JP2003504304A - 小ペプチドならびに喘息および炎症の治療方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 アレルギー、皮膚炎症、関節炎、慢性閉塞性肺疾患の処置、および慢性炎症性腸疾患の処置のための方法について記載する。患者の気道への好酸球の侵入を阻止する方法、患者の気道への粘液の放出を阻止する方法、リンパ球のＩｇＥ活性化を遮断する方法、リンパ球の細胞膜を安定化し、それによりＩｇＥ抗原の対抗に対する炎症性応答がさらに増強されることを防御するする方法、Ｔセルの遊走を阻止する方法についても記載する。かかる方法は該患者に治療上有効量のｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（ここでＸはＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択される）の式で表されるペプチドを投与することを含む。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 （技術分野） 本発明は、肥満細胞性顆粒減少阻害活性を有する小ペプチドならびに炎症の治
療方法に関するものであり、詳細にはアレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アナフィラキ
シー、薬物感受性、食物感受性などのアレルギー、皮膚炎、湿疹、乾癬、接触皮
膚炎、日焼け、加齢などの皮膚炎症、骨関節炎、乾癬性関節炎、狼瘡、脊椎関節
炎などの関節炎の治療に有用なＮ−ホルミル−メチオニルペプチド類に関する。
これらのペプチド類はまた、慢性閉塞性肺疾患および慢性炎症性腸疾患の治療に
も有用である。さらに詳細にはこれらペプチドは、移植における免疫抑制および
癌治療など、コルチコステロイド類が使用されるあらゆる用途でコルチコステロ
イドに代えて使用することができる。

【０００２】 （背景技術） 喘息は複雑な障害である。遺伝的および環境的要素（アレルギー、ウィルス感
染、刺激物）が、喘息発症および炎症性増悪に関与している。喘息患者（成人お
よび小児）の半数以上がアレルギーを有しており、実際には、その疾患の発症お
よび増悪発生における主要因子はイエダニ糞に対するアレルギーである。幼児期
における呼吸合胞体ウイルス感染も喘息発症とかなり関連があり、呼吸系のウィ
ルス感染が急性発症を誘発する場合が多い。

【０００３】 ３０年前に気管支拡張β_２−作働薬（β_２受容体に対して選択的なアドレナリ
ン作働薬）が導入されることで、喘息治療に革命が起こった。その薬剤は、α−
およびβ−の両方のアドレナリン受容体を刺激するイソプロテレノールなどの非
選択的アドレナリン受容体作働薬より強力かつ長期作用性（４〜６時間）である
ことが明らかになった。β_２−作働薬は急速に症状を緩和し、運動や酷寒空気吸
入などの刺激によって引き起こされる急性気管支収縮に対して保護を与えるもの
でもある。使用頻度は喘息抑制の指標としても役立ち得る。最近米国で、極めて
長期作用性のβ_２−作働薬であるサルメテロール（１２時間以下の期間）が導入
された。サルメテロールは非常に強力であって、炎症徴候を鎮めることができる
ことから、抗炎症剤とともに使用しなければならない。

【０００４】 テオフィリンは、治療マージンが狭く（毒性を回避するには血中レベルのモニ
タリングが必要）、薬剤相互作用の傾向性（肝臓チトクロムＰ４５０薬剤代謝酵
素についての競合によって、同じ系によって代謝されるいくつかの重要な薬剤の
血漿レベルが変わる）のある気管支拡張薬である。

【０００５】 中等度の喘息は、抗炎症性コルチコステロイドまたは肥満細胞阻害剤（クロモ
リンナトリウムまたはネドクロミル（nedocromil））の１日１回吸入と破綻症状
またはアレルゲンもしくは運動誘発性喘息を緩和する上での必要に応じてのβ_２ −作働薬吸入（１日３〜４回）によって治療される。クロモリンナトリウムおよ
びネドクロミルは気管支痙攣および炎症を遮断するが、通常はアレルゲンや運動
に関連する喘息のみに有効であり、そこで若年性喘息のみに有効である。コルチ
コステロイド吸入によって、炎症、気道過敏反応および閉塞が改善され、急性増
悪の数が減少する。しかしながらそれは、効果が認められるまでに１ヶ月を要し
、顕著な改善が起こるには１年もかかる。最も高頻度で生じる副作用は嗄れ声お
よび口腔カンジダ症である。比較的重篤な副作用が報告されており、それには部
分的副腎抑制、成長阻害および骨形成低下などがあるが、これらは比較的高用量
を用いた場合のみである。ベクロメタゾン、トリアムシノロンおよびフルニソリ
ドが恐らく、ｍｇ単位で（mg-for-mg）同様の効力を有する。さらに新しい承認
薬であるブデソニドおよびフルチカゾン（fluticasone）はより強力であって、
報告によると全身性の副作用が相対的に少ない。

【０００６】 軽度の疾患を有する患者であっても、活性化Ｔ細胞、肥満細胞および好酸球に
よる粘膜および上皮の浸潤などの気道の炎症を示す。Ｔ細胞および肥満細胞は、
好酸球の成長および成熟ならびにＩｇＥ抗体の産生を促進するサイトカイン類を
放出し、それらが次に微小血管透過性を高め、上皮を破壊し、神経緩和および粘
液分泌腺を刺激する。結果的に、気道の過反応、気管支収縮および分泌過多が生
じて、喘鳴、咳および呼吸困難として発現する。

【０００７】 従来、喘息は経口および吸入での気管支拡張薬によって治療されてきた。その
薬剤は喘息の症状には役立つが、基礎となる炎症に対しては効果がない。喘息の
病因において炎症が重要であることが最近１０年間で認められるようになったこ
とで、コルチコステロイド類の使用が増加してきたが、多くの患者がなおも、喘
息を抑制できずに苦しんでいる。

【０００８】 科学者らは、喘息においてロイコトリエン類（Ａ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥのサブ
タイプがある）が非常に重要な役割を果たしていることを認めている。これらは
気道平滑筋痙攣、血管透過性向上、浮腫、粘液産生促進、粘膜破壊輸送低下およ
び白血球走化性を引き起こす。

【０００９】 関連するプロスタグランジン化合物同様、ロイコトリエン類は細胞膜において
アラキドン酸から合成される。肥満細胞、好酸球、大食球、単核球および好塩基
球中のアラキドン酸は、ホスホリパーゼＡ２の活性化によって、膜リン脂質から
形成される。それが形成されるとアラキドン酸は、シクロオキシゲナーゼ経路（
各種のプロスタグランジン類およびトロンボキサン類を産生）および５−リポキ
シゲナーゼ経路（ロイコトリエン類を産生）という２つの主要な経路を経由して
代謝を受ける。アラキドン酸代謝の概略を図４に示してある。プロスタグランジ
ン類、トロンボキサン類およびロイコトリエン類はエイコサノイドと総称される
。

【００１０】 抗ロイコトリエン類は、炎症カスケードの初期段階を妨害する可能性のある多
様な種類の抗喘息薬である。ロイコトリエン類は、プロスタグランジン類に関係
する炎症物質である。いずれも細胞膜でアラキドン酸から形成される。肥満細胞
、好酸球、大食球、単核球および好塩基球でアラキドン酸が形成されると、それ
は（１）シクロオキシゲナーゼ経路（プロスタグランジン類およびトロンボキサ
ン類を産生）および（２）５−リポキシゲナーゼ経路（細胞質でロイコトリエン
類を産生）という２つの主要な経路を経由して代謝される。ロイコトリエン類は
医学において、アナフィラキシーの遅反応性物質（「ＳＲＳ−Ａ」）として知ら
れている。ロイコトリエン類は、気管支炎症において重要な役割を果たす。それ
は、各種白血球（例：好中球、好酸球および単核球）の血管中への移動、付着お
よび凝集を誘発し、気管支および血管平滑筋収縮を引き起こす。結果的に肺にお
いて、浮腫、白血球走化性、粘液産生、粘膜破壊機能不全および気管支痙攣が起
こる。ある種のロイコトリエン類、例えばシステイニルロイコトリエン類（ＬＴ
Ｄ）は特に強力な気管支収縮薬であり、ヒスタミンと比較して活性が約１００〜
１０００倍である。システイニルロイコトリエン類などのロイコトリエン類は、
顆粒消失時に肥満細胞から放出される。

【００１１】 ロイコトリエン受容体を遮断するかまたは酵素５−リポキシゲナーゼを遮断す
ることでロイコトリエン合成を防止する多くの抗ロイコトリエン類が研究中であ
ったり、商業的に使用されている。ロイコトリエン阻害薬は作用において類似し
ていない。一部のものは５−リポキシゲナーゼを直接遮断し、一部のものは蛋白
活性化５−リポキシゲナーゼを阻害し、一部のものは蛋白上の結合部位からアラ
キドン酸を転位させる。対照的にロイコトリエン拮抗薬は、気道機能亢進、気管
支収縮および分泌過多に介在する受容体自体を遮断する。

【００１２】 ヒト肺肥満細胞は、in vitroでのＩｇＥ刺激によって腫瘍壊死因子（ＩＮＦ）
ＩＬ−４およびＩＬ−５を産生する（Chest 1997; 112: 523-29）。気管支内生
検試料における免疫組織化学的分析から、ＩＬ−６産生を伴うそれの産生が確認
されている。さらに肥満細胞数およびＴＮＦは、正常被験者と比較して喘息患者
においては統計的に有意に大きい。ＴＮＦおよびＩＬ−４は、気管支血管系の内
皮層における血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）（免疫グロブリンスーパー
ファミリーの接着分子）発現亢進を強化し得る。好酸球、好塩基球および単核球
は、細胞表面上で超後期活性化抗原４（ＶＬＡ−４）インテグリンを示し、それ
はＶＣＡＭ−１と相互作用する。従って、相互作用ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１を
介して、ＴＮＦおよびＩＬ−４は循環白血球の補充を促進する。ＩｇＥ介在刺激
に対して前形成サイトカインを放出したり、あるいは他のもの（ＩＬ−４、ＩＬ
−５）を迅速に合成する肥満細胞の能力が、気管支炎症につながる初期事象であ
ると考えられる。実際、サイトカイン類のさらなる産生によるＴＨ２クローンの
誘導および活性化が好酸球の活性化および補充を促進し、その好酸球が炎症反応
の最終的エフェクターとして作用する。次に、白血球（特にはＴＨ２細胞）によ
って産生されるサイトカイン類は、粘膜肥満細胞の発達、活性化およびプライミ
ングに大きく影響することから、陽性の催炎ループを促進する。最近、ヒト肥満
細胞がＩＬ−８を産生し、マウス肺由来の肥満細胞が単核球化学誘引物質蛋白−
１および大食球炎症蛋白−１という両方のケモカイン類を発現するという所見が
得られている。これは、白血球補充に従来のように関与するサイトカイン類（Ｉ
Ｌ−４、ＩＬ−５、ＴＮＦ）以外に肥満細胞も、好酸球および多形核白血球に対
して作用する気道でのさらに別の強力な化学誘引物質（ＩＬ−８）を産生するこ
とを示唆している。さらに、ヒスタミン放出因子として作用するケモカイン類が
肥満細胞顆粒減少を誘発することから、それはさらに自己分泌活性化ループを維
持し得るものである。

【００１３】 肥満細胞はまた、Ｂ細胞成長において重要な役割を果たして、ＩｇＥ合成にお
いてＩＬ−４とともに必要とされる細胞接触（好塩基球のように）を提供するも
のである。それは、肥満細胞が、Ｔ−細胞とは独立にＩｇＥの産生を直接調節し
得ることを示唆し、そしてＩｇＥ架橋が生じると、アトピー性喘息において中心
的役割を果たすと考えられているＴ−細胞の小群である局所ＴＨ２応答を開始す
るだけの量のＩＬ−４を形成し得ることを示唆している。さらに肥満細胞は、Ｔ
−リンパ球に対する抗原提供細胞としても作用し得るものであり、喘息の免疫ネ
ットワークにおいて肥満細胞がかなり大きい役割を果たすことが示唆される。

【００１４】 文献に（Inflammation, Vol.5, No.1, pp.13-16 (1981)）、Ｎ−ホルミル−メ
チオニル−ロイシル−フェニルアラニンによる肥満細胞顆粒減少の阻害が報告さ
れている。その文献では、２種類の構造的に異なる走化性ペプチド、すなわちペ
プスタチンおよびＮ−ホルミル−メチオニル−ロイシル−フェニルアラニンが、
ラット皮膚での４０／８０、抗ラットＩｇＥ血清または仔ウシ肺から単離された
巨大分子アニオン浸透性因子の経皮注射によって生じる血管浸透性向上を阻害す
ることが報告されている。さらには、それらのペプチドが肥満細胞に対して直接
作用するように思われることも報告されている。

