CN1282253A - 小肽和用于治疗哮喘和炎症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种药物组合物,它是药学载体和下式所示肽的混合物:f－Met－Leu－X。X选自Tyr、Tyr－Phe、Phe－Phe和Phe－Tyr。本发明还公开了用于抑制肥大细胞脱粒和治疗患者中的炎症的方法,例如,其中炎症是选自哮喘、类风湿性关节炎和过敏反应的疾病所致。此外,本发明公开了抑制患者中细胞因子释放的方法,用于抑制患者中组胺释放的方法,用于抑制患者中白三烯类物质释放的方法,用于减少患者中淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性细胞粘着、迁移和聚集在炎症位点的方法,用于减少患者中炎症位点产生IgE抗体的方法,和用于抑制患者中炎症位点血管通透性增高的方法。这些方法采用了上述药物组合物。

Description

小肽和用于治疗哮喘和炎症的方法
发明领域
本发明涉及具有肥大细胞脱粒抑制作用的小肽和炎症的治疗方法，尤其涉及可以有效治疗炎症的N-甲酰基-甲硫氨酰基肽类。更具体而言，本发明涉及有肥大细胞脱粒作用参与的疾病或病症的治疗方法，所述疾病或病症包括，例如，哮喘、类风湿性关节炎和过敏反应。
发明背景
哮喘是一种复杂病症。遗传因素和环境因素--变应性变态反应、病毒感染、刺激物--都会诱发哮喘及其炎症恶化。半数以上的哮喘患者(成人和儿童)具有变应性变态反应；事实上，对粉尘螨虫粪便的变应性变态反应是疾病加重和发生恶化的主要诱因。在婴儿期被呼吸道合胞体病毒感染还与哮喘恶化密切相关，并且病毒性呼吸道感染常常引起急性发作。
30年前支气管扩张性β2激动剂--选择性作用于β2受体的肾上腺素能激动剂--使哮喘的治疗发生了根本性的改变。已证实这些药物比非选择性肾上腺能受体激动剂如异丙肾上腺素更有效且作用时间更长(4-6小时)，异丙肾上腺素能够同时激动α-和β-肾上腺素能受体。β2激动剂可以迅速缓解症状，同时还保护机体对抗由刺激如运动或吸入冷空气引起的急性支气管狭窄。用药频率也是哮喘控制的指标。近年来，特长效β2拮抗剂-沙美特罗(持续时间高达12小时)已在美国引入。沙美特罗如此有效以致于掩盖了炎症征兆；所以，它应和抗炎药联合使用。
茶碱是一种相对弱效支气管扩张药，该药物的治疗范围狭窄(建议进行血药水平监测以避免中毒)并且易于药物相互作用(对细胞色素P450药物代谢酶的竞争作用改变了若干种重要的由此体系代谢的药物的血药浓度)。
对中度哮喘的治疗是每天吸入抗炎药-皮质类固醇或肥大细胞抑制剂(色苷酸钠或萘多罗米)，另外可根据需要吸入β2激动剂(3-4次每天)，以便减轻临界点症状和由变应原或运动诱发的哮喘。色苷酸钠和萘多罗米能够阻断支气管痉挛和炎症，但通常只对变应原或运动有关的哮喘有效，因此一般仅仅对幼年性哮喘症有效。吸入皮质类固醇可以改善炎症、气管过敏和梗阻，并且减少急性发作的次数。然而，疗效需要一个月后才明显，并且直至一年后病情才能发生显著改善。最常见的副作用是声音嘶哑和口腔念珠菌病。更严重的副作用已见报导--局部肾上腺抑制、生长抑制病情减慢骨骼形成--但这只在使用高剂量时发生。丙酸倍氯米松、氟羟泼尼松龙和氟尼缩松在药量相同时(mg级)具有相似的功效；新近批准的布地缩松和氟地松更加有效，而且据报导其全身副作用较小。
实际上患有轻度疾病的患者也表现出呼吸道炎症，包括粘膜和上皮被活化T细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞浸润。T细胞和肥大细胞释放出细胞因子，它促进嗜酸性粒细胞的生长和成熟，并且产生IgE抗体，这些将增加微血管的通透性，使上皮破裂，并且刺激神经反射和粘液分泌腺。结果是气管过敏、支气管狭窄并且分泌过多，表现为喘鸣、咳嗽和呼吸困难。
传统上，哮喘是通过口服和吸入支气管扩张药来治疗。这些药物有助于哮喘症状，但对潜在的炎症无济于事。在最近10年内，对炎症在哮喘病因学中重要性的认识导致增加了对皮质类固醇药物的使用，但许多患者所患的哮喘仍然无法得到控制。
科学家们已能肯定白三烯类化合物(分为A、B、C、D和E亚型)在哮喘中起着决定性的作用。它们引起气管平滑肌痉挛，提高血管通透性，水肿，增加粘液的产生，降低粘液纤毛运输和白细胞趋化性。
与有关前列腺素类化合物一样，白三烯类化合物合成自细胞膜内的花生四烯酸。肥大细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜碱性粒细胞中的花生四烯酸是由膜磷脂通过活化磷脂酶A2形成的。生成后，花生四烯酸主要通过两条途径代谢：环加氧酶途径(该途径产生多种前列腺素和血栓烷)和5-脂氧化酶途径(该途径产生白三烯类化合物)。花生四烯酸代谢的概略图如图4中举例说明。前列腺素类、血栓烷和白三烯类化合物被总称为类二十烷酸。
抗白三烯类物质是异质类抗哮喘药中的成员，其对炎症级联中的初始步骤具有干扰作用。白三烯是与前列腺素有关的炎性物质；两者均由细胞膜内的花生四烯酸生成。在肥大细胞、嗜酸性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞中的花生四烯酸形成之后，它主要通过两条途径代谢：(1)环加氧酶途径(该途径生成前列腺素和血栓烷)和(2)5-脂肪氧化酶途径，该途径在血浆中生产白三烯。为医学科学界所熟知，白三烯是过敏性的慢反应物质(“SRS-A”)。白三烯类化合物在支气管炎症中发挥重要作用。它们引起多种白细胞(例如嗜嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞)迁移、粘着和聚集在血管处，增高毛细血管通透性，并且诱发支气管和血管平滑肌痉挛。其后果包括间质性水肿、白细胞趋化性、粘液生成、粘液纤毛机能障碍和肺内支气管痉挛。某些类型的白三烯类化合物，例如，半胱氨酰白三烯(LTD4)，是特别有效的支气管收缩药，其活性比组胺高约100-1000倍。白三烯类化合物(包括半胱氨酰白三烯)是在脱粒作用期间由肥大细胞释放出的。
许多抗白三烯类物质或是阻断白三烯受体，或是通过阻断酶5-脂肪氧化酶来阻止白三烯合成，人们已经对这些抗白三烯类物质进行研究且用于商用。白三烯抑制剂在作用中是异质的：一些白三烯类抑制剂直接阻断5-脂肪氧化酶，一些抑制蛋白激活5-脂肪氧化酶，而一些取代占据花生四烯酸酯(盐)在蛋白质上的结合位点。相反地，白三烯拮抗剂阻断了介气管过敏、支气管痉挛和分泌过多的受体本身。
