있다. 류코트리엔은 기관지 염증에서 중요한 역할을 한다. 이들은 다양한 백혈구 세포(예, 호중구, 호산구, 및 단핵세포)의 혈관에의 이동, 접착 및 응집을 유도하고, 모세혈관 투과성을 증가시키며, 기관지 및 혈관 평활근 수축을 일으킨다. 결과로는 간질성(intestitial) 부종, 백혈구 화학주성, 점액 생성, 뮤코실리어리 역기능, 및 폐에서의 기관지 경련이 나타난다. 특정 부류의 류코트리엔, 예를들어 시스테이닐 류코트리엔(LTD₄)이 특히 효능있는 기관지 수축제이고, 히스타민 보다 대략 100 내지 1,000 배 활성적이다. 시스테이닐 류코트리엔을 포함하는 류코트리엔은 탈과립화동안 비만세포로부터 방출된다.

류코트리엔 수용체를 차단하거나 효소 5-리폭시게나제를 차단하여 류코트리엔 합성을 방지하는 다수의 항-류코트리엔이 연구중에 있고 시판되고 있다. 류코트리엔 억제제는 작용이 이종성이다: 일부는 5-리폭시게나제를 직접 직접 차단하고, 일부는 5-리폭시게나제를 활성화시키는 단백질을 억제하며, 일부는 단백질상의 아라키도네이트 결합 부위에서 아라키도네이트를 대체한다. 대조적으로, 류코트리엔 길항제는 기도 과다활동, 기관지 수축 및 과분비를 중재하는 수용체 자체를 차단한다.

인간 폐 비만 세포는 시험관내에서 IgE 자극후 종양 괴사 인자(TNF), IL-4 및 IL-5를 생성한다(Chest 1997; 112:523-29). 기관지내 생검 종에서의 면역조직화학적 분석은 IL-6 생성과 함께 이를 확인하였다. 또한, 비만세포 계수 및 TNF는 정상적 대상과 비교했을 때 천식환자에서 통계학적으로 보다 유의적이다. TNF 및 IL-4는 기관지 맥관구조의 내피층에서 맥관 세포 접착 분자-1(VCAM-1)--면역글로부린 슈퍼 패밀리의 접착분자--의 발현을 업-레귤레이션(up-regulation)을 가능하게 할 수 있다. 호산구, 호염기구 및 단핵 세포는, VCAM-1과 상호작용하는, 그들의 세포 표면상의 매우 늦은 활성화 항원 4(VLA-4) 인테그린을 나타낸다. 따라서, 상호작용 VLA-4/VCAM-1을 통하여, TNF 및 IL-4는 순환하는 백혈구의 동원(recruiment)을 용이하게 한다. 비만세포가 IgE-중재된 자극에 미리형성된 시토킨(TNF)를 방출하는 능력 및 다른 것(IL-4, IL-5)을 급속히 합성하는 능력은 기관지 염증에 이르는 초기 사건일 수 있다. 사실, TH2 클론의 유도 및 활성화는, 추가로 시토킨 생성을 통하여, 염증 반응의 말기 효과인자(effactors)로 작용하는 호산구의 활성화 및 동원을 용이하게한다. 다시, 백혈구(특히, TH2 세포)에 의해 생성된 시토킨은 점막 비만세포의 발달, 활성화 및 프라이밍(priming)에 깊숙히 영향을 주고, 따라서 양성의 예비염증 루프를 촉진시킨다. 인간 비만 세포가 IL-8을 생성하고, 쥐의 폐-유래된 비만세포가 케모킨, 단핵세포 주화인자 단백질-1 및 대식세포 염증 단백질-1을 발현한다는 것이 최근 밝혀졌다. 이는 분류학적으로 백혈구 동원(IL-4, IL-5, TNF)에 포함된 시토킨외에도 비만세포가 또한 호산구 및 다형핵 백혈구(IL-8)에 작용하면서, 기도에서 추가의 효능있는 주화인자를 생산한다. 또한, 히스타민-방출 인자로서 작용하는 케모킨이 비만세포 탈과립화를 유도하기 때문에, 이들은 또한 오토크린(autocrine) 활성화 루프를 유지할 수 있다.

비만세포는 또한 시험관내에서 IgE 합성을 위해 IL-4와 함께 요구되는 세포 접촉(호염기구와 같이)을 제공하는 B-세포 성장에서 중요한 역할을 하며, 이는 비만세포가 T-세포와 독립적으로 IgE 생산을 직접적으로 조절할 수 있으며, IgE 가교-결합시 국부적인 TH2 반응을 개시하기에 충분한 양의 IL-4를 생산하며, T-세포의 서브세트는 아토피성 천식에서 중추적 역할을 한다는 것을 제안한다. 더구나, 비만세포는 또한 T-림프구에 항원-제공 세포로서 작용할 수 있어, 천식의 면역 네트웍에서 비만세포의 보다 큰 역할을 제시한다.

N-포르밀-메티오닐-류실-페닐알라닌에 의한 비만세포 탈과립화의 억제가 문헌[Inflammation, Vol. 5, No. 1, pp. 13-16(1981)]에 보고되어 있다. 여기에서, 두개의 구조적으로 상이한 화학주성의 펩타이드, 즉 펩스타틴 및 N-포르밀-메티오닐-류실-페닐알라닌이 래트 피부에서 40/80, 항-래트 IgE 혈청, 또는 송아지 폐로부터 단리된 거대분자 음이온성 투과성 인자를 피내주입에 의해 생성된 혈관 투과성에서의 증가를 억제한다는 것이 보고되었다. 또한, 이들 펩타이드들은 비만세포에 직접적으로 작용하는 것으로 보인다고 보고되었다.

인간에서의 염증 질병, 특히 예를들어 천식, 관절염 및 아나필락시의 치료의 중요성 때문에, 부작용이 적은 새로운 생리활성 화합물이 계속 요구되고 있다. 천식 염증 과정의 상황내에서 본 발명의 신규한 펩타이드의 개재에 의한 비만세포 탈과립화의 억제가 도 4에 시각적으로 묘사되어 있다.

본 발명은 적절한 약리학적 담체안에 비만세포 탈과립화 억제 활성을 갖는 N-포르밀-메티오닐-류실("f-Met-Leu") 펩타이드를 함유하는 신규의 약제학적 조성물을 제공한다. 특히 유용한 이러한 펩타이드는 식 f-Met-Leu-X(여기에서, X는 Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe 및 Phe-Tyr로 구성되는 그룹으로부터 선택된다)를 갖는 펩타이드이다. 이러한 펩타이드는 염증 치료, 및 특히 천식, 관절염 및 아나필락시와 관련된 염증을 치료하는데에 유용하다. 이들 펩타이드는 또한 만성 폐쇄성 폐 질병 및 만성 염증 내장 질병을 치료하는데에 유용하다.

본 발명에 따르면, 포유동물에서 염증을 치료하는 방법은 포유동물에 항-염증 유효량의 식 f-Met-Leu-X(여기에서, X는 Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe 및 Phe-Tyr로 구성되는 그룹으로부터 선택된다)를 갖는 펩타이드를 투여하는 것을 포함한다. 천식과 관련된 염증을 치료하는 경우, 바람직한 투여 방식은 흡입이다. 관절염과 관련된 염증을 치료하는 경우 바람직한 투여방식은 적절한 약리학적 담체를 사용하는 국소적 적용 또는 피내 주입이다.

본 발명은 또한 비만세포의 탈과립화를 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 비만세포를 탈과립화 억제량의 식 f-Met-Leu-X(여기에서, X는 Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe 및 Phe-Tyr로 구성되는 그룹으로부터 선택된다)를 갖는 펩타이드와 접촉시키는 것을 포함한다.

