ES2326500T3 - Pequeños peptidos y metodos para el tratamiento del asma y la inflamacion. - Google Patents
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Abstract
Composición farmacéutica para el tratamiento terapéutico que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y un péptido de fórmula f-Met-Leu-X, donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe- Phe y Phe-Tyr, siendo f N-formilo.
Description
Pequeños péptidos y métodos para el tratamiento
del asma y la inflamación.
Esta invención se refiere a pequeños péptidos
con actividad inhibidora la de degranulación de mastocitos y a
métodos para el tratamiento de la inflamación, y en concreto a
péptidos N-formil-metionil útiles
para el tratamiento de la inflamación. Más en particular, la
invención se refiere a métodos para el tratamiento de enfermedades
o estados que implican la degranulación de mastocitos, incluyendo
por ejemplo asma, artritis reumatoide y anafilaxis.
El asma es un trastorno complejo. En los ataques
de asma y sus exacerbaciones inflamatorias están implicados
factores tanto hereditarios como ambientales -alergias, infecciones
virales, agentes irritantes. Más de la mitad de los asmáticos
(adultos y niños) tienen alergias; en efecto, la alergia a los
excrementos de los acáridos del polvo en las casas representa un
importante factor en el desarrollo de la enfermedad y en la
aparición de exacerbaciones. La infección por el virus sincitial
respiratorio durante la infancia también está muy relacionada con
el desarrollo del asma y, a menudo, las infecciones virales
respiratorias desencadenan episodios agudos.
La introducción hace tres décadas de los
agonistas broncodilatadores beta_{2}-agonistas
adrenérgicos selectivos de los receptores beta_{2} revolucionó el
tratamiento del asma. Estos agentes demostraron ser más potentes y
de acción más prolongada (4-6 horas) que los
agonistas de los receptores adrenérgicos no selectivos, tales como
isoproterenol, que estimula los receptores adrenérgicos tanto alfa
como beta. Los beta_{2}-agonistas producen un
alivio sintomático rápido y protegen también contra la
broncoconstricción aguda provocada por estímulos tales como el
ejercicio o la inhalación de aire muy frío. La frecuencia de uso
puede servir también de indicador para el control del asma.
Recientemente, se ha introducido en Estados Unidos un
beta_{2}-agonista-salmeterol de
acción extremadamente prolongada (duración de hasta 12 horas). El
salmeterol es tan potente que puede ocultar las señales
inflamatorias; por tanto, debería utilizarse junto con un
antiinflamatorio.
La teofilina es un broncodilatador relativamente
débil con un margen terapéutico estrecho (se recomienda la
comprobación de los niveles sanguíneos para evitar la toxicidad) y
es propenso a interacciones medicamentosas (la competición de las
enzimas metabolizantes de fármacos del citocromo hepático P450
altera los niveles plasmáticos de varios medicamentos importantes
metabolizados por este mismo sistema).
El asma moderada se trata con corticosteroides
antiinflamatorios de inhalación diaria o con un inhibidor de
mastocitos (cromolina sódica o nedocromil) más un
beta_{2}-agonista inhalado según sea necesario
(3-4 veces al día) para aliviar el avance de los
síntomas del asma inducida por alergenos o por el ejercicio. La
cromolina sódica y el nedocromil bloquean el broncoespasmo y la
inflamación, pero normalmente sólo son eficaces para el asma
relacionada con alérgenos o con el ejercicio y, por ello,
típicamente sólo para asmáticos juveniles. Los corticosteroides
inhalados mejoran la inflamación, la hiperreactividad de las vías
aéreas, así como la obstrucción, y reducen el número de crisis
agudas. Sin embargo, se necesita un mes para que los efectos sean
evidentes y hasta un año para que se produzca una notable mejora.
Los efectos secundarios más frecuentes son la ronquera y la
candidiasis oral. Se han indicado efectos secundarios más graves
-supresión adrenal parcial, inhibición del crecimiento y formación
ósea reducida- pero sólo con el uso de dosis más altas. La
beclometasona, la triamcinolona y la flunisolida tienen
probablemente una potencia mg-por-mg
similar; las nuevas autorizaciones para la budesonida y la
fluticasona son más potentes y, según los informes recibidos, tienen
menos efectos secundarios sistémicos.
Incluso los pacientes enfermos leves muestran
inflamación de las vías aéreas, incluyendo infiltraciones de la
mucosa y del epitelio por células T activadas, mastocitos y
eosinófilos. Las células T y los mastocitos liberan citocinas, que
favorecen el crecimiento de los eosinófilos y la maduración y la
producción de anticuerpos IgE, y éstos, a su vez, aumentan la
permeabilidad microvascular, rompen el epitelio y estimulan los
reflejos neurales y las glándulas segregadoras de mucosidad. El
resultado es una hiperreactividad de las vías aéreas,
broncoconstricción e hipersecreción, manifestadas por una
respiración jadeante, tos y disnea.
Tradicionalmente, el asma se ha tratado con
broncodilatadores orales e inhalados. Estos agentes alivian los
síntomas del asma, pero no tienen efecto en la inflamación
subyacente. El reconocimiento en los últimos 10 años de la
importancia de la inflamación en la etiología del asma ha llevado a
un aumento del uso de corticosteroides, pero muchos pacientes
siguen padeciendo un asma incontrolada.
Los científicos han determinado que los
leucotrienos (de los cuales existen los subtipos A, B, C, D y E)
desempeñan un papel crucial en el asma. Provocan espasmos en los
músculos lisos de las vías aéreas, un aumento de la permeabilidad
vascular, edemas, un aumento de la producción de mucosidad, una
reducción del transporte mucociliar y la quimiotaxis de los
leucocitos.
Al igual que los compuestos de prostaglandina
relacionados, los leucotrienos son sintetizados a partir del ácido
araquidónico en la membrana celular. El ácido araquidónico en los
mastocitos, eosinófilos, macrófagos, monocitos y basófilos se forma
a partir de los fosfolípidos de la membrana mediante la activación
de la fosfolipasa A2. Después de su formación, el ácido
araquidónico experimenta un metabolismo a través de dos vías
mayores: la vía de la ciclooxigenasa (que produce varias
prostaglandinas y tromboxanos) y la vía
5-lipooxigenasa (que produce leucotrienos). Se
muestra un esquema del metabolismo del ácido araquidónico en la Fig.
4. Las prostaglandinas, tromboxanos y leucotrienos se conocen
colectivamente como eicosanoides.
Los antileucotrienos son elementos de una clase
heterogénea de agentes antiasmáticos con la posibilidad de
interferir en los pasos iniciales de la cascada inflamatoria. Los
leucotrienos son sustancias inflamatorias relacionadas con las
prostaglandinas; ambas se generan a partir del ácido araquidónico en
las membranas celulares. Después de que se forme el ácido
araquidónico en los mastocitos, eosinófilos, macrófagos, monocitos y
basófilos, es metabolizado a través de dos importantes vías: (1)
una vía de la ciclooxigenasa (que produce prostaglandinas y
tromboxanos) y (2) la vía 5-lipooxigenasa que
produce leucotrienos en el citoplasma. Los leucotrienos son bien
conocidos en medicina como sustancia de reacción lenta de anafilaxis
("SRS-A"). Los leucotrienos desempeñan un
papel importante en la inflamación bronquial. Inducen la migración,
la adhesión y la agregación de diversos glóbulos blancos (por
ejemplo neutrófilos, eosinófilos y monocitos) en los vasos
sanguíneos, aumentan la permeabilidad capilar y provocan la
constricción de los músculos lisos bronquiales y de los vasos. Los
resultados incluyen edema intersticial, quimiotaxis de los
leucocitos, producción de mucosidad, disfunción mucociliar y
broncoespasmo en los pulmones. Ciertas clases de leucotrienos, por
ejemplo los leucotrienos cisteinilo (LTD_{4}), son
broncoconstrictores particularmente potentes, siendo aproximadamente
de 100 a 1.000 veces más activos que las histaminas. Los
leucotrienos, incluidos los leucotrienos cisteinilo, son liberados
de los mastocitos durante la degranulación.
Se están investigando y utilizando
comercialmente diversos antileucotrienos que bloquean los receptores
de leucotrienos o que impiden la síntesis de los leucotrienos
bloqueando la enzima 5-lipooxigenasa. Los
inhibidores de leucotrienos son de acción heterogénea: algunos
bloquean la 5-lipooxigenasa directamente, otros
inhiben la proteína que activa la 5-lipooxigenasa y
algunos desplazan el araquidonato de su sitio de unión a la
proteína. Los antagonistas de los leucotrienos, por el contrario,
bloquean los receptores mismos que son mediadores en la
hiperactividad, la broncoconstricción y la hipersecreción de las
vías aéreas.