人体肺部肥大细胞在受到体外IgE刺激后产生肿瘤坏死因子(TNF)、IL-4和IL-5(Chest 1997；112：523-29)。对支气管内活组织样本进行的免疫组织化学分析证实肥大细胞也产生IL-6。此外，哮喘患者体内的肥大细胞数和TNF在和正常对象比较时存在统计学意义上的显著性差异。TNF和IL-4可以加强增量调节血管细胞粘着分子-1(VCAM-1)在支气管内皮层中的表达，VCAM-1是免疫球蛋白大类的粘着分子。嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞在其细胞表面显示出极迟活化抗原4(VLA-4)整联蛋白，同时和VCAM-1反应。所以，通过和VLA-4／VCAM-1的相互作用，TNF和IL-4促进循环白细胞的补充。肥大细胞在IgE介导的刺激下释放出预形成细胞因子(TNF)或快速合成其他因子(IL-4，IL-5)的能力是导致支气管炎症的初始活动。事实上，通过进一步产生细胞因子，TH2克隆的诱导和活化促使嗜酸性粒细胞活化和补充，在炎症反应中起着终端效应器的作用。因此，由白细胞(特别是TH2)产生的细胞因子极大地影响着粘膜肥大细胞的发育、激活和引发，从而启动阳性促炎回路。最近发现，人体肥大细胞产生IL-8，而鼠科肺产生的肥大细胞表达趋化因子、单核细胞化学引诱物蛋白-1和巨噬细胞炎症蛋白-1。这表明，除了白细胞补充中通常涉及的细胞因子(IL-4，IL-5，TNF)以外，肥大细胞还在呼吸道中作为附加、有效的化学引诱物，对嗜酸性粒细胞和多形核白细胞(L-8)起作用。此外，由于它们作为组胺释放因子的趋化因子诱使肥大细胞脱粒，所以还延迟了自分泌活化回路。
肥大细胞在B细胞生长中为提供和IL-4一起是对于IgE的体外合成必要的细胞接触(类似嗜碱粒细胞)起关键作用，这表示肥大细胞在不依赖于T细胞下直接调节IgE的生产，并且基于IgE的交联，可以产生足够量的IL-4来引发局部TH2反应，被认为在特应性哮喘中发挥核心作用的T细胞的亚型。此外，肥大细胞还可以为T淋巴细胞充当抗原呈递细胞，这表示肥大细胞在哮喘的免疫网络中起更大的作用。
在《炎症》(Inflammation)第5卷，第1期，13-16页(1981)中报导了N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯基丙氨酸对肥大细胞脱粒作用的抑制。该文献报导了两种结构不同的趋化肽类，即抑胃酶肽和N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-苯基丙氨酸，可以抑制通过真皮内注射40／80、抗鼠IgE血清或分离自牛肺的大分子阴离子透性因子所导致的大鼠皮肤内血管通透性增高。该文献还报导，这些肽似乎直接作用于肥大细胞。
鉴于治疗人体炎性疾病，特别是如哮喘、关节炎和过敏反应的重要性，人们始终在寻找新的副作用较小的生物活性化合物。图4图示了通过本发明新的肽类化合物对哮喘炎症过程的干预而抑制肥大细胞脱粒作用。
发明概述
本发明提供了新的药物组合物，在该组合物适当的药学载体中含有具有肥大细胞脱粒抑制活性的N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基-(“f-Met-Leu-”)肽。特别有效的此类肽是那些具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。该类肽可以有效治疗炎症，特别适用于治疗与哮喘、关节炎和过敏反应有关的炎症。这些肽类还可以有效治疗慢性梗阻性肺病和慢性炎性肠病。
根据本发明，一种用于治疗哺乳动物炎症的方法，包括给哺乳动物施用抗炎有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。为了治疗与哮喘有关的炎症，优选的给药方式是吸入。为了治疗与关节炎有关的炎症，优选的给药方式是局部使用或皮内注射，采用适当的药学载体。
本发明还提供了一种用于抑制肥大细胞脱粒作用的方法。该方法包括令肥大细胞与脱粒抑制有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽相接触，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
此外，本发明还提供一种用于抑制细胞因子、组胺类和白三烯类化合物释放的方法。抑制细胞因子释放的方法包括给患者施用细胞因子释放抑制有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。用于抑制组胺类物质释放的方法包括给患者施用组胺释放抑制有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。用于抑制白三烯释放的方法包括给患者施用白三烯释放抑制有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
根据本发明的另一个实施方案，本发明提供了一种用于降低淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜嗜中性粒细胞粘着、迁移和聚集在患者炎症位点的方法。该方法包括给患者施用抑制治疗有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
而且，本发明提供一种用于减少IgE抗体且降低或阻断IgE在患者炎症位点的交联。该方法包括给患者施用IgE抗体生产抑制有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
此外，本发明提供一种抑制血管通透性在患者炎症位点增高的方法。该方法包括给患者施用血管透性抑制有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
在本发明某些优选的实施方案中，患有慢性炎症的患者可以受益于施用与另一种活性组分合用的本发明的肽类。对于本发明的合用特别有用的其它活性组分是，例如，抗白三烯类化合物，β2激动剂、皮质类固醇等。
附图简述