【００１５】 ヒトにおける炎症疾患、特に例えば喘息、関節炎およびアナフィラキシーの治
療は重要であることから、副作用が相対的に少ない新たな生理活性化合物が現在
もなお求められている。喘息炎症プロセスの文脈の範囲内での本発明の新規ペプ
チドの介入による肥満細胞顆粒減少の阻害を図４に視覚的に描いてある。

【００１６】 （発明の要旨） 本発明は、適当な医薬担体中にマスト細胞顆粒消失抑制活性を有するＮ−ホル
ミル−メチオニル−ロイシル（“ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ”）ペプチドを含む新規な
医薬組成物を用いる各種適応症の治療方法を提供する。特に有用なペプチドは、
式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中、ＸはＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｈ
ｅ及びＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択される）を有するものである。前記ペ
プチドは、アレルギー（例えば、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アナフィラキシー
、薬物過敏症、食物過敏症等）、皮膚炎症（例えば、皮膚炎、湿疹、乾せん、接
触皮膚炎、日焼け、老化等）、及び関節炎（例えば、骨関節症、乾せん性関節炎
、狼瘡、脊椎関節炎等）を治療するのに有用である。前記ペプチドは、慢性閉塞
性肺疾患及び慢性炎症性腸疾患の治療にも有用である。本発明のペプチドは、移
植の際の免疫抑制やガン治療を含めたコルチコステロイドを使用する適応症にお
いてコルチコステロイドの代わりに使用することができる。

【００１７】 本発明によれば、哺乳動物におけるアレルギー反応を治療する方法は、抗アレ
ルギー有効量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中、ＸはＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ
、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ及びＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択される）を有するペプ
チドを哺乳動物に投与することを含む。例えば鼻粘膜に関連したアレルギーの治
療のための好ましい投与モードは吸入による。接触アレルギーの治療のための好
ましい投与モードは適当な医薬担体を用いる局所投与である。全身治療のために
は皮内注射または錠剤を使用することができる。

【００１８】 本発明はまた、哺乳動物における皮膚炎症の治療方法を提供する。この方法は
、抗炎症有効量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中、ＸはＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈ
ｅ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ及びＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択される）を有するペ
プチドを哺乳動物に投与することを含む。

【００１９】 本発明は更に、哺乳動物における骨関節症、乾せん性関節炎、狼瘡、脊椎関節
炎等からなる群から選択される関節炎の治療方法を提供する。この方法は、抗関
節炎有効量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中、ＸはＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、
Ｐｈｅ−Ｐｈｅ及びＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択される）を有するペプチ
ドを哺乳動物に投与することを含む。

【００２０】 別の実施態様によれば、本発明は、好酸球の患者気道への浸潤を抑制する方法
を提供する。この方法は、気道への好酸球浸潤を抑制するのに有効な量の式ｆ−
Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中、ＸはＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ及び
Ｐｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択される）を有するペプチドを患者に投与する
ことを含む。

【００２１】 別の実施態様によれば、本発明は、患者の気道における粘液放出を抑制する方
法を提供する。この方法は、気道粘液放出を抑制するのに有効な量の式ｆ−Ｍｅ
ｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中、ＸはＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ及びＰｈ
ｅ−Ｔｙｒからなる群から選択される）を有するペプチドを患者に投与すること
を含む。

【００２２】 更に、本発明は、患者における慢性閉塞性肺疾患の治療方法を提供する。この
方法は、慢性閉塞性肺疾患の治療に有効な量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中
、ＸはＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ及びＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群
から選択される）を有するペプチドを患者に投与することを含む。

【００２３】 加えて、本発明は、患者における慢性炎症性腸疾患の治療方法を提供する。こ
の方法は、慢性炎症性腸疾患の治療に有効な量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式
中、ＸはＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ及びＰｈｅ−Ｔｙｒからなる
群から選択される）を有するペプチドを患者に投与することを含む。

【００２４】 本発明は更に、リンパ球（例えば、マクロファージ、単核細胞、好酸球、好中
球、ＴＮＦ等）のＩｇＥ活性化を阻止する方法を提供する。この方法は、前記リ
ンパ球をＩｇＥ活性化の阻止に有効な量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中、Ｘ
はＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ及びＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から
選択される）を有するペプチドと接触させることを含む。

【００２５】 本発明はまた、ＩｇＥ抗原攻撃に対する高い炎症性応答への更なる関与を妨げ
るべくリンパ球（例えば、マクロファージ、単核細胞、好酸球、好中球、ＴＮＦ
等）の細胞膜を安定化させる方法を提供する。この方法は、前記リンパ球を細胞
安定化に有効な量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ（式中、ＸはＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐ
ｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ及びＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択される）を有する
ペプチドと接触させることを含む。

【００２６】 更に、本発明は、ＩＬ−４及びＩＬ−５の産生への関与を妨げるべくＴ細胞（
例えば、ＣＤ４−細胞）及び他のケモキンの遊走を抑制する方法を提供する。こ
の方法は、前記Ｔ細胞を該Ｔ細胞の遊走抑制に有効な量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ
−Ｘ（式中、ＸはＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ及びＰｈｅ−Ｔｙｒ
からなる群から選択される）を有するペプチドと接触させることを含む。

【００２７】 本発明の特定の好ましい実施態様では、本発明のペプチドを第２活性成分と組
合せて投与することが患者にとって有利であり得る。本発明の前記組合せのため
に特に有用な他の活性成分は、例えば抗ロイコトリエン、β_２−アゴニスト、コ
ルチコステロイド等である。

【００２８】 （図面の簡単な説明） 図１は、化合物７８／８０の各種濃度についての毛細管透過性の面積を示すｌ
ｏｇ用量−反応曲線である。

【００２９】 図２は、各種濃度のｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅによる毛細管透過性の抑制に
ついての用量−反応曲線である。

【００３０】 図３は、各種濃度の本発明の好ましいペプチドによる毛細管透過性の抑制につ
いての用量−反応曲線である。

【００３１】 図４は、更にマスト細胞顆粒消失の抑制を示すアラキドン酸代謝の主要経路の
概略図である。

【００３２】 図５Ａ及び５Ｂは、ＯＶＡ誘発気管支喘息マウスモデルで使用した標準（５Ａ
）及び分解（５Ｂ）の異なるプロトコルの概略図である。

【００３３】 図６Ａ〜６Ｄは、処置マウス及び対照マウスにおけるＯＶＡ誘発喘息を抑制す
る本発明化合物の処置の比較組織検査を示す顕微鏡写真である。

【００３４】 図７は、マウス喘息マデルにおける粘液プラグの形成に対する本発明の治療結
果を示すヒストグラムである。

【００３５】 図８Ａ〜８Ｃは、喘息を誘発後本発明に従って処置したマウスの肺組織の組織
検査を示す。

【００３６】 図９Ａ〜９Ｄは、喘息を誘発後本発明に従って処置した第２群のマウスの肺組
織の組織検査を示す。

【００３７】 図１０Ａ〜１０Ｄは、喘息を誘発後本発明に従って処置した第３群のマウスの
肺組織の組織検査を示す。

【００３８】 図１１は、ＯＶＡ誘発喘息マウスから回収した肺胞中の炎症細胞の分布を示す
グラフである。

【００３９】 図１２は、ＯＶＡ誘発喘息マウスの気道中の気道プラグスコアを示すグラフで
ある。

【００４０】 図１３は、ＯＶＡ誘発喘息マウスの気道中の白血球遊走を示すグラフである。

【００４１】 図１４は、ＯＶＡ誘発喘息マウスの肺洗浄から回収した全細胞を示すグラフで
ある。

【００４２】 （詳細な説明） 本発明によれば、式−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘ〔式中、ＸはＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈ
ｅ、Ｐｈｅ−Ｐｈｅ及びＰｈｅ−Ｔｙｒから成るグループから選択される〕を有
しているある種の小ペプチドは、マスト細胞の脱顆粒反応を阻害するという予想
外の活性を有していることが知見された。その結果としてこのようなペプチドは
、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ）、ヒスタミン及びロイコトリエンの放出を阻
害し、様々な病気、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、ｕｔｉｃａｒｉａ、アナフ
ィラキシー、薬物過敏症、食物過敏症のようなアレルギーなどで生じる炎症の治
療、また、皮膚炎、湿疹、乾癬、接触皮膚炎、日焼け、老化のような皮膚炎症の
治療、また、骨関節炎、乾癬性関節炎、狼瘡、海綿状関節炎のような関節炎の治
療、などに有用である。これらのペプチドはまた、慢性の閉塞性肺疾患及び慢性
の炎症性腸疾患に有用である。本発明のペプチドは、移植組織の免疫抑制及び癌
治療のようなコルチコステロイドが使用される任意の用途でコルチコステロイド
に代替して使用され得る。

【００４３】 本発明のペプチドによる治療後に、マスト細胞の連続的脱顆粒反応が低下し、
マスト細胞によるロイコトリエン、ヒスタミン及びその他のサイトカインの放出
が減少するかまたは好ましい実施態様では完全に停止する。本発明の好ましい実
施態様によれば、ペプチドはまた、好酸球、好塩基球及び好中球が炎症組織に浸
潤することを抑制し得る。本発明の好ましいペプチドに反応してリンパ球、好酸
球及び好中球が走化性を示さない。その結果として、炎症部位に対するリンパ球
、好酸球及び好中球の走化性的接着、泳動及び凝集が有意に減少し、また、炎症
部位の血管透過性も低下する。更に、本発明の好ましい化合物は、心臓、肝臓及
び肺などのような生命器官に対して毒性を示さない。

【００４４】 本発明の好ましいペプチドは、例えば、マクロファージ、単球、好酸球、好中
球、ＴＮＦのようなリンパ球のＩｇＥ活性化をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉ
ｖｏでブロックするレセプターリンクを提供する。ペプチドはこのようなリンパ
球の細胞膜を安定化し、ＩｇＥ抗原刺激に対する炎症応答の増加にリンパ球が関
与することを阻止する。ペプチドはまた、慢性炎症の場合に異種細胞間、例えば
マスト細胞と好酸球との間のＩｇＥ結合をブロックする。

【００４５】 本発明のペプチドは慣用の小ペプチド化学技術によって調製され得る。投与に
使用されるペプチドは、医薬として許容される担体または希釈剤と共に無菌条件
下で調製される。

【００４６】 医薬組成物の用量は患者次第で、及び、使用される特定の投与経路次第で異な
るであろう。１日あたり０．１−１００，０００μｇ／ｋｇの範囲、より好まし
くは１−１０，０００μｇ／ｋｇの範囲の用量を投与し得る。体重１ｋｇあたり
約１−１００μｇ／ｋｇ、より好ましくは約１−１０μ／ｋｇ、最も好ましくは
１．０−２．０μｇ／ｋｇの用量を投与するのが極めて好ましい。病気の重篤度
に応じてこれらの用量を典型的には１日１回または４−６時間おきに投与する。
急病の場合は、ペプチドを４−６時間おきに投与するのが好ましい。維持目的ま
たは治療目的で使用する場合には、１日１回だけまたは２回の投与が好ましい。
投与経路及び病気の重篤度次第では、１日あたり約０．１８−約１６ｍｇのペプ
チドを投与するのが好ましい。特定化合物を分割用量でデリバリーするために望
ましい時間間隔は平均的な当業者が常套的な実験方法で決定できる。

【００４７】 投与経路には、経口、非経口、直腸内、膣内、外用、鼻孔内、眼内、直接注入
、などがある。好ましい実施態様では、本発明のペプチドを、抗炎症有効量また
はマスト細胞の脱顆粒反応を阻害する用量で患者に投与する。代表的な医薬組成
物は、典型的には医薬として許容される担体に含まれており、抗炎症効果を与え
るかまたはマスト細胞の脱顆粒反応を阻害する治療有効量の本発明のペプチドで
ある。

【００４８】 本文中に使用されておりかつより詳細に後述される“医薬として許容される担
体”という用語は、ヒトまたは他の動物への投与に好適な１種または複数の固体
状または液体状の増量希釈剤または封入用物質を意味する。従って本発明におけ
る“担体”なる用語は、投与を容易にするために本発明の分子に組合せる天然ま
たは合成の有機または無機の成分を意味する。“治療有効量”という用語は、所
望の効果を生じるかまたは治療される特定疾患に所望の作用を与える本発明の医
薬組成物の量を意味する。治療される患者の年齢、病気の重篤度、治療期間及び
投与形態などの種々の違いに対応できるように、同じ成分を種々の濃度で含む組
成物を調製する。

【００４９】 担体はまた、相溶性でなければならない。本文中で使用される“相溶性”とい
う用語は、所望の薬効を実質的に損なうことなく医薬組成物の諸成分が互いにか
つ本発明の小ペプチドと混合できることを意味する。