추가로, 본 발명은 시토킨, 히스타민 및 류코트리엔의 방출을 억제하는 방법을 제공한다. 시토킨 방출 억제 방법은 환자에게 시토킨 방출 억제 유효량의 식 f-Met-Leu-X(여기에서, X는 Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe 및 Phe-Tyr로 구성되는 그룹으로부터 선택된다)를 갖는 펩타이드를 투여하는 것을 포함한다. 히스타민 방출 억제 방법은 환자에게 히스타민 방출 억제 유효량의 식 f-Met-Leu-X(여기에서, X는 Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe 및 Phe-Tyr로 구성되는 그룹으로부터 선택된다)를 갖는 펩타이드를 투여하는 것을 포함한다. 류코트리엔 방출 억제 방법은 환자에게 류코트리엔 방출 억제 유효량의 식 f-Met-Leu-X(여기에서, X는 Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe 및 Phe-Tyr로 구성되는 그룹으로부터 선택된다)를 갖는 펩타이드를 투여하는 것을 포함한다.

또다른 구체예에 따르면, 본 발명은 환자에서 염증 부위에 림프구, 호산구 및 호중구의 접착, 이동 및 응집을 감소시키는 방법을 제공한다. 이 방법은 환자에게 억제 치료 유효량의 식 f-Met-Leu-X(여기에서, X는 Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe 및 Phe-Tyr로 구성되는 그룹으로부터 선택된다)를 갖는 펩타이드를 투여하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 환자에서 IgE 항체의 생성을 감소시키고 염증 부위에서 IgE 가교-결합을 감소시키거나 차단하는 방법을 제공한다. 이 방법은 환자에게 IgE 항체 생산 억제 유효량의 식 f-Met-Leu-X(여기에서, X는 Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe 및 Phe-Tyr로 구성되는 그룹으로부터 선택된다)를 갖는 펩타이드를 투여하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명은 환자의 염증부위에서 혈관 투과성이 증가되는 것을 억제하는 방법을 제공한다. 이 방법은 환자에게 혈관 투과성 억제 유효량의 식 f-Met-Leu-X(여기에서, X는 Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe 및 Phe-Tyr로 구성되는 그룹으로부터 선택된다)를 갖는 펩타이드를 투여하는 것을 포함한다.

본 발명의 특정의 바람직한 구체예에서, 만성 염증을 앓는 환자는 또다른 활성 성분과 배합하여 본 발명의 펩타이드를 투여하여 이익을 얻을 수 있다. 본 발명에 따른 이런 배합에 특히 유용한 다른 활성 성분은 예를들어 항류코트리엔, 베타₂ 작용제, 코르티코스테로이드등이다.

도 1은 화합물 48/80의 다양한 농도에 대한 모세혈관 투과성의 영역을 예시하는 로그 투여량 반응 곡선이다.

도 2는 f-Met-Leu-Phe의 다양한 농도에 의한 모세혈관 투과성의 억제경우의 투여량 반응 곡선이다.

도 3은 본 발명의 바람직한 펩타이드의 다양한 농도에의한 모세혈관 투과성의 억제경우의 투여량 반응 곡선이다.

도 4는 비만세포 탈과립화의 억제를 추가로 예시하는 아라키돈산 대사의 주요 경로의 도식적인 예시도이다.

도 5A 및 -5B는 OVA-유도된 기관지 천식 마우스 모델에서 사용되는 표준(5A) 및 분할(resolution)(5B)의 상이한 프로토콜의 도식적 예시도이다.

도 6a-6D는 처리된 마우스 및 대조군 마우스에서 OVA-유도된 천식을 억제하는 본 발명의 화합물에 의한 처리의 비교 병리조직학을 예시하는 현미경 사진이다.

도 7은 쥐 천식 모델에서 점액 플러그(plug)를 형성하는데 대한 본 발명에 따른 처리의 결과를 보여주는 막대 그래프이다.

본 발명에 따르면, 식 f-Met-Leu-X(여기에서, X는 Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe 및 Phe-Tyr로 구성되는 그룹으로부터 선택된다)의 특정한 소형 펩타이드는 비만세포의 탈과립화를 억제하는데에 놀라운 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 결과로서, 이러한 펩타이드는 시토킨(예를들어, TNF), 및 히스타민 및 류코트리엔의 방출을 억제하고, 예를들어 천식, 류마티스 및 아나필락시와 같은 다양한 병으로부터 생성될 수 있는 염증의 치료에 유용하다. 이러한 펩타이드는 또한 만성 폐쇄 폐 질병 및 만 성 염증 내장 질병의 치료에 유용하다.

본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 펩타이드는 또한 호산구, 호염기구 및 호중구의 염증 조직으로의 침투를 감소시킬 수 있다. 림프구, 호산구, 및 호중구는 본 발명의 바람직한 펩타이드에 반응하여 화학주성을 나타내지 않는다. 또한, 본 발명의 바람직한 화합물은 심장, 간 및 폐와 같은 지극히 중요한 기관에 독성을 나타내지 않는다.

본 발명의 펩타이드는 통상적인 소형 펩타이드 화학 기법에 의해 제조할 수 있다. 투여에 사용될 때, 펩타이드는 무균 조건하에서 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제와 함께 제조된다.

약제학적 조성물의 투여량은 대상에 따라 및 사용된 특별한 투여 경로에 따라 변할 수 있다. 투여량은 1일 0.1 내지 100,000 ㎍/kg, 보다 바람직하게는 1 내지 10,000 ㎍/kg 범위일 수 있다. 가장 바람직한 투여량 범위는 약 1 내지 100 ㎍/kg, 보다 바람직하게는 약 1 내지 10 ㎍/체중 kg이다. 투여량은 전형적으로 증상의 심각성에 따라 하루 내지 매 4-6 시간마다 1회 투여된다. 급성인 상황인 경우, 매 4-6 시간마다 펩타이드를 투여하는 것이 바람직하다. 유지 또는 치료 사용경우, 하루에 오직 1회 또는 2회 투여하는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 투여 경로 및 증상의 심각성에 따라 1일당 약 0.18 내지 약 16 mg의 펩타이드를 투여한다. 특별한 조성물의 다중 투여량의 전달을 위한 바람직한 시간 간격은 일상적인 실험이상을 하지않으면서 본 분야에 숙련된자에 의해 결정될 수 있다.

투여 경로는 경구, 비경구, 직장, 질내, 국소, 코, 눈, 직접 주입등을 포함 한다. 바람직한 구체예에서, 본 발명의 펩타이드는 항염증 유효량 또는 비만세포의 탈과립화를 억제하는 투여량으로 환자에게 투여한다. 예시적인 약제학적 조성물은 전형적으로 약제학적으로 허용되는 담체에 포함된 항염증 효과를 제공하거나 비만세포의 탈과립화를 억제하는 본 발명에 따른 치료 유효량의 펩타이드이다.

본 명세서에서 사용되고 하기에서 보다 자세히 기술되는 용어 "약제학적으로 허용되는 담체"는 인간 또는 다른 동물에 투여하기에 적절한 하나이상의 상용성 고체 또는 액체 충전 희석제 또는 캡슐화 물질을 포함한다. 본 발명에서, 용어"담체"는 따라서 본 발명의 분자가 적용을 용이하게 하도록 배합되는 천연 또는 합성의 유기 또는 무기 성분을 나타낸다. 용어 "치료-유효량"은 처리하려는 특별한 증상에 원하는 결과를 낳거나 원하는 영향을 주는 본 약제학적 조성물의 양이다. 다양한 농도가 치료하려는 환자의 연령, 증상의 심각성, 치료 기간 및 투여 방식에서의 변화를 주기위해 동일한 성분을 혼입한 조성물을 제조하는 데에 사용될 수 있다.

담체는 또한 상용성이어야 한다. 본 명세서에서 사용된 용어"상용성"이란 약제학적 조성물의 성분들이 본 발명의 소형 펩타이드와 서로, 투여량이 원하는 약제학적 효능을 실질적으로 손상시키지 않으면서 혼합될 수 있는 것을 의미한다.