图1是一个对数剂量反应曲线，用于举例说明不同浓度化合物48／80的毛细血管通透性面积。
图2是一个表示不同浓度f-Met-Leu-Phe对毛细血管通透性抑制作用的剂量反应曲线。
图3是一个表示不同浓度的本发明优选肽对毛细血管通透性抑制作用的剂量反应曲线。
图4是一个说明花生四烯酸代谢主要途径的路线说明图，它进一步说明了对肥大细胞脱粒作用的抑制。
图5A和5B表示在OVA诱发的支气管哮喘小鼠模型中所采用的不同的标准(5A)和分解(5B)方案的路线图示。
图6a-6D是显微照片，表示用抑制OVA诱发哮喘的本发明化合物治疗的被治疗小鼠的与对照小鼠的比较组织病理学。
图7是表示在鼠哮喘模型中本发明的治疗对粘液栓形成的结果的直方图。
发明详述
根据本发明，意外地发现了某些具有式f-Met-Leu-X且其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr的小肽类具有令人吃惊的肥大细胞脱粒抑制活性。所以，此类肽能够抑制细胞因子(例如TNF)以及组胺和白三烯的释放，它们适合用来治疗炎症，所述炎症可以源自多种疾病，例如哮喘、关节炎和过敏反应。此类肽还适于治疗慢性阻塞性肺病和慢性炎性肠病。
按照本发明的一个优选实施方案，所述肽也可以减少嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和嗜中性粒细胞对炎症组织内的浸润。在对本发明优选的肽类化合物的反应中，淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞未表现出趋化性。此外，本发明的优选化合物在重要的器官如心脏、肝脏和肺中不产生毒性。
通过常规的小肽化学技术可以制备本发明的肽类。给药用的肽是在无菌条件下与药物可接受载体或稀释剂一起制备。
药物组合物的剂量随给药对象和特定给药途径而改变。剂量可以是0．1-100，000μg／kg／天，更优选1-10，000μg／kg／天。首选的剂量是约1-100μg／kg体重，更优选约1-10μg／kg体重。给药一般为每天1次或每4-6小时1次，这取决于病症的严重程度。对于急性病症，肽的给药是优选每4-6小时1次。对于维持或治疗的用途，优选每天仅给药1次或2次。所述肽的日给药剂量优选约0．18-约16mg，这取决于给药途径和病症的严重程度。所属领域普通技术人员可以仅利用常规试验就可测出特定药物组合物的多剂量给药的预期时间间隔。
给药途径包括口服、非肠道、直肠、阴道内、局部、经鼻、眼、直接注射等。在一个优选实施方案中，本发明所述肽类是以抗炎有效量或以抑制肥大细胞脱粒的剂量向患者给药。示例药物组合物是一种治疗有效量的、能够产生抗炎作用或抑制肥大细胞脱粒作用的本发明肽类，它们通常含在药物可接受载体中。
此处和下文所用的术语“药物可接受载体”包括一种或多种适合对人体或其它动物给药的相容性固体或液体填充剂、稀释剂或包囊物质。在本发明中，术语“载体”因此表示有机或无机的、天然或合成的组分，本发明所述的肽分子与之结合以适于使用。术语“治疗有效量”是指本发明药物组合物达到预期效果或对特定的被治疗病症表现出所需作用时的用量。同一组分可以在制备组合物时以不同浓度混入，由此提供适合医治患者的年龄、病症的严重程度、治疗持续时间和给药方式的变化。
载体必须还是相容性的。此处所用的术语“相容性”是指药物组合物的成分能够和本发明的小肽和各种其它成分以一种不实质性地有损于所需的药效的方式掺混。
本发明的小肽通常本身也可以给药(纯净的)。然而，它们可以药物可接受盐的形式给药。所述药物可接受盐包括但不限于那些由以下酸制备的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、醋酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-1-磺酸和苯磺酸。另外，药物可接受盐可以制备为碱金属或碱土金属的盐，例如，羧酸基的钠、钾或钙盐。所以，本发明提供了适合医用的药物组合物，该组合物含有本发明的肽类以及一种或多种药物可接受载体和任选的其它任何治疗性组分。
所述组合物包括那些适合口服、直肠、阴道内、局部、经鼻、眼或非肠道给药的组合物，它们均可作为本发明所述物质的给药途径。含有本发明肽类的药物组合物还可以含有一种或多种药物可接受载体，该组合物可以含有赋形剂，例如稳定剂(以延长储存时间)、乳化剂、粘合剂、增稠剂、盐、防腐剂、溶剂、分散介质、包衣、杀细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。所述技术领域很熟悉为药物活性物质使用上述介质和试剂。除了任何与本发明肽类不相容的常规介质或试剂以外，在此可以考虑在药物组合物中使用它们。本发明的组合物中还可以混入另外的活性组分。
适合口服给药的组合物是治疗哮喘所优选的。通常，这种组合物被制备成吸入气溶胶、喷雾剂、糖浆剂或片剂。尽管口服组合物也是可行的，但治疗关节炎优选适宜局部给药的组合物。通常，这种局部组合物被制成霜剂、软膏或溶液。
所述组合物可方便地以单位剂型存在并且可以通过药学领域任何已知的常规方法来制备。制备方法通常包括将本发明的活性组分与构成一种或多种辅助剂的载体结合的步骤。
适合吸入给药的本发明组合物可以以气溶胶或吸入溶液存在。常规气溶胶组合物的实例是由预定量的、悬浮在三氯一氟甲烷和二氯二氟甲烷加油酸的混合物中的微晶肽组成。典型溶液的实例是由溶解或悬浮在无菌盐水(任选约5％v／v，为了溶解度的二甲基亚砜(“DMSO”))中的预定量的肽、苯扎氯铵和硫酸(用于调节pH)组成。
适于口服给药的本发明组合物也可以作为离散单位存在，例如胶囊、扁囊剂、片剂或锭剂，它们分别含有预定量的本发明的肽；或含在脂质体中，或作为存在于含水液体或非水液体中的混悬液，例如糖浆剂、酏剂或乳剂。片剂基质的实例包括玉米淀粉、乳糖和硬脂酸镁作为非活性组分。糖浆剂基质的实例包括柠檬酸、着色染料、矫味剂、羟丙基甲基纤维素、糖精、苯甲酸钠、柠檬酸钠和纯水。
