CN1341026A

CN1341026A - 治疗哮喘和炎症的小肽和方法

Info

Publication number: CN1341026A
Application number: CN98814393A
Authority: CN
Inventors: J·C·胡克; J·克拉盖特
Original assignee: Histatek LLC
Current assignee: Histatek LLC
Priority date: 1998-12-03
Filing date: 1998-12-03
Publication date: 2002-03-20
Also published as: AU1801899A; MXPA01005600A; KR20010108002A; JP2003504304A; EP1152770A1; CA2353550A1; KR100596136B1; HK1044468A1; WO2000032217A1; BR9816097A

Abstract

本发明描述了治疗变态反应、皮肤炎症、关节炎、慢性堵塞性肺病、和慢性炎性肠病的方法。本发明还描述了抑制嗜酸性细胞渗入到患者导气管中的方法,抑制粘液释放到患者导气管中的方法,阻断IgE激活淋巴细胞的方法,稳定淋巴细胞的细胞膜、从而阻止其进一步参与增强对IgE抗原激发的炎性反应的方法,和抑制T－细胞迁移的方法。所述方法包括给所述患者施用治疗有效量的式f－Met－Leu－X所示肽,其中X选自Tyr、Tyr－Phe、Phe－Phe和Phe－Tyr。

Description

治疗哮喘和炎症的小肽和方法

发明领域

本发明涉及具有肥大细胞脱粒抑制活性的小肽、和治疗炎症的方法，特别涉及可用于治疗下述疾病的N-甲酰基-甲硫氨酰肽：变态反应例如变应性鼻炎、荨麻疹、过敏症、药物过敏、和食物过敏等，皮肤炎症例如皮炎、湿疹、牛皮癣、接触性皮炎、晒伤、和衰老等，以及关节炎例如骨关节炎、牛皮癣性关节炎、狼疮、和椎关节炎等。这些肽还可用于治疗慢性堵塞性肺病以及慢性炎性肠病。这些肽尤其可用于在使用皮质类固醇的任何应用中，包括在移植中的免疫抑制和癌症治疗中代替皮质类固醇。

发明背景

哮喘是一种复杂的疾病。遗传和环境因素—变态反应、病毒感染、刺激物—在哮喘起病及其炎性加重中都有涉及。有一半以上的哮喘患者(成人和儿童)具有变态反应；实际上，对住宅粉尘螨粪的变态反应是哮喘形成以及加重的主要因素。在婴儿期的呼吸道合胞体病毒感染也与哮喘的形成高度相关，并且病毒呼吸道感染经常引发急性发作。

30年前支气管扩张性β₂-激动剂—β₂受体的选择性肾上腺素能激动剂—的问世给哮喘的治疗带来了一场革命。已证实这些治疗剂比既刺激α-肾上腺素能受体又刺激β-肾上腺素能受体的非选择性肾上腺素能受体激动剂例如异丙肾上腺素更有效和作用持续时间更长(4-6小时)。β₂-激动剂能产生迅速的症状缓解效果，并且还保护不发生由刺激例如运动或吸入寒冷空气引起的急性支气管收缩。使用频率还可用作哮喘控制的指标。最近，在美国问世了一种作用持续时间特别长的β₂-激动剂—沙美特罗(作用持续时间高达12小时)。沙美特罗的效力非常强以至于可以掩饰炎性症状；因此，其可用于抗炎治疗。

茶碱是比较弱的支气管扩张剂，其具有很窄的治疗临界范围(推荐进行血液水平监测来防止毒性)，并易于发生药物相互作用(与肝细胞色素P450药物代谢酶竞争，改变了通过该酶代谢的几种重要药物的血浆水平)。

中度哮喘是用每天吸入抗炎性皮质类固醇或肥大细胞抑制剂(色甘酸钠或奈多罗米)加上(按照需要)吸入β₂-激动剂(每天3-4次)进行治疗以减轻突破性症状或者变应原或运动引起的哮喘。色甘酸钠或奈多罗米阻断支气管痉挛和炎症，但是通常仅对由变应原或运动引起的哮喘有效，所以一般仅用于少年哮喘患者。吸入的皮质类固醇改善炎症、导气管高反应性、和堵塞，并减少急性恶化的次数。然而，其效果需要一个月才能变得明显，并需要高达1年的时间才能使病症得到显著改善。最常发生的副作用是声嘶和口腔念珠菌病。更严重的副作用已有报道—部分肾上腺抑制、生长抑制、和降低骨形成—但是仅在以较高剂量使用时发生。倍氯米松、曲安西龙和氟尼缩松可能具有类似mg级效力；新近批准的布地奈德和氟地卡松效力更强，并且据报道有较少系统副作用。

甚至轻度疾病患者也表现出导气管炎症，包括激活的T细胞、肥大细胞、和嗜酸性细胞渗入粘膜和上皮。T细胞和肥大细胞释放促进嗜酸性细胞生长和成熟以及IgE抗体生成的细胞因子，而这些后果又提高微血管渗透性、使上皮破裂、并刺激神经反射和粘液分泌腺。结果导致导气管高反应性、支气管收缩和分泌过多，表现为喘鸣、咳嗽和呼吸困难。

按惯例，哮喘是用口服和吸入的支气管扩张剂进行治疗。这些治疗剂能治疗哮喘症状，但是对作为其发病基础的炎症没有任何作用。在最近10年，人们已认识到炎症在哮喘病因中的重要性，并增加了皮质类固醇的使用，但是仍有许多患者在继续受着失控哮喘的折磨。

科学家已经证实了白三烯(有A、B、C、D、和E亚型)在哮喘中的决定性作用。它们引起导气管平滑肌痉挛、增加血管渗透性、水肿、增加粘液产生、减少粘液纤毛迁移和白细胞趋化性。

象相关的前列腺素化合物一样，白三烯是在细胞膜中由花生四烯酸合成的。肥大细胞、嗜酸性细胞、巨噬细胞、单核细胞、和嗜碱细胞中的花生四烯酸是由膜磷脂通过激活磷脂酶A2而形成的。形成后，花生四烯酸通过两条主要途径代谢：环加氧酶途径(产生各种前列腺素和血栓烷)和5-脂氧合酶途径(产生白三烯)。花生四烯酸代谢概况如附图4所示。前列腺素、血栓烷、和白三烯统称为类花生酸。

抗白三烯是能干扰炎症级联中的初始步骤的一异类抗哮喘剂中的成员。白三烯是与前列腺素有关的炎性物质；二者都是在细胞膜中由花生四烯酸产生的。当花生四烯酸在肥大细胞、嗜酸性细胞、巨噬细胞、单核细胞、和嗜碱细胞中形成以后，其通过两条主要途径代谢：(1)环加氧酶途径(产生前列腺素和血栓烷)，和(2)5-脂氧合酶途径，在胞质中产生白三烯。在医学领域中，白三烯作为过敏反应的慢反应物质(″SRS-A″)是众所周知的。白三烯在支气管炎症中起重要作用。它们诱导各种白细胞(例如嗜中性白细胞、嗜酸性白细胞和单核细胞)迁移、粘着和聚集到血管中，增加毛细血管渗透性和引起血管平滑肌收缩。导致的结果包括间质水肿、白细胞趋化性、粘液产生、粘液纤毛机能障碍、和肺中支气管痉挛。一些种类白三烯，例如半胱氨酰白三烯(LTD₄)是效力特别强的支气管收缩剂，比组胺的活性强大约100-1000倍。包括半胱氨酰白三烯在内的白三烯是在脱粒期间从肥大细胞释放出来。

有多种通过阻断5-脂氧合酶而阻断白三烯受体或阻止白三烯合成的抗白三烯剂正处在研究阶段或者已在市售。白三烯抑制剂在其作用方面是呈多样化的：有些直接阻断5-脂氧合酶，有些抑制激活5-脂氧合酶的蛋白，有些将花生四烯酸从其在蛋白上的结合位点上置换下来。与之相反，白三烯激动剂阻断介导导气管高反应性、支气管收缩、和分泌过多的它们自己的受体。

在体外IgE刺激后，人肺肥大细胞产生肿瘤坏死因子(TNF)、IL-4和IL-5(Chest 1997；112：523-29)。在支气管内活组织检查样本中进行的免疫组织化学分析已证实了这一点以及IL-6生成。此外，当与正常个体比较时，在哮喘患者中肥大细胞计数和TNF更多(有统计学显著性)。TNF和IL-4可加强血管细胞粘着分子-1(VCAM-1)-一个免疫球蛋白超家族的粘着分子—在支气管血管系统内皮层中表达的正调节。嗜酸性细胞、嗜碱细胞和单核细胞在其细胞表面上展现出与VCAM-1相互作用的极迟活化抗原4(VLA-4)整联蛋白。因此，通过VLA-4/VCAM-1相互作用，TNF和IL-4促进循环白细胞的募集。在受到IG-E介导的刺激时肥大细胞释放形成的细胞因子(TNF)或迅速合成其它细胞因子(IL-4，IL-5)的能力可能是导致支气管炎症的初始事件。实际上，通过进一步生成细胞因子，诱导和激活TH2克隆促进了起炎性反应末期效应子作用的嗜酸性细胞的激活和募集。白细胞(特别是TH2细胞)产生的细胞因子极大地影响粘膜肥大细胞的发育、激活、和引发，由此促进了正促炎环。最近发现，人肥大细胞产生IL-8，源自鼠肺的肥大细胞表达两种趋化因子—单核细胞趋化物蛋白-1和巨噬细胞炎性蛋白-1。这意味着，除了通常已知涉及白细胞募集的细胞因子(IL-4、IL-5、TNF)以外，肥大细胞还在导气管中中产生另外的强效趋化物，这些趋化物作用于嗜酸性细胞和多形核白细胞(IL-8)。此外，因为起组胺释放因子作用的趋化因子引起肥大细胞脱粒，所以它们可进一步支持自分泌激活环。