본 발명의 소형 펩타이드는 전형적으로 그자체로서(neat) 투여된다. 그러나, 이들은 약제학적으로 허용되는 염의 형태로 투여될 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 염은 제한되는 것은 아니지만 다음의 산으로부터 제조되는 것을 포함한다: 염산, 브롬화수소산, 황산, 질산, 인산, 말레산, 아세트산, 살리실산, p- 톨루엔-설폰산, 타르타르산, 시트르산, 메탄설폰산, 포름산, 말론산, 숙신산, 나프탈렌-2-설폰산, 및 벤젠설폰산. 또한, 약제학적으로 허용되는 염은 카복실산 그룹의 나트륨, 칼륨 또는 칼슘염과 같은 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 염으로서 제조될 수 있다. 따라서, 본 발명은 하나이상의 약제학적으로 허용되는 담체 및 임의로 다른 치료 성분과 함께 본 발명의 펩타이드를 포함하는 의학 용도의 약제학적 조성물을 제공한다.

조성물은 본 발명의 물질을 사용하여 투여 경로로서 사용될 수 있는 경구, 직장, 질내, 국소, 코, 눈 또는 비경구 투여에 적절한 것을 포함한다. 본 발명의 펩타이드를 함유하는 약제학적 조성물은 또한 안정화제(장기간 저장이 가능하도록), 유화제, 결합제, 농후화제, 염, 방부제, 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장제 및 흡수지연제와 같은 부형제를 포함할 수 있는 하나이상의 약제학적으로 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 약제학적 활성 물질용의 이러한 매질 및 제제의 사용은 본 분야에 잘 알려져 있다. 어떤 통상적인 매질 또는 제제가 본 발명의 펩타이드와 비상용성이지 않는한, 약제학적 제제에서의 그의 사용이 여기에서 예측된다. 보충의 활성 성분이 또한 본 발명의 조성물에 혼입될 수 있다.

경구 투여에 적합한 조성물이 천식의 치료에 바람직하다. 전형적으로, 이러한 조성물은 흡입 에어로졸, 네불(nebule), 시럽 또는 정제로서 제조된다. 경구 조성물이 또한 편리할 수 있지만 국소 투여에 적절한 조성물이 관절염의 치료에 바람직하다. 전형적으로, 이러한 국소 조성물은 크림, 연고 또는 용액으로서 제조된 다.

조성물은 편리하게는 단위 투여형으로 제공될 수 있으며, 약학 분야에서 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있다. 방법들은 전형적으로 본 발명의 활성 성분을 하나이상의 부속 성분들을 구성하는 담체와 결합시키는 단계를 포함한다.

흡입 투여에 적절한 본 발명의 조성물은 예를들어 에어로졸 또는 흡입 용액으로 제공될 수 있다. 전형적인 에어로졸 조성물의 예는 트리클로로모노플루오로메탄 및 디클로로디플루오로메탄에 더한 올레산의 혼합물에 현탁된 원하는 양의 미세결정성 펩타이드로 구성된다. 전형적인 용액의 예는 멸균 염수(용해도를 위하여 임의로 약 5%v/v 디메틸설폭사이드("DMSO")), 벤즈알코늄 클로라이드, 및 황산(pH 조정을 위하여)중에 용해되거나 현탁된 원하는 양의 펩타이드로 구성된다.

경구 투여에 적절한 본 발명의 조성물은 또한 본 발명의 펩타이드의 예정된 양을 함유하는 캡슐, 캐세이(cachets), 정제 또는 로젠지와 같은 분리된 유니트 또는 각각 리포좀내에 함유될 수 있는 분리된 유니트 또는 시럽, 엘리서르, 또는 유제와 같은 수성액 또는 비수성 액체중의 현탁액으로서 제공될 수 있다. 정제 제제 베이스의 예는 불활성 성분으로서 옥수수 전분, 락토오즈 및 마그네슘 스테아레이트를 포함한다. 시럽 제제 베이스의 예는 시트르산, 착색 염료, 향미제, 하이드록시프로필메틸셀루로즈, 사카린, 소듐 벤조에이트, 소듐 시트레이트 및 정제수를 포함한다.

비경구 투여용으로 적절한 조성물은 바람직하게는 수용체의 혈액과 등장성인 본 발명의 분자의 멸균 수성 제제를 편리하게는 포함한다. 이 수성 제제는 적절한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하는 공지된 방법에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사 제제는 예를들어 1,3-부탄 디올로서 비독성의 비경구적으로-허용가능한 희석제 또는 용매중의 멸균 주사 용액 또는 현탁제일 수 있다. 이용될 수 있는 허용가능한 비히클 및 용매에는 물, 링게르 용액 및 등장성 염화 나트륨용액이 있다. 수용액에는 일부 펩타이드의 용해도를 유지하기 위하여 약 10 %v/v이하의 DMSO 또는 트랩졸(Trappsol)이 사용될 수 있다. 또한, 편리하게는 멸균, 고정된 오일이 용매 또는 현탁 매질로서 이용될 수 있다. 이를 위하여, 합성 모노- 또는 디글리세리드을 포함하는 다수의 고정된 오일이 이용될 수 있다. 또한, 지방산(올레산 또는 중성 지방산과 같은)이 주사 제제에 사용될 수 있다. 또한, 플루로닉(PLuronic) 블록 공중합체는 37℃에서 수주 또는 수개월에 걸쳐 고체 형태로부터 시간 방출되는 기초로 화합물 주사경우 4℃에서 지질과 제형화된다.

국소 투여에 적절한 조성물은 트랩졸 또는 DMSO중의 용액으로서 또는 크림, 연고, 또는 로션으로서 제공될 수 있다. 전형적으로, 약 0.1 내지 약 2.5% 활성 성분이 베이스 또는 담체에 혼입된다. 크림 제제 베이스의 예에는 정제수, 와셀린, 벤질 알콜, 스테아릴 알콜, 프로필렌 글리콜, 이소프로필 미리스테이트, 폴리옥실 40 스테아레이트, 카르보머(carbomer) 934, 소듐 라우릴 설페이트, 아세테이트 디소듐, 수산화 나트륨, 및 임의로 DMSO이 있다. 연고 제제 베이스의 예에는 백색 와셀린 및 임의로 광유, 소르비탄 세스퀴올리에이트, 및 DMSO가 있다. 로션 제제 베이스의 예에는 카르보모 940, 프로필렌 글리콜, 폴리소르베이트 40, 프로필렌 글리콜 스테아레이트, 콜레스테롤 및 관련된 스테롤, 이소프로필 미리스테이트, 소르비탄 팔미테이트, 아세틸 알콜, 트리에탄올아민, 아스코브산, 시메티콘, 및 정제수가 있다.

비만 세포 탈과립화의 억제를 측정하기 위한 래트 피부 모델

알레르기 유도된 천식은 유기체가 과민화되는 물질(알레르겐)에의 노출에 의해 일어난다. 알레르겐에의 노출은 폐에서 비만 세포의 탈과립화를 일으키고 류코트리엔 및 히스타민을 방출시킨다. 류코트리엔 및 히스타민의 방출에 반응하여, 모세혈관 투과성이 드라마틱하게 증가되고, 혈장이 모세혈관으로부터 주위 조직으로 누출된다. 이러한 노출로부터 생성되는 호흡기 증상은 극도의 만성 경우 아나필락시에 의한 사망을 포함하는, 온화한 것(가려움 및 재채기)으로부터 잠재적으로 치명적인 것(천식)에 이른다.

이 현상을 실험적으로 입증하기 위하여, 폐대신 래트 피부로 대체했다. 이 모델에서, 실험 래트의 혈장은 염료 트리판 블루(trypan blue)로 표지화한다. 이 가용성 염료는 혈장 그자체의 패시브(passive) 마커로서 혈류중에 수반되고, 간세포에서 배제된다. 모세혈관 시스템을 포함하는 완전한 혈관은 정상 상황에서 이 염료를 보유한다. 비만 세포의 탈과립화(류코트리엔 및 히스타민을 방출시킴)유도하는 화합물을 알레르겐-유도된 탈과립화를 자극하기 위하여 피부에 주입한다. 이 실험에서, 이를 위하여 화합물 48/80을 사용하였다. 류코트리엔 및 히스타민 방출에 이어지는 사건에서, 모세혈관 투과성이 증가되고, 푸르게 염색된 혈장이 모세혈관으로부터 누출되어 주입 부위 주변의 피부를 푸르게 염색시킨다. 푸르게 되는 영역은 주입된 화합물 48/80의 양의 측정이다.