适于非肠道给药的组合物一般包括本发明肽分子的无菌含水制剂，优选它与给药者的血液等渗。可以利用那些适当的分散剂或湿润剂和助悬剂、按照已知方法来制备所述含水制剂。无菌可注射制剂也可以是存在于无毒非肠道给药可接受稀释剂或溶剂中的无菌可注射溶液或悬浮液，例如存在于1，3-丁二醇中的溶液。在可接受的赋形体或溶剂中，可以使用水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。在含水溶液中，可以使用至多约10％v／v的DMSO或Trappsol以维持一些肽的溶解度。另外，灭菌固定油一般可以用作溶剂或助悬介质。鉴于此目的，可以采用多种固定油，其中包括合成甘油单酯和甘油二酯。此外，脂肪酸(例如油酸或中性脂肪酸)可以应用于注射制剂中。而且，Pluronic嵌段共聚物在4℃下与脂质配制，用于在数周或数月的时间内在37℃自固体形式的基于时间的释放模式的化合物注射。
适合局部给药的组合物可以是所述肽存在于Trappsol或DMSO中的溶液，或霜剂、软膏或洗剂。通常，基质或载体中加入约0．1-约2．5％的活性组分。霜剂基质的实例包括纯水、矿脂、苄醇、硬脂基醇、丙二醇、肉豆蔻酸异丙酯、硬脂酸40聚烃氧基酯、Carbomer 934、十二烷基硫酸钠、醋酸二钠、氢氧化钠和任选的DMSO。软膏剂基质的实例包括白凡士林和任选的矿物油、脱水山梨糖醇倍半油酸酯和DMSO。洗剂制剂基质包括Carbomer 940、丙二醇、吐温40、硬脂酸丙二醇酯、胆甾醇和有关甾醇、肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸脱水山梨糖醇酯、乙醇(acetyl alcohol)、三乙醇胺、抗坏血酸、二甲硅油和纯水。用于测定肥大细胞脱粒抑制作用的大鼠皮肤模型
令已超敏的机体暴露在一定的物质(变应原)下导致变态反应诱发性哮喘。在变应原下暴露可以引起肺内的肥大细胞脱粒，释放出白三烯类和组胺类。在对于白三烯和组胺释放的反应中，毛细血管通透性急剧增高且血浆从毛细血管渗漏到周围组织中。该暴露引起的呼吸症状从轻度(瘙痒和喷嚏)直至潜在的致命性的(哮喘)，包括过敏反应所致的极慢性病例死亡。
为了通过试验证明该现象，用大鼠皮肤代替肺。在此模型中，用染料台盼蓝标记试验大鼠的血浆。这种可溶性染料作为血浆自身的被动标识物，由血流携带且自肝脏细胞排出。在正常情况下，完整无损的血管(包括毛细血管体系)保留该染料。将可诱发肥大细胞脱粒(引起白三烯和组胺释放)的化合物注射到皮肤内以激发变应原诱导脱粒作用。在这些实验中，化合物48／80用于完成该目的。在白三烯和组胺释放之后的情况中，毛细血管(通)透性增高，毛细血管渗漏出血浆、染料蓝，由此使注射位点周围的皮肤染色。着成蓝色的面积是衡量注射化合物48／80的量的一个量度。
通过在注射之前和化合物48／80混合可以测试出化合物的“抗-白三烯”和／或“抗组胺”活性。如果试验化合物能够抑制白三烯或组胺的释放，则在与同一大鼠的只注射化合物48／80但未注射任何试验化合物的注射位点比较时，可以观察到蓝色面积的直径减小。在抗白三烯和抗组胺活性较高的情况中，实际上蓝色着色被彻底抑制。试验
建立并确认大鼠皮肤模型。对预定剂量的多种肽类的抗白三烯和／或抗组胺活性进行试验。所选剂量可以与作为比较的标准化合物的f-Met-Leu-Phe进行全面比较。
进行某些化合物的“剂量反应”滴定并且和标准化合物相比较。观察到在使用了连续低剂量的推定抑制化合物后毛细血管通透面积的大小持续减小，由此证实了已在初始预定剂量的试验中所观察到的对白三烯和／或组胺释放的抑制作用。材料和方法
由Sigma或Aldrich获得试剂，但兽用麻醉剂氯胺酮得自不同的兽药供应商。所用大鼠是购自B&K国际公司时体重为220-240g的雄性Sprague-Dawley品系。
为使大鼠皮肤反应，用0．25ml 10mg／ml氯胺酮将大鼠麻醉。将1．0ml盐水中的台盼蓝(无菌过滤的)给药至尾静脉内，并剃净大鼠的背部。每只大鼠取4个皮内注射位点作试验和对照注射。
在盐水中将化合物48／80制备成1．5mg／ml的储备液。发现此原料似乎在含水溶液中不稳定，因此每天制备新鲜溶液。刚好在给各大鼠注射之前，用盐水配制出符合试验所需浓度的连续稀释液。
在DMSO中将肽类制备成23mM储备液，并且在试验期间储藏在-20℃。使用时，将冷冻的储备液融化，并将适当的等分试样以及适量的DMSO加入到化合物48／80的稀释液中，使DMSO和化合物48／80水溶液的配比为5μl：0．1ml。由此得到维持某些肽类溶解度所必需的5％的DMSO溶液。对照试验证实5％DMSO的作用为零。
对于注射给药，将0．1ml化合物40／80，+／-试验化合物皮内注射到麻醉、染色和剃净的大鼠。温育15分钟后，用颈脱位法处死大鼠，撕下背部皮肤并置于光照箱中。利用CCD图像获取照相机和相匹配的硬件／软件对背光皮肤的影像进行数字化处理。用科学的图形分析软件包分析数字化影像，并且整合毛细血管通透的面积(变蓝)，所得数字化数据用于进一步分析。
取约0．01μg-约15μg范围内不同剂量的化合物48／80作出剂量反应曲线。结果如图1所示。基于鼠和鼠之间的差异(如皮肤厚度)，发现对于指定剂量的化合物48／80，毛细血管通透面积的直径具有较宽的变异性。选择0．15μg剂量的化合物48／80用于进一步的试验。
实施例1
利用选定剂量为0．15μg的化合物48／80，得到标准化合物f-Met-Leu-Phe的剂量反应曲线。对0至约230nM的f-Met-Leu-Phe剂量进行试验，结果如图2所示。可以明显看出抑制了化合物48／80所引起的脱粒作用。实施例2-11
利用100nmol的试验化合物和剂量约为0．15μg的化合物48／80来试验若干种f-Met-Leu肽类对大鼠皮肤模型中诱发性脱粒的抑制作用。对于各个试验，每只大鼠都包括一个固有的肽剂量为零的48／80对照，并且百分抑制率是相对于该对照结果(0％抑制)而言。同时还测定化合物48／80所致的肥大细胞脱粒百分率。结果如下表所列。表1实施例 肽                      ％抑制        ％脱粒*2      f-Met-Leu-Phe(现有技术) 30            603      N-乙酰基-Met-Leu-Phe    0             984      N-t-BOC-Met-Leu-Phe     0             -5      f-Met-Leu-(I)Phe        0             -6      f-Met-Leu-Phe(苄酰胺)   0             -7      f-Met-Leu-Phe-Lys       0             -8      f-Met-Leu-Phe(甲酯)     0             -9     f-Met-Leu-Phe-Phe    100    1-310    f-Met-Leu-Tyr        55     3011    f-Met-Leu-Tyr-Tyr    0      -实施例12