【００５０】 本発明のペプチドは典型的にはｐｅｒ ｓｅ（原形）で投与される。しかしな
がら、医薬として許容される塩の形態で投与されてもよい。このような医薬とし
て許容される塩の非限定例は、以下の酸から製造される塩である：塩酸、臭化水
素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、ｐ−トルエンスル
ホン酸、酒石酸、クエン酸、メタンスルホン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸、ナ
フタレン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸。医薬として許容される塩はま
た、カルボン酸基のナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩のようなアルカリ
金属塩またはアルカリ土類金属塩として調製されてもよい。従って本発明は、本
発明のペプチドを１種または複数の医薬として許容される担体及び他の任意の治
療用成分と共に含む医療用の医薬組成物を提供する。

【００５１】 組成物は、経口、直腸内、膣内、外用、鼻孔内、眼内または非経口などの投与
経路に適した組成物を包含し、本発明物質を使用するために上記の全部の投与経
路を使用し得る。本発明のペプチドを含有する医薬組成物はまた、医薬として許
容される１種または複数の担体を含有してもよく、担体は、安定剤（長期保存を
補助）、乳化剤、結合剤、増粘剤、塩、保存剤、溶媒、分散媒、コーティング剤
、抗菌剤及び抗真菌剤、等張化剤、吸収遅延剤、などの賦形剤を含有し得る。医
薬活性物質にこのような媒体及び薬剤を使用することは当業界で公知である。慣
用の媒体または薬剤が本発明のペプチドに不相溶性でない限り、本発明の医薬組
成物に使用し得る。また、補助有効成分を本発明の医薬組成物に混在させてもよ
い。

【００５２】 喘息の治療には経口投与に適した組成物が好ましい。典型的にはこのような組
成物を、吸入エアロゾル、吸入噴霧剤、シロップまたは錠剤として調製される。
関節炎の治療には外用投与に適した組成物が好ましいが、経口組成物も便利であ
る。典型的にはこのような外用組成物は、クリーム、軟膏または溶液として調製
される。このような組成物中のペプチド有効成分の濃度は典型的には５０μｇ／
ｍｌ未満、より好ましくは３０μｇ／ｍｌ未満、最も好ましくは約５−１０μｇ
／ｍｌ未満である。

【００５３】 組成物は単位剤形の形態で提供されるのが便利であり、製薬業界で公知の任意
の方法によって調製され得る。典型的な方法は、本発明の有効成分を、１種また
は複数の補助成分を含む担体に会合させる段階を含む。

【００５４】 吸入投与に適した本発明の組成物は例えばエアロゾルまたは吸入溶液の形態で
提供される。典型的なエアロゾル組成物の一例は、トリクロロ−モノフルオロメ
タン及びジクロロジフルオロメタンにオレイン酸を加えた混合物に懸濁した所望
量の微晶質ペプチドから成る。典型的な溶液の一例は、無菌の生理食塩水（溶解
度を上げるために約５％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド（“ＤＭＳＯ”）を任意
に添加）に溶解または懸濁させた所望量のペプチドとベンズアルコニウムクロリ
ドと硫酸（ｐＨ調整用）とから成る。

【００５５】 経口投与に適した本発明の組成物はまた、各々が所定量の本発明のペプチドを
含むカプセル、カシェ剤、錠剤またはドロップのような個別単体でもよく、ある
いは、リポソームに収容されていてもよくまたはシロップ、エリキシル剤もしく
はエマルジョンのように水性液体または非水性液体に懸濁液として含まれていて
もよい。錠剤配合基剤の一例は、コーンスターチ、ラクトース及びステアリン酸
マグネシウムなどの不活性成分である。シロップ配合基剤の一例は、クエン酸、
着色剤、香味剤、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、サッカリン、安息香酸
ナトリウム、クエン酸ナトリウム及び純水である。

【００５６】 非経口投与に適した組成物は好ましくは本発明分子の無菌水性調製物から成る
。調製物はレシピエントの血液に等張性であるのが好ましい。この水性調製物を
適当な分散剤または湿潤剤と懸濁化剤とを使用して公知の方法に従って製剤化し
得る。無菌の注射用調製物はまた、非経口的に許容される無毒性の希釈剤または
溶媒中の無菌の注射用溶液または懸濁液、例えば１，３−ブタンジオール溶液で
もよい。使用が許容されるビヒクル及び溶媒は、水、リンゲル液、等張塩化ナト
リウム溶液である。幾つかのペプチドでは溶解度を維持するために水溶液中に約
１０％ｖ／ｖまでのＤＭＳＯまたはＴｒａｐｐｓｏｌを使用し得る。また、慣用
の無菌性不揮発油を溶媒または懸濁媒体として使用してもよい。この目的で、合
成モノ−またはジグリセリドのような多くの不揮発性油を使用し得る。更に、脂
肪酸（例えばオレイン酸または中性脂肪酸）を注射剤の調製に使用し得る。更に
、固体形態から３７℃で数週間または数カ月にわたって徐放性に化合物を注入す
るためにプルロニックブロックコポリマーを４℃で脂質に配合し得る。

【００５７】 外用投与に適した組成物はＴｒａｐｐｓｏｌもしくはＤＭＳＯ中のペプチドの
溶液、または、クリーム、軟膏またはローションの形態で提供され得る。典型的
には、約０．１−約２．５％の有効成分を基剤または担体に組込む。クリーム配
合基剤の一例は、純水、ワセリン、ベンジルアルコール、ステアリルアルコール
、プロピレングリコール、イソプロピルミリステート、ポリオキシル４０ステア
レート、ｃａｒｂｏｍｅｒ ９３４、ラウリル硫酸ナトリウム、酢酸二ナトリウ
ム、水酸化ナトリウム、及び任意にＤＭＳＯである。軟膏配合基剤の一例は、白
色ワセリン、及び、任意に鉱油、ソルビタンセスキオレエート及びＤＭＳＯであ
る。ローション配合基剤の一例はｃａｒｂｏｍｅｒ ９４０、プロピレングリコ
ール、ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ ４０、プロピレングリコールステアレート、コ
レステロール及び近縁ステロール、イソプロピルミリステート、ソルビタンパル
ミテート、アセチルアルコール、トリエタノールアミン、アスコルビン酸、シメ
チコーン及び純水である。

【００５８】 マスト細胞脱顆粒の抑制を測定するためのラット皮膚モデル アレルギーにより誘導される喘息は、生物が過感作状態になっている物質（ア
レルゲン）の暴露から生じる。アレルゲンに対する暴露は肺内のマスト細胞の脱
顆粒を引き起こして、ロイコトリエンおよびヒスタミンを放出させる。ロイコト
リエンおよびヒスタミンの放出に応答して、毛細血管の透過性が劇的に増加し、
血漿が該毛細管から周辺組織内に漏出する。そのような暴露から生じる呼吸症状
は、軽度なもの（かゆみおよびくしゃみ）から、致命的となる可能性のもの（喘
息）（極度に慢性の場合にはアナフィラキシーによる死を含む）まで様々である
。

【００５９】 この現象を実験的に示すために、ラットの皮膚を肺の代わりに使用する。この
モデルにおいては、該実験的ラットの血漿を色素トリパンブルーで標識する。こ
の可溶性色素は、血漿自体の受動的マーカーとして血流中で運ばれ、肝細胞から
除かれる。毛細血管系を含む無傷血管は、通常の状況下でこの色素を保持する。
マスト細胞の脱顆粒（ロイコトリエンおよびヒスタミンの放出を引き起こす）を
誘導する化合物を該皮膚内に注射して、アレルゲン誘導性脱顆粒を刺激する。こ
れらの実験においては、この目的に化合物48/80を使用した。ロイコトリエンお
よびヒスタミンの放出後の事象において、毛細血管の透過性が増加し、青く染ま
った血漿が毛細血管から漏出し、該注射部位の周囲の皮膚を青く染める。青くな
った（青変）面積が、注射した化合物48/80の量の尺度となる。

【００６０】 注射前に試験化合物を化合物48/80と混合することにより、「抗ロイコトリエ
ン」および／または「抗ヒスタミン」活性に関して該試験化合物を試験すること
ができる。該試験化合物がロイコトリエンまたはヒスタミンの放出を抑制する場
合には、該試験化合物の不存在下で化合物48/80が注射された同一ラットの注射
部位より小さな直径の青変領域が観察される。高い抗ロイコトリエンおよび抗ヒ
スタミン活性の場合には、該青変は事実上完全に抑制されうる。

【００６１】 実験 ラット皮膚モデルを用い、有効性を確認した。種々のペプチドを、抗ロイコト
リエンおよび／または抗ヒスタミン活性に関して所定用量で試験した。選択した
用量は、比較のための標準化合物であるMet-Leu-Pheに対する全般的な比較を可
能にした。

【００６２】 いくつかの化合物に関して「用量反応」力価測定を行ない、該標準化合物と比
較した。連続的に減少する用量の推定抑制化合物を使用した場合の、毛細血管透
過性領域の面積の連続的な減少は、初期所定用量試験において認められたロイコ
トリエンおよび／またはヒスタミンの放出の抑制を示すものである。

【００６３】 材料および方法 試薬はSigmaまたはAldrichから入手した。ただし、獣医学用麻酔剤ケタミンは
種々の獣医学的供給業者から入手した。使用したラットは、B＆K International
から購入した時点で220〜240gであった雄のSprague-Dawley品種であった。

【００６４】 ラット皮膚反応のために、0.25mlの10mg/mlケタミンでラットを麻酔した。食
塩水（滅菌濾過したもの）中の1.0mlのトリパンブルーを尾静脈内に投与し、該
ラットの背部を剃毛した。試験および対照注射のために、ラット1匹当たり4個の
皮内注射部位を用いた。

【００６５】 化合物48/80は、食塩水中の1.5mg/mlのストック溶液として調製した。この物
質は水溶液中で不安定となる可能性があることが判明し、毎日新たに調製した。
各ラットに注射する直前に、使用レベルまでの食塩水中の系列希釈液を調製した
。

【００６６】 ペプチドは、DMSO中の23mMストック溶液として調製し、実験の合間は-20℃で
保存した。使用時に、該凍結ストック溶液を融解し、0.1mlの水性・化合物48/80
に対して5μlのDMSOの割合になるよう、適量のDMSOと共に適当なアリコートを化
合物48/80の希釈液に加えた。これにより、ある種のペプチドの溶解性を維持す
るのに必要な5％ DMSO溶液が得られた。5％ DMSOの影響は皆無であることが対照
実験により示された。

【００６７】 注射のために、0.1mlの化合物40/80、+/-試験化合物を、麻酔され色素処理さ
れ剃毛されたラットに皮内注射した。15分間のインキュベーションの後、該ラッ
トを頚部脱臼により犠牲にし、背部の皮膚を剥ぎ取り、ライトボックス上に配置
した。背後から光を当てられた皮膚のイメージを、CCDビデオ捕獲カメラおよび
適当なハードウェア／ソフトウェアを使用してデジタル化した。科学的グラフィ
ックス解析ソフトウェアを使用して該デジタル化イメージを解析し、毛細血管透
過性（青変）領域の面積について積分して、さらなる解析のためのデジタル値を
得た。

【００６８】 化合物48/80を約0.01μg〜約15μgの種々の用量で使用して、用量反応曲線を
作成した。その結果を図1に示す。ラット間のばらつき（例えば、皮膚の厚さ）
に基づく、化合物48/80の与えられた用量に関する毛細血管透過性領域の直径に
おける広範なばらつきが認められた。さらなる試験を行なうために、0.15μgの
用量の化合物48/80を選択した。

【００６９】 実施例１ 選択した用量０．１５μｇの化合物４８／８０を用いて標準化合物ｆ−Ｍｅｔ
−Ｌｅｕ−Ｐｈｅの用量反応曲線を作成した。０ないし約２３０ｎＭのｆ−Ｍｅ
ｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅを試験し、結果を図２に示す。化合物１８／８０に誘起され
る脱顆粒の阻害が明白に示された。

【００７０】 実施例２から１１ １００ナノモルおよび０．１５μｇの用量の化合物４８／８０を用いて、ラッ
ト皮膚モデルにおいて誘起された脱顆粒の阻害に関して試験ペプチドおよびいく
つかのｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕペプチドを試験した。各試験の各ラットにおいて内在
性ペプチド用量がゼロの４８／８０対照を含め、阻害％をこの対照（０％阻害）
に対する相対的な値として表した。４８／８０により生じる肥満細胞の脱顆粒の
％をも決定した。この結果を以下の表にまとめる。

【００７１】

【表１】

【００７２】 実施例１２ 選択した用量０．１５μｇの化合物４８／８０を用いてｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−
Ｐｈｅ−Ｐｈｅの用量反応曲線を作成した。０ないし約２３０ｎＭのｆ−Ｍｅｔ
−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅを試験し、結果を図３に示す。化合物１８／８０に誘
起される脱顆粒の驚くべき顕著な阻害が明白に示された。ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−
Ｐｈｅ−Ｐｈｅにより誘起された脱顆粒の阻害は予期しないことに標準化合物ｆ
−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅによる阻害よりも実質的に良好であった。