Los mastocitos de pulmón humano producen el
factor de necrosis tumoral (TNF), IL-4 e
IL-5 después del estímulo de IgE in vitro
(Chest 1997; 112:523-29). El análisis
inmunohistoquímico en especímenes de biopsia endobronquial ha
confirmado esto, además de la producción de IL-6.
Además, los recuentos de mastocitos y el TNF son estadísticamente
más significativos en los asmáticos en comparación con sujetos
normales. El TNF e IL-4 pueden potenciar la
sobrerregulación de la expresión de la molécula-1 de
adhesión celular vascular (VCAM-1) -molécula de
adhesión de la superfamilia de las inmunoglobulinas- en la capa
endotelial de la vasculatura bronquial. Los eosinófilos, basófilos
y células mononucleares muestran la integrina antígeno 4 de
activación muy tardía (VLA-4) en sus superficies
celulares, que interactúa con la VCAM-1. Así, a
través de la interacción
VLA-4/VCAM-1, TNF e
IL-4 facilitan el reclutamiento de leucocitos
circulantes. La capacidad de los mastocitos para liberar las
citocinas preformadas (TNF) ante el estímulo mediado por IgE o para
sintetizar rápidamente otras (IL-4,
IL-5) podría ser el evento inicial que lleva a la
inflamación bronquial. De hecho, la inducción y la activación de los
clones TH2, a través de otra producción de citocinas, facilita la
activación y el reclutamiento de los eosinófilos, que actúan como
efectores terminales de la reacción inflamatoria. A su vez, las
citocinas producidas por los leucocitos (células TH2, en
particular) afectan profundamente al desarrollo, la activación y el
cebado de los mastocitos mucosales, favoreciendo así un bucle
proinflamatorio positivo. Los descubrimientos recientes de que los
mastocitos humanos producen IL-8 y de que los
mastocitos pulmonares murinos expresan tanto las quimiocinas,
proteína-1 quimioatractiva de monocitos como la
proteína 1 inflamatoria de macrófagos. Esto sugiere que, aparte de
las citocinas clásicamente implicadas en el reclutamiento de
leucocitos (IL-4, IL-5, TNF), los
mastocitos generan también factores quimioatractivos adicionales
potentes en las vías aéreas, actuando en los eosinófilos y
leucocitos polimorfonucleares (IL-8). Además, debido
a que las quimiocinas que actúan como factores liberadores de
histamina provocan la degranulación de mastocitos, pueden soportar
además un bucle de activación autocrino.
Los mastocitos también desempeñan un papel clave
en el crecimiento de células-B (como los basófilos)
para proporcionar el contacto celular necesario, junto con
IL-4, para la síntesis de IgE in vitro, lo
que sugiere que los mastocitos pueden regular directamente la
producción de IgE independientemente de las
células-T, y pueden, con la reticulación de IgE,
generar una cantidad suficiente de IL-4 para iniciar
una respuesta local de TH2, considerándose que el subconjunto de
células-T desempeña un papel central en el asma
atópica. Además, los mastocitos pueden actuar también como células
presentadoras de antígenos para los linfocitos-T, lo
que sugiere un papel aun más importante para los mastocitos en la
red inmune del asma.
Se ha informado de la inhibición de la
degranulación de mastocitos por
N-formil-metionil-leucil-fenilalanina
en Inflammation, Vol. 5, Nº 1, pp. 13-17. Allí se
indica que dos péptidos quimiotácticos estructuralmente diferentes,
a saber pepstatina y
N-formil-metionil-leucil-fenilalanina,
inhiben el aumento de la permeabilidad vascular producido por una
inyección intradérmica 40/80 de suero anti-IgE de
rata o el factor de permeabilidad aniónica macromolecular aislado
del tejido pulmonar en crías de rata. Se ha indicado también que
parece que estos péptidos actúan directamente sobre los
mastocitos.
Además, el informe revisado de Casale, T.B. y
col. en Annals of Allergy, Vol. 51, Nº 1, pp. 2-6,
ofrece un resumen de los trabajos que investigan el papel de los
mediadores de los mastocitos en la patogénesis del asma
alérgica.
\newpage
Kermode, J.C. y col., en Journal of Leucocyte
Biology, Vol. 43, pp. 420-428 (1988) y en
Biochemistry Journal, Vol. 276, pp. 715-723 (1991)
publicaron un estudio de unión in vitro de pequeños péptidos
formilo a los receptores en neutrófilos en conejos. El primer
estudio indicó que
f-Met-Leu-Phe-Phe
se une rápidamente y de forma saturable a los mismos receptores de
los neutrófilos como
f-Met-Leu-Phe y
f-Nle-Leu-Phe. En el
segundo estudio, se descubrió que mientras la mayoría de los
péptidos formilo quimiotácticos se unen a su receptor de
neutrófilos de una manera heterogénea, aquellos con mayor potencia
muestran un modelo de unión homogéneo.
Anderson, R.P. y col., en Digestive Diseases and
Sciences, Vol. 37, No. 2, pp. 248-256 (1992),
publicaron un estudio sobre la actividad de la estructura in
vivo con referencia a la excreción hepatobiliar de pequeños
péptidos. Se descubrió que los péptidos no acilados sólo muestran
poca excreción en comparación con los péptidos
N-acilo.
Además, Ferry, D.M. y col., en Gastroenterology,
Vol. 97, pp. 61-67 (1989) publicaron un estudio
in vivo referente a pequeños péptidos con respecto a la
barrera de la mucosa intestinal. En esta publicación se investigó
la absorción intestinal y la circulación enterohepática de
f-Met-Leu-^{125}I-Tyr,
análogo sintético de
f-Met-Leu-Phe.
Debido a la importancia de tratar las
enfermedades inflamatorias en seres humanos, particularmente, por
ejemplo, el asma, artritis y la anafilaxis, se buscan continuamente
nuevos compuestos bioactivos que tengan menos efectos secundarios.
La inhibición de la degranulación de mastocitos mediante la
intervención de los nuevos péptidos de la presente invención en el
contexto del proceso inflamatorio del asma se describe visualmente
en la Fig. 4.
La presente invención proporciona nuevas
composiciones farmacéuticas que contienen, en un soporte
farmacológico adecuado, un péptido
N-formil-metionil-leucil
("f-Met-Leu") con actividad
inhibidora de la degranulación de mastocitos. Estos péptidos
particularmente útiles son aquellos de fórmula
f-Met-Leu-X, donde X
se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr,
Tyr-Phe, Phe-Phe y
Phe-Tyr. Estos péptidos son útiles para el
tratamiento de la inflamación y, en particular, para el tratamiento
de la inflamación relacionada con el asma, la artritis y la
anafilaxis. Estos péptidos son también útiles para tratar la
enfermedad de obstrucción pulmonar crónica y la enfermedad
inflamatoria crónica del intestino.
De acuerdo con la presente invención, un método
para tratar la inflamación en un mamífero comprende la
administración al mamífero de una cantidad eficaz antiinflamatoria
de un péptido de fórmula
f-Met-Leu-X, donde X
se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr,
Tyr-Phe, Phe-Phe y
Phe-Tyr. Para tratar la inflamación relacionada con
el asma, un modo preferente de administración es por inhalación.
Para tratar la inflamación relacionada con la artritis, un modo
preferente de administración es la aplicación tópica o la inyección
intradérmica, utilizando un soporte farmacológico adecuado.
La presente invención también proporciona un
método para inhibir la degranulación de mastocitos. El método
comprende la puesta en contacto de los mastocitos con una cantidad
inhibidora de la degranulación del péptido con fórmula
f-Met-Leu-X, donde X
se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr,
Tyr-Phe, Phe-Phe y
Phe-Tyr.
Además, la presente invención proporciona
asimismo un método para la inhibición de la liberación de citocinas,
histaminas y leucotrienos. El método para inhibir la liberación de
citocinas comprende la administración al paciente de una cantidad
inhibidora eficaz de la liberación de citocinas de un péptido de
fórmula f-Met-Leu-X,
donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr,
Tyr-Phe, Phe-Phe y
Phe-Tyr. El método para inhibir la liberación de
histaminas comprende la administración al paciente de una cantidad
eficaz inhibidora de la liberación de histaminas de un péptido de
fórmula f-Met-Leu-X,
donde X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr,
Tyr-Phe, Phe-Phe y
Phe-Tyr. El método para inhibir la liberación de
leucotrienos comprende la administración al paciente de una
cantidad eficaz inhibidora de la liberación de leucotrienos de un
péptido de fórmula
f-Met-Leu-X, donde
X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr,
Tyr-Phe, Phe-Phe y
Phe-Tyr.