利用选定剂量为0．15μg的化合物48／80，得到f-Met-Leu-Phe-Phe的剂量反应曲线。对0至约230nM的f-Met-Leu-Phe-Phe剂量进行试验并且结果如图3所示。可明显地看到对化合物48／80所引起的脱粒作用具有异常显著的抑制作用。f-Met-Leu-Phe-Phe对诱发性脱粒作用的抑制出入预料地大大地优于标准化合物f-Met-Leu-Phe。OVA-诱导性支气管哮喘小鼠模型对于肥大细胞脱粒作用的抑制
哮喘是一种复杂的疾病，其特征在于气管梗阻的自发性恶化和持久的支气管超反应。另一个确定特征是呼吸道粘膜下层被活化的T淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和巨噬细胞／单核细胞慢性浸润。炎症机制有细胞因子表达且释放出炎症介质，成为支气管狭窄和支气管超反应的发病机理的基础。然而，许多致病机制仍然不清楚，例如引起症状和慢性炎症持久作用的机理，以及控制和预防疾病必需的干预的机理。
人们早已认识到在一些个体和动物模型中，一种被吸入的变应原攻击可诱发气管反应性急性增高。然而，业已证实反复吸入变应原将使气管反应性更加显著、连贯和持久地升高。该长时间反复吸入变应原的小鼠模型已被用来研究变应性疾病在肺内的长期作用，并且用于描绘出参与诱发人体肺气管超反应的细胞、机制、分子和介质。
材料和方法
试剂：结晶OVA得自Pierce Chem．Co．(Rockford，IL)，硫酸钾铝(明矾)得自于Sigma Chem．Co．(St．Louis，MO)，无热原蒸馏水得自Baxter，Healthcare Corporation(Deerfield，IL)，0．9％氯化钠溶液(生理盐水)得自Lymphomed(Deerfield，IL)和TrappsolTM HPB-L100(含水的羟丙基β环糊精；45％w／v水溶液)得自Cyclodextrin TechnologiesDevelopment，Inc．(Gainesville，FLA)。将OVA(在生理盐水中为500μg／ml)和等体积的10％(w／v)明矾的蒸馏水溶液混合。在室温下放置60分钟后，将混合物(用10N NaOH调至pH 6．5)在750 g下离心5分钟；将团状物重新悬浮在原始体积的蒸馏水中且在1小时内使用。
选择性的5-脂肪氧化酶抑制剂，弃白通(N-[1-苯并[b]噻吩-2-基乙基]-N-羟脲；《药理学和试验治疗学杂志》1991；256：929-937)是由Bell&George W．Carter博士(Abbott Laboratories，Abbott Part，IL)友情提供。将弃白通溶解在TrappsolTM中。Histatek．Inc．(Seattle，WA)提供了肥大细胞脱粒抑制剂，f-Met-Leu-Phe-Phe(″HK-X″)。
在常规试验条件下饲养雌性BALB／c Once(购得时6-8周龄；D&K，Seattle WA)。
变应原免疫／攻击方案：基于不同的标准方案(图5A)和分解方案(图5B)，小鼠经腹膜内注射0．2ml(100μg)的OVA和明矾(《试验医学杂志》1996；184：1483-1494)。按照不同的方案，用0．2ml氯胺酮(0．44mg／ml)／甲苯噻嗪(6．3mg／ml)的生理盐水溶液经腹膜内给药麻醉，随后分别在不同天内将100μg OVA在0．05ml生理盐水中的溶液鼻内给药，并且50μg OVA在0．05ml生理盐水中的溶液的鼻内给药。采用两个对照组。因此，第一组接受生理盐水和明矾的腹膜内给药以及不含有明矾的生理盐水的鼻内(i．n．)给药；第二组接受OVA和明矾的腹膜内给药，不含有明矾的OVA的鼻内给药和生理盐水单独给药。组织学
取气管和左肺(右肺用作支气管肺泡灌洗(“BAL”))，室温下在10％中性甲醛溶液中固定5-15小时。包埋在石蜡中后，将组织切为5um切片，进行不同的染色或免疫标记处理。采用Discombe氏嗜酸性粒细胞染色且用亚甲基蓝复染色来以将细胞计数。利用形态测定法测出每单位气管面积(2，200μm2)中嗜酸性粒细胞的数量(《病理学杂志》1992；166：395-404；《美国呼吸系统疾病评论》1993：147：448-456)。利用Masson氏三色团染色来鉴定纤维变性。气管粘液通过下列方法鉴定：亚甲基蓝，苏木精，曙红，粘蛋白胭脂红，爱茜蓝G和爱茜蓝G／高碘酸-希夫反应(PAS)(troyer，H．，组织化学的原理和技术中的“糖类”，Little，Borwn&Company，Boston，MA，1980：89-121；Sheehan，D．C．等人，组织学技术的原理和实践中的“糖类”Battle Press，Columbus，0H，1980：159-179)．粘蛋白用粘蛋白胭脂红溶液染色；用酸性间胺黄作复染色。酸性粘蛋白和硫酸化粘液物质用爱茜蓝G染色，pH为2．5；用核坚固红作复染色。中性和酸性粘液物质是由爱茜蓝G(pH2．5)和PAS反应来鉴定。通过形态测定法来评估气管(直径0．5-0．8mm)中粘液的阻塞程度。如图例所示，半定量地将气管直径的粘液闭塞百分率分为0至4+级。通过个体对给药方案的盲从试验来完成组织学和形态学分析。肺功能试验
在第28天时，在生理盐水或OVA末次鼻内给药后24小时时，利用体积描记法来测定以机械方式静脉内灌注到肺内的小鼠体内乙酰甲胆碱(10，1958；192：364-368；《应用心理学杂志》1988；64：2318-2323；《试验医学杂志》1996；184：1483-1494)。当肺功能试验完成后，通过心脏穿刺将各小鼠放血，取带有气管的肺组织用于进一步分析。
支气管肺泡灌洗