【００７３】 肥満細胞の脱顆粒阻害のためのＯＶＡ誘起気管支喘息マウスモデル 喘息は複合的な疾患であり、気道閉塞および持続的な気管支過敏反応の自発的
な悪化により特徴づけられる。気道粘膜下組織のＴリンパ球、好酸球およびマク
ロファージ／単球の活性化はもうひとつの確立された特徴である。サイトカイン
の発現および炎症性の媒介物質を伴う炎症メカニズムは気管支収縮および気管支
過敏反応の病因の基盤である。しかしながら、病因メカニズムの多く、例えば持
続的な症状および慢性炎症および疾患を調節および防御するために必要な介在に
ついては明らかにされていない。

【００７４】 単一の対抗性アレルゲンが吸入されるとある個体および動物モデルにおいて気
道の反応性が急激に増強されることは長く認識されている。しかしながら、アレ
ルゲン吸入を繰り返すと、より顕著で、一貫した、持続的な気道反応性の増強が
認められた。このアレルゲン吸入を長時間繰り返したマウスモデルを用いて肺に
おけるアレルギー性疾患の長期影響を研究し、ヒトの肺における気道過敏反応の
誘導に関与する細胞、メカニズム、分子および媒介物質について表した。

【００７５】 材料および方法 試薬：ピアース・ケム・コーポレーション（ロックフォールド、イリノイ州）
から結晶性ＯＶＡを、シグマ・ケム・コーポレーション（セントルイス、ミズー
リー州）から硫酸カリウムアルミニウム（アルム）を、バクスター・ヘルスケア
・コーポレーション（ディアフィールド、イリノイ州）からパイロジェン不含蒸
留水を、リンフォムド（ディアフィールド、イリノイ州）から０．９％塩化ナト
リウム（通常のセイライン）を、およびシクロデキストリン・テクノロジーズ・
デベロプメント・インコーポレーティッド（ガイネスヴィル、フロリダ州）から
トラップソル（商標）ＨＰＢ−Ｌ１００（水性ヒドロキシプロピルβシクロデキ
ストリン；４５重量／容量％水溶液）を入手した。ＯＶＡ（通常のセイライン中
５００μｇ／ｍｌ）を等容量の蒸留水中１０重量／容量％アルムと混合した。混
合物（１０Ｎ ＮａＯＨを用いてｐＨ６．５にする）を室温で６０分インキュベ
ートした後、７５０ｇで５分間遠心し；ペレットを蒸留水で元の容量に再懸濁し
、１時間以内に使用した。

【００７６】 選択した５−リポキシゲナーゼインヒビター、ジロイトン（１−［１−ベンゾ
［ｂ］チエン−２−イルエチル］−Ｎ−ヒドロキシウレア；Ｊ．Ｐｈａｒｍｃｏ
ｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２５６：９２９−９３７（１９９１））は親切にもＤｒ
．ＢｅｌｌおよびＤｒ．Ｇｅｏｒｇｅ，Ｗ．Ｃａｒｔｅｒ（アボット・ラボラト
リーズ、アボットパート、イリノイ州）より提供された。ジロイトンをトラポソ
ル（商標）に溶解した。肥満細胞脱顆粒インヒビター、ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐ
ｈｅ−Ｐｈｅ（「ＨＫ−Ｘ」）はヒスタテック・インコーポレーティッド（シア
トル、ワシントン州）により提供された。

【００７７】 雌ＢＡＬＢ／ｃワンス（６ないし８週齢で購入；ディー・アンド・ケイ、シア
トル、ワシントン州）を研究に慣用される条件下で飼育した。

【００７８】 アレルゲン免疫／対抗プロトコル：標準（図５Ａ）および解析（図５Ｂ）（Ｊ
．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１４８３−１４９４（１９９６））の異なるプロト
コルでマウスにｉ．ｐ．注射によりアルムを伴うＯＶＡ０．２ｍｌ（１００μｇ
）を投与した。異なるプロトコルに従って、通常のセイライン中ケタミン（０．
４４ｍｇ／ｍｌ）／キシラジン（６．３ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌのｉ．ｐ．によ
りマウスを麻酔し、その後通常のセイライン０．０５ｍｌ中ＯＶＡ１００μｇの
用量で鼻腔内（ｉ．ｎ．）におよび通常のセイライン０．０５ｍｌ中ＯＶＡ５０
μｇの用量で鼻腔内（ｉ．ｎ．）に投与した。二つの対照群を用いた。従って、
第１群にはアルムを含む通常のセイラインをｉ．ｐ．およびアルムを含まない通
常のセイラインをｉ．ｎ．投与し；第２群にはアルムを含むＯＶＡをｉ．ｐ．お
よびアルムを含まないＯＶＡをｉ．ｎ．投与および通常のセイライン単独を投与
した。

【００７９】 組織学 気管および左肺（右肺は気管支肺胞洗浄に用いる）を得、１０％中性ホルムア
ルデヒド溶液で室温で６ないし１５時間固定した。パラフィンに包埋した後、組
織を５μｍ切片に切断し、さらに異なる染色または免疫標識で処理した。細胞数
を計数するためにディスクーム好酸球染色を用い、対比染色にメチレンブルーを
用いた。気道面積（２２００μｍ^２）あたりの好酸球数を形態計測により決定し
た（Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１６６；３９５−４０４（１９９２）；Ａｍ．Ｒｅｖ．
Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１４７：４４８−４５６（１９９３））。メイソンのト
リクローム染色により繊維形成を決定した。染色法：メチレンーブルー、ヘモト
キシリンおよびエオシン、ムチカルミン、アルシアン・ブルー、並びにアルシア
ン・ブルー／過ヨウ素酸・シッフ（ＰＡＳ）反応（Ｔｒｏｙｅｒ，Ｈ．，Ｐｒｉ
ｎｃｉｐｌｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ（リトル・ブラウン・アンド・カンパニー、ボストン、マサチューセッツ
州）、「炭水化物」、８９−１２１（１９８０）；Ｓｈｅｅｈａｎ，Ｄ．Ｃ．ら
、Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｈｉｓｔｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ（バトル・プレス、コロンブス、オハイオ州）、「炭水化物」、１５９−
１７９（１９８０）、）の後気道粘液を決定した。ムチカルミン溶液でムチンを
染色し；メタニルイエローを対比染色に用いた。酸性ムチンおよび硫酸化粘液物
質をアルシアン・ブルー、ｐＨ２．５で染色し；ヌクレアファスト赤対比染色を
用いた。中性および酸性粘液物質をアルシアン・ブルー、ｐＨ２．５およびＰＡ
Ｓ反応で同定した。気道（直径０．５ないし０．８ｍｍ）の閉塞の程度を形態学
的にも評価した。粘液による気道直径の閉塞％をフィギュア・レジェンドに記載
の０から４＋の半定量スケールで分類した。個体にはプロトコル設計を伏せて形
態計測分析を実施した。

【００８０】 肺機能試験 ２８日に、マウス、インビボで、前記の方法を修飾したプレチスモグラフィー
法（１０、１９５８；１９２：３６４−３６８；Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ
．６４：２３１８−２３２３（１９８８）；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８４：１４
８３−１４９４（１９９６））により通常のセイラインかまたはＯＶＡのいずれ
かを最後にｉ．ｎ．投与した２４時間後、メタコリンの静脈内注入に対する肺の
力学を決定した。肺機能試験の完了時に各マウスを心穿刺により放血し、さらな
る分析のために肺組織を気管と共に取り出した。

【００８１】 気管支肺胞洗浄 主気管支で左肺を糸結びし、右肺を通常のセイライン０．４ｍｌで３回洗浄し
た。プールしたサンプルの０．０５ｍｌアリコートから気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ
）液細胞をヘモサイトメーターで計数し、残った液体を４℃、２００ｇで１０分
間遠心した。エイコサノイド分析を実施するまで上澄を−７０℃で保存した。１
０％ウシ血清アルブミン（「ＢＳＡ」）を含有する通常のセイライン中細胞ペレ
ットを再懸濁した後、ガラススライド上にＢＡＬ細胞スメアを作った。好酸球を
染色するために乾燥したスライドをディスクーム希釈液（０．０５％エオシン水
溶液および蒸留水中５容量／容量％アセトン；Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３１：１
２７１−１２８７（１９７０））で５ないし８分間染色し、０．５分間水ですす
ぎ、０．０７％メチレン・ブルーで２分間対比染色した。

【００８２】 気道粘液糖蛋白質のアッセイ ＢＡＬ液中の粘液糖蛋白質をスロットブロット法及びＰＡＳ染色法によってア
ッセイした（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８９；１８２：１６０−１６４；
Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９５；１２：２９
６−３０６）。ニトロセルロース膜（孔サイズ０．２μｍ；Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅ
ｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｋｅｅｎｅ，ＮＨ）を蒸留水、次いで通常生理食塩溶
液で湿らせたあと、Ｍｉｎｉｆｏｌｄ ＩＩ ７２穴スロットブロット装置（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ＆ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に入れた。ＢＡＬ液のサンプル（０
．０５ｍｌ）とヒト気道ムチン糖蛋白質の原液（２μｍ／ｍｌ）のアリコート（
０．０５−０．７５ｌ）（Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１９９１；５：７１−７９）を水吸引真空によってニトロセルロース膜にブ
ロッティングし、粘液糖蛋白質をＰＡＳ反応によって視覚化した。ＰＡＳ染色を
定量するために反射デンシトメトリーを実施した。その後下記に述べる画像処理
システムによって画像を分析した。ＢＡＬサンプルのＰＡＳ反応性の面積強度を
、ヒト気道ムチンについての標準曲線と比較して定量した。

【００８３】 免疫細胞化学 モノクローナル抗体：ＣＤ１１ｃ（ＤＡＢ法）及びＭａｃ１（Ｂｅｈｒｉｎｇ
ｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ、Ｈｉｔｏｍｏｕｓｅ ＫｉｔによるＡＢＣ法、Ｚｙｍ
ｅｄ）を使用して、血管系、気道及び線維症の領域内及びその周囲の炎症性細胞
型、例えば樹状細胞、マクロファージ及びリンパ球を同定した。

【００８４】 形態測定及び画像分析 ＳｃａｎＪｅｔＩＩＣＸ ＳｃａｎｎｅｒとＨＰ ＤｅｃｋＳｃａｎ ＩＩソ
フトウエア（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ（登録商標）Ｗｉｎｄｏｗｓ^ＴＭバージョン）
（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により、すべ
ての画像を捕捉してデジタル化した。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ（登録商標）Ｐｌｕｓ
、ＷｉｎｄｏｗｓＴＭソフトウエア用１．１バージョン（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅ
ｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ）を用いてこのシステムを
Ｄｅｌｌ Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ ＸＰＳ Ｐ９０コンピュータ（Ｄｅｌｌ Ｃｏ
ｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）に接続した。Ｄｅｌｌ Ｕｌｔｒａ
ｓｃａｎ １７ＥＳモニターを超高解像力グラフィックモード（１．２８０×１
，０２４ピクセル、７８．９ｋＨｚ水平走査周波数、７４Ｈｚ垂直走査周波数）
で使用して、２５６グレイレベルスケールで画像を評価した。

【００８５】 ロイコトリエン阻害因子試験 気道炎症における５−リポキシゲナーゼ産物の役割を評価するため、図５に記
載されている日に、５−リポキシゲナーゼ阻害因子、Ｚｉｌｅｕｔｏｎ（３５ｍ
ｇ／ｋｇ）を各々のｉ．ｎ．攻撃誘発の３０分前にｉ．ｐ．投与した。１組の動
物では、ｉ．ｐ．ＯＶＡの前にもＺｉｌｅｕｔｏｎを投与した。３５ｍｇ／ｋｇ
のＺｉｌｅｕｔｏｎは、ＢＳＡ抗原をｉ．ｐ．投与した受身感作ラットにおいて
システイニルロイコトリエンの放出を〜９５％抑制する。（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｌ．Ｅｘｐ．１９９１；２５６：９２９−９３７）。

【００８６】 本発明のＨＫ−Ｘ化合物 上述したのと同じ手順を用いてＨＫ−Ｘ化合物を５ｍｇ／ｋｇと１０ｍｇ／ｋ
ｇで投与した。

【００８７】 統計分析 保護最小有意差法（Ｓｔａｔｖｉｅｗ ＩＩ，Ａｂａｃｕｓ Ｃｏｎｃｅｐｔ
ｓ，Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）を用いて、肺機能データを分散分析（ＡＮＯＶＡ
）によって評価した。この方法は、多数のｔ統計を用いて可能なすべての対応あ
る比較を評価するものであり、等しい対サイズと等しくない対サイズの両方に適
用できる。その他のデータは結合実験の平均±ＳＥとして報告される。独立平均
についてのスチューデント両側ｔ検定により、差を有意性（Ｐ＜０．０５）に関
して分析した。