De acuerdo con otra realización, la invención
proporciona un método para reducir la adhesión, la migración y la
agregación de los linfocitos, eosinófilos y neutrófilos a un sitio
de inflamación en un paciente. El método comprende la
administración al paciente de una cantidad inhibidora
terapéuticamente eficaz de un péptido de fórmula
f-Met-Leu-X, donde X
se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr,
Tyr-Phe, Phe-Phe y
Phe-Tyr.
Igualmente, la invención proporciona un método
para reducir la producción de anticuerpos IgE y la reducción o
bloqueo de la reticulación de IgE en el sitio de inflamación en un
paciente. El método comprende la administración al paciente de una
cantidad inhibidora eficaz de la producción de anticuerpos IgE de un
péptido de fórmula
f-Met-Leu-X, donde X
se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr,
Tyr-Phe, Phe-Phe y
Phe-Tyr.
Además, la presente invención proporciona un
método para inhibir el aumento de la permeabilidad vascular en el
sitio de inflamación en un paciente. El método comprende la
administración al paciente de una cantidad inhibidora eficaz de la
permeabilidad vascular de un péptido de fórmula
f-Met-Leu-X, donde X
se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr,
Tyr-Phe, Phe-Phe y
Phe-Tyr.
En ciertas realizaciones preferentes de la
presente invención, los pacientes con inflamación crónica pueden
beneficiarse de la administración del péptido de la presente
invención en combinación con otro ingrediente activo. Otros
ingredientes activos particularmente útiles para esta combinación de
acuerdo con la presente invención son, por ejemplo,
antileucotrienos, beta_{2}-agonistas,
corticosteroides y similares.
Fig. 1: curva logarítmica
dosis-respuesta que ilustra la zona de permeabilidad
capilar para diversas concentraciones del Compuesto 48/80.
Fig. 2: curva dosis-respuesta
para la inhibición de la permeabilidad capilar por diversas
concentraciones de
f-Met-Leu-Phe.
Fig. 3: curva dosis-respuesta
para la inhibición de la permeabilidad capilar por diversas
concentraciones de un péptido preferente de la presente
invención.
Fig. 4: esquema ilustrativo de las vías
metabólicas más importantes del ácido araquidónico, ilustrando
además la inhibición de la degranulación de los mastocitos.
Fig. 5A y 5B esquemas ilustrativos de los
distintos protocolos Standard (5A) y Resolución (5B) utilizados en
el Modelo de Asma Bronquial inducida por OVA en ratones.
Fig. 6A-6D: micrografías que
ilustran la histopatología comparativa de un tratamiento con un
compuesto de la presente invención que inhibe el asma inducida por
OVA en ratones tratados y ratones control.
Fig. 7: histograma que muestra los resultados
para el tratamiento de acuerdo con la presente invención sobre la
formación de tapones de mucosidad en un modelo de asma murina.
De acuerdo con la presente invención, se ha
descubierto que ciertos pequeños péptidos de fórmula
f-Met-Leu-X, donde
X se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr,
Tyr-Phe, Phe-Phe y
Phe-Tyr, sorprendentemente tienen la actividad de
inhibir la degranulación de mastocitos. Como consecuencia, estos
péptidos inhiben la liberación de las citocinas (tales como, por
ejemplo, TNF), así como de las histaminas y leucotrienos, y son
útiles para el tratamiento de la inflamación que puede resultar de
varias indisposiciones, tales como, por ejemplo, asma, artritis y
anafilaxis. Estos péptidos son útiles también para el tratamiento de
la enfermedad pulmonar obstructiva crónica y la enfermedad
inflamatoria crónica del intestino.
De acuerdo con las realizaciones preferentes de
la presente invención, los péptidos también pueden reducir la
infiltración de eosinófilos, basófilos y neutrófilos en los tejidos
inflamatorios. Los linfocitos, eosinófilos y neutrófilos no
muestran quimiotaxis en respuesta a los péptidos preferentes de la
presente invención. Además, los compuestos preferentes de la
presente invención no muestran toxicidad hacia órganos vitales tales
como corazón, hígado y
pulmones.
pulmones.
Los péptidos de esta invención se pueden
preparar mediante técnicas convencionales de la química de pequeños
péptidos. Los péptidos, cuando se utilizan para la administración,
se preparan en condiciones asépticas con un vehículo o diluyente
farmacéuticamente aceptable.
Las dosis de las composiciones farmacéuticas
varían dependiendo del sujeto y de la vía particular de
administración utilizada. Las dosificaciones pueden oscilar de 0,1
a 100.000 \mug/kg al día, especialmente de 1 a 10.000 \mug/kg.
Las dosificaciones especialmente preferentes oscilan entre
aproximadamente 1 y 100 \mug/kg, en particular entre
aproximadamente 1 y 10 \mug/kg de peso corporal. Las
dosificaciones se administran típicamente una vez al día cada
4-6 horas, dependiendo de la gravedad de la
condición. Para los estados agudos, es preferente administrar el
péptido cada 4-6 horas. Para el mantenimiento o uso
terapéutico, puede resultar preferente una administración de sólo
una o dos veces al día. Preferentemente, se administran de
aproximadamente 0,18 a aproximadamente 16 mg de péptido por día,
dependiendo de la vía de administración y de la gravedad de la
condición. Los intervalos de tiempo deseados para el suministro de
múltiples dosis de una composición particular pueden ser
determinados por un especialista medio en la técnica mediante una
experimentación rutinaria.
La administración se realiza por vía oral,
parenteral, rectal, intravaginal, tópica, nasal, oftálmica, por
inyección directa, etc. En una realización preferente, los péptidos
de esta invención se administran al paciente en una cantidad
antiinflamatoria eficaz o en una dosificación que inhibe la
degranulación de los mastocitos. Una composición farmacéutica
típica es una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido de
acuerdo con la presente invención que proporciona un efecto
antiinflamatorio o que inhibe la degranulación de los mastocitos,
normalmente incluyendo un vehículo farmacéuticamente aceptable.
El término "vehículo farmacéuticamente
aceptable" tal como se emplea aquí, y descrito de forma más
completa a continuación, incluye una o más sustancias encapsulantes
o diluyentes de carga sólidos o líquidos compatibles adecuados para
la administración a un humano o animal. En la presente invención, el
término "vehículo" indica por tanto un ingrediente orgánico o
inorgánico, natural o sintético, con el cual se combinan las
moléculas de la invención para facilitar su aplicación. El término
"cantidad terapéuticamente eficaz" es aquella cantidad de las
presentes composiciones farmacéuticas que produce un resultado
deseado o que ejerce una influencia deseada sobre la condición
particular que se esté tratando. Se pueden utilizar diversas
concentraciones para preparar las composiciones que incorporen el
mismo ingrediente con el fin de prever la posibilidad de variaciones
en la edad del paciente a tratar, la gravedad de su estado, la
duración del tratamiento y el modo de administración.
El vehículo también debe ser compatible. El
término "compatible" tal como se emplea aquí significa que los
componentes de las composiciones farmacéuticas pueden mezclarse con
los pequeños péptidos de la presente invención y entre sí de un
modo tal que no se perjudique sustancialmente la eficacia
farmacéutica deseada.
Los pequeños péptidos de la invención se
utilizan típicamente en sí mismos (solos). Sin embargo, se pueden
administrar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable. Estas
sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a,
aquellas preparadas a partir de los siguientes ácidos: clorhídrico,
bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, maleico, acético,
salicílico, p-toluensulfónico, tartárico, cítrico,
metanosulfónico, fórmico, malónico, succínico,
naftaleno-2-sulfónico y
bencenosulfónico. Asimismo, se pueden preparar sales
farmacéuticamente aceptables como sales de metales alcalinos o
alcalinotérreos, tales como sales sódicas, potásicas o cálcicas del
grupo ácido carboxílico. Así, la presente invención proporciona
composiciones farmacéuticas para uso médico que comprenden los
péptidos de la invención junto con uno o más vehículos
farmacéuticamente aceptables de los mismos y opcionalmente
cualquier otro ingrediente terapéutico.
Las composiciones incluyen aquellas para la
administración oral, rectal, intravaginal, tópica, nasal, oftálmica
o parenteral, pudiendo utilizarse todas ellas como vías de
administración utilizando los materiales de la presente invención.
Las composiciones farmacéuticas que contienen los péptidos de la
presente invención contienen también uno o más vehículos
farmacéuticamente aceptables, que pueden incluir excipientes tales
como estabilizantes (para favorecer el almacenamiento a largo
plazo), emulsionantes, agentes de unión, agentes espesantes, sales,
conservantes, disolventes, medios de dispersión, recubrimientos,
agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la
absorción e isotónicos y similares. La utilización de estos medios y
agentes para las sustancias activas farmacéuticas es bien conocida
en la técnica. Excepto en la medida en que algún medio o agente
convencional sea incompatible con el péptido de esta invención, se
contempla aquí su uso en preparaciones farmacéuticas. Se pueden
incorporar también ingredientes activos adicionales en las
composiciones de la presente invención.