在将左肺和主支气管分离开之后，用0．4ml生理盐水将右肺灌洗3次。用血细胞计数器对0．05ml等分合并试样内的支气管肺泡灌洗(BAL)液细胞进行计数，并且将残余液体在4℃下以200g离心10分钟。将上清液储存在-70℃下直至进行类二十烷酸分析。在将细胞沉淀团重新悬浮在含有10％牛血清白蛋白(“BSA”)的生理盐水中之后，在玻璃载片上制备BAL细胞涂片。为了将嗜酸性粒细胞染色，将干燥载片用Discombe氏稀释液(含有0．05％含水曙红和5％丙酮(v／v)的蒸馏水溶液；《试验医学杂志》1970；131；1271-1287)染色5-8分钟，用水漂洗0．5分钟，并且用0．07％亚甲基蓝复染色2分钟。
气管粘液糖蛋白的测定
通过狭线印迹法和PAS染色来测定BAL液中的粘液糖蛋白(《分析生物化学》1989；182：160-164；《美国呼吸学和细胞分子生物学杂志》(Am．J．Respir．Cell Mol．Biol．)1995；12：296-306)。用蒸馏水湿润硝基纤维素膜(0．2μm孔径；Schleicher&Schuell，Keene，NH)，随后置于生理盐水中，再置于Minifold Ⅱ 72-孔狭线印迹装置内(Schleicher&Schuell)。通过水抽真空，将BAL液的样本(0．05ml)和人体呼吸粘蛋白糖蛋白(《美国呼吸学和细胞分子生物学杂志》1991；5：71-79)的储备液的等分试样(0．05-0．751)印迹到硝基纤维素膜上，利用PAS反应目测粘液糖蛋白。利用反射光密度测定法来定量测出PAS染色。应用下述的影像处理系统来分析图像。通过和人体呼吸粘蛋白的标准曲线比较，定量测出BAL样本PAS反应性的综合强度。
免疫细胞化学
单克隆抗体：用CDllc(DAB法)和Mac 1(Beringer mannheim，ABC法，使用Hitomouse试剂盒，Zymed)来鉴定位于脉管系统、气管和纤维变性之中／周围的炎症细胞的类型，例如树状细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。
形态测定法和影像分析
利用ScanJet ⅡCX扫描仪和HP DeskScanⅡ软件(Microsoft_WindowsTM Version)(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)获取影像并数字化。该系统和Dell Dimension XPS P90计算机(Dell Corporation，Austin，TX)连接并使用了WindowsTM软件的Image-Pro_Plus，1．1版(media Cybernetics，Silver Spring，MD)。利用具有超高分辨率图形方式的Dell Ultrascan 17ES监测器(1．280X，1．024象素，78．9-kHz水平扫描频率，74Hz垂直扫描频率)在256的灰度下对影像进行评估。
白三烯抑制剂的研究
为了评估5-脂肪氧化酶在气管炎症中的作用，在如图5所示天数内的各次鼻内给药攻击之前30分钟时，将5-脂肪氧化酶抑制剂，弃白通(35mg／kg)腹膜内给药。在一组动物中，在OVA腹膜内给药之前给予弃白通。在BSA抗原腹膜内给药被动致敏的大鼠中，35mg／kg的弃白通能够将半胱氨酰白三烯的释放抑制～95％(《药理学和试验治疗学杂志1991；256：929-937)。
本发明的化合物HK-X
用上述的同样方法以5mg／kg和l0mg／kg给药化合物Hk-X。
统计学分析
通过方差分析(ANOVA)、利用保护最小显著性差异法(Statview Ⅱ，Abacus Concepts，Berkeley，CA)评估肺功能数据。该方法采用多重t统计量来评估所有可能的配对比较，并且适合于相等和不等的配对量。其他数据表示为组合试验的平均值±SE。通过独立的平均值的学生双尾t试验来分析差异的显著性(P＜0．05)。
1．嗜酸性粒细胞(表2A-2B)
在1-、2-和3个月组的OVA处理小鼠中，气管的嗜酸性粒细胞数量分别从44．83％显著减少到37．40％和19．15％(P＜0．025)。甚至当OVA处理组中的嗜曙红数目在相同的时期内极其高于其他两组的动物时，弃白通仍然能够一般在1-3个月内减少嗜酸性粒细胞。然而，本发明的HK-X化合物在1个月内可以相当地减少嗜酸性粒细胞，但在两个和三个月时要有效的多。表1A：嗜酸性粒细胞的气道流入
(％)   盐水   OVA     弃白通     HK P值
3个月  1．00  19．15  10．73     -2个月  1．00  37．40  11．66     -1个月  1．00  44．83  15．50    14．20 ＜0．025＜0．01＜0．001
P值    ＞0．05＜0．025＜0．025＜0．025
”表2B：气道组织中嗜酸性粒细胞的百分率
处理时间    盐水    OVA    弃白通 HK-X
28天      1．0     44．8  15．8 14．2
2．其他炎症细胞
其他炎症细胞表示将外源蛋白质引入气管后所诱导的非特异性炎症反应。淋巴细胞募集到气管内，但事实上对照组中并未发生募集。在boot假致敏和OVA致敏小鼠中，嗜中性粒细胞在受到OVA刺激后仍然发生募集，尽管在OVA致敏组的气管内该细胞的数目极高。偶尔可以看见特有的多核巨细胞(融合巨噬细胞)，在其广大的胞浆周围环绕着新月形核。Langhan氏巨细胞和球形白细胞都仅可见于用OVA敏化和攻击的动物中。它们通常存在于和较大气管有关的结缔组织中。有时可以观察到浆细胞位于气管近处和局部淋巴样组织中。
3．气管塞(表3)
粘蛋白：三组用相同处理但处理时间的长短不同的动物没有差异(P＞0．05)。OVA处理组的评分值高于用盐水、弃白通(P＜0．05)和Ⅷ(-X化合物处理的动物组。
表3：气道(airway)中的粘液塞评分
处理时间 盐水 OVA 弃白通 HK-X
28天 0.7 2.8 1.3 1.4
气管塞 ＞5％ 55％ 16％ 19％
百分率
哮喘是慢性气道(airway)炎症。在人体中，一旦患有该病，气管超反应性可持续数年。在不存在变应原吸入、可检查出的气管炎症或上皮脱屑的情况下它也明显存在。所以，该疾病可以是终生的，因为它不可逆(或至少缓慢可逆)地改变了气管的超微结构。