肥大细胞还在B-细胞生长中起关键作用，以提供对于体外IgE合成来说是必需的与IL-4的细胞接触(例如嗜碱细胞)，这意味着肥大细胞可能独立于T-细胞直接调节IgE的生成，并且可以通过IgE交联产生足量的IL-4，以启动局部TH2—据认为在特异反应性哮喘中起中枢作用的T-细胞的子细胞—的反应。此外，肥大细胞还可以起T-淋巴细胞的抗原传递细胞的作用，这表明肥大细胞在哮喘的免疫网络中有更大的作用。

Inflammation，Vol.5，No.1，pp.13-16(198)中报道了N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基苯丙氨酸抑制肥大细胞脱粒的作用。该文献报道，两种结构不同的趋化肽，即胃蛋白酶抑制剂和N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基苯丙氨酸抑制了由于将40/80、抗大鼠IgE血清、或大分子阴离子渗透性因子(从牛肺中分离的)真皮内注射到大鼠皮肤中所引起的血管渗透性增加。该文献还报道了这些肽似乎能直接作用于肥大细胞。

由于治疗人的炎性疾病，特别是例如哮喘、关节炎和过敏症的重要性，人们一直在不断地寻找具有较少副作用的新生物活性分子。附图4形象化地描述了在哮喘炎症过程中引入本发明新肽来抑制肥大细胞脱粒。

发明概述

本发明提供了使用新药物组合物来治疗各种适应征的方法，所述药物组合物在合适的药物载体中包含具有肥大细胞脱粒抑制活性的N-甲酰基-甲硫氨酰基-亮氨酰基(″f-Met-Leu″)肽。特别适用的这类肽是式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。这样的肽可用于治疗变态反应例如变应性鼻炎、荨麻疹、过敏症、药物过敏、和食物过敏等，皮肤炎症例如皮炎、湿疹、牛皮癣、接触性皮炎、晒伤、和衰老等，以及关节炎例如骨关节炎、牛皮癣性关节炎、狼疮、和椎关节炎等。这些肽还可用于治疗慢性堵塞性肺病以及慢性炎性肠病。本发明肽尤其可用于在使用皮质类固醇的任何应用中，包括在移植中的免疫抑制和癌症治疗中代替皮质类固醇。

依据本发明，治疗哺乳动物变态反应的方法包括给该哺乳动物施用抗变态反应有效量的式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。为了治疗与例如鼻粘膜有关的变态反应，优选的给药方式是吸入给药。为了治疗接触性变态反应，优选的给药方式是使用合适的药物载体局部涂敷。对于系统治疗，可使用真皮内注射或片剂。

本发明还提供了治疗哺乳动物皮肤炎症的方法。所述方法包括给该哺乳动物施用抗炎有效量的式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

本发明还提供了治疗哺乳动物选自骨关节炎、牛皮癣性关节炎、狼疮、和椎关节炎等的关节炎的方法。所述方法包括给该哺乳动物施用抗关节炎有效量的式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

依据另一实施方案，本发明提供了抑制嗜酸性细胞渗透到患者导气管内的方法。该方法包括给所述患者施用导气管嗜酸性细胞渗透抑制有效量的式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

依据本发明另一实施方案，本发明提供了抑制患者导气管中粘液释放的方法。该方法包括给所述患者施用导气管粘液释放抑制有效量的式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

本发明还提供了治疗患者慢性堵塞性肺病的方法。该方法包括给所述患者施用慢性堵塞性肺病治疗有效量的式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

此外，本发明还提供了治疗患者慢性炎性肠病的方法。该方法包括给所述患者施用慢性炎性肠病治疗有效量的式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

本发明还提供了阻断IgE激活淋巴细胞例如巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜中性白细胞、和TNF等的方法。所述方法包括将所述淋巴细胞与IgE激活阻断有效量的式f-Met-Leu-X所示肽接触，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

本发明还提供了稳定淋巴细胞例如巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜中性白细胞、和TNF等的细胞膜，从而阻止其进一步参与增强对IgE抗原攻击的炎性反应的方法。该方法包括将所述淋巴细胞与细胞稳定有效量的式f-Met-Leu-X所示肽接触，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

此外，本发明还提供了抑制T-细胞例如CD4⁺细胞迁移，从而阻止其参与IL-4和IL-5以及其它趋化因子生成的方法。该方法包括将所述T-细胞与T-细胞迁移抑制有效量的式f-Met-Leu-X所示肽接触，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

在一些优选的本发明实施方案中，患者可受益于本发明肽与另一活性组分的联合给药。对于依据本发明的该联合给药，特别有用的其它活性组分是例如抗白三烯、β2激动剂、和皮质类固醇等。

附图概述

附图1是对数剂量反应曲线，它表明的是对于不同浓度的化合物48/80，毛细血管渗透的面积。

附图2是关于不同浓度f-Met-Leu-Phe抑制毛细血管渗透性的剂量反应曲线。

附图3是关于不同浓度本发明优选肽抑制毛细血管渗透性的剂量反应曲线。

附图4是以图解方式说明了花生四烯酸代谢的主要途径，还说明了抑制肥大细胞脱粒。

附图5A和5B以图解方式说明了在OVA诱导的支气管哮喘小鼠模型中使用的Standard(5A)方案和Resolution(5B)方案。

附图6A-6D是显微图，其表明的是在治疗小鼠和对照小鼠中，用抑制OVA诱导的哮喘的本发明化合物治疗的比较病理组织学。

附图7是直方图，它表明的是在鼠哮喘模型中，依据本发明进行的治疗在粘液堵块形成方面的结果。

附图8A-8C表示的是，诱导哮喘后依据本发明治疗的小鼠肺组织的病理组织学。

附图9A-9D表示的是，诱导哮喘后依据本发明治疗的第二组小鼠肺组织的病理组织学。

附图10A-10D表示的是，诱导哮喘后依据本发明治疗的第三组小鼠肺组织的病理组织学。

附图11表示的是在从OVA诱导的哮喘小鼠采集的肺泡中炎性细胞细胞的分布。

附图12表示的是在OVA诱导的哮喘小鼠的导气管中导气管堵塞得分。

附图13表示的是，在OVA诱导的哮喘小鼠的导气管中的白细胞迁移。

附图14表示的是，从OVA诱导的哮喘小鼠的肺灌洗所回收的细胞总数。

发明详述

依据本发明，我们发现一些式f-Met-Leu-X所示小肽具有令人惊奇的抑制肥大细胞脱粒的活性，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。结果这些肽抑制细胞因子(例如TNF)、以及组胺和白三烯的释放，并且可用于治疗由多种疾病例如哮喘引起的炎症，变态反应例如变应性鼻炎、荨麻疹、过敏症、药物过敏、和食物过敏等，皮肤炎症例如皮炎、湿疹、牛皮癣、接触性皮炎、晒伤、和衰老等，以及关节炎例如骨关节炎、牛皮癣性关节炎、狼疮、和椎关节炎等。这些肽还可用于治疗慢性堵塞性肺病以及慢性炎性肠病。本发明肽可用于在使用皮质类固醇的任何应用中，包括在移植中的免疫抑制和癌症治疗中代替皮质类固醇。

用本发明肽治疗后，可降低或者在优选方案中完全停止连续的肥大细胞脱粒、及其释放白三烯、组胺、和其它细胞因子。依据本发明优选的实施方案，本发明肽还降低嗜酸性细胞、嗜碱细胞和嗜中性白细胞渗入到炎性组织中。通过施用本发明优选的肽，淋巴细胞、嗜酸性细胞、和嗜中性白细胞不表现出趋化性。结果使得淋巴细胞、嗜酸性细胞、和嗜中性白细胞朝着炎性位点的趋化粘着、迁移和聚集显著下降，并且在炎性位点的血管渗透性也显著下降。此外，本发明优选的化合物对生命器官例如心脏、肝脏和肺不表现出任何毒性作用。

本发明优选的肽在体外和体内提供了阻断IgE激活淋巴细胞例如巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜中性白细胞、和TNF等的受体连结。本发明肽稳定这些淋巴细胞的细胞膜，从而阻止其进一步参与增强对IgE抗原攻击的炎性反应。本发明肽还阻断慢性炎症中的交叉-细胞IgE连结，例如肥大细胞与嗜酸性细胞之间的交叉IgE连结。

本发明肽可通过常规小肽化学技术制得。当用于给药时，在无菌条件下用可药用载体或稀释剂配制本发明肽。

本发明药物组合物的剂量随着治疗对象和特定给药途径的不同而异。剂量可以为0.1-100000μg/kg/天、更优选1-10000μg/kg/天。最优选的剂量为约1-100μg/kg体重、更优选为约1-10μg/kg、最优选为约1.0-2.0μg/kg。根据病症的严重程度，剂量通常每天给药一次到每4-6小时给药一次。对于急性病症，优选每4-6小时给药一次本发明肽。对于维持或治疗应用，优选每天仅给药一次或2次。根据给药途径和病症的严重程度，优选每天施用约0.18-约16mg本发明肽。为了施用多次剂量的特定组合物，本领域技术人员通过采用一个或多个常规实验，可确定出理想的给药时间间隔。