Para el tratamiento del asma son preferentes
aquellas composiciones adecuadas para la administración oral.
Típicamente, estas composiciones se preparan como aerosol de
inhalación, vahos, jarabes o tabletas. Para el tratamiento de la
artritis son preferentes aquellas composiciones adecuadas para la
administración tópica, aunque pueden resultar adecuadas
composiciones orales. Típicamente, estas composiciones tópicas se
preparan como cremas, ungüentos o soluciones.
Las composiciones se pueden presentar
apropiadamente en forma de dosificación unitaria y pueden ser
preparadas por medio de cualquiera de los métodos bien conocidos en
la técnica farmacéutica. Los métodos incluyen típicamente el paso
de poner los ingredientes activos de la invención en relación con un
vehículo, el cual constituye uno o más ingredientes
adicionales.
Las composiciones de la presente invención
adecuadas para la administración por inhalación pueden presentarse,
por ejemplo, como aerosoles o soluciones para inhalación. Un ejemplo
de una típica composición en aerosol consiste en la cantidad
deseada del péptido microcristalino suspendido en una mezcla de
tricloromonofluorometano y diclorodifluorometano más ácido oleico.
Un ejemplo de solución típica se compone de la cantidad deseada del
péptido disuelto o suspendido en una solución salina estéril
(opcionalmente un 5% en volumen/volumen aproximadamente de
dimetilsulfóxido ("DMSO") para la solubilidad), cloruro de
benzalconio y ácido sulfúrico (para ajustar el pH).
Las composiciones de la presente invención
adecuadas para la administración oral se pueden presentar también
como unidades individuales, tales como cápsulas, pastillas, tabletas
o grageas, conteniendo cada una una cantidad predeterminada del
péptido de la invención, o que puedan estar contenidas en liposomas
o como suspensión en un licor acuoso o en un líquido acuoso tal
como un jarabe, un elixir o una emulsión. Un ejemplo de formulación
base en forma de tableta incluye almidón de maíz, lactosa y
estearato de magnesio como ingredientes inactivos. Un ejemplo de
formulación base en forma de jarabe incluye ácido cítrico, tinte
colorante, agente aromatizante, hidroxipropilmetilcelulosa,
sacarina, benzoato de sodio, citrato de sodio y agua purificada.
Las composiciones adecuadas para la
administración parenteral comprenden apropiadamente una preparación
acuosa estéril de la molécula de la invención que preferentemente
es isotónica con la sangre del receptor. Esta preparación acuosa se
puede formular de acuerdo con métodos conocidos utilizando aquellos
agentes dispersantes o humectantes adecuados, así como agentes de
suspensión. La preparación inyectable estéril puede ser también una
solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o
disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo como
solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y
disolventes aceptables que se pueden emplear, se encuentran agua,
solución Ringer y una solución isotónica de cloruro sódico. En las
soluciones acuosas se puede utilizar hasta aproximadamente un 10%
en volumen/volumen de DMSO o Trappsol para mantener la solubilidad
de ciertos péptidos. Asimismo, se pueden emplear convencionalmente
aceites estériles no volátiles como disolventes o medios de
suspensión. Con este propósito, se puede emplear una cantidad de
aceites no volátiles, incluyendo mono- o
di-glicéridos sintéticos. Además, se pueden utilizar
ácidos grasos (tales como ácido oleico o ácidos grasos neutros) en
la preparación de inyectables. Además, los copolímeros Pluronic en
bloque se pueden formular con lípidos a 4ºC para la inyección
compuesta en base a un tiempo de liberación de la forma sólida a
37ºC durante un período de tiempo de semanas o meses.
Las composiciones adecuadas para la
administración tópica se pueden presentar como una solución del
péptido en Trappsol o DMSO, o en crema, ungüento o loción.
Típicamente, se incorpora en la base o vehículo de aproximadamente
un 0,1 a aproximadamente un 2,5% de ingrediente activo. Un ejemplo
de formulación base en forma de crema incluye agua purificada,
petrolato, alcohol de bencilo, alcohol de estearilo, propilenglicol,
miristato de isopropilo, polioxil 40 estearato, carbómero 934,
lauril sulfato de sodio, acetato de disodio, hidróxido de sodio y
opcionalmente DMSO. Un ejemplo de formulación base en forma de
ungüento incluye petrolato blanco y opcionalmente aceite mineral,
sesquioleato de sorbitano y DMSO. Un ejemplo de formulación base
para lociones incluye carbómero 940, propilenglicol, polisorbato
40, estearato de propilenglicol, colesterol y esteroles asociados,
miristato de isopropilo, palmitato de sorbitano, alcohol de
acetilo, trietanolamina, ácido ascórbico, simeticona y agua
purificada.
El asma inducida por alergia resulta de la
exposición a sustancias (alérgenos) a las cuales un organismo se ha
vuelto hipersensible. La exposición a un alérgeno resulta en la
degranulación de los mastocitos en el pulmón, liberando
leucotrienos e histaminas. En respuesta a la liberación de
leucotrienos e histaminas, la permeabilidad capilar aumenta
sorprendentemente y el plasma sanguíneo sale de los capilares en los
tejidos circundantes. Los síntomas respiratorios que derivan de
este nivel de exposición son desde suaves (picazón y estornudos) a
potencialmente mortales (asma), incluyendo en los casos crónicos
extremos la muerte por anafilaxis.
Para demostrar este fenómeno de forma
experimental, se sustituye el pulmón por piel de rata. En este
modelo, el plasma sanguíneo de la rata experimental se marca con un
colorante azul de tripano. Este colorante soluble es llevado en la
sangre como marcador pasivo del plasma mismo y está excluido de las
células vivas. En circunstancias normales, los vasos sanguíneos
intactos, incluido el sistema capilar, conservan este colorante. Se
inyecta en la piel un compuesto que induce la degranulación de los
mastocitos (que resulta en la liberación de leucotrienos e
histaminas) para simular una degranulación inducida por alérgenos.
En estos experimentos se utilizó con este propósito el Compuesto
48/80. Como consecuencia de la liberación de leucotrienos e
histaminas, aumenta la permeabilidad capilar, y el plasma, teñido
de azul, sale de los capilares y colorea de azul la piel que rodea
el lugar de inyección. La zona azulada es una medida de la cantidad
del Compuesto 48/80 inyectada.
Se puede ensayar un compuesto en busca de la
actividad "anti-leucotrieno" y/o
"anti-histamina" mediante su mezcla con el
Compuesto 48/80 antes de la inyección. Si el compuesto de prueba
inhibe la liberación de leucotrienos o histaminas, se observa una
zona azulada de diámetro más pequeño en comparación con un lugar de
inyección en la misma rata donde se ha inyectado el Compuesto 48/80
sin ningún compuesto de prueba. En el caso de una alta actividad
anti-leucotrieno y anti-histamina,
el azulado puede ser realmente inhibido en su totalidad.
Se llevó a cabo y validó un modelo de piel de
rata. Se sometieron a prueba varios péptidos a una dosis
predeterminada en busca de la actividad
anti-leucotrieno y/o anti-histamina.
La dosis seleccionada permitió una comparación general con
f-Met-Leu-Phe, que
era el compuesto estándar para la comparación.
Se llevó a cabo una valoración
"dosis-respuesta" de varios compuestos y se
comparó con el compuesto estándar. La observación de una
disminución de la permeabilidad capilar en serie en las zonas
tratadas utilizando dosis en serie más pequeñas del compuesto
inhibidor putativo valida la inhibición de la liberación de
leucotrienos y/o histaminas observada en la prueba inicial con una
dosis predeterminada.
Se obtuvieron los reactivos de Sigma o Aldrich,
con excepción de la cetamina, anestésico veterinario, que se obtuvo
de varios suministradores veterinarios. Las ratas utilizadas eran
machos de raza Sprague-Dawley, de
220-240 g en el momento de la compra a B&K
International.
Para la reacción de la piel de rata, se
anestesiaron las ratas con 0,25 ml de cetamina a 10 mg/ml. Se
administró en una vena de la cola 1,0 ml de azul de tripano en
solución salina (estéril filtrada) y se afeitó el lomo de la rata.
Se utilizaron para la prueba y para las inyecciones control cuatro
puntos de inyección intradérmica.
Se preparó el compuesto 48/80 como una solución
stock de 1,5 mg/ml en solución salina. Se descubrió que este
material era potencialmente inestable en la solución acuosa y se
preparó nueva todos los días. Se prepararon diluciones seriales en
la solución salina hasta los niveles de aplicación justo antes de la
inyección de cada rata.