【００８８】 １．好酸球（表２Ａ−２Ｂ） １、２及び３ヵ月群のＯＶＡ処置マウスにおいて気道の好酸球数はそれぞれ４
４．８３％から３７．４０％及び１９．１５％に有意に減少した（Ｐ＜０．０２
５）。同じ時間経過で、ＯＶＡ処置群では他の２つの群よりも好酸球数がはるか
に高かったが（Ｐ＜０．０２５）、Ｚｉｌｅｕｔｏｎは概して１−３ヵ月間好酸
球を低下させることができた。しかし本発明のＨＫ−Ｘ化合物は、１ヵ月で同等
に好酸球を低下させたが、２ヶ月目と３ヵ月目にははるかに有効に好酸球を低下
させた。

【００８９】

【表２】

【００９０】

【表３】

【００９１】 ２．他の炎症細胞 他の炎症細胞は、気道内への異種蛋白の侵入後非特異的炎症応答を示す。リン
パ球が気道内に集積したが、対照群では実質的に存在しなかった。ｂｏｏｔ擬似
感作したマウスとＯＶＡ感作したマウスにおいてＯＶＡ攻撃誘発後好中球が集積
したが、ＯＶＡ感作群の気道にはるかに多くの好中球が存在した。広い細胞質の
末梢付近に半月形の核を持つ独特の多核巨細胞（融合したマクロファージ）が時
として認められた。ランゲルハンス巨細胞と球状白血球の両方が、ＯＶＡで感作
し、攻撃誘発した動物においてのみ認められた。それらは通常、より大きな気道
に関連する結合組織中に存在した。気道の近くと局所的リンパ系組織において時
としてプラスマ細胞が認められた。

【００９２】 ３．気道栓（表３） ムチン：同じ処置を行った３群間で差はなかったが、時間経過には差があった
（Ｐ＞０．０５）。ＯＶＡ処置群は、食塩溶液、Ｚｉｌｅｕｔｏｎ（Ｐ＜０．０
５）及びＨＫ−Ｘ化合物で処置した群よりも高いスコアを有していた。

【００９３】

【表４】

【００９４】 喘息は気道の慢性炎症状態である。ヒトでは、ひとたび確立されてしまうと、
気道の過敏症は何年も安定なままでありうる。アレルゲンの吸入、検出しうる気
道炎症あるいは上皮剥離が存在しなくても明らかに持続する。それ故、気道の超
微細構造の不可逆性（あるいは少なくとも緩慢な可逆性）変化により永続的とな
りうる。

【００９５】 軽度の喘息患者では、これらのエピソードあるいは「発作」は比較的まれで、
気管支拡張薬の吸入によって良好に治療される（可逆性である）。基礎となる示
差的な慢性気道炎症の強度が、より頻繁で強く且つ持続的な、気管支拡張薬によ
ってあまり可逆性でない発作に関連し、見掛け上結びついている。この理由は近
年徐々に明らかになってきた。主としてＴｈ２−リンパ球、好酸球、肥満細胞、
そしておそらく血小板の活性化された又は感作された浸潤物から成る炎症は、脈
管周囲（間質）腔の拡大とメディエイタ／成長因子の放出を引き起こし、基底膜
の肥厚、上皮の損傷と脱離、粘っこい粘液の産生、過形成、初回感作ならびに気
道平滑筋の部分的収縮を生じさせる。これらの結果はすべて気道反応性の上昇を
裏付けており、気道反応性の上昇は環境刺激に対する応答の閾値を低下させ、そ
れ故より頻繁で強い発作を引き起こす。

【００９６】 上記の形態学的変化はすべて、肺機能に直接且つ強力に影響する。急性喘息マ
ウスモデルと長期的喘息マウスモデルに関する実験において、肺機能の有意の病
態生理学的変化が認められ、上記の形態学的変化を裏付けた。アレルゲンの吸入
は、気道と肺胞上皮での好酸球と肥満細胞の発現、ならびに気道上皮だけでの誘
導Ｅ選択発現、好酸球の浸潤と気道反応性の上昇、そしてその他の種類の炎症細
胞（球状白血球及びランゲルハンスが他の多核巨細胞（融合マクロファージ））
を増加させることが認められ、喘息肺内での非特異的炎症反応を示唆した。

【００９７】 ＨＫ−Ｘ化合物は、ＯＶＡ処置（ＯＶＡ）マウスと対照マウスの気道における
粘液蓄積を抑制する。擬似感作したマウスと食塩溶液で攻撃誘発したマウス（食
塩溶液、ｎ＝４）及びＨＫ−Ｘ処置なし（ＯＶＡ、ｎ＝４）と処置あり（ＨＫ−
Ｘ／ＯＶＡ、ｎ＝８）のＯＶＡ感作／攻撃誘発マウスから、気道の粘液閉塞の分
布を測定した。気道直径の粘液閉塞を次のような形態測定によって検定した：０
、粘液なし；＋、〜１０％閉塞；＋＋、３０％閉塞；＋＋＋、〜６０％閉塞；＋
＋＋＋、〜８０％閉塞。各々のマウスの肺全体に無作為に分布する１０の気道を
、形態測定により粘液閉塞に関して評価した。

【００９８】 図６Ａ−６Ｄは、ＨＫ−Ｘ化合物が、ＯＶＡを用いて喘息を誘発したラットに
おいて肥満細胞の脱顆粒を抑制する能力、そしてそれによりＨＫ−Ｘ化合物で喘
息を治療する効果についての目に見える組織学的証拠を提供する。図６Ａは、Ｏ
ＶＡ感作／攻撃誘発したマウスの気道（ＡＷ）内腔における多量の分泌された粘
液を示す。図６Ｂは、好酸球及び他の炎症細胞（矢印で示されている）による間
質組織の大量浸潤を示す。図６Ｃは、ｉ．ｎ．ＯＶＡの前に阻害因子であるＨＫ
−Ｘ化合物を投与したとき、気道（ＡＷ）内腔での気道粘液放出が著明に低下す
ることを示している。ＯＶＡ攻撃誘発だけと比較してＨＫ−Ｘ化合物処置後には
好酸球による間質組織の浸潤も低下する（図６Ｃと図６Ａ及び６Ｂの比較）。図
６Ｄは、食塩溶液処置マウスでは気道（ＡＷ）に粘液及び細胞が存在しないこと
を示す。気管支上皮に結合組織細胞が浸潤しているが、気管支周囲の間質腔には
白血球が存在しない。

【００９９】 気道マクロファージは、喘息患者のアレルゲン抗原投与肺によるＢＡＬ液にて
回収されたマクロファージで報告された場合に似た、総活性化の徴候を示した（
Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１９８７；１３５：４３３−４４０）。
マクロファージおよび樹状細胞は肺にて抗原提示細胞として機能し、気道上皮お
よび周辺部位の表現型変化を開始可能なサイトカインを分泌する、直接的または
間接的な原因となる場合がある。気道の慢性炎症の刺激は、気道上皮および繊維
芽細胞の増殖を直接引き起こすことがあり、結果としてこれらの領域周囲へのコ
ラーゲン沈着につながる。同領域におけるマクロファージおよび樹状細胞の活性
は、最終段階抗原投与中の他の炎症細胞と比較すると、高いままであった。

【０１００】 気道上皮は、特に太い気道では、しかし細いおよび末端細気管支においてさえ
も、主として杯状細胞の著しい肥厚によって厚くなった。通常、円柱状の繊毛性
細胞に対する杯状細胞の比は、対照グループと比較すると著しく大きくなった。
対照の気道（細い気道と太い気道両方）には臨時杯状細胞のみがあったが、ＯＶ
Ａ抗原投与肺による切片は、太い気道の１００％と細い気道の一部が、気道上皮
細胞すべての８８％までの杯状細胞を持つことを示した。洗浄されていない肺に
おいて、杯状細胞内および一部の気道内に粘液が見られ、場合によっては管腔を
完全に塞いでいた。細胞の破片がこのような粘液栓に絡まった。杯状細胞肥厚は
対照グループでは見られなかったため、ＯＶＡの「非アレルギー性」効果または
気管内投与手法によるものではなかった。細い気道内の杯状細胞の一部にはこの
ような特徴が見られなかったことは、おそらく、呼吸ツリー内のＯＶＡの分布が
均一でなかったことを示している。

【０１０１】 図７は、このネズミ喘息モデルにおける粘液栓の形成に対する、化合物ＨＫ−
Ｘによる、投与量５μｇ／ｋｇおよび１０μｇ／ｋｇでの治療の結果のヒストグ
ラムである。どちらの投与量も、細気道における粘液生成を低下させる。

【０１０２】 喘息は、気道好酸球増加症、浮腫、粘液過分泌、気管支上皮損傷、反応亢進な
どの複合炎症反応によって特徴付けられる。アレルギー喘息患者における吸入ア
レルゲン抗原投与は、即時型気道過敏症反応、数時間後に遅延気道反応が続くこ
とが多い、早期気道反応（ＥＡＲ）、後期気道反応（ＬＡＲ）の原因となる。Ｌ
ＡＲからの回復後、メタコリンなどの数日間持続する薬剤に対する後天性気道過
敏症（ＡＨＲ）が増加している。アレルゲン抗原投与直後に発生するＥＡＲは、
ＩｇＥ−媒介脱顆粒の結果として、ヒト肺マスト細胞によって放出される気管支
収縮剤分子の作用に付随するものである。

【０１０３】 ＩｇＥ媒介マスト細胞の脱顆粒は、アレルギー性鼻炎、喘息およびアナフィラ
キシスなどのアレルギー性障害の病因における主要な事象である。アトピー性患
者では、特定のアレルゲンを皮内注射すると、皮膚試験部位でのヒスタミン放出
および脂質メディエータの生成によって特徴付けられる即時型ホイールアンドフ
レア反応が発生する。初期皮膚反応に続き、６〜１２時間後に後期皮膚反応が発
生する。この後期アレルギー性皮膚反応は、好酸球および他の炎症細胞（たとえ
ば好中球、単球および好塩基球）による血管周囲の浮腫および細胞浸潤より成る
炎症反応によって特徴付けられる。早期および後期鼻炎または喘息反応などの同
様の二相ＩｇＥ−依存反応は、特定のアレルゲンによる局所抗原投与の後、アト
ピー性患者の上部および下部気道に発生する。マスト細胞は、血管に対する肺胞
表面に近接して配置されている。マスト細胞は、状態に影響を及ぼし、炎症反応
を促進することによって、肺脈管構造に影響を与えることがある。免疫的または
非免疫的刺激によって活性化されたマスト細胞は、ヒスタミン、中性プロテアー
ゼ、ペルオキシダーゼ、Ｏ_２、ＰＡＦおよびエイコサノイド（たとえばＬＴＢ４
、ＬＴＣ４、ＰＧＤ２、ＴＸＡ２）およびサイトカイン（たとえばＩＬ−４、Ｉ
Ｌ−５、ＴＮＦａ）などの使用済みおよび新たに生成された多数のメディエータ
を脱顆粒化および放出し、これらは肺炎症を媒介する。

【０１０４】 上記のネズミモデルは、ヒト喘息の主要な特徴を再現している。後期アレルゲ
ン固有肺病は、オボアルブミン（ＯＶＡ）をアレルゲンとして使用して、正常な
ＢＡＬＢ／ｃマウスにて誘発した。あるプロトコルは、第１日目と第１４日目の
ｉ．ｐ．ＯＶＡを用いたマウスの免疫化、第１４、２５、２６および２７日目の
ＯＶＡの鼻腔内投与を含む。第２８日目にＯＶＡ処置マウスは、アレルゲン誘起
喘息に著しく似ている、以下の事項を含む疾患を示す：（１）全体およびＯＶＡ
固有のＩｇＥの循環レベルの上昇、（２）ＢＡＬ液中のＬＴＢ４およびＬＴＣ４
の放出の上昇、（３）ＢＡＬ液および肺柔組織への顕著な好酸球流入、（４）細
気道の粘液閉塞、（５）気管支リンパ節組織における、Ｔ−ヘルパー細胞タイプ
２（Ｔｈ２）サイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１３）の発現上昇
およびサイトカイン内Ｔｈ１の発現低下、（６）気道コンダクタンスの著しく迅
速な低下および対照マウスに比較したメタコリン投与量の増加との動的適合によ
って評価される、肺反応亢進。

【０１０５】 マウスはＩｇＥ媒介アレルギー性気道反応の発生に対しても感受性である。好
酸球の後期流入はこのネズミモデルでも再現され、アレルギー性気道疾患は、以
前に腹膜内でオボアルブミンに感作させたマウスにオボアルブミンを吸入させた
後に発生する。メタコリンまたはアセチルコリン抗原投与に対する気道反応性も
、抗原に対して気道を曝露した後に免疫化マウスにおいて上昇する。