给药途径包括口服给药、非胃肠道给药、直肠给药、阴道内给药、局部给药、经鼻给药、经眼给药、直接注射等。在优选的实施方案中，可将抗炎有效量或抑制肥大细胞脱粒剂量的本发明肽施用给患者。药物组合物的一个实例是通常包含在可药用载体中的、能提供抗炎效果或抑制肥大细胞脱粒的、治疗有效量的本发明肽。

本文所用的、并且在下文中更充分描述的术语“可药用载体”包括一种或多种适于施用给人或其它动物的可配伍固体或液体填充剂、稀释剂或做成胶囊的物质。因此在本发明中，术语“载体”是指与本发明分子合并在一起以促进施用的有机或无机天然或合成组分。术语“治疗有效量”是指能对所治疗的特定病症产生所需结果或施加所需影响的本发明药物组合物的量。在制备含有相同组分的组合物时，可采用不同浓度以随着所治疗患者的年龄、病症严重程度、治疗持续时间和给药方式的不同而提供不同剂量。

载体还必须是可配伍的。本文所用术语“可配伍的”是表示药物组合物的组分能够与本发明小肽以及组分彼此之间以基本上不影响所需药物效力的方式混合。

本发明小肽通常以自身(纯净)形式给药。然而，本发明小肽可以以可药用盐的形式给药。这样的可药用盐包括但不限于用下列酸制得的盐：盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸、马来酸、乙酸、水杨酸、对甲苯磺酸、酒石酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、丙二酸、琥珀酸、萘-2-磺酸、和苯磺酸。而且，可药用盐可作为碱金属盐或碱土金属盐制得，例如羧酸基的钠盐、钾盐或钙盐。因此，本发明提供了医疗用药物组合物，其中包含本发明肽与一种或多种可药用载体以及任选含有的任何其它治疗组分。

本发明组合物包括适于口服给药、直肠给药、阴道内给药、局部给药、经鼻给药、经眼给药、或非胃肠道给药的组合物，所有这些途径都可用作使用本发明物质的给药途径。含有本发明肽的药物组合物还可以含有一种或多种可药用载体，所述载体可包括赋形剂例如稳定剂(以促进长期贮存)、乳化剂、粘合剂、增稠剂、盐、防腐剂、溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。对于药物活性物质，使用这样的介质和辅助剂在本领域内是众所周知的。除了排除与本发明肽有配伍禁忌的任何常规介质或辅助剂以外，在本发明中还要考虑其在药物制剂中的应用。本发明组合物还可以包含补充活性组分。

对于治疗哮喘，适于口服给药的组合物是优选的。这样的组合物一般是制成吸入气雾剂、喷雾剂、糖浆剂或片剂。对于治疗关节炎，适于局部给药的组合物是优选的，但是口服组合物也是方便的。这样的局部施用组合物通常是制成霜剂、膏剂、或溶液剂。在这样的组合物中，本发明肽活性组分的浓度一般低于50μg/ml、更优选低于30μg/ml、最优选为约5-10μg/ml。

方便起见，本发明组合物可以以单位剂型的形式使用，并且可通过制药领域众所周知的任何方法制得。其制备方法一般包括将本发明活性组分与组成一种或多种辅助组分的载体混合在一起的步骤。

适于吸入给药的本发明组合物可以以例如气雾剂或吸入溶液的形式使用。典型气雾剂组合物的一个实例由悬浮在三氯一氟甲烷与二氯二氟甲烷的混合物中的所需量的微晶肽和油酸组成。典型溶液的一个实例由溶解或悬浮在无菌盐水(任选含有约5％v/v二甲亚砜(″DMSO″)以促进溶解)中的所需量的肽、苯扎氯铵、和硫酸(以调节pH)组成。

适于口服给药的本发明组合物还可以以不连续单位例如胶囊、扁囊剂、片剂或锭剂的形式使用，每一不连续单位含有预定量的本发明肽，或者本发明肽可包含在脂质体中，或者以在含水液体或非水液体例如糖浆中的悬浮液、酏剂、或乳剂的形式使用。片剂基质的实例包括作为非活性组分的玉米淀粉、乳糖和硬脂酸镁。糖浆剂基质的实例包括柠檬酸、着色染料、矫味剂、羟丙基甲基纤维素、糖精、苯甲酸钠、柠檬酸钠和纯化水。

方便起见，适于非胃肠道给药的组合物包括本发明分子的无菌水制剂，该水制剂优选与接受者的血液等渗。可依据已知方法，使用合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂配制这样的水制剂。无菌注射剂还可以是在无毒可非胃肠道用稀释剂或溶剂中的无菌注射溶液或悬浮液，例如在1，3-丁二醇中的溶液。在这些可接受的载体和溶剂中，可使用的有水、林格氏溶液和氯化钠等渗溶液。在水溶液中，可使用最高达约10％v/v的DMSO或Trappsol来维持某些肽的溶解性。无菌不挥发油也可以方便地用作溶剂或悬浮介质。对于此，可使用多种不挥发油，包括合成的甘油一酯和甘油二酯。此外，可在注射剂中使用脂肪酸(例如油酸或中性脂肪酸)。另外，可在4℃用泊洛沙姆嵌段共聚物和脂质配制其中在37℃释放时间达到数周或数月的缓释复合注射剂。

适于局部给药的组合物可以以本发明肽在Trappsol或DMSO中的溶液、或霜剂、膏剂、或洗剂的形式使用。通常将约0.1-约2.5％活性组分掺合到基质或载体中。霜剂基质的实例包括纯化水、凡士林、苯甲醇、硬脂醇、丙二醇、肉豆蔻酸异丙酯、硬脂酸-40-聚烃氧基酯、卡波姆934、十二烷基硫酸钠、乙酸钠、氢氧化钠、和任选的DMSO。膏剂基质的实例包括白凡士林和任选的矿物油、脱水山梨醇倍半油酸酯、和DMSO。洗剂基质的实例包括卡波姆940、丙二醇、吐温40、丙二醇硬脂酸酯、胆固醇和相关甾醇、肉豆蔻酸异丙酯、脱水山梨醇棕榈酸酯、乙酰醇、三乙醇胺、抗坏血酸、二甲基硅油、和纯化水。确定肥大细胞脱粒抑制的大鼠皮肤模型

通过将物质(变应原)暴露于已经变得过敏的生物体来获得变态反应诱导的哮喘。暴露于变应原导致肺中的肥大细胞脱粒，释放白三烯和组胺。作为对白三烯和组胺释放的反应，毛细血管渗透性显著增加，并且血浆从毛细血管渗漏到周围组织中。由此导致的呼吸症状从轻度(瘙痒和喷嚏)到可能致命(哮喘)不等，包括由过敏反应引起的严重慢性死亡病例。

为了通过实验证实该现象，用大鼠皮肤代替肺。在该模型中，用染料台盼蓝标记实验大鼠的血浆。这种可溶性染料作为血浆自身的被动标记物被携带到血流中，并且不能进入活细胞。完整血管，包括毛细血管系统将该染料保持在正常环境下。将能诱导肥大细胞脱粒(导致白三烯和组胺释放)的化合物注射到皮肤内以刺激变应原诱导的脱粒。在这些实验中，使用化合物48/80来诱导肥大细胞脱粒。在白三烯和组胺释放后的事件中，毛细血管渗透性增加，并且染上蓝色的血浆从毛细血管中渗漏出来，并且将注射位点周围的皮肤染上蓝色。染上蓝色的面积是化合物48/80注射量的度量标准。

可通过将化合物在注射前与化合物48/80混合来测定其“抗白三烯”和/或“抗组胺”活性。如果测试化合物抑制白三烯或组胺的释放，那么与在同一大鼠中注射了不含任何测试化合物的化合物48/80的注射位点相比，就会观察到染上蓝色的区域有更小的直径。当测试化合物具有高抗白三烯和抗组胺活性时，蓝色染色可实际上被完全抑制。实验

建立并验证大鼠皮肤模型。以预定剂量测定各种肽的抗白三烯和/抗组胺活性。所选剂量使得能与用于比较的标准化合物f-Met-Leu-Phe进行一般比较。

对于一些化合物，进行“剂量反应”滴定，并与标准化合物比较。使用一系列较小剂量被公认有抑制活性的化合物，结果观察到毛细血管渗透区域的大小发生了系列下降，从而验证了在开始预定的剂量测试中所观察到的白三烯和/或组胺释放抑制。材料和方法

除了氯胺酮之外，所有试剂均购自Sigma或Aldrich，兽医用麻醉剂氯胺酮得自不同的兽药供应商。所用大鼠是购自B&KInternational的雄性Sprague-Dawley品种，在购买时重220-240g。

为了进行大鼠皮肤反应，用0.25ml 10mg/ml氯胺酮将大鼠麻醉。将1.0ml在盐水(无菌过滤)中的台盼蓝施用到尾静脉中，将大鼠背部的毛剃光。每只大鼠使用4个真皮内注射位点以进行测试和对照注射。