Se prepararon los péptidos como una solución
stock 23 mM en DMSO y se almacenaron a -20ºC entre experimentos. En
el momento de su uso, se descongelaron las soluciones stock
congeladas y se añadieron partes alícuotas apropiadas a las
diluciones del Compuesto 48/80, junto con cantidades adecuadas de
DMSO, para que resultara en una proporción de 5 \mul de DMSO con
respecto a 0,1 ml de Compuesto 48/80 acuoso. Esto resultó en una
solución al 5% de DMSO, necesaria para mantener la solubilidad de
ciertos péptidos. Los experimentos de control demostraron que el
efecto del DMSO al 5% era nulo.
Para las inyecciones, 0,1 ml del Compuesto
48/80, +/- los compuestos de prueba se inyectaron intradérmicamente
en ratas anestesiadas, teñidas y afeitadas. Después de 15 minutos de
incubación, se sacrificaron las ratas por dislocación cervical, se
extrajo la piel dorsal y se colocó en una caja de iluminación. Se
digitalizó una imagen de la piel retroiluminada utilizando una
vídeo cámara de captura CCD y un hardware/software compatible. Se
analizó la imagen digitalizada utilizando un paquete de software
para análisis científico de gráficos, se integraron las zonas de
permeabilidad capilar (azuladas) y se obtuvieron los valores
digitales para otro análisis.
Se generó una curva
dosis-respuesta utilizando el Compuesto 48/80 a
varias dosis desde aprox. 0,01 \mug hasta aprox. 15 \mug. Se
muestran los resultados en la Fig. 1. Se observó una amplia
variabilidad en el diámetro de las zonas de permeabilidad capilar
para cada dosis del Compuesto 48/80 basada en variaciones de una
rata a otra (por ejemplo el espesor de la piel). Se seleccionó una
dosis de 0,15 \mug del Compuesto 48/80 para realizar otras
pruebas.
Se preparó una curva
dosis-respuesta para el compuesto estándar,
f-Met-Leu-Phe,
utilizando la dosis seleccionada de 0,15 \mug del Compuesto
48/80. Se sometieron a prueba dosis de 0 a aproximadamente 230 nM de
f-Met-Leu-Phe y se
muestran los resultados en la Fig. 2. Se mostró claramente la
inhibición de la degranulación inducida por el Compuesto 48/80.
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplos
2-11
Se sometieron a prueba varios péptidos
f-Met-Leu en busca de la inhibición
de la degranulación inducida en el modelo de piel de rata mediante
la utilización de 100 nanomoles del péptido de prueba y una dosis de
0,15 \mug del Compuesto 48/80. Se incluyó en cada rata, para cada
experimento, una dosis control 48/80 con cero péptidos, y el % de
inhibición se expresó en términos relativos con respecto a este
control (0% de inhibición). Se determinó también el porcentaje de
degranulación de mastocitos producida por 48/80. Los resultados se
exponen en la tabla siguiente.
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\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó una curva
dosis-respuesta para
f-Met-Leu-Phe-Phe
utilizando la dosis seleccionada de 0,15 \mug del Compuesto
48/80. Se sometieron a prueba dosis de 0 a aproximadamente 230 nM de
f-Met-Leu-Phe-Phe
y se muestran los resultados en la Fig. 3. Sorprendentemente, se
mostró claramente la inhibición notable de la degranulación
inducida por el Compuesto 48/80. La inhibición de la degranulación
inducida para
f-Met-Leu-Phe-Phe
era inesperada y sustancialmente mejor que la del compuesto
estándar
f-Met-Leu-Phe.
El asma es una enfermedad compleja que se
caracteriza por la exacerbación espontánea de la obstrucción de las
vías aéreas y una hiperrespuesta bronquial persistente. La
infiltración crónica con T-linfocitos activados,
eosinófilos y macrófagos/monocitos de la submucosa de las vías
aéreas es otra característica establecida. Los mecanismos
inflamatorios, con expresión de las citocinas, así como la
liberación de mediadores inflamatorios, sirven de base a la
patogénesis de la broncoconstricción y la hiperrespuesta bronquial.
Sin embargo, gran parte del mecanismo patogénico sigue sin estar
claros, por ejemplo, los mecanismos que inducen la persistencia de
los síntomas y la inflamación crónica, así como las intervenciones
necesarias para controlar y prevenir la enfermedad.
Se ha reconocido durante mucho tiempo que una
sola exposición a un alérgeno inhalado puede provocar un aumento
agudo de la capacidad de respuesta de la vía aérea en algunos
individuos y modelos animales. Sin embargo, repetidas inhalaciones
de alérgenos han demostrado incrementos más pronunciados,
consistentes y prolongados en la capacidad de respuesta de las vías
aéreas. Este modelo de ratón de inhalaciones repetidas de alérgenos
durante mucho tiempo ha sido utilizado para estudiar el efecto a
largo plazo de las enfermedades alérgicas en el pulmón y para
describir las células, mecanismos, moléculas y mediadores implicados
en la inducción de la hiperrespuesta de las vías aéreas del pulmón
en humanos.
Reactivos: Se obtuvo OVA cristalina de Pierce
Chem. Co. (Rockford, IL), sulfato de aluminio y potasio (alumbre)
de Sigma Chem. Co. (St. Louis, MO), agua destilada libre de
pirógenos de Baxter, Healthcare Corporation (Deerfield, IL),
cloruro sódico al 0,9% (solución salina normal) de Lymphomed
(Deerfield, IL) y Trappsol^{TM} HPB-L100
(hidroxipropil-beta-ciclodextrina
acuosa; solución acuosa al 45% en peso/volumen) de Cyclodextrin
Technologies Development, Inc. (Gainesville, FLA). Se mezcló la OVA
(500 \mug/ml en solución salina normal) con volúmenes iguales de
alumbre al 10% (peso/volumen) en agua destilada. La mezcla (pH 6,5
utilizando NaOH 10N), después de 60 minutos de incubación a
temperatura ambiente, se sometió a centrifugación a 750 g durante 5
minutos; el gránulo se resuspendió hasta el volumen original en
agua destilada y se utilizó en una hora.
El inhibidor selectivo de la
5-lipoxigenasa, Zileuton
(N-[1-benzo[b]tien-2-iletil]-N-hidroxiurea;
J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991; 256: 929-937), fue
amablemente proporcionado por los doctores Bell y George W. Carter
(Abbott Laboratories, Abbott Part, IL). Se disolvió el Zileuton en
Trappsol^{TM}, Histatek Inc. (Seattle, WA) suministró el
inhibidor de degranulación de mastocitos,
f-Met-Leu-Phe-Phe
("HK-X").
Se alojaron ratones hembra BALB/c juntos
(6-8 semanas de edad a la compra; D and K, Seattle
WA) bajo condiciones convencionales para los estudios.
Protocolos de Inmunización/Exposición a
Alérgenos: Los ratones recibieron una inyección i.p. de 0,2 ml
(100 \mug) de OVA con alumbre según los distintos protocolos de
Standard (Fig. 5A) y Resolución (Fig. 5B) (J. Exp. Med. 1996; 184:
1483-1494). De acuerdo con los distintos protocolos,
se anestesiaron los ratones con 0,2 ml i.p. de cetamina (0,44
mg/ml)/xilazina (6,3 mg/ml) en solución salina normal antes de
recibir una dosis intranasal (i.n.) de 100 \mug de OVA en 0,05 ml
de solución salina normal y una dosis i.n. de 50 \mug de OVA en
0,05 ml de solución salina normal separadamente en distintos días.
Se utilizaron dos grupos de control. En consecuencia, el primer
grupo recibió la solución salina normal con alumbre i.p. y la
solución salina normal sin alumbre i.n.; el segundo grupo recibió
OVA con alumbre i.p., OVA sin alumbre i.n. y la solución salina
normal sola.
La tráquea y el pulmón izquierdo (se utiliza el
pulmón derecho para el lavado broncoalveolar ("BAL")) se
obtuvieron y fijaron en una solución de formaldehído neutro al 10%,
a temperatura ambiente, durante 6-15 horas. Después
de su introducción en parafina, se cortaron los tejidos en secciones
de 5 \mum y se procesaron luego con las distintas tinciones o
inmunomarcajes. Se empleó la coloración de Discombe de eosinófilos
para el recuento del número de células con la contracoloración azul
de metileno. El número de eosinófilos por unidad de área de las
vías aéreas (2.200 \mum^{2}) se determinó por morfometría (J.
Pathol. 1992; 166: 395-404; Am. Rev. Respir. Dis.