한 화합물을 주입전 화합물 48/80과 혼합하여 "항-류코트리엔" 및 /또는 "항-히스타민" 활성에 대해 시험할 수 있다. 시험 화합물이 류코트리엔 또는 히스타민 방출을 억제한다면, 화합물 48/80이 어떤 시험 화합물 없이 주입된 동일한 래트에서의 주입 부위에 비교했을 때, 보다 작은 직경의 푸른 영역이 관찰된다. 높은 항-류코트리엔 및 항-히스타민 활성의 경우에, 푸르름은 실제적으로 완전히 억제된다.

실험

래트 피부 모델에 대해 책임을 지고 확인하였다. 다양한 펩타이드를 예정된 투여량에서 항-류코트리엔 및/또는 항-히스타민 활성에 대해 시험하였다. 선택된 투여량에서 비교를 위한 표준 화합물인 f-Met-Leu-Phe에 대해 일반적인 비교가 가능하였다.

"투여량 반응" 적정화를 일부 화합물에 대해 수행하고 표준 화합물과 비교하였다. 추정상의 억제 화합물의 일련의 작은 투여량을 사용하여 모세혈관 투과성의 영역 크기의 일련의 감소를 관찰하는 것은 초기 예정된 투여량 시험에서 관찰되는 류코트리엔 및/또는 히스타민 방출의 억제를 확인한다.

재료 및 방법

다양한 수의학 공급자에게서 입수된 수의학 마취제인 케타민을 제외한 시약들은 Sigma 또는 Aldrich로부터 입수하였다. 사용된 래트는 B&K International로부터 구입시 220-240g의 수컷 스프레그-도울리 혈통(Sprague-Dawley breed)이었다.

래트 피부 반응 경우, 래트를 케타민 0.25 ml 10 mg/ml으로 마취시켰다. 염 수중의 1.0 ml 트리판 블루(멸균 여과)를 꼬리 정맥에 투여하고, 래트의 등을 면도했다. 래트당 4개의 피내 주입 부위를 시험 및 대조군 주입을 위하여 사용하였다.

화합물 48/80을 염수중의 1.5 mg/ml 저장 용액으로서 제조하였다. 이 물질은 수용액중에서 잠재력으로 불안정한 것으로 확인되고, 각 날짜에 새롭게 제조하였다. 각 래트에 주입하기전 작업 수준으로 염수중의 일련의 희석액을 제조하였다.

펩타이드를 DMSO중의 23 mM 저장 용액으로서 제조하고, 실험간에 -20℃에서 저장하였다. 사용시, 냉동 저장 용액을 해동시키고, 적절한 분취량을 적절한 양의 DMSO와 함께 화합물 48/80의 희석액에 첨가하여 5 ㎕ DMSO 대 0.1 ml 수성 화합물 48/80의 비를 만들었다. 이로써 특정 펩타이드의 용해도를 유지하는데에 필요한 5% DMSO 용액을 얻었다. 5% DMSO의 효과는 0인 대조군 실험에 의해 입증되었다.

주입을 위하여, 0.1 ml 화합물 40/80, +/- 시험 화합물을 마취되고 염색되며, 면도된 래트에 피내 주입하였다. 15분의 인큐베이션에 이어, 래트를 경부 탈구(cervical dislocation)에 의해 희생시키고, 등 피부를 채취하여 경량 박스에 위치시켰다. 백리트(backlit) 피부의 영상을 CCD 비데오 캡춰 카메라 및 상용성 하드웨어/소프트웨어를 사용하여 디지탈화하였다. 디지탈화된 영상을 과학 그래픽 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 분석하고, 모세혈관 투과성의 영역(푸름)을 인테그레이션하여 추가 분석을 위한 디지탈 값을 얻었다.

약 0.01 ㎍ 내지 약 15 ㎍의 다양한 투여량에서 화합물 48/80을 사용하여 투여량 반응 곡선을 작성하였다. 그 결과를 도 1에 나타냈다. 래트-대-래트변화( 예, 피부의 두께)에 기초한 화합물 48/80의 소정의 투여량에서 모세혈관 투과성 영역의 직경에서 넓은 가변성이 주목되었다. 화합물 48/80의 0.15 ㎍ 투여량을 추가 시험을 수행하기 위하여 선택했다.

실시예 1

0.15 ㎍의 화합물 48/80의 선택된 투여량을 사용하여 표준 화합물, f-Met-Leu-Phe에 대하여 투여량 반응 곡선을 작성하였다. 0 내지 약 230 nM의 f-Met-Leu-Phe 투여량을 시험하고, 그 결과를 도 2에 나타냈다. 화합물 48/80에 의해 유도된 탈과립화의 억제가 분명히 나타났다.

실시예 2-11

수개의 f-Met-Leu 펩타이드를 100 나노몰의 시험 펩타이드 및 0.15 ㎍ 화합물 48/80 투여량을 사용하여 래트 피부 모델에서 유도된 탈과립화의 억제에 대해 시험하였다. 고유의 제로-펩타이드-투여량 48/80 대조군을 각 실험경우 각 래트에 포함시키고, 억제%를 이 대조군(0% 억제)에 관련하여 표현하였다. 48/80에 의해 생성된 비만 세포 탈과립화 퍼센트를 또한 측정하였다. 그 결과를 하기에 표에 나타내었다.

표 1

실시예	펩타이드	억제%	탈과립화 %
2	f-Met-Leu-Phe(선행기술)	30	60
3	N-아세틸-Met-Leu-Phe	0	98
4	N-t-BOC-Met-Leu-Phe	0	-
5	f-Met-Leu-(요오도)Phe	0	-
6	f-Met-Leu-Phe(벤질아미드)	0	-
7	f-Met-Leu-Phe-Lys	0	-
8	f-Met-Leu-Phe(메틸 에스테르)	0	-
9	f-Met-Leu-Phe-Phe	100	1-3
10	f-Met-Leu-Tyr	55	30
11	f-Met-Leu-Tyr-Tyr	0	-

실시예 12

0.15 ㎍ 화합물 48/80의 선택된 투여량을 사용하여 f-Met-Leu-Phe-Phe에 대하여 투여량 반응 곡선을 작성하였다. f-Met-Leu-Phe-Phe의 0 내지 230 nM의 투여량을 시험하고 그 결과를 도 3에 나타내었다. 놀랍게도 화합물 48/80에 의해 유도된 탈과립화의 괄목할만한 억제가 분명히 나타났다. f-Met-Leu-Phe-Phe경우 유도된 탈과립화의 억제가 예기치않게 표준 화합물 f-Met-Leu-Phe보다 상당히 우수했다.

OVA-유도된 기관지 천식 마우스 모델

비만 세포 탈과립화의 억제를 위한

천식은 기도 폐쇄 및 영구적인 기관지 과반응(hyperresponsivness)의 자발적인 악화를 특징으로 하는 복합 질병이다. 기도 점막하조직으로의 활성화된 T-림프구, 호산구 및 대식세포/단핵 세포의 만성 침투가 또다른 특징이다. 시토킨의 발현과 함께 염증 메카니즘 및 염증 중개자의 방출이 기관지 수축 및 기관지 과반응의 병인론의 근저를 이룬다. 그러나, 많은 병인론 메카니즘, 예로 증상 및 만성 염증의 지속성을 유도하는 메카니즘 및 질병을 조절하고 방지하는데에 필요한 중재가 불분명하다.

단일 흡입된 알레르겐 챌린지(challenge)는 몇몇 개인 및 동물 모델에서 기도 반응의 급속한 증가를 유도할 수 있다는 것이 오랜동안 인지되어 왔다. 그러나, 반복된 알레르겐 흡입은 기도 반응에서 보다 뛰어나고, 지속적이며, 연장된 증가를 나타낸다. 장기간 반복된 알레르겐의 흡입의 이 마우스 모델이 폐에서의 알레르기 질병의 장기간 효과를 연구하기 위해서 및 인간 폐의 기도 과반응의 유도에 포함되는 세포, 메카니즘, 분자 및 중재자의 윤곽을 그리는데에 사용되어 왔다.