在轻度哮喘患者中，发病或“发作”的频率较低，并且容易通过吸入支气管扩张药来治疗(逆转)。其潜伏、不同的和慢性气管炎症的强度与更加频繁、剧烈和长时间的发作有关，或相关，而后者是支气管扩张药难以逆转的。其原因在近年类变得越来越清楚。主要由TH2-淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞和可能的血小板的活化的或已接触抗原的侵润物构成的炎症导致血管周围(间质)间隙扩张，释放介质／生长因子，从而引起基底膜增厚，上皮损伤且脱落，粘液产生，增生，引发和气管平滑肌部分狭窄。所有这些结果表明气管反应能力增高，对外界刺激的反应阈值降低，所以使发作更频繁和剧烈。
所有上述形态上的变化直接且严重地影响了肺功能。在急性哮喘小鼠模型和长期哮喘小鼠模型的试验中，已观察到肺功能的明显的病理生理性变化，这证明上述形态性变化。业已发现，变应原吸入增强了嗜酸性粒细胞和肥大细胞在气管和肺泡内皮和上皮的表达，并且只在气管内皮诱发E选择表达，嗜酸性粒细胞浸润和气管反应性增高，以及其他类型的炎症细胞(球形白细胞和Langhans型多核巨细胞(融合巨噬细胞))，这表明哮喘病的肺内存在非特异性炎症反应。
化合物HK-X抑制粘液在OVA处理(OVA)组和对照组小鼠的气管中蓄积。在HK-X处理不存在(OVA，n=4)或存在(KH-X／OVA，n=8)的条件下，由假致敏和盐水攻击小鼠(盐水，n=4)和OVA致敏／攻击的小鼠测出气管粘液闭塞的分布。通过形态测定法对气管直径的粘液闭塞的分析如下：0，无粘液，+，～10％闭塞；++，～30％闭塞；+++，～60％闭塞；++++，～80％闭塞。利用形态测定法，形态测定评估每只小鼠的随机分布穿过肺的10个气道的粘液闭塞。
图6A-6D提供的是目测组织学迹象，它表示了化合物HK-X在OVA诱发的哮喘小鼠中对肥大细胞脱粒的抑制能力，以及化合物HK-X治疗哮喘的效果。图6A表示在OVA致敏／攻击的小鼠中气管(AW)腔内分泌粘液的丰度。图6B显示嗜酸性粒细胞和其他炎症细胞(用箭头标出)大块浸润间质组织。图6C是当在OVA鼻内给药之前使用化合物HK-X抑制剂时，可以明显降低气管腔中粘液的释放。嗜酸性粒细胞对间质组织的浸润作用在用化合物HK-X处理后也比单独使用OVA攻击时降低。(将图6C与图6A和6B比较)。图6D显示盐水处理对照组的气管(AW)无粘液和细胞。支气管上皮被结缔组织细胞浸润，但支气管周间质中不存在白细胞。
气管巨噬细胞是显著活化的标记，这类似于那些有关于从变应原攻击的哮喘患者肺获得的BAL液中回收的巨噬细胞的报导(Am．Rev．Respir．Dis．1987；135：433-440)。巨噬细胞和树状细胞在肺中充当抗原呈递细胞，并且直接或间接地引起能在气管上皮及其外周位点中诱发表型改变的细胞因子的分泌。慢性炎症对气管的刺激可以直接引发气管上皮和成纤维细胞增殖，随后胶原沉降在这些区域的周围。与其它炎症细胞相比，在攻击的后期阶段中，活化巨噬细胞和树状细胞在这些区域中仍然很高。
气管上皮增厚，主要是因为标记杯形细胞尤其是在大气管内超常增生，但也在小气管并且甚至在末端细支气管超常增生。和对照组的比较，杯状细胞对正常柱状纤毛细胞的比例大大增高。对照气管(小气管和大气管)仅仅偶然存在杯状细胞，但OVA攻击的肺切片显示100％的大气管和部分小气管中含有占总气管上皮细胞88％的杯状细胞。在未经灌洗的肺中，在杯状细胞和一些气管中可以看到粘液，有时将腔体全部闭塞。细胞碎屑陷入这些粘液塞中。在对照组中未发现杯状细胞超常增生，所以不能归因于OVA的“非变应性”作用，或气管内给药技术。一些存在于小气管内的杯状细胞没有此特征，这表明OVA在呼吸道树中的分布可能不均匀。
图7是直方图，它给出了在此哮喘鼠模型中化合物HK-X以5μg／kg和10μg／kg的剂量对粘液塞形成的治疗结果。两种剂量都可以明显降低小气管中粘液的产生。诱发的Ⅱ型胶原关节炎小鼠模型
用小鼠模型评估本发明化合物对诱发的Ⅱ型胶原关节炎的组织学、放射照相和临床表象的作用。
自身免疫性疾病引起严重和慢性的发病和劳动能力丧失。关节炎以其多种形式成为一类代表性的自身免疫性疾病。在临床领域中，类风湿性关节炎(RA)是最常见形式的严重关节发育不良病。所有临床医师认为RA是一种进行性疾病。
在CIA鼠中出现的关节炎损害的病理组织学与人类患者中RA的病理组织学有着许多相似之处。所以，CIA鼠是一个被接受的用于研究对RA的可能的治疗有效性的模型。
材料和方法
小鼠：本试验中采用体重为25克的DBA／1(2)雄性小鼠(JacksonLaboratories，Bar Harbor，Me or B&K Universal，Kent WA)。这种品系的小鼠易于通过注射Ⅱ型异源胶原感染上RA。可以由SigmaChemical获得牛胶原(BC)、完全Freund氏佐剂(CFA)和不完全Freund氏佐剂(ICFA)。用于免疫的抗原在0．1M的醋酸中处理并用CFA和ICFA配制。
关节炎的诱发
免疫方案：在研究过程中的预定时间间隔，给小鼠注射存在于CFA中的100μg Ⅱ型胶原。
在预定时间间隔检查小鼠关节炎的发展。推定关节炎的症状包括前和／或后足上至少一个脚趾关节在两次连续观察之间出现肿胀和红斑。
关节炎的确认诊断
关节的组织学检查：在适当的时间间隔取下被处死动物的趾关节，固定，脱钙，包埋在石蜡中，作切片并染色，用于观察细胞和结构特征，并且酌情监测各关节的关节翳的软骨基质。利用数字化的组织学显微照片，使用上述标准面积和点计数技术，对细胞构成的程度和炎症面积进行定量测定。
对趾关节进行放射照相评估以检测用Ⅱ型胶原免疫后关节变化的发生率。将乳房X线照相影像系统改进后用于本试验。通过分析微机数字化的放射照片来测出关节软组织(关节翳)的平均面积，并且通过和各个放射照片中所含内标物进行比较来测出相邻硬组织密度的改变。为了给硬组织改变的密度和脂膜面积作基线对照，在同一时间内采用另外的小鼠，并且比较它们的密度和面积数据。对照小鼠和试验小鼠在密度和面积上差异的显著性是用各时间点的配对T试验来评估的。
关节炎的评估
从关节炎发生开始每天观察动物。关节炎指数得自于对各鼠爪严重程度的评分，等级分为0-4。评分基于关节周红斑和水肿，以及关节变形程度。还可以通过用定张力卡钳从内侧踝骨至外侧踝骨测量出踝关节厚度，从而定量测出后爪的肿胀程度。
试验设计
为了评估化合物KH-X的抗关节炎作用，基于对患者最适当给药机理的经验来选择给药途径。
HK-X和泼尼松龙的剂量：通过经皮(TC)(吸收性)给药途径和足内注射途径，将代表分散和推定治疗量的肽的制剂给药至局部位点内。为了人为现象，而直接注射到关节内间隙似乎过于伤害动物。所以，方法上是选择将药物注射到邻近于关节内间隙的足垫(FP)内。对照小鼠也接受泼尼松龙(文献证明其在试验和临床自身免疫疾病的治疗中是一种有效的抗炎药)注射作为阳性对照。