将化合物48/80在盐水中配制成1.5mg/ml贮备液。结果发现该化合物在水溶液中可能不稳定，因此每天都制备新的贮备液。在临注射给每只大鼠前，在盐水中进行系列稀释以达到实验水平。

将肽在DMSO中制成23mM贮备液，并且在实验之间于-20℃贮存。在使用时，将冷冻的贮备液融化，并将适当的等分试样与适当量的DMSO一起加到化合物48/80的稀释液中，以产生5μl DMSO对0.1ml化合物48/80水溶液的比例。这获得了维持一些肽的溶解性所必需的5％DMSO溶液。结果是零的对照实验证实了5％DMSO的影响。

为了注射，将0.1ml化合物40/80、+/-测试化合物真皮内注射到麻醉、染色和剃毛的大鼠中。培育15分钟后，通过颈椎脱臼法处死大鼠，撕下背部皮肤并置于有光的箱中。用CCD视频截留照相机和兼容硬件/软件对库存的皮肤图象进行数字化处理。使用科学图形分析软件包分析进行过数字化处理的图象，将毛细血管渗透(染上蓝色)区域整合，获得了用于进一步分析的数字值。

用约0.01μg-约15μg不同剂量的化合物48/80产生剂量反应曲线。所得结果如附图1所示。我们注意到，对于给定剂量的化合物48/80，由于大鼠-大鼠之间的差异(例如皮肤厚度)，毛细血管渗透区域直径有很大差异。选择0.15μg化合物48/80进行进一步测试。

实施例1

使用所选0.15μg剂量的化合物48/80制作标准化合物f-Met-Leu-Phe的剂量反应曲线。测试剂量为0-约230 nM的f-Met-Leu-Phe，并且结果如附图2所示。结果清楚地表明由化合物48/80诱导的脱粒作用被抑制了。

实施例2-11

在大鼠皮肤模型中，使用100毫微摩尔测试肽和0.15μg化合物48/80测定几种f-Met-Leu肽抑制所诱导的脱粒的效力。对于每一实验，每只大鼠都包括内在的零-肽-剂量48/80对照，并且％抑制以相对于该对照(0％抑制)的百分数表示。还确定48/80产生的肥大细胞脱粒百分比。结果列在下表中。

表1实施例肽％抑制％脱粒*2 f-Met-Leu-Phe(现有技术) 30 603 N-乙酰基-Met-Leu-Phe 0 984 N-t-BOC-Met-Leu-Phe 0 -5 f-Met-Leu-(碘)Phe 0 -6 f-Met-Leu-Phe(苄基酰胺) 0 -7 f-Met-Leu-Phe-Lys 0 -8 f-Met-Leu-Phe(甲酯) 0 -9 f-Met-Leu-Phe-Phe 100 1-310 f-Met-Leu-Tyr 55 3011 f-Met-Leu-Tyr-Tyr 0 -实施例12

使用所选0.15μg剂量的化合物48/80制作f-Met-Leu-Phe-Phe的剂量反应曲线。测试剂量为0-约230 nM的f-Met-Leu-Phe-Phe，并且结果如附图3所示。结果清楚地表明，由化合物48/80诱导的脱粒作用被令人惊奇地显著地抑制了。出乎意料的是，f-Met-Leu-Phe-Phe对所诱导的脱粒的抑制作用比标准化合物f-Met-Leu-Phe要好。用于测定抑制肥大细胞脱粒的OVA诱导的支气管哮喘小鼠模型

哮喘是一种复杂疾病，其特征是自发加重导气管堵塞和持续的支气管高反应性。在导气管粘膜下层具有激活的T-淋巴细胞、嗜酸性细胞和巨噬细胞/单核细胞的慢性炎症是另一已确立的特征。炎性机制、表达细胞因子、以及释放炎性介质是支气管收缩和支气管高反应性的发病基础。然而，有很多致病机制仍是不清楚的，例如引起持续症状和慢性炎症的机制，以及控制和预防该疾病的干预手段。

很久以前人们就已认识到，在一些个体和动物模型中，单次吸入变应原攻击物可招致导气管反应性急剧增加。然而，人们已证实，反复地吸入变应原会导致更显著、持续、且长时间的导气管反应性增加。该长期反复吸入变应原的小鼠模型已被用来试验肺中变应性疾病的长期影响，和研究人体中涉及诱导肺导气管高反应性的细胞、机制、分子和介质。材料和方法

试剂：OVA晶体得自Pierce Chem.Co.(Rockford，IL)，硫酸铝钾(明矾)得自Sigma Chem.Co.(St.Louis，M0)，不含热原的蒸馏水得自Baxter，Healthcare Corporation(Deerfield，IL)，0.9％氯化钠(生理盐水)得自Lymphomed(Deerfield，IL)，Trappsol^TM HPB-L100(含水羟丙基β环糊精；45 wt/vol％水溶液)得自 Cyclodextrin Technologies Development，Inc.(Gainesville，FLA)。将OVA(500μg/ml在生理盐水中的溶液)与等体积的10％(wt/vol)明矾的蒸馏水溶液混合。将该混合物(用10NNaOH调节至pH6.5)在室温培育60分钟后，以750g离心5分钟；将离心团重悬在最初体积的蒸馏水中，并在1小时内使用。

选择性5-脂氧合酶抑制剂Zileuton(N-[1-苯并[b]噻吩-2基乙基]-N-羟基脲；J.Pharmacol Exp Ther.1991；256：929-937)是由Drs.Bell and George W.Carter(Abbott Laboratories，Abbott Part，IL)友情提供的。将Zileuton溶于TrappsolTM中。Histatek，Inc.(Seattle，WA)提供了肥大细胞脱粒抑制剂f-Met-Leu-Phe-Phe(″HK-X″)。

在常规实验条件下饲养雌性BALB/c Once(购买时6-8周大小；Dand K，Seattle WA)。

变应原免疫接种/激发方案：在不同Standard(附图5A)和Resolution(附图5B)(J.Exp Med.1996；184：1483-1494)中，给小鼠腹膜内注射含有明矾的0.2ml(100μg)OVA。依据不同方案，通过腹膜内注射0.2ml在生理盐水中的氯胺酮(0.44mg/ml)/赛拉嗪(6.3mg/ml)将小鼠麻醉，然后在不同天单独鼻内(i.n.)接受在0.05ml生理盐水中的100μg OVA和在0.05ml生理盐水中的50μg OVA(i.n.)。使用两个对照组。相应地，第一个对照组接受含有明矾的生理盐水(i.p.)和不含有明矾的生理盐水(i.n.)；第二个对照组接受含有明矾的OVA(i.p.)，不含明矾的OVA(i.n.)，和仅生理盐水。组织学

获得气管和左肺(使用右肺进行支气管肺泡灌洗(″BAL″))，并在10％中性甲醛溶液中于室温固定6-15小时。包埋在石蜡中后，将组织切成5-μm切片，并进行不同染色或进一步免疫标记。采用Discombe’s嗜酸性细胞染色，用亚甲蓝作对比染色来计数细胞数目。通过形态测定法(J.Pathol.1992；166：395-404；Am RevRespir Dis.1993；147：448-456)确定每单位导气管面积(2200μm²)上的嗜酸性细胞数目。用马森氏三色染剂鉴定纤维变性。通过下述染色法鉴定导气管粘液：亚甲基、苏木紫和曙红、粘蛋白卡红、阿尔新蓝8GX、和阿尔新蓝8GX/高碘酸-Schiff(PAS)反应(Troyer，H.，组织化学原理和技术中的碳水化合物(″Carbohydrates″inPrinciples and Techniques of Histochemistry)，Little，Brown and Company，Boston，MA，1980：89-121；Sheehan，D.C.，等人，组织化学理论与实践中的碳水化合物(″Carbohydrates″in Theory and Practice of Histotechnology)，Battle Press，Columbus，0H，1980：159-179)。用粘蛋白卡红溶液将粘蛋白染色；使用酸性间胺黄作对比染色。用阿尔新蓝8GX(pH 2.5)将酸性粘蛋白和硫酸化的粘液物质染色；使用核坚牢红作对比染色。通过阿尔新蓝8GX(pH 2.5)和PAS反应鉴定中性和酸性粘液物质。还通过形态测定法估测导气管(直径0.5-0.8mm)的粘液堵塞程度。采用如附图概述中所述的0-4+的半定量等级将导气管直径堵塞百分比分级。由不清楚该方案设计的个人进行组织学和形态学分析。肺功能测试

在第28天，最后一次i.n.施用生理盐水或OVA后24小时，通过体积描记法在小鼠体内测定静脉内输注醋甲胆碱后的肺结构，所用体积描记法是现有技术方法的改进(10，1958；192：364-368；J.Appl.Physiol.1988；64：2318-2323；J.Exp.Med.1996；184：1483-1494)。在肺功能测试完成时，通过心脏穿刺将每只小鼠放血，获得具有气管的肺组织以进行进一步分析。支气管肺泡灌洗

将左肺在主干支气管处结扎后，用0.4ml生理盐水将右肺灌洗3次。使用血细胞计数器计数在0.05-ml等分试样的汇集样本中的支气管肺泡灌洗(BAL)液细胞，将剩余灌洗液在4℃以200g离心10分钟。将上清液贮存在-70℃直至进行类二十烷酸分析。将细胞离心团重悬在含有10％牛血清白蛋白(″BSA″)的生理盐水中，然后在载玻片上制作BAL细胞涂片。为了将嗜酸性细胞染色，用Discombe’s稀释液(0.05％曙红水溶液和5％丙酮(vol/ol)的蒸馏水溶液；J.Exp.Med.1970；131：1271-1287)将干燥的载玻片染色5-8分钟，用水洗涤0.5分钟，并用0.07％亚甲蓝对比染色2分钟。导气管粘液糖蛋白测定