재료 및 방법

시약: 결정성 OVA를 Pierce Chem. Co.(Rockfold, IL)로부터 입수하였고, 알루미늄 포타슘 설페이트(alum)를 Sigma Chem. Co.(St. Louis, MO)로부터 입수하였으며, 피로젠이 없는 증류수를 Baxter, Healthcare Corporation(Deerfield, IL)로부터 입수하였고, 0.9% 염화 나트륨(보통 염수)을 Lymphomed(Deerfield, IL)로부터 입수하였으며, 트랩졸^TM HPB-L100(수성 하이드록시프로필 베타 사이클로덱스트린; 45 wt/vol% 수용액)을 Cyclodextrin Technologies Development, Inc.(Gainesville, FLA)로부터 입수하였다. OVA(보통 염수중의 500 ㎍/ml)를 증류수중의 10%(wt/vol)(알룸)의 동부피와 혼합했다. 실온에서 60분간 인큐베이션후 혼합물(10 N NaOH를 사용하여 pH 6.5)을 750g에서 5분간 원심분리했다; 펠리트를 증류수중에 본래 부피로 재현탁시키고 1시간안에 사용하였다.

선택적인 5-리폭시게나제 억제제, 질레우톤(Zileuton)(N-[1-벤조[b]티엔-2-일에틸]-N-하이드록시우레아; J. Pharmacol Exp Ther. 1991; 256:929-937)은 친절 하게도 Drs. Bell 및 George W. Carter(Abbott Laboratories, AbbotPart, IL)에 의해 제공받았다. 질레우톤을 트랩솔^TM에 용해시켰다. Histatek, Inc.(Seattle, WA)는 비만 세포 탈과립화 억제제, f-Met-Leu-Phe-Phe("HK-X")를 제공했다.

암컷 BALB/c Once(구입시 6-8주; D and K, Seattle WA)를 연구를 위하여 통상적인 조건하에서 생활하게 하였다.

알레르겐 면역화/챌린지 프로토콜: 표준(도 5A) 및 분할(도 5B)의 상이한 프로토콜에 따라 알룸을 갖는 OVA 0.2 ml(100 ㎍)을 마우스에 복강내 주사하였다(J Exp Med. 1996; 1483-1494). 상이한 프로토콜에 따라, 상이한 날에 별개로 0.05 ml 보통 염수중의 100 ㎍ OVA 비강내(i.n.) 투여량 및 0.05 ml 보통 염수중의 50 ㎍ OVA의 비강내 투여량을 받기전에 보통 염수중의 케타민(0.44 mg/ml)/크실라진(6.3 mg/ml)의 0.2 ml를 복강내 투여하여 마취시켰다. 두개의 대조군 그룹을 사용하였다. 따라서, 첫번째 그룹은 알룸을 갖는 보통 염수를 복강내 투여받고 알룸이 없는 보통 염수를 비강내 투여받았으며; 두번째 그룹은 알룸을 갖는 OVA를 복강내, 알룸이 없는 OVA 를 비강내 및 보통 염수만을 투여받았다.

조직학

기관(trachea) 및 좌측 폐(우측 폐는 기관지폐포 세정("BAL")을 위해 사용한다)를 수득하고 실온에서 6-15 시간동안 10% 중성 포름알데히드 용액중에서 고정시켰다. 파라핀에 묻은 다음에, 조직을 5 ㎛ 섹션으로 절단하고, 추가로 상이한 염색 또는 면역표지화시켰다. 디스콤브(Discombe)의 호산구 염색을 세포수를 세기위 하여 메틸렌 블루의 대비염색(counterstain)과 함께 사용하였다. 단위 기도 영역(2,200 ㎛²)당 호산구 수는 생물형태계측에 의해 측정하였다(J. Pathol. 1992; 166:395-404; Am Rev Respir Dis. 1993; 147:448-456). 섬유조직증식(fibrosis)을 마손(Masson)의 트리크롬 염색에 의해 확인하였다. 기도 점액은 하기 염색 방법에 의해 확인하였다: 메틸렌 블루, 헤마톡실린 및 에오신, 뮤시카민, 알시안 블루, 및 알시안 블루/페리오드산-쉬프(PAS) 반응(Troyer, H., "Carbohydrates" in Principle and Techiniques of Histochemistry, Little, Brown and Company, Boston, MA, 1980:89-121; Sceehan, D.C., et al., "Carbohydrates" in Theory and Practice of Histotechnology, Battle Press, Columbus, OH, 1980: 159-179). 뮤신을 뮤시카민 용액으로 염색하고; 메타닐 옐로우 대비염색을 이용하였다. 산성 뮤신 및 황산화 점액물질(mucosubstances)을 알신 블루, pH 2.5로 염색하였으며; 핵 급속 레드 대비염색(nuclear fast red counstein)을 사용하였다. 중성 및 산성 점액물질을 알시안 블루, pH 2.5, 및 PAS 반응으로 동정했다. 기도(직경 0.5-0.8 mm)의 점액 플러깅(plugging)도를 또한 생물형태계측에 의해 측정했다. 점액에 의한 기도 직경의 폐색(occlusion) 퍼센트는 도면 설명에 기술된대로 0 내지 4+의 반정량적 규모로 분류했다. 조직학적 및 생물형태계측 분석은 프로토콜 디자인에 대해 모르게한(blinded) 개개인에 의해 수행되었다.

폐 기능 시험

28일째 보통 염수 또는 OVA의 비강내 최종 투여 24시간후, 메타콜린의 정맥 내 주입에 대한 폐 역학(mechanics)을 이미 기술된 것(10, 1958; 192: 364-368; J. Appl. physiol. 1988; 64:2318-2323; J. Exp. Med 1996; 184: 1483-1494)으로부터 변형된 체적변동기록 방법에 의해 마우스 생체내에서 측정하였다. 폐 기능 시험의 완결시, 각 마우스를 분문(cardiac)에 구멍내 방혈시키고 기관(trachea)을 갖는 폐 조직을 추가 분석을 위하여 얻었다.

기관지폐포 세정

주줄기 기관지에서 좌측 폐를 묶고, 우측폐를 0.4 ml의 보통 염수로 3회 세정했다. 울혈(pooled) 샘플의 0.05 ml 분취량으로부터의 기관지폐포 세정(BAL) 유체 세포를 혈구계를 사용하여 계수하고, 나머지 유체를 200g에서 4℃에서 10분동안 원심분리했다. 상등액을 에이코사노이드 분석이 수행될 때까지 -70℃에서 저장했다. 10% 소 혈청 알부민("BSA")을 함유하는 보통 염수중에 세포 펠리트를 재현탁시킨후, BAL 세포 도포 표본을 유리 슬라이드상에 만들었다. 호산구를 염색하기 위하여, 건조된 슬라이드를 5-8분 동안 디콤브 희석 유체(증류수중의 0.05% 수성 에오신 및 5% 아세톤(vol/vol); J. Exp. Med. 1970; 131: 1271-1287)로 염색시키고 물로 0.5분동안 세정한후 0.07% 메틸렌 블루로 2분동안 대비염색하였다.

기도 점액 당단백질의 분석

BAL 유체중의 점액 당단백질을 슬로트 블로팅 및 PAS 염색에 의해 분석하였다(Anal. Biochem. 1989; 182: 160-164; Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1995; 12: 296-306). 니트로셀루로즈 막(0.2 ㎛ 구멍 크기; Schleicher & Schuell, Keene, NH)을 증류수에서 습윤시키고, 이어서 매니폴드 II 72-웰 슬로트 장치(Schleicher & Schuell)에 위치시키기전에 보통 염수에서 습윤시켰다. BAL 유체 샘플(0.05 ml) 및 인간 호흡기 뮤신 당단백질(Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1991; 5: 71-79)의 저장용액 분취량(0.05-0.75 ℓ)을 물 흡입 진공에 의해 니트로-셀루로즈 막에 블로팅시키고, 점액 당단백질을 PAS 반응에 의해 시각화하였다. PAS 염색을 정량화하기 위하여 반사율 밀도계측을 하였다. 이어서 영상을 하기 기술된 영상 처리 시스템에 의해 분석하였다. BAL 샘플의 PAS 반응성의 인테그레이트된 강도를 인간 호흡기 뮤신에 대한 표준곡선과 비교하여 정량화하였다.