【０１０６】 アレルゲン誘起気道炎症のマウスモデルでは、気道の好酸球浸潤、粘液放出お
よびメタコリンに対する反応亢進におけるマスト細胞の役割を調査した。小型の
ペプチドＨＫ−Ｘが、マスト細胞顆粒化および気道の好酸球浸潤を防止するメカ
ニズムによる粘液放出防止の鍵であることがわかった。

【０１０７】 上述の物質を使用した。マウスは第０日および第１４日に、硫酸アルミニウム
カリウム（ａｌｕｍ）によって錯化したＯＶＡ ０．２μｌ（１００μｇ）を腹
腔内注射した。第１４、２５、２６および２７日に、マウスに正常生理的食塩水
に加えたケタミン（０．４４ｍｇ／ｍｌ）／キシラジン（６．３ｍｇ／ｍｌ）０
．２ｍｌ ｉ．ｐ．によって麻酔をかけた後、第２５、２６および２７日に、０
．０５ｍｌ正常生理的食塩水にＯＶＡ１００μｇを加えて鼻腔投与した。第２８
日の最後の鼻腔抗原投与の２４時間後に、肺組織を採取した。対照グループは第
０日および第１４日にａｌｕｍを含む正常生理的食塩水を鼻腔投与し、第１４、
２５、２６および２７日にａｌｕｍを含まない正常生理的食塩水を鼻腔投与した
。ＯＶＡ誘起喘息に対するＨＫ−Ｘの効果を評価するために、第２５、２６およ
び２７日の各鼻腔抗原投与の３０分前に、ＨＫ−Ｘ（１０μｇ／ｍｌ）を鼻腔投
与した。

【０１０８】 主幹気管支で左肺を縛った後、右肺を正常生理的食塩水で３階洗浄した。プー
ルしたサンプルの０．０５ｍｌ分割量による気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液細胞は
、血球計算板を使用してカウントし、残りの液は４℃にて２００ｇで１０分間遠
心分離した。１０％ＢＳＡを含む正常生理的食塩水中で細胞ペレットを再懸濁さ
せた後、スライドグラス上にＢＡＬ細胞塗沫を作成した。好酸球を着色するため
に、乾燥スライドを５〜８分間、Ｄｉｓｃｏｍｂｅの希釈液（蒸留水中の０．０
５％水性エオシンおよび５％（体積／体積）アセトン）によって着色し、水で０
．５分間すすぎ、０．０７メチレンブルーによって２分間対比染色した。

【０１０９】 ＢＡＬの後、気管および左肺（上葉および下葉）を採取し、２０℃の１０％緩
衝ホルマリン溶液中で１８時間固定化した。組織を処理し、パラフィン中に包埋
した後、組織を５μｍの切片に切断し、上述したようにＤｉｓｃｏｍｂｅ溶液で
染色し、メチレンブルーで対比染色するか、ヘマトキシリンおよびエオシンを用
いて染色した。気道単位面積（２２００μｍ２）当たりの好酸球数は、以前述べ
たように形態計測によって決定した。気道粘液は、各種の染色方法、すなわちメ
チレンブルー、ヘマトキシリンならびにエオシン、ムチカルミン、トルイジンブ
ルー、アルシアンブルーおよびアルシアンブルー／過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）
反応によって確認した。ムチンはムチカルミン溶液で染色した；メタニルイエロ
ー対比染色を採用した。ムチンおよびシアリン酸を多く含む非硫酸化粘液性物質
は、ｐＨ４．５のトルイジンブルーを用いて異染的に染色した。酸性ムチンおよ
び硫酸化ムチンは、ｐＨ２．５のアルシアンブルーを用いて染色した；ニューク
リアファーストレッド対比染色を使用した。中性および酸性粘液性物質は、ｐＨ
２．５のアルシアンブルーおよびＰＡＳ反応によって確認した。気道（直径０．
５〜０．８ｍｍ）の粘液による閉塞度も、形態計測によって評価した。気道直径
の粘液による閉塞百分率は、０〜＋＋＋＋＋の半定量的スケールで分類した。組
織および形態計測分析プロトコル設計は、プロトコル設計がわからないようにさ
れた人々によって実施された。

【０１１０】 ＢＡＬ液の粘液糖タンパク質は、前述したようにスロットブロッティングおよ
びＰＡＳ染色によって分析した。ニトロセルロース膜（孔径０．２μｍ；Ｓｃｈ
ｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ， Ｋｅｅｎｅ， ニューハンプシャー州）は
蒸留水、次に正常生理的食塩水で湿らせてから、Ｍｉｎｉｆｏｌｄ ＩＩ ７２
ウェルスロットブロット装置（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ）内に配
置した。ＢＡＬ液サンプル（０．０５ｍｌ）およびヒト呼吸ムチン糖タンパク質
の原液（２μｇ／ｍｌ）の分割量（０．０５〜０．７５ｍｌ）をニトロセルロー
ス膜上に、水吸引真空によってブロッティングし、粘液糖タンパク質はＰＡＳ反
応によって視覚化した。ＰＡＳ染色を定量化するために、反射率濃度測定を実施
した。画像を取込んで、ＨＰ ＤｅｓｋＳｃａｎ ＩＩソフトウェア（Ｍｉｃｒ
ｏｓｏｆｔ Ｗｉｎｄｏｗｓ ＴＭ バージョン）を用いてＳｃａｎＪｅｔ Ｉ
Ｉｃｘスキャナ（Ｈｅｗｌｅｔｔ Ｐａｃｋａｒｄ、パロアルト、カリフォルニ
ア州）によってデジタル化した。本システムは、Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ Ｐｌｕｓ
、Ｖｅｒｓｉｏｎ １．１ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ ＴＭ Ｓｏｆｔｗａｒｅ
（Ｍｅｄｉａ Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、シルバースプリング、メリーランド州
）を採用したＤｅｌｌＤｉｍｅｎｓｉｏｎ ＸＰＳ Ｐ９０コンピュータ（Ｄｅ
ｌｌ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、オースティン、テキサス州）に接続した。画像
は、超高解像度グラフィックスモードを装備したＤｅｌｌ ＵｌｔｒａＳｃａｎ
１ ７ＥＳモニタ（１２８０ｘ１０２４ピクセル、７８．９ｋＨｚ水平走査周波
数、７４−Ｈｚ垂直走査周波数）を使用して２５６グレーレベルスケールで評価
した。ＢＡＬサンプルのＰＡＳ反応度の面積強度は、ヒト呼吸ムチンの標準曲線
と比較して定量化した。

【０１１１】 ＯＶＡによる腹腔内免疫化は、ＢＡＬＢ／Ｃマウスの血液中に検出可能なレベ
ルのＯＶＡ固有ＩｇＥを生じる。間接ＥＬＩＳＡを採用して、ＯＶＡ固有ＩｇＥ
血清抗体力価を決定した。ＥＬＩＳＡプレート（ＩＣＮ、コスタメサ、カリフォ
ルニア州）は、ｐＨ８．３の０．１Ｍ ＮａＨＣＯ緩衝液で希釈したＯＶＡ（２
０ｍｇ／ｍｌ）によってコーティングし、４℃で１８時間培養した。３回洗浄し
た後、プレートをｐＨ７．４の１％ＢＳＡのＰＢＳ溶液を用いて３７℃にて２時
間培養した。１％ＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中での血清サンプルの連続希釈液をプレ
ートに加え、４℃で１８時間培養した後に、再度洗浄した。ウェルは、５％ヤギ
血清（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、ゲーサーズバーグ、メリーランド州）／ＰＢＳ緩衝
液で希釈したＨＲＰ（ホースラディッシュペルオキシダーゼ）結合ラット抗マウ
スＩｇＥモノクローナル抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州サンデ
ィエゴ）を用いて、室温で２時間培養した。３，３’，５，５’−テトラメチル
ベンジン基質を用いてウェルを発現させ、６１０ｎｍにて吸収を決定した。各分
析の内部標準物質は、ＯＶＡ免疫化ＢＡＬＢ／Ｃマウスによるプールされた血清
より構成された。

【０１１２】 肺機能データは、保護最小有意差法（Ｓｔａｔｖｉｅｗ ＩＩ、Ａｂａｃｕｓ
Ｃｏｎｃｅｐｔｓ、バークレー、カリフォルニア州）を用いた分散分析（ＡＮ
ＯＶＡ）によって評価した。この方法は複数のｔ−統計量を使用して、考えられ
るすべての２つ１組の比較を評価するもので、同一または異なるペアサイズに適
用できる。もう片方のデータは、組合せ実験の平均＋ＳＥとして報告されている
。有意差は、独立平均用のＳｔｕｄｅｎｔの両側検定について分析された。

【０１１３】 結果 アレルゲン固有ＩｇＥの生成。ＯＶＡ固有ＩｇＥ（１２．９＋０．３Ｕ／ｍｌ
、ｎ＝５）は、第０および１４日にＯＶＡおよびａｌｕｍを腹腔投与したマウス
の血液中および第２５、２６および２７日にＯＶＡを鼻腔投与したマウスの血液
中で、第２８日に検出された。これに対して、生理的食塩水ならびにａｌｕｍに
よる腹腔投与および生理的食塩水（ｎ＝６）による鼻腔投与で処置した対照マウ
スでは、抗−ＯＶＡ ＩｇＥは検出されなかった。

【０１１４】 アレルゲン誘導による気道炎症。アレルゲンによって誘導される気道の炎症を
組織学的に評価するために、肺組織およびＢＡＬ液を、２８日目に、すなわち、
２５日目、２６日目および２７日目の３回の連続したｉ．ｎ．ＯＶＡ投与の最後
から２４時間後に得た。光学顕微鏡により、好酸球による気管支間質の顕著な浸
潤が認められた（図８Ｃ）。好酸球の気管支上皮粘液層への流入（図９Ｄ）およ
びＢＡＬ液もまた認められた。

【０１１５】 ＯＶＡ感作／投与のマウスにおいては、ＢＡＬ液細胞の６１．０＋５．０％（
ｎ＝１０）が好酸球であり、これと比較して、生理食塩水が投与された対照動物
では０．８＋０．３％（ｎ＝１０）であった（ｐ＝０．０００１）。

【０１１６】 気道の粘液閉塞が、ＯＶＡを気管支投与した後の免疫化マウスで生じていた（
図１０）。下部（図９Ｂ）および上部（図９Ｃ、９Ｄ）の両方の肺気道における
気道粘液放出が別の組織学的染色法により同定された：ムシカルミン染色による
ムチン、トルイジンブルーによる酸性非硫酸化ムコ物質、アルシアンブルーによ
る酸性硫酸化ムコ物質（図１０）、およびアルシアンブルー／ＰＡＳ反応による
中性ムコ物質および酸性ムコ物質。粘液による気道腔閉塞は、下部気道の方が大
きかった。これらの炎症変化は、アルムとともに生理食塩水（図８Ｂ）またはＯ
ＶＡ（示さず）のいずれかを用いてｉ．ｐ．処置されたｉ．ｎ．生理食塩水投与
の対照動物では見られなかった。

【０１１７】 ＨＫ−Ｘ阻害は気道における好酸球浸潤および粘液蓄積を阻止する。ＨＫ−Ｘ
による炎症阻害は、ＯＶＡ感作／投与マウスの肺組織への好酸球流入およびＢＡ
Ｌ液を顕著に低下させ、そしてこれらの動物における気道粘液放出をも防止した
（図８Ａ、９Ａ、１０Ａ）。

【０１１８】 好酸球浸潤。形態計測分析により、肺間質への好酸球流入が、ＨＫ−Ｘ処置に
より９０％低下した（ｐ＜０．００６、ＨＫ−Ｘを伴わないＯＶＡ処置と比較し
た場合）（図１１）。ＳＬＯ Ｚｉｌｅｕｔｏｎは、ＢＡＬ液における好酸球の
数を８２％低下させた（ｐ＜０．００４、ＯＶＡ Ｚｉｌｅｕｔｏｎと比較した
場合）（図１１）。ＨＫ−Ｘで処置されたＯＶＡ感作／投与マウスから得られる
ＢＡＬ液における好酸球の数は０．５７＋０．１１Ｘ１０^５と測定され、ＯＶＡ
免疫化／生理食塩水投与の場合には０．１６＋０．０３Ｘ１０^５（対照マウス）
と測定された。Ｚｉｌｅｕｔｏｎは、ＯＶＡ感作／投与マウスのＢＡＬ液に回収
された好酸球を８９％低下させた（ｐ＝０．０１２８、ｚｉｌｅｕｔｏｎを伴わ
ないＯＶＡと比較した場合；データ示さず）。ビヒクル対照（Ｚｉｌｅｕｔｏｎ
研究用のＴｒａｐｐｓｏｌＴＭ）は、ＯＶＡ感作／投与マウスにおいて認められ
た肺の好酸球浸潤に影響しなかった。