通过狭线印迹法和PAS染色法(Anal.Biochem.1989；182：160-164；Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.1995；12：296-306)测定BAL流体中的粘液糖蛋白。将硝酸纤维素膜(0.2-μm孔径；Schleicher & Schuell，Keene，NH)依次在蒸馏水、生理盐水中润湿，然后置于Minifold II 72-孔狭线印迹仪器(Schleicher &Schuell)中。通过吸水真空将BAL流体样本(0.05ml)和等分试样(0.05-0.751)的人呼吸粘蛋白糖蛋白(Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.1991；5：71-79)贮备液(2μm/ml)点在硝酸纤维素膜上，并通过PAS反应目测将粘液糖蛋白显形。进行反射比测光密度术以定量测定PAS染色。然后通过下文中描述的图象处理系统分析图象。通过与人呼吸粘蛋白的标准曲线进行比较来定量确定BAL样本PAS反应的整合强度。免疫细胞化学

单克隆抗体：使用CDllc(DAB法)和Macl(使用Hitomouse Kit，Zymed的Beringer Mannheim，ABC法)来鉴定在血管系统、导气管和纤维变性中/其周围的炎性细胞类型，例如树状细胞、巨噬细胞和淋巴细胞。形态测定法和图象分析

所有图象都是通过具有HP DeskScan II软件(Microsoft^Windows^TMVersion)的ScanJet IICX扫描器(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)截获和进行数字化处理。该系统连接在DellDimension XPS P90电脑(Dell Corporation，Austin，TX)上，该电脑使用的是Image-Pro^加1.1版本的Windows^TM软件(MediaCybernetics，Silver Spring，MD)。使用具有超高图形分辨率图形方式的Dell Ultrascan 17ES监视器(1.280×1024图像素，78.9-kHz水平扫描频率，74-Hz垂直扫描频率)在256灰度刻度上评价图象。白三烯抑制剂实验

为了评价5-脂氧合酶产物在导气管炎症中的作用，在依据附图5的日子，在每一i.n.激发前30分钟i.p.给予5-脂氧合酶抑制剂Zileuton(35mg/kg)。在一组动物中，还在i.p.给予OVA之前给予Zileuton。在给予BSA抗原(i.p.)来被动致敏的大鼠(J.Pharmacol.Exp.Ther.1991；256：929-937)中，35mg/kg的Zileuton将半胱氨酰白三烯的释放抑制了约95％。本发明化合物HK-X

使用与上述相同的操作，以5mg/kg和10mg/kg的剂量施用化合物HK-X。统计学分析

使用保护最小显著性差异法(Statview II，Abacus Concepts，Berkeley，CA)，通过方差分析(ANOVA)评价肺功能数据。该方法使用多重t统计以评价所有可能的成对比较，并适用于相等和不等的对大小。其它数据是作为联合实验的平均±SE报道的。对于各独立平均值，通过学生双尾t检验分析差异的显著性(P＜0.05)。1. 嗜酸性细胞(表2A-2B)

在OVA处理的1-月、2-月和3-月组小鼠中，导气管嗜酸性细胞的数目从44.83％分别显著地下降至37.40％和19.15％(P＜0.025)。虽然在OVA处理组中嗜酸性细胞数目比同时间的另外2组高很多(P＜0.025)，但是Zileuton一般可经过1-3个月降低嗜酸性细胞。然而，本发明HK-X化合物同样在一个月减少嗜酸性细胞，但是在2个和3个月更有效。表2A：导气管嗜酸性细胞流入(％) 盐水 OVA Zileuton HK P值3个月 1.00 19.15 10.73 - ＜0.0252个月 1.00 37.40 11.66 - ＜0.011个月 1.00 44.83 15.50 14.20 ＜0.001P值＞0.05 ＜0.025 ＜0.025 ＜0.025 -表2B：导气管组织中嗜酸性细胞的百分比治疗时间盐水 OVA Zileuton HK-X28天 1.0 44.8 15.8 14.22.其它炎性细胞

其它炎性细胞表明在导气管内引入外源性蛋白后发生非特异性炎性反应。淋巴细胞汇集到导气管内，但在对照组中事实上没有。在效用假-致敏和OVA致敏的小鼠中，OVA激发后嗜中性白细胞募集，但是在OVA致敏组的导气管中存在更大数量的嗜中性白细胞。偶而发现在其宽广的细胞质周围有新月形核的特异多核巨细胞(融合的巨噬细胞)。Langhans巨细胞和白细胞都仅在用OVA致敏和激发的动物中观察到。它们通常存在于和较大导气管相连的结缔组织中。在导气管附近和局部淋巴组织中偶尔发现了浆细胞。3.导气管堵塞(表3)

粘蛋白：在采用相同治疗但是不同时间的3组当中没有任何差异(P＞0.05)。OVA治疗组比用盐水、Zileuton(P＜0.05)和HK-X化合物治疗的组有更高的分数。表3：导气管中粘液堵塞分数治疗时间盐水 OVA Zileuton HK-X28天 0.7 2.8 1.3 1.4％导气管堵塞＞5％ 55％ 16％ 19％

哮喘是导气管的慢性炎性病症。在人体中，一旦发生，导气管高反应性就可以稳定地保持数年。其在缺乏变应原吸入、可检测的导气管炎症或上皮脱落的情况下明显地持续发生。因此，其可由于导气管超微结构的不可逆(或至少缓慢地可逆)变化而变得持久。

在轻度哮喘中，这些发作或“攻击”比较少见，并且能用吸入的支气管扩张剂良好治疗(逆转)。其潜在、明显且慢性导气管炎症的强度与不太能被支气管扩张剂逆转的更频繁、更强和更长时间的攻击有关或者似乎有联系。近几年来，其原因已经变得越来越清楚了。主要由激活或致敏渗入的Th2-淋巴细胞、嗜酸性细胞、肥大细胞、和可能的血小板构成的炎症引起血管周围(间隙)空间扩张，并释放介质/生长因子，这些介质/生长因子引起基膜增厚、上皮损伤和脱落、产生粘性粘液、和导气管平滑肌增生、致敏以及部分狭窄。所有这些结果都支持导气管反应性增加，这降低了对环境刺激反应的阈值，因此使得发作更频繁和更严重。

所有上述形态学变化都直接且强有力地影响肺功能。在用急性哮喘小鼠模型和长期哮喘小鼠模型进行的实验中，观察到了支持上述形态学变化的严重的肺功能病理生理改变。发现变应原吸入能增加导气管和肺泡内皮以及上皮上的嗜酸性细胞和肥大细胞表达，以及诱导仅在导气管内皮上的E-选择表达，和嗜酸性细胞渗入与导气管反应增强，以及在哮喘肺中引起非特异性炎性反应的其它类型炎性细胞(Langhans型白细胞和多核巨细胞(融合的巨噬细胞))。

化合物HK-X抑制OVA处理(OVA)和对照小鼠导气管中的粘液积聚。从假致敏和盐水激发小鼠(盐水，n＝4)，和OVA致敏/激发小鼠(分为同时未进行HK-X治疗(OVA，n＝4)或进行HK-X治疗(HK-X/OVA，n＝8)组)确定导气管粘液堵塞的分布。通过如下所述的形态测定法测定导气管直径粘液堵塞的分布：0，没有粘液；+，约10％堵塞；++，30％堵塞；+++，约60％堵塞；++++，约80％堵塞。通过形态测定法评价随机分布在每只小鼠整个肺中的10个导气管的粘液堵塞。

附图6A-6D提供了在用OVA诱导的哮喘大鼠中，化合物HK-X抑制肥大细胞脱粒的视觉组织学证据，以及由此用化合物HK-X治疗哮喘的效果。附图6A表示的是，在OVA致敏/激发的小鼠导气管(AW)腔中有大量分泌的粘液。附图6B表示的是，有大量嗜酸性细胞和其它炎性细胞(由箭头表示)渗入间隙组织。附图6C表示的是，当在i.n.给予OVA之前给予化合物HK-X时，在导气管(AW)腔中释放的导气管粘液显著减少。与仅用OVA激发相比，用化合物HK-X治疗后渗入到间隙组织中的嗜酸性细胞也减少了(比较附图6C与附图6A和6B)。附图6D表示的是，在盐水处理的对照小鼠中，导气管(AW)中没有粘液和细胞。支气管上皮中渗入了结缔组织细胞，但是在支气管周围间隙空间中不存在任何白细胞。

导气管巨噬细胞显示了总激活的表征，该表征与所报道的在从变应原激发的哮喘患者肺的BAL流体中收集的巨噬细胞的表征类似(Am.Rev.Respir.Dis.1987；135：433-440)。巨噬细胞和树状细胞在肺中起抗原呈递细胞的作用，并且可直接或间接导致分泌能引起导气管上皮及其周围位点发生表型变化的细胞因子。刺激导气管慢性炎症可直接引起导气管上皮和成纤维细胞增殖，和随后导致的胶原沉积在这些区域周围。在后期激发期间，与其它炎性细胞相比，在该区域保持着高水平的激活的巨噬细胞和树状细胞。