1993; 147: 448-456). La fibrosis fue identificada
con la tinción tricrómica de Masson. La mucosidad de las vías
aéreas se identificó por el siguiente método de tinción: azul de
metileno, hematoxilina y eosina, mucicarmina, azul alciano, y
reacción de azul alciano/ácido peryódico-Schiff
(PAS) (Troyer, H., "Carbohydrates" in Principles and
Techniques of Histochemistry, Little, Brown and Company, Boston, MA,
1980: 89-121; Sheehan, D.C., y col.,
"Carbohydrates" in Theory and Practice of Histotechnology,
Battle Press, Columbus, OH, 1980: 159-179). Se tiñó
la mucina con una solución de mucicarmina; se empleó la
contracoloración amarillo de metanilo. La mucina ácida y las
mucosustancias sulfatadas se colorearon con azul alciano, pH 2,5; se
utilizó la contracoloración rojo nuclear rápido. Las mucosustancias
neutras y ácidas se identificaron con azul alciano, pH 2,5 y
reacción de PAS. El grado de taponamiento por mucosidades de las
vías aéreas (0,5-0,8 mm de diámetro) fue evaluado
también por morfometría. El porcentaje de oclusión del diámetro de
las vías aéreas por la mucosidad se clasificó en una escala
semicuantitativa de 0 a 4+ tal como se describe en las Leyendas de
las Figuras. Los análisis histológicos y morfométricos fueron
realizados por individuos ciegos al diseño de los protocolos.
Al día 28, 24 horas después de la última
administración i.n. de la solución salina u OVA, se determinó in
vivo la mecánica pulmonar con respecto a la infusión intravenosa
de metacolina en ratones mediante un método pletismográfico
modificado a partir del descrito previamente (10, 1958; 192:
364-368; J. Appl. Physiol. 1988; 64:
2318-2323; J. Exp. Med. 1996; 184:
1483-1494). A la finalización de las pruebas de la
función pulmonar, cada ratón fue exanguinado por punción cardiaca y
se obtuvo tejido pulmonar con tráquea para otros análisis.
Después de desconectar el pulmón izquierdo en el
bronquio principal, se lavó el pulmón derecho tres veces con 0,4 ml
de una solución salina normal. Las células broncoalveolares del
fluido de lavado (BAL) a partir de una parte alícuota de 0,05 ml de
la muestra conjunta se contaron con un hemocitómetro y el fluido
restante se centrifugó a 4ºC durante 10 minutos a 200 g. Se
almacenó el sobrenadante a -70ºC hasta que se realizara el análisis
de eicosanoides. Después de la resuspensión del gránulo celular en
una solución salina normal que contenía seroalbúmina bovina al 10%
("BSA"), se realizaron frotis celulares del BAL en placas de
vidrio. Para teñir los eosinófilos, se colorearon las placas secas
con el fluido de dilución de Discombe (eosina acuosa al 0,05% y
acetona al 5% (volumen/volumen) en agua destilada; J. Exp. Med.
1970; 131: 1271-1287) durante 5-8
minutos, se aclararon con agua durante 0,5 minutos y se
contracolorearon con azul de metileno al 0,07% durante 2
minutos.
Las glicoproteínas de la mucosidad en el fluido
BAL se sometieron a ensayo mediante Slot Blotting y tinción PAS
(Anal. Biochem. 1989; 182: 160-164; Am. J. Respir.
Cell Mol. Biol. 1995; 12: 296-306). Se humedecieron
membranas de nitrocelulosa (tamaño de poro de 0,2 \mum; Schleicher
& Schuell, Keene, NH) en agua destilada y después en una
solución salina normal antes de colocarlas en un equipo slot blot de
72 pocillos Manifold II (Schleicher & Schuell). Muestras del
fluido BAL (0,05 ml) y partes alícuotas (0,05-0,751)
de una solución stock (2 \mum/ml) de glicoproteína de mucina
respiratoria humana (Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1991; 5:
71-79) se secaron sobre las membranas de
nitrocelulosa a vacío por succión de agua y se visualizaron las
glicoproteínas de la mucosidad por reacción PAS. Se realizó una
densitometría de reflectancia para cuantificar la tinción de PAS.
Se analizaron entonces las imágenes mediante un sistema de
procesamiento de imágenes descrito más adelante. La intensidad
integrada de la reactividad de PAS de las muestras de BAL fue
cuantificada mediante la comparación con la curva estándar para la
mucina respiratoria humana.
Anticuerpo monoclonal: se utilizaron CD11c
(método DAB) y Mac1 (Beringer Mannheim, método ABC con Kit
Hitomouse, Zymed) para identificar los tipos de células
inflamatorias, por ejemplo células dendríticas, macrófagos y
linfocitos en/alrededor de zonas de vasculatura, vías aéreas y
fibrosis.
Todas las imágenes fueron capturadas y
digitalizadas mediante un Escáner ScanJetIICX con software HP
DeskScan II (Microsoft® Versión Windows^{TM}) (Hewlett Packard,
Palo Alto, CA). Este sistema se conectó a un ordenador Dell
Dimension XPS P90 (Dell Corporation, Austin, TX) que emplea el
software Image-Pro® Plus, versión 1.1 para
Windows^{TM} (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Las imágenes
se evaluaron en una escala de 256 niveles de grises utilizando un
monitor Dell Ultrascan 17ES en modo de gráfico de resolución extra
alta (1.280 x 1.024 píxeles, 78,9-kHz de frecuencia
de escaneo horizontal, 72 Hz de frecuencia de escaneo vertical).
Para evaluar el papel de los productos
5-lipoxigenasa en la inflamación de las vías aéreas,
se administró i.p. el inhibidor de 5-lipoxigenasa
Zileuton, (35 mg/kg) 30 minutos antes de cada exposición i.n. en los
días según la Fig. 5. En un grupo de animales se administró también
el Zileuton antes de la OVA i.p. El Zileuton a 35 mg/kg inhibe la
liberación de los leucotrienos cisteinilo en un -95% en ratas
pasivamente sensibilizadas con el antígeno BSA administrado i.p.
(J. Pharmacol. Exp. Ther. 1991; 256: 929-937).
Se administró el Compuesto HK-X
a 5 mg/kg y 10 mg/kg utilizando el mismo procedimiento que el
descrito anteriormente.
Se evaluaron los datos sobre la función pulmonar
mediante análisis de variancia (ANOVA) utilizando el método de
diferencia mínima significativa protegida (Statview II, Abacus
Concepts, Berkeley, CA). Este método utiliza una estadística
múltiple t para evaluar todas las comparaciones posibles por pares y
es aplicable tanto a tamaños de pares iguales como desiguales. Los
demás datos se indican como promedio \pm SE de los experimentos
combinados. Se analizaron las diferencias en busca de la
significancia (P < 0,05) mediante wel ensayo t de Student de dos
colas para medios independientes.
El número de eosinófilos de la vía aérea en los
ratones tratado con OVA del grupo de 1, 2 y 3 meses se redujo
notablemente del 44,83% al 37,40% y 19,15% respectivamente (P <
0,025). Aun así, el conteo de eosinófilos es mucho más alto en el
grupo tratado con OVA que en los otros dos grupos en un mismo lapso
de tiempo (P < 0,025). El Zileuton ha podido reducir los
eosinófilos en general en 1-3 meses. Sin embargo, el
compuesto HK-X de la presente invención redujo los
eosinófilos comparativamente al mes, pero de forma mucho más
provechosa a los dos y tres meses.
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Otras células inflamatorias indican una
respuesta inflamatoria no-específica después de la
introducción en la vía aérea de una proteína extraña. Se reclutaron
linfocitos en las vías aéreas pero que estaban virtualmente
ausentes en los grupos de control. Se reclutaron neutrófilos después
de la exposición a OVA en ratones sham-boot
sensibilizados y sensibilizados con OVA, aunque se presentaron
mayores números en las vías aéreas del grupo sensibilizado con OVA.
Se observaron ocasionalmente células gigantes multinucleadas
peculiares (macrófagos fusionados) con núcleos en semiluna
alrededor de la periferia de su citoplasma extensivo. Tanto las
células gigantes de Langhans como los leucocitos o glóbulos se
observaron solamente en animales sensibilizados y expuestos a OVA.
Normalmente estaban presentes en el tejido conectivo asociado a vías
aéreas más grandes. Se observaron ocasionalmente células
plasmáticas en la proximidad de las vías aéreas y en tejidos
linfoides locales.
Mucina: No existía diferencia alguna entre los
tres grupos con el mismo tratamiento, sino un lapso de tiempo
diferente (P > 0,05). El grupo tratado con OVA tenía un
importancia mayor que el de los grupos tratados con la solución
salina, Zileuton (P < 0,05) y el Compuesto
HK-X.
El asma es una condición inflamatoria crónica de
las vías aéreas. En los humanos, una vez establecida, la
hiperrespuesta de la vía aérea puede permanecer estable durante
años. Persiste aparentemente en ausencia de inhalación de
alérgenos, inflamación detectable de las vías aéreas o descamación
epitelial. Por tanto, puede convertirse en permanente debido a
alteraciones irreversibles (o al menos lentamente reversibles) en la
ultraestructura de las vías
aéreas.
aéreas.