면역세포화학

모노클로날 항체: CD 11c(DAB 방법) 및 Mac1(Beringer Mannheim, ABC method with Hitomouse Kit, Zymed)을 염증 세포 타입, 예를들어 수상 세포, 대식세포 및 림프구, 맥관구조의 영역안/주변, 기도 및 섬유조직증식을 확인하기 위하여 사용하였다.

생물형태계측 및 영상 분석

모든 영상을 SanJet IICX Scanner 및 HP DeskScan II 소프트웨어(Microsoft^R Windows^TM Version)(Hewlett Packard, Palo Alto, CA)에 의해 포착하여 디지탈화하였다. 이 시스템을 Windows^TM 소프트웨어(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)용 Image-Pro^R Plus, version 1.1을 이용하는 Dell Dimension XPS P90에 연결시켰다. 영상을 초고해상 그래픽 모드를 갖는 Dell Ultrascan 17ES 모니터(1.280 ×1,024 픽셀, 78.9-kHz horizontal scanning frequency, 74-Hz vertical scanning frequency)를 사용하여 256 그레이(gray) 레벨 규모상에서 평가했다.

류코트리엔 억제제 연구

기도 염증에서 5-리폭시케나제 생성물의 역할을 평가하기 위하여, 5-리폭시게나제 억제제, 질레우톤(35 mg/kg)을 도 5에 따른 날들에서 각각 비강내 챌린지(challenge)하기 30분전에 복강내(i.p.) 투여하였다. 동물의 한 세트에서 질레우톤을 OVA 복강내 투여하기전 투여하였다. 35 mg/kg에서 질레우톤은 BSA 항원 복강내 투여된 능동적으로 감작화된 래트(J. Phamacol. Exp. Ther. 1991; 256:929-937)에서 ~ 95% 로 시스테이닐 류코트리엔 방출을 억제한다

본 발명의 화합물 HK-X

화합물 HK-X를 상기 기술된 것과 동일한 과정을 사용하여 5 mg/kg 및 10 mg/kg에서 투여하였다.

통계학적 분석

폐 기능 데이타를 보호된 적어도 유의적인 차이 방법(Statview II, Abacus Concepts, Berkeley, CA)를 사용하여 분산 분석(ANOVA)을 하여 평가하였다. 이 방법은 모든 가능한 페어와이즈(pairwise) 비교를 평가하는 다중 t 통계치를 사용하고, 동등 및 비동등 페어 사이즈(pair size)에 모두 적용할 수 있다. 다른 데이터는 조합된 실험의 평균치±SE로서 보고된다. 차이는 독립적인 평균치들에 대한 Student의 two-tailed t 시험에 의해 유의도(P ＜ 0.05)로 분석하였다.

1. 호산구(표 2A-2B)

1-, 2- 및 3-개월 그룹의 OVA-처리된 마우스의 기도의 호산구수는 각각 44.83%에서 37.40% 및 19.15%로 유의적으로 감소하였다(P＜ 0.025). 호산구 계수가 동일한 시간 과정에서 다른 두 그룹보다 OVA 처리된 그룹에서 훨씬 높았지만(P＜0.025), 질레우톤은 일반적으로 1-3 개월을 통해 호산구를 감소시킬 수 있었다. 그러나, 본 발명의 HK-X 화합물은 한달째에서 비교할만하게 호산구를 감소시키나 둘째 및 셋째 달에서는 훨씬 유리하게 감소시켰다.

표 2A: 호산구의 기도 유입

(%)	염수	OVA	질레우톤	HK	P 값
3개월	1.00	19.15	10.73	-	＜0.025
2개월	1.00	37.4	11.66	-	＜0.01
1개월	1.00	44.83	15.50	14.20	＜0.001
P 값	＞0.05	＜0.025	＜0.025	＜0.025

표 2B: 기도 조직에서 호산구의 퍼센트

처리 시간	염수	OVA	질레톤	HK-X
28일	1.0	44.8	15.8	14.2

2. 다른 염증 세포

다른 염증 세포는 외래 단백질의 기도에의 도입에 이어 비-특이적 염증 반응을 나타낸다. 림프구는 기도로 모집되었으나, 대조군 그룹에서는 실질적으로 부재이었다. 호중구는, 많은 수가 OVA 감작된 그룹의 기도에서 나타났지만, 부트 샴(boot sham)-감작화되고 OVA-감작화된 마우스에서 OVA 챌린지에 이어 모집되었다. 다방면 세포질의 주변에 초승달 모양의(crescents) 핵이 있는 피큘리어 다핵 거대 세포(Peculiar multinucleate giant cells)가 종종 보인다. 랑간스 거대 세포(Langhans giant cells) 및 글로불(globule) 백혈구 모두가 OVA로 챌린지되고 감작화된 동물에서만 발견되었다. 이들은 보통보다 큰 기도와 결합된 연결조직에서 존재한다. 원형질 세포가 종종 기도 근접부에서 및 국소적 림프구 조직에서 보인다.

3. 기도 플러그(표 3)

뮤신: 동일한 처리를 받으나 상이한 처리 경과를 갖는 세개 그룹에서 어떤 차이도 없었다(P＞0.05). OVA-처리된 그룹은 염수, 질레우톤(P＜0.05) 및 HK-X 화합물로 처리된 그룹보다 스코어가 높았다.

표 3: 기도에서의 점액 플러그 스코어

처리시간	염수	OVA	질레우톤	HK-X
28일	0.7	2.8	1.3	1.4
기도 플러그%	＞5%	55%	16%	19%

천식은 기도의 만성 염증 상태이다. 인간에서, 일단 발생하면, 기도 과반응이 수년동안 안정하게 남아있을 수 있다. 이는 알레르겐 흡입, 검출가능한 기도 염증 또는 에피텔리언 낙설(epithelian desquamation)의 부재하에서도 명백히 지속된다. 따라서, 이는 기도 초미세구조에서 비가역적인(또는 적어도 느린 가역성) 변형에 기인하여 지속성이 될 수 있다.

약한 천식에서는, 이들 에피소드 또는 "공격"이 비교적 드물고 강건한 기관지확장제로 잘-치료된다(전환된다). 근저가 되고, 분명하며 만성적인 기도 염증의 강도는 기관지확장제로 덜 가역적인 보다 빈번하고, 강하며 연장된 공격과 연합되고 연결된 것으로 보인다. 이에 대한 이유가 최근 수년동안 점점 명백해지고 있다. 주로 Th2-림프구, 호산구, 비만 세포 및 가능하게는 혈소판의 활성화되거나 프라임된(primed) 침투로 구성되는 염증은 혈관주위(간질성) 공간의 확장 및 중재자/성장 인자의 방출을 일으키고,이는 기초막의 두꺼워짐, 상피 손상 및 벗겨짐, 점성 점액의 생성, 및 과형성, 기도 평활근의 프라이밍 및 부분적 수축을 일으킨다. 이들 모든 결과는 기도 반응에서의 증가를 지지하고, 이는 환경적 자극에 대한 반응의 역치를 낮추며, 따라서 공격을 보다 빈번하고 강건하게 만든다.

상기 형태학적 변화는 폐 기능에 직접적이고 강하게 영향을 끼친다. 급성 천식 마우스 모델 및 장기적 천식 마우스 모델에 대한 실험에서, 폐기능의 중요한 병태생리적 변화는 상기 형태학적 변화를 지지하는 것으로 관찰되어 왔다. 알레르겐 흡입은 기도 및 폐포 내피 및 상피상에서의 호산구 및 비만 세포의 발현을 증가시키고 기도 내피에서만의 E-선택 발현, 및 호산구 침투 및 기도 반응에서의 증가, 천식 폐에서의 비-특이적 염증 반응을 나타내는 다른 타입의 염증 세포(글로불 백혈구 및 랑간 타입의 다중핵 거대 세포(융합된 대식세포))를 유도한다.