主要是由于明显的杯状细胞增生所致的导气管上皮变厚特别发生在较大导气管中，但是在小支气管甚至末端支气管中也有发生。与对照组相比，杯形细胞与正常、柱状、有纤毛细胞的比例显著增加。而对照导气管(小和大导气管)仅具有偶尔出现的杯形细胞，得自OVA激发肺的切片表明，100％大导气管和部分小导气管含有占导气管上皮细胞总数高达88％的杯形细胞。在未灌洗的肺中，可在杯形细胞内发现粘液，并且在一些导气管中，偶尔可见完全堵塞的腔。细胞碎屑陷入到这些粘液堵塞物中。在对照组中没有看见杯形细胞增殖，因此杯形细胞增殖不可能是由于OVA的“非变应性”作用，或者气管内给药技术所致。在小导气管中的一些杯形细胞没有该特征，这意味着OVA在呼吸树内的分布是不均匀的。

附图7是直方图，它表明的是在该鼠哮喘模型中，用化合物HK-X以5μg/kg和10μg/kg的剂量进行的治疗在粘液堵块形成方面的结果。这两个剂量都显著地减少了小导气管中的粘液生成。

哮喘的特征是导气管嗜酸性细胞增多、水肿、粘液分泌过多、支气管上皮损伤和高反应性的复杂炎性反应。在变应性哮喘中吸入变应原激发引起立即的导气管高反应性反应—一种早期导气管反应(EAR)，在该早期反应几小时后经常发生延迟分导气管反应—后期导气管反应(LAR)。从LAR恢复后，对刺激剂例如醋甲胆碱的获得性导气管高反应性(AHR)增加了，并且可以持续几天。变应原激发后的EAR发生可能是对人肺肥大细胞释放的支气管收缩剂分子作用的继发反应，并且是IgE-介导的脱粒的后果。

IgE介导的肥大细胞脱粒是诸如变应性鼻炎、哮喘和过敏症这样的变应性病症的发病机理中的主要事件。在特异反应性个体中，皮内注射特异变应原可立即导致特征是在皮肤测试位点释放组胺和形成脂质介质的旋转和潮红反应。早期皮肤反应6-12小时后发生后期皮肤反应。该后期变应性皮肤反应的特征是由血管周围水肿和嗜酸性细胞和其它炎性细胞(例如嗜中性白细胞、单核细胞和嗜碱细胞)的细胞渗入构成的炎性反应。用特异性变应原局部激发后，在特异反应性个体的上和下导气管中发生类似双相IgE依赖性反应，例如早期和后期鼻炎和哮喘反应。肥大细胞位于紧靠血管的肺泡表面处。肥大细胞可通过影响紧张性或通过促进炎性反应而影响肺血管系统。由免疫或非免疫刺激激活的肥大细胞发生脱粒，并释放多种可介导肺炎症的预先形成的或新生成的介质例如组胺、中性蛋白酶、过氧化物酶、O₂、PAF和类二十烷酸(例如LTB4、LTC4、PGD2、TXA2)和细胞因子(例如IL-4、IL-5、TNFa)。

上述鼠模型复制了人哮喘的关键特征。使用卵白蛋白(OVA)作为变应原在正常BALB/c小鼠中诱导后期变应原特异性肺病。其中一个方案包括，在第1和14天用OVA(i.p.)进行免疫刺激，在第14、25、26和27天鼻内(i.n.)施用OVA。在第28天，OVA处理的小鼠表现出与变应原诱导的哮喘惊人相似的疾病，包括(1)总的和OVA特异性IgE循环水平增加，(2)在BAL流体中释放的LTB4和LTC4增加，(3)非常明显的嗜酸性细胞汇集到BAL流体和肺实质内，(4)小导气管的粘液堵塞，(5)在支气管淋巴结组织中T-辅助细胞2型(Th2)细胞因子(IL-4、IL-5、和IL-13)的表达增加以及Th1细胞因子(IL-2和IFN-y)的表达下降，(6)肺高反应性，这是通过与对照小鼠相比，使用递增剂量的醋甲胆碱时导气管导气能力和动力学顺应性下降的速度要快得多来评定的。

小鼠还易于发展成IgE介导的变应性导气管反应。在该鼠模型中复制了嗜酸性细胞的后期渗入，其中在该模型中，通过吸入卵白蛋白、然后腹膜内施用卵白蛋白致敏来形成变应性导气管疾病。对醋甲胆碱或乙酰胆碱激发的导气管反应性增加还发生在将导气管暴露于抗原后的被免疫小鼠中。

在变应原诱导的导气管炎症小鼠模型中，测定肥大细胞在导气管嗜酸性细胞渗入、肌肉松弛、和对醋甲胆碱的高反应性中的作用。结果发现小肽HK-X能通过阻止肥大细胞脱粒和导气管嗜酸性细胞渗入的机制阻止粘液释放。

使用如上所述的材料。在第0和14天，给小鼠腹膜内注射0.2ml(100ug)与硫酸铝钾(明矾)络合的OVA。在第14、25、26、和27天，通过腹膜内注射0.2ml在生理盐水中的氯胺酮(0.44mg/ml)/赛拉嗪(6.3mg/m1)将小鼠麻醉，在第25、26、和27天，在麻醉之后鼻内(i.n.)给予100ug在0.05ml生理盐水中的OVA。在第28天，最后一次i.n.激发24小时后获得肺组织。对照组在第0和14天i.p.接受含有明矾的生理盐水，在第14、25、26、和27天i.n.接受不含的明矾的生理盐水。为了测定HK-X抑制OVA诱导的哮喘的作用，在第25、26和27天，每次i.n.激发前30分钟i.n.施用HK-X(10ug/ml)。

将左肺在主干支气管处结扎后，用0.4ml生理盐水将右肺灌洗3次。使用血细胞计数器计数在0.05-ml等分试样的汇集样本中的支气管肺泡灌洗(BAL)液细胞，将剩余灌洗液在4℃以200g离心10分钟。将细胞离心团重悬在含有10％BSA的生理盐水中，然后在载玻片上制作BAL细胞涂片。为了将嗜酸性细胞染色，用Discombe’s稀释液(0.05％曙红水溶液和5％丙酮(v/v)的蒸馏水溶液)将干燥的载玻片染色5-8分钟，用水洗涤0.5分钟，并用0.07％亚甲蓝对比染色2分钟。

BAL后，获得气管和左肺(上叶和下叶)，并在10％缓冲的甲醛溶液中于20℃固定15小时。将组织加工并包埋在石蜡中后，将组织切成5μm切片，如上所述用Discombe’s溶液染色，和用亚甲蓝作对比染色，或者用苏木紫和曙红染色。通过如上所述的形态测定法确定每单位导气管面积(2200μm²)上的嗜酸性细胞数目。通过多种染色法，即亚甲基、苏木紫和曙红、粘蛋白卡红、阿尔新蓝8GX、和阿尔新蓝8GX/高碘酸-Schiff(PAS)反应鉴定导气管粘液。用粘蛋白卡红溶液将粘蛋白染色；使用酸性间胺黄作对比染色。用甲苯胺蓝(pH4.5)将粘蛋白和富含唾液酸的硫酸化粘液物质进行异染性染色。用阿尔新蓝8GX(pH2.5)将酸性粘蛋白和硫酸化的粘液物质染色；使用核坚牢红作对比染色。通过阿尔新蓝8GX(pH2.5)和PAS反应鉴定中性和酸性粘液物质。还通过形态测定法估测导气管(直径0.5-0.8mm)的粘液堵塞程度。采用0至+++++的半定量等级将导气管直径堵塞百分比分级。由不清楚该方案设计的个人进行组织学和形态学分析。

通过狭线印迹法和PAS染色法测定BAL流体中的粘液糖蛋白。将硝酸纤维素膜(0.2μm孔径；Schleicher & Schuell，Keene，NH)依次在蒸馏水、生理盐水中润湿，然后置于Minifold II 72-孔狭线印迹仪器(Schleicher & Schuell)中。通过吸水真空将BAL流体样本(0.05ml)和等分试样(0.05-0.75ml)的人呼吸粘蛋白糖蛋白贮备液(2μm/ml)点在硝酸纤维素膜上，并通过PAS反应目测粘液糖蛋白显形。进行反射比测光密度术以定量测定PAS染色。通过具有HPDeskScan II软件(Mi crosoft Windows^TMVers ion)的ScanJet IICX扫描器(Hewlett Packard，Palo Alto，CA)截获图象和进行数字化处理。该系统连接在Dell Dimension XPS P90电脑(DellCorporation，Austin，TX)上，该电脑使用的是Image-Pro加1.1版本的Windows TM软件(Media Cybernetics，Silver Spring，MD)。使用具有超高图形分辨率图形方式的Dell Ultrascan 17ES监视器(1.280×1024图像素，78.9-kHz水平扫描频率，74-Hz垂直扫描频率)在256灰度刻度上评价图象。通过与人呼吸粘蛋白的标准曲线进行比较来定量确定BAL样本PAS反应的整合强度。