En los asmáticos leves, estos episodios o
"ataques" son relativamente poco frecuentes y bien tratados
(invertidos) con broncodilatadores inocuos. La intensidad de una
inflamación subyacente, característica y crónica de las vías aéreas
está asociada, y aparentemente vinculada, a ataques más frecuentes,
intensos y prolongados, que son menos reversibles por los
broncodilatadores. Las razones de ello se han ido aclarando en los
últimos años. La inflamación, que se compone principalmente de un
infiltrado activado o iniciado de los linfocitos Th2, eosinófilos,
mastocitos y posiblemente plaquetas, provocan una dilatación de los
espacios perivasculares (intersticiales) y la liberación de los
factores mediadores/de crecimiento, lo que origina el espesamiento
de la membrana basal, daño epitelial y propagación, producción de
mucosidad viscosa e hiperplasia, iniciando igualmente la
constricción parcial del músculo liso de las vías aéreas. Todas
estas consecuencias aluden a un aumento de la capacidad de
respuesta de las vías aéreas, lo que baja el umbral de respuesta a
los estímulos ambientales, provocando así que los ataques sean más
frecuentes y fuertes.
Todos los cambios morfológicos anteriores
afectarán directa y fuertemente a las funciones pulmonares. En
experimentos basados en el modelo de ratón asmático grave y el
modelo de ratón asmático de larga duración se han observado que los
cambios patofisiológicos significativos de las funciones pulmonares
soportan los cambios morfológicos anteriores. Se descubrió que la
inhalación de alérgenos aumenta la expresión de los eosinófilos y
mastocitos en el endotelio y epitelio alveolar y de las vías
aéreas, e induce asimismo la expresión de la selección E solamente
en el endotelio de las vías aéreas, y tanto la infiltración como el
aumento de eosinófilos en la capacidad de respuesta de las vías
aéreas, y los demás tipos de células inflamatorias (leucocitos o
glóbulos y células gigantes multinucleadas (macrófagos fusionados)
del tipo Langhans), lo que indica una reacción inflamatoria no
específica dentro de los pulmones asmáticos.
El Compuesto HK-X inhibe la
acumulación de mucosidad en la vía aérea de los ratones tratados con
OVA (OVA) y de control. La distribución de la oclusión por
mucosidad de las vías aéreas se determinó en ratones
sham-sensibilizados y expuestos a solución salina
(solución salina, n=4) y ratones sensibilizados/expuestos a OVA en
ausencia (OVA, n=4) o presencia (HK-X/OVA, n=8) de
tratamiento con HK-X. La oclusión por mucosidad del
diámetro de las vías aéreas se sometió a ensayo morfométrico como
sigue: 0, ninguna mucosidad; +, \sim10% de oclusión; ++, 30% de
oclusión; +++,
-60% de oclusión; ++++, -80% de oclusión. Se evaluaron morfométricamente 10 vías aéreas distribuidas aleatoriamente por los pulmones de cada ratón en busca de oclusión por mucosidad.
-60% de oclusión; ++++, -80% de oclusión. Se evaluaron morfométricamente 10 vías aéreas distribuidas aleatoriamente por los pulmones de cada ratón en busca de oclusión por mucosidad.
Las Fig. 6A-6D proporcionan la
evidencia histológica visual de la capacidad del Compuesto
HK-X para inhibir la degranulación de los
mastocitos en ratas inducidas de asma utilizando OVA y, con ello, el
efecto del tratamiento del asma con el Compuesto
HK-X. La Fig. 6A muestra abundante mucosidad
segregada en el lumen de la vía aérea (AW) de los ratones
sensibilizados/expuestos a OVA. La Fig. 6B muestra la infiltración
masiva del tejido intersticial por los eosinófilos y otras células
inflamatorias (indicadas por flechas). La Fig. 6C muestra que la
liberación de mucosidad de la vía aérea en el lumen de la vía aérea
(AW) se reduce notablemente cuando se administra el compuesto
inhibidor HK-X antes de la OVA vía i.n. La
infiltración del tejido intersticial por los eosinófilos se reduce
también después del tratamiento con el Compuesto
HK-X comparado con la exposición a OVA sola
(comparar la Fig. 6C con las Fig. 6A y 6B). La Fig. 6D muestra que
la vía aérea (AW) está libre de mucosidad y de células en los
ratones control tratados con la solución salina. El epitelio
bronquial se infiltra con células de tejido conectivo, pero no se
encuentran leucocitos en el espacio intersticial peribronquial.
Los macrófagos de las vías aéreas mostraron
señales de una gran activación que se parecían a las indicadas en
los macrófagos recuperados en el fluido BAL procedentes de pulmones
de asmáticos expuestos a alérgenos (Am. Rev. Respir. Dis. 1987;
135: 433-440). Los macrófagos y células dendríticas
funcionan como las células que presentan antígenos en el pulmón y
pueden llevar, directa o indirectamente, a la secreción de citocinas
capaces de iniciar cambios fenotípicos en el epitelio de la vía
aérea y sus lugares periféricos. El estímulo de la inflamación
crónica de la vía aérea puede provocar directamente la proliferación
de epitelio y fibroblastos de la vía aérea, y el depósito
subsiguiente de colágeno alrededor de estas zonas. Los macrófagos y
células dendríticas activados siguen siendo altos en la zona en
comparación con las demás células inflamatorias durante las
exposiciones de la última etapa.
El epitelio de la vía aérea se espesó debido en
gran parte a una hiperplasia marcada de las células caliciformes,
particularmente en las vías aéreas más grandes, pero también en los
bronquiolos pequeños e incluso terminales. La proporción de células
caliciformes con respecto a las células normales columnares ciliadas
aumentó mucho en comparación con los grupos control. Aunque las
vías aéreas de control (tanto pequeñas como grandes) tenían sólo
células caliciformes ocasionales, la sección procedente de los
pulmones expuestos a OVA mostró que el 100% de las grandes vías
aéreas y parte de las pequeñas vías aéreas contenían células
caliciformes hasta un 88% de las células epiteliales totales de las
vías aéreas. En los pulmones que no habían sido sometidos a lavado,
se pudo observar mucosidad dentro de la célula caliciforme y en
algunas vías aéreas, ocasionalmente obstruyendo completamente el
lumen. El residuo celular se enredó en estos tapones de mucosidad.
No se observó hiperplasia de las células caliciformes en los grupos
control y, por tanto, no podría haberse visto debido a un efecto
"no alérgico" de la OVA, o a la técnica de dosificación
intratraqueal. Algunas de las células caliciformes en las pequeñas
vías aéreas están exentas de esta característica, indicando quizás
que la distribución de OVA dentro del árbol respiratorio no había
sido uniforme.
La Fig. 7 es un histograma de los resultados
referidos al tratamiento con el Compuesto HK-X a
unas dosis de 5 \mug/kg y 10 \mug/kg en cuanto a la formación
de tapones de mucosidad en este modelo de asma murino. Ambas dosis
reducen notablemente la producción de mucosidad en las pequeñas vías
aéreas.
Se utiliza un modelo de ratón para evaluar el
efecto de los compuestos de la presente invención sobre la aparición
histológica, radiográfica y clínica de una artritis inducida por
colágeno de tipo II.
Las enfermedades autoinmunes provocan una
morbilidad e incapacidad crónicas y significativas. La artritis en
sus numerosas formas es representativa de una familia de
enfermedades autoinmunes. En el terreno clínico, la artritis
reumatoide (RA) es la forma más común de la enfermedad
artrodisplástica severa. Todos los médicos reconocen que la RA es
una enfermedad progresiva.
La histopatología de las lesiones artríticas que
ocurren en CIA murina comparten enormes similitudes con la de RA en
pacientes humanos. Por tanto, la CIA murina es un modelo aceptado
para estudiar tratamientos terapéuticos potenciales de la RA.
Ratones: se utilizan para este trabajo ratones
macho DBA/1(2) que pesan 25 gramos (Jackson Laboratories, Bar
Harbor, ME or B&K Universal, Kent WA). Esta raza de ratón se
predispone a la CIA mediante la inyección de colágeno heterólogo de
tipo II. Se pueden obtener Colágeno Bovino (BC), Adyuvante Completo
de Freund (CFA) y Adyuvante Incompleto de Freund (ICFA) de Sigma
Chemical. El antígeno para la inmunización se procesa en ácido
acético 0,1M y se formula con CFA o ICFA.
Protocolo de inmunización: se inyectan a los
ratones 100 \mug de colágeno de tipo II en CFA a intervalos
predeterminados durante el período de estudio.
Se examinan los ratones a intervalos
predeterminados para el desarrollo de la artritis. La presunta
evidencia de artritis incluye inflamación y eritema de al menos una
articulación de dedo en la pata delantera y/o trasera en dos
observaciones consecutivas.