【０１１９】 粘液蓄積。ＯＶＡ処置マウスおよび対照マウスの左肺の上部肺葉および下部肺
葉の切片を気道における粘液蓄積について光学顕微鏡で調べた。形態計測分析に
より、生理食塩水で処置された対照マウスの気道の６８％は、気道の粘液放出が
認められなかったが、残りは、小さな粘液層が認められただけであった。対照的
に、ＯＶＡ免疫化／投与マウスは気道の広範囲の粘液閉塞の形態学的な証拠を有
していた。ＯＶＡ処置マウスの気道の大部分（７４％）は粘液による気道腔の少
なくとも３０％の閉塞を有していた；これらのマウスの気道の２２％は８０％以
上の粘液閉塞を有していた。ＢＡＬ液に回収された粘液糖タンパク質の量を定量
した場合（図１２）、気道ムチンにおける７倍の増大が、対照マウスと比較した
場合にＯＶＡ処置マウスで明らかにされた（ｐ＝０．００００１、ＯＶＡ対生理
食塩水）。ＨＫ−Ｘ処置により、ＯＶＡ処置マウスにおける気道粘液放出が阻止
された（図８Ａ、９Ａ、１０Ａ）。

【０１２０】 図８Ａ〜８Ｃは、肺組織の組織病理学を示し、各動物群における小ペプチド（
ＨＫ−Ｘ）（ｎ＝８）によるＯＶＡ誘導マウス喘息の処置の有効性を示している
。図８Ａは、ＨＫ−Ｘ処置マウスの肺の写真であり、気道（ＡＷ）および血管（
ＢＶ）の構成体の正常な特徴を示している。

【０１２１】 非常に少数の細胞が気道組織の周辺部（矢印）に位置する（Ｈ＆Ｅ染色、Ｘ１
２）。図８Ｂは、正常な対照として使用された、生理食塩水の注射のみを受けた
マウスの写真である。気道および血管は正常な外見である。少数の細胞が気道組
織に見られる（矢印）（Ｈ＆Ｅ染色、Ｘ１２０）。図８Ｃは、ＯＶＡ免疫化動物
の写真であり、気道組織における特徴的な好酸球およびＴ細胞、単球およびマク
ロファージの浸潤（矢印）による著しい影響を示している。気道は粘液および細
胞により塞がれている（矢印）（Ｈ＆Ｅ染色、Ｘ１２０）。

【０１２２】 図９Ａ〜９Ｄは、マウスに喘息を誘導させた後に小ペプチド（ＨＫＸ）で処置
された肺組織の組織病理学を示す。このデータ群は別のマウス群から得られてい
る。マウスモデルにおける喘息の処置におけるＨＫ−Ｘ化合物の有効性の組織病
理学的証拠が図示されている。ＨＫ−Ｘ化合物は、合計で３日間にわたってＯＶ
Ａを毎日投与することによって気道粘液分泌を防止する。ＨＫ−Ｘはまた、喘息
の発作発症時の細胞浸潤を低下させる。マウスは、１日目および１４日目にＯＶ
Ａで静脈注射および鼻腔内投与により免疫化された。２５日目、２６日目および
２７日目に、マウスにはＯＶＡが投与され、あるいは投与の３０分前に、マウス
には１０μｇのＨＫ−Ｘが鼻腔内に投与された。

【０１２３】 図９Ａは、中サイズの気道（ＡＷ）の顕微鏡写真であり、典型的なＨＫ−Ｘ処
置マウスの肺を示している。ＨＫ−Ｘ処置の肺は、ＯＶＡ処置動物において見ら
れるように、ほとんど病理学的状態を示していない。気道は非常に正常であり、
粘液は腔または上皮細胞表面にほとんど認められないか、または全く認められな
い。気道の実質組織における非常に少量の細胞浸潤が認められる。平滑筋細胞層
は厚さが一様である（Ｈ＆Ｅ染色、Ｘ１５０）。図９Ｂは、ＯＶＡ免疫化および
投与マウスの肺の写真であり、ヒトにおける喘息に典型的な特徴を示している：
部分的に塞がった気道（ＡＷ）腔（矢印）、気道および血管の間質における細胞
浸潤の優勢な特徴、ならびに血管に伴って見られる末梢の水腫（矢印）（Ｈ＆Ｅ
染色、Ｘ７５）。図９Ｃは、喘息マウスの肺の気道の高倍率写真であり、塞がっ
た腔を示している。多数の白血球細胞が気道上皮細胞層の基底領域に存在してい
る（矢印）。多くの好酸球が実質組織に認められ、平滑筋細胞層は厚さが一様で
ない（Ｈ＆Ｅ染色、Ｘ１５０）。図９Ｄは、喘息マウスの部分的な長さ方向に切
開された肺の写真であり、放出された粘液によって気道腔が広範囲に塞がってい
ることを示している（矢印）。細胞浸潤が、上皮細胞層の領域に非常に接近して
存在する（矢印）。平滑筋細胞層は白血球細胞の浸潤により乱され、小さな肉芽
腫が多くの場合形成されている（Ｈ＆Ｅ染色、Ｘ１５０）。

【０１２４】 図１０Ａ〜１０Ｄは、別のマウス群（ｎ＝９）から得られた組織病理学的結果
を示している。ＨＫ−Ｘ化合物がＯＶＡの免疫化および投与によって粘液細胞の
誘導を妨げ、そして気道における粘液分泌を低下させるというさらなる組織病理
学的および組織化学的な証拠が認められる。喘息発作時に、粘液分泌が増大し、
気道が収縮する。粘液の産生は、粘液細胞が気道に現れることによって明かであ
る。アルシアンブルーを使用して、ムコ物質を発現させる硫酸化グルコサミング
ルカンが染色される。図１０Ａは、ＨＫ−Ｘ処置された喘息マウスの肺の写真で
あり、気道（ＡＷ）腔が塞がっていないこと、細胞外物質が腔内に存在していな
いことを示している。隣接した血管（ＢＶ）もまた見られない。正常な外見は、
細胞浸潤または水腫液がないことを示している（Ｈ＆Ｅ染色、Ｘ１５０）。図１
０Ｂは、図１０Ａに見られる同じ気道の連続切片であり、上皮細胞におけるムコ
物質を局在化するためにｐＨ２．４においてアルシアンブルーで染色されている
。少数の陽性細胞が腔内に見られるだけである（矢印）。青色陽性物質の突発性
の薄層が認められる（アルシアンブルーおよびニュートラルレッド染色、Ｘ１５
０）。図１０Ｃは、ＯＶＡ免疫化および投与のマウスの肺の写真であり、腔にお
ける収縮した気道および粘液分泌を示している（矢印）。多数の白血球が肺組織
に認められる。その多くは好酸球である（Ｈ＆Ｅ染色、Ｘ１５０）。図１０Ｄは
、図１０Ｃに示されるのと同様な切片であり、収縮した気道におけるムコ物質を
示すためにアルシアンブルーで染色されている。粘液の厚い層が、上皮細胞表面
の近くに付着している（矢印）。より多くの青色陽性細胞がそこに見られる。こ
のことは、粘液細胞のはるかに大きな割合が気道腔に現れていることを示してい
る。粘液で満たされた長さ方向の小さな気道もまたこの切片において見られるこ
とに留意されたい（アルシアンブルー＆ニュートラルレッド染色、Ｘ１５０）。

【０１２５】 図１１は、ＯＶＡ誘導された喘息マウスから回収された肺胞における炎症細胞
の分布を示す。図１２は、ＯＶＡ誘導された喘息マウスの気道における気道閉塞
スコアを示す。図１３は、ＯＶＡ誘導された喘息マウスの気道における白血球の
遊走を示す。図１４は、ＯＶＡ誘導された喘息マウスの肺洗浄から回収された全
細胞を示す。

【０１２６】 誘導されたＩＩ型コラーゲン関節炎のマウスモデル マウスモデルが、誘導されたＩＩ型コラーゲン関節炎の組織化学的、Ｘ線撮影
的および臨床的な外見に対する本発明の化合物の効果を評価するために使用され
る。

【０１２７】 自己免疫疾患は、著しい慢性的な病的状態および障害を引き起こす。関節炎は
、その多くの形態で、自己免疫疾患の家系に典型的である。臨床的な領域におい
て、慢性関節リウマチ（ＲＡ）は、重篤な関節異形成疾患の最も一般的な形態で
ある。すべての臨床医は、ＲＡが進行性疾患であることを認めている。

【０１２８】 ネズミＣＩＡに生じる関節炎病巣の組織病理学は、ヒト患者におけるＲＡの組
織病理学との多数の類似性を有する。従って、ネズミＣＩＡは、ＲＡの潜在的な
治療的処置を研究するために受け入れられるモデルである。

【０１２９】 材料および方法 マウス：体重が２５グラムのＤＢＡ／１（２）雄性マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥまたはＢ＆Ｋ Ｕｎｉ
ｖｅｒｓａｌ、Ｋｅｎｔ、ＷＡ）がこの研究に使用される。このマウス系統は、
異種のＩＩ型コラーゲンを注射することによってＣＩＡに対して感受性になる。
ウシコラーゲン（ＢＣ）、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）および不完全
フロイントアジュバント（ＩＣＦＡ）はＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌから得る
ことができる。免疫化用抗原は０．１Ｍ酢酸で処理され、ＣＦＡまたはＩＣＦＡ
と配合される。

【０１３０】 関節炎の誘導 免疫化プロトコル：マウスには、研究期間中、１００μｇのＩＩ型コラーゲン
がＣＦＡにおいて所定間隔で注射される。

【０１３１】 マウスは関節炎の発症について所定間隔で調べられる。関節炎の推定的な証拠
には、２回の連続した観察での、前肢および／または後肢における少なくとも１
つの指関節の腫大および紅斑が含まれる。

【０１３２】 関節炎の確認診断 関節の組織学的試験：適切な間隔で屠殺された動物の指関節を取り出し、固定
し、脱灰し、パラフィンに包埋し、切片にして、一般的な細胞特徴および構造的
特徴を観察するために、そして適する場合には、各関節のパンヌスの軟骨マトリ
ックスを検出するために染色する。細胞性の程度および炎症領域を、組織学的な
顕微鏡写真のデジタル化を使用し、上記に記載される面積および点の標準的な計
測技術を適用して定量する。 ＩＩ型コラーゲンによる免疫感作後の関節変化の発生を検出するため、足指関
節のＸ線撮影評価を実施する。乳房撮影画像化システムが、この作業のため修飾
されている。コンピュータデジタル化Ｘ線写真の分析により、関節の軟組織（パ
ンヌス）の平均面積を決定し、同時に、各Ｘ線写真に含まれる内部標準との比較
により、隣接する硬組織の密度の変化を決定する。変化する硬組織の密度及びパ
ンヌスの面積の基線対照として用いるために、同期間にわたり付加的なマウスを
使用し、密度及び面積のデータを比較する。対照マウスと実験マウスの密度及び
面積の差の有意性を、各時点において、対Ｔ検定（ｐａｉｒｅｄ Ｔ−ｔｅｓｔ
ｓ）を使用して査定する。

【０１３３】 関節炎の評価 関節炎の開始について、動物を毎日観察する。各前足への影響の重度を０から
４までのスケールで段階付けすることにより関節炎指数を導出する。スコア化は
、関節周囲の紅斑及び水腫、並びに関節の変形の程度に基づく。一定張力（ｃｏ
ｎｓｔａｎｔ ｔｅｎｓｉｏｎ）カリパスを用いて、内果から外果までの足根関
節の厚さを測定することにより、後足の腫脹も定量する。

【０１３４】 実験設計 化合物ＨＫ−Ｘの抗関節炎効果を査定するため、最も適切な輸送メカニズムに
関するヒト患者での経験に基づき、投与経路を選択する。

【０１３５】 ＨＫ−Ｘ及びプレドニゾロンの用量：治療レベル外及びおそらく治療レベルで
ある用量のペプチドを、経皮（ＴＣ）（吸着）経路及び足への注射の両方により
、限局された部位へ置く。関節内空間への直接的な注射は、あまりに外傷性が強
いため、アーチファクトを作製するには不適である。従って、関節内空間と隣接
するフットパッド（ＦＰ）への薬物の注射が、選択された方法論である。対照マ
ウスにも、陽性対照として、プレドニゾロン（実験的及び臨床的な自己免疫疾患
の治療において証明されている強力な抗炎症剤）を注射する。

【０１３６】 まず、１０匹からなる群の各マウス（及び対照）に、５０日間、毎日コラーゲ
ンを注射する。３日目及び１８日目に、５又は１０μｇ／ｋｇの化合物ＨＫ−Ｘ
を含む０．１Ｍ酢酸溶液１ｍｇ／ｍｌをマウスに注射する。５０日目に、組織学
的研究のためマウスを放血する。