用OVA进行的i.p.免疫使得在BALB/C小鼠中产生可检测水平的OVA-特异性IgE。使用间接ELISA测定OVA-特异性IgE血清抗体效价。用在0.1 M NaHCO₃缓冲液(pH8.3)中稀释的OVA(20mg/ml)包被ELISA板(ICN，Costa Mesa，CA)，并在室温培育18小时。洗涤3次后，将ELISA板与1％BSA在PBS中的溶液pH 7.4在37℃培育2小时。将血清样本在1％BSA/PBS缓冲液中的系列稀释液加到ELISA板中，并在4℃培养18小时，然后再次洗涤。将各个孔与在50％山羊血清(Gibco-BRL，Gaithersburg，MD)/PBS缓冲液中稀释的、缀合有大鼠抗-小鼠IgE单克隆抗体(Pharmingen，San Diego，CA)的HRP(辣根过氧化物酶)在室温培养2小时。使用3，3’，5，5’-四甲基联苯胺底物将各孔显影，在610nm测定吸收度。在各测定中使用的内标由得自OVA免疫BALB/c小鼠的混合血清组成。

使用保护最小显著性差异法(Statview II，Abacus Concepts，Berkeley，CA)，通过方差分析(ANOVA)评价肺功能数据。该方法使用多重t统计以评价所有可能的成对比较，并适用于相等和不等的对大小。其它数据是作为联合实验的平均+SE报道的。对于各独立平均值，通过学生双尾t检验分析差异的显著性(P＜0.05)。结果

变应原特异性IgE生成。在第28天，在下述小鼠的血液中检测到了OVA-特异性IgE(12.9+0.3 U/ml，n＝5)：在第0天和第14天i.p.施用OVA和明矾的小鼠，在第25、26、和27天i.n.施用OVA的小鼠。相反，在用i.p.给予盐水和明矾以及i.n.给予盐水(n＝6)处理的对照小鼠中没有任何可检测到的抗-OVA IgE。

变应原诱导的导气管炎症。为了在组织学上测定变应原诱导的导气管炎症，在第28天，在最后3次于第25、26和27天依次进行的i.n.OVA激发24小时后获取肺组织和BAL流体。通过光学显微镜观察到明显的嗜酸性细胞渗入到支气管小间隙内(附图8C)。还注意到了嗜酸性细胞渗入到支气管上皮粘液层(附图9D)和BAL流体中。

在OVA致敏/激发小鼠中，61.0+5.0％(n＝10)的BAL流体细胞是嗜酸性细胞，而在盐水激发对照动物(p＝0.0001)中该比例是0.8+0.3％(n＝10)相比。

在用OVA进行支气管激发的免疫小鼠中发生了导气管的粘液堵塞(附图10)。通过下述独立的组织化学染色法鉴定在下(附图9B)和上(附图9C、9D)肺导气管中的导气管粘液释放：通过粘蛋白卡红将粘蛋白染色，通过甲苯胺蓝将酸性未硫酸化粘液物质染色，通过阿尔新蓝8GX将酸性硫酸化粘液物质染色(附图10)，通过阿尔新蓝8GX/PAS反应给中性和酸性粘液物质染色。导气管腔堵塞在下导气管中比较严重。在已经用盐水(附图8B)或含有明矾的OVA(未显示)i.p.处理的这些盐水激发对照动物中，没有观察到这些炎症变化。

HK-X抑制阻断导气管中的嗜酸性细胞渗入和粘液积聚。在OVA致敏/激发小鼠中，通过HK-X的炎性抑制显著减少了嗜酸性细胞向肺组织和BAL流体中的渗入，并且还阻止了这些动物中的导气管粘液释放(附图8A、9A、10A)。

嗜酸性细胞渗入。如形态测定分析所示，通过HK-X治疗，渗入到肺小间隙中的嗜酸性细胞减少了90％(p＜0.006，与不使用HK-X的OVA相比)(附图11)。SLO Zileuton使BAL流体中嗜酸性细胞的数量减少了82％(p＜0.004，与OVA Zileuton相比(FIG.11))。经测定，在得自用HK-X处理的OVA致敏/激发小鼠的BAL流体中，嗜酸性细胞数目为0.57+0.11×10⁵，对于OVA免疫/盐水激发小鼠(对照小鼠)，该值为0.16+0.03×10⁵。类似地，Zileuton将OVA致敏/激发小鼠的BAL流体中汇集的嗜酸性细胞减少了89％(p＝0.0128，与不使用zileuton的OVA相比；数据未显示)。载体对照(用于Zileuton实验的Trappsol^TM)不影响在OVA致敏/激发小鼠中观察到的肺嗜酸性细胞渗入。

粘液积聚。通过光学显微镜测定OVA处理小鼠和对照小鼠左肺的上叶和下叶交叉部分的导气管粘液积聚。通过形态测定分析，对于用盐水处理的对照小鼠，68％导气管没有表现出任何导气管粘液释放，余下部分仅观察到了小的粘液层。相反，对于OVA免疫/激发小鼠，形态学证据表明了广布的导气管粘液堵塞块。OVA处理小鼠的大部分(74％)导气管具有至少30％的导气管腔粘液堵塞；这些小鼠22％导气管具有80％或更大的粘液堵塞。当定量测定在BAL流体中汇集的粘液糖蛋白的量时(附图12)，结果发现，与对照小鼠相比，OVA处理小鼠中的导气管粘液增加了7倍(p＝0.00001，OVA对盐水)。在OVA处理小鼠中，HK-X治疗阻断了粘液释放(附图8A、9A、10A)。

附图8A-8C表示的是肺组织病理组织学，并且表明了在各组动物(n＝8)中小肽(HK-X)治疗OVA诱导的小鼠哮喘的有效性。附图8A是HK-X治疗小鼠肺的照片，该照片表明了导气管(AW)和血管(BV)特征的正常特性。有非常少的细胞位于导气管组织(箭头)的外周(H & E染色，X12)。附图8B是仅注射用作正常对照的盐水的小鼠的照片。其导气管和血管具有正常外观。在导气管组织(箭头)中发现了一些细胞(H & E染色，X120)。附图8C是OVA免疫动物的照片，其通过特征性嗜酸性细胞和T细胞、单核细胞、和巨噬细胞渗入到导气管组织(箭头)中表示了深厚影响。导气管被粘液和细胞(箭)堵塞(H & E染色，X120)。

附图9A-9D表示的是，在小鼠中诱导出哮喘后，用小肽(HKX)治疗的肺组织的病理组织学。该组数据是从另一组小鼠获得的。图解说明了在小鼠模型中化合物HK-X治疗哮喘的有效性的病理组织学证据。化合物HK-X阻止在总共3天内由于进行OVA激发所致的导气管粘液分泌。HK-X还降低哮喘发作期间的细胞渗入。在第1和14天对小鼠静脉内和鼻内给予OVA。在第25、26、和27天，用OVA激发小鼠，或者在激发前30分钟对小鼠鼻内施用10μg HK-X。

附图9A是中等大小导气管(AW)的显微照片，并代表典型的用HK-X处理的小鼠的肺。HK-X处理的肺表现出非常小的如在OVA处理动物中所发现的病理学状态。导气管非常干净，在腔或者上皮细胞表面中观察到了非常小的粘液或没有观察到任何粘液。在导气管实质中发现了非常少量的细胞渗入。平滑肌细胞层的厚度很均匀(H&E染色，X150)。附图9B是用OVA免疫和激发的小鼠肺的照片，其显示了人哮喘的典型特征：部分堵塞的导气管(AW)腔(箭头)，细胞渗入到导气管和血管的小间隙中(主要特征)，和发现与血管有关的周围水肿(箭头)(H&E染色，X75)。附图9C是哮喘小鼠肺导气管的较高放大倍数照片，其显示了堵塞的腔。大量白血球细胞位于导气管上皮细胞层的基底区域(箭头)。在实质中发现了许多嗜酸性细胞，并且平滑肌细胞层的厚度不均匀(H&E染色，X150)。附图9D是哮喘小鼠肺的部分纵向切开的导气管的照片，其显示了由于释放粘液所致的导气管腔的广泛堵塞(箭头)。细胞渗入处非常靠近上皮细胞层区域(箭头)。平滑肌细胞层被渗入的白细胞转移，并且经常形成小的肉芽肿(H & E染色，X150)。

附图10A-10D表示的是得自另一组小鼠(n＝9)的病理组织学数据。通过另外的病理组织学和组织化学证据可看出，化合物HK-X阻止了由OVA免疫和激发诱导的粘液细胞，并减少了导气管中的粘液分泌。在哮喘发作期间，粘液分泌增加和导气管收缩增强。导气管中形成了粘液细胞使得粘液生成很明显。使用阿尔新蓝8GX将硫酸化葡萄糖胺葡聚糖染色以表示出粘液物质。附图10A是用HK-X处理的哮喘小鼠肺的照片，其显示导气管(AW)腔是空的，并且在腔中不存在任何细胞外物质。也存在相邻血管(BV)。正常外观显示没有任何细胞渗入或水肿液体(H & E染色，X150)。附图10B是附图10A中显示的相同导气管的顺序切片，该切片是用阿尔新蓝8GX在pH 2.4染色以显示上皮细胞中粘液物质的位置。在腔中仅看见了少量阳性细胞(箭头)。蓝色阳性物质的散在薄层很明显(阿尔新蓝8GX和中性红染色，X150)。附图10C是OVA免疫和激发小鼠肺的照片，其显示了收缩的导气管和腔中粘液分泌(箭头)。在该肺组织中观察到了大量白细胞。它们当中有许多是嗜酸性细胞(H & E染色，X150)。附图10D是附图10C的类似部分，其是用阿尔新蓝8GX染色以显示出收缩导气管中的粘液物质。观察到了紧紧连接在上皮表面上的厚粘液层(箭头)。在此发现了更多的蓝色阳性细胞，这意味着在导气管腔中出现了更高比例的粘液细胞。在该切片中还看见了填充有粘液的小的长形导气管(阿尔新蓝8GX&中性红染色，X150)。