Examen histológico de las articulaciones: Las
articulaciones de los dedos de los animales sacrificados a
intervalos adecuados se retiran, se fijan, se descalcifican, se
introducen en parafina, se cortan y se tiñen para observar las
características celulares y estructurales generales y para detectar
la matriz cartilaginosa del panículo de cada articulación, como
conviene. El grado de celularidad y las zonas de inflamación se
cuantifican utilizando la digitalización de fotomicrografías
histológicas y aplicando técnicas estándar de recuento por zona y
punto tal como se ha descrito anteriormente.
Se lleva a cabo una evaluación radiográfica de
las articulaciones de los dedos para detectar la incidencia de los
cambios en las articulaciones después de la inmunización con
colágeno de tipo II. Para este trabajo, se ha modificado un sistema
de imágenes por mamografía. La zona media de tejido blando
(panículo) de la articulación se determina mediante el análisis de
las radiografías digitalizadas por ordenador, junto con los cambios
en la densidad de los tejidos duros adyacentes mediante la
comparación con los estándares internos incluidos con cada
radiografía. Como control para la línea base del cambio de densidad
de los tejidos duros y zonas de los panículos, se utilizan ratones
adicionales durante el mismo período y se comparan los datos sobre
densidad y zona. El significado de las diferencias en densidad y
zona para el control y los ratones experimentales se evalúa
mediante ensayos T por pares en cada punto de tiempo.
Se observa diariamente el principio de una
artritis en los animales. Se obtiene un índice de artritis graduando
la severidad de implicación de cada pata en una escala del 0 al 4.
La puntuación se basa en el grado de eritema y edema periarticular,
así como en la deformidad de las articulaciones. La inflamación de
las patas traseras se cuantifica también midiendo el espesor del
tobillo desde el malleus (martillo) lateral al medial con un
calibrador de tensión constante.
Para evaluar el efecto antiartrítico del
Compuesto HK-X, se seleccionan las vías de
administración en base a la experiencia con pacientes humanos con
respecto al(a los) mecanismo(s) de suministro más
apropiado(s).
Dosis de HK-X y Prednisolona: Se
colocan dosificaciones que representan niveles divergentes y
putativamente terapéuticos de péptido en sitios localizados, tanto
por vía transcutánea (TC) (absortiva) como por inyección en el pié.
Es demasiado probable que la inyección directa en el espacio
intraarticular produzca artefactos traumáticos. Por tanto, la
inyección del medicamento en la almohadilla plantar (FP) adyacente
al espacio intraarticular es la metodología elegida. Se inyecta
también a los ratones control Prednisolona (potente antiinflamatorio
documentado en el tratamiento de enfermedades experimentales y
clínicas autoinmunes) como control positivo.
En primer lugar, se inyecta diariamente durante
50 días a cada ratón en un grupo de diez (más los controles)
colágeno. Los días 3 y 18, se inyecta al ratón 5 ó 10 \mug/kg del
Compuesto HK-X en una solución de ácido acético
0,1M a 1 mg/ml. El día 50, el ratón es exanguinado para los estudios
histológicos.
Entonces, ocho grupos (A-I) de
diez ratones cada uno son tratados de acuerdo con el siguiente
protocolo específico.
Se inmuniza al Grupo A con 1º CFA más BC, 2º
ICFA más BC y no se da ningún tratamiento (control).
Se inmuniza al Grupo B con 1º CFA más BC, 2º
ICFA más BC y se administra prednisolona a 5 mg/kg empezando el día
después del 2º ICFA más BC y se continúa durante 20 días.
Se inmuniza al Grupo C con 1º CFA más BC, 2º
ICFA más BC y se administra TC el Compuesto HK-X a 4
mg/kg (dosis alta) empezando el día después del 2º ICFA más BC y se
continúa durante 20 días.
Se inmuniza al Grupo D con 1º CFA más BC, 2º
ICFA más BC y se administra TC el Compuesto HK-X a
0,4 mg/kg (dosis baja) empezando el día después del 2º ICFA más BC
y se continúa durante 20 días.
Se inmuniza al Grupo E con 1º CFA más BC, 2º
ICFA más BC y se administra TC el Compuesto HK-X a 4
mg/kg (dosis alta) empezando el día después del 2º ICFA más BC y se
continúa durante 20 días.
Se inmuniza al Grupo F con 1º CFA más BC, 2º
ICFA más BC y se administra TC el Compuesto HK-X a
0,4 mg/kg (dosis baja) empezando el día después del 2º ICFA más BC
y se continúa durante 20 días.
Se inmuniza al Grupo G con 1º CFA, 2º ICFA y se
administran TC 10 ml de DMSO empezando el día después del 2º ICFA
más BC y se continúa durante 20 días (control).
Se inmuniza al Grupo H con 1º CFA, 2º ICFA y se
administran FP 10 ml de DMSO empezando el día después del 2º ICFA
más BC y se continúa durante 20 días (control).
Se inmuniza al Grupo I con 1º CFA, 2º ICFA y se
administran FP 10 ml de solución salina empezando el día después
del 2º ICFA más BC y se continúa durante 20 días (control).
Se someten los animales de cada grupo a
rayos-X inmediatamente después de la 2º inmunización
e inmediatamente antes de sacrificarlos. Después de su sacrificio,
se retiran las patas según convenga y se procesan para su examen
histológico. Se descubre que el tratamiento con el Compuesto
HK-X reduce el grado de artritis.
Se ha descrito la invención detalladamente con
referencia a las realizaciones preferentes de la misma. Sin
embargo, se apreciará que, al considerar la presente descripción y
las figuras, los especialistas en la técnica puedan realizar
modificaciones y mejoras dentro del alcance de esta invención tal
como viene definido por las reivindicaciones.
Claims (12)
1. Composición farmacéutica para el tratamiento
terapéutico que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y
un péptido de fórmula
f-Met-Leu-X, donde X
se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr,
Tyr-Phe, Phe-Phe y
Phe-Tyr, siendo f N-formilo.
2. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, caracterizada porque dicho péptido es
f-Met-Leu-Phe-Phe
o caracterizada porque dicho péptido es
f-Met-Leu-Tyr.
3. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, caracterizada porque se selecciona dicho
vehículo para la administración oral del péptido o porque se
selecciona dicho vehículo para la administración por inhalación del
péptido.
4. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, caracterizada porque dicha composición es
una composición en aerosol.
5. Composición farmacéutica según la
reivindicación 1, caracterizada porque se selecciona dicho
vehículo para la administración tópica del péptido o
caracterizada porque se selecciona dicho vehículo para la
administración en tabletas del péptido.
6. Utilización de un péptido de fórmula
f-Met-Leu-X para la
preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de
la inflamación, seleccionándose X de entre el grupo consistente en
Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe y
Phe-Tyr.
7. Utilización de un péptido según la
reivindicación 6, caracterizada porque la inflamación es
controlada por la inhibición de la degranulación de los
mastocitos.
8. Utilización de un péptido según la
reivindicación 6, caracterizada porque la inflamación es
asma, artritis reumatoide y anafilaxis o caracterizado
porque la inflamación es una consecuencia del asma, la artritis
reumatoide o la anafilaxis.
9. Utilización de un péptido de fórmula
f-Met-Leu-X para la
preparación de una composición farmacéutica para tratar el asma,
caracterizada porque X se selecciona de entre el grupo
consistente en Tyr, Tyr-Phe, Phe-Phe
y Phe-Tyr.
10. Utilización de un péptido de fórmula
f-Met-Leu-X, donde X
se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr,
Tyr-Phe, Phe-Phe y
Phe-Tyr, para la preparación de una composición
farmacéutica para el tratamiento de enfermedades controladas por
cualquiera de las siguientes condiciones:
inhibición de la liberación de citocinas,
histaminas y leucotrienos en un paciente,
mediante la reducción de la adhesión, migración
y agregación de los linfocitos, eosinófilos y neutrófilos a un
lugar de inflamación en un paciente,
mediante la reducción de los anticuerpos IgE en
el lugar de inflamación en un paciente,
mediante la reducción de la reticulación de IgE
en un lugar de inflamación en un paciente, o
mediante la inhibición de la permeabilidad
vascular incrementada en un lugar de inflamación en un paciente.
\vskip1.000000\baselineskip
11. Utilización de una cantidad antiinflamatoria
eficaz de (i) un péptido de fórmula
f-Met-Leu-X, donde X
se selecciona de entre el grupo consistente en Tyr,
Tyr-Phe, Phe-Phe y
Phe-Tyr y (ii) otro ingrediente activo, para la
preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de
la inflamación crónica en un paciente.
12. Utilización según la reivindicación 11,
caracterizada porque el otro ingrediente activo se selecciona
de entre el grupo consistente en antileucotrienos,
beta_{2}-agonistas y corticosteroides.
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