首先，每天给每10只动物(加对照)一组中的各个小鼠注射胶原，连续50天。在第3天和第18天时，给小鼠注射5或10μg／kg的化合物HK-X以1mg／ml溶于0．1M醋酸中的溶液。在第50天，从小鼠放血，进行组织学研究。
随后，按照下列特定方案对每组10只的8组(A-I)小鼠进行处理：
A组是用1°CFA+BC、2°ICFA+BC免疫并不进行处理(对照)。
B组是用1°CFA+BC、2°ICFA+BC免疫并且在2°ICFA+BC免疫后的那天开始给予泼尼松龙5mg／kg并且连续20天。
C组是用1°CFA+BC、2°ICFA+BC免疫并且在2°ICFA+BC免疫后的那天开始经皮给予化合物HK-X 4mg／kg(高剂量)并且连续20天。
D组是用1°CFA+BC、2°ICFA+BC免疫并且在2°ICFA+BC免疫后的那天开始经皮给予化合物HK-X 0．4mg／kg(低剂量)并且连续20天。
E组是用1°CFA+BC、2°ICFA+BC免疫并且在2°ICFA+BC免疫后的那天开始经皮给予化合物HK-X 4mg／kg(高剂量)并且连续20天。
F组是用1°CFA+BC、2°ICFA+BC免疫并且在2°ICFA+BC免疫后的那天开始经皮给予化合物HK-X 0．4mg／kg(低剂量)并且连续20天。
G组是用1°CFA、2°ICFA免疫并且在2°ICFA+BC免疫后的那天开始经皮给予10mlDMSO并且连续20天(对照)。
H组是用1°CFA、2°ICFA免疫并且在2°ICFA+BC免疫后的那天开始FP给予10mlDMSO并且连续20天(对照)。
I组是用1°CFA、2°ICFA免疫并且在2°ICFA+BC免疫后的那天开始FP给予10ml盐水并且连续20天(对照)。
各组的动物在2°免疫后和刚刚处死之前接受X射线照相。处死后，酌情取下足部并进行组织学检查。发现化合物HK-X的处理降低了关节炎的水平。
本发明参考其优选实施方案进行了详细说明。然而，应理解，根据本发明的说明书和附图，所属领域技术人员可在本发明权利要求书所限定的精神和范围内进行修改和改进。

Claims (23)

1．一种药物组合物，含有药学载体和具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
2．如权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽是f-Met-Leu-Phe-Phe。
3．如权利要求1所述的药物组合物，其中所述肽是f-Met-Leu-Tyr。
4．如权利要求1所述的药物组合物，其中选择适用于肽的口服给药的载体。
5．如权利要求1所述的药物组合物，其中选择适用于肽的吸入给药的载体。
6．如权利要求1所述的药物组合物，其中所述组合物是气雾剂组合物。
7．如权利要求1所述的药物组合物，其中选择适用于肽的局部给药的载体。
8．如权利要求1所述的药物组合物，其中选择适合于所述肽通过片剂给药的载体。
9．一种抑制肥大细胞脱粒的方法，该方法包括使肥大细胞和具有式f-Met-Leu-X的肽接触，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
10．一种治疗患者哮喘的方法，该方法包括给该患者施用治疗有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。。
11．一种治疗患者炎症的方法，该方法包括给该患者施用抗炎有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
12．如权利要求11所述的方法，其中所述炎症是由选自哮喘、类风湿性关节炎和过敏反应的疾病所致。
13．如权利要求11所述的方法，其中所述炎症是类风湿性关节炎所致。
14．如权利要求11所述的方法，其中所述炎症是过敏反应所致。
15．一种用于抑制患者的细胞因子释放的方法，该方法包括给该患者施用细胞因子释放抑制有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
16．一种用于抑制患者的组胺类释放的方法，该方法包括给该患者施用组胺释放抑制有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
17．一种用于抑制患者的白三烯类释放的方法，该方法包括给该患者施用抑制白三烯释放有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
18．一种用于减少患者淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞粘着、迁移和聚集到炎症位点的方法，该方法包括给该患者施用抑制治疗有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
19．一种用于降低患者的炎症位点IgE抗体的产生的方法，该方法包括给该患者施用IgE抗体生产抑制有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
20．一种用于减少患者炎症处IgE交联的方法，该方法包括给该患者施用IgE交联抑制有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
21．一种用于抑制患者炎症位点的增高的血管通透性的方法，该方法包括给该患者施用血管通透性抑制有效量的具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。
22．一种用于治疗患者的慢性炎症的方法，该方法包括给该患者施用抗炎有效量的(ⅰ)具有式f-Met-Leu-X的肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr，和(ⅱ)另一种活性组分。
23．如权利要求24所述的方法，其中所述其它活性组分选自抗白三烯类物质、β2-激动剂和皮质类固醇。
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