【０１３７】 次いで、それぞれ１０匹のマウスからなる８個の群（Ａ〜Ｉ）を、以下の特定
のプロトコルに従い治療する。

【０１３８】 群Ａは、１°ＣＦＡ＋ＢＣ、２°ＩＣＦＡ＋ＢＣで免疫感作し、治療は施さな
い（対照）。

【０１３９】 群Ｂは、１°ＣＦＡ＋ＢＣ、２°ＩＣＦＡ＋ＢＣで免疫感作し、２°ＩＣＦＡ
＋ＢＣの次の日に、５ｍｇ／ｋｇのプレドニゾロンの投与を開始し、２０日間続
行する。

【０１４０】 群Ｃは、１°ＣＦＡ＋ＢＣ、２°ＩＣＦＡ＋ＢＣで免疫感作し、２°ＩＣＦＡ
＋ＢＣの次の日に、４ｍｇ／ｋｇ（高用量）の化合物ＨＫ−ＸのＴＣ投与を開始
し、２０日間続行する。

【０１４１】 群Ｄは、１°ＣＦＡ＋ＢＣ、２°ＩＣＦＡ＋ＢＣで免疫感作し、２°ＩＣＦＡ
＋ＢＣの次の日に、０．４ｍｇ／ｋｇ（低用量）の化合物ＨＫ−ＸのＴＣ投与を
開始し、２０日間続行する。

【０１４２】 群Ｅは、１°ＣＦＡ＋ＢＣ、２°ＩＣＦＡ＋ＢＣで免疫感作し、２°ＩＣＦＡ
＋ＢＣの次の日に、４ｍｇ／ｋｇ（高用量）の化合物ＨＫ−ＸのＴＣ投与を開始
し、２０日間続行する。

【０１４３】 群Ｆは、１°ＣＦＡ＋ＢＣ、２°ＩＣＦＡ＋ＢＣで免疫感作し、２°ＩＣＦＡ
＋ＢＣの次の日に、０．４ｍｇ／ｋｇ（低用量）の化合物ＨＫ−ＸのＴＣ投与を
開始し、２０日間続行する。

【０１４４】 群Ｇは、１°ＣＦＡ、２°ＩＣＦＡで免疫感作し、２°ＩＣＦＡ＋ＢＣの次の
日に、１０ｍｌのＤＭＳＯのＴＣ投与を開始し、２０日間続行する（対照）。

【０１４５】 群Ｈは、１°ＣＦＡ、２°ＩＣＦＡで免疫感作し、２°ＩＣＦＡ＋ＢＣの次の
日に、１０ｍｌのＤＭＳＯのＦＰ投与を開始し、２０日間続行する（対照）。

【０１４６】 群Ｉは、１°ＣＦＡ、２°ＩＣＦＡで免疫感作し、２°ＩＣＦＡ＋ＢＣの次の
日に１０ｍｌの生理食塩水のＦＰ投与を開始し、２０日間続行する（対照）。

【０１４７】 ２°免疫感作の直後及び屠殺の直前に、各群の動物のＸ線写真を撮影する。屠
殺後、適宜、足を切除し、組織学的検査のため処理する。化合物ＨＫ−Ｘによる
治療は、関節炎の程度を減少させることが見出される。

【０１４８】 本発明の好ましい実施形態を参照しつつ、本発明を詳細に説明した。しかし、
本明細書及び図面を考慮することにより、当業者が、請求の範囲により定義され
る本発明の本旨及び精神の範囲内で、修飾及び改良を行いうることが理解されよ
う。

【図面の簡単な説明】

【図１】 化合物７８／８０の各種濃度についての毛細管透過性の面積を示すｌｏｇ用量
−反応曲線である。

【図２】 各種濃度のｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅによる毛細管透過性の抑制についての
用量−反応曲線である。

【図３】 各種濃度の本発明の好ましいペプチドによる毛細管透過性の抑制についての用
量−反応曲線である。

【図４】 更にマスト細胞顆粒消失の抑制を示すアラキドン酸代謝の主要経路の概略図で
ある。

【図５Ａ】 ＯＶＡ誘発気管支喘息マウスモデルで使用した標準の異なるプロトコルの概略
図である。

【図５Ｂ】 ＯＶＡ誘発気管支喘息マウスモデルで使用した分解の異なるプロトコルの概略
図である。

【図６Ａ】 処置マウス及び対照マウスにおけるＯＶＡ誘発喘息を抑制する本発明化合物の
処置の比較組織検査を示す顕微鏡写真である。

【図６Ｂ】 処置マウス及び対照マウスにおけるＯＶＡ誘発喘息を抑制する本発明化合物の
処置の比較組織検査を示す顕微鏡写真である。

【図６Ｃ】 処置マウス及び対照マウスにおけるＯＶＡ誘発喘息を抑制する本発明化合物の
処置の比較組織検査を示す顕微鏡写真である。

【図６Ｄ】 処置マウス及び対照マウスにおけるＯＶＡ誘発喘息を抑制する本発明化合物の
処置の比較組織検査を示す顕微鏡写真である。

【図７】 マウス喘息マデルにおける粘液プラグの形成に対する本発明の治療結果を示す
ヒストグラムである。

【図８Ａ】 喘息を誘発後本発明に従って処置したマウスの肺組織の組織検査を示す。

【図８Ｂ】 喘息を誘発後本発明に従って処置したマウスの肺組織の組織検査を示す。

【図８Ｃ】 喘息を誘発後本発明に従って処置したマウスの肺組織の組織検査を示す。

【図９Ａ】 喘息を誘発後本発明に従って処置した第２群のマウスの肺組織の組織検査を示
す。

【図９Ｂ】 喘息を誘発後本発明に従って処置した第２群のマウスの肺組織の組織検査を示
す。

【図９Ｃ】 喘息を誘発後本発明に従って処置した第２群のマウスの肺組織の組織検査を示
す。

【図９Ｄ】 喘息を誘発後本発明に従って処置した第２群のマウスの肺組織の組織検査を示
す。

【図１０Ａ】 喘息を誘発後本発明に従って処置した第３群のマウスの肺組織の組織検査を示
す。

【図１０Ｂ】 喘息を誘発後本発明に従って処置した第３群のマウスの肺組織の組織検査を示
す。

【図１０Ｃ】 喘息を誘発後本発明に従って処置した第３群のマウスの肺組織の組織検査を示
す。

【図１０Ｄ】 喘息を誘発後本発明に従って処置した第３群のマウスの肺組織の組織検査を示
す。

【図１１】 ＯＶＡ誘発喘息マウスから回収した肺胞中の炎症細胞の分布を示すグラフであ
る。

【図１２】 ＯＶＡ誘発喘息マウスの気道中の気道プラグスコアを示すグラフである。

【図１３】 ＯＶＡ誘発喘息マウスの気道中の白血球遊走を示すグラフである。

【図１４】 ＯＶＡ誘発喘息マウスの肺洗浄から回収した全細胞を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 17/00 Ａ６１Ｐ 17/06 17/04 17/16 17/06 19/02 17/16 27/16 19/02 35/00 27/16 37/06 35/00 37/08 37/06 43/00 １１１ 37/08 Ｃ０７Ｋ 5/083 43/00 １１１ 5/103 Ｃ０７Ｋ 5/083 Ａ６１Ｋ 37/02 5/103 37/40 // Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ， ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ， ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，Ｕ Ｚ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 クラゲツト，ジエームズ アメリカ合衆国、ワシントン・98290、ス ノホミツシユ、サウス・イースト、ワンハ ンドレツドアンドサーテイナインス・アベ ニユー・5615 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA20 4C084 AA02 AA19 BA08 BA15 BA16 MA02 NA14 ZA34 ZA59 ZA66 ZA89 ZA96 ZB11 ZB13 4H045 AA10 BA12 BA13 EA22

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 哺乳動物におけるアレルギー反応の治療方法において、該哺
   乳動物に対して、抗アレルギー的に有効量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘを有する
   ペプチドであってＸがＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−
   Ｔｙｒからなる群から選択されるものを投与する段階を有することを特徴とする
   方法。
2. 【請求項２】 前記アレルギーが、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、薬物感受性
   および食物感受性からなる群から選択される請求項１に記載の方法。
3. 【請求項３】 前記ペプチドとの併用で別の有効成分を投与し、該有効成分
   が抗ロイコトリエン類、β_２作働薬およびコルチコステロイド類からなる群から
   選択される請求項１に記載の方法。
4. 【請求項４】 哺乳動物における皮膚炎症の治療方法において、抗炎症的に
   有効量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘを有するペプチドであってＸがＴｙｒ、Ｔｙ
   ｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択されるも
   のを該哺乳動物に対して投与する段階を有することを特徴とする方法。
5. 【請求項５】 前記皮膚炎症が、皮膚炎、湿疹、乾癬、接触皮膚炎、日焼け
   および加齢からなる群から選択される請求項３に記載の方法。
6. 【請求項６】 前記ペプチドとの併用で別の有効成分を投与し、該有効成分
   が抗ロイコトリエン類、β_２作働薬およびコルチコステロイド類からなる群から
   選択される請求項４に記載の方法。
7. 【請求項７】 骨関節炎、乾癬性関節炎、狼瘡および脊椎関節炎からなる群
   から選択される関節炎の治療方法において、抗関節炎的に有効量の式ｆ−Ｍｅｔ
   −Ｌｅｕ−Ｘを有するペプチドであってＸがＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−
   ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択されるものを哺乳動物に対して
   投与する段階を有することを特徴とする方法。
8. 【請求項８】 前記ペプチドとの併用で別の有効成分を投与し、該有効成分
   が抗ロイコトリエン類、β_２作働薬およびコルチコステロイド類からなる群から
   選択される請求項７に記載の方法。
9. 【請求項９】 患者における慢性閉塞性肺疾患の治療方法において、治療上
   有効量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘを有するペプチドであってＸがＴｙｒ、Ｔｙ
   ｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択されるも
   のを該患者に対して投与する段階を有することを特徴とする方法。
10. 【請求項１０】 前記ペプチドとの併用で別の有効成分を投与し、該有効成
    分が抗ロイコトリエン類、β_２作働薬およびコルチコステロイド類からなる群か
    ら選択される請求項９に記載の方法。
11. 【請求項１１】 患者における慢性炎症性腸疾患の治療方法において、治療
    上有効量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘを有するペプチドであってＸがＴｙｒ、Ｔ
    ｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択される
    ものを該患者に対して投与する段階を有することを特徴とする方法。
12. 【請求項１２】 前記ペプチドとの併用で別の有効成分を投与し、該有効成
    分が抗ロイコトリエン類、β_２作働薬およびコルチコステロイド類からなる群か
    ら選択される請求項１１に記載の方法。
13. 【請求項１３】 患者の気道における好酸球浸潤の阻害方法において、気道
    好酸球浸潤阻害上有効量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘを有するペプチドであって
    ＸがＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群
    から選択されるものを該患者に対して投与する段階を有することを特徴とする方
    法。
14. 【請求項１４】 患者の気道中への粘液放出の阻害方法において、気道粘液
    放出阻害上有効量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘを有するペプチドであってＸがＴ
    ｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選
    択されるものを該患者に対して投与する段階を有することを特徴とする方法。
15. 【請求項１５】 リンパ球のＩｇＥ活性化遮断方法において、ＩｇＥ活性化
    遮断上有効量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘを有するペプチドであってＸがＴｙｒ
    、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択さ
    れるものと前記リンパ球とを接触させる段階を有することを特徴とする方法。
16. 【請求項１６】 前記リンパ球が、大食球、単核球、好酸球、好中球および
    ＴＮＦからなる群から選択される請求項１５に記載の方法。
17. 【請求項１７】 リンパ球の細胞膜を安定化させることでＩｇＥ抗原攻撃に
    対する炎症反応亢進への該リンパ球のさらなる関与を防止する方法において、細
    胞安定化上有効量の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘを有するペプチドであってＸがＴ
    ｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選
    択されるものと前記リンパ球とを接触させる段階を有することを特徴とする方法
    。
18. 【請求項１８】 前記リンパ球が、大食球、単核球、好酸球、好中球および
    ＴＮＦからなる群から選択される請求項１７に記載の方法。
19. 【請求項１９】 Ｔ細胞移動の阻害方法において、Ｔ細胞移動阻害上有効量
    の式ｆ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｘを有するペプチドであってＸがＴｙｒ、Ｔｙｒ−Ｐ
    ｈｅ、Ｐｈｅ−ＰｈｅおよびＰｈｅ−Ｔｙｒからなる群から選択されるものと前
    記Ｔ細胞とを接触させる段階を有することを特徴とする方法。
20. 【請求項２０】 前記Ｔ細胞がＣＤ４⁻細胞である請求項１９に記載の方法
    。