화합물 HK-X는 OVA-처리된(OVA) 마우스 및 대조군 마우스의 기도에서 점액 축적을 억제한다. 기도의 점액 폐색의 분포를 샴(sham)-감작화되고 염수-챌린지된 마우스(염수, n=4), 및 OVA-감작화되고/챌린지된 마우스로부터 HK-X 처리의 부재하(OVA, n=4) 또는 존재하(HK-X/OVA, n=8)에서 측정하였다. 기도 직경의 점액 폐색은 다음과 같이 생물형태계측으로 분석하였다: 0, 점액 없음; +, ~10% 폐색; ++, 30% 폐색; +++. ~60% 폐색; ++++. ~80% 폐색. 각 마우스의 폐 전체에 임의로 분포된 10개의 기도에 대해 생물형태게측으로 점액 폐색에 대해 평가하였다.

도 6A-6D는 OVA를 사용하여 천식 유도된 래트에서의 비만 세포의 탈과립화를 억제하는 화합물 HK-X의 능력의 시각적 조직학적 증거 및 따라서 화학적 HK-X로 천식을 치료하는 효과를 제공한다. 도 6A는 OVA 감작화되고/챌린지된 마우스의 기도(AW)의 관강에서의 점액 분비의 풍부함을 보여준다. 도 6B는 호산구 및 다른 염증세포(화살표로 표시)에 의한 간질성 조직의 대량적 침투를 보여준다. 도 6C는 화합물 HK-X 억제제가 OVA 비강내 투여전에 투여된경우 기도(AW) 관강에서의 기도 점액 방출이 뛰어나게 감소되었음을 보여준다. 호산구에 의한 간질성 조직에로의 침투가 화합물 HK-X 처리후 단독 OVA-챌린지와 비교해서 감소된다 (도 6C를 도 6A 및 6B와 비교). 도 6D는 염수-처리된 대조군 마우스에서 기도(AW)가 점액 및 세포가 없음을 보여준다. 기관지 상피가 연결조직 세포로 침투되나 어떤 백혈구도 기관지 주변 간질 공간에서는 존재하지 않는다.

기도 대식세포는 천식의 알레르겐-챌린지된 폐에서 BAL 유체에서 회수된 대식세포에서 보고된 것과 닮은 그로스(gross) 활성의 신호를 보여준다(Am. Rev. Respir. Dis. 1987; 135:433-440). 대식세포 및 수상 세포는 폐에서 항원-제공 세포로서 기능하고, 직간접적으로 기도 상피 및 그의 주변 부위에서 표현형 변화를 개시할 수 있는 시토킨을 분비시킬 수 있다. 기도의 만성 염증의 자극은 직접적으 로 기도 상피 및 섬유아세포의 증식을 유도할 수 있고, 결과적으로 이들 영역 주변에 콜라겐이 증착되게 한다. 활성화된 대식 세포 및 수상 세포는 늦은 단계의 챌린지동안 다른 염증 세포와 비교해서 이 영역에서 높게 남아있다.

기도 상피는 주로 표지된 글로베트(globet) 세포 과형성에 기인하여, 특히 큰 기도, 그러나 또한 작고 고른 말단 세기관지에서 두꺼워졌다. 글로베트 세포 대 보통의 칼럼형, 섬모가 있는 세포의 비는 대조군 그룹에 비해 크게 증가한다. 대조군 기도(작은 것 및 큰 것)는 오직 가끔 글로베트 세포를 갖지만, OVA-챌린지된 페로 부터의 섹션은 100%의 큰 기도와 작은 기도의 일부가 총 기도 상피 세포의 88% 이하의 글로베트 세포를 함유함을 나타낸다. 세정되지 않은 폐에서, 점액은 글로베트 세포에서 볼 수 있고, 일부 기도에서는 때때로 관강을 완전히 폐색한다. 세포 조각은 이들 점액 플러그에서 걸렸다. 글로베트 세포 과형성은 대조군 그룹에서는 보이지 않았고, 그러므로, OVA의 "비알레르기" 효과, 또는 기관내 투여 기술에 기인될 수 없다. 작은 기도에서의 일부 글로베트 세포는 이런 특징이 없어, 아마도, 호흡기 트리(tree)내에서의 OVA의 분포는 균일하지 않음을 나타낸다.

도 7은 쥐의 천식 모델에서 점액 플러그의 형성시 5㎍/kg 및 10㎍/kg의 투여량에서 화합물 HK-X로 처리시 결과의 막대 그래프이다. 두 투여량은 작은 기도에서 점액 생성을 상당히 감소시킨다.

유도된 타입 II 콜라겐 천식 마우스 모델

마우스 모델을 유도된 타입 II 콜라겐 천식의 조직학적, 방사선 사진술 및 임상적 외관에서 본 발명 화합물의 효과를 평가하는데에 사용한다.

자가면역 질병은 중요하고 만성적인 불건전 및 무능력을 일으킨다. 많은 형태에 있어서 천식은 자가면역 질병계의 대표이다. 임상 부문에서, 류마티스성 관절염(RA)은 심각한 관절이형성(arthodysplastic) 질병의 가장 흔한 형태이다. 모든 임상의는 RA가 진행성 질병임에 동의한다.

쥐의 CIA에서 일어나는 관절염 손상의 조직 병리학은 인간 환자의 RA와 상당한 유사성을 공유한다. 따라서, 쥐의 CIA는 RA의 잠재적인 치료 처리를 연구하기 위한 인정된 모델이다.

재료 및 방법

마우스: 25 gm 무게의 DBA/1(2) 수컷 마우스(Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME or B&K Universal, Kent WA)를 이 연구에 사용한다. 이 마우스 스트레인은 이종형 타입 II 콜라겐의 주입에 의해 CIA에 감수성이다. 소 콜라겐(BC), 완전한 프로인드 어쥬번트(CFA) 및 불완전한 프로인드 어쥬번트(ICFA)는 Sigma Chemical로부터 입수할 수 있다. 면역화를 위한 항원을 0.1 M 아세트산으로 처리하고 CFA 또는 ICFA와 함께 제형화했다.

천식의 유도

면역화 프로토콜: 연구 기간동안 마우스에 예정된 간격으로 CFA중의 타입 II 콜라겐 100㎍을 주입했다.

마우스를 천식의 발달에 대해서 예정된 간격으로 조사했다. 천식의 예상되는 증거는 두번의 연속적인 관찰에서 앞발 및/또는 뒷발에서 적어도 하나의 발가락 관절의 부어오름 및 홍반을 포함한다.

천식의 확인적 진단

관절의 조직학적 조사: 적절한 간격으로 희생시킨 동물의 발가락 관절을 제거하고, 고정하며, 석회질을 빼고 파라핀에 묻고, 섹션화하여 일반적인 세포적 및 구조적 특징을 관찰하기 위하여 및 적절한대로 각 관절의 판누스의 연골 매트릭스를 검출하기 위하여 염색했다. 세포질 정도 및 염증 영역을 조직학적 현미경 사진의 디지탈화를 사용하고 상기 기술된 바와 같은 표준 영역 및 점 계수를 적용하여 정량화했다.

발가락 관절의 방사선 사진술에 의한 평가를 타입II 콜라겐으로 면역화후 관절 변화의 발생을 검출하기 위하여 수행하였다. 맘모그래피 영상화 시스템을 이 작업을 위해 변형시켰다. 관절의 연골 조직(판누스)의 평균 영역을 각 방사선 사진술과 함께 포함된 내부 표준과 비교하여 인접한 경질 조직의 밀도에서의 변화와 함께 콤퓨터 디지탈화 방사선 사진술의 분석에 의해 측정하였다. 경질 조직 및 판니(panni) 영역의 변화에 대한 베이스라인 대조군으로서 추가의 마우스를 동일한 기간동안 사용하고 영역 데이타를 비교하였다. 대조군 및 실험 마우스에 대한 밀도 및 영역의 차이에 있어서의 유의성은 각 시간점에서 쌍 T-세포를 사용하여 측정하였다.

천식 평가

동물을 천식의 개시에 대해 매일 관찰했다. 천식 지수는 0 내지 4의 규모로 각 발의 포함의 심각성을 등급화하여 유도했다. 스코어링은 관절의 기형 및 관절주위의 홍반 및 부종 정도에 기초한다. 뒷발의 부어오름을 또한 내측으로부터 측 부의 말레두스(malledus) 까지의 발목의 두께를 일정한 인장 캘리퍼스로 측정하여 정량화했다.