附图11表示的是在从OVA诱导的哮喘小鼠采集的肺泡中炎性细胞的分布。附图12表示的是在OVA诱导的哮喘小鼠的导气管中导气管堵塞得分。附图13表示的是，在OVA诱导的哮喘小鼠的导气管中的白细胞迁移。附图14表示的是，从OVA诱导的哮喘小鼠的肺灌洗所回收的细胞总数。诱导的II型胶原关节炎小鼠模型

使用小鼠模型来评价本发明化合物对诱导的II型胶原关节炎的组织学、放射照相以及临床表象的影响。

自身免疫性疾病引起引起严重和长期的发病和残疾。呈现多种形式的关节炎是自身免疫性疾病家族中的一种代表性疾病。在临床领域，类风湿性关节炎(RA)是这种严重关节发育不良疾病的最常见形式。所有临床医师都同意RA是进行性疾病。

在鼠CIA中发生的关节炎性损害的病理组织学与人类患者中RA的病理组织学有大量相似之处。因此，鼠CIA是为人们所接受的研究RA可能临床治疗的模型。材料和方法

小鼠：该试验使用重25克的DBA/1(2)雄性小鼠(JacksonLaboratories，Bar Harbor，ME or B & K Universal，KentWA)。这种小鼠易于通过注射异源II型胶原而患有CIA。牛胶原(BC)、完全弗氏佐剂(CFA)和不完全弗氏佐剂(ICFA)可得自SigmaChemical。用于免疫接种的抗原在0.1M乙酸中加工，并用CFA或ICFA配制。诱导关节炎

免疫接种方案：在该试验期间，在预定时间间隔给小鼠注射在CFA中的100μgII型胶原。

在预定时间间隔检查小鼠的关节炎形成情况。关节炎的推定证据包括在两次连续观察中看见前和/或后足上至少一个趾关节肿胀或出现红斑。关节炎的证实性诊断

关节的组织学检查：将在适当时间间隔处死的动物的趾关节取出，固定，脱钙，包埋在石蜡中，切片，并染色以观察一般的细胞和结构特征，并视情况而定检查每一关节血管翳的软骨基质。通过使用如上所述的组织学显微照相数字化技术和采用标准区域和点计数技术来定量测定细胞构成程度以及炎症面积。

进行趾关节的放射照相评价以测定用II型胶原免疫后关节变化的发生率。为了该试验，已经将乳房X线照相术成象系统作了改进。通过分析电脑数字化的放射照片来测定关节软组织(血管翳)的平均面积，并通过与每一放射照片的内标比较来测定相邻硬组织的密度变化。为了用作改变的硬组织密度和血管翳面积的基准对照，在相同期间使用另外的小鼠，并比较密度和面积数据。在每一时间点，使用成对T检验评价对照与试验小鼠的密度和面积的差异的显著性。关节炎评价

每天观察动物的关节炎发作。通过将每只爪子关节炎的严重程度划分为0-4的等级，来获得关节炎指数。打分是基于关节周围红斑和水肿以及关节变形来进行的。还通过用定张力卡尺测定踝关节从中间到外踝的厚度来定量确定后爪的肿胀。实验设计

为了测定化合物HK-X抗关节炎的效果，基于在人类患者方面最合适递送机制的经验，来选择给药途径。

HK-X和强的松龙的剂量：通过透皮(TC)(吸收)途径和通过注射到足中，将代表分散和公认的肽治疗水平的剂量给到局部位点。直接注射到关节内腔由于创伤太严重而不能产生人工效果。因此，将药物注射到与关节内腔相邻的足垫(FP)内是所选方法。还给对照小鼠注射强的松龙(在实验和临床自身免疫性疾病治疗中得到证明的强效抗炎药物)以用作阳性对照。

首先，每天给由10只(加对照)小鼠组成的实验组中的每只小鼠注射胶原，注射50天。在第3和18天，给小鼠注射在0.1M乙酸溶液中的浓度为1mg/ml的5或10μg/kg化合物HK-X，将小鼠放血以进行组织学测定。

然后，依据下述特定方案治疗分别由10只小鼠组成的8组(A-I)小鼠。

用1°CFA+BC、2°ICFA+BC将A组免疫，不给予任何治疗(对照)。

用1°CFA+BC、2°ICFA+BC将B组免疫，在2°ICFA+BC的下一天开始施用5mg/kg的强的松龙，并继续20天。

用1°CFA+BC、2°ICFA+BC将C组免疫，在2°ICFA+BC的下一天开始TC施用4mg/kg(高剂量)的化合物HK-X，并继续20天。

用1°CFA+BC、2°ICFA+BC将D组免疫，在2°ICFA+BC的下一天开始TC施用0.4mg/kg(低剂量)的化合物HK-X，并继续20天。

用1°CFA+BC、2°ICFA+BC将E组免疫，在2°ICFA+BC的下一天开始TC施用4mg/kg(高剂量)的化合物HK-X，并继续20天。

用1°CFA+BC、2°ICFA+BC将F组免疫，在2°ICFA+BC的下一天开始TC施用0.4mg/kg(低剂量)的化合物HK-X，并继续20天。

用1°CFA、2°ICFA将G组免疫，在2°ICFA+BC的下一天开始TC施用10ml DMSO，并继续20天(对照)。

用1°CFA、2°ICFA将H组免疫，在2°ICFA+BC的下一天开始FP施用10ml DMSO，并继续20天(对照)。

用1°CFA、2°ICFA将I组免疫，在2°ICFA+BC的下一天开始FP施用10ml盐水，并继续20天(对照)。

2°免疫后(立即)和临处死前给各组动物照射X-射线。处死后，视情况而定取下足，并进行组织学检查。结果发现，用化合物HK-X治疗减轻了关节炎程度。

已经用优选实施方案详细地描述了本发明。然而，应当理解，通过考虑本发明说明书和附图，本领域技术人员在可如权利要求书所限定的本发明精神和范围内作更改和改进。

Claims

1. 治疗哺乳动物变态反应的方法，包括给该哺乳动物施用抗变态反应有效量的式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

2. 权利要求1的方法，其中所示变态反应选自变应性鼻炎、荨麻疹、药物过敏、和食物过敏。

3. 权利要求1的方法，其中与所述肽一起施用另一种活性组分，所述活性组分选自抗白三烯、β₂激动剂和皮质类固醇。

4. 治疗哺乳动物皮肤炎症的方法，所述方法包括给该哺乳动物施用抗炎有效量的式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

5. 权利要求3的方法，其中所述皮肤炎症选自皮炎、湿疹、牛皮癣、接触性皮炎、晒伤、和衰老。

6. 权利要求4的方法，其中与所述肽一起施用另一种活性组分，所述活性组分选自抗白三烯、β₂激动剂和皮质类固醇。

7. 治疗哺乳动物选自骨关节炎、牛皮癣性关节炎、狼疮、和椎关节炎的关节炎的方法，所述方法包括给该哺乳动物施用抗关节炎有效量的式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

8. 权利要求7的方法，其中与所述肽一起施用另一种活性组分，所述活性组分选自抗白三烯、β₂激动剂和皮质类固醇。

9. 治疗患者慢性堵塞性肺病的方法，所述方法包括给该患者施用治疗有效量的式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

10. 权利要求9的方法，其中与所述肽一起施用另一种活性组分，所述活性组分选自抗白三烯、β₂激动剂和皮质类固醇。

11. 治疗患者慢性炎性肠病的方法，所述方法包括给该患者施用治疗有效量的式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

12. 权利要求11的方法，其中与所述肽一起施用另一种活性组分，所述活性组分选自抗白三烯、β₂激动剂和皮质类固醇。

13. 抑制嗜酸性细胞渗透到患者导气管内的方法，该方法包括给所述患者施用导气管嗜酸性细胞渗透抑制有效量的式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

14. 抑制患者导气管中粘液释放的方法，该方法包括给所述患者施用导气管粘液释放抑制有效量的式f-Met-Leu-X所示肽，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

15. 阻断IgE激活淋巴细胞的方法，所述方法包括将所述淋巴细胞与IgE激活阻断有效量的式f-Met-Leu-X所示肽接触，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

16. 权利要求15的方法，其中所述淋巴细胞选自巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜中性白细胞、和TNF。

17. 稳定淋巴细胞的细胞膜，从而阻止其进一步参与增强对IgE抗原激发的炎性反应的方法，该方法包括将所述淋巴细胞与细胞稳定有效量的式f-Met-Leu-X所示肽接触，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

18. 权利要求17的方法，其中所述淋巴细胞选自巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜中性白细胞、和TNF。

19. 抑制T-细胞迁移的方法，该方法包括将所述T-细胞与T-细胞迁移抑制有效量的式f-Met-Leu-X所示肽接触，其中X选自Tyr、Tyr-Phe、Phe-Phe和Phe-Tyr。

20. 权利要求19的方法，其中所述T-细胞是CD4⁺细胞。