실험 설계

화합물 HK-X의 항-관절염 효과를 평가하기 위하여, 투여 경로를 가장 적절한 전달 메카니즘과 관련하여 인간 환자에 대한 실험을 기초로하여 선택한다.

HK-X 및 프레드니솔론의 투여량: 펩타이드의 분기하고(divergent) 추정되는 치료 수준을 나타내는 투여량을 경피성(TC)(흡수) 경로 및 발에의 주입에 의해 국소화된 부위에 위치시켰다. 관절내 공간에 직접 주입은 너무 외상적이어서 인공물을 생성할 수가 없다. 따라서, 관절내 공간에 인접한 발바닥(FP)에 약물을 주입하는 것을 선택된 방법으로 하였다. 양성 대조군으로서 대조군 마우스에 또한 프레드니솔론(실험적 및 임상적 자가면역 질병의 치료에서 증명된 효능있는 항-염증성)을 주입하였다.

먼저 10마리 그룹(더하기 대조군)중의 각 마우스에 50일 동안 매일 콜라겐을 주입하였다. 3일 및 18일째에 마우스에 1mg/ml로 0.1 M 아세트산중의 화합물 HK-X를 5 또는 10㎍/kg으로 주입하였다. 50일째, 마우스를 조직학적 연구를 위하여 채혈했다.

이어서, 10마리의 마우스 8개 그룹(A-I) 그룹을 다음의 특정 프로토콜에 따라 처리한다.

그룹 A는 1˚CFA 더하기 BC, 2˚ICFA 더하기 BC로 면역화시키고, 처리하지 않은 것을 대조군으로 하였다.

그룹 B는 1˚CFA 더하기 BC, 2˚ICFA 더하기 BC로 면역화시키고, 프레드니솔론을 2˚ICFA 더하기 BC로 처리하고 다음날 출발하여 5 mg/kg으로 투여하고 20일동안 계속하였다.

그룹 C는 1˚CFA 더하기 BC, 2˚ICFA 더하기 BC로 면역화시키고, 화합물 HK-X를 2˚ICFA 더하기 BC로 처리하고 다음날 출발하여 4 mg/kg(고투여량)으로 TC 투여하고 20일동안 계속하였다.

그룹 D는 1˚CFA 더하기 BC, 2˚ICFA 더하기 BC로 면역화시키고, 화합물 HK-X를 2˚ICFA 더하기 BC로 처리하고 다음날 출발하여 0.4 mg/kg(저투여량)으로 TC 투여하고 20일동안 계속하였다.

그룹 E는 1˚CFA 더하기 BC, 2˚ICFA 더하기 BC로 면역화시키고, 화합물 HK-X를 2˚ICFA 더하기 BC로 처리하고 다음날 출발하여 4 mg/kg(고투여량)으로 TC 투여하고 20일동안 계속하였다.

그룹 F는 1˚CFA 더하기 BC, 2˚ICFA 더하기 BC로 면역화시키고, 화합물 HK-X를 2˚ICFA 더하기 BC로 처리하고 다음날 출발하여 0.4 mg/kg(저투여량)으로 TC 투여하고 20일동안 계속하였다.

그룹 G는 1˚CFA, 2˚ICFA로 면역화시키고, 10 ml DMSO를 2˚ICFA 더하기 BC로 처리하고 다음날 출발하여 TC 투여하고 20일동안 계속하였다(대조군).

그룹 H는 1˚CFA, 2˚ICFA로 면역화시키고, 10 ml DMSO를 2˚ICFA 더하기 BC로 처리하고 다음날 출발하여 FP 투여하고 20일동안 계속하였다(대조군).

그룹 I는 1˚CFA, 2˚ICFA로 면역화시키고, 10 ml 염수를 2˚ICFA 더하기 BC 로 처리하고 다음날 출발하여 FP 투여하고 20일동안 계속하였다(대조군).

각 그룹의 동물은 2˚면역화후 즉각적으로 및 희생시키기 바로전 x선 조사하였다. 희생시킨후, 발을 적절하게 제거하고 조직학적 조사를 위하여 처리하였다. 화합물 HK-X로 처리하면 관절염 정도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다.

본 발명은 바람직한 구체예를 참고로 하여 상세히 기술되었다. 그러나, 본 명세서 및 도면을 고려하여 본 분야에 숙련된자는 청구범위에 정의된 본 발명의 취지 및 범위내에서 수정 및 개선을 할 수 있다는 것이 인지될 것이다.

Claims

약리학적 담체 및 식 f-Met-Leu-X(여기에서 X는 Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe 및 Phe-Tyr로 구성되는 그룹으로부터 선택된다)를 갖는 펩타이드를 함유하되, 상기 펩타이드가 히스타민 방출, 시토킨 방출, 류코트리엔 방출, 비만 세포 탈과립화, 림프구, 호산구 및 호중구의 염증 부위로의 접착 및 이동, IgE 항체의 생산, 염증 부위에서 IgE 가교-결합, 및 염증 부위에서 혈관 투과성 증가로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포 기능 또는 그의 조합을 저해 또는 감소시키는데 유효한 양으로 존재하는 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드가 f-Met-Leu-Phe-Phe인 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 펩타이드가 f-Met-Leu-Tyr인 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 담체가 펩타이드를 경구적으로 투여하기 위해 선택된 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 담체가 펩타이드를 흡입에 의해 투여하기 위해 선택된 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물이 에어로졸 조성물인 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 담체가 펩타이드를 국소적으로 투여하기 위해 선택된 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 담체가 펩타이드를 정제로 투여하기 위하여 선택된 약제학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 펩타이드가 비만 세포 탈과립화 및 히스타민 방출을 저해 또는 감소시키는데 유효한 양으로 존재하는 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 세포 기능의 저해 또는 감소가 염증 치료에 유용한 조성물.
제 11 항에 있어서, 염증이 천식, 관절염, 아나필락시, 만성 염증 내장 질병, 및 만성 폐쇄성 폐 질병으로 구성되는 그룹으로부터 선택된 질병의 결과인 조성물.
제 11 항에 있어서, 염증이 류마티스성 관절염의 결과인 조성물.
제 11 항에 있어서, 염증이 아나필락시의 결과인 조성물.
제 1 항에 있어서, 펩타이드가 시토킨 방출을 저해 또는 감소시키는데 유효한 양으로 존재하는 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 펩타이드가 류코트리엔 방출을 저해 또는 감소시키는데 유효한 양으로 존재하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 펩타이드가 림프구, 호산구 및 호중구의 염증 부위로의 접착 및 이동을 저해 또는 감소시키는데 유효한 양으로 존재하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 펩타이드가 IgE 항체의 생산을 저해 또는 감소시키는데 유효한 양으로 존재하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 펩타이드가 염증 부위에서 IgE 가교-결합을 저해 또는 감소시키는데 유효한 양으로 존재하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 펩타이드가 염증 부위에서 혈관 투과성 증가를 저해 또는 감소시키는데 유효한 양으로 존재하는 조성물.
(i) 식 f-Met-Leu-X(여기에서 X는 Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe 및 Phe-Tyr로 구성되는 그룹으로부터 선택된다)를 갖는 펩타이드 및 (ii) 또다른 활성 성분을 포함하되, 상기 펩타이드가 히스타민 방출, 시토킨 방출, 류코트리엔 방출, 비만 세포 탈과립화, 림프구, 호산구 및 호중구의 염증 부위로의 접착 및 이동, IgE 항체의 생산, 염증 부위에서 IgE 가교-결합, 및 염증 부위에서 혈관 투과성 증가로 구성된 그룹으로부터 선택된 세포 기능 또는 그의 조합을 저해 또는 감소시키는데 유효한 양으로 존재하는 약제학적 조성물.
제 22 항에 있어서, 다른 활성 성분이 항-류코트리엔, 베타₂ 작용제 및 코르티코스테로이드로 구성되는 그룹으로부터 선택된 조성물.